proje sonuç raporu yazımında

Aminoasitlerin Sıvı Kromatografi-Potansiyometri
Hibrit Analiz Sistemi İle Basit, Hızlı Ve Ekonomik
Olarak Eşzamanlı Tayinleri
Proje No: 110T793
Doç. Dr. Ömer IŞILDAK
Prof. Dr. İbrahim IŞILDAK
MAYIS 2013
TOKAT
I
İÇİNDEKİLER
ŞEKİLLER LİSTESİ……………………………………………………………….
IV
TABLOLAR LİSTESİ……………………………………………………………..
VII
ÖNSÖZ ……………………………………………………..………………………
1
ÖZET…………………………………………………………………….…………..
2
ABSTRACT …………………………………..…………………………………...
3
1. GİRİŞ……………………………………………………………………………..
4
1.1. BİYOSENSÖRLERİN YAPISI VE İŞLEVİ…………………………..……..
5
1.1.1 Biyoaktif Tabaka………………………………………………………………
7
1.1.2 Transduser…………………………………………….……………………….
7
1.1.3. Biyosensörlerin Kullanım Alanları…………………………………………….
8
1.1.4. İdeal Bir Biyosensörün Sahip Olması Gereken Özellikler…………………….
9
1.1.5. Kimyasal Sensörlerin Avantaj ve Dezavantajları……………………………..
11
1.2. ENZİM SENSÖRLERİ……………………….………………………………
12
1.3. ENZİM SENSÖRLERİNİNİN SINIFLANDIRILMASI…………………...
14
1.4. POTANSİYOMETRİK ESASLI ENZİM SENSÖRLERİ…………………
14
1.4.1. Amonyum Duyar Potansiyometrik Enzim Elektrotları………………………..
17
1.4.2. Amonyum Duyar Potansiyometrik Enzim Elektrotlarının Bazı Uygulamaları...
17
1.5. BİYOSENSÖRLERİN PERFORMANSINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER.
18
1.5.1. Cevap Zamanı………………………………………………………………….
18
1.5.2. Tayin Limiti (Ölçümlerin Duyarlılığı)…………………………………………
19
1.5.3. Seçicilik………………………………………………………………………..
19
1.6. ENZİM İMMOBİLİZASYONU………………………………………………
20
1.6.1. Biyoaktif Tabaka İçin İmmobilizasyon Yöntemleri……………………………
21
1.7. KROMATOGRAFİK SİSTEM………………………………………………..
26
1.8. POTANSİYOMETRİK DEDEKSİYON……………………………………...
27
1.8.1. Potansiyometri…………………………………………………………………..
27
1.9. AMİNO ASİTLER………………………………………………………………
28
1.9.1. L-amino Asit Oksidaz…………………………………………………………...
29
1.10. LİTERATÜR BİLGİLERİ…………………………………………………….
30
2. MATERYAL VE YÖNTEM………………………………………………………
38
2.1. MATERYAL………………………………………………………………………
38
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler………………………………………………………..
38
II
2.1.2. Cihazlar……………………………………………………………………….…
38
2.2. METOT…………………………………………………………………………..
39
2.2.1. PVC-NH2 Sentezi……………………………………………………………….
39
2.2.2. Standart Çözeltilerin Hazırlanması………………………………………………
39
2.2.3. Elektrotların Hazırlanması……………………………………………………….
40
2.2.3.1. NH4+-seçici Sensörün Hazırlanması……………………………………………
40
2.2.3.2. Biyosensörlerinin Hazırlanması………………………………………………..
41
2.2.4. Hareketli Ortam Hücresinin Hazırlanması……………………………………….
42
2.2.5. İyon Kromatografik Çalışmalar………………………………………………….
43
2.2.6. Potansiyometrik Tayin Prensibi………………………………………………….
44
2.2.7 Elektrotların Seçicilik hesaplamaları……………………………………………..
45
3. BULGULAR VE TARTIŞMA……………………………………………….…….
46
3. 1. KOMPOZİT NH4+-SEÇİCİ ELEKTROTUN POTANSİYOMETRİK
PERFORMANSI………………………………………………………………….
46
3.2. L-AMİNO ASİT OKSİDAZ (L-AAO) ENZİMİNİN, NH4+ ELEKTRODU
YÜZEYİNDE İMMOBİLİZASYONU……………............................………….
56
3.3. AMİNOASİT BİYOSENSÖRLERİN POTANSİYOMETRİK
DAVRANIŞLARI………………………………………………………………..
59
3.3.1. Biyosensörün deiyonize suda hazırlanan amino asit çözeltilerine karşı potansiyel
Davranışları………………………………………………………………………….
59
3.3.2. Biyosensörün pH’sı 7,02 olan fosfat tamponunda hazırlanan amino asit
çözeltilerine karşı potansiyel davranışları…………………………………………… 65
3.3.3 Aminoasit biyosensörün farklı pH’lardaki Amino asit çözeltilerine karşı davranışları 69
3.4. AKIŞ ENJEKSİYON ANALİZ ÇALIŞMALARI………………………………
74
3.5. İYON KROMATOGRAFİK ÇALIŞMALAR…………………………………..
75
3.5.1. Örneklerde Amino Asit Analiz Sonuçları…………………………………………. 85
KAYNAKLAR…………………………………………………………………………..
III
89
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil................................................................................................................................... Sayfa
1.1. Biyosensörün şematik görünümü….........................................................................
5
1.2. Genel biyosensör ve bileşenleri…………………………………………………….
7
1.3. Enzim sensörünün genel görünümü………………………………………………..
12
1.4. Enzim sensörünün genel çalışma ilkesi ………..………………………………….
13
1.5. Potansiyometrik ölçüm sisteminin şematik olarak gösterimi ……………………..
15
1.6. IUPAC’a göre biyosensörün cevap zamanı……..…………………………….……
18
1.7. Enzim molekülünün glutaraldehid ile çapraz bağlanması........................................
25
1.8. Bazı bifonksiyonel reaktiflerin kimyasal formülleri ………..……………………..
25
1.9. Kromatografik sisteminin şematik gösterimi….………………………………..…… 26
1.10. Potansiyometrik sistem ……………………………………………………………. 28
1.11. Aminoasitlerin genel gösterimi ……………………………………………………. 28
1.12. L- Amino asitlerin, L-Amino asit oksidaz (L-AAO) tarafından katalizlenmesi…… 30
1.13. Çoklu mikro sensör ve flow-through akış hücreleri………………………………… 31
1.14. Bazı amino asitlerin yükseltgenme ürünleri ve piruvik asidin yükseltgenmesi…..... 35
1.15. Elektrokimyasal bi-enzim protein sensör için enzimatik reaksiyon prosesi………… 36
1.16. Sensör cevabına proteaz enzim aktivitesinin etkisi………………………………… 36
2.1. Katı hal NH4+-seçici sensör ……………………………………………………..…... 40
2.2. Katı-hal NH4+-seçici sensör yüzeyine L-AAO enziminin tek adımda tutturulması…. 41
2.3. Kompozit yapıda aminoasit biyosensör …………………………………………….. 42
2.4. Mikrolitre ölü hacime sahip 2 aminoasit biyosensör içeren akış hücresi…………….. 43
2.5. Aminoasit tayininde kullanılan iyon kromatografi-potansiyometri hibrit sistem…….. 43
2.6. Seçicilik katsayısının kalibrasyon grafiği ile gösterimi .…………………………….. 45
3.1. Katı hal NH4+-seçici sensor…………………………………………………….…… 46
3.2. Kompozit 1 membranlı NH4+ seçici elektrotun potansiyometrik davranışı………….. 48
3.3. Kompozit 2 membranlı NH4+ seçici elektrotun potansiyometrik davranışı………….. 48
3.4. Kompozit 3 membranlı NH4+ seçici elektrotun potansiyometrik davranışı………….. 49
3.5. kompozit 1-2-3 membranlarının kalibrasyon grafiği …………………….………..… 50
3.6. Kompozit 3 no’ lu NH4+ seçici elektrotun kalibrasyon grafiği………………………. 50
3.7. NH4+ elektrotun Ca2+ iyonuna karşı potansiyometrik davranışı…………………….. 51
3.8. NH4+ elektrotun K+ iyonuna karşı potansiyometrik davranışı……………………….. 52
3.9. NH4+ elektrotun Na+ iyonuna karşı potansiyometrik davranışı………………………. 52
IV
3.10. NH4+ -seçici elektrotun NH4+, Ca2+, K+ ve Na+ derişimlerine karşı
potansiyometrik davranışı….………………………………………………………
54
+
3.11. NH4 -seçici elektrotun tekrarlanabilirliği………………………………………….. 55
3.12. NH4+-seçici elektrotun pH çalışma aralığı ……………………….………………..
55
3.13. NH4+- seçici elektrotun kullanım ömrü…………………………………………….. 56
3.14. Enzim molekülü ile glutaraldehit molekülünün bağlanması .…………….……….
57
3.15. Amonyum elektrotunun yüzeyine, glutaraldehit ile bağlanmış enzim
molekülünün (L-AAO) tutturulması……………………………………………….
58
3.16. Enzim-Gluteraldehit çözeltisine daldırılarak hazırlanan bir biyosensör…………… 58
3.17. Biyosensörün şematik gösterimi……………………………………………………. 59
3.18. Elektrotun 10-1 – 10-5 M çözeltilerde alanine karşı potansiyometrik davranışı…….. 59
3.19. Elektrotun 10-1 – 10-5 M seri çözeltilerde glisine karşı potansiyometrik davranışı…. 60
3.20. Elektrotun 10-1 – 10-4 M seri çözeltilerde izolösine karşı potansiyometrik davranışı.. 60
3.21. Elektrotun 10-1 – 10-5 M seri çözeltilerde triptofan karşı potansiyometrik davranışı.. 61
3.22. Elektrotun 10-1–10-5 M seri çözeltilerde fenilalanine karşı potansiyometrik davranışı 61
3.23. Elektrotun 10-1 – 10-4 M seri çözeltilerde trozine karşı potansiyometrik davranışı…. 62
3.24. Elektrotun 10-1 – 10-5 M seri çözeltilerde valine karşı potansiyometrik davranışı…. 62
3.25. Deiyonize su içerisinde, değisik konsantrasyonlardaki, Ala, Gln, Ile, Trp, Phe,
Tyr, ve Val amino asitleri için kalibrasyon grafiği…………………………………. 64
3.26. Amino asit Biyosensörünün, alaninin 10-1 – 10-5 M’lık çözeltilerindeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)………………………………………………… 65
3.27. Amino asit Biyosensörünün, lisinin 10-2 – 10-5 M’lık çözeltilerindeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)………………………………………………… 65
3.28. Amino asit Biyosensörünün, fenilalanin10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)…………………………………………………. 66
3.29. Amino asit Biyosensörünün, histidinin 10-1 – 10-5 M’lık çözeltilerinde
potansiyometrik davranış (pH: 7,2)………………………………………………….. 66
3.30. Amino asit Biyosensörünün, glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerdeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)………………………………………………… 67
3.31. Amino asit Biyosensörünün, glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık
çözeltilerdeki potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)…………………………………. 67
3.32. Fosfat tamponu ortamında Ala, Lys, Phe, His, Gly, Glu amino asitlerinin
konsantrasyon değişimlerine karşı biyosensörün potansiyometrik davranışı………. 69
V
3.33. Sensörün pH: 6’da arjininin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı……………. 70
3.34. Sensörün pH: 7,2’de arjininin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı…………... 70
3.35. Sensörün pH: 8’de arjininin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı…………….. 70
3.36. Sensörün pH: 6’da glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı……………… 71
3.37. Sensörün pH: 7,2’de glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı…………… 71
3.38. Sensörün pH: 8’de glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı…………….. 71
3.39. Sensörün pH: 6’da glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı…….. 72
3.40. Sensörün pH: 7,2’de glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı…… 72
3.41. Sensörün pH: 8’de glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı……… 72
3.42. Biyosensörün, fosfat tamponunda (pH= 7,2) hazırlanan amino asit
konsantrasyon değişimlerine karşı potansiyometrik davranışı……………………… 73
3.43. Mikrolitre ölü hacime sahip 2 aminoasit biyosensör içeren akış hücresi…………… 74
3.44. Akış enjeksiyon analiz sisteminde aminoasit duyarlı biyosensörün fenilalaninin
farklı konsantrasyonalarına karşı potansiyometrik cevabı……………………………75
3.45. Aminoasit tayininde kullanılan iyon kromatografi-potansiyometri hibrit sistem……. 76
3.46. Lösin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı……………………… 77
3.47. Alanin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı……………………..
77
3.48. Glisin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı……………………….. 78
3.49. Valin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı……………………….. 78
3.50. İzolösin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı…………………….. 79
3.51. Triptofan için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı………………….. 79
3.52. Fenilalanin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı………………….. 80
3.53. Sistin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı……………………….. 80
3.54. Trozin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı……………………….. 81
3.55. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı…………………………………… 81
3.56. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı…………………………………… 82
3.57. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı…………………….……….…….. 82
3.58. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı………….……………………….. 83
3.59. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı ……………………..…………..
83
3.60. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı………….………………………. 84
VI
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo..................................................................................................................................Sayfa
1 1. Biyosensörlerin uygulama alanları…………………………………..........................
8
1 2. Enzim Sensörlerinin Sınıflandırılması……………………………………………….. 14
1.3. Çeşitli enzimlerin katalizör olarak kullanıldığı potansiyometrik sensörler …………. 17
1.4. Enzim immobilizasyonun da kullanılan maddelerde bulunan reaktif gruplar ve
reaksiyona girdikleri amino asitlerin fonksiyonel grupları……………………………. 23
1.5. Enzimlerin kovalent bağlama ile immobilizasyonun da bağ oluşumuna katılan
amino asitlerin reaktif grupları……………………………………………………….. 23
1.6. Esensiyal ve esensiyal olmayan aminoasitler………………………………………… 29
3. 1. Kompozit 1,2 ve 3 membranları için kimyasal bileşim oranları…………………….. 47
3.2. Farklı kompozisyonlarda hazırlanan amonyum elektrotların değişen
NH4+ konsantrasyonlarına karsı elde edilen potansiyel değerleri……………………. 49
3.3. NH4+ elektrotun K+, Na+, Ca2+ iyonlarının konsantrasyonlarına karsı elde edilen
ortalama mV potansiyel değerleri……………………………………………………. 53
3. 4. NH4+ seçici elektrotun Na+, K+ ve Ca2+ yanında seçicilik katsayıları……………….. 53
3.5. Aminoasit biyosensörünün aminoasitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı elde
edilen ortalama mV potansiyel değerleri…………………………………………….. 64
3.6. Fosfat tamponunda hazırlanan amino asitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı
elde edilen ortalama mV potansiyel değerleri………………………………………… 68
3.7. Fosfat tamponunda (pH= 7) hazırlanan konsantrasyon değişimlerine karşı elde
edilen ortalama mV potansiyel değerleri…………………………………………….. 73
3.8. Amino asitlerin geliştirilen iyon kromatografik yöntemde alıkonma zamanları
ve tayin sınırları……………………………………………………………………… 85
3.9. Konsantre meyve suyu, hamur mayası ve kuru fasülye örneklerindeki
amino asitlerin miktarları……………………………………………………………… 87
3.10. Standart ilavesi yapılarak elde edilen konsantre meyve suyu, hamur mayası
ve kuru fasülye örneklerindeki amino asitlerin miktarları……………………………. 87
3.11. Meyve suyu, hamur mayası ve kuru fasulye ekstraktlarında toplam
amino asit miktarları…………………………………………………………………. 88
VII
ÖNSÖZ
Bu çalışma kapsamında, mikro boyutlarda amino asitlere duyarlı potansiyometrik
biyosensörlerin
geliştirilmesi
ve
bu
sensörlerin
kromatografide
dedektör
olarak
uygulanmasıyla biyolojik öneme sahip bu maddelerin etkili bir şekilde basit ve ekonomik
olarak tayinlerinin gerçekleştirilmesi sağlanmıştır. Amino asit duyarlı biyosensörler üzerine
çalışmalara literatürde rastlanmaktadır. Ancak bu biyosensörlerin bütünü klasik NH4+ seçici
sensörler kullanılarak hazırlanmıştır. Çalışmada planalanan mikro boyutlarda potansiyometrik
amino asit duyarlı biyosensörler, mikro boyutlarda kompozit pH ve NH4+ seçici sensörler
kullanılarak hazırlandığından dünyada ilk kez geliştirilmiş bir yöntemdir. Serbest amino
asitlerin eşzamanlı tayini amacıyla, amino asit duyarlı biyosensörlerin ve flow-through akış
hücrelerin sıvı kromatografide dedektör olarak uygulanmasına yönelik herhangi bir çalışmaya
ise literatürde rastlanmamıştır. Bu nedenle yapılan bu çalışmada geliştirilen sensörlerin, flowthrough akış hücrelerin ve bu sensörlere dayalı kromatografi-potansiyometri hibrit serbest
amino asit tayin sistemin bütünüyle özgün değer taşıdıkları düşünülmektedir.
Bu çalışmayla sıvı kromatografi-potansiyometri hibrit sistem ile basit, ekonomik, duyarlı,
hızlı ve eşzamanlı serbest amino asit tayin yöntemlerinin geliştirilmesi sağlanmıştır. Yapılan
çalışmalardan elde edilen sonuçların literatüre, bilime, sıvı kromatografik analiz teknolojisine
önemli katkı sağlayacağı ve patentlenebilir nitelikte olacağı düşüncesindeyiz.
Bu proje çalışmasının mali desteği TÜBİTAK tarafından sağlanmıştır. TÜBİTAK’a bu
katkılarından dolayı teşekkür ederiz.
1
ÖZET
Serbest amino asitlerin eşzamanlı olarak tayinleri sıvı kromatografik yöntemler
kullanılarak sağlanabilmektedir. Ancak geliştirilen yöntemlerin çoğu pahalı ve zaman alıcı
(post-column veya pre-column işlemler) veya yeterli duyarlılık ve seçicilik sergilememektedir.
Planladığımız bu proje çalışmasında, mikro boyutlarda kompozit pH ve NH4+ -seçici
sensörlerin hazırlanmasını, hazırlanan mikro boyutlarda kompozit pH ve NH4+ -seçici
sensörler kullanılarak yeni tip amino asit duyarlı potansiyometrik biyosensörlerin
geliştirilmesini, sıvı kromatografide (LC) dedektör olarak kullanılmasını ve biyolojik sıvı ve
gıdalarda amino asitlerin eşzamanlı tayinlerini hedefledik. Hazırladığımız mikro boyutlarda
amino asit duyarlı biyosensörlerin kompozit yapıda olması, mikrolitre ölü hacme sahip flowthrough akış-hücrelerinin hazırlanmasına ve serbest aminositlerin etkili tayini için LC de
dedektör olarak kullanılmasına izin vermektedir.
Proje kapsamında potansiyometri ve kromatografi gibi temel elektrokimyasal ve
analitik tekniklerin, bu tekniklere ilave olarak akış-enjeksiyon analiz ve immobilizasyon gibi
anlaşılması zor kimyasal metotların ve bir çok diğer kimyasal işlemlerin varlığı, açığa
kavuşturulmuştur. Daha da önemlisi geliştirilen sensörlerin (pH ve NH4+ duyarlı) ve
biyosensörlerin (amino asit duyarlı) ve ölçüm sistemlerinin ekonomik olması, bu tür
sensörlerin öğrenci laboratuarlarında uygulama bulmasını sağlayacak ve deneye dayalı eğitime
katkıda bulunacaktır.
Anahtar Sözcükler: potansiyometrik deteksiyon, aminoasit duyarlı biyosensörler, sıvı
kromatografi, aminoasitlerin tayini
2
ABSTRACT
Free aminoacids can be analysed simultaneously by liquid chromatographic techniques
(LC). However all developed methods based on LC are expensive, time consuming due to
pre-and post column reaction, and also not very selective and sensitive.
Under the planned project study, we have purposed to develop micro sized
potentiometric pH and NH4+ -selective sensors by using a composite material first time
produced in our laboratories. Later on, micro sized aminoacid sensitive biosensors will be
prepared by using the sensors it self, pH or NH4+ -selective sensor. Because micro sized
sensors will be developed in the present project study proposed are composite material, the
fabrication of flow-through cells in nano-liter dead volume can be produced for the use as
detectors in LC of free amino acids that could be efficiently determined.
During the project study, techniques such as potentiometry and chromatography,
which are very important modern electrochemical and analytical methods, in addition, flowinjection analysis, and enzyme immobilization methods, which are complex and difficult for
the undergraduate was, understood all above techniques and methods. More important, the
sensors (pH and NH4+ selective) and biosensors (aminoacid sensitive) developed under the
project study which would be very economic and mass-producible easily can be deployed for
practical education in the analytical, electrochemical and biochemical student laboratories to
obtain more efficient teaching and learning.
Keywords: potentiometric detection, aminoacid sensitive biosensors, liquid chromatography,
determination of amino acids
3
1. GİRİŞ
Genelde biyosensörler; kimya, biyokimya, biyoloji, mühendislik gibi pek çok bilim
alanının bilgi birikiminden yararlanılarak, kimyasal ve biyolojik moleküllerin veya sistemlerin
seçicilik özellikleri ile modern elektronik tekniklerin işlem yeteneğinin birleştirilmesiyle
geliştirilen analitik/biyoanalitik aygıtlar olarak tanımlanabilir. Günümüzdeki bilimsel ve
teknik ilerlemeler, biyosensör teknolojisinde önemli gelişmelere yol açarak biyoteknoloji,
yiyecek, çevre, farmasi ve klinik teşhis gibi alanlarda yaygın olarak kulanılmasına neden
olmuştur. Uygulamaların önemli bir kısmında kuartz kristal mikrobalans, surface plasmon
resonance, elektrooptik ve elektrokimyasal algılama teknikleri kullanılarak sensör yüzeyinde
biyo veya immüno reaksiyonun direkt takibi sağlanmaya çalışılmıştır. Sensör teknolojisindeki
yeni gelişmeler ile birlikte, basit ve ekonomik ölçüm sistemlerine duyulan gereksinim,
elektrokimyasal biyosensör sistemler üzerine çalışmalarda da hızla artışa neden olmuştur.
