tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü farmakoloji anabilim dalı
advertisement
T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI MİYOKARDİYAL İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARININ TEDAVİSİNDE RESVERATROL: mitoKATP KANALLARININ ROLÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ecz. Mohammadreza LAK ZADEH Tez danışmanı Doç. Dr. Nilüfer N. TURAN DURAL ANKARA Temmuz 2012 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMAKOLOJİ ANABİLİM DALI MİYOKARDİYAL İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARININ TEDAVİSİNDE RESVERATROL: mitoKATP KANALLARININ ROLÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ecz. Mohammadreza LAK ZADEH Tez danışmanı Doç. Dr. Nilüfer N. TURAN DURAL Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Birimi tarafından 02/2010-16 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Temmuz 2012 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Şekiller Semboller, Kısaltmalar i ii iii iv 1.GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Miyokart Fizyolojisi 2.2. Miyokart İskemisi-Reperfüzyon 2.3. Miyokart İskemisi-Reperfüzyon Hasarına Koruyucu Yöntemler: İskemik ve Farmakolojik Koşullama 2.3.1. İskemik Ön ve Ard koşullama 2.3.2. Farmakolojik Koşullama 2.4. Resveratrol 2.5. 5-Hidroksidekanoat 3. GEREÇ VE YÖNTEM 4 9 18 18 25 26 29 32 3.1. Gereçler 3.1.1. Kullanılan Deney Hayvanları 3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler 3.1.3. Kullanılan Aletler 3.2. Yöntem 3.2.1. Sıçan İzole Kalp Preparatının Hazırlanması ve Ölçülen Hemodinamik Parametreler 3.2.2. Deney Protokolü 3.2.3. İnfarkt Alan Değerlendirilmesi 3.2.4. İstatistiksel Analiz 4. BULGULAR 32 32 32 33 34 4.1. İnfarkt Alan 4.2. Hemodinamik Parametreler 4.2.1. Sol Ventrikül Gelişen Basıncı 4.2.2. Sol ventrikül Sonu Diyastolik Basınc 4.2.3 –dP/dt ve +dP/dt 5.TARTIŞMA 6.SONUÇ 7.ÖZET 8.SUMMARY 9.KAYNAKLAR 10.ÖZGEÇMİŞ 38 39 39 41 42 45 50 51 52 53 61 34 35 37 37 38 ii ŞEKİLLER Şekil 1: A-Miyozin moleküler yapısı B-Aktin moleküler yapısı Şekil 2: İskemik önkoşullama oluşum mekanizmaları 7 17 Şekil 3: İskemi-reperfüzyon hasarı içeriği, önkoşullama ve ardkoşullama ile kalp koruma 24 Şekil 4: Deney protokolü 36 Şekil 5: İnfarkt alan değerlendirilmesi 38 Şekil 6: TTC ile boyanan kalpleri 39 Şekil 7: Sol ventrikül gelişen basınç değerlendirmesi 40 Şekil 8: Sol ventrikül gelişen basınç kayıtları 41 Şekil 9: Sol ventrikül diyastol sonu basınç değerlendirmesi 42 Şekil 10: -dP/dt değerlendirmesi 43 Şekil 11: +dP/dt değerlendirmesi 44 iii KISALTMALAR ve SEMBOLLER ATP : Adenozin trifosfat ROS : Reaktif oksijen türevleri NO : Nitrik oksit mPTP : Mitokondriyal permeabilite transizyon poru BK : Büyük kalsiyum ile aktive edilen potasyum kanalları ER : Endoplazmik retikulum PKC : Protein kinaz C L-NAME : Nitro-L-arjinin metil esteri TTC : Trifeniltetrazolyum klorür µM : Mikromolar SVGB : Sol Ventrikül Gelişen Basıncı SVDSB : Sol Ventrikül Diyastol Sonu Basıncı İNOS : İndüklenebilir nitrik oksit sentaz AV : Atriyoventriküler düğüm Ach : Asetil kolin KATP : ATP’ye duyarlı potasyum kanalları NAD(P)H : Nikotinamid adenin nükleotid fosfat mKATP : Mitokondriyal potasyum-ATP kanalları H : Hidrojen K : Potasyum Ca : Kalsiyum Na : Sodyum HCO : Bikarbonat NaCl : Sodyum klorür KCl : Potasyum klorür KH2PO4 : Potasyum dihidrojen fosfat MgSO4 : Magnezyum sülfat NaHCO3 : Sodyum bikarbonat 5-HD : 5-Hidroksidekanoat MAPK : Mitojen ile aktive olan protein kinaz ADO : Adenozin cGMP : Siklik guanozin mono fosfat eNOS : Endoteliyal nitrik oksit sentaz ATPaz : Adenozin trifosfataz MLCP : Miyozin hafif zincir fosfataz MLCK : Miyozin hafif zincir kinaz iv 1.GİRİŞ Miyokart iskemisi dünyada ölüm nedenlerinin başında yer almaktadır. Amerika Birleşik Devletlerinin (ABD) raporlarına göre 2010 yılında 82.000.000 kişi kardiyovasküler hastalıklarının bir veya daha fazlasına sahiptir. Aynı rapora göre 16.300.000 kişi koroner arter damar hastasıdır ve bunun 7.900.000 miyokart infarktüsü olan hastalardır. ABD 'de kardiyovasküler hastalıklardan %20 ölüm oranı olarak rapor edilmektedir. Bu durum dünyada pek çok ülkede benzerdir ve büyük mali yüke de neden olmaktadır1,2. Miyokart infarktüsü klinik olarak ilk defa 1910 yılında tanımlanmıştır fakat kesin teşhis 1920’lerde klinik uygulamalara 3 elektrokardiyogramın girişinden sonra mümkün olabilmiştir . Dokulara kan sağlayan damarların, bir pıhtı veya mekanik etkenle tıkanması sonucu dokunun beslenmesinin bozulmasına iskemi, doku kanlanmasının ilaçlarla veya mekanik müdahalelerle yeniden sağlanmasına reperfüzyon denir. Önkoşullama, kontrollü kısa periyodlarda öldürücü düzey altı iskemiye maruz kalan kalbin daha sonraki uzun lethal bir iskemi periyodunda oluşan hücresel hasarı azaltan kalbi koruyucu bir mekanizmadır. 