Kök Hücre Nakli Amacıyla HLA Uyumlu ve Sağlıklı Embriyoların Preimplantasyon Genetik Tanı Yöntemiyle Seçimi Ender ALTIOK GENETİKA Acıbadem Genetik Hastalıklar Tanı Merkezi, Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi, İstanbul K ök hücre nakli için aile içi vericiler deerli kaynak oluturmaktadr. Ancak özellikle kök hücre nakli endikasyonu olan tek gen hastalklarnda tam HLA uyumu gereksinimi ve ailelerdeki çocuk saysnn azl verici saysn kstlamaktadr. Son yllarda Preimplantasyon genetik tan yöntemiyle meydana getirilen “kurtarc bebekler” kök hücre nakli endikasyonu bulunan hastalarda kök hücre kaynaklar olarak seçenek oluturmulardr. PGT 20 yla yakn bir süredir kaltsal hastalklarn doum öncesi önleme yöntemi olarak prenatal tanya seçenek oluturmaktadr. European Society Human Reproduction ( ESHRE) PGD Consortium 2007 verilerine göre xx adet tek gen hastal için xx adet PGT gerçekletirilmi, xx adet bebek domutur. PGT’nin prenatal tanya göre en önemli avantaj eer gebelik oluursa fetusun incelenen hastalk nedeniyle salkl olmas ve gebelik sonlandrlmasna neden olmamasdr. Bu nedenle ahlaki, etik ve tbbi nedenlerle artan sayda uygulanmaya balanmtr. PGT’nin prenatal tanya göre dezavantaj ise gebelik olaslnn düük olmas, gebelik denemeleri arasnda uzun süre geçmesi, sosyal sigorta kurumlarnn destek vermemesi, yüksek maliyeti ve uygulayabilen genetik tan merkezi saysnn çok az olmasdr. PGT son yllarda sadece kaltsal hastalklarn önlenmesi amacyla deil, kök hücre nakli amacyla aile içi HLA uyumlu bebeklerin meydana getirilmesi çin de uygulanmaktadr. ESHR verilerine göre 2007’e kadar sadece HLA veya kök hücre nakli endikasyonu olan bir kaltsal hastalkla beraber HLA uyumu amacyla gerçekletirilen PGT says xxx olmu, xxxx adet bebek domu, xx adet transplantasyon gerçeklemitir. Embriyo genetik seçimi olaslklara kar mücadele olarak görülebilir. Çekinik bir hastalk tayan elerden doacak bebeklerin hastalktan etkilenme- 7-10 Ekim 2009, Antalya me olaslklar 3/4’tür. Ayn eten doacak bebeklerin tüm HLA lokusu uyum olasl da ¼’tür. Hem salkl hem HLA uyumlu olma olasl ise 3/16 ( % 18.75) ‘tir. Kadnlarda bu olasl arttrmak için yumurta saysnn dardan gonadotropin tedavisi ile çoaltlmas ve ayn zamanda embriyolarn genetik inceleme için eriilebilir olmas gerekmektedir. Bu nedenlerle genetik ön deerlendirme ve ayrntl moleküler incelemeler sonras PGT programna balanan hasta tüp bebek uygulamasna alnr. Ancak tüp bebek ilemlerinde gebelik ihtimali spontan gebelie kyasla yüksek olmakla beraber %40 civarndadr. Genetik özellikleri istenildii ekilde salkl ve HLA uyumlu olsa bile anne adayna transfer edilen embriyolardan gebelik olumayabilir. Bu olaslklar göz önüne alndnda daha fazla sayda PGT denemeleri gerekebilir. Hasta ve salkl aile bireylerinden alnan kanlardan geni MHC haplotipi ve mutasyonlar için tanmlamalar yaplmakta ve sonra tek hücrelerde çallabilecek ekilde optimizasyon gerçeklketirilmektedir. Tüp bebek ilemleri sonucu oluan ve 6-8 blastomer barndran embriyolara biyopsi yaplarak 1 adet blastomer çkarlmakta ve daha önce hazrlanm olan protokol uygulanarak inceleme yaplmaktadr. HLA ve monogenik hastalklarn PGT incelemesi amacyla aile bireylerinde ve daha sonra embriyolarn seçimi srasnda kullanlan moleküler yöntemler arasnda multipleks PCR, Fluoresan PCR ve ergime erisi (melting curve) incelemesi, DNA dizi analizi, kapiler elektroforezde floresan fragman incelemesi ile HLA STR haplotip saptanmas, minidizileme (minisequencing) bulunmaktadr. Tek hücrede moleküler incelemeler srasnda sorunlara rastlanabilmektir. PCR srasnda DNA 105 ALTIOK E. Kök Hücre Nakli Amacıyla HLA Uyumlu ve Sağlıklı Embriyoların Preimplantasyon Genetik Tanı Yöntemiyle Seçimi çoalmas olmamas, sadece tek alelin DNA’snn çoalmas ( ADO, allele drop out), baka PCR ürünleriyle veya baka embriyoya ait blastomerle karma bu sorunlardan bazlardr. Seyrek de olsa dünyada PGT hatalar bildirilmitir. Hata nedenleri yukarda saylan yöntemlerin verimli ve dikkatli kullanlmamas, tüp bebek laboratuarnda embriyolarn karmas, çiftin pgt sürecinde ilikide bulunmas olarak