Elektrokimyasal biyosensörler, genellikle enzimin (biyosensörler için), antikor veya antijenin
(immünosensörler
için)
bir
transdüser
elektrot
yüzeyine
immobilizasyonu
sonucu
üretilmektedir. İmmobilizasyon; adsorbsiyon, kovalent bağlanma, polimerlere tutuklanma gibi
yollarla yapılabilmektedir. Biyolojik moleküllerin immobilizasyonu ve transdüşer elektrot
membran ara yüzey teknolojisinin tasarımı, elektrokimyasal sensör sistemlerde anahtar rol
oynamaktadır. Bu nedenle elektrokimyasal sistemlerde, etkili bir algılama amacıyla,
araştırmalar yeni immobilizasyon yöntemler üzerine yoğunlaşmıştır. Spesifik enzim-substrat
reaksiyonlarını temel alan elektrokimyasal biyosensör sistemler; minyatürize olabilme,
ekonomik, taşınabilir, özel türlere karşı seçici ve yüksek duyarlılık sergileme gibi önemli
özelliklere sahiptirler. Mevcut proje çalışması, mikro boyutlarda amino asit duyarlı
biyosensörlerin geliştirilmesini ve sıvı kromatografik sistemde dedektör gibi kullanılmasını
konu almaktadır. Proje kapsamında hazırlanan amino asitlere duyarlı mikro boyutlarda
biyosensörler iç referans elektrot ve iç referans çözelti içermemektedir. Hazırlanan amino asit
duyarlı biyosensörlerin potansiyometrik performansları (seçicilik sabitleri, doğrusal çalışma
aralığı, tayin limiti, cevap süresi, pH çalışma aralığı, tekrarlanabilirliği, kullanım ömrü ve
zamanla oluşan potansiyelde kayma) bilgisayar kontrollü ölçüm sistemi ile statik ve dinamik
şartlar belirlenmiştir.
Kromatografik sistemde dedektör olarak kullanılan minyatürize flow-through akış
hücreleri 1 cm uzunluğu ve genişliğinde bir polikarbonat malzeme bloğunda oluşturulmuştur.
Polikarbonat blok, mikro boyutlarda amino asit duyarlı biyosensörle beraber, mikro
4
boyutlarda polimer jel Ag/AgCl referans elektrot içermrktedir. Yüksek performansa sahip
mikro boyutlarda polimer jel Ag/AgCl referans elektrot Prof. Dr. İbrahim Işıldak tarafından
geliştirilmiştir. Hazırlanan minyatürize akış hücre veya hücreler bir akış enjeksiyon analiz
sisteminde test edilmiştir.
Genel anlamda biyosensörler; biyoloji, kimya, biyokimya, mühendislik gibi pek çok
bilim alanının bilgi birikiminden yararlanılarak biyolojik moleküllerin veya sistemlerin
seçicilik özellikleri ile modern elektronik tekniklerin işlem yeteneğinin birleştirilmesi sonucu
geliştirilen biyoanalitik cihazlar olarak tanımlanabilir. Son yıllarda bilim ve teknolojideki hızlı
gelişmeler biyosensör kavram ve tanımlarında da önemli genişlemelere yol açmıştır.
(Spichiger-Keller, 1998)
Biyosensörler genel olarak analiz edilecek madde ile seçimli bir şekilde etkileşime
giren biyoaktif bir bileşenin bu etkileşme sonucu ortaya çıkan sinyali ileten bir iletici sistemle
birleştirilmesi ve bunların bir ölçüm sistemiyle kombinasyonuyla oluşturulurlar. Sistemin
özelliğine bağlı olarak yükseltici, mikroişlemci, dijital görüntüleyici gibi kısımlar sistem
içinde yer almaktadır. Şekil 1.1’de bir biyosensör şematik olarak gösterimektedir.
Ölçüm Cihazı
Bakır Elektrot (İletici)
Biyoaktif Tabaka
Analit
Şekil 1.1. Biyosensörün şematik görünümü
Her bir canlı türü mükemmel biyosensörler sahibi olarak yaratılmıştır. Mesela beş
duyumuz; görme, işitme, dokunma, koklama ve tat almamız yine alıcılar tarafından hissedilen
verilerin kimyasal ve elektriksel sinyallere dönüştürülüp, beynin değerlendirilmesine
sunulmasıdır. Modern teknolojinin bir ürünü olan biyosensörler ile bir ya da birkaç molekülü
tanımaya, algılamaya çalışırken, bir yandan gözleriniz dergiye bakıp her an sinyalleri beyne
5
gönderiyor; diğer yandan kulağınız radyodan gelen hafif müziğin sinyallerini göndermekle
meşgul; derginin sayfalarını hisseden parmaklarınız sinirlere uyarılar veriyorlar; burnunuz
bardaktaki meyve çayını koklamak ve yine uyarıları beyne göndermekle meşgul; öteki yanda
antikorlarınız yabancı madde avında ve buldukları anda gereken bilgileri beyne gönderip
savunma mekanizmasını harekete geçirmeye çalışıyorlar.
Günümüzde görme, işitme gibi yeteneklerini kaybetmiş kişilerin bu yeteneklerini
tekrar yerine koyacak yapay sistemler üzerine yoğun araştırmalar yapılmaktadır (Gerard ve
Ark 2002). Bununla birlikte, biyosensörden bahsedilince ilk olarak daha genel ve yaygın
kullanım imkânına sahip, analiz amacına yönelik ve ticari olarak üretim imkânı bulmuş biyoanalitik sistemler akla gelmektedir.
Biyosensör teknolojisinin tarihsel geçmişine bakıldığında bu alandaki ilk çalışmaların
enzim sensörleriyle başladığı görülmektedir. 1962 yılında Clark ve Lyons Glikoz Oksidaz
(GOD) enzimini O2 elektrotu ile birleştirerek kanın glikoz düzeyini ölçmeyi başarmışlardır
(Clark ve Lyons, 1962). Günümüze kadar da bu alandaki çalışmalarla oluşturulan bu yeni
analitik sistemlerle, bir yandan biyolojik sistemin(enzim) yüksek seçiciliği ile diğer taraftan
fiziksel sistemin(sensör) tayin duyarlılığın birleştirilmiş olmasından dolayı birçok biyolojik
parametrenin tayinine yönelik çeşitli tipte biyosensörler geliştirildi. Biyosensörlerin yüksek bir
seçiciliğe sahip olmaları yanında, renkli ve bulanık çözeltilerde geniş bir konsantrasyon
aralığında doğrudan ölçüm yapmak gibi üstünlükleri de vardır (Telefoncu, 1999).
1.1.
BİYOSENSÖRLERİN YAPISI VE İŞLEVİ
Biyosensörler, genel anlamda analizlenecek madde ile seçimli bir şekilde etkileşime
giren biyoaktif bir bileşen (biyokomponent)’in, bu etkileşim sonucu ortaya çıkan sinyali ileten
bir iletici sistem(transduser-elektrot)’le ve bunların da bir ölçüm sistemiyle birleştirilmesiyle
oluşturulabilir (Şekil 1.2).
6
Şekil 1.2. Genel biyosensör ve bileşenleri
1.1.1 Biyoaktif Tabaka
Biyosensörlerin yapısında yer alan biyoaktif tabaka, biyoreseptör, biyokomponent gibi
isimlerle de adlandırılır. Enzimler mikroorganizmalar, organeller, doku kesitleri, antikorlar,
nükleik asitler ve biyolojik
membranlar içine yerleştirilmiş kimyasal reseptörler
biyokomponent olarak kullanılırlar. Bunların içinde biyoaktif tabaka da en yaygın kullanılan
biyokomponent türü enzimlerdir. Enzim-substrat etkileşiminin ilk adımı analitlerin protein
moleküllerine bağlanmasıdır. Dönüşüme uğrayan analitteki değişimler transduser tarafından
algılanır ve sinyale dönüştürülür. Bu sinyaller elektronik devreler aracılığıyla kaydediciye
iletilir.(Telefoncu, 1999).
1.1.2 Transduser
Transduserler(çevirici-elektrot), biyoaktif tabakanın biyolojik reaksiyonunu ölçülebilir
fiziksel bir sinyale dönüştürürler. Biyokimyasal reaksiyonun özelliğine göre transduserler
kullanılır. Amperometrik ve potansiyometrik ölçümlerde kullanılan elektrotları örnek olarak
verebiliriz. Bu elektrotlarda amaç; O2 elektrotunda çözünmüş O2’ ni, pH elektrotunda H+
iyonunu ölçmektir. Optik sensörlerde hedef; ışık, pieozoelektrik sensörlerde ise kristalin
salınım rezonansının kütle yüklenimi sebebiyle değişmesidir. Bunların dışında transistörler ve
termistörler de transduser olarak kullanılmaktadır (Turna, 2006).
7
1.1.3. Biyosensörlerin Kullanım Alanları
Biyosensörlerin kullanım alanları incelendiğinde, ilaç, gıda, tarım endüstrisinde,
kimyasal ölçümlerde, savunma faaliyetlerinde, çevre analizleri ve kontrolleri gibi pek çok
alanda uygulama imkanı bulduğu görülür. Biyosensörler, klinik biyokimya ve tıbbi analizlerde
eşzamanlı hücre içi (in vivo) olayların izlenmesinde, biyolojik ve sentetik süreçlerin
eşzamanlı hücre dışı (in vitro) incelenmesinde kullanılmaktadır (Schugerl ve ark., 2001).
Tablo 1.1’ de biyosensörlerin kullanıldığı alanlar görülmektedir.
Tablo 1 1. Biyosensörlerin uygulama alanları.
Klinik diyagnostik, biyomedikal sektör
Proses kontrol
Biyoreaktör kontrolü
Gıda üretim ve Analizi
Tarla tarımı, bağ bahçe tarımı ve veterinerlik
Bakteriyel ve viral diyagnostik
İlaç analizi
Endüstriyel atık kontrolü
Çevre koruma ve kirlilik kontrolü
Maden işletmelerinde toksik gaz analizi
Askeri uygulamalar
Biyosensör pazarında üretimin % 90’dan fazlasının tıp alanında kullanıldığı ve bunun da
ağırlıklı olarak glikoz tayinine yönelik enzim esaslı biyosensörlerden oluştuğu görülmektedir
(Spencer, 1986). Bu konuya olan ilginin iki önemli sebebi; şeker hastalığının yaygın olması ve
tasarlanan sistemlerin uygun olmasıdır. Doğal olarak, son yıllardaki bilimsel ve teknolojik
gelişmeler diğer bazı biyosensör türlerinin de bu pazarda paylarının hızlı bir şekilde artmasına
yol açacaktır. Ancak enzimlerin çok yüksek sayı ve çeşitliliği, çok farklı kullanım alan ve
amaçlarında yararlanılabilir olmaları bu pazarda egemenliğin enzim esaslı biyosensörlerde
olması sonucuna götürmektedir (Turna, 2006; Alberade-Sirvent ve ark., 2001).
Biyosensörlerin, ilaçların vücuttaki düzeylerinin ayarlanması ve kontrolünde
kullanılması yakın bir gelecekte gerçekleştirilebilecektir. Biyosensörlerin gelecekte önemli
uygulamalarından biri de süper oksit ve nitrik oksit gibi kısa ömürlü, hormonlar ve
8
nörotransmitterler gibi düşük konsantrasyonlu maddelerin in vivo tayinidir. İnsan vücuduna
yerleştirilebilen biyosensörler de geliştirilmiş olup bunlar biyolojik sıvılar vücut dışına
alınmadan ve tüketilmeden analiz imkânı verirler ki, özellikle ameliyat sırasında bu bilgilerin
kesintisiz sağlanması çok önemlidir (Turna, 2006).
Biyoteknoloji ve gıda endüstrisinde başta glikoz olmak üzere birçok monosakkarit,
aminoasitler, organik asitler(laktik asit), üre ve alkol tayinlerinde enzim sensörleri
kullanılmaktadır. Ayrıca gıdalardaki yabancı maddeler (pestisitler, toksinler ve yabancı
hormonlar vb.) yanında aroma ve tazelik gibi kompleks parametreler için de biyosensörler
hazırlanabilmektedir. İlaçların kötü amaçla kullanımı ve uyuşturucu ile mücadelede
biyosensörler kullanılabilecektir. Uyuşturucu arayan köpeklerin yerini biyosensörler alabilir.
Böylece özellikle gümrüklerde, karakollarda zaman kazanılacaktır. Toprak, hava ve su
kirliliğinin kontrolünde mikrobiyal sensörler ve enzim sensörleri kullanılmaktadır (Telefoncu,
1999).
1.1.4. İdeal Bir Biyosensörün Sahip Olması Gereken Özellikler
Seçicilik: İdeal bir biyosensörde en önemli parametrelerden birisi seçicilik özelliğidir. Eğer
yeterli seçicilik mevcut değilse bu eksiği giderecek uzun ek işlemler gerekir.
Kullanım Ömrü: Biyosensörün kullanım ömrünü kısıtlayan en önemli faktör biyolojik
çeviricinin aktivitesindeki azalmadır. Bu durum ayrıca, biyosensörün kalibrasyon sıklığı,
stabilite, tekrarlanabilirlik gibi diğer parametrelerini de etkilemektedir.
Kalibrasyon Gereksinmesi: İdeal bir biyosensörün hiç kalibrasyona gerek duymaması ya da en
az kalibrasyona gereksinmesi istenir. Fakat bu özellik, teorikte planladığı gibi, pratikte
gerçekleştirilememiştir.
Kullanım
ömürleri
boyunca
biyosensörler,
sıklıkla
kalibre
edilmelidirler.
Tekrarlanabilirlik: İdeal bir biyosensör için, elektrotun aynı koşullar altında arka arkaya
yapılan ölçümlerde hemen hemen aynı sonuçların okunması istenir. Pratikte pek mümkün
olmayan bu durum göz önüne alınarak yapılan çalışmalarda tekrarlanabilirlik parametresi
9
mutlaka incelenmelidir. Tekrarlanabilirlik ne kadar iyi olursa biyosensörün uygulamalarının
da o denli iyi olduğundan söz edilebilir.
Stabilite: Elektrot stabilitesinin (kararlılığının) yüksek olması ideal biyosensörler için
gereklidir. Stabilite, kullanılan biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığına bağlıdır. Ayrıca;
pH, ısı, nem, ortam, O2 derişimi gibi parametrelerden de etkilenmektedir.
Yüksek Duyarlılık: Biyosensöre immobilize edilmiş biyolojik materyalin yalnız belirli
maddelere karsı duyarlı olması ideal biyosensörlerin özelliklerindendir.
Tayin Sınırı: Tasarlanan bir biyosensörün tayin sınırının belirli bir derişim değerinin altında
olması gerekmektedir. İstenen bu sınır, elektrot yüzeyinin büyüklüğü, biyolojik materyalin
tayin edilecek maddeye afinitesi, immobilize edilen madde miktarı gibi faktörlerden etkilenir.
Ölçüm Aralığı: Biyosensör uygulamalarında ölçüm aralığı olarak adlandırılan bölge
biyosensörlerden alınan akım - derişim eğrilerinin lineer olduğu derişim aralığıdır.
Hızlı Cevap Zamanı: Bir biyosensör elektrotunun cevap zamanı elde edilen akım-zaman
eğrilerinden anlaşılabilir. Örneğin elde edilen eğride basamakların sekli yayvan ve genişse
cevap zamanı uzun (yavaş), tersi söz konusu ise cevap zamanı kısadır.
Hızlı Geriye Dönme Zamanı: Geriye dönme zamanı örneğin amperometrik çalışmalarda ilk
örnekten ne kadar süre sonra ikinci örneğin ölçülebileceğini belirler. Yani ilk örneğin
ilavesinden sonra sabit akım değerleri kısa sürede gözlenebiliyorsa ikinci örnek de aynı süre
sonra ilave edilebilecektir.
Basitlik ve Ucuzluk: Tasarımı basit ve ucuz, kullanımı rahat biyosensörler ideal
biyosensörlerdir. Bu nedenle ilk biyosensörlerdeki karmaşık ve de pahalı olan yapılar daha
sonra basitleştirilmiş ve mümkün olduğunca da maliyeti düşürülmüştür.
Küçültülebilirlik ve Sterilize edilebilirlik: Elektrotlarının sterilize edilebilmesi ve boyutlarının
küçültülmesi biyosensör tasarımında önemlidir. Buna karsın, biyosensör yapısına giren
biyolojik materyalin fiziksel dayanıklılığı, sterilizasyonu kısıtlayan en önemli parametredir.
10
1.1.5. Kimyasal Sensörlerin Avantaj ve Dezavantajları
- Elektrotlar, pek çok kimyasal tür için geniş bir konsantrasyon aralığında doğrusal olarak
değişim gösterirler.
- Elektrotlar sadece iyon aktivitesine duyarlı olmalarına rağmen, titrasyon, standart ekleme
gibi metotlar vasıtasıyla serbest iyon veya toplam konsantrasyon tayinlerinde de
kullanılabilirler.
- Elektrotların kullanımı kolay olup ölçüm sırasında numuneye zarar vermezler. Sadece ihmal
edilebilir ölçüde numuneyi kirletirler. Bu sayede küçük ve tek bir örnek üzerinde defalarca
tayin yapılması gereken biyolojik uygulamalarda kullanılabilmektedirler.
- Elektrotların cevap süreleri genellikle kısadır (saniye ve dakika seviyelerinde). Bu nedenle
klinik ve endüstriyel numunelerin tayininde kullanılırlar.
- Spektrofotometrik ölçümlere uygun olmayan, koyu renkli ve bulanık çözeltiler elektrotlarla
kolaylıkla ölçülebilirler. Bu nedenle birçok kez numuneye ön işlem yapmak gerekmez.
Böylece süzme ve destilasyon gibi zaman kaybına neden olan işlemlere gerek kalmaz.
- Özel olarak hazırlanan elektrotlar ile canlı hücrelerin içi gibi değişik yollarla ulaşılamayan
zor ortamlarda ölçüm yapılabilir.
- Elektrotlar, kromatografik ve akış yolu enjeksiyonu analiz yöntemlerinde detektör olarak
kullanılabilirler.
Bu avantajlarının yanı sıra elektrotların bazı dezavantajları da vardır;
- Elektrotlarla çalışılırken olumlu sonuç elde edebilmek için çok dikkatli olmak gerekir.
- İyon seçici elektrotlarla yapılan ölçümlerin kesinliği nadiren % l‘ den daha iyi olup,
genellikle daha düşüktür.
- Elektrotlar, potansiyellerin kararsız olmasına ve kaymasına yol açacak şekilde, proteinler ve
diğer organik maddeler vasıtasıyla kirlenebilirler.
- Bazı iyonik türler girişim yapabilir veya elektrotları zehirleyebilir.
- Elektrotların periyodik olarak şartlandırılmasının gerekmesi
- Diğer bir dikkat edilecek husus ise numune ve standartların hazırlanmasıdır. Çözeltilerin
hazırlanmasında gösterilecek özel dikkat, anlamlı sonuçların elde edilmesi için çok
önemlidir. Elektrot serbest iyonun aktifliğine cevap vereceğinden ortamda ligand olmamalı
veya olduğu durumlarda maskelenmelidir (Durst ve Khuri 1969).
11
1.2. ENZİM SENSÖRLERİ
Enzim sensörleri genel olarak, biyoaktif tabaka, transduser (iletici) ve ölçüm
sisteminden oluşmaktadır. Diğer biyosensörlerden tek farkı biyoaktif tabakada biyomolekül
olarak enzimlerin yer almasıdır. Buna karşılık diğer biyosensörlerde olduğu gibi biyoaktif
tabakanın iç ve dış yüzeylerinde membranlar, iletici ile ölçüm düzeneği arasında sinyal
yükselticiler, mikroişlemciler veya ölçüm düzeneğiyle bağlantılı kaydedici veya bilgisayar
sistemleri gereksinimlere göre eklenen unsurlardır (Turna, 2006). Bir enzim sensörünün genel
şematik gösterimi Şekil 1.3’ de verilmiştir.
Plastik İzolasyon
Bakır Tel
NH4+ membran
Enzim(L- Aminoasit Oksidaz)
Şekil 1.3. Enzim sensörünün genel görünümü
Bir enzim sensörünün çalışma prensibi, enzim veya enzimlerin immobilize edilmiş
olduğu biyoaktif tabakadaki olayların biraz daha yakından incelenmesiyle daha kolay
anlaşılabilir. Şekil 1.4’te biyoaktif tabakada gerçeklesen olaylar açısından bir enzim
sensörünün genel çalışma ilkesi özetlenmiştir.
12
İ
[Ay]
[By]
[Cy]
[Fy]
D. T.
B.T
[At] +
[Bt]
E
[Ct]
+
[Ft]
-----------------------------------[Aç]
[Bç]
[Cç]
Ö.Ç
[Fç]
Şekil 1.4. Enzim sensörünün genel çalışma ilkesi (A: Substrat, B: Kosubstrat veya Koenzim,
C ve F: Ürünler, ç: Ölçüm çözeltisi içindeki, t: Biyoaktif tabakadaki ve y: Elektrot
yüzeyindeki konsantrasyonlar; D.T.: Difüzyon tabakası, Ö.Ç.: Ölçüm çözeltisi, B.T.:
Biyoaktif tabaka, İ:İletici).