1986’da Murry ve arkadaşlarının köpeklerde, miyokardın dört kısa dönem iskemi ve reperfüzyona maruz kalmasının, daha uzun iskemi periyotlarına, önceden maruz kalmayanlara göre iskemiyi iyi tolere 1 ettiklerini gösterilmesi, önkoşullama (preconditioning) teriminin ileri sürülmesine yol açmıştır4,5. Literatürde, önkoşulluma ile ilişkili diğer bir terim farmakolojik önkoşullamadır. Bu terim, farmakolojik ajanların muhtemel koroner tıkanmadan önce verilerek miyokart hasarın azaltılmasını ifade etmektedir. Farmakolojik önkoşullamaya örnek olarak, Adenozin A1 agonistleri ve K ATP kanal açıcıları verilebilir. Bu ajanlar “önkoşullamayı taklit ediciler” olarak da adlandırılırlar6,7,8. Son dönemlerde farmakolojik önkoşullama metodlarında kullanılan maddelerin başında resveratrol gelmektedir. Resveratrolun hücre içi kalsiyumun aşırı yüklenmesini azaltarak aritmiyi önlemekle beraber koroner vazodilatasyon sağladığı ya da KATP kanal açıcı olarak etki gösterdiği öne sürülmüştür10. Resveratrol (3, 4, 5-trihidroksistilben) üzüm tanelerinde bol miktarda bulunan polifenol yapısında doğal bir antioksidan maddedir. Yapılan çalışmalar güney Fransa’da yağlı diyet ve sigara kullanımının fazla olmasına rağmen bol tüketilen şarap nedeniyle kalp hastalıklarının görülme sıklığının diğer ülkelere göre düşük olmasına yol açmıştır. Bu durum Fransız Paradoksu olarak adlandırılır 9. Resveratrol düşük toksisitesi ve çoklu koruyucu etkisi ile klinikte kullanımı çok uygun bir ajandır. You-Ren Chen ve ark.’ı uzun süreli resveratrol uygulamasının inceledikleri çalışmada miyokart infarktüsünün neden olduğu aritminin, kardiyak hipertrofinin ve yaşam süresinin iyileştiğini göstermişler. Resveratrol bu etkiyi kardiyak miyositler üzerine kalsiyum kanallarını bloke ederek ve KATP kanallarını açarak göstermektedir10,11. 2 Resveratrol, hücre içi kalsiyumun aşırı yükselmesini azaltarak aritmiyi önlemekte ve koroner vazodilatasyonu sağlamaktadır ya da KATP kanal açıcı olarak etki gösterdiği ileri sürülmüştür. Wu ve ark.’ı resveratrolün büyük-Ca+2’ kanal ile aktive edilen K+ kanallarının (BK) direkt aktivasyonu ile vasküler endotel hücrelerde hiperpolarizasyon yaptığını göstermişler10. Oldenburg ve arkadaşlarının ATP duyarlı K+ kanallarının iskemik önkoşullamada kalbi koruduğunu belirtmişlerdir12. Bu kanalların iskemi sırasında açılmasının infarkt alan boyutunu düşürmede önemli rolü olduğunu bildirmişlerdir. Son dönemde yapılan çalışmalara göre bu kanalların açılması gerçekten de sinyal iletimine hizmet edebilir. Var olan bilgilere göre mitokondriyal ATP duyarlı K+ kanallarının açılması reaktif oksijen türlerinin oluşumunu aktif kinaz aracılığıyla düşürmektedir 12. Biz de bu çalışmamızda resveratrol’ün miyokart iskemisi-reperfüzyonda oluşturduğu koruyucu etkisinde iyon kanallarının etkisini araştırdık. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Miyokart Fizyolojisi Kalp iki ayrı pompadan oluşur. Akciğerlere kanı, oksijenkarbondioksit, değiş tokuşu için pompalayan kalbin sağ tarafı ve vücut dokularına kan pompalayan ise kalbin sol tarafıdır. Bu pompaların her biri, bir atriyum ve bir ventrikülden oluşan iki bölmeli bir atım pompasıdır. Atriyumlar, ventriküller için zayıf bir hazırlayıcı pompa işlevi görür. Kalp başlıca üç tip kastan meydana gelir. Bunlar atrium kası, ventrikül kası, özelleşmiş uyarıcı ve iletici kas lifleridir. Kasılma süresinin daha uzun olması dışında, atrium ve ventrikül kasları iskelet kasına oldukça benzer şekilde kasılırlar. Çok az miktarda kasılabilir fibril içeren özelleşmiş uyarı ve ileti lifleri ise, yalnızca belli belirsiz kasılırlar. Bunun yerine ritmisite ve değişik hızlarda ileti göstererek, kalbe bir uyarı sistemi sağlarlar13. Kalp kasında kas hücreleri arasında ara diskler (interkale disk) bulunur. Kalp kası hücre zarlarını birbirinden ayıran interkale disklerdir. Bu disklerin elektrik direnci çok düşüktür ve aksiyon potansiyelinin kalp kası lifleri arasında kolayca yayılabilmesini sağlar13. Kalp kası, aksiyon potansiyelinin bir uçtan bir uca kolayca yayıldığı tek bir bileşik hücre gibidir (sinsisyum). Kalp, gerçekte iki sinsisyumdan meydana gelir. Bunlar iki atrium duvarını oluşturan atrium 4 sinsisyumu ve iki ventrikül duvarını oluşturan ventrikül sinsisyumudur. Normalde aksiyon potansiyelleri, atrium sinsiyumundan ventrikül sinsisyumuna yalnızca özelleşmiş bir ileti sistemi aracılığı ile iletilebilirler. Kalbin kas kitlesinin bu şekilde iki işlevsel sinsisyuma bölünmesi, atriumların ventriküllerden kısa bir süre önce kasılmasına olanak verir13. Miyokardın kasılmasında rol alan anahtar proteinler miyozin, aktin, tropomiyozin ve troponin kompleksidir (Şekil 1). Kas kasılması kayan iplikçikler mekanizmasıyla oluşur. Miyozin çapraz bağlarının aktin flamenti ile etkileşmesi ile oluşan mekanik güç, aktin iplikçiğinin miyozin