DNA Tamir Sistemleri Yrd. Doç. Dr. Pınar Tulay, Ph.D. Tıbbi Biyoloji AD Tıp Fakültesi, Ofis 402 DNA Hasarı • Hücre endojen metobolitlere ve ekzojen ajanlara maruz kaldığında DNA hasarına yol açıyor • Bunun haricinde, her hücrede gerçekleşen normal metabolizma reaksiyonların sonucunda, günde ~ 2 104 değişikliğe uğrar Hasar nerden oluşur? • DNA’yı etkileyen kimyasal ajanlar – DNA bazlarına eklenen metil ve etil grupları – Reaktif oksijen türleri (ROS): – normal okzidatif metabolizmanın yan ürünleri olarak bir çok hiper-reaktif oksijen türleri (tekli oksijen, peroksit radikalleri, hidrojen peroksit ve hidroksil radikalleri) oluşur. – Bunun yanı sıra ROS iyonizan radyasyon (X-rays, gamma rays) sonucu da ROS oluşur. – ROS DNA bazlarını değiştirir: örneğin, timin oksitlenerek timin glikola dönüşür Hasar nerden oluşur? • UV ışını DNA’ya enerji verir – UV ışını DNA’yı oluşturan bazlar tarafından emilir ve kimyasal değişikliğe yol açar. En çok rastlanan foto-ürünler: T-T, T-C or C-T, C-C • DNA’daki spontan değişiklikler – Spontan baz kayıpları: günde her haploid genomda binlerce purin ve pirimidin kaybı gerçekleşir – Spontan deaminasyon: memelilerde, günde her haploid genomda yaklaşık 100 sitozin, urasile deamine olur – Spontaneous depurinizasyon: guaninin depurinizasyonu (guanin kaybı) Hasar nerden oluşur? • DNA replikasyon hataları – Çok düşük seviyededir – DNA polimeraz neredeyse tüm hataları hemen hemen düzeltir. Ancak replikasyon mekanizması mükemmel değildir. – Çoğu hata ve hasar tamir edilir (sadece 10-9 ’da 1 hata kalır) – DNA replikasyonu sırasında yanlış eşleşme veya kısa insersiyon veya delesyonlar hataları meydana gelir. Hasar nerden oluşur? • DNA iplikciği arası çapraz bağ – Çapraz bağlar, DNA zincirine bağlanan bazlar ile oluşur. – Çapraz bağlar, UV ve iyonizan radyasyon ile de oluşabilir. Hasar nerden oluşur? • DNA-protein çapraz bağı – DNA topoizomerazlar DNA ile kovalent bağ oluştururlar. – Genellikle çapraz bağlar geçicidir ve bu bağlar ortadan kaldırılabilir. – Bazı durumlarda da bu bağlar sabit kalır. Hasar nerden oluşur? • DNA zincir kırıkları – Tek zincir ve çift zincir kırıklarının oluşması normal metabolizmada düşük seviyededir. • Bu kırıklar topoizomerazlar, nüleazlar, replikasyon çatalı çöküşü ve tamir işlemi esnasında oluşur. – Kırıklar iyonizan radyasyonun etkisi ile de oluşabilir. • Buna ek olarak, iyonizan radyasyonundan oluşan hatalar tamir edilmediğinde, mutasyonlara sebep olur Hasar nerden oluşur? • DNA’da metabolizma sonucu olarak gerçekleşen tüm değişikliklere ve hasara karşı, bunların sadece bir kaçı mutasyon olarak karşımıza çıkar • DNA’da 1’de 1000’den daha az baz değişiklikleri mutasyona sebep olur • Bu kadar DNA hasarı var madem, nasıl hayatta kalabiliyoruz? DNA Tamir Sistemleri • Etkin DNA tamir sistemleri ile! • DNA tamir sistemlerinin doğru çalışmadığı durumlarda, mutasyon oranı artıyor DNA Tamir Sistemleri • DNA hasarının tesbit edilmesinde ve gerekli müdahalenin yapılması için atılacak olan adımın yapılmasıda komplike sistemler görev alır • Yıllar içinde DNA tamir enzimleri değişkenlik göstermemiş bu da DNA tamir enzimlerinin ve tamir sistemlerinin doğru foksiyonun yaşam için önemini gösterir. • İnsanda, ~ 150 DNA tamir geni tesbit edilip dizilenmiştir. – Günümüzde halen daha bunların hepsinin görevlerini bilmiyoruz. DNA Tamir Sistemleri • DNA tamir