18. Ulusal Biyokimya Kongresi, Trabzon [18ıh National Biochemisıry imgress. Trabzon, Turkey] ' gösterdik ve COMET yöntemi ile karşılaştırarak iki yöntemin uyumlu olduğunu tespit ettik. 2 Max-Planck Deneysel Endokrinoloji Enstitüsü 30625, Hannover-AImanya [email protected] SB-21 THE COMPARASION OF p-FADU AND COMET METHODS İN DNA DAMAGE ANALYSIS Abdulkerim BEDİR, Birsen BİLGİCİ, Zafer YURDAKUL, Ş. Bilge GÜRSEL, Muhlise ALVUR Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyokimya Ana Bilim Dalı, Samsun/Türkiye Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi, Radyasyon Onkolojisi Ana Bilim Dalı, Samsun/Türkiye [email protected] p-FADU (Fluorometric Analysis of DNA Unwinding) and COMET are methods developed for the rapid detection of DNA damage and repair capacity. Both are based on time dependent alkaline DNA unwinding under appropriate denaturing conditions. COMET and p-FADU are fluorometric and spectroflurometric assays, respectively. Tail length and tail moment are assessed by the COMET method, vvhereas the decrease of fluorescent intensity are determined by FADU. There are lots of different methods for detecting DNA damage. in this study, we selected and compared p-FADU and COMET methods for DNA damage. The cells were isolated from vvhole blood collected with EDTA tubes (2000 cell/pL). Total (T), background (B) and standart P tubes irradiated by Cobalt 60 (P,->1 Gy, P 2 -*2 Gy, P3->3 Gy, P„->4 Gy, P 5 4 5 Gy) are prepared for p-FADU and COMET assays. While p-FADU method was performed to ali tubes in LightCycler (Roche), COMET is applied only to standart P tubes irradiated by different dosages and assessed by fluorescence microskope (Nikon E800). The resulting DNA damage was assessed quantitatively by COMET and p-FADU methods. in p-FADU method, the fluorescence of T and B tubes vvere the highest and lowest, respectively. The fluorescence of standart P tubes were in the decreasing order as fol!ows: P, > P2 > P3 > P4 > Py As for COMET method, tail length and tail moment were correlated with the v-radiation dosage.Both methods are compared statisticaly by correaltion and Iinear regression analysis. A significant relation is detected between methods (r = 0.9525, p = 0.004). in this study, whe showed that DNA damage can be detected in Light Cycler with the p-FADU method using low volume (20 pL) as compared with the traditional FADU method. in addition to this, we compared p-FADU and COMET methods and found in good harmony with each other. ÎÜüO FARE HEKZOKİNAZ VE GLUKOKİNAZ cDNA'LARININ ÜRETİLMESİ VE İN SİTU HİBRİDİZASYON TEKNİĞİ İLE GEN EKSPRESYON ANALİZİ ÖJrfan KÜFREVİOftlIIl, Mehmet ÇİFTÇİ', Şükrü BEYDEMİR1, Hasan ÖZDEMİR 1 , Murat ÇANKAYA1, İlhami GÜLÇİN', Harun BUDAK1, Gregor EICHELE 2 'Atatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, 25240, Erzurum-Türkiye Türk J Biochem, 2004; 29(1); 1-176. Genlerin büyük çoğunluğunun sekanslarının yapılmasından dolayı, onların hücresel fonksiyonlarının anlaşılması için yüksek duyarlı gen ekspresyonunun analizi gerekir. Bundan dolayı bu çalışmada fare hekzokinaz (Hkl ve Hk2) ve glukokinaz (Gck) genleri için in situ hibridizasyon tekniği ile bir robotun prototipi kullanılarak ekspresyon analizi yapıldı, in situ hibridizasyon için en önemli basamaklardan biri ilgili genin antisens mRNA'sının üretilmesidir. Belirli bir antisens mRNA üretimi için spesifik bir cDNA gerekir. Bundan dolayı hiç bir genle homolojisi olmayan primerler dizayn edilmelidir. Bu amaçla farenin değişik dokularından önce mRNA saflaştırıldı. Revers transkriptaz enzimi ve diğer kimyasallar vasıtasıyla cDNA kütüphanesi elde edildi. Fare hekzokinaz (Hkl ve Hk2) ve glukokinaz (Gck) genlerinin cDNA'Iarının sekansları internetten bulundu ve spesifik primerler dizayn edildi. Aynı a hazırlanan primerlerin başka genlerin cDNA'Ian ile homoloji gösterip göstermedikleri internet