iplikçiklerinin arasında kaymasına neden olur. Dinlenme koşullarında bu güçler baskılanmıştır ama bir aksiyon potansiyeli kas hücresinin zarı boyunca yayıldığında sarkoplazmik retikulumdan aktin ve miyozin arasındaki güçleri aktive eden çok miktarda kalsiyum iyonu serbestler ve kasılma başlar. Sarkoplazmik retikulum fonksiyonu şiddetli iskemi, reperfüzyon ve kalp yetmezliğinde bozulmaktadır. Bu değişiklikler kasılma fonksiyonunun bozulmasına katkıda bulunabilir15. Miyozin iplikçiği çok sayıda miyozin molekülünden oluşmuştur17. Miyozin heliks yapısında büyük bir protein molekülü olup 4 hafif ve 2 ağır zincir olmak üzere 6 polipeptid zincirden oluşmuştur. İki ağır zincir bir çift sarmal oluşturmak üzere birbiri etrafına spiral olarak sarılır. Bu zincirlerden her birinin ucu kıvrılarak miyozin başı denilen globüler polipeptid yapıyı meydana getirir. Dolayısıyla çift sarmal miyozin molekülünün bir ucunda yan yana uzanan iki serbest baş vardır. Sarmalın devam eden kısmına kuyruk denir13. 5 Miyozinin kuyruğu demetler halinde iplikçiğin gövdesini oluşturur, miyozin başlar ve her bir miyozin molekülünün dışarı doğru sarkan bölümleri birlikte gövdeden dışarı doğru uzanan bir kol gibidir. Bu yapıya çapraz köprüler denir. Miyozin başın önemli bir özelliği ATP’yi ADP’ye dönüştürecek kasılma süreci için gerekli enerjiyi sağlayan bir ATP az enzim olmasıdır14. Aktin iplikçiği de üç protein komponentinden oluşmuş bir komplekstir: aktin, tropomiyozin ve troponin. Aktinin bir ucu Z disklerine (bir miyofibrili diğerine bağlayan yapı) sıkı biçimde bağlıyken diğer ucu komşu sarkomerde (iki Z çizgisi arasındaki yapı) yer alan miyozin iplikçikleri arasındaki boşluklara doğru uzanır14. Aktin iplikçiğini oluşturan moleküllerden biri olan tropomiyozin moleküllerinin istirahat durumunda aktin ipliklerinin aktif bölgesini kapattıkları, dolayısıyla aktin ile miyozin arasındaki kasılmaya neden olacak çekimi engellediği düşünülür. Buna troponin-tropomiyozin birleşimiyle baskılanma da denebilir. Troponin ise tropomiyozin molekülüne tutulmuş, her biri kas kasılmasında özgün bir göreve sahip zayıf bağlı üç protein altbirimden oluşmuş bir komplekstir. Troponin I aktin için, troponin T tropomiyozin için, troponin C ise kalsiyum iyonları için kuvvetli affiniteye sahiptir. Troponin C kalsiyumun bağlanması için 4 bağlanma yeri bulunan bir proteindir. Aktin iplikçiği troponin-tropomiyozin kompleksi tarafından baskılanır. Kasılma esnasında aktin iplikçiğinin üzerinde bulunan aktif noktaların baskılanması kalsiyum iyonunun varlığında baskılanır. Kalsiyum troponin ile bağlanarak troponin kompleksinin tropomiyozinden ayrılmasına sebep olur ve aktin üzerindeki aktif noktalar açılır ve kasılma gerçekleşir14. 6 Şekil 1: (A) Aktin moleküler yapısı (B) Miyozin moleküler yapısı 13 . 7 Aksiyon potansiyelinin kasılma oluşturabilmesi için elektriksel akımların kalp kası lifinin iç kısımlarına kadar inmesi gerekir. Bir aksiyon potansiyeli kalp kasının zarı üzerinde ilerlerken aynı zamanda transfers (T) tübüllerin zarları boyunca kalp kası lifinin iç kısımlarına da yayılır. T tübüllerindeki aksiyon potansiyelleri longitüdinel sarkoplazmik tübüllerin zarlarını etkileyerek, kalsiyum iyonlarının sarkoplazmik retikulumdan kasın sarkoplazmasına serbestlenmesini sağlarlar. Bu kalsiyum iyonları serbestlenmesini izleyen birkaç saniye içerisinde miyofibrillerin içine doğru difüze olur; aktin ve miyozinin birbirleri üzerinde kaymalarını sağlayan kimyasal tepkimeleri katalizleyerek kas kasılmasına neden olurlar. Ayrıca sarkoplazmik retikulumun sisternalarından sarkoplazmaya serbestlenen kalsiyum iyonlarına ek olarak, aksiyon potansiyeli sırasında T tübüllerinden de sarkoplazmaya büyük miktarda ek kalsiyum difüzyonu gerçekleşir. T tübüllerinden gelen bu ek kalsiyum olmasaydı kalp kasının kasılma kuvveti önemli ölçüde azalırdı. Çünkü kalp kasının sarkoplazmik retikulumu, iskelet kasınınkine kıyasla daha az gelişmiştir ve tam bir kasılma sağlayacak kadar kalsiyum içermez13. Kalp kasının kasılma kuvveti, büyük ölçüde, hücre dışı sıvılardaki kalsiyum iyonlarının yoğunluğuna bağlıdır. Çünkü T tübüllerinin uçları hücre zarından geçerek kalp kasını çevreleyen hücre dışı alana açıldığı için, kalp kasının interstisyumundaki aynı hücre dışı sıvının kalsiyum iyonu yoğunluğuna bağlıdır13. Kalbin aksiyon potansiyelindeki platonun sonunda, kalsiyum iyonlarının kas lifinin içine akışı aniden son bulur ve sarkoplazmadaki kalsiyum iyonları hızla hem sarkoplazmik retikuluma hem de T tübüllerine hücre dışı sıvıya geri pompalanır. Yeni bir aksiyon potansiyeli oluşuncaya kadar kasılma durur13. 