Şekil 1.4’ten de görüldüğü gibi bir enzim elektrotunda enzimi içeren biyoaktif tabaka,
enzimin katalizlediği reaksiyona uygun bir iletim ve ölçüm sisteminin uzantısı olan bir iletici
ile birleştirilmektedir. İletim sistemi, biyoaktif tabakada gerçeklesen enzimatik reaksiyon
sonucu substrat, kosubstrat (veya koenzim) konsantrasyonundaki azalış ya da ürün
konsantrasyonundaki artısı tespit edebilecek şekilde seçilebilir. Konsantrasyonların hızlı bir
şekilde dengeye ulaşabilmesi için difüzyonu azaltmak amacıyla biyoaktif tabaka kalınlığının
mümkün olduğunca ince olması gerekmektedir. Bunun yanı sıra biyoaktif tabakada sabit bir
substrat konsantrasyonu sağlayabilmek için ölçüm çözeltisinin yeterli bir şekilde karıştırılması
da gerekmektedir. Doğal olarak tayin edilecek türlerin ölçüm çözeltisindeki, biyoaktif
tabakadaki ve biyoaktif tabaka-iletici ara yüzeyindeki konsantrasyonları farklı olmaktadır.
İletici sistemin ölçeceği sinyal biyoaktif tabaka-iletici ara yüzeyindeki konsantrasyonlarla
ilişkilidir (Turna, 2006).
13
1.3. ENZİM SENSÖRLERİNİNİN SINIFLANDIRILMASI
Enzim sensörlerinin sınıflandırılması genel olarak, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan
sinyalin belirlenme ilkesine göre yapılmaktadır. Bu çerçevede Tablo 1.2’de söz konusu
sınıflandırma özetlenmektedir (Telefoncu, 1997).
Tablo 1 2. Enzim Sensörlerinin Sınıflandırılması
Elektrokimyasal Esaslı Enzim Sensörleri;
Amperometrik Esaslı Enzim Sensörleri;
Birinci Nesil Amperometrik Enzim Sensörleri
İkinci Nesil Amperometrik Enzim Sensörleri
Üçüncü Nesil Amperometrik Enzim Sensörleri
Potansiyometrik Esaslı Enzim Sensörleri;
Proton Duyar Potansiyometrik Enzim Sensörleri
Amonyum Duyar Potansiyometrik Enzim Sensörleri
Karbondioksit Duyar Potansiyometrik Enzim Sensörleri
Diğer iyon Duyar Potansiyometrik Enzim Sensörleri
Yarı iletkenleri Esas Alan Enzim Sensörleri;
Enzim Alan Etki Transistörleri (ENFET)
Optik Esaslı Enzim Sensörleri;
Absorpsiyon Esaslı Optik Enzim Sensörleri
Flouresans Esaslı Optik Enzim Sensörleri
Biyolüminesans Esaslı Optik Enzim Sensörleri
Kalorimetrik Esaslı Enzim Sensörleri
Piezoelektrik Esaslı Enzim Sensörleri
1.4. POTANSİYOMETRİK ESASLI ENZİM SENSÖRLERİ
Akımın çok az geçtiği veya hiç geçmediği sistemlerde, indikatör elektrotun referans
elektroda karsı gösterdiği, konsantrasyon değişimine bağlı olarak değişen potansiyelin
ölçüldüğü tayin yöntemine potansiyometri denir. Potansiyometre değişken dirençle bağlantılı
voltaj kaynağından ibarettir. Değişken direncin ayarlanması ile standart voltajın bilinen kısmı
bilinmeyen voltaja karşı işaretlendirilir. İki voltaj eşit olduğu an, iki voltaj arasına bağlanmış
galvanometreden herhangi bir akım geçmez. Böylelikle bilinmeyen voltaj, değişken direncin
pozisyonundan okunabilir. Potansiyometrenin duyarlılığı hücrenin direnci ve galvanometrenin
duyarlılığına bağlıdır. Çoğu ticari potansiyometreler 0,01 mV veya daha duyarlı ölçümler
yapabilmektedir ve analitik amaçlar için uygundur.
14
Potansiyometrik sistem, bir test hücresi ve buna bağlantılı olan indikatör elektrot (değişken
potansiyel) ve referans elektrot (sabit potansiyel) ile kararlı bir potansiyelin okunabildiği bir
potansiyometreden oluşur. Potansiyometride geçen akımın elektrot potansiyelini değiştirmemesi için
indikatör elektrottan geçen akımın sıfıra yakın tutulması gerekir. Bu nedenle yüksek direnç
voltametreleri kullanılır. Böylelikle geçen akım çok küçük (10-2 amper) ve ölçülen voltaj, sistemin
doğru potansiyelini oluşturur. Potansiyel değişimi, çözeltideki iyon ve iyonların konsantrasyonu ile
ilişkili olduğu için iyon konsantrasyonlarının tayininin yapılmasını sağlar. Potansiyometri, yıllardır
sulu çözeltideki iyonlarının konsantrasyonlarının tayininde daha çok iyon seçici elektrotların (ISE)
kullanımıyla yaygın olarak uygulanmaktadır. Şekil 1.5’de potansiyometrik bir ölçüm sistemi
şematik olarak görülmektedir.
Şekil 1.5. Potansiyometrik ölçüm sisteminin şematik olarak gösterimi.
Çalışma elektrotu, çözeltideki türlerden bazılarına seçimlilik gösteren ve iç kısmında
bir başka karsılaştırma elektrotu ile nicel analizi yapılacak türün belli derişimdeki çözeltisi
bulunan ve bir membran ile analizi yapılacak çözeltiden ayrılmış bir elektrottur. Analizi
yapılacak çözeltiye daldırılan bu elektrot ile aynı çözelti ile temasta olan bir karşılaştırma
elektrotu arasında oluşan gerilim değeri ile analizi yapılan tür arasında logaritmik bir ilişki
vardır. Bu hücre geriliminin ölçümü sırasında iki elektrot arasında uygun bir devre yardımıyla
bir akımın geçmemesi sağlanır.
İçte ve dışta bulunan çözeltilerde analizi yapılacak türün derişimi açısından bir fark
varsa membranın iç yüzeyi ve dış yüzeyi arasında bir gerilim farkı oluşur. Bu gerilim farkının
değeri analizi yapılan türe ve derişimine bağlı olduğu gibi, membranın cinsine ve çözeltide
bulunan öteki bileşenlerin tür ve miktarlarına da bağlıdır. İyon seçici elektrotlar olarak
adlandırılan bu elektrotların en çok bilineni, H+ iyonlarına karsı seçimlilik gösteren ve ince bir
cam zarın membran olarak kullanıldığı cam elektrottur. Bir iyon seçici elektrotla ölçülen
15
gerilim değeri, elektrotun seçimlilik gösterdiği türe ek olarak çözeltide bulunan diğer türlerden
de etkilenir (Turna, 2006). Bu etki,
eşitliği ile belirlenir. Bu eşitlikte kij sabiti, elektrotun i iyonunu j iyonuna göre ne kadar bir
seçicilikle ölçtüğünü belirten seçimlilik katsayısıdır. Pozitif yüklü iyon değiştiriciler, anyon
duyarlı maddelerdir. Örneğin; CI-, NO3-, CO32- gibi anyonlar için tetraalkil amonyum tuzları
iyon-değiştirici olarak kullanılır. Negatif yüklü iyon değiştiriciler, katyon duyarlı maddelerdir.
Örneğin; K+ için potasyum tetrakis (p-klorofenil) borat (KTpCIPB) tuzu iyon-değiştirici
olarak kullanılır. Bir anyona veya katyona karsı seçimlilik gösteren maddenin her zaman
iyonik yapıda olması gerekmez. Örneğin; K+ iyonunu bağlayan ve doğal bir antibiyotik olan
valinomisin (nötral tasıyıcı iyon-degiştirici) ile hazırlanan bir elektrot, K+ iyonunu öteki
iyonların yanında büyük bir seçimlilikle ölçer. Nonaktin (nötral tasıyıcı iyon-degiştirici), NH4+
iyonunu bağlamakta büyük bir seçimlilik gösterir. Bazı sentetik taç eterleri ise alkali ve toprak
alkali iyonları için kullanılabilecek nötral ligandlardır. Bazı daha basit iyon seçici
elektrotlarda membran kullanılmaz; sıvı iyon değiştirici veya nötral ligand, tel seklindeki bir
metal elektrotun üstüne kaplanan epoksi, polivinil klorür veya polimetilmetakrilat gibi
polimerlerin içine yerleştirilmiştir. Bu tür elektrotlarda bir iç çözelti yoktur ve metal tel iç
karşılaştırma elektrotu görevini yapar. İyon seçici bir elektrotun membranı, içinde belli bir
tepkimeyi katalizleyen bir enzimi tutan ikinci bir membran ile kaplanırsa, elektrotun
seçiciliğine enzimin seçiciliği de eklenir. Örneğin, NH4+ iyonu için seçimlilik gösteren bir
cam elektrotun cam membranı, içinde üreaz enziminin tutuklandığı poliakrilamid membranı
ile kaplanırsa bu elektrot sisteminin daldırıldığı bir çözeltide,
-
Üre + H + + 2H2O ↔ HCO3 + 2NH4+
tepkimesine göre oluşan NH4+ iyonu iki membran arasındaki çözeltiye geçer ve NH4+
elektrotu ile ölçülerek üre tayini yapılabilir. Bu tür elektrotlar potansiyometrik biyosensör
olarak da bilinir. Potansiyometrik sensörlerin duyarlı, kararlı, dayanıklı olması ve hızlı cevap
üretmesi istenir. Tablo 1.3’de çeşitli enzimlerin kullanıldığı potansiyometrik sensörler
görülmektedir.
16
Tablo 1.3. Çeşitli enzimlerin katalizör olarak kullanıldığı potansiyometrik sensörler. (Turna,
2006; Cha ve Meyerhoff, 1989)
Enzim
Substrat(Tayin edilen madde)
Kullanılan Elektrot
Peroksidaz
H2O2
I- elektrodu
Ürikaz
Ürik asit
I- elektrodu
L-amino asit oksidaz
L-amino asitler
NH4+ elektrodu
Arjinaz/Üreaz
L-arginin
NH4+ elektrodu
ᵦ-glukosidaz
Amigdalin
CN- elektrodu
D-kimotripsin
Difenilkarbamil florür
F- elektrodu
Asetilkolin esteraz
Asetilkolin
H+ elektrodu
Penisilinaz
Penisilin
H+ elektrodu
Aldehit dehidrojenaz
Asetilaldehit
H+ elektrodu
Glikozoksidaz
Glikoz
H+ elektrodu
Okzalat dekarboksilaz
Okzalat
CO2 elektrodu
Fenilalanin amonyak liyaz
L-fenilalanin
NH3 elektrodu
Üreaz
Üre
NH4+, NH3, CO2 veya H+
elektrodu
1.4.1. Amonyum Duyar Potansiyometrik Enzim Elektrotları
Amonyum iyonlarına duyar temel sensör ile enzimin birleştirilmesiyle hazırlanan bu
elektrotlar genelde H+, K+ ve Na+ gibi tek yüklü katyonlara da duyarlık gösterdikleri için
ölçüm ortamlarında benzer maddelerin bulunması durumunda girişim problemleri ortaya
çıkmaktadır. Girişim etkilerini azaltmak için değişik yöntemler kullanılmaktadır.
1.4.2. Amonyum Duyar Potansiyometrik Enzim Elektrotlarının Bazı Uygulamaları
Amonyum duyar potansiyometrik enzim elektrotlarına ilişkin seçilmiş örnekler
aşağıda verilmiştir. Bu tür enzim sensörlerinde temel iletici olarak pNH4 duyar elektrotlar
kullanılır.
1 ) Üre Tayini
Üre + H2O
CO2 + 2NH3
-
( CO2 + H2O ↔ HCO3 + H+ )
-
(NH3 + H2O ↔ NH4+ + OH )
17
2) L- Amino Asit Tayini
2- Oksoasit + NH4+ + H2O2
L- Amino Asit + H2O + O2
H2O2
H2O +
(L- Amino Asit +
1
/2 O2
1
/2 O2
→ 2- Okzoasit + NH4+ )
3) Glutamin Tayini
Glutamin
Glutamat + NH3
-
(NH3 + H2O ↔ NH4+ + OH )
1.5. BİYOSENSÖRLERİN PERFORMANSINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER
1.5.1. Cevap Zamanı
Biyosensörlerde cevap zamanı temel olarak elektrotun fiziksel yapısıyla ilgili bir
özelliktir. Cevap zamanı, genel olarak membranın duyarlı kısmıyla çözeltideki analitin
dengeye gelmesi için geçen zaman olarak bilinir. International Union of Pure and Applied
Chemistry (IUPAC)’ a göre ise; dengeye gelme zamanının % 95’ i olarak alınır ve t95 olarak
gösterilir (denge potansiyelinin de %95’ ine karşılık gelir). Şekil 1.6’da IUPAC’ a göre cevap
zamanı grafiksel olarak gösterilmiştir.
Şekil 1.6. IUPAC’a göre biyosensörün cevap zamanı.
18
Girişim yapan parametreler, bir Nernst potansiyel farkı oluşması için taşınması
gereken iyonların aktif elektrot yüzeyine ulaşmalarını geciktirir ve cevap zamanını etkiler.
Cevap zamanı aşağıdaki işlemlerle azaltılabilir;
1. Etkili karıştırma (veya akış hızının artırılması),
2. Membran yüzeyinden kirliliklerin uzaklaştırılması veya çok küçük membran yüzeyli mikroelektrotlar kullanılması,
3. Ölçüm sırasında çözelti konsantrasyonunun seyreltikten derişiğe doğru olması. Nötral
taşıyıcı membranlar da, aktif maddeye (ligand veya kompleks) çözeltideki Analitin tutunma
hızı, cevap zamanını etkileyen en önemli faktördür. Bunun dışında;
1. Difüzyona karsı direnç
2. Membran kalınlığı
3. Membrandaki çözücünün polaritesi de cevap zamanını etkileyen faktörlerdir.
1.5.2. Tayin Limiti (Ölçümlerin Duyarlılığı)
Biyosensörlerin tayin limiti, membran ara fazında ölçülebilir bir potansiyel farkı
meydana getiren en düşük analit konsantrasyonu olarak tanımlanır.
Çoğu biyosensör için tayin limiti 10-5 mol.L-1 civarındadır. Bazılarında ise 10-7 mol.L1
’ e kadar düşebilir. Bu limitler, ortamda bulunan girişim yapan moleküller ile ters yönde
etkilenebilir
1.5.3. Seçicilik
Sadece tek bir maddeye veya iyona seçici bir elektrot yoktur. X maddesini ölçmek için
kullanılan bir elektrot Y maddesine de duyarlı olabilir. Diğer maddelerin varlığı elektrot
performansını önemli ölçüde zayıflatır. Bu maddelerin girişimi, elektrot membranının
yapısına bağlı olarak çeşitli şekillerde olabilir. Seçicilik ilk kez Nicolsky tarafından hidrojen
ve sodyum iyonlarına duyarlılık gösteren cam elektrot için kullanılmış ve aşağıdaki eşitlikle
verilmiştir. Pek çok iyon seçici elektrot (ISE) çoğunlukla aşağıdaki eşitliğe uygun davranır
(Edmonds, 1988)
19
Denklem, bir elektrotun ölçülecek X iyonu ve bütün girişim yapan iyonlara cevabını
gösterir. Elektrotun farklı iyonik türlere karsı duyarlılığı seçicilik katsayısı ile belirlenir.
Seçicilik katsayısı (
) büyüdükçe elektrotun ölçülecek maddeye duyarlılığı azalır
ve log ax-potansiyel grafiği yataya doğru gider (Şekil 1. 6). Örneğin; Ca2+ seçici bir elektrot
için Na+ girişimi söz konusu ise ve kCaNa=10-3 ise elektrotun Ca2+ iyonuna Na+ iyonundan
1000 kez daha duyarlı olduğu sonucu çıkarılır. Girişim yapan iyonun yokluğunda Nernst
davranışı gözlenir.
Seçicilik katsayısı;
1. Ayrı çözelti metotu,
2. Analitin girişim yapan madde çözeltisine ilavesi metotu,
3. Girişim yapan maddenin analit çözeltisine ilavesi metotu ile hesaplanabilir.
1.6. ENZİM İMMOBİLİZASYONU
Enzimlerin çeşit ve sayısının fazla olması, çok farklı kullanım alanı ve amaçlarına
sahip olmaları biyoaktif bileşen olarak enzim esaslı biyosensörlerin yaygın olarak
kullanılmalarına neden olmuştur. Enzimlerin endüstriyel alanda kullanımını arttırmak için,
özellikle son otuz yılda enzim immobilizasyonu üzerine araştırmalar yoğunlaşmıştır. Bu
20
alanda yapılan yayınların sayısı da yıldan yıla artmaktadır (Schügerl, 2001). Kelime anlamı
olarak “immobilizasyon” hareketi sınırlandırma demektir. İmmobilize edilmiş enzimlerin de
gerçekten hareketleri sınırlandırılmış olmaktadır. Enzimler, suda çözünmeyen bir taşıyıcıya
fiziksel veya kimyasal olarak bağlanarak immobilize edilebilirler. Suda çözünmeyen ürün
veren bir kopolimerizasyon reaksiyonuna enzim molekülünün monomer olarak katılması ve
suda çözünmeyen bir matriks veya mikro kapsüllerde tutuklanmasıyla immobilizasyon
gerçekleştirilir. İmmobilize enzimlerin doğal (serbest) enzimlere göre üstünlükleri aşağıdaki
gibi sıralanabilir (Turna, 2006; Fagain, 2003);

Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir(süzme, santrifüjleme v.b.) ve
ürünlerin enzim tarafından kirletilmesi gibi bir problem yaratmaz.

Çevre koşullarına (pH, sıcaklık vs.) karsı daha dayanaklıdır.

Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir.

Sürekli işlemlere uygulanabilir.

Doğal enzime kıyasla daha kararlıdır.

Ürünün oluşumu kontrol altında tutulabilir.

Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur.

Bazı durumlarda serbest enzimden daha yüksek bir aktivite gösterebilir.

Enzimin kendi kendini parçalaması (autolysis, self-digestion) olasılığı azalır.
Gerçek anlamda ilk enzim immobilizasyon denemelerinin sonuçları 1950’li yıllarda
birçok çalışma grubu tarafından aynı anda yayınlanmıştır. Daha sonra bu alandaki çalışmalara
dünyanın her alanında büyük bir ilgi duyulup enzimler değişik amaçlarla immobilize
edilmiştir.
1.6.1. Biyoaktif Tabaka İçin İmmobilizasyon Yöntemleri
Daha önce de bahsettiğimiz gibi biyosensörler iki farklı elemanın (transduser ve
biyoaktif tabaka) birleştirilmesiyle oluşurlar. Uygun biyoaktif bileşen ve transduser seçildikten
sonra bunların birbirine bağlanması asılması gereken en önemli sorundur. Bu bağlama
işlemini biyosensörlerin immobilizasyonu olarak tanımlanmaktadır. Bağlama işleminde çok
değişik yöntemler kullanılabilir. Hangi yöntemin kullanılacağı seçilen transduser ve biyoaktif
bileşene göre belirlenir. Enzimler hücrelerde biyokimyasal reaksiyonları katalize eden
proteinlerdir ve hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan çok çeşitli amaçlar için
21
kullanılmak üzere günlük hayata girmişlerdir. Pek çok endüstriyel, analitik ve klinik
proseslerde enzimler, substrat çözeltisi ile karıştırılırlar ve ürüne dönüşüm gerçekleştirildikten
sonra ekonomik olarak geri kazanılamazlar. Enzimlerin sadece bir kere kullanılmaları, pahalı
olmaları nedeni ile büyük masraflara neden olmaktadır. Bu nedenle immobilize edilerek
defalarca kullanılmaları ekonomik olarak daha makul olmaktadır. İmmobilizasyon
biyosensörlerin
kararlılığı
ve
tekrar
kullanımı
açısından
büyük
avantaj
sağlar.
Günümüzde enzimler en sık kullanılan biyoaktif bileşendir ve bu immobilize enzimler
endüstrinin pek çok alanında kullanılmaktadır. Biyosensör immobilizasyonun da başlıca dört
yöntem kullanılmaktadır (Turna, 2006).
Kovalent Bağlama: Enzimler, aktive edilmiş sensör yüzeylerine doğrudan bağlanabileceği
gibi önceden uygun bir film veya tabakaya immobilize edilmiş olarak da sensör yüzeylerine
kovalent olarak bağlanabilirler. Enzimlerin kovalent bağlanmasında kullanılabilecek
taşıyıcıların içermesi gereken reaktif gruplar ve bunların enzimdeki hangi amino asitlerle
etkileşime girdikleri Tablo 1. 4’de verilmiştir.
Enzimlerin kovalent bağlanmasında dikkat edilmesi gereken önemli nokta,
bağlanmanın enzim aktivitesi için esansiyel olan amino asitler üzerinden gerçekleşmemesi ve
bu grupların bağlanma sırasında sterik olarak rahatsız edilmemesidir. Kovalent bağlanma
enzim molekülü üzerindeki Tablo 1.5’de verilen amino asitlerin reaktif fonksiyonel grupları
üzerinden gerçekleştirilir.
Kovalent bağlama ile enzim veya protein yapısındaki diğer biyoaktif bileşenlerin
önemli immobilizasyon reaksiyonlarından birisi olan glutaraldehid ile çapraz bağlama
reaksiyonu aşağıda görülmektedir (Telefoncu, 1997);
22
Tablo 1.4. Enzim immobilizasyonunda kullanılan maddelerde bulunan reaktif gruplar ve
reaksiyona girdikleri amino asitlerin fonksiyonel grupları.
Taşıyıcının reaktif grubu
Enzimdeki fonksiyonel grup ve ilgili amino asit
Tablo 1.5. Enzimlerin kovalent bağlama ile immobilizasyonunda bağ oluşumuna katılan
amino asitlerin reaktif grupları.