vasıtasıyla kontrol edildi. Primer dizaynı yapıldıktan sonra RNA problarının hazırlanması amacıyla, fonvard primerin 5' ucuna T7 promotor sekansı (23 baz) ve revers primerin 5' ucuna SP6 promotor sekansı (21 baz) eklendi ve sipariş edildi. Yaklaşık 40 nükleotidlik bu primerler ve cDNA kütüphanesi kullanılarak PCR yapıldı ve ilgili cDNA'lar üretildi. Böylece hekzokinaz (Hkl ve Hk2) ve glukokinaz (Gck) genlerinin cDNA probları amplifiye edildi. Daha sonra agaroz jel elektroforeziyle genlerin cDNA problarının doğruluğu standartlarla kontrol edildi.Elde edilen bu cDNA problarından söz konusu genler için antisens mRNA üretildi ve farenin çeşitli dokularında in situ hibridizasyona tabi tutuldu. Böylece ilgili genlerin hangi dokularda ekspresyona uğradığı belirlendi. 1 SB - 22 I THE PRODUCTION OF cDNAs OF MOUSE HEXOKINASE AND GLUCOKINASE AND GENE EXPRESSION ANALYSİS THROUGH İN SITU HYBRIDIZATION TECHNIQUE Ö. İrfan KITFRFVIOGI.m. Mehmet ÇİFTÇİ', Şükrü BEYDEMİR1, Hasan ÖZDEMİR', Murat ÇANKAYA', İlhami GÜLÇİN', Harun BUDAK', Gregor EICHELE 2 1 Department of Chemistry, Faculty of Science and Arts, Atatürk University, 25240, Erzurum-Turkey : Max-Planck Institut für experimentelle Endokrinologie, 30625, Hannover-Deutschland [email protected] Because of the large number of genes sequenced, a highthroughput analysis of gene expression is needed to understand their roles in cellular function. Therefore, in this study, the gene expression analyses for the mouse hexokinase (Hkl and Hk2) and glucokinase (Gck) genes were made by in situ hybridizidation technique using a prototype of robot. One of the most important steps for in situ hybridizidation, is to produce the antisense mRNA of corresponding gene. For such antisense mRNA production, a specific cDNA is required. Therefore, the primers, which do not have homology with any genes, must be designed.For this purpose, mRNAs vvere firsüy purified from different tissues of mouse. cDNA library vvas obtained http://www.TurldBiochem.com 18. Ulusal Biyokimya Kongresi. Trabzon [18ıh National Biochemistry Congress, Trabzon. TurkeyJ by reverse transcriptase enzyme and other chemicals. cDNAs sequences of mouse hexokinase and glucokinase genes were provided with internet and specific primers were designed. Moreover, if the primers prepared have homology with the cDNA of other genes was checked through internet. After primers were designed, T7 promotor sequence (23 base) to 5' terminal of the fonvard primerand SP6 promotor sequence (21 base) to 5' terminal of the reverse primer were attached and ordered for the purpose of preparation of RNA probes. PCR was carried out by these primers of about 40 nucleotides and cDNA library and cDNAs were produced. Thus, cDNA probes of hexokinase (Hkl and Hk2) and glucokinase (Gck) genes were amplified. Then. cDNA probes of corresponding genes were checked by standards on agarose gel electrophoresis. Antisense mRNAs were produced from these cDNA probes of corresponding genes and the antisense mRNAs were used for in situ hybridization in different tissues of mouse. Finally, it was determined that which tissue contained expression of corresponding genes. SB-23 GST LERİN (GSTMİ, GSTTl, GSTPl) GENETİK POLIMORFIZMI İLE PRİMER BEYİN TÜMÖRÜ İNSIDANSI ARASINDAKİ İLİŞKİ. Hatice PINARBAŞI», Yavuz SİLİĞ", Mustafa GÜRELİK C Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı1, c Nöroşirurji Anabilim DaIı ,Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü.Biyokimya Anabilim Dalıb, 58140 Sivas. Türkiye. [email protected] Glutatyon S-transferazlar, GSTMİ, GSTTl ve GSTPl, karsinojenleri de içeren geniş yelpazedeki eksojen bileşiklerin detoksifıkasyonunda görevli faz II biyotransformasyon enzimleridir. Kişinin çevresel karsinojenlere olan duyarlılığının belirlenmesinde bu genlerdeki farklılıkların önemli rol oynayabileceği tanımlayıcı