8 Kalp kası, aksiyon potansiyeli başladıktan birkaç milisaniye sonra kasılmaya başlar, aksiyon potansiyelinin son bulmasından birkaç milisaniye sonraya kadar kasılmaya devam eder. Kalp kasında kasılmanın süresini plato da dahil olmak üzere aksiyon potansiyelinin süresi belirler. Bu süre atriyum kasında yaklaşık 0.2 saniye, ventrikül kasında ise yaklaşık 0.3 saniyedir13. Yapılan çalışmalar koşullama ile ilgili olarak beş temel mekanizmayı ortaya çıkartmıştır. Bunlar; 1-Endojen adenozin varlığı ve adenozin reseptör alt tiplerinin aktivasyonu, 2- NO/cGMP yolağının rolü, 3-ATP’ye bağımlı mitokondriyal potasyum kanallarının katılımı, 4-Reperfüzyon Salvage Kinaz yolağının aktivasyonu15. 5- Reperfüzyonda mPTP’nin açılmasının inhibisyonu olarak belirtilebilir16,17. 2.2. Miyokart İskemisi-Reperfüzyon Koroner arter hastalıkları dünyada ölüm nedenlerinin başında yer almaktadır. Yılda 7,2 milyon yetişkin (3,8 milyon erkek ve 3,4 milyon kadın olmak üzere) koroner arter hastalıkları yüzünden hayatını 18 kaybetmektedir . Koroner arter hastalıklarının patofizyolojik olarak ana göstergelerinden biri ise akut miyokart iskemisi ve reperfüzyon hasarıdır19. 9 İskemi; vücudun bir bölgesine gelen kan miktarında azalma durumu ve bunun sonucunda sözü edilen bölgeye besin ve oksijen yetersizliği, zararlı metabolizma maddelerinin uzaklaştırılmasındaki azalma ve bu olayın sonucunda zedelenme oluşumu durumudur 20. Reperfüzyon ise iskemi sonrası kan akımının sağlanmasıdır. İskemik dokunun canlılığını koruya bilmesi için reperfüzyon önemli olmakla birlikte diğer yandan bazı morfolojik değişikliklere, enzim yıkılımına ve hatta hücre ölümüne de yol açabilmektedir21. Miyokart reperfüzyon hasarı, iskemiyi takip eden reperfüzyon döneminde henüz sağlam olan miyositlerin reperfüzyonla tetiklenen olaylar sonucu hasar görmesi olarak ifade edilmektedir22. Bu hastalığın yıkıcı etkilerine asıl olarak hücre ölüm mekanizmaları neden olmaktadır. Bu etkiler doğrudan veya dolaylı olabilir. Kasılma fonksiyonunun bozulması ventriküller remodelling, aritmilere, hasara ve ölüme neden olduğu gösterilmiştir. Bu hasar, reperfüze iskemik köpek miyokartlarının özelliklerinin belirlenmesi ile ilk defa Jenning ve Ark. tarafından 1960 yılında gösterilmiştir4. Akut iskemi reperfüzyon hasarını azaltan kalbin koşullama kabiliyeti 1986 yılında ilk defa Murry ve arkadaşları tarafından keşfedilmiştir5. 10 İskemi ve reperfüzyon sonucu oluşan kardiyak stunning’den nekroza kadar giden hasarı incelemek için değişik deneysel yöntemler kullanılmaktadır. Deneysel olarak çalışılan konular; miyokardiyal stunning (Miyokart sersemlemesi), hibernation (kronik kontraktil disfonksiyonu), önkoşullama ve reperfüzyon aritmileridir6,23. Reperfüzyon, miyokardı iskemi hasarından kurtarmak için zamanında yapılırsa hasar geri dönüşümlü olabilir, ancak reperfüzyon olmazsa infarktüs gelebilir; meydana hücreler yaşamsal iyon homeostazının kontrolünü ele geçirebilirler (aslında kardiyomiyosit iyon dengesizliği oranındaki değişiklikler tam olarak doğrulanmamış fakat kötüleştiği doğrulanmıştır). Sonuç olarak acil nekrotik hücre ölümü başlatılır. Ölümün bu tipi oksijen ve kan akışının yeniden sağlandığı ilk dakikalar boyunca meydana gelmesi ile karakterize edilir, buna hücre membran yırtılması eşlik eder ve hücre içeriği (asıl olarak sitozolik enzimler) ekstraselüler matrikse salınır. Her bir kardiyomiyosit çok kısalır ve sarkomerik yapıların çalışması bozulur. Bu hücrelerin yapısal görüntüleri örneğin; sarkolemmal yırtılmalar, mitokondriyal şişlik ve mitokondriyal matrikse Ca+2’un aşırı birikimine ek olarak kısalan ve düzensiz sarkomerik miyofibrillerin görüntüleri elektron mikroskobu kullanılarak elde edilir25. Oksidatif yüklenmesi, akut stres, nitrik inflamatuvar oksit, cevap, pH paradoksu, terapötik kalsiyum hipotermi, renin- anjiyotensin-aldosteron sistemi, mitokondrial permeabilite transizyon poru (mPTP) açılması miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarına aracılık eden yolaklardır18 (Şekil 2). 11 Oksijen Paradoksu Reperfüzyon sağlandıktan sonra tekrar oksijenlenen dokuda reaktif oksijen türleri nedeniyle endotel hasarı meydana gelmektedir ve bu iskemi-reperfüzyon hasarının en önemli nedeni olarak kabul edilmektedir25. Oksijen paradoksu Hearse ve arkadaşları tarafından 1973’te yayınlandı26. Miyokart reperfüzyonu sırasındaki oksidatif stres aynı zamanda reperfüzyonun kalp koruma etkilerini ortadan kaldırarak NO ve hücre içi sinyal molekülünün vücutta kullanılabilirliğini azaltır. Bu etkiler nötrofil birikiminin inhibisyonu, süperoksit radikallerinin inaktivasyonu ve koroner kan akımı gelişimini içerir27. Kalsiyum paradoksu Reperfüzyon sırasında miyokart dokularında üretilen reaktif oksijen türleri; proteinler, membran lipidleri ve nükleik asitlerin oksidasyonuna yol açar, membran iyon kanallarının K+, Ca++ ve Na+ ‘a geçirgenliğini değiştirir. Oksidatif strese maruz kalan dokuda Na/K ATPaz, Ca ATPaz gibi iyon pompalarının aktivitesi