23
Tutuklama: Enzimler polimer jel matrikslerde tutuklanabilirler. Bu yöntem enzimler
yanında organeller, hücreler ve antikorlar için de uygulanabilir. Updike ve Hicks, tarafından
hazırlanan, ilk enzim elektrotunda glikoz oksidaz (GOD) poliakrilamid jelinde tutuklanmıştır
(Updike ve Hicks, 1967). Guilbault ve arkadaşlarının hazırladığı üre elektrotunda ise üreaz
süspansiyonu elektrot yüzeyinde diyaliz membranı tarafından sarılarak tutuklanmıştır
(Mascini ve Guilbault, 1977). Çözeltide enzim aktivitesi hızla düştüğünden fiziksel tutuklama
yerine kimyasal kovalent bağlama tercih edilir. Tutuklama için en yaygın kullanılan film veya
matriksler; nişasta, selüloz asetat, silikon, poliamid, poliakrilamid, polistiren, polivinilklorur,
polivinilbutirat, poliester ve polivinil alkoldur (Turna, 2006; Shih ve Huang 1999).
Adsorpsiyon: Biyoaktif film veya tabaka ile hidrofobik, hidrofilik ve/veya iyonik
etkileşim sonucu assosiyasyonudur. Biyoreseptörlerin kimyasal yapısı ve fiziksel durumuna
göre immobilizasyon yöntemi belirlenir. Enzimler için uygulanan tüm immobilizasyon
yöntemleri protein yapısındaki diğer biyoreseptörler için de uygulanabilir. Örneğin; Hayvan ve
bitki dokuları membran yapısında olduklarından farklı immobilizasyon yöntemleri uygulamak
gerekir.
Çapraz Bağlama: Bu yöntem biyosensör hazırlanmasında daha çok tutuklama ve
kovalent bağlama yöntemlerinin birleştirilmesi şeklinde uygulanır. Şekil 1.7’de bir enzim
molekülünün glutaraldehid ile çapraz bağlanma mekanizması görülmektedir. Bazı çapraz
bağlayıcı reaktiflerin formülleri da Şekil 1.8’de verilmiştir. Glutaraldehit en sık kullanılan
bifonksiyonel reaktiftir. Ortamdaki konsantrasyonu %2-5 (w/w) olmalıdır.
Biyoaktif bileşenin immobilizasyonu için birçok alternatif vardır. Ancak bunların ticari
üretimlere uygulanabilmesi için basit, kıs sürede ve nötral pH, oda sıcaklığı gibi reaksiyon
koşullarında gerçekleşip biyomolekülün yapı ve fonksiyonunu etkilemeyen bir yöntem olması
gerekir. Bu koşulların nispeten kolay sağlanabildiği enzim esaslı birçok biyosensör ticari
olarak üretilmekte ve bunlara talep gittikçe artmaktadır.
24
Şekil 1.7. Enzim molekülünün glutaraldehid ile çapraz bağlanması.
Şekil 1.8. Bazı bifonksiyonel reaktiflerin kimyasal formülleri.
25
1.7. KROMATOGRAFİK SİSTEM
Dionex tarafından geliştirilen modern bir iyon kromatografi sisteminin ana bileşenleri
Şekil 1.9’da gösterilmektedir.
Şekil 1.9. Kromatografik sisteminin şematik gösterimi
Hareketli faz çift pistonlu bir pompa ile kromatografik sistem boyunca pompalanır.
Pulssuz bir akış, pompanın elektronik kontrolü ile sağlanır. Bu amperometrik ve UV/Vis
dedektörlerinin her ikisi için de geçerlidir.
Kromatografinin en önemli kısmı analitik kolondur. Uygun sabit faz seçimine ek
olarak uygun kromatografik parametrelerin seçimi analizlerin kalitesini belirler. Kolon
gövdeleri inert materyallerden yapılır ve genellikle oda sıcaklığında çalıştırılırlar.
Karbonhidrat ve aminoasitlerin analizi gibi bazı durumlarda yüksek sıcaklıklarda kolonun
sıcaklığının termostat ile kontrol edilmesi gerekir.
Analiz edilen türlerin miktarını ve türünü belirlemeye yarayan dedektörün
performansını artırmak amacıyla aşağıdaki kıstaslar göz önünde bulundurulmalıdır:

Doğrusallık

Ayrım

Gürültü
İyon kromatografide en geniş uygulaması bulunan dedektör iletkenlik dedektörüdür.
Bu tayin sistemi genellikle suppressor kolon içermektedir. Suppressor kolon analit iyonlarını
etkilemez. Sadece hareketli fazdan gelen iletkenliği kapatarak dedektör duyarlılığını artırır.
26
İletkenlik dedektörüne ek olarak, UV/Vis, amperometrik ve flouresans dedektörler de
kullanılmaktadır.
Çözünen maddenin derişimine cevap veren bir dedektör, kolon çıkışına yerleştirilirse
elde edilen sinyaller zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilir. Elde edilen bu veriler ile
çözünen türlerin kalitatif (nitel) ya da kantitatif (nicel) analizleri yapılabilir. Kantitatif
sonuçlar; analit pikinin yüksekliğinin veya pik alanının, standardın pik yüksekliği veya pik
alanı ile kıyaslanması sonucu elde edilir. Çünkü pik alanları ve pik yükseklikleri tayini
yapılacak türlerin derişimi ile doğru orantılıdır. Elde edilen verilerin sadeleştirilmesi dijital
integratörler ya da bilgisayar sistemleri ile yapılmaktadır.
1.8. POTANSİYOMETRİK DEDEKSİYON
1.8.1. Potansiyometri
Potansiyometri; akımın çok az geçtiği veya hiç geçmediği sistemlerde, indikatör
elektrodun referans elektrota karşı gösterdiği, derişim değişimine bağlı olarak değişen
potansiyelin ölçüldüğü tayin yöntemidir.
Potansiyel ölçümüne dayalı analitik metotlar “potansiyometrik metotlar” olarak
adlandırılır. Potansiyel ölçümlerinde genellikle iki tür cihaz kullanılır. Bunlar potansiyometre
ve pH metredir. Potansiyometre düşük dirençli devre ölçümleri için kullanılırken, pH metre
yüksek dirençli cam elektrotların kullanımı için tasarlanmıştır. Cam elektrotla pH ölçümleri,
potansiyel ölçümünü de içine alır.
Potansiyometrik sistem, bir test hücresi (elektrolitik çözelti), buna bağlantılı olan
indikatör elektrot (değişken potansiyel) ve referans elektrot (sabit potansiyel) ile kararlı bir
potansiyometreden oluşur. Bunlara “potansiyometrik hücre elemanları” da denir. Şekil
1.10’da basit bir potansiyometrik sistem görülmektedir.
Analit çözeltisine daldırılan indikatör elektrotta, mevcut iyon veya iyonların derişimine
bağlı olan bir potansiyel değişimi meydana gelir. Dolayısıyla potansiyel değişimi ölçülerek
iyonların derişimleri tayin edilebilir.
27
Referans
elektrot
Potansiyometre
İndikatör
elektrot
Şekil 1.10. Potansiyometrik sistem
1.9. AMİNO ASİTLER
Basit proteinler asit, baz veya enzimler tarafından hidroliz edildikleri zaman, yapı
taşları olan -amino asitlere parçalanır. Şekil 1.11’da görüldüğü gibi -amino asitler,
yapılarında hem amino grubu (−NH2 ) hem de karboksil grubu (−COOH) içeren bileşiklerdir.
COOH
NH2
C H
R
Şekil 1.11. Aminoasitlerin genel gösterimi
28
Protein, bazı hormon, vitamin ve antibiyotikler gibi önemli bileşiklerin yapısını
oluşturan amino asitler, dokuların yenilenmesi, büyüme ve kas yapımı için metabolizmanın
kullandığı en önemli maddelerdendir. Doğada 300 farklı amino asit bulunmasına rağmen
DNA tarafından kodlanarak protein yapısına giren 20 çeşit amino asit bulunmaktadır. Bu
amino asitlerin insan vücudunda ancak yarısı sentezlenir. Sentezlenemeyen aminoasitlerin
diyetle alınması gerekir. Esensiyal veya oksojen amino asitler olarak da isimlendirilen bu
amino asitlerin listesi esensiyal olmayan amino asitlerle birlikte Tablo 1.6’da verilmiştir.
Tablo 1.6. Esensiyal ve esensiyal olmayan aminoasitler.
Esensiyal olmayan
Kısaltma
Esensiyal
Kısaltma
Alanin
Ala
A
Arjinin
Arg
R
Asparajin
Asn
N
Histidin
His
H
Aspartik Asit
Asp
D
İzolösin
Ile
I
Sistein
Cys
C
Lösin
Leu
L
Glutamik Asit
Glu
E
Lizin
Lys
K
Glutamin
Gln
Q
Metiyonin
Met
M
Glisin
Gly
G
Fenilalanin
Phe
F
Prolin
Pro
P
Treonin
Thr
T
Serin
Ser
S
Triptofan
Typ
W
Tirozin
Tyr
V
Valin
Val
Y
Canlı yapısındaki amino asitler, yağlar veya karbonhidratlar gibi depolanmazlar.
Vücutta sentezlenen her protein molekülü fonksiyoneldir ve hiçbir zaman amino asit deposu
değildir. Fakat uzun süreli açlıkta kas proteinleri, amino asit sağlamak amacıyla değil de, kan
glikozunu normal seviyede tutmak için amino asitlerinden glikozun sentezlenmesi maksadıyla
yıkılır. Süt ve yumurta proteinleri istisna olarak amino asit deposu fonksiyonu görürler.
Amino asitler öncelikle, vücutta ihtiyaç duyulan proteinler ve diğer biyo moleküllerin
sentezinde kullanılırlar. Amino asitlerin fazlası atılmaz ve depolanmazlar, bunlar hücre içinde
yakıt metabolizmasına dahil olmak üzere yıkılırlar.
1.9.1. L-amino Asit Oksidaz
Amino asitlerdeki amino grupları, böbrek ve karaciğerdeki L-amino asit oksidazlar ile
de uzaklaştırılabilirler; ancak amino asit yıkımında bu enzimlerin daha az önemi vardır. Bu
enzimler çok özgül değildir. Bu nedenle pek çok farklı amino asit, substrat olarak
kullanılabilir ama oksidasyon hızları yavaştır. Böbreklerdeki L-amino asit oksidaza sıkıca
29
bağlı olan koenzim, flavin mononükleotit (FMN)’ dir. Şekil 1.12’de L-amino asit oksidaz (LAAO)’ın katalizledigi tepkime görülmektedir (Montgomery ve ark., 2000)
Şekil 1.12. L- Amino asitlerin, L-Amino asit oksidaz (L-AAO) tarafından katalizlenmesi.
1.10. LİTERATÜR BİLGİLERİ
Biyolojik, yiyecek ve çevre örneklerinde tayini önem arzeden bir çok biyolojik
maddenin tayininde biyosensörler etkili bir şekilde kullanılmaktadır (Lakard ve ark., 2004a;
Lakard ve ark., 2004b; Keusgen ve ark., 2003; Pandey ve Mishra, 2004; Yoshinobu ve ark.,
2001; Mourzina ve Yoshinobu, 2001). Biyosensörlerin hazırlanmasında kullanılan iyonseçici
sensörlerin teknolojisindeki gelişmeler ve sensör materyallerin sayıların artması, yeni tip
biyosensörlerin
gelişmesini
hızlandırmıştır.
Uygun
iyonofor
maddelerle
hazırlanan
polyvinilklorür (PVC) tipi membran elektrotlar (Petersson, 1988; Cammann ve Butt, 1992)
duyarlı, kısa cevap zamanı ve tekrarlanabilir sonuçlar veren basit biyosensörlerin geliştirilmesi
için avantajlara sahiptirler. Enzimler genel olarak PVC tipi bir iyon seçici elektrot membran
yüzeyine glutaraldehit karşıt-bağlayıcısı kullanılarak tutturulmaktadır (Saurina ve ark., 1998;
Bilitewski ve ark., 1992). Fakat hidrofobik bir yüzeye sahip PVC tipi bir iyon seçici elektrot
membran yüzeyine enzimin tutunması oldukça zayıftır. Bu yüzden PVC yerine fonksiyonel
hale getirilmiş PVC (aminlenmiş veya karboksilatlanmış) kullanılarak enzimin etkili bir
biçimde tutturulması yoluna gidilmiştir (Walcerz ve ark., 1995). Bu tip fonksiyonel PVC
membran iyon seçici elektrotların, potansiyometrik davranışları detaylı olarak incelenmiştir
(Ma ve ark., 1988; Alegret ve ark., 1989; Bilitewski ve ark., 1992). Aynı zamanda,
fonksiyonel PVC'nin yeni biyosensörlerin geliştirilmesinde kullanılıp kullanılmayacağı
tartışılmıştır (Walcerz ve ark., 1995; Alegret ve ark., 1989). İyonofor kullanılmadan
30
hazırlanan PVC-NH2 (aminlenmiş-PVC) temelli pH membran elektrot yüzeyine, enzimin
(üreaz) kovalent olarak tutturulmasıyla hazırlanan bir biyosensör, çözeltideki enzimatik
reaksiyon sonucu, enzimatik membran içinde oluşan son protolitik ürün olan hidronyum
iyonun değişiminin ölçülmesine dayalı olarak, ürenin tayininde başarıyla kullanılmıştır (Walcerz
ve ark., 1995; Alegret ve ark., 1989; Ma ve ark., 1988; Alegret ve ark., 1989; Bilitewski ve
ark., 1992; Guilbault, 1977; Işıldak ve Asan, 1999; Tinkilic ve ark., 2002). Diğer taraftan,
kliniksel çalışmalarda basit ölçüm metotları ile birlikte, enzim ve madde kullanımını
minimuma indirecek minyatürize biyosensörlerin geliştirilmesi de oldukça önem arz
etmektedir (Guilbault, 1977). Son yıllarda, bütünüyle katı-hal tipi iyon seçici membran
elektrotların kullanımına olan ilgi giderek artmaktadır (Işıldak ve Asan, 1999; Tinkilic ve ark.,
2002). Böyle bir sensörde duyarlı membran (polimer membran), iç referans çözeltisi olmadan
sensör yüzeyine kuvvetlice yapışabilmektedir. Böylece, potansiyometrik davranışında önemli
herhangi bir değişme olmaksızın, uzun zaman kullanılabilen, kırılgan olmayan sensörler
hazırlanabilmektedir. Tarafımızdan geliştirilen bu tip sensörler klasik yöntemlerle hazırlanan
elektrotlardan farklılık göstermektedir. Bu sensörler, membran kokteylinin polimer + grafit
karışımı olan bir katı-hal kontakt (iletken) yapı yüzeyine yapıştırılmasıyla hazırlanmaktadır.
Klasik yollarla hazırlanan polimer membran elektrotlarla aynı performansı gösteren bu yeni
tip sensörler, bütünüyle katı-hal olduklarından iç referans çözelti ve iç referans elektrot
bulundurmamaktadır, istenilen büyüklükte ve tipte hazırlanmaya olanak tanımaktadır. Aynı
zamanda, bütünüyle katı-hal polimer membran sensörler ucuz, hazırlanması kolay ve
minyatürize flow-through akış hücrelerinin tasarımına da izin vermektedir. Benzeri teknoloji
kullanılarak laboratuvarımızda geliştirdiğimiz çoklu mikro sensör ve “sensör-dizileri” içeren
flow-through akış hücreler Resim 1’de görülmektedir. Bütünüyle katı hal kontak polimer
membrane iyon-seçici sensörlerin kromatografide dedektör olarak kullanımı üzerine
çalışmaların bir bölümü etkili bir biçimde Işıldak ve grubu tarafından yapılmıştır (Işıldak,
1999; Işıldak ve Asan, 1999; Işıldak ve Covington, 1998a; Işıldak ve Covington, 1998b;
Işıldak ve Covington, 1993). Bu tip potansiyometrik dedektörlerin en önemli avantajı, birden
çok seçici sensörün birlikte kullanımına izin vermesidir. Böylelikle, diğer dedektörlerle tek
basamakta analiz edilemeyen bir çok bileşiğin eşzamanlı tayini sağlanabilmektedir.
31
Şekil 1.13. Çoklu mikro sensör ve flow-through akış hücreleri.
Çok farklı örnek matrikslerinde serbest amino asitlerin eşzamanlı tayini önem
arzetmektedir. Metabolik düzensizliklerin belirlenmesi amacıyla biyolojik sıvılarda (Jellum
ve ark., 1988; Den and Denk, 2003; Magni ve ark., 1994; Hiroaki ve ark., 2009) ve yenidoğan
bebeklerin gıda ihtiyacının karşılanması amacıyla gıdalarda yoğun olarak tayin edilmektedir
(Shen ve ark., 2006; Deng ve ark., 2004; des Robert ve ark., 2002; Miller ve ark., 2005).
Biyolojik sıvı ve gıdalarda serbest amino asitlerin tayinleri için, yaygın olarak pre-kolon veya
post-kolon türevlendirme işlemlerini içeren sıvı kromatografik teknikler kullanılmaktadır
(Fekkes ve ark., 1995; Cohen ve De Antonis, 1994; van Eijk ve ark., 1993; Fekkes,1996 ;
Hamilton ve Anderson, 1959; Benson ve Hare, 1975; Crabb ve ark., 1990). Pre-kolon
türevlendirme işleminde serbest amino asitler, daha çok hidrofobik ajanlar ile hidrofobik UV
ve floresans aktif türevlerine dönüştürülerek ters-faz sıvı kromatografik kolonlarda ayırıma
tabi tutulmaktadır. (Fekkes ve ark., 1995; Cohen ve De Antonis, 1994; van Eijk ve ark.,
1993; Fekkes,1996). Post-kolon türevlendirme de ise amino asitler, iyon değişim
kromatografi kolonlarında ayırıma uğratıldıktan sonra genellikle o-fitaldehit veya ninhidrin
gibi ajanlarla reksiyona sokularak UV veya floresans detektörlerle tayin edilmektedir
(Hamilton ve Anderson, 1959; Benson ve Hare, 1975 ). Bu yaklaşımlara dayalı çok sayıda
metot için laboratuvar içi validasyon çalışmaları yapılmıştır. Ancak türevlendirme
şartlarındaki farklılıklar nedeniyle validasyon çalışmalarından elde edilen sonuçlarda
tutarsızlıklar meydana geldiği ifade edilmektedir (Crabb ve ark., 1990). Bu tutarsızlıklara,
oluşturulan türev bileşiklerin kararsızlığı, yan reaksiyonların oluşumu ve türevlendirmede
kullanılan ajanların girişiminın neden olduğu ifade edilmektedir. Dolayısıyla türevlendirmeye
dayalı olmayan amino asit tayin yöntemlerin geliştirilmesi önem arzetmektedir. Bu durum
basit ve hızlı örnek hazırlama prosedürleri içeren, direkt ve otomatik eşzamanlı amino asit
32
tayin yöntemlerin geliştirilmesine gereksinim bulunduğunu açıkça göstermektedir. Bu nedenle
mevcut proje çalışması, amino asit duyarlı biyosensörün dedektör olarak kullanıldığı
kromatografi-potansiyometri hibrit sistemi ile biyolojik sıvı ve gıdalarda serbest amino
asitlerin duyarlı, hassas, basit ve ekonomik olarak kısa sürede eşzamanlı tayinlerinin yapılması
için yöntem veya yöntemlerin geliştirilmesini amaçlamıştır.
Amino asitler, bilhassa beslenme ve biyokimya yönünden pek büyük bir önem
taşımaktadırlar. Gerek besinlerde ve gerekse biyolojik materyalde bulunan amino asitlerin
kalite ve kantitelerinin bilinmesinde hekimlik yönünden büyük faydalar vardır. Amino
asidierin tayini maksadıyla eskiden beri birçok metotlar kullanılmaktadır. Bu hususta ilk
metotlardan birisi, amino asidierin etil esterlerinin vakumda fraksiyonel distilasyona tabi
tutulmasıdır. Amino asit gruplarını birbirinden ayırabilmek için butil alkol kullanılmıştır.
Amino asidierin nötral, bazik ve asidik gruplar halinde fraksiyone edilmelerinden sonra Van
Slyke'nin nitröz asidi metotunun tatbik edilmesi, protein hidrolizatında bulunan amino
asitierin ayrılması ve hesaplanması için başvurulmuş ilk metotlardan bir diğeridir. Bu
teknikler, zamanımızda nadiren kullanılmaktadır.
Amino asitlerin analizinde kullanılan bir diğer metot da elektrodiya1iz metotudur.
Bunda, yarı geçirgen bir zarla birbirinden ayrılmış üç parçalı bir düzeneğin orta
kompartmanında bulunan bir amino asit karışımından elektrik akımı geçirilmek suretiyle
amino asidierin bir kompartmandan diğerine farklı şekilde göç ettirilmeleri mümkündür.
Amino asidIerin taşıdıkları yükler, özel pH ayarlayıcıları tarafından ayarlanabilir ve bu suretle,
diamino asidler katotta, dikarboksilik asidler anot kompartmanında ve mono amino mono
karboksilik asitler de orta kompartmanda toplanabilirler.
İzotop seyreltme metotu da bu metotlardan bir diğeridir. İçinde hangi amino asidierin
bulunduğu bilinmeyen bir karışıma izotop ile işaretlenmiş, bilinen bir amino asidden belirli
miktarda ilave edilir. Sonra eklenen amino asit, karışırndan mümkün olduğu kadar saf bir
halde tekrar elde edilir. Bu saf amino asidde izotop atomunu taşıyan amino asidin hangi
oranda seyreltildiği tayin edilir. Seyreltme oranından da karışımda önceden mevcut olan o
amino asidin miktarı hesaplanır.