genlerini iki ana gruba ayırabiliriz: – Sinyalleme ve regülasyonda görev alan genler – Belirli tamir sistemlerinde görev alan genler – DNA tamir sistemlerini indirek olarak etkileyen genler (örneğin, hücre siklus kontrol genleri) • Bir çok protein farklı DNA hasarlarını tanımada ve tamirinde bir arada hareket eder. DNA Hasarına Cevap • DNA hasarına karşı hücre 3 yol takip edebilir : – – – genomdan lezyonu çıkartabilir hasara rağmen fonksiyona devam edebilir (hücresel metabolizmayı etkiler ve kanser veya hücre ölümüne yol açar) hücre siklusunu teşvik eder veya apoptoz yolağını aktive ederek hücre ölümüne yol açar DNA Hasarına Cevap DNA tamir mekanizmasının aktivasyonu Lezyon tamiri Normal hücre çoğalması ve diferensiyonu Normal gelişim Hücre siklusu kontrol durdurulması Tamir aktivasyonu eksikliği Hücre siklusu kontrol ünün eksikliği Daha fazla hasar oluşumu Lezyonun devamı Apoptoz Anormal hücre çoğalması ve diferensiyonu Anormal gelişim Hücre Siklusu Yüksek metabolizma DNA sentezi • Bir hücre bölünmeye başladığı Hücre büyümesi ve bölünmeyi tamamladığı ana kadar geçen zamana hücre siklusu (döngüsü) denir. • İnterfaz- hücrenin bölünmeye hazırlandığı evre: • G1 evresi: ATP sentezi, protein sentezi • S evresi: DNA replikasyonu • G2 evresi: hücre bölünmesinden önceki son evre • Mitotik faz- çekirdek ve sitoplazma bölünmesi Hücre Siklusu • Hücrenin DNA hasarına yanıt verebilmesi için hücre siklusunun doğru kordinasyonu büyük önem taşır. • Tüm DNA tamir sistemleri ve stres sensörleri hücre siklusu ile yakın iletişim halindedir. • Bazı DNA hasarı sensörleri hücre siklusu kontrol mekanizmasını ve apoptotik hücre ölümünü aktive edebilir. Hücre siklusu kontrol mekanizması • Hücre siklusu G1/S veya G2/M kontrol noktalarında DNA sentezi ve hücre bölünmesi gerçekleşmeden önce, DNA tamir mekanizmalarının devreye girerek hasarı tamir etmesine izin verir. Mitosis M G2 S DNA Synthesis G1 G0 Resting Kimya alanında Nobel Ödülü Kimya alanında Nobel Ödülü • Tomas Lindahl– Genoma her gün binlerce hasar olduğunu farketti – Bu sıklık normal insan yaşamına göre uygun olmadığını öne sürdü – Dolayısıyla DNA hatalarının tamiri için moleküler sistemlerin olması gerektiğini öne sürdü • 35 yıllık başarılı çalışmanın sonucu • Lindahl, baz eksizyon tamirinin moleküler mekanizmasını tanımladı Kimya alanında Nobel Ödülü • Aziz Sancar– Nükleotid eksizyon tamir sisteminde görev alan uvrA, uvrB ve uvrC genlerini tanıplayıp karakterize etti. – Bu enzimler UV’nin yol açtığı hasarların tanımlanmasında ve DNA’nın tamirinde görev alır. Kimya alanında Nobel Ödülü • Paul Modrich– Yanlış eşleşme tamir sistemi – Yanlış eşleşmenin hangi DNA ipliğinde gerçekleştiğini metilasyon düzeyi ile anlayarak tamir edildiğini tanımladı. DNR Tamir Sistemleri • Hasarın direk tersine çevrilmesi – Fotoreaksiyon (bakteri, maya, bazı omurgalılarda – insanlarda değil) • Eksizyon Tamiri – hasarlı DNA’nın çıkarılması. • Üç ana metod: • 1) baz eksizyon tamiri • 2) nükleotid eksizyon tamiri • 3) yanlış eşleşme tamiri • Çift zincir kırıklarının tamiri DNR Tamir Sistemleri Genellikle DNA tamir sistemleri üç ana adımı takip eder: 1) Eksizyon: DNA’nın hasarlı bölgesinin DNA tamir nükleazları ile tanımlanması fosfodiester bağların hidrolizi ve hasarlı bazların atılması DNA sarmalında kısa boşluklar) 2) Sentezleme: DNA polimerazı DNA’nın 3’-OH ucuna bağlanarak DNA sentezler (templat/ hasarsız DNA ipliğini tamamlayan kopya) 3) Bağlama (ligasyon): Polimerazın oluşturduğu boşluk DNA ligaz ile kapatılıyor 5’ 3’ 3’ 5’ DNA ipliğinde hasar oluşması 5’ 3’ 3’ 5’ 1. basamak DNA ipliğinde oluşan hasarın eksizyonu 5’ 3’ 3’ 5’ 2. basamak DNA polimeraz ile yeniden sentezlenme 5’ 3’ 3’ 5’ 3. basamak 5’ 3’ DNA Ligaz ile oluşan boşluğun sentezlenmesi 3’ 5’ Baz Eksizyon Tamiri (BER) • Baz eksizyon tamiri ne tür hasarların tamirinde görev alır? • Genellikle küçük lezyonların tamiri • Substratları: – Deamine olmuş C’ler – Deamine olmuş A’ler – Alkillenmiş veya oksitlenmiş baz Baz Eksizyon Tamiri (BER) • DNA tamiri nasıl gerçekleşir? • Bir çok DNA glikozilaz • Her biri belirli substratları hedefler • İki yolak vardır: – Kısa patch : bir nükleotid tamiri – Uzun patch: 2-12 nükleotid tamiri • BER’in % 25’i uzun BER ile tamir olur • İki yolağın da ilk aşamaları aynidir BER: Escherichia coli (E. Coli) •DNA’daki hasarlı baz glikozilaz ile DNA’dan alınır AP (apurinik/apirimidinik bölge site) bölgesi oluşur •AP endonükleaz DNA ipliğini keser •DNA pol I DNA sentezler •DNA ligaz oluşan boş DNA ipliğini bağlar Hasarlı baz Hasarı tanımlanma Glikozilaz APE1 OGG1 NTH1 Kısa patch Glikozilaz UNG AAG Uzun patch Kesme Pol δ/ ε FEN1 Pol β Pol β Bağlama (Ligasyon) APTX Pol β Lig 3 XRCC1 Pol δ/ ε FEN1 PCNA Pol β Lig 1 XRCC1 BER Sistemi ve Anomaliler • Farede glikozilazların delesyonu belirgin fenotip değişikliği göstermemiştir • DNA pol β’nın somatik mutasyonları kanser ile ilişkilendirilmiştir. • Oksitlenmeyi engellemekte rol alan MYH genindeki mutasyonlar kalın bağırsak kanseri ile ilişkilendirildi • DNA polimeraz β, Apex, DNA ligaz 1 ve Fen 1’deki mutasyonlar embriyonik letal Nükleotid Eksizyon Tamiri (NER) • Multi-protein tamir sistemi – 20 -30 protein beraber çalışıyor • Farklı tiplerde DNA hasarı tamir etmektedir – UV radyasyon sonucunda oluşan hasar – büyük lezyonlar • BER’den farklı olarak, baz değişikliklerinden dolayı oluşan hasarı aramak yerine, DNA sarmalında olan hataları araştırır • Genellikle hücre siklusunun G1 aşamasında görev alır. NER • İlk olarak E. Coli’da UV hasarına karşı yapılan tamir ile belirlenmiştir. • UV direnci için görev alan genler tesbit edilmiştir: UvrA, UvrB and UvrC. • Ekstarktlar kullanılarak bu genlerin görev aldığı mekanizmalar tanımlanmıştır. NER: E. Coli uvrAB - ATP-helikaz DNA’da hasar taraması yapar. DNA hasarı tesbit edildiğinde, uvrAB - ATP-helikaz bölgede sabitlenir ve DNA’nın katlanmasına sebep verir uvrA kompleksten ayrılarak, uvrC işleme dahil olur NER: E. Coli NER • 2 yolağı vardır: – – • Global genom tamiri (GGR)- genomdaki hasarların tamiri Transkripsiyona kenetlenmiş tamir (TCR): transkripsiyon olan DNA ipliğindeki DNA hasarının tamiri Bu iki yolak arasındaki fark – – Hasarın transkripsiyon olan bölgesinde olup olmadığıdır Hasarı tanımlamada kullanılan proteinlerin farklı olmasıdır DNA sarmalındaki hataların tanımlanması için multi protein kompleksi DNA’yı tarar (tek tek baz değişikliklerini taramaz) Hasarlı bazlar İlk aşamada hasarın transkripsiyon olan DNA ipliğinde olup olmadığı tesbit edilir Global genom tamiri (GGR) Hasar tanımlanması Transkripsiyona kenetlenmiş tamir (TCR) DDB2 DDB1 XPC HR23B Hasarlı bölgeye bağlanma RNA pol II RPA XPF ERCC2 ERCC3 XPA XPG RNA pol II ERCC1 Helikaz aktivitesi ERCC2 ERCC3 DNA sentezi ve ligazyon Pol δ/ ε RPA