azalmıştır9. İskemi-reperfüzyon sırasında hücre içine Ca girişi artıp çıkışı azaldığı için hücre için Ca+2 homeostazı bozulur. Bu etki L-tipi Ca+2 kanalları aracılığıyla sarkolemal Ca+2 artmasıyla ya da sekonder olarak sarkoplazmik retikulum Ca+2 siklusundaki değişikliklerle ilişkilidir. Fizyolojik koşullarda hücre içinde biriken fazla Ca+2 dışarı atılarak ya da depolanarak tolere edilir. İskemi sırasında hücrede enerji tükendiğinden sitoplazma ve mitokondride aşırı 12 miktarda Ca+2 birikmekte ve Ca+2 un toksik etki göstermesine neden olmaktadır10. Sonuçta intrasellüler ve mitokondriyal kalsiyum aşırı yüklenir. Bu olay Ca+2 paradoksu olarak adlandırılır. Ca+2‘un bu şekilde salıverilmesi mPTP açılmasına ve kalp hücrelerinin aşırı kasılmasına neden olarak kardiyomiyosit ölümünü meydana getirir18. Serbest Radikaller Dış kabuklarında çiftleşmemiş elektronu bulunan molekül ve atomlar serbest radikaller olarak adlandırılırlar ve çok reaktiflerdir. Oksijen orijinli serbest radikaller reaktif oksijen türleri (ROT) olarak adlandırılırlar. Bunlar süper oksit anyon (O2−) ve hidroksil radikali (OH∙)’dir. Bir alt sınıf serbest radikal olarak değerlendiren ve oksijen ile nitrojenin reaksiyonuyla elde edilen reaktif nitrojen türleri (RNT) nitrikoksit (NO∙) ve peroksinitrit (ONOO−)’dir28. RNT biyolojik aktiviteye sahip olabilirler. NO; kalp koruma, düz kas gevşemesi, kan basıncı düzenlenmesi, nörotransmisyon, koruma mekanizmaları, immün düzenleme ve platelet fonksiyonunu içeren farklı fizyolojik işlemlerde önemli biyolojik sinyal molekülü gibi rol oynar. Pek çok enzim ve biyokimyasal işlemler ROT ve RNT üretebilirler. KVS’de oksidatif stresin önemli kaynağı; - Ksantin oksidoredüktaz enzimi - NAD(P)H oksidaz, - NOSs (Nitrik oksit sentetaz), - Mitokondriyal sitokromlardır. Miyokartda ROT’un ana kaynağı mitokondriye yerleşmiştir28. 13 Global iskemi modellerinde doku oksijen konsantrasyonları aniden sıfıra düşmez, bu nedenle ilk ROT üretimi önemlidir. İskemi boyunca üretilen ROT miktarı genellikle düşüktür ve hasardaki patolojik önemleri kesin değildir29. Reperfüzyonun ilk birkaç dakikasında ROT fazla miktarda üretilir. Normal koruma mekanizmaları yeterli olmadığında sürekli yüksek konsantrasyondaki serbest radikallerin pek çok hastalık patojenine katkıda bulunduğu kabul edilir28. Reperfüzyonun sebep olduğu hücre ölüm mekanizmaları tam olarak anlaşılmamakla beraber oksidatif stresle ilişkili serbest radikal üretiminin önemli rol oynayabileceği düşünülmektedir. Koroner damar tıkanıklığında, süperoksit anyon (O2−) üretimi farklı enzimatik komplekslerin aktivasyonu sonucunda artar. O2− ve diğer ROT’leri iskemi tarafından hasara uğratılmış olan miyokard liflerini oksitler. Reperfüzyonda O2−, NO ile reaksiyona girerek peroksinitrit oluşturur (ONOO−). Yüksek ONOO− konsantrasyonu fazlaca sitotoksik olabileceği gösterilmiştir30. O2− bağımlı hasar eğer süperoksit dismutaz tarafından H2O2’ye (hidrojen peroksit) çevrilirse azalır. pH Paradoksu Miyokart reperfüzyonun esnasında fizyolojik pH’nın hızla onarımı laktik asidin uzaklaşmasını, sodyum-hidrojen değiş tokuşunu ve sodyum-bikarbonat taşıyıcısının aktivasyonunu sağlarken ölümcül 14 reperfüzyon hasarına neden olur. Bu olay pH paradoksu olarak adlandırılır18. İnflamasyon Akut miyokart infarktüsünden sonra inflamatuar mediyatörlerin salınımı miyokart reperfüzyonun ilk 6 saatinde nötrofilleri infarkt alanına çeker ve sonraki 24 saatte nötrofiller miyokardiyal dokuya göç ederler. Bu süreç hücre adezyon molekülü ile gerçekleştirilir. Bu nötrofiller vasküler tıkanmaya, yıkıcı enzim ve reaktif oksijen türlerinin salınımına neden olur31. Terapötik Hipotermi mPTP iç mitokondriyal membranda bulunan seçici olmayan bir kanaldır. Kanalın açılması ATP tükenmesi ve hücre ölümüyle sonuçlanan oksidatif fosforilasyon ve mitokondriyal membran potansiyelini bozar. Miyokardiyal iskemi sırasında mPTP kalıntıları, ATP tükenmesi, fizyolojik pH’nın düzenlenmesi, oksidatif stres, mitokondriyal kalsiyumun aşırı yüklenmesine tepki olarak miyokardiyal reperfüzyondan sonra birkaç dakika içinde açılmak üzere kapanır32. Bu yüzden mPTP kalp koruma için önemli yeni bir hedef ve ölümcül reperfüzyon hasarında kritik belirleyicidir. Ölümcül reperfüzyon hasarını belirten akut miyokart infarktüsün hayvan modellerindeki çalışmaları miyokardiyal infarktı %50’ye varır. Ölümcül reperfüzyon hasarını düzeltmek için birkaç strateji 15 gösterilmektedir. Fakat bu faydalı sonuçların klinik uygulamaya çevrimi hayal kırıklığı yaşatmaktadır33. Yine de kısa süreli miyokart iskemi periyodları ile kesintiye uğratılan primer perkütan müdahale geçirmiş akut miyokard infarktüsü olan hastalarda, miyokart reperfüzyonunda iskemik ardkoşullamanın faydası kalp koruma hedefi olarak reperfüzyon fazındaki merakı yeniden oluşturmuştur34. 