Mikrobiyolojik
ve
enzimatik
metotlar
da
amino
asidIerin
tayinleri
için
kullanılmaktadır. Bazı mikroorganizmalar, çoğalmaları için kültür vasatlarında amino
asidierin bulunmasına ihtiyaç gösterirler. Bundan faydalanılarak, sadece tayini yapılacak olan
amino asidi önceden ihtiva etmeyen, fakat belirli miktar nümuneyi içeren bir ortamda
mikroorganizmaların çoğalma derecelerinden hareketle o amino asidin miktarı hesaplanır.
33
Bakterilerin bazı türlerinde bilinen amino asidieri dekarboksile eden spesifik enzimler
mevcuttur. Bunların tesiriyle amino asitten açığa çıkan CO2 gazının miktarı, manometrik
olarak ölçülür. Buradan da o amino asidin miktarı hesaplanır (Bayşu, 1970).
Kolorimetrik metotlar, amino asidierin ninhidrin ile verdikleri renk reaksiyonuna
dayanan hassas metotlardır. Bununla beraber kolorimetrik tayin metotları, hassasiyet
bakımından amino asit analizerinki kadar tatminkar değildir.
Amino asitlerin analizlerinde yaygın olarak kullanılan bir metot da kromatografik
yöntemlerdir. Kromatografi, bir eritken içerisinde erimiş halde bulunan maddelerin sabit ve
hareketli fazlar arasında dağılması için uygun şekilde kurulmuş bir düzenekte, karışımda
mevcut bileşenlerin farklı hızlarda göç etmeleri esasına dayanan bir tekniktir. Zamanımızda,
adsorpsiyon, partitisyon ve iyon değişimi kromatografileri olmak üzere üç tip kromatografi
kullanılmaktadır (Bayşu, 1970).
Literatürde amino asitlerin tayinine yönelik pek çok çalışma bulunmaktadır. Bu
çalışmalardan bazıları şunlardır.
Rebane ve Herodes’in 2010 yılında yaptıkları bir çalışmada dietiletoksimetilenmalonat
ile kolon öncesi türevlendirilen amino asitlerin ultraviyole ve kütle spektroskopisi dedektörleri
kullanılarak sıvı kromatografisi ile bal numunelerinde serbest amino asit tayini yapmışlardır.
Bu çalışmada baldaki amino asitlerin tayini için bir metot geliştirilmiştir. Geliştirilen bu
yöntemle Estonya ve çevresinden alınan 200 bal numunesinden 23 amino asidi tayin etmeyi
başarmışlardır.
Amino asitler N,N-dimethyl-2,4-dinitro-5-fluorobenzylamine ile ön türevlendirme
yapılarak electrospray ionization kütle spektroskopisinin dedektör olarak kullanıldığı iyon
kromatografisi ile tayinleri gerçekleştirilmiştir (Liu ve Ark., 2004).
2007 yılında yapılan bir çalışmada biyolojik sıvılarda amino asitlerin tayini ön
türevlendirme yapılmadan time-of-flight kütle spektroskopisinin detektör olarak kullanıldığı
ion-pairing ters-faz sıvı kromatografisi ile yapılmıştır (Armstrong ve Ark., 2007).
Lindroth ve Mopper deniz suyu örneklerinde amino asitleri Florasans detektörünun
kullanıldığı Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi ile tayin etmişlerdir. Amino asitlerin
enjeksiyon öncesi o-Phthaldialdehyde ile susuz ortamda türevlendirmesi yapılmıştır (Lindroth
ve Mopper, 1979).
Chen ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada dabsyl-Cl ile türevlendirdikleri amino
asitleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ve tandem kütle spektroskopisini birleştirerek tayin
etmişlerdir. Bu çalışmanın sonucunda kompleks gıda ortamlarındaki amino asitin analizinde
34
kullanılan yöntemin sonuçlarından yöntemin daha iyi olduğu ve daha gerçekleşebilir olduğu
görülmüştür (Chen ve Ark., 2003).
Inaba ve çalışma grubu D- ve L-Amino asit tayini için geliştirdikleri amperometrik
piruvik asit biyosensörüyle yaptıkları bir çalışmada; örnek çözeltisindeki çeşitli amino asitler,
Şekil 1.14’de gösterildiği gibi, D- ve L-aminoasit oksidaz tarafından yükseltgenir. Piruvik
asit, bu amino asit karışımından, sadece D- ve L- alanin’ den oluşur. Piruvik asit, oksijen
elektrotunun yüzeyinde immobilize olan piruvat oksidaz tarafından yükseltgenir ve bu sırada
oksijen tüketilir. Tüketilmis oksijen miktarı, akımda bir düşüşe neden olur ve bu düşüş
oksijen elektrotu tarafından belirlenir (Turna, 2006; Inaba ve ark.).
Şekil 1.14. Bazı amino asitlerin yükseltgenme ürünleri ve piruvik asidin yükseltgenmesi.
Akım miktarı ile piruvik asit konsantrasyonu arasında doğrusal bir ilişki vardır. Bu
ilişkiden yararlanılarak piruvik asit konsantrasyonu belirlenir. Buradan da D- ve L-alanin
35
konsantrasyonları bulunur. Piruvik asit sensörü kullanılarak, yumuşakçalardan çift kabuklu
hayvanlarda (midye, deniztarağı, istiridye, v.b.), D- ve L-alanin tayin edilmiştir.
Steven ve çalışma grubu elektrokimyasal bi-enzim sensörü kullanarak proteinlerin
analizlerini yapmışlardır. Casilan 90 maddesi kullanılarak elektrokimyasal bi-enzim sensörü
ile protein ölçümü yapılmıştır. (Steven ve ark., 2001) Casilan 90, kasların gelişmesinde
kullanılan bir gıda maddesi olup, pek çok amino asit bileşiminden oluşmakta ve bu yüzden
örnek test proteini olarak seçilmiştir. Tayinin esası Şekil 1.15’de görülmektedir.
[Amino asit]n
proteaz
n amino asit
L-AAO
n Enzim-FAD
n H2O
n 2-oksoasit + NH4+
n Enzim-FADH2
n O2
Şekil 1.15. Elektrokimyasal bi-enzim protein sensör için enzimatik reaksiyon prosesi
O2 molekülünün indirgenmesi sonucu oluşan H2O2, amperometrik olarak saptanır ve
numunedeki serbest protein buradan hesaplanır (Şekil 1.16).
Şekil 1.16. Sensör cevabına proteaz enzim aktivitesinin etkisi.
36
Roger ve çalışma grubu L-amino asitlerin hızlı tayini için L-AAO, polikarbamoil
sülfonat hidrojel (PCS) ile tutuklanarak, amperometrik bir biyosensör geliştirmişlerdir. Lamino asit miktarları, LAAO tarafından enzimatik olarak tüketilen O2 ve meydana gelen
H2O2’ in amperometrik ölçümleri sonucunda belirlenmiştir. 22 farklı amino asit bu sistemle
tayin edilmiştir (Roger, 2002).
R− CHNH2−COOH + O2 + H2O
R – CO – COOH + NH3 +H2O2
Bu proje çalışmasıda da, amino asitlerin analizine yönelik potansiyometrik tayin
yöntemine dayalı amino asitlere duyarlı davranabilen bir biyosensör sistemini geliştirme ve
geliştirilen bu potansiyometrik biyosensörleri kromatografik sistemde detektör gibi kullanarak
amino asitlerin analizlerini gerçekleştirme ve analiz yönteminin validasyonunu yaparak
literatüre yeni bir metot olarak kazandırma amaçlanmıştır.
37
2. MATERYAL VE YÖNTEM
2.1. MATERYAL
2.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler
1. H2SO4
%98; 1,98 g/cm3
Merck
(Analitik saflıkta)
2. HNO3
%96; 1,83 g/cm3
Carlo Erba
(Analitik saflıkta)
3. NaNO3
Merck
(Analitik saflıkta)
4. Ca(NO3)2
Fluka
(Analitik saflıkta)
5. NH4NO3
Merck
(Analitik saflıkta)
6. KNO3
Merck
(Analitik saflıkta)
7. NaBr
Merck
(Analitik saflıkta)
8. Nonactin
Merck
(Analitik saflıkta)
9. Amonyum iyonofor-I
Merck
(Analitik saflıkta)
10. Tetradodesilamonyum Bromür
Fluka
(Analitik saflıkta)
11. Dibutilftalat
Merck
(Kromatografik saflıkta)
12. Disiklo-hekzil-18-krown-6-KSCN
Aldrich
(Analitik saflıkta)
13. Dibenzo-18-Crown-6-KBr
Fluka
(Kromatografik saflıkta)
14. Nitrofeniloktileter
Fluka
(Kromatografik saflıkta)
15. Potasyum tetrakis (klorofenil)borat
Fluka
(Analitik saflıkta)
16. Polivinil klorür (high moleküler weight) Fluka
(Analitik saflıkta)
17. Tetrahidrofuran
Merck
(Kromatografik saflıkta)
18. 1,4-diaminobütan
Merck
(Analitik saflıkta)
19. Trietilamin
Merck
(Analitik saflıkta)
20. Metanol
Merck
(Analitik saflıkta)
21. L-amino asit Oksidaz
Sigma
(Analitik saflıkta)
22. Glutaraldehit
Merck
(Analitik saflıkta)
23. Amino asit standartları
Fluka
(Kromatografik saflıkta)
24. DI 800 Model Deiyonize Saf Su Cihazı
2.1.2. Cihazlar
1. Potansiyometrik Sensörler (Laboratuar Yapımı)
2. Bilgisayar kontrollü potansiyometre (National Instr. USA),
3. Bilgisayar ve potansiyometre ölçüm programı
4. Ag/AgCl referans elektrot (Thermo-Orion )
5. Terazi [WA304 Model, 300g x 0,0001g] (Avery Berkel)
38
2.2. METOT
Amino asit biyosensörünün hazırlanması için ilk olarak, temel sensör olarak
kullanılmak üzere, potansiyometrik kompozit katı-hal NH4+-seçici elektrotlar hazırlandı.
Hazırlanan kompozit katı-hal NH4+-seçici elektrotlar, test edilmeden önce ana iyon
çözeltilerinde (NH4+NO3-), şartlanmaya (doyurulmaya) bırakıldı. Bu şekilde hazırlanan
kompozit katı-hal NH4+-seçici elektrotlar, NH4+, K+, Na+, ve Ca+2 çözeltilerinde test edilerek
karakteristik özellikleri incelendi. Uygun olarak çalıştığı tespit edilen elektrotlar üzerine
enzim tabakası kaplandı (L-AAO). Enzim tabakasının kaplanmasıyla hazırlanan amino asit
biyosensörlerinin yüzeyi kuruyuncaya kadar karanlıkta (yaklaşık 4-5 saat) saklandı.
Kuruduktan sonra dolapta muhafaza edildi. Daha sonra bu elektrotlar, değişik amino asit
çözeltilerinde test edilerek karakteristik özellikleri incelendi. Ölçümler amino asitlerin 1xl0-11x10-5 mol.L-1 çözeltileri kullanılarak yapıldı ve ölçüm alınırken, seyreltik çözeltilerden
derişik çözeltilere doğru bir sıra takip edilerek veriler alındı. Her ölçümden önce indikatör
elektrot ve referans elektrot çifti deiyonize su ile yıkandı. Her ölçüm için yeni bir biyosensör
hazırlanmadı. Bir biyosensör birden çok kez ölçümde kullanıldı
2.2.1. PVC-NH2 Sentezi
PVC-NH2 literatürde belirtildiği şekilde sentezlendi (Turna, 2006; Walcerz ve ark.,
1995). Buna göre, 1,43 g PVC tartılıp 250 mL’lik bir balona konularak üzerine 6 gr 1,6diamino hekzan ve 3,5 mL trietilamin ilave edildi. Sonra bu karışım üzerine 35 mL metil alkol
ilave edilerek geri soğutucu altında, karıştırılarak, 3,5 saat reflaks işlemi yapıldı. Bu işlemden
sonra oluşan sarımsı madde ilk önce metil alkol ile sonra sırasıyla suyla, derişik HCl ve suyla
yıkandıktan sonra son olarak metil alkolle yıkanarak kurutuldu. Kurutulan madde THF’ de
çözüldü. Çözünmeyen kısım süzülerek atıldı, çözünen kısım kurutuldu. Kurutulan sarımsı
polimer madde PVC-NH2 olarak kullanıldı.
2.2.2. Standart Çözeltilerin Hazırlanması
Ölçümlerde kullanılan amino asitlerin 0,1 M’lık stok çözeltileri pH’ sı 7,2 olan 5x10 -3
M fosfat tamponunda (H2PO4-/HPO42-) ve deiyonize su içerisinde çözülmesiyle hazırlandı.
Hazırlanan stok çözeltilerinden istenilen konsantrasyonlarda (10-1-10-5 M) seyreltme yapılarak
standart amino asit çözeltileri hazırlandı. Değişik pH’ lardaki amino asit çözeltilerinin
hazırlanmasında ilk olarak, amino asitlerin konsantrasyonları 0,1-0,5 M olacak şekilde fosfat
39
tamponu ile hazırlandı ve daha sonra değişik pH değerlerine (pH=6.00, pH=7.2 ve pH=8.00)
ayarlamalar yapıldı.
Standart katyon çözeltileri ise katyonların nitrat tuzları kullanılarak de iyonize su ile
hazırlandı. Her bir katyonun 0,1 M konsantrasyonundaki stok standart çözeltisi hazırlanarak
bu standart çözeltilerden her bir katyonun istenilen konsantrasyonlardaki standart çözeltileri
seyreltilerek hazırlandı.
2. 2. 3. Elektrotların Hazırlanması
2. 2. 3. 1. NH4+-seçici Sensörün Hazırlanması
Amino asitlerin ölçümü için kullanılacak olan biyosensörlerin yapımında kullanılacak
olan temel sensör potansiyometrik kompozit katı-hal NH4+-seçici sensörler hazırlanmıştır. Bu
katı-hal kompozit NH4+-seçici sensörler aşağıda belirtilen yöntem ve denemeler takip edilerek
hazırlandı; Kompozit katı-hal NH4+-seçici sensörlerin hazırlanması için öncelikle,
literatürdeki gibi PVC-NH2 sentezlendi (Turna, 2006; Walcerz ve Ark., 1995). NH4+-seçici
PVC-NH2 kokteyli hazırlandı. Bu aşamada, amonyum iyonofor I, di-benzo 18 crown–6,
potasyum tetrakis(4- klorofenil) borat (KTpClPB), o-nitrofeniloktil eter (o-NPOE) ve PVCNH2 maddelerinin uygun kompozisyonları kullanılarak elektrotlar hazırlandı. NH4+-seçici
PVC-NH2 kokteyli, aktive grafit kompozisyon miktarları; 100 mg aktive grafit, 400 L NH4+seçici PVC-NH2 kokteyli olarak kullanıldı. Şekil 2. 1’ de bu şekilde hazırlanan kompozit katıhal NH4+-seçici bir sensör şematik olarak gösterilmiştir.
Plastik İzalosyon
Bakır Tel
Katı-Kontak
NH4+-Membran
Şekil 2.1. Katı hal NH4+-seçici sensör
40
2. 2. 3. 2. Biyosensörlerinin Hazırlanması
Hazırlanan kompozit NH4+-seçici sensörlerin yüzeyine, L-amino asit oksidaz enzimi
tek adımda enzim tutturma yöntemiyle bağlanarak amino asit biyosensörleri hazırlandı (Şekil
2.2). Bu yöntemde, % 2,5’luk (w/w) 100 µL glutaraldehitin 5 mM, pH=7.20, 400 µL fosfat
tamponunda (H2PO4-/HPO42-) hazırlanan çözeltisi kullanıldı. Daha sonra, 2.0 mg L-amino asit
oksidaz enziminin, 5 mM, pH=7.20, 500 µL fosfat tamponunda çözülmesi ile enzim çözeltisi
hazırlandı. Glutaraldehit çözeltisi ve enzim çözeltisinin bir arada karıştırılmasıyla hazırlanan
kokteyl, viskoz hale gelmesi için karanlıkta ve buzdolabında (4-5 °C’de) bekletildi.
Sonra, viskoz karışımdan şırıngaya bir miktar alınarak, kompozit NH4+-seçici
sensörlerin yüzeyine birer damla damlatıldı. Elektrotların yüzeyi kuruyunca işlem tekrar
edildi (Bu işlem toplam beş defa tekrar edildi). Son olarak, hazırlanan kompozit aminoasit
biyosensörler,
yüzeyinde
tutunmayan
ve
açıkta
kalan
glutaraldehid
kalıntılarının
uzaklaştırması için fosfat tamponu ile yıkandı ve buzdolabında (4-5 °C’de) muhafaza
edildi.
Şekil 2.2. Katı-hal NH4+-seçici sensör yüzeyine L-AAO enziminin tek adımda
tutturulması.
41
Bu şekilde hazırlanan aminoasit biyosensörün bir şematik olarak görünümü Şekil 2.3’te
görülmektedir.
Şekil 2.3. Kompozit yapıda aminoasit biyosensör.
Daha sonra kompozit yapıda aminoasit biyosensörler, değişik aminoasit çözeltileri için
test edilerek karakteristik özellikleri incelendi. Ölçümler çoğunlukla aminoasitlerin 1xl0-11x10-5 M çözeltileri kullanılarak yapıldı. Ölçüm alınırken, seyreltik çözeltilerden derişik
çözeltilere doğru bir sıra takip edilerek veriler alındı. Her ölçümden önce kompozit yapıda
aminoasit biyosensör ve referans elektrot çifti deiyonize su ile yıkandı.
2.2.4. Hareketli Ortam Hücresinin Hazırlanması
Akış Enjeksiyon Analiz (AEA) ve ve İyon Kromatografik sistemde dedektör olarak
kullanılan minyatürize akış hücreleri (mikrolitre ölü hacime sahip) şekil 2.4’te görüldüğü gibi.
2 cm uzunluğu, 1 cm genişliğinde ve 2 cm yüksekliğinde polikarbonat malzeme bloğunda
oluşturuldu. Polikarbonat blok üzerine, NH4+-seçici sensör veya mikro boyutlarda amino asit
duyarlı biyosensörle beraber, mikro boyutlarda polimer jel Ag/AgCl referans elektrot
yerleştirildi. Sensörlerin mikro boyutlarda olması aynı anda birden fazla sensörün
kullanılmasına da izin vermekteydi. Nitekim test amaçlı iki aminoasit biyosensörün birlikte
kullanıldığı bir akış hücre hazırlanarak kontrol amaçlı testler yapıldı. Mikro boyutlarda
polimer jel Ag/AgCl referans elektrot laboratuvarlarımızda geliştirilmiştir. Kompozit yapıda
sensor materyalin işlenebilmesi, bu şekilde mikrolitre ölü hacme sahip minyatürize akış
hücrelerinin hazırlanmasına izin vermektedir.
42
Şekil 2.4. Mikrolitre ölü hacime sahip 2 aminoasit biyosensör içeren akış hücresi
2.2.5. İyon Kromatografik Çalışmalar
Kromatografik ayırımlar tek kolonlu iyon kromatografi (suppresor kolon kullanılmadan)
modunda gerçekleştirildi. Yukarıda ifade edilen şekilde hazırlanan mikrolitre ölü hacme sahip
akış hücreleri, iyon kromatografik sistemde bir dedektör gibi ayırım kolonu çıkışına
bağlanarak izokritik olarak ayırımı sağlanan serbest aminoasitlerin eşzamanlı tayini
ekonomik, kolay ve basit bir şekilde sağlandı. Şekil 2.5’de çalışmada kullanılan iyon
kromatografi-potansiyometri hibrit sistemi ve potansiyometrik deteksiyon hücresi şematize
edilmiştir. İyon kromatografik çalışmalarda Dionex Amino Pac PA 10 analitik kolon, 2-mm
kullanıldı. Hareketli faz türü ve hareketli faz akış hızı gibi analitik parametreler ayrı ayrı test
edilerek optimum çalışma şartları belirlenmeye çalışıldı.
Şekil 2.5. Aminoasit tayininde kullanılan iyon kromatografi-potansiyometri hibrit
sistem. (IC: iyon kromatografik sistem; AK: analitik kolon; PDH: potansyometrik dedektör
43
hücre; P: potansiyometre; B: bilgisayar; M: monitör; AA Biyosensör: aminoasit biyosensör;
RE: referans elektrot)
2.2.6. Potansiyometrik Tayin Prensibi
Modern bir iyon seçici elektrotta, iyon seçici membran iyonların iç standart ve test
çözeltisini birbirinden ayırır. Elektronlar, iyonlar ve test edilen iyonun yüklü yada nötral
kompleksleri, membranın iç kısımlarına doğru iç standart çözeltinin kompozisyonuyla orantılı
olarak taşınırlar. Böylece oluşan elektrostatik potansiyel (EMF), standart referans yarı
hücresiyle membran yarı hücresi birleştirilerek ölçülür. Bir iyon seçici elektrot hücresindeki
potansiyel değişimi şematik olarak aşağıdaki gibi gösterilebilir (Skoog and West, 1982).
İç referans elektrot / İç referans çözelti // İyon seçici elektrot membran // Test
çözeltisi / Dış referans elektrot, veya;
İç referans elektrot (bakır tel gibi) / Katı-hal kontak // İyon seçici elektrot
membran // Test çözeltisi / Dış referans elektrot
Bir elektrotun potansiyel farkı (E) Nernst Eşitliği ile verilmiştir.
E  E 
RT
ln a i
nF
Eşitlikteki E; İndikatör elektrot potansiyeli, E; standart elektrot potansiyeli, R, T ve F; sabit
sayılar, ai; elektrotta hissedilen iyon aktivitesi, n; reaksiyonda alınıp verilen elektron sayısı
veya membran elektrotta aktif iyon yüküdür.
Eğer iyon aktivitesi a1 den a2 ye değişiyorsa potansiyel değişimi aşağıdaki gibi olur.
 RT  a 2
E  E  (sbt)  
 ln
 nF  a 1
Eşitliğe göre, çözeltide iyon aktivitesinin artması sonucu elektrotun cevabı logaritmik
olarak gözlenir.
