albümin duyarlı membran tasarımı
advertisement
0 ALBÜMİN DUYARLI MEMBRAN TASARIMI Deniz YİĞİTER – Cemal Uğur DURSUN ÖZEL EGE LİSESİ 2010 00 1 İÇERİK LİSTESİ PROJENİN AMACI……………………………………………………………………………… 2 GİRİŞ…………………………………………………………………………………………… 3 MATERYEL VE YÖNTEM…………………………………………………...………………. 6 Materyel…………………………………………………………………………………… 6 Kullanılan Cihazlar................................................................................................... 6 p(HEMA) Membranın Sentezi…………………………………………..……………… 7 Ligand İmmobilizasyonu………………………………………………...………………. 7 Pelletlerin Karakterizasyonu ve Adsorpsiyon Çalışmaları…………………………… 8 SONUÇ VE TARTIŞMA…………………………………………………..…………………. 10 Reactive Green 19 İmmobilize poli(HEMA) Pelletlerin Karakterizasyonu…...…….. 10 Sürenin Albümin Adsorpsiyonuna Etkisi…………………………..…………………… 11 pH’ın Albümin Adsorpsiyonuna Etkisi……………………………….…………………. 11 Başlangıç Albümin Derişiminin Adsorpsiyona Etkisi……………..…………………… 12 Albümin Adsorpsiyonuna Sıcaklığın Etkisi………………………………..…………… 12 Pelletlerin Albümin Adsorpsiyonuna İyonik Şiddetin Etkisi…………………..……… 13 Desorpsiyon ve Tekrar Kullanılabilirlik……………………………………………........ 13 TEŞEKKÜR……………………………………………………………………………………. 15 KAYNAKLAR................................................................................................................. 16 1 2 PROJENİN AMACI 1 Albümin toplam plazma proteinlerinin yarısından fazlasını oluşturur. Albüminin insan vücudunda çok önemli görevleri vardır; kan ve dokular arası osmatik basıncın düzenlenmesinde, yağ asitleri, bazı aminoasitler ve metal iyonlarının taşınmasında rol oynar. Albümin tedavi amaçlı olarak yaygın kullanıldığı gibi kanda Albümin düzeyinin değişmesi bazı hastalıkların belirtisidir. Albüminin kandan saflaştırılmasının hastalıkların erken teşhisinde rolü vardır. Çeşitli kanser türleri ve bazı hastalıkların erken tanısında belirleyici olan kandaki düşük konsantrasyondaki (Romatoit artritte, moleküller, konsantrasyonu fazla olan albümin tarafından perdelenir kanda çok düşük oranlarda bulunan lizozim enziminin konsantrasyonundaki değişimin tayini önemlidir, bu hastalığın günümüzde kesin tedavisi olmamakla birlikte erken tanısı hastalığın ilerlemesini engellemektedir). Bu anlamda albüminin kandan yüksek verimle, ekonomik yöntemlerle ve kısa sürede saflaştırılması önemlidir. Ayrıca ilaç endüstrisinde biyoteknolojik yöntemlerle elde edilen albüminin (dünya çapında yılda 500 ton albümin üretilir) ekonomik ve verimli yöntemlerle izole edilmesi gerekir. Çeşitli pH, iyonik şiddet ve sıcaklık aralıklarında proteinlerin çöktürülmesine dayanan bu yöntemin ayırıcılığının düşük olamasının yanında işlem sırasında proteinler denatüre olabilirler. Bu nedenle, uygun ayırma yöntemlerinin geliştirilmesi endüstri açısından da önemlidir. Bu çalışmadaki amacımız albüminin saflaştırılmasında yüksek verimli, duyarlılığı yüksek tekrar kullanılabilir afinite membranı sentezleyerek albüminin optimum adsorpsiyon koşullarını belirlemektir. 