16 Şekil 2: İskemik önkoşullama oluşum mekanizmaları. ADO, Bradikinin gibi moleküllerin tetiklemesiyle başlayan iskemik önkoşullamada, PKC aktivasyonu ve NO oluşumu kritik öneme sahiptir. eNOS: Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz, PKC: + Protein Kinaz C, K ATP Kanalı: Adenozin Trifosfata Duyarlı Potasyum Kanalı, MAP Kinaz: Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz, iNOS: İndüklenebilir Nitrik Oksit 70 Sentaz . 17 2.3. Miyokart İskemisi-Reperfüzyon Hasarına Karşı Koruyucu Yöntemler: İskemik ve Farmakolojik Koşullama 2.3.1. İskemik Ön ve Ard Koşullama İskemik önkoşullama, tek ya da tekrarlayan kısa süreli iskemik dönemleri daha sonra gerçekleşebilecek ve hasara neden olacak uzun süreli iskemik dönemlere karşı koruyucu bir oluşumdur35 (Şekil 3). İskemik önkoşullama ilk olarak 1986 yılında Murry ve arkadaşları tarafından tanımlanmış4. Murry ve arkadaşlarının kısa süreli iskeminin, daha uzun süreli iskeminin olumsuz sonuçlarına karşı koruyucu olabileceğini ve infarkt alanın büyüklüğünü belirgin bir şekilde azaltabileceğini göstermişlerdir36. Murry ve arkadaşları tarafından köpekler üzerinde yapılmış olan bu çalışmada 40 dakikalık iskemi süresi yerine 4’er kez 5’er dakika iskemi ve reperfüzyon uygulaması yapılmıştır. Bu uygulama miyokartta infarkt alan boyutunu %75 azaltmıştır4. İskemik önkoşullaşmayı indükleyebilmek için gereken iskemik tekrarlar türe ve organ sistemine göre değişiklik göstermektedir 37. Sıçan, tavşan, köpek ve insan kalbi için literatürde iskemik önkoşullama oluşturan farklı sayıda iskemik tekrar protokolleri bulunmaktadır4,38,39. 18 Deneysel olarak rat, tavşan ve diğer türlerde de miyokart infarktüsün önkoşullama ile azaltıldığı gösterilmiştir. Klinik çalışmalardan elde edilen verilerden, önkoşullamanın muhtemelen insanlarda da oluştuğu düşünülmektedir. Önkoşullamanın koruyucu etkisi geçicidir, reperfüzyondan 1-2 saat sonra yok olur. Eğer iskemi çok uzarsa (90 dk’nın üzerindeki epizodlarda) önkoşullamanın koruyucu etkisi kaybolur. Bazı çalışmalarda önkoşullamanın oluşturduğu korumanın 24-72 saate kadar uzadığı gösterilmiştir. Murry ve arkadaşları, önkoşullanmış dokuda kreatin fosfat, intrasellüler glikozun yükseldiğini, glikojene edenin nükleotid miktarının azaldığını göstermişlerdir5. Önkoşullama, başlangıçta kısa süreli iskemik periyotları takip eden uzun süreli iskemide oluşan miyokart nekrozu azaltma yöntemi olarak tanımlanırken, bu tanım aritmilere karşı korunma ve postiskemik sol ventrikül disfonksiyonunu (stunning) da içerecek şekilde genişletildi. İskemik önkoşullamanın stunning’i ve aritmileri azaltmadaki etkililiği, nekrozu azaltmadaki kadar belirgin değildir. Önkoşullamanın aritmi ve stunning’deki koruma mekanizması ile ölümcül hücre hasarındaki korumasının aynı mekanizmalar üzerinden olup olmadığı bilinmemektedir. İskemik önkoşullamanın erken döneminde oluşan koruyucu etkinin süresi de türe özgü olarak değişiklik göstermektedir bu koruyucu etki tavşanda 30 dakikalık reperfüzyondan sonra sonlanırken 40, bu sürenin sıçanlarda bir saat41, köpeklerde iki saat olduğu bildirilmiştir42. Önkoşullama aynı zamanda iskemi reperfüzyon aritmilerinin kasılma fonksiyon bozukluklarını da azaltır. İlk olarak önkoşullamanın koruması önkoşullama manevralarından sonra ortaya çıkar ve birkaç saat 19 sürer. Bu koruma kaybolur ve sonra tekrar meydana çıkan ve 24-72 saat süren korumanın ikinci penceresi ya da geç koşullama olarak adlandırılan bölüm ortaya çıkar28. Önkoşullamanın koruyucu etkisinde iskemi ile tetiklenme sonucu intrasellüler bazı mediyatörlerin rol oynadığı söylenmektedir. İskemik önkoşullama ile koruma adenozin, bradikinin, opioidler ve platelet aktive eden faktörler gibi otokoidler tarafından tetiklenir ve kısa süren iskemi/reperfüzyon siklusunu cevap olarak üretilir43. Önkoşullamada bilinen major sinyal yolaklar ve aracıları: Fosfotidilinozitol-3-kinaz (PI3-K)Akt, Nitrik oksit (NO)-PKG, mitokondriyal KATP kanalları, adenozin, ROT ve mPTP’dir44. Bu maddeler miyosit yüzeyinde kendi G-protein çifti reseptörlerine bağlanırlar ve nüklear faktör κB, hipoksi indükleyen faktör (HIF) gibi transkripsiyon faktörleri, ekstraselüler sinyal düzenleyici kinaz (Erk ½) ve fosfatidilinozitol-3-kinaz (PI3-K)-Akt’ı içeren pek çok sinyal transdüktör kaskatlarını aktive eder. Bu mediyatörlerin aktive olması mKATP kanallarının açılmasına neden olur. Bunlardan başka iskemik önkoşullamanın ‘’hafıza etkisi’’ nakli için sorumlu olan protein kinaz C gibi sinyal kinazlar aktive olur45. Özetle, önkoşullama korumasındaki ana fikir, iskemik faz boyunca otakoidler salınır, reseptörlerini aktive eder ve NO aracılı sinyal yolu ile mKATP kanallarının açılmasına neden olur. Reperfüzyon fazındayken tekrar oksijenle karşılaşması mitokondri tarafından tekrar ROT’nin oluşmasına yol açar. Önkoşullama ön tedavi gerektiren bir uygulama olduğundan klinik uygulamaları sınırlıdır28. 