Eğer ölçümler 25 C de alınırsa Nernst eşitliği aşağıdaki gibi olur.
E  E  (sbt) 
a
0,0592
log 2
n
a1
44
Buna göre
25 C de E - loga i ilişkisinin teorik değişimi n yüklü iyonlar için 59.2/n mV dür. Bu
değişim genel olarak katyonlar için pozitif anyonlar için negatiftir.
2.2.7 Elektrotların Seçicilik hesaplamaları
Seçicilik katsayısının hesaplanmasında metotlardan herhangi birisi kullanılabilir.
Bizim çalışmamızda ayrı çözelti metotu kullanıldı. Ayrı çözelti metotunda, elektrotun hem
analite karşı hem de girişim yapan maddeye karşı kalibrasyonu alındı ve Şekil 2.3’te
gösterildiği gibi kalibrasyon grafikleri karşılaştırılarak seçicilik katsayısı hesaplandı.
Şekil 2.6. Seçicilik katsayısının kalibrasyon grafiği ile gösterimi.
45
3. BULGULAR VE TARTIŞMA
Kompozit potansiyometrik sensörler hazırlanarak ve seçicilik, cevap zamanı, tayin
limiti, durgun ortam potansiyometrik performansları gibi davranışları incelendi.
Amino asit biyosensörlerinin hazırlanmasında, temel sensör (iyon seçici elektrot)
olarak katı-hal amonyum elektrotları kullanıldı. Ve bu kompozit katı-hal elektrotların
potansiyometrik performansları belirlendi. Hazırlanan NH4+-seçici sensörün şematik
görünümü Şekil 3.1'de görülmektedir. Aminoasit biyosensörünün hazırlanması amacına
yönelik olarak, PVC-NH2 kokteyli hazırlanmış ve bu aşamada, amonyum iyonofor I, di-cyclohexyl 18-crown–6, potasyum tetrakis(4-klorofenil) borat (KTpClPB), o-nitrofeniloktil eter (oNPOE) ve PVC-NH2 bileşenlerinin miktarları değişik oranlarda kullanılarak test edilerek en
uygun kompozisyon tespit edilmiştir.
Şekil 3.1. Katı hal NH4+-seçici sensor
Potansiyometrik
enzim
biyosensörün
performansı,
iyonofor
oranınadan
etkilenmektedir ve biyosensörün seçicilik, cevap zamanı, kullanım süresi gibi önemli
özelliklerini etkileyerek önemli bir rol oynamaktadır. İyon seçici elektrotun, enzimin kataliz
reaksiyonu sonucu oluşan iyona seçici olması, cevap süresinin kısa olması, uzun süre
kullanılması enzim biyosensörün performansının yüksek olmasını sağlamaktadır.
3.1.
KOMPOZİT
NH4+-SEÇİCİ
ELEKTROTUN
POTANSİYOMETRİK
PERFORMANSI
Hazırlanan kompozit katı-hal NH4+-seçici elektrotlar, test edilmeden önce ana iyon
çözeltilerinde (NH4+NO3-), şartlanmaya bırakıldı. Bu şekilde hazırlanan kompozit katı-hal
46
NH4+-seçici elektrotlar test edilerek karakteristik özellikleri incelendi. Ölçümler arasında
elektrotun de iyonize su ile yıkanmasına dikkat edildi.
Farklı kompozisyonlarda hazırlanan kompozit NH4+-seçici elektrotların 1x10-1-5x10-5
mol/L NH4+ konsantrasyon değişimine karşı potansiyometrik davranışları incelenerek
biyosensör yapımı için en uygun kompozit karışımı tespit edildi. Tablo 3.1’de elektrotların
kompozisyon oranları yüzde olarak görülmektedir. Farklı kompozisyonlarda hazırlanan bazı
elektrotların zamana bağlı ve NH4+ konsantrosyonunun değişimine karşı elde edilen
potansiyel değişimleri Şekil 3.2-4’te ve Tablo 3.2’de görülmektedir.
NH4+
konsantrasyonunun
değişimine
karşı
ölçülen
potansiyel
değişimlerini
incelediğimizde kompozit 3 yapısına sahip membran elektrotun diğerlerine oranla daha iyi bir
değişim sergilediği görülmektedir. Elde edilen potansiyel değişim değerleri Nernst
denklemine de uygunluk göstermektedir. Elektrotun NH4+ iyonunun 1x10-1-5x10-5 M
aralığında konsantrasyon değişimlerine karşı sergilediği cevap Şekil 3.4. de görülmektedir.
Hazırlanan kompozit 3 elektrotun 8 saniyeden daha az cevap zamanı ve uzun süre kullanım
ömrüne sahip olduğu gözlemlenmiştir.
Tablo 3. 1. Kompozit 1,2 ve 3 membranları için kimyasal bileşim oranları
% Bileşen
Kompozit 1
Kompozit 2
Kompozit 3
NFOE
65
65
64
PVC-NH2
32
32,5
31,5
Amonyum
İyonofor
2
2
4
KTClPB
0,5
0,5
0,5
Dibenzo-18crown-6
0,5
-
-
47
Şekil 3.2. Kompozit 1 membranlı NH4+ seçici elektrotun potansiyometrik davranışı
Şekil 3.3. Kompozit 2 membranlı NH4+ seçici elektrotun potansiyometrik davranışı
48
Şekil 3.4. Kompozit 3 membranlı NH4+ seçici elektrotun potansiyometrik davranışı
Tablo 3.2. Farklı kompozisyonlarda hazırlanan amonyum elektrotların değişen NH4+
konsantrasyonlarına karsı elde edilen potansiyel değerleri (mV).
-LogC (mol/L)
Kompozit 1
Kompozit 2
Kompozit 3
1
2874±2
2845±4
2917±2
2
2845±3
2814±3
2863±2
3
2792±4
2761±3
2808±4
4
2734±3
2707±2
2752±3
5
2726±2
2700±2
2687±6
6
2721±3
2693±3
2695±2
NH4+
konsantrasyonunun
değişimine
karşı
ölçülen
potansiyel
değişimlerini
incelediğimizde kompozit 3 membranlı elektrotların diğerlerine oranla daha iyi bir değişim
sergiledikleri görülmektedir. Elde edilen potansiyel değişim değerleri Nernst denklemine de
uygunluk
göstermektedir.
Elektrotun
NH4+
iyonunun
1x10-1-5x10-5 M
aralığında
konsantrasyon değişimlerine karşı doğrusal cevap sergilediği görülmektedir. Hazırlanan
49
kompozit elektrotun 8 saniyeden daha az cevap zamanı ve uzun süre kullanım ömrüne sahip
olduğu gözlemlenmiştir.
NH4+ elektrotların değişen konsantrasyon değerlerine karşı sergiledikleri doğrusallık
şekil 3.5’de görülmektedir.
Şekil 3.5. kompozit 1-2-3 membranlarının kalibrasyon grafiği
Kalibrasyon grafiğiklerinden görüldüğü gibi NH4+ konsantrasyonunun değişimine
karşı en iyi cevap sergileyen kompozit 3 bileşenine sahip olan elektrotun doğrusal eğim
grafiği Şekil 3.6’da görülmektedir.
Şekil 3.6. Kompozit 3 no’ lu NH4+ seçici elektrotun kalibrasyon grafiği
50
Elektrotlar 10-1 – 10-6 M NH4+ derişim aralığında 10-5 M' a kadar çok iyi bir
doğrusallık sergilemiştir. Ancak 10-6 M da potansiyel değişim daha az bulunmuştur.
Konsantrasyon artışına doğru ölçüm alındığında 1 nolu elektrotun dengeye gelmesi biraz
yavaş olmaktadır.
Hazırlanan NH4+ elektrotların girişim yapma olasılıkları yüksek olabilen K+, Na+ ve
Ca2+ iyonlarına karşı potansiyel değerleri ölçülerek seçicilikleri belirlendi. Amonyum
elektrotunun, değişik konsantrasyonlarda NH4+ ve diğer iyonların (K+, Na+, Ca2+)
konsantrasyonlarına karşı elde edilen potansiyel davranışları Şekil 3.7-9’da görülmektedir.
NH4+ elektrotun bu iyonlara karşı sergilediği potansiyel değerleri Tablo 3.3’de ve bu
değerlerin kalibrasyon grafikleri de Şekil 3.10’da görülmektedir..
Şekil 3.7. NH4+ elektrotun Ca2+ iyonuna karşı potansiyometrik davranışı.
51
Şekil 3.8. NH4+ elektrotun K+ iyonuna karşı potansiyometrik davranışı.
Şekil 3.9. NH4+ elektrotun Na+ iyonuna karşı potansiyometrik davranışı.
52
Tablo 3.3. NH4+ elektrotun K+, Na+, Ca2+ iyonlarının konsantrasyonlarına karşı elde
edilen ortalama mV potansiyel değerleri. (n: 3)
-LogC
(mol/L)
NH4+
Ca2+
K+
Na+
1
2868±3
2772±3
2758±3
2810±2
2
2816±2
2727±2
2726±3
2777±3
3
2765±2
2706±2
2697±2
2728±2
4
2713±3
2687±2
2695±3
2696±2
5
2652±4
2698±1
2715±3
2723±2
6
2627±2
-
-
-
NH4+ elektrotun Na+, K+ ve Ca2+ iyonları yanında NH4+ iyonuna karşı sergilediği
seçiciliğin bir ifadesi olan elektrotun seçicilik sabitleri ayrı çözelti metoduna göre
hesaplanarak Tablo 3.4’te verilmiştir.
Tablo 3. 4. NH4+ seçici elektrotun Na+, K+ ve Ca2+ yanında seçicilik katsayıları
Girişim Yapan İyon
Ki,j
log Ki,j
Na+
0,003042
-2,50
K+
0,122247
-0,90
Ca2+
0,000510
-3,27
53
Şekil 3.10. NH4+ -seçici elektrotun NH4+, Ca2+, K+ ve Na+ derişimlerine karşı
potansiyometrik davranışı
Şekil 3.10’da görüldüğü gibi kompozit NH4+ elektrotunun girişim yapma olasılıkları
olan K+, Na+ ve Ca2+ iyonlarına karşı sergilediği potansiyel doğrusallık aralığı 1x10-1 – 1x10-4
M arasında değişmektedir. Ayrıca NH4+ elektrotun NH4+ iyonuna bu iyonlardan daha fazla
seçici davrandığı görülmektedir.
Şekil 3.11 en uygun kompozisyona sahip olan kompozit 3 membranlı NH4+-seçici
elektrotun tekrarlanabilirliğini göstermektedir. 10-2, 10-3 ve 10-4 M NH4+ çözeltileri
kullanılarak alınan ölçümlerde elde edilen ortalama potansiyel değerleri sırasıyla 133,8 ± 1,5,
141,0 ± 1,2 ve 190,3 ± 1,3 olarak hesaplanmıştır.
54
Şekil 3.11. NH4+-seçici elektrotun tekrarlanabilirliği
NH4+-seçici elektrotun pH çalışma aralığını belirlemek için, pH’sı 2-12 arasında
değişen 10-2 M sabit NH4+ konsantrasyonu ve 5x10-3 M fosfat tamponu çözeltilerinde alınan
ölçümlerle belirlendi. Şekil 3.12’de görüldüğü gibi pH:2-7 aralığında elektrot, ortam
pH’sından etkilenmeden çalışabilmektedir.
Şekil 3.12. NH4+-seçici elektrotun pH çalışma aralığı
55
Kompozit yapıda NH4+-seçici sensörün kullanım ömrü ise zamana bağlı olarak 10-1-10-5
M NH4+ çözeltilerinden alınan ölçümlerle çizilen kalibrasyon grafiğinin eğimindeki değişim
dikkate alınarak belirlendi. Şekil 3.13’de Kompozit yapıda NH4+-seçici sensörün verdiği
cevabın eğiminin zamana bağlı olarak değişimi görülmektedir. Kompozit yapıda NH4+-seçici
sensör, hazırlandıktan sonraki 45 günlük süre içerisinde yaklaşık 30 mV’luk bir eğimle iyi bir
performans sergilemektedir. Hazırlandıktan sonraki 2-5 aylık süreç içerisinde sensör cevap
eğimi yaklaşık 15 mV seviyesine düşmektedir.
Şekil 3.13. NH4+- seçici elektrotun kullanım ömrü
Yukarıda verilen bütün sonuçlar kompozit yapıda NH4+-seçici sensörün aminoasit
duyarlı biyosensör hazırlamada başarıyla kullanılabileceğini göstermektedir. Nitekim
kompozit yapıda NH4+-seçici sensör temel alınarak aminoasit duyarlı biyosensör başarıyla
hazırlandı. Aminoasit duyarlı biyosensörün hazırlanışı ve bu biyosensörle statik ve dinamik
şartlarda elde edilen sonuçlar aşağıda verilmiştir.
3.2. L-AMİNO ASİT OKSİDAZ (L-AAO) ENZİMİNİN, NH4+ ELEKTRODU
YÜZEYİNDE İMMOBİLİZASYONU
Çalışmalarımızın bu aşamasında elde ettiğimiz en uygun kompozit NH4+-seçici
elektrotu kullanarak aminoasitlere duyarlı olabilecek biyosensör yapımına gidildi. Uygun
olarak çalıştığı tespit edilen kompozit 3 membranla hazırlanan elektrotlar üzerine enzim
membran tabakası kaplandı. Enzim molekülünün L-aminoasit oksidaz (L-AAO), çapraz
56
bağlayıcı reaktif olan glutaraldehit ile bağlanması sağlandı. Glutaraldehit ile bağlanan enzim,
amonyum elektrotunun yüzeyine uygun bir yöntemle tutturuldu. (L-AAO) enzim tabakasının
kaplanmasıyla hazırlanan aminoasit biyosensörlerinin yüzeyi kuruyuncaya kadar karanlıkta
(yaklaşık 4-5 saat) saklandı. Kuruduktan sonra dolapta muhafaza edildi. Daha sonra bu
elektrotlar, değişik aminoasit çözeltilerinde test edilerek potansiyometrik davranışları
incelendi.
Şekil 3.14 ve Şekil 3.15’de, enzim molekülünün (L-AAO) glutaraldehit molekülüne
bağlanması ve amonyum elektrotunun yüzeyine glutaraldehit ile bağlanmış enzim
molekülünün tutturulması mekanizması görülmektedir. Ölçümler çoğunlukla aminoasitlerin
1xl0-1-1x10-5 mol.L-1 çözeltileri kullanılarak yapıldı. Ölçüm alınırken, seyreltik çözeltilerden
derişik çözeltilere tekrar derişik çözeltiden seyreltik çözeltilere doğru bir sıra takip edilerek
veriler alındı. Her ölçümden önce indikatör elektrot ve referans elektrot çifti deiyonize su ile
yıkandı.
Şekil 3.14. Enzim molekülü ile glutaraldehit molekülünün bağlanması.
57
Şekil 3.15. Amonyum elektrotunun yüzeyine, glutaraldehit ile bağlanmış enzim
molekülünün (L-AAO) tutturulması
Glutaraldehit ile bağlanmış enzim molekülü (L-AAO), hazırlanan amonyum elektrotun
yüzeyine bağlanması ile immobilize edildi. Böylece temel aminoasitlere karsı potansiyometrik
cevap sergileyen aminoasit biyosensörlerini geliştirildi (Şekil 3.16).
Şekil 3. 16. Enzim-Gluteraldehit çözeltisine daldırılarak hazırlanan bir biyosensör.
58
Şekil 3.17'de hazırlamış olduğumuz biyosensörün genel şematik gösterimi görülmektedir.
Şekil 3.17. Biyosensörün şematik gösterimi
3. 3. AMİNOASİT BİYOSENSÖRLERİN POTANSİYOMETRİK DAVRANIŞLARI
3. 3. 1. Biyosensörün deiyonize suda hazırlanan amino asit çözeltilerine karşı potansiyel
davranışları
Hazırlanan biyosensörün 1x10-1-1x10-5 M konsantrasyon aralığındaki aminoasit
çözeltilerine karşı sergiledikleri potansiyometrik davranışları incelendi. Deiyonize su
içerisinde hazırlanmış olan aminoasitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı biyosensörlerin
sergiledikleri potansiyel değişimleri Şekil 3. 18-24’de görülmektedir.
Şekil 3.18. Elektrotun 10-1 – 10-5 M çözeltilerde alanine karşı potansiyometrik davranışı
59
Şekil 3.19. Elektrotun 10-1 – 10-5 M seri çözeltilerde glisine karşı potansiyometrik davranışı
Şekil 3.20. Elektrotun 10-1 – 10-4 M seri çözeltilerde izolösine karşı potansiyometrik davranışı
60
Şekil 3.21. Elektrotun 10-1 – 10-5 M seri çözeltilerde triptofan karşı potansiyometrik davranışı
Şekil 3.22. Elektrotun 10-1–10-5 M seri çözeltilerde fenilalanine karşı potansiyometrik
davranışı
61
Şekil 3.23. Elektrotun 10-1 – 10-4 M seri çözeltilerde trozine karşı potansiyometrik davranışı
Şekil 3.24. Elektrotun 10-1 – 10-5 M seri çözeltilerde valine karşı potansiyometrik davranışı
62
Deiyonize suda çözülen aminoasitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı ölçülen
potansiyel değişimlerini incelediğimizde alanin valin, fenilalanin, trozinin ve izolösinin 1x10-1
– 1x10-4 M aralığında triptofanın 1x10-2 – 1x10-5 M aralığında doğrusal bir potansiyel
sergilediği görülmektedir. Elde edilen potansiyel değerler Tablo 3.5’de ve potansiyel
değişimlerinin grafiksel gösterimi de Şekil 3.25’de görülmektedir. Amino asit biyosensör,
alanin, valin, fenilalanin, izolösinin 10-4 -10-2 M derişimleri aralığında her 10 kat derişim
farkına karşı yaklaşık 40 mV’luk bir potansiyel değişimi sergilerken trozine karşı sadece 10-3 10-2 M derişim aralığında 90 mV potansiyel farkı sergilemekteydi. Bu durum amino asitlerin
izoelektrik noktaları ile açıklanabilir.
Şekil 3.12’de elektrotun elektrotun pH çalışma aralığı ile amino asitlerin izoelektrik
pH değerleri arasında bir fark görülmektedir. Ortaya çıkan bu farklı durum tam olarak
anlaşılmamakla beraber, sonuçlar amino asitlerin izoelektrik noktaları, (pI değerleri: alanin
için 6; valin için 5.96; fenilalanin için 5.48; izolösinin için 6.02; ve trozine için 5.66 ) ile
uyum içerisinde görülmektedir. Sensörün duyarlılık sergilediği bütün aminoasitler için pI
değerleri yaklaşık 5 ile 6 arasındadır. Bu durum bu amino asitlerin pH 5-6 aralığında nötral
olduğunu dolayısıyla enzimin bu aralıkta daha iyi çalışarak amino asitlerin bütününü
katalizlediğini göstermektedir. Bu nedenle biyosensör, test edilen bu aminoasitlere karşı seçici
davranmamaktadır.
Elektrot glisine karşı artan konsantrasyon sırasında ölçüm için kullanıldığında 40 mV/
her on kat fark şeklinde değişim gösterirken, geri dönüşte bu fark azalmakta ve potansiyel
farkı düşmektedir. Bu durum biyosensörün yüksek konsantrasyondan düşük konsantrasyona
doğru inerken cevap zamanının uzadığını göstermektedir. Genel olarak iyon-seçici
elektrotlarda sıkça rastlanan bu duruma, birçok biyosensör için de rastlanabilmektedir. Ancak
elektrot bol deiyonize su ile yıkanarak tekrar artan konsantrasyon yönünde kullanıldığında
cevap zamanı hızlanmakta ve tekrarlanabilir sonuçlar sergileyebilmekteydi.
Diğer taraftan biyosensörün alanine karşı cevabına bakıldığında 10-4-10-2 M aralığında
doğrusal davranırken 10-4 ile 10-5 M arasında davranış tersine dönmektedir. Bu durum
beklenenden farklı bir durumdur. Zaman zaman ortaya çıkan buna benzer durumlar diğer
biyosensör sistemlerde de görülmektedir. Tam olarak nedeni ortaya konamayan bu durum,
çoğunlukla
biyosensör
mebranın
veya
ilişkilendirilmektedir.
63
biyotabakanın
hetorejen
karekteriyle
Tablo 3.5 Aminoasit biyosensörünün aminoasitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı elde
edilen ortalama mV potansiyel değerleri. (n: 3)
-LogC
Alanin
(mol/L)
Glisin
İzolösin Triptofan Fenilalanin
Trozin
Valin
-
2503±4
1
2555±3 2513±3
2573±3
-
2555±2
2
2523±2 2515±3
2533±2
2574±2
2503±3
2552±2 2476±6
3
2493±3 2473±4
2470±3
2512±2
2451±3
2462±2 2441±5
4
2442±3 2460±2
2432±2
2457±2
2433±2
2451±2 2434±5
5
2482±2 2433±3
-
2446±2
2479±3
-
-
Şekil 3.25. Deiyonize su içerisinde, değisik konsantrasyonlardaki, Ala, Gln, Ile,
Trp, Phe, Tyr, ve Val amino asitleri için kalibrasyon grafiği
.
Aminoasitlerden triptofan ve trozinin 1x10-2 M’lık stok çözeltileri hazırlanıp seyreltme
yoluyla diğer çözeltileri hazırlandığından bu aminoasitlerin 1x10-1 M daki potansiyel
davranışları ölçülemedi. İzolösin, trozin ve valinin 1x10-5 M’lık çözeltilerinde ise biyosensör
elektrot ters çalışmakta vegüvenilir sonuçlar vermemektedir. Hazırlanan amino asit
biyosensörü diğer amino asitlere karşıda bir potansiyel sergilemekte ancak tam doğrusal bir
ilişki gözlenememektedir. Bu durumun nedeni enzimin aktif bölgesinin substratla olan
ilişkidir. Çünkü amino asitler sadece R yan grupları ile birbirinden farklıdır. Bundan dolayı
amino asit biyosensörün amino asitlere karşı cevabı birbirinden farklı olmaktadır (Turna,
2006).