2 3 GİRİŞ Proteinler, aminoasitlerden oluşan büyük yapılı ve biyolojik önemi yüksek moleküllerdir. Metabolizmada proteinlerin gerekenden fazla ya da eksik olması çeşitli rahatsızlıklara neden olmaktadır. Bu nedenle proteinlerin uygun yöntemlerle saflaştırılması veya uzaklaştırılması önemlidir. Kullanılan ayırma yönteminde proteinin yüksek oranda saflaştırılması ve işlemin az sayıda basamaktan oluşması tercih edilir. Proteinlerin ve biyolojik moleküllerin saflaştırılma basamaklarında kromatografik yöntemler kullanılır. Kromatografik yöntemler kimyasal ve fiziksel özellikleri biribirine çok yakın birleşenlerden oluşan karışımları ayırmada etkilidir. Bu teknik; yüksek verimle, uygulanabilirliği kolay olan ve zaman- maliyet açısından ekonomik bir çalışma imkanı sunar. Kromatografik yöntemler ayırma mekanizmasına göre sınıflandırılır. Ayırma prosedürleri bileşenlerin fiziksel özelliklerine göre farklılıklar gösterir. Polarite farkına dayanan gaz-sıvı kromatografisi, iyonik özellik farkına dayanan iyon değişim kromatografisi, molekül büyüklüğüne dayanan jel geçirgenlik kromatografisi buna örnek gösterilebilir. Adsorpsiyon- yüzeye tutunmaprensibinin uygulandığı afinite kromatografisi ise kromatografik tekniklerin hızla gelişmekte olan bir dalıdır. Afinite kromatografisi biyomoleküllerin biyolojik esasına dayalı olan bir yöntemdir. Bu yöntem, enzim substrat gibi biribiri ile spesifik etkileşen moleküllerdeki etkileşim temel alınarak geliştirilmiştir. Afinite kromatografisinde sıklıkla kullanılan biyolojik etkileşimler antikor-antijen, enzim-kofaktör gibi moleküllerin etkileşimine benzer. Afinite kromatografisi; metal-şelat, moleküler baskılama, lektin, membran bazlı, immuno-afinite ve boya-ligand afinite kromatografisi gibi bir çok türü olan etkili bir ayırma yöntemidir. Afinite kromatografisi protein ile spesifik ligandların, tersinir (adsorpsiyon- desorpsiyon) etkileşimine dayanmaktadır. Bu etkileşimler elektrostatik ya da Van der Waals, hidrojen bağı gibi hidrofobik etkileşimlerdir. Genelllikle katı olarak seçilen destek materyel yüzeyine, kovalent etkileşimlerle ligand adı verilen ve karışımdan ayrılması istenen bileşene ilgisi olan seçici gruplar bağlanır. Ayrılması istenen protein katı yüzey üzerine optimum koşullarda adsorplanarak karışımdan uzaklaştırılır. Protein ile ligand arasındaki etkileşimler 3 4 uygun ajanlar yardımı ile yok edilerek proteinin yüzeyden desorpsiyonu sağlanır. Böylece çoklu işlem basamağına gerek kalmadan tek basamakta yüksek saflıkta ayırma gerçekleşir. Ligand olarak enzim, antikor, aminoasit, nükleik asit ve oligopeptit gibi çeşitli moleküller kullanılarak birçok destek materyal dizayn edilmiştir. [1],[2] Ancak bu moleküllerin ve uygulanan tekniğin maliyeti yüksektir. Boya-ligand afinite kromatografisinin dikkat çekici ve önemli yanı bu doğal moleküllerin alternatifi olarak ligand yerine boya kullanılmasıdır. Boya ligandlar birçok proteine, aynı doğal moleküllerde olduğu gibi spesifik olarak bağlanabilmektedir. Uygulanabilirliği maliyeti ve boyanın destek materyel yüzeyine kolay tutunup, kalıcı olmasından dolayı da tercih edilen bir yöntemdir. Kullanılan boyalar tekstil boyası olarak bilinen oldukça ucuz ve uygun çalışma imkanı sağlayan materyallerdir. Boya yerine enzim gibi protein yapılı biyolojik moleküllerin bağlanması hem daha zor bir tekniği hem de maliyeti beraberinde getirir. Bunun yanında protein tabanlı bu tip maddelerin işlem sürensince bozunma riski de yüksektir. Bu nedenle boya-ligand afinite kromatagrafisi kullanışlı ve verimli bir uygulamaya sahiptir.[2][9] Albümin toplam plazma proteinlerinin yarısından fazlasını oluşturur ki sağlıklı bireylerde miktarı 35-50 g/lt dir.