20 Miyokardda meydana gelen uzun süreli iskemiye karşı geliştirilen bir diğer koruma yöntemide iskemik ardkoşullamadır. İskemik ard koşullama reperfüzyonun başında kısa ve tekrarlayan iskemireperfüzyon periyotlarının uygulanmasıdır ve iskemi-reperfüzyon algoritimlerinin toplam süresi türlere bağlı olarak 1-3 dakika arasında sürmektedir8. Ardkoşullama iskemik periyodun sonunda kalp koruyucu farmakolojik ajanlarla ya da miyokardiyal iskemi ve reperfüzyonun birbirini izleyen kısa periyotlarının uygulanmasıyla uyarılan infarkt alan boyutunda azalma olarak tanımlanır3. Zhao ve arkadaşları tarafından 2003 yılında yapılan 45 dakikalık miyokard iskemisinden sonra reperfüzyonun erken fazında iki koroner arterin 3 kez 30’ar saniyelik miyokardiyal iskemi-reperfüzyon döngüsü köpeklerdeki miyokard hasarını %47’den %11’e düşürmüştür. Bu kalp koruma mekanizması iskemik ardkoşullama olarak adlandırılmıştır 46. İskemi ardkoşullama ile indüklenen kardiyak koruma mekanizması tümüyle anlaşılamamıştır. Fakat azalmış oksidadif stresin ve intraselüler kalsiyum aşırı yüklenmesinin azalması, endotelyal fonksiyonun iyileşmesi, apoptotik kardiyomiyosit ölümünün azalması, nötrofil akümülasyonunun düşmesi47, pH’nın düzelmesi48 ile lethal reperfüzyon hasarının önemli mediyatörlerinin hedeflendiği gösterilmiştir. Aynı zamanda, iskemik ardkoşullama, RISK yolağını aktive ve mPTP’nin açılmasını ise inhibe eder. Her iki durumda ardkoşullamanın lethal reperfüzyon hasarına karşı koruyucu olduğunu gösteren önemli 21 parametrelerdir. İskemik ardkoşullama, iskemik önkoşullamaya benzer mekanizmalar ile reperfüzyon hasarını inhibe etmektedir18. İskemik ardkoşullamanın koruyucu etkilerinin araştırılmasında çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Kolay uygulanabilir olması açısından çeşitli maddelerin ardkoşullamayı taklit ettiğinin saptanması, farmakolojik ön ve ardkoşullama kavramını gündeme getirmiştir8. Reperfüzyon esnasında miyokart dokularında reaktif oksijen türleri; proteinler, membran lipidleri ve nükleik asitlerin oksidasyonuna neden olur, membran iyon kanallarının K +, Ca+2 ve Na+ ‘ya geçirgenliğini değiştirir. Oksidatif strese maruz kalan dokuda Na+/K+ATPaz, Ca+2ATPaz gibi iyon pompalarının aktivitesi azalmıştır49. İskemi-reperfüzyonda hücre içine Ca+2 girişi artıp, çıkışı azaldığı için hücre içi Ca+2 homeostazı bozulur. Fizyolojik koşullarda hücre içindeki fazla Ca+2 dışarı atılarak ya da hücre içinde depolanarak tolere edilir. İskemi sırasında da hücrede enerji tükenmekte Ca+2 hücrede birikmekte, dışarı sürekli K+ akışı meydana gelmekte ve toksik etki göstermektedir. Enerji eksikliği nedeni ile pompalar ve depolama mekanizmaları iflas eder50. İskemik önkoşullama ATP bağımlı potasyum ve sodyum kanallarının eksitabilitesinde değişimlere neden olarak, hücre içine aşırı Ca+2 girişini azaltarak anormal oluşumları önler51. Wu ve ark. önkoşullamada kalsiyum bağımlı K+ kanallarının da etkin olduğunu, hiperpolarizasyona neden olarak koruma sağladıklarını göstermiştir52. 22 Bugüne kadar denenen tüm hayvan modellerinin iskemik ardkoşullanabileceği gösterilmiştir. Ard koşullamayı klinik açıdan kısıtlayan faktör ise invaziv girişim gerektiriyor olmasıdır. İskemik ardkoşullamanın aktive ettiği yolakları aktive edebilecek farmakolojik ajanların bulunması ile bu kısıtlılık aşılabilir. Miyokart reperfüzyonun esnasında, öldürücü reperfüzyon hasarını önlemek için kalpten uzak bir dokuda veya bir organda kısa süreli iskemi ve reperfüzyon periyotlarının oluşturulması fenomenine ‘uzak iskemik koşullama’ denir53. Özetle, ard koşullama ile ilgili olarak beş major mekanik duruma dikkat çekilmiştir. 1-Endojen adenozin varlığı ve adenozin reseptör alt tiplerinin aktivasyonu, 2-NO/cGMP yolağının rolü, 3-ATP’ye bağımlı mitokandriyal potasyum kanallarının katılımı, 4-Reperfüzyon Salvage Kinaz yolağının aktivasyonu, 5- reperfüzyonda mPTP’nin açılmasının inhibisyonu olarak belirtilebilir16. 23 Şekil 3: İskemi reperfüzyon-hasarı içeriği, önkoşullama ve ardkoşullama ile kalp 1 koruma . 