2016 (Ekim)

TÜBİTAK-1003 Projesi
Serin İklim Tahıllarında Çeşit Islah Programlarının Oluşturulması Çağrısı
214O072 no’lu Klasik ve Moleküler Islah Yöntemleri Kullanılarak Bazı
Buğday Çeşitlerine Tuza Toleranslılık Genlerinin Aktarılması Başlıklı
Projenin 1. Gelişme Raporu Özeti (Ekim 2016)
Proje Yürütücüsü
Prof. Dr. Erdoğan Eşref Hakkı
Selçuk Üniversitesi Toprak Bilimi ve Bitki Besleme Bölümü
Projenin Konusu:
Dünya’da ve de ülkemizde insan beslenmesinde en ön sırada olan kültür bitkisi buğdayın
ekim alanlarına oldukça yaygın olan elverişsiz (tuz ve bor içeriği yüksek) tarım alanlarının
ve gittikçe önem kazanan marjinal alanların dahil edilebilmesi için kendi ekolojik
şartlarımıza uygun genotiplerimizin bu ortamlarda verimli ve kaliteli üretimi konusunda
ilerleme sağlamaktır.
Projenin Amacı:
Avustralya’da CSIRO’dan temin edilerek çoğaltılan tuza toleranslı ekmeklik ve makarnalık
buğday hatlarından klasik ve moleküler ıslah yöntemleri ile bu toleranslılığı sağlayan Nax1
ve Nax2 genlerinin Orta Anadolu tarım kuşağına iyi adapte olmuş yerel buğday çeşitleri ve
ümitvar hatlara aktarılmasıdır. Ayrıca tuzlu, kurak ve yarı kurak toprakların önemli bir
kısmında aynı zamanda bor toksisitesi özellikle buğday tarımında verimi düşüren ve kaliteyi
etkileyen önemli bir abiyotik strestir. Bor toksisitesine tolerans allelini taşıyan eski bir Türk
buğday çeşidinin melezleme programına dahil edilmesi ile tuz ve bor toleranslılığı
özelliğine sahip buğday genotiplerinin geliştirilmesinde ilerletilmiş melez hatlar elde
edilmesi hedeflenmektedir.
Ön Çalışmalar-1
• Proje 1 Ekim 2015 tarihinde başlamıştır. CSRIO’dan 2013 yılında temin edilen tuza
tolerans genlerini taşıyan Avustralyalı hatlar (5004, 5020-7, 5924 and 5907)
fakültemizin tarlasına ekilmiştir ve tohumluk eldesi için çoğaltılmıştır.
• 2013 Ekim ve 2014 Mart aylarında ise makarnalık (Mirzabey 2000, Kızıltan 91 ve
MBH1) ve ekmeklik (Bayraktar 2000, Kınacı 97, EBH1 ve EBH2) ve Avustralyalı
hatlar ekilmiştir. Bu aşamada genotiplerin çiçeklenme zamanları/gelişimleri takip
edilmiştir. İlk melezlemeler 2014 Mayıs ayında yapılmıştır.
• Bu aşamada elde edilemeyen veya yeterli olmayan melez tohumlar için 20142015 sezonunda 3 farklı zamanda arazi şartlarında ekim gerçekleştirilmiştir: Ekim
2014, Kasım 2014 ve Mart 2015.
2014-2015 Ekim Dönemi
2015 Mayıs Melezleme Dönemi
Ön Çalışmalar-2
• Arazi ekimine paralel olarak ayrıca sera koşullarında da bitkilerin
gelişimini/büyümesini takip etmek için ekim gerçekleştirilmiştir ve melezleme
çalışmaları yürütülmüştür.
• 2014-2015 sezonu melezleme çalışmalarında her bir kombinasyon için minimum
150 tohum hedeflenmiştir. 16 kombinasyondan sadece EBH1*5924
kombinasyonunda 119 melez tohum elde edilmiştir.
• Projenin resmi başlangıç tarihi olan Ekim 2015den evvel F1 tohumları hazır
edilmiştir.
2014-2015 Sezonu Sera Ekimi
2014-2015 Sezonu
Sera Melezleme
Geri Melezleme(GM1) Eldesi için Çalışmalar
• Bir önceki senenin tecrübesine dayanarak melezleme için çiçeklenme zamanlarını
yakalayabilmek için GM1 eldesi için tarlada 10ar gün arayla 3 farklı zamanda ekim
gerçekleştirilmiştir: 5 Ekim 2015, 15.10.2015, 25.10.2015.
• Ekim öncesi parsellere DAP gübresi uygulanmıştır, Şubat sonunda üre ve Nisan ayında
da amonyum sülfat gübrelemesi yapılmıştır.
• Bitkiler ekim sonrası için çim suyu ve daha sonraki dönem ihtiyaçlarına göre damlama
sulama yapılmıştır. Herhangi bir ilaçlama yapılmamıştır. Yabancı otlar ise elle
uzaklaştırılmıştır.
• Anne olarak kullanılacak olan F1 genotiplerin her birinden kardeşlenme döneminde
Nax1,Nax2 ve Bot gen taramalarını yapmak için yaprak örnekleri alınmıştır. Moleküler
taramalarını gerçekleştirdikten sonra gen taşıyan pozitif genotipler belirlenmiştir.
