TÜBİTAK 1003 Buğday Tuzluluğu Projesinin Üçüncü Dönem

TÜBİTAK 1003 Buğday Tuzluluğu Projesinin
Üçüncü Dönem Raporu Özeti
Toprak tuzluluğu, özellikle kurak ve yarı kurak bölgelerde buğday verimliliğini
etkileyen başlıca tarımsal sorunlardan biridir. Ayrıca, bu tuzlu toprak
bölgelerine çoğunlukla Bor toksisitesi eşlik eder. TÜBİTAK 1003 programı
tarafından desteklenen bu projede, Türk buğday genotip ve hatlarında tuz ve bor
toleransı oluşturulmasını amaçlıyoruz. Ekim 2015'te başlatılan proje, Avustralya
çeşitlerinin alınması (2012), kabul edilen projede daha fazla kullanım için
çoğalmaları (2013), deneysel Türk genotiplerinin çiçeklenme süresinin ve
gelişim döneminin belirlenmesi (2013-2014), F1 tohumlarının gelişimi (2014)
ve bunların çoğaltılmaları (2014, 2015), geri melezleme 1 (2015-2016), geri
melezleme 2 (2016-2017) ve geri melezleme 3 (2017-2017) aşamalarını içerir.
Şu anda, geri melezleme 4 denemesinin yürütülmesi için hazırlık aşamasındayız.
1.Şimdiye Kadar Yapılan Çalışmaların Özeti
1.1Alan Koşulları (2015-2016) kapsamında İlk Geri Melezleme
(GM1)
Projenin başlatılmasından sonra, farklı durum ve ekmeklik buğday hatlarının ilk
geri çaprazlanması tarla koşulları altında gerçekleştirildi (2015-2016). Ekim
2015'te anne genotipleri bir kez ekildi; baba genotipleri çiçeklenme zamanındaki
farklılıklar nedeniyle her ekim zamanı arasında 10 gün ara bırakılarak üç kez
ekildi. Yaprak örnekleri üç yapraklı fide aşamasında iken farklı bitkilerden
toplanarak moleküler analiz yapıldı ve Nax1, Nax2 ve Bot genlerinin varlığı
tespit edildi. Ekilen F1 materyali ile ilk geri-çaprazlama Mayıs 2016'da yapıldı.
Elde edilen pozitif bitki örneklerinin sayısı ile birlikte laboratuvar koşullarına
uyarlanmış optimize DNA ekstraksiyonu ve PCR yöntemi hakkında detaylı bilgi
ve hibritlenmiş tohumların sayısı ilk proje dönem raporunda sunulmuştur. Bu
geçiş döneminde, Bir önceki dönemde anne ebeveyn olarak kullanılan bitki
genotipleri erkek ebeveyn olarak kullanıldı ve ilk geri melezlemenin, F1
ebeveynlerini anne ebeveyn olarak kullanıldı. GM1 geçiş döneminde ortalama
416 tohum elde edildi.
1.2.Sera Koşulları (2016-2017) Altında İkinci Geri Melezleme
(GM2)
İkinci geri çaprazlamanın sera içerisinde yapılması planlandığı için, ısıtmasoğutma, kenar reflektörler, otomatik sistem ve LED kırmızı mavi büyüme ışık
sistemi kurulumu bu dönem başlamadan önce yapıldı. Bu geçiş döneminde, 16
kombinasyonun her biri için 150 fide seradaki saksılara transfer edildi. DNA
izolasyonu için yaprak örnekleri fide aşamasında toplandı ve mikrosatellit
primeri, GWM312 ve lokusa spesifik primer, cslink Nax2 sırasıyla geçiş
kombinasyonlarında Nax1 ve Nax2 genlerinin amplifikasyonunu kontrol etmek
için kullanıldı. Pestisitler ve gübre uygulamaları gibi bakım prosedürlerinin
doğru uygulanmasının ardından ve her melez kombinasyonunda en az 50 adet
geri melezleme yapılıp istenilen hedef doğrultusunda ilerlemiştir.