64
3.3.2. Biyosensörün pH’sı 7,02 olan fosfat tamponunda hazırlanan amino asit
çözeltilerine karşı potansiyel davranışları
Hazırlanan biyosensörün pH’sı 7,02 ye ayarlanmış fosfat tamponu ile hazırlanan 1x101
-1x10-5
M
konsantrasyon
aralığındaki
aminoasit
çözeltilerine
karşı
sergiledikleri
potansiyometrik davranışları incelendi. Aminoasitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı
biyosensörün sergilediği potansiyel değişimleri Şekil 3. 26-31'de görülmektedir.
Şekil 3.26. Amino asit Biyosensörünün, alaninin 10-1 – 10-5 M’lık çözeltilerindeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)
Şekil 3.27. Amino asit Biyosensörünün, lisinin 10-2 – 10-5 M’lık çözeltilerindeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)
65
Şekil 3.28. Amino asit Biyosensörünün, fenilalanin10-1 – 10-5 M’lık çözeltilerindeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)
Şekil 3.29. Amino asit Biyosensörünün, histidinin 10-1 – 10-5 M’lık çözeltilerinde
potansiyometrik davranış (pH: 7,2)
66
Şekil 3.30. Amino asit Biyosensörünün, glisinin 10-1–10-5 M’lık
çözeltilerdeki
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)
Şekil 3.31. Amino asit Biyosensörünün, glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık
potansiyometrik davranışı (pH: 7,2)
67
çözeltilerdeki
Hazırlanan biyosensörün fosfat tamponu ile hazırlanmış amino asit çözeltilerinin
konsantrasyon değişimlerine karşı ölçülen potansiyel değişimlerini incelediğimizde lisin ve
histidin 1x10-1–1x10-3 M aralığında 10 mV’ luk bir potansiyel değişim gösterse de 10-3-10-5 M
arasında kayda değer bir potansiyel değişim olmadığı görülmektedir. Glisin 10-1-10-2 M
arasında az bir potansiyel fark göstermiş olmasına rağmen 10-2-10-5 M aralığında 20-25
mV’luk doğrusal bir potansiyel değişime sahiptir. Aynı performansı glutamik asit 10-2-10-4 M
aralığında göstermektedir. Ancak 10-4-10-5 potansiyel fark biraz düşük kalmıştır. Alanin ve
Fenilalanin 10-1-10-2 M aralığında 50-55 mV’ luk ve 10-2-10-3 M aralığında da 10-15 mV’luk
bir potansiyel değişim gösterdiği görülmektedir. Elde edilen potansiyel değerler. Tablo 3. 6’
da ve potansiyel değişimleri de Şekil 3. 32’de görülmektedir.
Tablo 3.6. Fosfat tamponunda hazırlanan amino asitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı
elde edilen ortalama mV potansiyel değerleri. (n: 3)
-LogC
(mol/L)
Alanin
Lisin
Fenilalanin
Histidin
Glisin
Glutamik asit
1
2554±7
-
2573±3
2499±2
2566±5
-
2
2502±7
2493±3
2517±3
2485±4
2592±7
2586±5
3
2481±4
2473±2
2492±1
2478±3
2616±13
2554±1
4
2477±2
2483±2
2487±3
2478±5
2624±7
2533±4
5
2476±2
2485±3
2483±8
2476±3
2626±3
2519±3
68
Şekil 3.32. Fosfat tamponu ortamında (pH=7,2) Ala, Lys, Phe, His, Gly, Glu amino asitlerinin
konsantrasyon değişimlerine karşı biyosensörün potansiyometrik davranışı.
3.3.3 Aminoasit biyosensörün farklı pH’lardaki Amino asit çözeltilerine karşı
davranışları
Her enzim için aktivitelerin maksimum olduğu pH değerleri vardır. Bu değerlerin
üzerinde ve altında enzimin aktivitesi düşmektedir. İmmobilizasyon sonucu bazı durumlarda
taşıyıcının doğasına bağlı olarak optimum pH’ da kaymalar olabilir. L-Aminoasit oksidaz
enzimi optimum aktiviteyi pH=7,2 civarında göstermektedir. Bu nedenle temel amino
asitlerimizden Arjinin, glisin ve glutamik asit temsili seçilerek fosfat tamponunda pH’nın 6,0;
7,2 ve 8,0 olduğu seri çözeltiler hazırlanarak biyosensörler test edilmiştir. Bu amino asitlerin
fosfat tamponunda farklı pH’ larda hazırlanan 1x10-1–1x10-5 M standart çözeltilerine karşı
amino asit biyosensörüyle ölçülen test sonuçları Şekil 3. 33-41’de görülmektedir.
69
Şekil 3.33. Sensörün pH: 6,0’da arjininin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
Şekil 3.34. Sensörün pH: 7,2’de arjininin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
Şekil 3.35. Sensörün pH: 8,0’de arjininin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
70
Şekil 3.36. Sensörün pH: 6,0’da glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
Şekil 3.37. Sensörün pH: 7,2’de glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
Şekil 3.38. Sensörün pH: 8,0’de glisinin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
71
Şekil 3.39. Sensörün pH: 6,0’da glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
Şekil 3.40. Sensörün pH: 7,2’de glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
Şekil 3.41. Sensörün pH: 8,0’de glutamik asitin 10-1–10-5 M’lık çözeltilerindeki davranışı
72
Aminoasitlerin farklı pH’larda hazırlanan çözeltilerdeki konsantrasyon değişimlerine
karşı biyosensörümüz arjinin için bir potansiyel değişimi göstermemiştir, ayrıca kararsız
davranmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlardan L-amino asit oksidaz enziminin optimum aktivite
gösterdiği pH=7,2 civarında, amino asit biyosensörünün amino asitlerin konsantrasyon
değişimlerine karşı daha doğrusal bir sonuç verdiği görülmüştür.
pH’sı 7,2 olan fosfat tamponundaki ölçümlerimiz sonucu elde ettiğimiz potansiyel
değişim değerleri Tablo 3.7’de ve amino asitlerin konsantrasyon değişimlerine karşı göstermiş
olduğu potansiyel değişimleri de Şekil 3.42’de görülmektedir.
Tablo 3.7. Fosfat tamponunda (pH= 7,2) hazırlanan konsantrasyon değişimlerine karşı elde
edilen ortalama mV potansiyel değerleri. (n: 3)
-LogC (mol/L)
Arjinin
Glisin
Glutamik asit
1
2521
2526
-
2
2502
2617
2586
3
2501
2603
2554
4
2504
2585
2533
5
2506
2563
2519
Şekil 3.42. Biyosensörün, fosfat tamponunda (pH= 7,2) hazırlanan amino asit konsantrasyon
değişimlerine karşı potansiyometrik davranışı.
73
3.4. AKIŞ ENJEKSİYON ANALİZ ÇALIŞMALARI
Akış enjeksiyon analiz (AEA) ve iyon kromatografik sistemde dedektör olarak
kullanılan minyatürize akış hücreleri (mikrolitre ölü hacime sahip) şekil 3.43’de görüldüğü
gibi 2 cm uzunluğu, 1 cm genişliğinde ve 2 cm yüksekliğinde polikarbonat malzeme bloğunda
oluşturuldu. Polikarbonat blok üzerine, NH4+-seçici sensör veya mikro boyutlarda amino asit
duyarlı biyosensörle beraber, mikro boyutlarda polimer jel Ag/AgCl referans elektrot
yerleştirildi. Sensörlerin mikro boyutlarda olması aynı anda birden fazla sensörün
kullanılmasına da izin vermekteydi. Nitekim test amaçlı iki aminoasit biyosensörün birlikte
kullanıldığı bir akış hücre hazırlanarak kontrol amaçlı testler yapıldı. Mikro boyutlarda
polimer jel Ag/AgCl referans elektrot laboratuvarlarımızda geliştirilmiştir. Kompozit yapıda
sensor materyalin işlenebilmesi, bu şekilde mikrolitre ölü hacme sahip minyatürize akış
hücrelerinin hazırlanmasına izin vermektedir.
Şekil 3.43. Mikrolitre ölü hacime sahip 2 aminoasit biyosensör içeren akış hücresi
AEA sisteminin optimizasyonu için hareketli faz kompozisyonu ve akış hızı test
edilerek en uygun akış parametreleri belirlendi. Bu amaçla yaptığımız çalışmalarda en uygun
hareketli fazın, kromatografik ayırım ve literatürde yapılan çalışmalar dikkate alınarak,
sodyum hidroksit içeren 0.5 M sodyumasetat çözeltisi olduğu belirlendi. 0.1 M NaOH + 0.5
M sodyum asetat hareketli faz olarak kullanılarak yapılan ölçümler sonucu en uygun akış hızı
0,8 ml/dk olarak belirlendi. Bu şartlar altında, 1,0x10-4 - 1,0x10-2 M konsantrasyon aralığında
standart aminoasit çözeltileri sisteme enjekte edilerek potansiyometrik davranışları incelendi.
Sisteme enjekte edilen farklı konsantrasyonlarda aminoasit çözeltileri için kalibrasyon
74
grafikleri elde edildi. Standart fenilalanin çözeltilerinin enjeksiyonu sonucu elde edilen örnek
bir flow-gram, Şekil 3.44’de görülmektedir.
Şekil 3.44. Akış enjeksiyon analiz sisteminde aminoasit duyarlı biyosensörün
fenilalaninin farklı konsantrasyonalarına karşı potansiyometrik cevabı.
Aminoasit duyarlı biyosensör ile akış enjeksiyon analiz sisteminde aminoasitler için
elde edilen sonuçlar iyon kromatografik sistemde aminoasit duyarlı biyosensörün detektör
olarak, aminoasitlerin duyarlı bir şekilde direkt olarak tayini için kullanılabileceğini
göstermektedir.
3.5. İYON KROMATOGRAFİK ÇALIŞMALAR
Kromatografik ayırımlar tek kolonlu iyon kromatografi (suppresor kolon kullanılmadan)
modunda gerçekleştirildi. Yukarıda ifade edilen şekilde hazırlanan mikrolitre ölü hacme sahip
akış hücreleri, iyon kromatografik sistemde bir dedektör gibi ayırım kolonu çıkışına
bağlanarak izokritik olarak ayırımı sağlanan serbest aminoasitlerin eşzamanlı tayini
ekonomik, kolay ve basit bir şekilde sağlandı. Şekil 3.45’de çalışmada kullanılan iyon
kromatografi-potansiyometri hibrit sistemi ve potansiyometrik deteksiyon hücresi şematize
edilmiştir. İyon kromatografik çalışmalarda Dionex Amino Pac PA 10 analitik kolon, 2-mm
kullanıldı. Hareketli faz türü ve hareketli faz akış hızı gibi analitik parametreler ayrı ayrı test
edilerek optimum çalışma şartları belirlenmeye çalışıldı.
75
Şekil 3.45. Aminoasit tayininde kullanılan iyon kromatografi-potansiyometri hibrit
sistem. (IC: iyon kromatografik sistem; AK: analitik kolon; PDH: potansyometrik dedektör
hücre; P: potansiyometre; B: bilgisayar; M: monitör; AA Biyosensör: aminoasit biyosensör;
RE: referans elektrot)
Yapılan ön analizlerde hareketli faz olarak, akış hızı 1 ml/dak olan 0.1 M NaOH + 0.5
M sodyumasetat karışımı kullanıldı. Geliştirilen aminoasit deteksiyon hücresi kullanılarak bu
şartlar altında elde edilen kromatogramlardan, enjeksiyonu yapılan amino asitlerin her biri için
alıkonma zamanları hesaplandı. Ayrıca farklı konsantrasyonlarda aminoasitlerin enjeksiyonu
ile elde edilen kromatogramlardan, tayin sınırları hesaplandı ve kromatografik şartlar altında
kalibrasyon grafikleri çizildi. Kalibrasyon grafikleri Şekil 3.46-54’de ve farklı hareketli faz
kombinasyonları kullanılarak iyon kromatografik çalışmalardan elde edilen örnek bazı
kromatogramlar Şekil 3. 55-60’da görülmektedir. Hareketli ortam çalışmalarında enjekte
edilen amino asit karışımlarında her bir amino asitin konsantrasyonu 2,5 x 10-4 M olacak
şekilde ayarlanmıştır.
76
Şekil 3. 46. Lösin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
Şekil 3. 47. Alanin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
77
Şekil 3. 48. Glisin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
Şekil 3. 49. Valin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
78
Şekil 3. 50. İzolösin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
Şekil 3. 51. Triptofan için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
79
Şekil 3. 52. Fenilalanin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
Şekil 3. 53. Sistin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
80
Şekil 3. 54. Trozin için biyosensörün sergilediği doğrusal çalışma aralığı
Şekil 3.55. 2,5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı.(Hareketli faz: 0.15 M
NaOH + 0.5 M sodyumasetat; akış hızı 1 ml/dak; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; 1. Alanin, 2.
Glisin, 3. Valin, 4. İzolösin, 5. Triptofan, 6. Fenilalanin, 7. Sistin, 8. Trozin)
81
Şekil 3.56. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı.(Hareketli faz: 0.1 M NaOH
+ 0.5 M sodyumasetat; akış hızı 1 ml/dak; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; 1. Lösin, 2. Alanin, 3.
Glisin, 4. Valin, 5. İzolösin, 6. Fenilalanin)
Şekil 3.57. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı.(Hareketli faz: 0.08 M
NaOH + 0.2 M sodyumasetat; akış hızı 1 ml/dak; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; 1. Lösin, 2.
Alanin, 3. Glisin, 4. Valin, 5. İzolösin, 6. Triptofan, 7. Fenilalanin)
82
Şekil 3.58. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı.(Hareketli faz: 0.2 M NaOH
+ 0.5 M sodyumasetat + % 5 asetonitril; akış hızı 1 ml/dak; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; 1.
Alanin, 2. Glisin, 3. Valin, 4. İzolösin, 5. Triptofan, 6. Fenilalanin, 7. Sistin, 8. Trozin)
Şekil 3.59. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı.(Hareketli faz: 0.1 M NaOH
+ 0.8 M sodyumasetat; akış hızı 1 ml/dak; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; 1. Alanin, 2. Glisin, 3.
Valin, 4. İzolösin, 5. Triptofan, 6. Fenilalanin, 7. Sistin, 8. Trozin)
83
Şekil 3.60. 2.5x10-4 M aminoasit karışımının kromatogramı.(Hareketli faz: 0.1 M NaOH
+ 0.3 M sodyumasetat; akış hızı 1 ml/dak; Enjeksiyon hacmi: 20 µL; 1. Alanin, 2. Glisin, 3.
Valin, 4. İzolösin, 5. Triptofan, 6. Fenilalanin, 7. Sistin, 8. Trozin)
Yukarıda verilen kromatogramlardan da görüleceği gibi, hareketli faz kompozisyonunun
değişmesi alıkonma zamanlarına etki ettiği gibi deteksiyon hücresinin cevabına ve baseline
gürültüye de önemli ölçüde eki ettiği izlenmektedir.
Şekil 3.46’daki şartlar altında aminoasitlerin tek tek enjeksiyonu sonucu elde edilen
kromatogramdan hesaplanan alıkonma zamanları ve tayin limitlerini içeren sonuçlar Tablo
3.8’de verilmiştir. Tablodan da görülebileceği gibi çok sayıda aminoasitin ayırımında, iyi bir
rezolusyon yakalanmıştır.
Farklı
konsantrasyonlarda
aminoasitlerin
enjeksiyonu
ile
elde
edilen
kromatogramlardan hesaplanan tayin sınırları ve lineer çalışma aralıkları sensörün durgun
ortamda sergilediği tayin sınırları ve lineer çalışma aralıklarından daha iyi çıkmıştır. Bu
durumun, amino asitlerin kolonda dağılmadan konsentre bandlar halinde sensör ölçüm
hücresine ulaşmasının neticesinde oluştuğu düşünülmektedir.
84
Tablo 3.8. Amino asitlerin geliştirilen iyon kromatografik yöntemde alıkonma zamanları
ve tayin sınırları
Amino asit
Alıkonma Zamanı (dak)
Tayin Sınırı (mol.L-1)
Lösin
8.0
1x10-4
Alanin
8.5
8x10-5
Glisin
9.5
5x10-5
Valin
11
3x10-5
İzolösin
14
7x10-5
Triptofan
16
6x10-5
Fenilalanin
18.5
2x10-5
Sistin
21.5
7x10-5
24
6x10-5
Tirozin
3.5.1. Örneklerde Amino Asit Analiz Sonuçları
Konsantre meyve suyu (Şeftali, kaysı, vişne, limon ve portakal) , hamur mayası ve
kuru fasülye örneklerinin ekstraksiyonu; Hamur mayası, kuru fasulye ve konsantre meyve
suyu örnekleri süpermarketten temin edildi. Her bir örnekten 20 g alındı. Kuru fasulye örneği
öğütüldü. Sonra sıvı-katı arasında bir kıvama gelinceye kadar deiyonize suyla muamele edildi.
Daha sonra %3 lük perklorik asit ile deprotonize edildi. Maya örneği de sıvı-katı arası
kıvamına gelinceye kadar deiyonize suyla seyreltildi. Daha sonra %3 lük perklorik asit ile
deprotonize edildi. Deprotonizasyon işleminden sonra her iki örnek de santrifüjlendi. Her iki
örnekten alınan sıvı kısımdan 20 µL direkt olarak sıvı kromatografik sisteme enjekte edildi.
Konsantre meyve suyu örnekleri santrifüj edildikten sonra direkt sıvı kromatografik sisteme
enjekte edildi.
Örneklerdeki 9 amino asit için piklerinin belirlenmesi, standart amino asit
çözeltilerinden elde edilen piklerin alıkonma zamanları dikkate alınarak sağlandı. Şüpheli
durumlarda gerçek örnek içerisine standart amino asit ilavesi yapılarak belirlendi.
Örneklerdeki amino asit miktarları, 0.01-10 mM arasında standart aminoasit çözeltileri
kullanılarak elde edilen aminoasit piklerin pik yükseklikleri dikkate alınarak elde edilen
kalibrasyon denkleminden hesaplandı. Bu aralıkta bütün amino asitler için kalibrasyon
85
denklemi doğrusaldı. Örnek çözeltilerin üç kez enjeksiyonu sonucu elde edilen pik
yüksekliklerinin ortalaması alınarak elde edilen sonuçların kesinliği belirlendi. Sonuçların
doğruluğunu artırmak için her bir standart amino asit çözeltisinden (0.04, 0.08 ve 1.2 mM)
daha önce analizi yapılan maya ve meyve suyu örneklerine standart ilavesi (spiking) yapıldı.
Standart ilavesi yapılan örnekler iki kez analiz yapıldı. Standart ilavesi yapılmadan ve
yapılarak elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak önemli bir fark bulunmadı. Meyve
sularındaki amino asit profilleri farklılık göstermekle birlikte fenilalanin, izolösin ve lösin
analizi yapılan bütün meyve suyu örneklerinde ya çok düşük düzeylerdeydi yada tespit
edilemedi. Prolin, glisin ve alanin, şeftali, kaysı, limon ve portakal sularında yüksek düzeyde
iken vişne suyunda düşük ölçüldü. Valin ve triptofan vişne, kaysı, şeftali, limon ve portakal
sularında orta düzeylerde bulunmaktaydı. Sistin ve tirozin vişne suyunda tespit edilmezken,
diğer meyve sularında düşük düzeylerde bulunmaktaydı.
Hamur mayası örneklerinde sistin ölçülemezken, fenilalanin, lösin ve tirozin çok düşük
düzeylerde bulundu. İzolösin, lösin, prolin, glisin, alanin, valin ve triptofan ise hamur mayası
örneklerinde oldukça yüksek düzeyde ölçüldü. Kuru fasulye örneklerinde sistin ve fenilalanin
hariç diğer bütün amino asitler yüksek düzeyde tespit edildi. Elde edilen sonuçlar mg/g örnek
cinsinden hesaplanarak Tablo 3.9 – 3.10’da verilmiştir. Bulunan sonuçların, literatürde
yapılan diğer çalışmalardan elde edilen sonuçlar ile uyum içerisinde olduğu gözlenmiştir
(Spayd and Andersen-Bagge, 1996; Lazos, 1991; Jan, 2009). Bu durum geliştirilen amino asit
duyarlı
biyosensörün
sıvı
kromatografide
dedektör
olarak
başarılı
bir
şekilde
kullanılabileceğini göstermektedir. Geliştirilen yöntem basit, duyarlı, ekonomik ve sınırlı
önişlem gerektirmektedir. Ancak geliştirilen biyosensör ile sadece 9 amino aside karşı cevap
alınmıştır. Böyle bir durum esensiyal aminoasitlerin bütününün eşzamanlı olarak tayin için,
geliştirilen
biyosensörün
sıvı
kromatografide
göstermektedir.