veanalitikepidemiyoloji çalışmaları ile gösterilmiştir. Tersini açıklayanlar olsa da bazı çalışmaların sonuçlan GST enzimlerini kodlayan genlerdeki polimorfızmler ile bazı kanserler arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki ortaya koymuştur. Bu çalışmada bu genlerdeki polimorfızmler ile primer beyin tümörü insidansı arasındaki ilişki 228 Türk bireyde (75 primer beyin tümörü hastası ve 153 kontrol) incelenmiştir. GSTMİ null genotipin sıklığı hastalarda %43, kontrollerde %24 ve OR=2.33 (%95 CI= 1.24-4.39) olarak bulunmuştur. Ne GSTTl ne de GSTPl IlelOSVa! polimorfizmi ile beyin tümör insidansı arasında bir ilişki gözlenmemiştir. GSTMİ, GSTTl ve GSTPl in polimorfizmleri ile beyin tümörünün histopatolojik tipi (glioma veya meninjioma) arasında bir ilişki saptanamamıştır, incelenen polimorfızmler ile beyin tümörlü hastaların sigara içme durumları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bulunmamıştır. Burada verilen sonuçlar açıkça GSTTl ve GSTPlgen varyantlarının değil fakat GSTMİ null genotipin beyin tümörü insidansı ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte bu bulgular daha fazla sayıda bireyi içeren çalışmalar tarafından doğrulanmalıdır. Turlc J Biochem. 2004; 29 (1) 1-176. 29 SB-23 GENETIC POLYMORPHISMS OF GSTs (GSTMİ, GSTTl, GSTPl) AND THE ASSOCIATION VVITH PRIMARY BRAIN TUMOR INCIDENCE Hatice PINARBAŞI», Yavuz SILIG", Mustafa GURELIK' Department of Biochemistry", Neurosurgeryc, Faculty of Medicine, Department of Biochemistryb, Faculty of Science and Art.Cumhuriyet University, 58140 Sivas, Turkey. [email protected] Glutathione S-Transferases, GSTMİ, GSTTl and GSTPl, are phase II biotransformation enzymes that function on detoxifıcation of wide range of exogenous agents including carcinogens. it has been shovvn by descriptive and analytic epidemiologic studies that genetic variations in these genes play an important role in determining the response of an individual to environmental carcinogens. Some studies revealed a statistically significant association between the polymorphisms in the genes encoding GST enzymes and some cancers although contrary reports exist. in this study, association between polymorphisms in these genes and primary brain tumor incidence was investigated in 228 Turkish individuals (75 patients with primary brain tumor and 153 controls). The prevalence of GSTMİ null genotype in the case group was 437c, compared to 24% in the control group gi ving an odds ratio (OR) of 2.33 (95% CI= 1.24-4.39). it was observed that neither GSTT1 nor GSTPl Ilel05Val polymorphism was associated with brain tumor incidence. Polymorphisms in GSTMİ, GSTTl and GSTPl did not shovv association with histopathologic type of brain tumor (glioma or meningioma). Analysis of the polymorphisms in the studied genes and smoking status of the brain tumor patients revealed no statistically significant association. Presented data clearly suggest a relation betvveen brain tumor incidence vvith GSTMİ null genotype but not with GSTTl or GSTPl gene variants. However this finding needs to be confırmed by the studies vvith larger number of study subjects. SB-24 ERZURUM BÖLGESİNDE GLUKOZ-6-FOSFAT DEHİDROGENAZ ENZİM EKSİKLİĞİ TESPİT EDİLEN ŞAHISLARDA MUTASYON İÇEREN EKZONLARIN BELİRLENMESİ VE BAZI İLAÇLARIN ENZİM AKTİVİTESİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN İNCELENMESİ İsmail ÖZMEN 1 , Mehmet ÇİFTÇİ^, Ö. İrfan KÜFREVİOĞLU2 ve M. Akif ÇÜRÜK3 'Atatürk Üniversitesi Biyoteknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi-Erzuru m/Türkiye 2 Aıatürk Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya BölümüErzuru m/Türkiye 'Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya ABDAdan a/Türkiye [email protected] Erzurum yöresindeki 0,5 - 6 yaş grubu 1183 çocuktan enzim eksikliği tespit edilen 3 çocukta glukoz 6-fosfat dehidrogenaz http://www.TurkJBiochem.com