2. Üçüncü Proje Rapor Döneminde yapılan çalışmalar (3.PGR)
2.1 Projenin 3. Döneminde Bilimsel ve Teknik Gelişmeler
Bu proje dönemine ilişkin hazırlıklar 2. proje döneminde başlamıştı ve 4-5 hafta
soğuk oda (0-4°C) sıcaklıklarında vernalizasyon işlemleri yapıldı.. GM3
tohumlarının yetiştirilebilmesi için bu proje döneminde hem arazi ve hem sera
koşullarında çapraz denemeler yapılması planlanmıştır. Bu amaca ulaşmak için,
her melez kombinasyonundan yaklaşık 200 GM2 tohum ve üç ekim zamanı için
ebeveyn genotipleri çimlenme için tutulduktan sonra 24 saat süreyle + 7°C
muamele edildi. Tohumlar, vernalizasyon öncesi %5 Sodyum Hipoklorit
çözeltisi ve damıtılmış su kullanılarak sterilize edildi (Şekil 1). Daha sonra
vernalizasyon için ayarlanabilir soğuk odaya 5 hafta süreyle transfer edildi.
Şekil 1. Soğuk oda vernalizasyonu, % 5 Sodyum Hipoklorit çözeltisi
sterilizasyonu ve tohum ekimi
Şekil 2. Sera içerisinde her bir kombinasyonun 10 saksıya beş fide olacak
şekilde transferi
Bu proje dönemi, aynı anda iki farklı yerde (sera ve tarla) planlanması
nedeniyle daha kritik hale geldi. Dolayısıyla, süreci başarıyla tamamlamak için
ek çabalar, kaynaklar ve harcamalar yapıldı. Sera için 16 farklı melez
kombinasyonun GM2 tohumları ve üç farklı ekim zamanı için baba genotipleri,
tarla için 16 farklı melez kombinasyonun GM2 tohumları ve üç farklı ekim
zamanı için baba genotipleri, hepsi farklı zamanlarda vernalizasyon için
tutuldu.Bundan dolayı, dikimleri her iki büyüme koşulunda farklı tarih ve
zamanlarda yapıldı.
Serada her 10 saksı başına beş fide olacak şekilde (her kombinasyonda toplam
50 fide) (Şekil 2) ve tarlada her bir sıraya 25 fide olacak şekilde, beş sıralı geçiş
kombinasyonu (toplam 125 bitki ) (Şekil 3) Mayıs 2017 boyunca dikildi. Serada,
bitki örtüsü ve yetiştirme döneminde, iki kez böcek ilacı uygulanması ile farklı
bakım prosedürleri uygulanmıştır. Serada saksılar için kullanılan toprak gerekli
besin elementleri mevcut olsa da ve besin açısından zengin alan deneme için
seçildi rağmen, tarlada bir ve serada iki kez gübre uygulanmıştır.
Şekil 3.Tarla her geçiş kombinasyonunun beş sıra olduğu her sıra 25
fidenin transferi
Şekil 4. DNA izolasyonu edilen fidelerdeki kaliteli jel görüntüsü
Sera ve tarlada yetiştirilen tüm buğday genotiplerinden DNA izolasyonu için
yaprak örneklerin alınması, sırasıyla 9 Haziran ve 19 Haziran 2017'de
başlatılmış ve daha ileri bir kullanım için sıvı azot ile muamele edildikten sonra
-80 ° C'de saklanmıştır. 1.PGR döneminde TÜBİTAK tarafından finanse edilen
QIAGEN QIAcube HT sistemini kullanarak Nax gen taramasını yapmak için her
bir bitkiden yaklaşık 100 mg örnek alındı ve sonuç olarak yüksek kaliteli ve
yüksek miktarda DNA elde edildi (Şekil 4).
Hem sera hem de tarla koşullarında bitkilerin hızlı büyümesi nedeniyle, toplanan
numunelerin DNA ekstraksiyonu ve moleküler taramaları aynı anda
gerçekleştirildi. Geçiş kombinasyonlarında Nax1 ve Nax2 genlerinin
amplifikasyonunu kontrol etmek için, sırasıyla mikrosatellite primer GWM312
ve lokusa spesifik primer, cslink Nax2 kullanıldı. Ayrıca, Qiaxcel ve Bioptic
analizör kapiler elektroforez sistemi kullanarak, Nax1 ve Nax2 genleri aktarılan
pozitif allellerin mevcudiyetinin saptanması için gerimelez2 (GM2) genotipleri
tarandı. Elde edilen elektrofenogramlardan spesifik aleller skorlandı (Şekil 5).