• Pozitif genotiplerin kastrasyonuna Nisan 2016’da başlanmıştır. Hava şartlarına göre 35 gün sonra da tozları verilmiştir.
Geri Melezleme(GM1) Eldesi için Çalışmalar
• Moleküler taramalarda skorlamalar sonucu geni taşıyanlar yani pozitif olan örnekler
arazide sarı fiyonk ile işaretlenmişlerdir.
• F1 eldesinde anne olarak kullanılan genotipler geri melezleme çalışmalarında baba
olarak kullanılmıştır. F1 genotipleri kastrasyon edildikten sonra, hava durumuna göre
F1 genotiplerine 3-5 gün sonra tozları verilmiştir.
• 2015 Temmuz ayında ise hasat gerçekleştirilmiştir. Hasat sonucunda her bir
kombinasyondan ortalama 300 tohum hedeflenmiştir. Ama bazı kombinasyonlarda
bu hedefe ulaşılamamıştır. (Bayraktar X 5924) X Bayraktar; (Bayraktar X 5907) X
Bayraktar; (EBH1 X 5907) X EBH1; (EBH2 X 5924) X EBH2’den sırası ile 185, 181, 144
and 203 tane pozitif melez tohum elde edilmiştir. Yalnız Mirzabey*5004
kombinasyonunda 902 melez tohum elde edilmiştir. Lakin tiplendirme çalışmalarında
teknik bir sorundan dolayı zamanında tamamlanmadığı için pozitif melez tohumlar
belirlenememiştir.
2015-2016 Nisan-Mayıs
Melezleme Dönemi
2015-2016 Nisan Mayıs
Melezleme
DNA İzolasyonu ve
Nax1, Nax2 ve Bot(Tp4A)-B5c taramaları
• DNA izolasyonları için Şubat 2016 döneminde alınan yaprak örnekleri sıvı azotta
şoklanıp, -80 C’e kaldırılmıştır. DNA izolasyonları ilk olarak modifiye edilmiş
2xCTAB
metodu
ile
gerçekleştirilmiştir.
İzolasyonların
daha
hızlı
gerçekleştirilebilmesi için 96 örneği aynı anda izole edebilen QIAGEN marka
Qiacube HT modeli devreye girmiştir.
• Nax1 ve Nax2 PCR taramaları CSIRO’dan alınan protokolün optimizasyonu ile
gerçekleştirilmiştir.
• Bot genleri taraması ise (Pallotta ve ark., 2014)’den modifiye edilerek
gerçekleştirilmiştir. Bor toksisitesi tolerans geni taramaları için AWW516 ve
AWW525 genetik markörleri test edilmiştir ama AWW525 ile genotiplerin
taraması gerçekleştirilmiştir.
• Tiplendirme çalışmaları için Bioptic cihazından elde edilen elektrofenogramlar ve
jel görüntülerinin sonucuna göre belirlenmiştir.
TissueLyser II İLE HOMOJENİZASYON
QIAcube HT İLE EKSTRAKSİYON
DNA Örneklerine Ait:
Agaroz Jel Görüntüsü & NanoDrop 1000 Okuması
Bioptic ile Tiplendirme
Moleküler Optimasyon
Çalışmaları Jel Görüntüleri
2016 2. Dönem için Ön Çalışmalar
• Pozitif olan genotiplerin başakları ayıklanmıştır. Projenin 2. dönem çalışma
planında GM1 tohumlarının serada yetiştirilip GM2 aşamasına getirilmesi
planlanmıştır. Tohumlar ekilmeden evvel vernalizasyona ihtiyaç duymaktadır. Bu
yüzden tohumların vernalizasyonu öncesinde 104 gözlü viyollerde tohumların
sterilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ebeveyn takibini yapabilmek için viyollerin
Excel’de ekim planları hazırlanmıştır.
• Tohumların sterilizasyonu için sırasıyla %5’lik Sodyum Hipoklorit çözeltisi, çeşme
suyu ve saf sudan geçirilmiştir. Tohum sayısı az olan kombinasyonlar hariç her bir
viyolde en az 200 tohum steril edilmiştir. 5 hafta boyunca +4 derece dolapta
ebeveynler ve GM1 tohumları vernalize edilmiştir. 6.haftada ise tohumların
devernalize olmaması için 8-10 C’ye sıcaklığı yükseltilmiştir.
• Eylül ayının son haftasında ise 15 kg’lık saksılar 1:1 oranında toprak torf
karışımından doldurulmuştur. Her bir saksıya 10ar tohum ekilmiştir.
Sera Revizyonu
• Selçuk Üniv. Ziraat Fakültesi Toprak Bilimi ve Bitki Besleme Bölümü’ne
ait olan sera yaklaşık 15 yıldan beri aktif çalıştığı için bazı revizyonlara
ihtiyaç duyulmuştur.
• Bu kapsamda projenin de desteği ile
1. Isıtma-soğutma, kenar yansıtıcıların ve otomasyon sisteminin
yenilenmesi
2. Konya şartlarında sera ekimleri için güz döneminde gerekli olan
özel amaçlı aydınlatma sistemi (LED Red-Blue Growth Light
Sistemi) devreye sokulmuştur.