RFC Lig 1 Hasarlı bölgede 24-32 bazlık bir dizi kesilir GGR Hasar aktif transkripsiyon bölgesinde değilse XPC ve HR23B proteinleri tarafından tanımlanır Farklı proteinlerde bu bölgeye bağlanarak DNA ipliğini stabil tutar RPA-DNA ipliğine bağlanarak koruma görevi yapar Transkripsiyona kenetlenmiş tamir (TCR) Transkripsiyon olan DNA ipliğindeki hasar genellikle daha hızlı tamir olur Hasar daha az yapısal bozukluğa sebep olur TFIIH’nin hasarlı bölgeye entegre olmasına CSA ve CSB görev aldığı düşünülüyor. TFIIH hasarlı bölgede DNA sarmalının 20-30 bazlık bölgesinin açılmasını sağlıyor XPB ve XPD helikaz ve XPG nükleaz RNA polimerazının hasarlı bölgeden ayrılmasında görev aldığı düşünülüyor NER’in son aşamaları (GGR ve TCR) XPG, 3’ tarafından hasarlı bölgeden yaklaşık2-8 baz keser ERCC1/XPF, 5’ tarafından hasarlı bölgeden 1524 baz keser DNA sentezi bir çok protein ve ligaz ile gerçekleşir NER Sistemi ve Anomaliler • NER genlerindeki mutasyonlar DNA tamir sistemlerindeki hastalıklarla ilişkilendirilmiştir • Xeroderma pigmentosum (XP): – multigenik, otomozal resesif hastalık – Foto duyarlılığı- deri kanserleri – NER’de görev alan farklı genlerin mutasyonu sebep olabilir NER Sistemi ve Anomaliteler • Cockayne sendromu (CS): – otomozal resesif hastalık – Fiziksel ve mental gerilik, mikrosefali, nöral defektler, ve uzun kollar bacaklar. – CS hastalarıda XP gibi ışığa duyarlıdırlar ancak bu hastalarda kanser oluşmaz – mutasyonlar - CSA ve CSB NER Sistemi ve Anomaliteler • Trichothio distrofi (TTD): – otomozal resesif hastalık – Kırılgan saç ve ihtiyosis (derinin pul pul olması). – Kısa boy, mental retardasyon ve farklı yüz özellikleri – XP genlerindeki mutasyonlar (XPB veya XPD TFIIH’i kompleksi komponentleri) NER Sistemi ve Anomaliler • Embriyonik gelişim • Ercc1 (DNA çift zincir kırığı onarımında da görev alır) eksikliği, dişi ve erkek farelerde infertiliteye sebep olur ve bu genin doğru fonksiyonu gametogenezde büyük rol oynar • Ercc1’in yokluğunda, oosit matürasyonunda primer folikülleri oluşmaz ve dejenere olurlar. • Ercc1 ve Xpf genlerindeki yanlış ifadeler yuvarlak spermatidlerin oluşumuna sebep olur NER Sistemi ve Anomaliteler • Embriyonik gelişim • Defektif NER- (çift mutant Csb ve Xpa veya Xpc) fareler hayatta kalıyor, ancak gelişim retardasyonu, ataksia & motor disfonksiyonu • Farelerde Xpd yokluğu embriyonik lethal (preimplantasyon) • Farelerde Xpg yokluğu postnatal defektleri ölüm Yanlış Eşleşme Tamiri (MMR) • Yanlış eşleşme (mismatch) tamiri- replikasyon hataları • Yanlış eşleşme- sitozinin deamine olması T oluşturarak G ile yanlış eşlenmesine yol • Neleri tamir eder? • baz-baz yanlış eşleşme • insersiyon/delesyon döngüleri • Yanlış eşleşmeler 100’den başlayarak 1000’den fazla bazı içerebiliyor Yanlış Eşleşme Tamiri • Yanlış Eşleşme Tamiri çift yönlüdür – DNA’nın 3’ veya 5’ yönünden başlayarak yanlış eşleşmeyi tamir edebilir • Yanlış eşleşen bazlar, DNA glikozilaz bulunan ortamda baz eksizyon tamir sistemi ile de tamir edilebilir Yanlış Eşleşme Tamiri • DNA replikasyonundan sonra aktiftir • Yanlış eşleşme tamir sistemi G2 hücre siklusu kontrolünde görev alıyor. • Yanlış eşleşme tamiri hücre siklusu kontrolünde iki şekilde görev alabilir: – Yanlış eşleşme tamir proteinleri direk olarak hücre siklusu kontrolü proteinleri ile ilişkili olup hücre siklusunu durdurur – Yanlış eşleşme tamiri, DNA