bildirilmitir. Merkezimizde 2002-2008 arasnda kardete kök hücre endikasyonu nedeniyle 95 hastaya HLA uyumlu ve salkl embriyo seçimi amacyla Preimplantasyon Genetik Tan (PGT) program uygulanmtr. PGT deneyimlerimiz kök hücre nakli uygulamalarna katks açsndan deerlendirilmitir. PGT bavurusu yaplan hastalklar arasnda 82 talasemi, 2 Fanconi A, 1 Fankoni C, 1 Griscelli, 3 Wiskott Aldrich sendromu, 4 ALL, 1 osteopetrozis, 1 SCID bulunmaktadr. Titiz ve kapsaml bir deerlendirmeden sonra 74 çift PGT programna kabul edilmitir. Kök hücre nakil endikasyonunun bulunmamas, kök hücre nakil endikasyonunun hematoloji hekimi tarafndan yazl olarak salanmamas, transplantasyona kadar sa kalm olaslnn azl, ailede uygun verici bulunmas, çiftin doacak çocukla ilgili beklentilerinin etik olmamas, çiftin ailelerinin zoruyla bavuruda bulunmas, ileri anne ya, annenin çok düük yumurta rezervi ve babalk durumu, PGT programna alnmama nedenleri arasnda bulunmaktadr. Genetik Tan Merkezine 57 hasta dorudan, 38 hasta hematoloji klinikleri tarafndan yönlendirilmitir. Tüp bebek kliniklerinden yönlendirme olmamtr. Bu hastalar ve aileleri hastalk endikasyonlar ve kök hücre nakil endikasyonlar açsndan tekrar deerlendirilerek yönlendiren merkezlerden yazl onay alnmtr. Ailelerin kapsaml soyaaçlar çkarlarak ve HLA haplotipleri çallarak HLA uyumlu vericiler aratrlmtr. Genetik danma verildikten ve onam alndktan sonra jinekolojik muayeneden geçirilen hastalara yumurta rezervleri açsndan belirgin bir kstlama yok ise hastalk genleri ve geni MHC lokusu ( HLA ve non-HLA genleri) açsndan genotipleme yaplmtr. Ailedeki genetik hastaln ve sorumlu gen adaylarnn belirlenmesi, aday genlerdeki mutasyonlarn aratrlmas, muhtemel HLA uyumlu bireylerin belirlenerek testlerinin yaplmas, embriyolarda çalma stratejilerinin oluturulmas ardndan tüp bebek programna aktarlan hastalardan döllenmeden sonraki 3. günde embriyo biyopsisi yaplarak birer adet blastomer çkarlmtr. Blastomerler moleküler genetik laboratuarnda tüm MHC 106 lokusu ve hastalk mutasyonlar açsndan DNA dizi analizi, STR analizi, Real Time PCR metodlar kullanlarak incelenmitir. HLA uyumlu ve salkl embriyolarn anne adaylarna transferi sonucu oluan gebeliklerden hastala kar ve kromozom anomalileri açsndan prenatal genetik tan ile dorulama yaplmtr. Merkezimizde HLA ve tek gen hastalklar için yaplan PGT sonucu doan bebek says 13’tür. Bebeklerin kordon kan saklanm, 4 hasta kardee deiik nakil merkezlerinde baarl transplantasyonlar yaplmtr. Literatür verilerine göre 2008’e dek dünyada HLA ve tek gen hastal nedeniyle yaplan PGT sonucu yaklak 100 bebek dünyaya gelmi ve 30 transplantasyon yaplmtr (1,2). HLA uyumu amacyla yaplan preimplantasyon genetik tan tpta etik, hukuk, maliyet ve teknik problemler açsndan yeni endieler oluturmaktadr. Embryo, ebeveyn, hekimler ve toplum etik açdan deiik bak açlarn oluturmaktadr. HLA uyumu ve tek gen hastalklarnn tedavisi için kök hücre kayna bulmak amacyla PGT deneyimlerine göre: 1) Tek gen hastalklar ve HLA için embriyo seçimi laboratuvar ve klinik açsndan uygulanabilmektedir. 2) PGT sonucu doan bebekler transplantasyonlarda verici olarak katkda bulunmaya balamlardr. 3) Hasta çocuun tedavisi amacyla gebelik planlayan aileler için PGT’nin prenatal tanya oranla avantajlar bulunmaktadr. 4) Hasta seçiminde titiz ölçütler kullanlarak etik açdan kayglar azaltlabilir 5) Genetik, tüp bebek ve hematoloji klinikleri arasnda multi disipliner yaklam ve iyi iletiim PGT baars için büyük öneme sahiptir. 6) PGT sürecinin bir genetik danma ve planlama ile balamas hastalarn doru seçimi, tbbi ve etik açdan uygun yönlendirilmesi için gereklidir . Bu durum 2008 ESHRE PGT rehberinde de belirtilmektedir. 7) Tedavi seçeneinde transplantasyon bulunan hastalar için ilk tan aamasnda PGT planlamas deerlendirilebilir. Kaynaklar 1. Goossens, V. ve ark. 2009. Hum Reprod. 24(8) 1786-1810. ESHRE PGD Consortium data collection IX: cycles from January to December 2006 with pregnancy follow-up to October 2007 2. Van de Velde, H. Ve ark. 2009. Hum Reprod 24(3) 732-740. 35. Ulusal Hematoloji Kongresi