[3] Yapısı 585 aminoasidin bulunduğu polipeptit zincirinden meydana gelir. Albüminin insan vucudundan çok önemli görevleri vardır; kan ve dokular arası osmatik basıncın düzenlenmesinde, safra asidi, billurubin, uzun zincirli yağ asitleri, triptofan sistein gibi aminoasitler; çinko, bakır gibi metal iyonlarının taşınmasında rol oynar. Örneğin; metabolizmada bulunması gerekenden fazla miktarda bulunan metal iyonlarına bağlanarak bu iyonların vucuttan uzaklaştırılmasına yardımcı olur, uzun zincirli yağ asitlerine bağlanıp bu molekülleri gereken yerlere taşıyarak damar tıkanıklığı gibi rahatsızlıkların oluşumunu engellemektedir. 4 5 Albümin tedavi amaçlı olarak yaygın kullanılan bir proteindir. Kanda albümin düzeyinin düşmesi protein noksanlığı, solunum yetmezliği, hemodiyaliz, akut böbrek hastalığı,nefroz, sarılık, karaciğer yetmezliği, karın zarının iltihabı, safra taşı veya alkol gibi sebeblerde oluşan pankreas çalışmasını durdurabilecek tahriş, bağ dokusunun özelllikle yumuşaklı yapıdaki deri altı dokusunun iltihabı durumunda albümin tedavisi önemlidir. Albümin terapisi; serum albümin konsantrasyonu kolloidal kan basıncının ve kanın plazma hacminin artması gibi durumlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Albüminin kandan saflaştırılmasının hastalıkların erken teşhisinde rolü vardır. Çeşitli kanser türleri ve bazı hastalıkların erken tanısında belirleyici olan kandaki düşük konsantrasyondaki moleküller, konsantrasyonu fazla olan albümin tarafından perdelenir. Özellikle Romatoit artritte, kanda çok düşük oranlarda bulunan lizozim enziminin konsantrasyonundaki değişimin tayini önemlidir. Bu hastalığın günümüzde kesin tedavisi olmamakla birlikte erken tanısı hastalığın ilerlemesini engellemektedir. Bu anlamda albüminin kandan yüksek verimle, ekonomik yöntemlerle ve kısa sürede saflaştırılması önemlidir.[4] Kanda albümin eksikliği veya fazlalığı bulunduğunda bu durum serum protein elektroforezi yöntemi ile değerlendirilir. İdrarda albümin varlığı için çeşitli testler vardır, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi kullanılır. Ayrıca ilaç endüstrisinde biyoteknolojik yöntemlerle elde edilen albüminin ekonomik ve verimli yöntemlerle izole edilmesi gerekir. Endüstride kullanılan en eski yöntem Cohn prosedürüdür.[4] Çeşitli pH, iyonik şiddet ve sıcaklık aralıklarında proteinlerin çöktürülmesine dayanan bu yöntemin ayırıcılığının düşük olamasının yanında işlem sırasında proteinler denatüre olabilirler. Bu nedenle, uygun ayırma yöntemlerinin geliştirilmesi endüstri açısından da önemlidir. Yapılan çalışmada boya-ligand afinite kromografisi prensibine göre pellet olarak hazırlanan kriyojelik poli(HEMA) polimeri katı faz olarak seçilmiştir. Ligand olarak pellet 5 6 yüzeyine –OH grupları üzerinden Reaktive Green-19 tekstil boyası bağlanmıştır. Yapılan çalışmada sulu çözeltiden albüminin adsorbsiyon- desorpsiyon prensibi ile uzaklaştırılması gerçekleştirilmiştir. Başlangıç derişiminin albümin adsorpsiyonuna etkisinin belirlenmesi amacıyla, albümin derişimi 0,3 mg/ml-1,5 mg/ml aralığında değişen konsantrasyon değerlerinde çalışılmıştır. pH’ın adsorpsiyona etkisinin belirlenmesi için pH 3,5-7,0 aralığında farklı tampon sistemleri kullanılarak (pH= 3,5-5,5 için 0,1 M asetat tamponu; pH=6,0-7,0 için 0,1 M fosfat tamponu) çalışılmıştır. İyonik şiddetin adsorpsiyona etkisinin belirlemesi için; önce tuz içermeyen, sonra da 0,01 M-1,0 M NaCl içeren ortamda adsorpsiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Adsorpsiyona sıcaklığın etkisinin belirlenmesi için de ortam sıcaklığı 15oC-45 oC aralığında değiştirilerek adsorpsiyon çalışmaları tamamlanmıştır. Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlerin albümin adsorpsiyon kapasitesi, 23.1 mg albümin/g olarak belirlenmiş, yapılan diğer çalışmalarla kıyaslandığında adsorpsiyon kapasitesinin oldukça yüksek olduğu gözlenmiştir. MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Bu çalışmada, %96’lık Bovine Serum Albumine (SAFC), 2-Hidroksietilmetakrilat (Fluka), N N,N’,N’-Tetrametiletilendiamin (Fluka), Amonyum peroksidisülfat (Fluka) N,N’Metilenbisakrilamid (SIGMA) ve Sodyum klorür (Riedel-de Haën) kullanılmıştır. Kullanılan diğer kimyasalların tümü analitik saflıktadır. Kullanılan cihazlar Adsorplanan albümin miktarının belirlenmesi için Shimadzu marka UV-1601 model UV-görünür bölge spektrofotometresi kullanılmıştır. Çözeltilerin pH değerleri WTW InoLab pH metresi ile belirlenmiştir. Sentezlenen pelletlerin fonksiyonel gruplarının belirlenmesi için Perkin Elmer marka Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FT-IR) kullanılmıştır. 6 7 Adsorpsiyon çalışmaları, Brandstead Lab-line MaxQ 4000 termal çalkalayıcıda gerçekleştirilmiştir. Resim 1: Termal çalkalayıcı Resim 2: pH metre ve manyetik karıştırıcı P(HEMA) Membranların Sentezi Sunulan çalışmada, albümin adsorpsiyonu amacıyla, 2-hidroksietilmetakrilat (HEMA) monomeri kullanılarak serbest radikal polimerizasyonu ile poli(HEMA) kriyojelik membranların sentezi gerçekleştirilmiştir. Sentez adımları kısaca şu şekilde özetlenebilir: 2.60 mL HEMA ve 0.566 g metilenbisakrilamid (MBAA) içeren reaksiyon karışımına başlatıcı olarak 0.04 g amonyumpersülfat (APS) ve 50 μl N,N,N’,N’ - Tetraetilmetilendiamin (TEMED) ilave edilmiş ve şırınga yardımı ile çekilen bu karışımın cam plakalar arasına enjekte edilmesiyle 24s süreyle -120C’de poli(HEMA) kriyojelik membranların sentezi tamamlanmıştır. Sentezlenen poli(HEMA) membranlar, reaksiyona girmeyen reaktiflerin uzaklaştırılması amacıyla yıkanmış ve adsorpsiyon çalışmalarında kullanılmak üzere pellet şeklinde kesilmişlerdir. Ligand İmmobilizasyonu Pellet şeklinde kesilen poli(HEMA) kriyojelik membranlara ligand olarak Reaktive Green -19 tekstil boyası bağlanmıştır. Bu amaçla pelletler, 100 mL Reaktive Green - 19 boya çözeltisi içerisine alınmış, 600C’de 30 dakika süreyle 150 rpm’de çalkalama işleminin ardından ortama 3.5 g NaCl ilave edilmiştir. Aynı koşullarda 30 dakika daha çalkalandıktan 7 8 sonra ortama 0.5 g Na2CO3 ilave edilmiş ve 700C’de 150 rpm’de 4 saat süreyle çalkalama sonunda ligand immobilizasyonu tamamlanmıştır. Bağlanan boya miktarının belirlenmesi amacıyla, boya çözeltisinden 0., 1., 2., 3. ve 4. saatlerde örnek alınarak spektrofotometrik olarak boya derişimindeki değişim takip edilmiştir. İmmobilizasyon işleminin tamamlanmasından sonra, kovalent olarak bağlanmayan ligand fazlalığının uzaklaştırılması için pelletler, birkaç kez saf su ile yıkanmıştır. Yapıdan boya salımı olup olmadığını belirlemek amacıyla yıkama işlemi etil alkol-su (%50-%50) karışımıyla da tekrarlanmıştır. Yıkama işleminin tamamlanmasından sonra pelletler, 35 0C de 6 saat boyunca etüvde inkübe edilerek kurutulmuş ve adsorpsiyon çalışmalarına kadar +40C’de muhafaza edilmiştir. Resim 3: Membran sentezleme aşaması. Resim 4: Reactive Green-19 ile boyanan poli(HEMA) pelletleri. Reactive Green-19 İmmobilize poli(HEMA) Pelletlerin Karakterizasyonu ve Adsorpsiyon Çalışmaları Polimerik yapılar, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) spektrumları ile karakterize edilmiştir. Sentezlenen