Şekil 5. Nax1 ve Nax2 genlerinin taranması sırasında Qiaxcel İleri
Elektroforez Sisteminden elde edilen elektrofenogram
Şekil 6. Edinilen sonuçlardan Pozitif genotiplerin seçilmesi
Edinilen sonuçlardan işaretlenen pozitif genotipler, daha fazla geçiş programı
için seçildi (Şekil 6) ve Nax genleri içermeyen negatif genotipler sera ve tarla
sıralarından çıkarıldı. Nax genlerini taşıyan olumlu bireyler için geriçaprazlama, 18 Haziran ve 2 Temmuz 2017 tarihleri arasında sırasıyla sera ve
tarla koşullarında yapıldı (Şekil 7, 8), burada pozitif bireyler anneler olarak
emaskülasyon yapıldı ve yerel genotipler, GM3 tohumları elde etmek için
babalar olarak kullanılmıştır. İlk proje raporu döneminde seranın yenilenmesi
nedeniyle, hibridizasyon için optimum koşullar muhafaza edilebilir ve serada
tekrar çaprazlama beklenenden daha uzun süre yapıldı.
Şekil 7. Serada Nax genleri taşıyan pozitif genotipler için emaskülasyon
işlemi
Şekil 8. Tarlada Nax genleri taşıyan pozitif genotipler için emaskülasyon
işlemi
Bu nedenle, farklı ebeveyn genotiplerinin erken ve geç çiçeklenme dönemine
göre, sırasıyla sera ve tarla çaprazında yeniden çaprazlama Temmuz 2017 ortası
ve sonuna kadar yapıldı ve sırayla: EBH1, EBH2, MBH1, Bolal 2973, Bayraktar
2000, Kınacı, Kızıltan ve Mirzabey çiçeklenme görüldü. Hem sera hem de tarla
koşullarında, 22-24 Ağustos 2017 tarihine kadar olgun döllenmiş başaklardan
hasat gerçekleştirildi (Şekil 9). Her kombinasyondaki her tozlanan başaklar ayrı
ayrı hasat edildi, ardından elde edilen tohum sayısının ayrı ayrı temizlenmesi,
depolanması ve kaydedildi (Şekil 10).
Şekil 9. Döllenen olgun başakların hasatı
Şekil 10. Ayrı olarak hasat edilen başakların ayrı ayrı temizlenmesi,
depolanması ve kaydedilmesi
Bu proje döneminde tarla ve seradan elde edilen hibrit GM3 tohum sayısı,
önceki proje şartlarında elde edilen tohum sayısı ile uyumludur (Tablo 1). Iki
farklı yerde aynı anda denemeler yapılırken ek iş yüküne rağmen, her iki
denemede de yaklaşık 50 geri melezleme yapıldı ve geri melezleme ile
hedeflenen sayı elde edilmiştir.
Tablo 1. Bu proje döneminde sera ve tarla elde edilen hibrit GM3 tohum
sayısı
3. Proje Süresince İlgili Çalışmalar ve Bilimsel Etkinlikler
Bu proje döneminde, tuz toleransı ve mekanizması hakkında daha fazla bilgi
edinmek için ve diğer ülkelerden bazı tuza dayanıklı buğday çeşitlerini projeye
dahil etmek için , hidroponik sistemde bir tuz stres denemesi yapıldı. Bu
araştırmada, tüm proje genotipleri ve ek hekzaploid buğday genotipleri, 0 mM
NaCl, 100 mM NaCI ve 200 mM NaCI ile bir hafta boyunca muamele yapıldı.
Lipid peroksidaz seviyeleri (MDA), Süperoksit dismutaz (SOD), Glutatyon
Redüktaz (GR), Peroksidaz (POX), H2O2 birikimi ve • OH-süpürme aktivitesi
tespit edildi. Bu ek deneme sonuçları 13. Uluslar arası “Bitkilerde Reaktif
Oksijen ve Nitrojen Türlerinin Rolleri” Konferansında sunuldu. (Kuşadası/
Türkiye 10-13 Eylül tarihleri arasında gerçekleşti).
Şekil 11. Hidroponik sistemde gerçekleştirilen tuz stres çalışması
4. Gelecek Dönem için Hazırlık
Sera ve tarladan elde edilen GM3 tohumlarının sayısına göre, bir sonraki proje
dönemi için ekim planı çizilmiştir. Bir sonraki tekrar çaprazlama serada
gerçekleştirileceğinden, her bir kombinasyondan yaklaşık 200 GM3 tohumları
ve baba genotipleri 4-5 hafta soğuk oda (0-4°C arasında) vernalizasyonda
tutulmuştur. Ayrıca, önümüzdeki proje dönemi için toprak ve saksı hazırlığı
devam ediyor.