86
dedektör
olarak
uygulanamayacağını
Tablo 3.9. Standart ilavesi yapılmadan elde edilen Konsantre meyve suyu, hamur mayası ve
kuru fasülye örneklerindeki amino asitlerin miktarları (mg/g)
Vişne
suyu
Şeftali
suyu
Kayısı
suyu
Limon
suyu
Portakal
suyu
Lösin
-
0,03
-
0,5
0,03
0,06
Alanin
0,06
0,8
0,6
0,4
0,5
Glisin
0,08
1,2
1,2
1,4
Valin
0,6
0,3
0,2
İzolösin
0,02
-
Triptofan
0,6
Fenilalanin
Kuru
fasulye 1
Kuru
fasulye 2
0,06
2,2
2,2
1,5
2,1
1,5
1,1
1,8
2,8
2,2
1,1
1,2
0,4
0,4
1,4
0,8
2,1
2,2
-
0,02
-
1,3
0,7
0,7
1,2
0,2
0,4
0,4
0,2
0,8
1,1
0,5
0,6
-
0,02
0,02
-
-
0,02
0,02
0,01
0,02
Sistin
-
0,05
0,08
0,02
0,04
-
-
0,02
0,02
Tirozin
-
0,05
0,04
0,06
0,02
0,02
0,03
1,3
1,4
Amino asitler
Hamur
Hamur
mayası 1 mayası 2
Tablo 3.10. Standart ilavesi yapılarak elde edilen konsantre meyve suyu, hamur mayası ve
kuru fasülye örneklerindeki amino asitlerin miktarları (mg/g)
Vişne
suyu
Şeftali
suyu
Kayısı
suyu
Limon
suyu
Portakal
suyu
Hamur
mayası 1
Hamur
mayası 2
Kuru
fasulye 1
Kuru
fasulye 2
Lösin
0,01
0,03
-
0,4
0,05
0,05
0,08
2,6
2,1
Alanin
0,05
0,7
0,6
0,4
0,4
1,7
2,0
1,6
1,2
Glisin
0,09
1,0
1,2
1,6
1,8
2,7
2,3
1,1
1,2
Valin
0,6
0,3
0,2
0,3
0,5
1,6
0,9
2,0
2,2
İzolösin
0,02
-
-
-
-
1,4
0,8
0,6
1,3
Triptofan
0,8
0,3
0,4
0,4
0,2
0,7
1,3
0,6
0,5
-
0,03
0,03
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
0,01
Sistin
0,01
0,06
0,09
0,02
0,04
0,01
0,02
0,03
0,03
Tirozin
0,02
0,06
0,05
0,05
0,03
0,02
0,02
1,5
1,6
Amino asitler
Fenilalanin
Diğer taraftan içeceklerde ve gıdalarda serbest amino asitlerin toplamının tayini,
içeceklerin besleme kalitesini göstermesi açısından önemlidir (Erbe, and Bruckner, 2000;
Casella, and Contursi, 2003). İlave olarak gıdaların işlenmesi ve bekletilmesi sürecinde
dönüşme ve olgunlaşma durumu hakkında da bilgi vermektedir (Bűtikofer, and Ardo, 1999).
Bu nedenle projede geliştirilen amino asit biyosensör ile toplam amino asit miktarının hızlı
tayini için, ekstraktlara direkt daldırılarak ve akış enjeksiyon analiz sistemine enjekte edilerek
87
ölçümler alındı. Ölçümler üç kez tekrarlandı. Meyve suyu, hamur mayası ve kuru fasulye
ekstraktı çözeltilerden 20 µL FIA sisteme enjekte edildi. Her iki yaklaşımla elde edilen toplam
amino asit miktarları tablo 3.11’de görülmektedir.
Tablo 3.11. Meyve suyu, hamur mayası ve kuru fasulye ekstraktlarında toplam amino asit
miktarları (mg/g), n:3
Örnek
Her
Direkt ölçüm
FIA ölçüm
Vişne suyu
5.2
4.9
Şeftali suyu
8.7
8.4
Kaysı suyu
6.6
7.2
Limon suyu
8.5
8.8
Portakal suyu
6.8
6.6
Hamur mayası 1
13.0
14.3
Hamur mayası 2
14.8
14.5
Kuru fasulye 1
22.4
20.0
Kuru fasulye 2
18.4
16.6
iki
yöntemle
elde
edilen
sonuçların
ortalamaları
istatistiksel
olarak
değerlendirilmiştir. Sonuçların uyumlu olduğu tespit edilmiştir. Proje sonrası dönemde toplam
asiditeyi ölçen taşınabilir bir biyosensör sistemin ve yöntemin geliştirilmesi düşünülmektedir.
Ancak elde edilen sonuçların kromatografik ölçümlerden elde edilen sonuçlara göre yüksek
olduğu görülmüştür. Bu durum, kromatografik ayırımın etkinliğinin düşük olduğu ve bazı
amin asit piklerinin üst üste geldiği kanaatini ortaya çıkarmaktadır. Yeni hareketli faz
sistemleri
kullanılarak daha etkili
ayırımların gerçekleştirilmesi gereklidir. Ancak
biyosensörün yeni hareketli faz kompozisyonları ile uyumlu çalışması da sağlanmalıdır.
88
KAYNAKLAR
ALBERADE-SİRVENT, M., MERKOCİ, A., and ALEGRET, S., Thick-film biosensors for
pesticised produced by screen-printing of graphite-epoxy composite and biocomposite
pastes, Sensors and Actuators B, 79, 48-57, (2001).
ALEGRET, S., AND MARTINEZ-FABREGAS, E., “Biosensors Based on Conducting Filled
Polymer All-Solid-State PVC-Matrix Membrane Electrodes” Biosensors, 4, 287-297,
(1989).
ARMSTRONG, M., JONSCHER, K., and REİSDORPH, N.A., Analysis of 25 underivatized
amino
acids
in
human
plasma
using
ion-pairing
reversed-phase
liquid
chromatography/time-of-flight mass spectrometry, Rapid Communications in Mass
Spectrometry, 21, 2717-2726, (2007).
BAY, C., KOWLOON, H.K., WALCERZ, I., KONCKİ, R., LESZCZYNSKA, E., and
GLAB, S., Nano-analytical lab (signal), enzyme biosensors for urea determination on
an ıonophore free ph membrane electrodes, Anal. Chim. Acta, 315, 289-296, (1995).
BAYŞU, N., Amino asidlerin tayin metotlarına genel bir bakış ve beckman 120/b model
otomatik amino asit analizer'in çalışma prensibi, Ankara Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Dergisi, 17 (1), (1970).
BENSON, J.R., and HARE, P.E., “o-phthalaldehyde: fluorogenic detection of primary amines
in the picomole range. Comparison with fluorescamine and ninhydrin” Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 72, 619-627, (1975).
BILITEWSKI, U., CHEMNITIUS, G.C., RUGER, P., and SCHMID, R,D., “Miniaturized
Disposable Biosensors” Sensors and Actuators B, 7, 351-355, (1992).
BŰTİKOFER, U., and ARDO, Y., Quantitative determination of free amino acids in cheese,
Bulletin of the IDF, 33, 24–32, (1999).
BUTT, S.B., AND CAMMANN, K., “Enzyme Urea Biosensors Based on A Modified
Potentiometric PVC-Nonactin Membrane Electrode for Assay of Urea in Blood” Anal.
Lett., 25(9), 1597-1615, (1992).
CASELLA, I.G., and CONTURSİ, M., Isocratic ion chromatographic determination of
underivatized amino acids by electrochemical detection, Analytica Chimica Acta, 478,
179–189, (2003).
CHA, G.S., and MEYERHOFF, M.E., Enzyme electrode-based differential potentiometric
cell with enhanced substrate sensitivity, Electroanalysis, 1, 205-211, (1989).
89
CHEN Y.H, SHİH L.L, LİOU S.E, and CHEN C.C, Analysis of dabsyl-Cl derivated amino
acids by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry,
Food Science and Technology Research, 9 276-282, (2003).
CLARK, L.C., and LYONS, C., Electrode system for continuous monitoring in cardiovascular
surgery. Ann. NY Acad. Sci. 102, 29-45, (1962).
COHEN, S.A., and DE ANTONİS, K.M., “Applications of amino acid derivatization with 6aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate” J Chromatogr A, 661, 25–34,
(1994).
CRABB, J.W., ERİCSSON, L.H., ATHERTON, D., SMİTH, A.J., and KUTNY, R., “A
collaborative amino acid analysis study form the associationof biomolecular resource
facilities” Current Research in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, pp.
49–61, (1990).
ÇUBUK, O., Bütünüyle katı-hal mikro enzim sensörler ve uygulamaları. (Doktora Tezi),
Ondokuz Mayıs Üniversitesi.Fen Bilimleri Enstitüsü, Samsun, (2007).
DES ROBERT, C., LE BACQUER, O., PİLOQUET, H., ROZE, J.C., and DARMAUN, D.,
“Acute effects of intravenous glutamine supplementation on protein metabolism in
very low birth weight infants: a stable isotope study” Pediatr. Res., , 51, 87-93, (2002).
DENG, C., Lİ, N., and ZHANG, X., “Rapid determination of amino acids in neonatal blood
samples based on derivatization with isobutyl chloroformate followed by solid-phase
microextraction and gas chromatography/mass spectrometry” Rapid Commun. Mass
Spectrom. 18, 2558-2564, (2004).
DENG, C., DENG, Y., “Diagnosis of maple syrup urine disease by determination of l-valine,
l-isoleucine, l-leucine and l-phenylalanine in neonatal blood spots by gas
chromatography-mass spectrometry” J. Chromatogr. B, 792, 261-268, (2003).
DURST, R.A. and KHURİ, R. N., Ion-selective electrodes. Nat. Bur. (U.S.), Special Publ.
Washington D.C. 314, p. 287, 474, (1969).
EDMONDS T. E., “Chemical Sensors” , Blackie and son, USA, 17-69 and 75-115 p. 12111250, (1988).
ERBE, T., and BRUCKNER, H., Chromatographic determination of amino acid enantiomers
in beers and raw materials used for their manufacture, Journal of Chromatography,
881, 81–91, (2000).
FAGAİN, C.O., Enzyme Stabilization-recent experimental progress, Enzyme and Microbial
Technology, 33, 137–149, (2003).
90
FEKKES, D., “State-of-the-art of high performance liquid chromatographic analysis of amino
acids in physiological samples” J Chromatogr B, 682, 3–22, (1996).
FEKKES, D., VAN DALEN, A., EDELMAN, M., and VOSKUİLEN, A., “Validation of the
determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography
using automated pre-column derivatization with o-phthaldialdehyde” J Chromatogr B,
669, 177–186, (1995).
GERARD, M., CHAUBEY, A., and MALHOTRA, B.D., Application of conducting polymers
to biosensors, Biosensors & Bioelectronics, 17, 345-359, (2002).
GUILBAULT, G.G., “Handbook of Enzymatic Methods of Analysis” Chap. 2, Dekker, New
York, (1977).
HAMİLTON, P.B., and ANDERSON, R.A., “Ion-exchange chromatography of amino acidssemi-automatic method of operation with cationic-exchange resin columns” Anal
Chem, 31, 1504–1512, (1959).
INABA, Y., HAMADA-SATO, N., KOBAYASHİ, T., IMADA, C., and WATANABE, E.,
Department of Food Science and Technology, Tokyo University of Fisheries, 5-7
Kounan 4, Minato-ku, Tokyo 108-8477, Japan, (2002).
ISILDAK, I., “Potentiometric Detection of Monovalent Anions Separated by Ion
Chromatography Using all Solid-State Contact PVC Matrix Membrane Electrode”
Chromatographia, Vol 49, pp 338-342, (1999).
ISILDAK, I., and ASAN, A., “Simultaneous detection of Monovalent Anions and Cations
Using all Solid-State Contact PVC Membrane Anion and Cation-Selective Electrodes
as Detectors in Single Column Ion Chromatography” Talanta, Vol 48, pp 967-978,
(1999).
ISILDAK, I., and COVINGTON, A.K., “Ion-Selective Electrode Potentiometric Detection in
Ion Chromatography” Electroanalysis, Vol 5, pp 815-824, (1993).
ISILDAK, I., and COVINGTON, A.K., “Simultaneous Determination of Sodium, Potassium
and Chloride in BSA Plasma by Ion Chromatography with Potentiometric Detection”
Chimica Acta Turcica, Vol 26, pp 49-56, (1998a).
ISILDAK, I., and COVINGTON, A.K.,”Potentiometric Detection at ppb-Ranges of Chloride,
Bromide, Nitrite, Nitrate, Iodide, Thiocyanate, and Benzoate Anions Separated in Ion
Chromatography in a Single Run” Chimica Acta Turcica, Vol 26, pp 57-63, (1998b).
91
JAN, T.S., Estimation of amino acids in juice/jaggery and sugar,Cooperative Sugar, 40 (11),
53-59, (2009).
JELLUM, E., KVİTTİNGEN, E.A., and STOKKE, O., “Mass spectrometry in diagnosis of
metabolic disorders” Biomed. Environ. Mass Spectrom, 16, 57-62, (1988).
KEHA, E., and KÜFREVİOGLU, Ö., Biyokimya, Aktif Yayınevi, Erzurum, 35, (2007).
KEUSGEN, M., JUNGER, M., KREST, I., and SCHÖNING, M.J., “Biosensoric Detection of
the Cysteine Sulphxide Alliin” Sensors and Actuators B, 95, 297-302, (2003).
KWAN, R.C.H. CHAN, C. and RENNEBERG, R., The Hong Kong University of Science
and Technology, Department of Chemistry and Sino-German Nano-Analytical Lab
(Signal), Clearwater Bay, Kowloon, Hong Kong, (2002).
LAKARD, B., HERLEM, G., and LABACHELERIE, M., Miniaturized pH Biosensors Based
on Electrochemically Modified Electrodes with Biocompatible Polymers, Biosensors
and Bioelectronics, 19, 595-606, (2004).
LAKARD, B., HERLEM, G., LAKARD, S.., ANTONIOU, A., and FAHYS, B.,“Urea
Potentiometric
Biosensor
Based
on
Modified
Electrodes
with
Urease on
Polyethylenimine Films” Biosensors and Bioelectronics, 19, 1641-1647, (2004).
LAZOS, E.S., Composition and oil characteristics of apricot, peach and cherry kernel, 42, 2,
127-131, (1991).
LİU, Z., MİNKLER, P.E., LİN, D., and SAYRE, L.M., Derivatization of amino acids with
N,N-dimethyl-2,4-dinitro-5-fluorobenzylamine
for
liquid
chromatography/
electrospray ionization mass spectrometry, Rapid Communications in Mass
Spectrometry, 18, 1059-1065, (2004).
LİNDROTH, L. MOPPER, K., High performance liquid chromatographic determination of
subpicomole amounts of amino acids by precolumn fluorescence derivatization with ophthaldialdehyde, Analytical Chemistry, 51(11), 1967-1974, (1979).
MA, S.C., CHANIOTAKIS, N.A., AND MEYERHOFF, M.E., “Response Properties of IonSelective Polymeric Membrane Electrodes Prepared With Aminated and Carboxylated
Poly(vinyl chloride)” Anal. Chem., 60, 2293-2299, (1988).
MASCİNİ, M., and GUİLBAULT, G.G., Urease coupled ammonia electrode for urea
determination in blood serum, Anal. Chem., 49, 795-798, (1977).
MAGNİ, F., ARNOLDİ,
L., GALATİ, G., and GALLİ KİENLE, M., “Simultaneous
determination of plasma levels of _-ketoisocaproic acid and leucine and evaluation of -
92
1-13C-ketoisocaproic acid and 1-13Cleucine enrichment by gas chromatography-mass
spectrometry” Anal. Biochem., 220, 308, (1994).
MİLLER, R.G., JAHOOR, F., REEDS, P.J., HEİRD, W.C., and JAKSİC, T., “A new stable
isotope tracer technique to assess human neonatal amino acid synthesis” J. Pediatr.
Surg., 30, 1325-1329, (1995).
MONTGOMERY, R., CONWAY, W.T., and SPECTOR, A.A., Çeviri : ALTAN, N.,
Biyokimya, Palme Yayıncılık, Ankara, 254, (2000).
PANDEY, P.C., and MİSHRA, A.P., “Novel Potentiometric Sensing of Creatinine” Sensors
and Actuators B, 99, 230-235, (2004).
PETERSSON, B.A., “Enzymatic Determination of Urea in Undiluted Whole Blood by Flow
Injection Analysis Using An Ammonium Ion-Selective Electrode” Anal. Chim. Acta,
209, 239-248, (1988).
REBANE, R., and HERODES, K., A sensitive method for free amino acids analysis by liquid
chromatography with ultraviolet and mass spectrometric detection using precolumn
derivatization with diethyl ethoxymethylenemalonate: Application to the honey
analysis, Analytica Chimica Acta, 672 79–84, (2010).
ROGER C.H. KWAN, CHİYUİ CHAN & REİNHARD RENNEBERG., The Hong Kong
University of Science and Technology, Department of Chemistry and Sino-German
Nano-Analytical Lab (Signal), Clearwater Bay, Kowloon, Hong Kong, (2002).
SANO, H., SHİBASAKİ, S., and SAWADA, H., “The effect of the source of nitrogen
supplementation on nitrogen balance, rates of plasma leucine turnover, protein
synthesis and degradation in sheep” Animal Nutrition, 63, 401 – 412, (2009).
SAURINA, S. HERNANDEZ, CASSOU FABREGAS, E., and ALEGRET S, “Potentiometric
Biosensors for Lysine Analysis Based on A Chemically Immobilized Lysine Oxidase
Membrane” Anal. Chim. Acta, 371, 49-56, (1998).
SCHUGERL, K., Progress in monitoring, modeling and control of bioprocesses during the
last 20 years, J. of Biotechnology, 85, 149-173, (2001).
SETFORD, J., STEPHEN, W.F., and BOLBOT, J.A., Cranfield biotechnology centre, IBST,
Cranfield University at Silsoe, Silsoe, Bedfordshire, MK45, 4DT, UK. (2001).
SHEN, X., DENG, C., WANG, B., and DONG, L., “Quantification of trimethylsilyl
derivatives of amino acid disease biomarkers in neonatal blood samples by gas
chromatography-mass spectrometry” Anal. Bioanal. Chem., 384, 931-938, (2006).
93
SHİH, Y.T., and HUANG, H.J., A Creatinine deiminase modified polyaniline electrode for
creatinine analysis, Anal. Chim. Acta 392, 143-150, (1999).
SPAYD, S.E., and ANDERSEN-BAGGE, J., Free Amino Acid Composition of Grape Juice
From 12 Vitis vinifera Cultivars in Washington, Am. J. Enol. Vitic, 47(4), 389-402,
(1996).
SPENCER, K., Analytical reviews in clinical biochemistry: The estimation of creatinine, Ann.
Clin. Biochem., 23, 1-16, (1986).
SPİCHİGER-KELLER, U.E., Chemical sensors and biosensors for medical and biological
applications, Verlag Chemie, Weinheim, 455, (1998).
STEVEN, S.J.,. WHİTE, S.F., and BOLBOT, J.A., Cranfield biotechnology centre, IBST,
Cranfield University at Silsoe, Silsoe, Bedfordshire, MK45, 4DT, UK. (2001).
TELEFONCU, A., Biyosensörler (Telefoncu, A., Ed.) s. 193-248, Ege Üniversitesi, İzmir,
(1999).
TELEFONCU, A., Enzimoloji, Ege Universitesi, İzmir, 380, (1997).
TINKILIC, N., CUBUK, O., and ISİLDAK, I., “Glucose and Urea Biosensors Based on All
Solid-State PVC-NH2 Membrane Electrodes” Anal. Chim. Acta, 452, 24-29, (2002).
TURNA, Ö., Aminoasit biyosensörlerinin geliştirilmesi. (Y.Lisans Tezi), Ondokuz Mayıs
Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Samsun, (2006).
UPDİKE, S.J., and HİCKS, G.P., The enzyme electrode, Nature, 214, 986-988, (1967).
VAN EİJK, H.M.H., ROOYAKKERS, D.R., and DEUTZ, N.E.P., “Rapid routine
determination of amino acids in plasma by high performance liquid chromatography
with a 2–3 mm Spherisorb ODS II column” J Chromatogr, 620, 143–148, (1993).
WALCERZ, I., KONCKİ, R., LESZCZYNSKA, E., GLAB, S., Enzyme Biosensors for Urea
Determination on an Ionophore Free pH Membrane Electrodes, Anal. Chim. Acta,
315, 289-296, (1995).
94
TÜBİTAK
PROJE ÖZET BİLGİ FORMU
Proje No: 110T793
Proje Başlığı: Aminoasitlerin Sıvı Kromatografi-Potansiyometri Hibrit Analiz Sistemi İle
Basit, Hızlı Ve Ekonomik Olarak Eşzamanlı Tayinleri
Proje Yürütücüsü ve Araştırmacılar: Ömer IŞILDAK, İbrahim IŞILDAK
Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi: Gaziosmanpaşa Üniversitesi, Fen-Edebiyat
Fakültesi, Kimya Bölümü, 60240, Taşlıçiftlik Kampüsü, Tokat
Destekleyen Kuruluş(ların) Adı ve Adresi:
Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri: 01. 05. 2011 – 01. 05. 2013
Öz (en çok 70 kelime)
Planladığımız bu proje çalışmasında, mikro boyutlarda kompozit NH4+ -seçici
sensörlerin hazırlanması, hazırlanan mikro boyutlarda kompozit NH4+ -seçici sensörler
kullanılarak yeni tip amino asit duyarlı potansiyometrik biyosensörlerin geliştirilmesi, sıvı
kromatografide (LC) dedektör olarak kullanılması ve gıdalarda amino asitlerin eşzamanlı
tayinleri hedeflendi. Hazırlanan biyosensörlerin kompozit yapıda olması, mikrolitre ölü
hacme sahip flow-through akış-hücrelerinin hazırlanmasına ve serbest aminositlerin etkili
tayini için LC de dedektör olarak kullanılmasına izin vermekteydi.
Anahtar Kelimeler: Potansiyometrik deteksiyon, aminoasit duyarlı biyosensörler, sıvı
kromatografi, aminoasitlerin tayini
Fikri Ürün Bildirim Formu Sunuldu mu?
Evet
Gerekli Değil
Fikri Ürün Bildirim Formu’nun tesliminden sonra 3 ay içerisinde patent başvurusu
yapılmalıdır.
Projeden Yapılan Yayınlar: Projeden elde edilen çıktılar 2 adet yayın içinde sunulmak
için hazırlanmaktadır.
95