Reactive Green 19 immobilize poli(HEMA) pelletlerin şişme derecelerinin (S) belirlenmesi için önce kuru pelletlerin (mkuru) ağırlıkları tartılıp, daha sonra da 50 mL saf su içerisinde 2saat inkübasyon sonrası yaş ağırlıkları (myaş) tartılıp kaydedilmiştir. Hazırlanan kriyojelik pelletlerin şişme derecesi, aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır. 8 9 Adsorpsiyonun optimizasyonu amacıyla, Reactive Green immobilize poli(HEMA) pelletlere albümin adsorpsiyonuna pH, başlangıç derişimi, sıcaklık, süre ve iyonik şiddet gibi değişkenlerin etkisi araştırılmıştır. Adsorpsiyon çalışmaları, belirli pH ve derişimdeki 5mL protein çözeltisine ağırlığı bilinen Reactive Green 19 immobilize poli(HEMA) kriyojelik membranın eklenip 200rpm’de 2 saat süreyle çalkalanmasıyla gerçekleştirilmiştir. Başlangıç derişiminin albümin adsorpsiyonuna etkisinin belirlenmesi amacıyla, albümin derişimi 0,3mg/ml-1,5 mg/ml aralığında değiştirilmiştir. pH’ın adsorpsiyona etkisinin belirlenmesi için pH 3.5-7.0 aralığında farklı tampon sistemleri kullanılarak (pH= 3.5-5.5 için 0.1 M asetat tamponu; pH=6.0-7.0 için 0.1 M fosfat tamponu) çalışılmıştır. İyonik şiddetin adsorpsiyona etkisinin belirlemesi amacıyla, once tuz içermeyen, sonra da 0.01M-1.0M NaCl içeren ortamda adsorpsiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Son olarak, adsorpsiyona sıcaklığın etkisinin belirlenmesi amacıyla, ortam sıcaklığı 15oC-45oC aralığında değiştirilerek adsorpsiyon çalışmaları tamamlanmıştır. Adsorplanan protein miktarı (Q), başlangıç ve adsorpsiyon sonrası albümin derişiminin spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile aşağıdaki eşitlik kullanılarak hesaplanmıştır. Co : başlangıçtaki protein derisimi (mg/mL) Ce : çözeltide kalan protein derişimi (mg/mL) V : Protein çözeltisin hacmi (mL) m :Adsorban miktarı (gram) 9 10 SONUÇ VE TARTIŞMA Proteinler katı ara yüzeyler için yüksek afiniteye sahiptirler. Bu, proteinlerin büyük boyutlarından dolayı bağ yapma olasılığının fazla olması ve aminoasit kalıntılarının heterojenliğinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca izoelektrik noktaya sahip olmaları, çözeltideki difüzyon hızlarının düşük olmalarından dolayı proteinler, kolloidal yapıda makromoleküllerdir. Bu nedenle proteinler elektrostatik, Van der Waals ve hidrofobik etkileşimler gibi membran yüzeyine adsorpsiyon ile sonuçlanan kolloidal ara yüzey etkileşimleri gösterirler.[6] Reactive Green 19 İmmobilize Poli(HEMA) Pelletlerin Karakterizasyonu Şekil 1’de verilen IR spektrumunda 1160 cm-1’de gözlenen S=O simetrik gerilme bandı ile 3400 cm-1 ve 3600 cm-1’ de gözlenen SO3H ve NH2 gruplarına ait gerilme bandları yapıya boyanın bağlandığını göstermektedir. a 2950 962 850 897 749 517 3413 1536 1020 1452 1390 1664 1075 %T 1159 1728 2354 965 851 901 751 b 1024 3793 520 1160 3664 3413 2951 1552 1452 1392 1532 1725 1250 1077 1664 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400,0 cm-1 Şekil 1. Pelletlerin IR spektrumu a) poli(HEMA) b) Reactive Green-19 immolize poli(HEMA) 10 11 Reactive Green-19 immolize poli(HEMA) kriyojelik pelletlerin şişme derecesi, 4.82g H2O/g kuru pellet olarak hesaplanmıştır. Sürenin Albümin Adsorpsiyonuna Etkisi Adsorpsiyona sürenin etkisi incelendiğinde 1. saate kadar p(HEMA)-RG kriyojelik pelletlere albümin adsorpsiyonunun arttığı, 1. saatten sonra dengeye ulaştığı gözlenmektedir. Bu nedenle, adsorpsiyon çalışmaları 1 saatlik sürede gerçekleştirilmiştir. pH’ın