hasarını işleyerek hücre siklusu kontrolünün aktivasyonunu sağlar Yanlış Eşleşme Tamiri • Tamir üç ana aşama ile gerçekleşir; – Tanımlama – Eksizyon – DNA sentezi Yanlış Eşleşme Tamiri: E.Coli İnsanlarda Yanlış Eşleşme Tamiri • Yanlış eşleşmenin tanımlanma mekanizması tam olarak bilinmiyor • Hücre ekstraktlarında yapılan çalışmalarda tanımlamanın replikasyon çatalının yapısından olabileceğini öne sürüyor • İnsanlarda bakterilerden farklı olarak farklı protein kompleksleri yanlış eşlenen baza bağlanır (MutSα: MSH2/MSH6 and MutSβ: MSH2/MSH3) Yanlış Eşleşme Tamiri Yanlış eşleşme ve halkaların tanımlanması farklı proteinleri içerir MutSb MutSa 5’ 3’ MSH2 MLH1 G MSH6 3’ 5’ T 5’ 3’ PMS2 MutLa MSH2 MLH1 MSH3 PMS2 3’ 5’ MutLa 5’ G 3’ 5’ 3’ 3’ C 5’ 3’ 5’ Yanlış Eşleşme Tamiri • Eksizyon işleminin mekanizması da tam olarak bilinmiyor. – ATP’ye bağlı olduğu düşünülüyor – Ekzonükleazlar yanlış eşlenen bazın her iki tarafından da keserek eksizyon işlemini gerçekleştirdiği düşünülüyor – Bazı çalışmalar ise eksizyonun başlayabilmesi için DNA zincirinde önceden kesik olması gerektiğini savunuyor Yanlış Eşleşme Tamiri: Hangi DNA zinciri hatalı? • Replikasyon esnasında olan bir kesikten ötürü memeliler hangi DNA zincirinde yanlış eşleşme olduğunu ayırt edebildiği öne sürülüyor • Bazı çalışmalar ise PCNA proteinin kesiti tanımlamada ve tamiri başlatmada rol oynadığını raporluyor. Yanlış Eşleşme Tamiri Yanlış eşleşme tamirinde görev alan genlerin farklı türlerde de homologları vardır Yanlış Eşleşme Tamiri ve Anomaliler • Yanlış eşleşme tamirinde görev alan genlerdeki mutasyonlar Lynch sendromu (kalın bağırsak kanserine ve farklı kanserlere yatkınlık) • MSH2 veya MLH1 olmadığında Lynch sendromu + farklı tümörler gelişiyor • MSH3 veya MSH6 olmadığında endometriyel kanser + kansere yatkınlık • MLH3 veya PMS2 olmadığında trinükleotid tekrar instabilitesi (Fragile X) Yanlış Eşleşme Tamiri ve Anomaliler • Embriyonik gelişim: • Yanlış Eşleşme Tamir genlerindeki anomaliler anormal spermatid fenotipine yol açıyor • Msh2, Msh3 ve Pms2 genleri uzamış fare spermatidlerinde daha az ve hatta hiç bulmaz • Pms2, Mlh1 ve Mlh3 genleri farelerde yok edildiğinde dişi ve erkek fareler infertil olur • Mlh3 geni fare oositlerinde yok edildiğinde mayoz bölünme tamamlanamaz • Msh4 ve Msh5 inaktive edildiğinde, mayoz bölünme hem oositte hem de spermde durur Yanlış Eşleşme Tamiri ve mikrosatellit instabilitesi (MSI) Mikrosatellitler insan genomu boyunca dağılmış olan basit ve kısa nükleotid tekrarlarıdır. •Tekrarlayan birimlerin delesyonu veya insersiyonu sonucunda segment uzunluğunun değişmesine mikrosatellit instabilite (MSİ) denilmektedir. •MSİ, genom üzerindeki mutasyonların ve DNA tamir yetersizliğinin bir öncüsü olarak tanımlanır ve bu yüzden yüksek mutasyon hızı ile bağlantılıdır. •MSİ kalın bağırsak tanısında biyomarker olarak kullanılır Çift Zincir Kırıkları • Çift zincir kırıkları yapısal değişikliğe sebep olurlar • Oluşum sebepleri: • Egzojen: radyasyon ve kimyasallar • Endojen: gen değişiklikleri, mayoz bölünme, ROS hasarı, replikasyon çatalı hataları Çift Zincir Kırığı Tamiri • Tamir edilmeyen çift zincir kırıkları hasara ve apoptoz ile hücre ölümüne sebep olur – Translokasyonlar (bir kromozomdan kopan bir parçanın başka bir kromozoma yapışması) • İki çeşit çift zincir kırığı tamir mekanizması vardır: – homolog rekombinasyon (HR) – non-homolog uç birleştirme (NHEJ) Çift Zincir Kırığı Tamiri • Diğer tamir mekanizmalarında bir çok organizma ayni yolağı izler (örneğin E.coli ve memeliler), ancak çift zincir kırığı tamirinde organizmalar farklı yolak izlerler. • Örneğin, Deinococcus radiurans bir çeşit bakteridir ve yüksek radyasyona maruz kalmasına karşın hayatta kalır – Bunun sebebi de genomunun bir çok kopyası olması ve homolog rekombinasyonu kullanarak DNA’yı tamir edebilmesidir. • Mayalarda da genellikle homolog rekombinasyon tamiri kullanılır. • Bunlardan farklı olarak ise memeliler çoğunlukla nonhomolog uç birleştirme tamir sistemi kullanılır. Bakterilerde Non-homolog uç birleştirme • Non-homolog uç birleştirme sisteminde homolog kromozoma ihtiyaç yoktur. • Ku proteini tarafından kırık belirlenir •DNA ligaz ile kırık bölge birleştirilir Non-homolog uç birleştirme • Hücre siklusunun G1 aşamasında aktifdir. • İki yolağı vardır; – Klasik non-homolog uç birleştirme – PARP1 proteine bağlı non-homolog uç birleştirme Non-homolog Uç Birleştirme (A) Ku70/80 kırık DNA’ya bağanır DNA-PKcs de bağlanır. DNA-PKcs kırığının DNA’yı degrede etmesinden korur. (B) DNA şekil değiştirir ve farklı proteinlerde bölgeye entegre olur. (C) İki yolaktaki fark, değişik proteinlerin kırığı onarmasında rol almasındandır. (D) DNA sentezi ligase IV/XRCC4 ile gerçekleşir. Non-homolog Uç Birleştirme ve Anomaliler • Ataksi telenjiektazi (AT):multisistem hastalıkmental retardasyon, serebellar ataksi, immün yetmezliği ve artmış kanser riski • ATM geninde mutasyon Non-homolog Uç Birleştirme ve Anomaliler • DNA-PKcs- hücre siklusunda önemli rolü var • B ve T hücrelerinin gelişimini non-homolog uç birleştirme sistemine bağlıdır – Bu sistemdeki hatalara bağlı olarak bağışıklık sistemi ile ilişkili hastalıklar gelişiyor. • Non-homolog uç birleştirme sisteminde görev alan genlerdeki mutasyonlar immün yetmezliğine yol açıyor: – Ağır kombine immün yetersizliği (SCID)- B ve T hücrelerinin gelişiminde bozukluklar (DNA-PKcs) – LIG4 Sendromu- multipl miylom, SCID (Ligaz IV) – SCID (Artemis) – SCID- mikrosefali (Cernunnos) Non-homolog Uç Birleştirme ve Anomaliler • Embriyonik gelişim: • ATM ve DNA-PKcs eksikliği farelerde embriyonik lethal • Ku70, Ku80 veya DNA-PKcs mutantları bağışıklık sistemi bozuklukları, gelişim geriliği ve infertilite Homolog Rekombinasyon Tamiri • Homolog rekombinasyon tamir sisteminin hata oranı yok sayılabilir • Hücre siklusunun S (sentez) ve G2/M fazlarında aktiftir. • Homolog rekombinasyon tamir sistemi homolog kromozomun dizisini kullanarak hasarlı bölgeyi sentezler Bakteride homolog rekombinasyon tamir sistemi • Ekzonükleaz ile kırık bölge kesilir. •Protein yardımı ile homolog kromozomu kullanarak DNA polymerase (POL) ile sentezlemeye başlar. •DNA ligaz ile geriye kalan kesikler sentezlenir. Memelilerde homolog rekombinasyon tamir sistemi •Protein kompleksi tarafından tanımlanır •RAD51, RAD52 gibi proteinlerle homolog kromozom kullanılarak DNA sentezi yapılır. BRCA1 BRCA2 Homolog rekombinasyon tamir sistemi ve Anomaliler • Farelerde Parp1 delesyonu veya inaktivasyonu homolog rekombinasyon. • HeLa kanser hücrelerinde RAD51’in inaktivasyonu hücre siklusunda hatalara sebep olur. • HeLa kanser hücrelerinde RAD51’in inaktivasyonu hücre siklusunun G2/M fazında durmasına sebep olur • XRCC3 yokluğunda hücre bölünmesinde hatalara