3. GRAM BOYAMA Bakterinin yapısı, içinde üredikleri ortamdan, çok

3. GRAM BOYAMA
Bakterinin yapısı, içinde üredikleri ortamdan, çok az bir refraktif indeksle ayrıldığından,
laboratuvarlarda genel amaçlar için kullanılan ışık mikroskoplarıyla iyi görülmeleri zordur.
Bu yarı geçirgen yapı, ancak boyanarak ve bulundukları yerle olan zıtlıkları artırılarak daha
belirgin hale getirilebilirler. Mikroorganizmalar boyandıktan sonra, mikroskopta kolay
görülebildikleri gibi, büyüklük, şekil, spor, kapsül, hücre içi yapıları hakkında da gerekli
bilgiler elde edilebilir. Ayrıca, boyanma özelliklerine göre de bazı mikroorganizmalar
(mikobakteriler gibi) tanımlanabilirler. Bu nedenle, mikroorganizmaları tanımada, boyama
çok önemli role sahiptir. Bunun için çok özel boyama yöntemleri ortaya konulmuştur.
Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki büyük
gruba (Gram-pozitif, Gram-negatif) ayırmak için kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu
metodu bulan kişi, Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram'dır. Bu metot, 1884 yılında,
pnömokoklar (Streptococcus pneumoniae) ile Klebsiella pneumoniae bakterilerini ayırt
edebilmek için geliştirilmiştir.
Gram pozitif mekanizması olayının bakterilerin hücre çeperi yapısına bağlı olduğu
bilinmektedir. Gram pozitif bakterilerin hücre duvarları gram negatiflerden farklıdır. Gram
pozitif bakterilerde hücre duvarında peptidoglikan katmanı daha kalındır. Bu şekilde tüm
hücre çeperinin %50'si peptidoglikandan ibarettir. Ayrıca çoğunda gram negatiflerde
bulunmayan teikoik asit bulunur. Gram negatiflerin hücre duvarında ise farklı olarak bir
lipopolissakkarit katmanı vardır. Bunlarda peptidoglikan yapı ise daha incedir. Her iki grup
bakteride kristal moru ve lügolün hücre duvarını geçerek hücrenin içine girdikleri, gram
pozitiflerde ise bu boyaların hücre çeperi ile zor ayrılabilen bileşikler yaptığı bilinmektedir.
Gram pozitif bakteri hücre zarı yapısı
Gram negatif bakteri hücre zarı yapısı
2. Gram Boyamada Uygulanan İşlemler
Gram pozitif veya Gram negatif olsun kristal viyole boyası ile tüm bakteriler mor renge
boyanırlar. Ortama eklenen lügol solüsyonu ile Gram pozitif bakterilerin oluşturdukları yapı,
daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa Gram (–) bakterilerin kristal viyole +
lügol karışımları alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya
salınır (dekolorizasyon). Gram (–) negatif bakterilerin, alkolle renkleri gittiğinden, ortama
daha sonra eklenen sulu füksin ile boyanır. Böylece Gram (+) bakteriler mor renkte (kristal
viyole rengi), Gram negatif bakteriler kırmızı - pembe renkte (sulu füksin) boyanırlar. Gram
boyanma özelliği bakteri duvar yapısı ile ilgilidir.
Gram tekniği, mikrobiyolojide çok kullanılan bir boyama yöntemi olup mikroorganizmaların
sınıflandırılması ve tanımlanmasında da yararlanılır. Bu gün uygulanan teknik, ilk kullanılan
Gram (1884) boyasından biraz değişik şekildedir. Fakat hepsinde de esas aynı kalmaktadır.
Laboratuvarda en fazla uygulanan Gram boyama yöntemi şöyledir:
1. Preparatın hazırlanması: Sıvı ya da katı kültürden lam üzerine öze kullanılarak
preparat aktarılır.
2. Lam üzerindeki preparat havada kurutulur ve alevde 3 kez tesbit işlemi gerçekleştirilir.
3. Kristal viyole damlatılır. 1-2 dakika beklenir ve lam su ile yıkanır.
4. Lügol damlatılır. 1-2 dakika beklenir ve su ile yıkanır.
5. %96'lık etil alkol ile renksiz sıvı akana dek renk giderilir. Preparat uygun bir kaptaki
alkol içine de daldırılabilir. Bu işleme dekolorizasyon denir. Sonra preparat hemen su
ile yıkanır.
6. Sulu füksin damlatılır, 30 saniye beklenir. Su ile yıkanır.
7. Kurutma kâğıdı arasında hafifçe bastırılarak kurutulur. 100'lük büyütmeli objektif ile
immersiyon yağı damlatılarak incelenir.
Tablo 1. Gram boyama aşamalarında hücrelerin mikroskopta görünümü.
Gram boyama aşamaları
İlk boyama (Kristal viyole)
Mordant çözeltisi ile muamele (Gram iyot-lügol)
Dekolorizasyon (etil alkol)
Karşıt boya ile boyama (sulu füksin)
Hücrelerin mikroskoptaki
görünümü
Gram pozitif
Gram negatif
Mor
Mor
Mor
Mor
Mor
Renksiz
Mor
Pembe