Albümin Adsorpsiyonuna Etkisi Adsorpsiyona etki eden en önemli parametrelerden birisi pH’tır. Ortamın asidik veya bazik olması adsorbanın yüzeyindeki tutunmayı sağlayan bölgelerin aktivitelerine etki eder; böylece adsorpsiyon kapasitesi değişir. Şekil 3’ten görüleceği üzere maksimum adsorpsiyon pH 4’te gözlenmiştir. Diğer pH değerlerinde adsorpsiyonun daha düşük gözlenmesinin nedeni, eş yüklü gruplar arasındaki itmeler ve proteinin yüzeyinde pH’a bağlı olarak bazı konformasyonel değişimlerin gerçekleşmesi olabilir. Şekil 2. Zaman Taraması (T:25 C pH:4; 0.8 mg/ml albumin) 0 Şekil 3. Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlere albumin 0 adsorpsiyonuna pH’ın etkisi (T:25 C, C: 0.8 mg/ml) 11 12 Başlangıç Albümin Derişiminin Adsorpsiyona Etkisi Şekil 4, başlangıç albümin derişminin adsorpsiyon üzerine olan etkisini göstermektedir. Başlangıçta artan protein derişimi ile adsorpsiyon kapasitesi de artmış, 1.5mg/ml değerinden sonra doygunluğa ulaşılmıştır. Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlerin albümin adsorpsiyon kapasitesi, 23.11599 mg albümin/g olarak belirlenmiştir. Bu durum, Reactive Green 19 molekülünün asidik ve aromatik grupları ile albümin molekülündeki amino asitlerin yan zincirleri arasındaki hidrofobik, elektrostatik ve hidrojen bağı etkileşimlerinin bir sonucu olabilir. Albümin Adsorpsiyonuna Sıcaklığın Etkisi Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlere albümin adsorpsiyonuna sıcaklığın etkisi, Şekil 5’te verilmiştir. Şekilden görüleceği üzere Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlere albüminin adsorpsiyonu sıcaklık arttıkça önemli ölçüde azalmıştır. Bu düşüş, adsorpsiyonun ekzotermik doğasına ya da yüksek sıcaklıkta adsorbanın veya proteinin yüzeyinde oluşabilecek fiziksel değişimlere bağlı olabilir. Şekil 4. Başlangıç albumin derişiminin Poli(HEMA)-RG 0 kriyojelik pelletlere adsorpsiyonuna etkisi (T:25 C; pH :4) Şekil 5. Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlere albumin adsorpsiyonuna sıcaklığın etkisi (pH= 4.0; c= 0.8 mg/ml) 12 13 Poli(HEMA)-RG kriyojelik Pelletlere Albümin Adsorpsiyonuna İyonik Şiddetin Etkisi NaCl derişiminin albümin adsorpsiyonuna etkisi Şekil 6’da verilmiştir. Şekilden görüleceği üzere, adsorpsiyon kapasitesi artan iyonik şiddetle azalmıştır. Adsorplanan albümin miktarı, NaCl derişiminin 0.01M’dan 0.1’ M’a artmasıyla azalmıştır.Artan iyonik şiddet, immobilize boya moleküllerinin kendi aralarındaki hidrofobik etkileşimleri teşvik eder, bu nedenle proteinle etkileşen boya miktarı azalır ve sonuç olarak matriksin adsorpsiyon kapasitesi düşer. Resim 5: Adsorpsiyon işleminin hazırlık aşaması. Resim 6: Albümin adsorpsiyon koşullarının optimize edilmesi Desorpsiyon ve Tekrar Kullanılabilirlik Desorpsiyon çalışmaları, albümin adsorplanmış poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlerin 0,5M NaSCN çözeltisinde 1 saat süreyle inkübasyonuyla gerçekleştirilmiş ve adsorplanan albümin % 89.2 oranında desorplanmıştır. Poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlerin tekarar kullanılabilirliğini belirlemek için adsorpsiyon çalışmaları aynı pelletle 5 kez tekrarlanmıştır. Şekil 7’den görüleceği üzere adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir düşüş gözlenmemektedir. Bu sonuç, poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlerin, adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir değişim olmaksızın albümin adsorpsiyonunda tekrar tekrar kullanılabileceğini göstermektedir. 