yol açar sayısal kromozom anomalileri Homolog rekombinasyon tamir sistemi ve Anomaliler • Nijmegen breakage sendromu (NBS):mikrosefali, bağışıklık sistemi yetmezliği & kanser riski • NBS1 geninde mutasyon • HR tamir sisteminde görev alan genlerdeki mutasyonlar HR tamirinde hatalara yol açar – RAD51, RAD51C/D, BRCA1/2 ve XRCC2/3 genlerindeki hatalar kanser riskini artırır: • lösemi • Göğüs ve over kanserleri Homolog rekombinasyon tamir sistemi ve Anomaliler • Embriyonik gelişim • Mre11, Rad50, Nbs1, Brca1, Brca2, ligase IV, Xrcc1 veya Xrcc4 genlerinde mutasyonlar fare embriyolarında lethal • 53BP1 ve RAD52 embriyonik genomun aktivasyonunda görev aldığı düşünülüyor Çift zincir kırıklarında hangi sistem kullanılır: HR veya non-homolog uç birleştirme • İki sistemin birbiri ile yarış içerisinde olduğu düşünüyor. • HR sisteminde çift zincir kırığını tanımlayan proteinler non-homolog uç birleştirme sisteminde görev alan proteinleri baskılayarak tamir işlemini gerçekleştirmeye çalıştığı düşünülüyor Çift zincir kırıklarında hangi sistem kullanılır: HR veya non-homolog uç birleştirme • Hücre siklusu: – HR tamiri için homolog kromozom şarttır, dolayısı ile hücre siklusunun S ve G2 fazlarında aktiftir • Hasar tipi: – Replikasyon çatalı hataları basitce uç birleştirme ile gerçekleşemez HR ve non-homolog uç birleştirme tamir sistemleri ve anomaliteler • Göğüs & over kanseri (BRCA1 & BRCA2) • Her iki sistemde defektler yaşam riski, az dozda radyasyona karşı bile sensitivite • Her iki sistemde defektler kromozom instabilitesine yol açar (kromozom kayıpları, translokasyonları) • RAD50 genindeki defektler Fanconi anemiye yol açar (gelişim geriliği, mikrosefali, deri pigmentasyon anomalileri, kardiyak, renal ve gastrointestinal anomaliler) • Dolayısı ile çift zincir kırıklarının tamiri normal gelişim için çok önemlidir. DNA İpliği Arası Çapraz Bağlar • DNA ipliği arası çapraz bağlara • Çevresel mutajenlere maruz kalma ve •Toksinlere maruz kalma sebep olur • Bu çapraz bağlar DNA ipliklerini ayrılmasını engelleyerek transkripsiyonu ve replikasyonu durdurur. • Çapraz bağların tamirinde görev alan genlerin hepsi henüz tanımlanmadı ancak bir çok farkı tamir sisteminin bir arada çalışması ile tamir gerçekleşiyor: •nükleotid eksizyon tamiri, homolog rekombinasyon tamiri, translezyon sentez tamiri DNA İpliği Arası Çapraz Bağlar HR tamiri Nükleotid eksizyon tamiri ve HR tamiri •Kompleks sistem! •Bir çok protein Özet • Egzojen metabolitler, kimyasal ve radyasyon gibi, veya endojen metabolitler, kimyasal modifikasyonlar gibi, DNA hasarına sebep olur. • Genomda farklı lezyonlar gözlemlenir. – Yanlış eşleşme – DNA kırıkları – Çapraz bağ oluşumu Özet • DNA tamir sistemleri komlike mekanizmalardan oluşur. • Bir çok farklı protein bir arada görev alır ve bunların birbirleri ile iletişimi çok önemlidir. • Son yıllarda yapılan çalışmalar ile – DNA tamir sistemlerinde görev alan proteinlerin yapısı, – DNA-protein arasındaki iletişim – proteinler arasındaki iletişim daha iyi anlaşılmıştır Özet • DNA tamiri gerçekleşemediğinde, hasarlı bazların ve kırıkların tamiri gerçekleşemez bu da genomdaki mutasyonlara ve kromozom bozukluklarına sebep olur. • Memelilerde DNA tamir sistemleri çalışmadığında, doğuştan defektlere, kansere ve hatta yaşam süresinde kısalmaya sebep olur. • Hayvanlarda ve insanlarda DNA tamir genlerinin eksikliğinin hastalıklara sebep olduğu biliniyor, bu da DNA tamir mekanizmalarının önemini vurguluyor. Özet • DNA hasarı ve tamiri arasındaki denge hücrenin ve organizmanın gelişip gelişemeyeceğini, yaşayıp yaşayamayacağını belirleyen etkenlerden biridir. • Gelişim döneminde farklı DNA tamir genlerinin ve proteinlerinin görev alması, DNA tamir sistemlerinin farklı gelişim dönemlerinde farklı görevleri olduğunu gösteriyor. • DNA tamir mekanizmasında görev alan bir çok protein ve enzim farklı hücresel yolaklarda da görev alır (örneğin replikasyon ve transkripsiyon). Özet : DNA tamir sistemleri • Memelilerde 4 ana tamir mekanizması vardır: • Baz eksizyon tamiri → hasarlı bazlar (alkilasyon & oxidasyon hasarlarının tamiri) • Nükleotid eksizyon tamiri → hasarlı nükleotidlerin tamirinde görev alır • Yanlış eşleşme tamiri → Bazlar hasar görmez • → DNA replikasyon hatalarının tamirinde kullanılır (G2/M hücre siklusu kontrolünde kullanılır) Özet: DNA tamir sistemleri • Çift zincir kırıklarının tamiri → çift zincir kırıkları (kromozom kayıpları veya translokasyonları) • Homolog rekombinasyon tamiri → hata oranı yok sayılabilir, homolog kromozomu sentez için kullanır (S/G2 hücre siklusu) • Non-homolog uç birleştirme→ hata oranı daha yüksek (G0/G1 hücre siklusunda aktiftir) Özet : Baz Eksizyon Tamiri • Baz eksizyon tamiri reaktif oksijen türlerinin veya egzojen ajanların sebep olduğu hasarlı bazların tamirinde kullanılır • İki yolağı vardır: – kısa-patch- bir nükleotid tamir eder – uzun-patch- 2-12 nükleotid tamir eder • Memelilerde bu iki yolağın ilk aşamaları aynidir – Hasarlı baz eksizyon ile kesilip atılır – bir çok protein beraber çalışarak DNA sentezini yapar. – İki yolak arasındaki fark en son aşamadır. Bu aşamada farklı proteinler görev alarak DNA kesiğini sentezler. Özet : Nükleotid Eksizyon Tamiri • Bu tamir sistemi bir çok proteinin beraber çalışması ile gerçekleşir. • UV radyasyon, çevresek karsinojenler, kimyasallar ve endojen metabolitlerin yarattığı hasarı tamir eder • İki yolagi vardır: global genomik tamir ve transkripsiyona kenetlenmiş tamir sistemleri • Bu iki yolak arasındaki fark tanımlama aşamasında kullanıan proteinlerdir • İnsanlarda global genomik tamir sistemi aktif transkripsiyon olan bölgelerin dışındaki bölgelerdeki hasarı tamir ederken, transkripsiyona kenetlenmiş tamir sistemi transkripsiyon aktif bölgedeki DNA hasarını tamir eder. Özet: Yanlış eşleşme tamir sistemi • Yanlış eşleşme tamir sistemi DNA replikasyonu esnasında oluşan hataları tamir eder. • Diğer tamir sistemlerinden farkı, bazlar hasarlı değildir. • Tamir yanlış eşlenen bazlar veya halkaların oluşması veya delesyonunu tamir eder • Bu tamir sistemi de eksizyon, sentez ve ligasyondan oluşur. Bir çok proteinin beraber çalışması ile tamir gerçekleşir. Özet: Çift zincir kırıkları- homolog rekombinasyon tamiri • Homolog rekombinasyon tamir sistemi çift zincir kırıklarını homolog kromozom kullanarak tamir eder. • DNA templatı kullanılarak sentez yapılır ve ligaz ile kırık DNA iplikleri birbirne bağlanır. • Bu tamir sisteminin hata oranı daha düşütür Özet: Çift zincir kırıklarınon-homolog uç birleştirme tamir sistemi • HR tamir sistemine göre hataya daha açıktır • Bu sistem kırık uçları proses ederek birbirlerine bağlanabilmesi için uyumlu hale getirir • Daha sonra DNA birbirlerine ligaz ile bağlanırlar Ofis: 402, Tıp Fakültesi