13 14 Şekil 6. Artan iyonik şiddetin Albumin adsorpsiyonuna 0 etkisi (T=25 C,pH=4,C=0,8mg/mL) Şekil 7. Poli(HEMA) pelletlerin tekrar kullanılabilirliği 0 (T=25 C,pH=4,C=0,8mg/mL) Biyolojik ligandlarla karşılaştırıldıklarında biyomimetik boya ligandları, yüksek adsorpsiyon kapasitesi, kararlılık, immobilizasyon kolaylığı ve ekonomik olmaları gibi birçok avantaja sahiptirler. Bu nedenle bu çalışmada, poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlere albümin adsorpsiyonu hedeflenmiştir. Maksimum albümin adsorpsiyonu, pH 4.0’da 22.98 mg/g olarak belirlenmiştir. Jinghingtan ve grubu, N-metil-D-Glutamin ile modifiye edilmiş silica jel üzerine albümin adsorpsiyonunu çalışmışlar ve adsorpsiyon kapasitesini 7,46 mg/g olarak bulmuşlardır.[7] Yapılan diğer bir çalışmada, anorganik membranlar üzerine albümin adsorpsiyonu hedeflenmiş ve adsorpsiyon kapasitesi 12mg/g olarak hesaplanmıştır.[8] Literatürdeki söz konusu çalışmalarla kıyaslandığında, sentezlenen poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletlerin adsorplama kapasitelerinin oldukça yüksek olduğu açıkça görülmektedir. Sonuç olarak, poli(HEMA)-RG kriyojelik pelletler, adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir değişim olmaksızın albümin adsorpsiyonunda tekrar tekrar kullanılabilecek uygun adsorban olarak değerlendirilebilir. 14 15 TEŞEKKÜR Çalışmalarımız sırasında bize danışmanlık yapan, bilgi ve deneyimlerini paylaşan Doç. Dr. Nalan Tüzmen ve Yüksek Lisans Öğrencisi Mehmet Antmen’e, kimya öğretmenlerimiz Funda Akdoğan ve Rüçhan Özdamar’a teşekkür ederiz. Ayrıca laboratuar olanaklarından yararlanmamızı sağlayan, gereksinim duyduğumuz cihaz ve malzemelerinin kullanımına izin veren Dokuz Eylül Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümüne teşekkür ederiz. 15 16 KAYNAKLAR [1] Lillehoj, E.P., Malik, V.S.(1982). Protein purification. In::Fiechter A, (Ed.) Advances in Biochemical engineering/biotecnology (20-65). Berlin: Springer-Verlag. Denizli, [2] A., Say, R., Pişkin, E. (1995). Protein A immobilized polyhydroxyethylmethacrylate beads for affinity sorption of human immunoglobulin-G. J.Chromatog, 668:13-9. [3] Choi, S., Choi, E., Kim, D., Kim, J., Kim, T., Oh, W. (2004). A rapid, simple measurement of human albumin in whole blood using a fluorescence immunoassay (I). Clinica Chimica Acta.147–156. [4] Demiryas, N., Tüzmen, N., Galaev, I., Pişkin, E., Denizli, A. (2007). Poly(acrylamide-allyl glycidyl ether) Cryogel as a Novel Stationary Phase in Dye-Affinity Chromatography. Wiley InterScience, 105, 1808–1816. [5] TOPRAK, S., Protein ve enzimlerin ultrafiltrasyon membran ile ayrılma performansına çözelti ve membran özelliklerinin etkisi Ankara üniversitesi bilimsel araştırma kesin raporu, 2004. [6] JINGTIAN HAN , SILCOCK Patrick , MCQUILLAN A. James , BREMER Phil. Bovine serum albumin adsorption on N-methyl-D-glucamine modified colloidal silica. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 349 (2009) 207–213 [7] Hidetaka Kawakita Æ Hiroyasu Masunaga Kanako Nomura Æ Kazuya Uezu Isamu Akiba Æ Satoshi Tsuneda. Adsorption of bovine serum albumin to a polymer brush prepared by atom-transfer radical polymerization in a porous inorganic membrane. J Porous Mater (2007) 14:387–391 DOI 10.1007/s10934-006-9031-0. [8] Denizli, A., Pişkin, E. (2001). Dye-ligand affinity systems. J. Biochemical.Biophys: Methods, 49, 391-416. 16 17 17