24 2.3.2. Farmakolojik Koşullama İskemik ön ve ard koşullamaya benzer etki gösteren ajanlarla yapılan çalışmalar ümit verici olmaktadır. Kilinikte kullanımları sınırlı olan ama önkoşullamada yararlı etkisi olan ajanların arasında, adenozin agonistleri (AMP579, NECA gibi), opioidler (morfin gibi), protein kinaz C analogları, KATP kanal açıcılar (pinasidil, kromakalim, diazoksit, nikorandil, levosimendan gibi) ve NO donörleri sayılabilir54. Turan N ve arkadaşlarının farmakolojik önkoşullama ile tavşan aorta-spinal kord modelinde resveratrol ile yaptıkları bir çalışmada, resveretrolun oksidatif stresi azaltıp NO salınımı artırdığını ve spinal kordu ön koşullama ile iskemi reperfüzyon hasarından koruduğunu göstermişlerdir55. Turan N ve arkadaşlarının başka bir çalışmada, suksinat dehidrojenaz irreversible enzim inhibitörü olan 3-nitropropiyonik asit kullanarak, sıçan kalbinde iskemiye karşı koruma sağladığını ve önkoşullamaya benzer infarkt alanın azalttığını göstermişlerdir56. Reperfüzyondan önce verilen bimakalim gibi mitoKATP açıcıları ile infarkt alanı sınırlandırabilmişlerdir57. mitoKATP kanal açıcılarının (örn: pinasidil, kromakalim, diazoksit, nikorandil) miyokardiyal iskemiden önce uygulandıklarında infarkt alanı sınırladıkları 25 bulunmuştur58. İskemi reperfüzyon boyunca izofluran gibi volatil anesteziklerin uygulanması kalp koruyucu olduğu bulunmuştur ve bu etkisi mitoKATP kanallarının açılmasına bağlanmıştır59. Anestezik ardkoşullayıcıların bu koruyucu etkisine KATP kuşatması ile yön verildiği bulunmuştur ve PI3K/AKT sinyalinin aktivasyonu, GSK-3β aktivasyonunun inhibisyonu ve mPTP açılmasının inhibisyonu ile ilişkilendirilmiştir16. Ardkoşullamada çeşitli ajanlar verilerek yapılan reperfüzyon farmakoterapisi hakkında birçok yayın bulunmaktadır. Bu amaçla kullanılan ajanlar arasında önkoşullamada da kullanılan adenozin analogları, nitrik oksit dönörleri, opioidler, farklı olarak insülin, statinlar sayılabilir. İnhalasyon anesteziklerinden sevofluranın ardkoşullayıcı etkisi olduğu görülmüştür60. Bu ajanlarla temel amaç reperfüzyon farmakoterapisi ile ardkoşullamayı taklit etmektir. Bunlardan hiç birinin klinik kullanımı yoktur8. 2.4. Resveratrol Trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihydroxystilbene) başta üzüm olmak üzere pekçok farklı bitkide varolan doğal bir fitoaleksindir (3, 4, 5). Fitoaleksinler, bitkilerde UV ışını, hasar ve infeksiyonlara karşı gelişen ikincil yapılardır61,62,63. Resveratrol, bitkilerde özellikle kırmızı üzümde, yer fıstığında ve ananasta yüksek konsantrasyonda bulunmaktadır. Resveratrol, siya üzümün soğuk hava koşulları, mantar enfeksiyonları gibi etkenlere bağlı olarak kendini korumak için ürettiği bir maddedir64. 26 Resveratrolün ilk tesbiti, Fransız mutfağının son derece yüksek miktarda doymuş yağ, kolesterol içerikli beslenmesi ve yoğun sigara tüketimine rağmen özellikle Bordeaux bölgesinde yaşayan kesiminde, kalp hastalıklarının yok denecek kadar az görülmesinin bilim adamları tarafından “Fransız paradoksu” olarak değerlendirilmesiyle başlamıştır. Bordeaux bölgesinin rutubetli havasında yetişen “cabernet sauvignon” cinsi üzümlerin kabuğunda oluşan küf mantarına karşı kabukta oluşan resveratrol adlı antioksidan maddenin, yüksek kalorili ve yüksek yağ oranlı yiyecekler tüketildiği halde, kalp hastalıklarına karşı koruyucu rolü olduğu yönünde sonuçlar elde edilmiştir. Harvard Tıp Fakültesinden, David A. Sinclair, bu buluşu “100 bin yıldan beri beklenen bir keşif” olarak nitelendirmiştir64,65,66. Resveratrolün doğal antioksidan rolü üç farklı antioksidan mekanizma ile açıklanmaktadır. Bunlardan biri; koenzim Q ile yarışmak ve ROS oluşum yerinde oksidatif zincir kompleksini azaltmaktadır. Diğeri, mitokondride oluşan superoksit radikalini yakalamak, sonuncusu ise fenton reaksiyonu ürünleri tarafından indüklenen lipid peroksidasyonunun inhibisyonudur67. Resveratrol kalbi korumak için anti apoptotik sinyali uyarır. Domuz koroner arterinde, özellikle MAPK aktivitesinin inhibisyonu ile ve resveratrolün kısa dönem tedavisi ve immünoblot analizleri ekstraselüler ERK ½, JNK-1, p38MAPK’nn fosforilasyonunda tutarı azalma meydana gelmiştir. Aynı çalışmada resveratrolün bazal ve endotelin-1 (ET-1) aracılı protein tirozin fosforilasyonunu azalttığı bulunmuştur68. Resveratrolün anti apoptotik fonksiyonu resveratrol ile ön tedavi edilen iskemik reperfüze kalpteki apoptotik kardiyomiyositlerde azalmanın gösterildiği pek çok diğer çalışmalarla daha fazla desteklenmiştir69. 27 Anti-enflamatuar etkisi; yapılan çalışmalar ile NO blokeri nitro-L-arjinin metil esterinin (L-NAME), resveratrolün yararlı etkilerini tamamen ortadan kaldırdığı gözlemlenmiştir. Bu sonuç resveratrolün antienflamatuar etkisinin NO’ ya bağlı mekanizmalarla gerçekleştiğini gösterir70. Budak B ve arkadaşlarının tavşan aortasına klemp konularak spinal kordda iskemi oluşturdukları çalışmada resveratrolün tek başına kullanıldığı (iskemi veya reperfüzyonda) gruplarda iskemi reperfüzyon hasarında etkili olduğu bulunmuş fakat en etkili sonuç resveratrolün iskemide ve L-NAME’in reperfüzyonda kombine kullanıldığı gruptan elde edilmiştir71. You-Ren Chen ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, uzun süre rezveratrolün uygulanması durumunda, miyokart infarktüsünün neden olduğu aritimiyi, kardiyak hipertrofisi ve yaşam süresinin iyileştirdiğini belirterek bu etkinin kardiyak miyositler üzerine kalsiyum kanallarını bloke ederek ve KATP kanal açıcı olarak ortaya çıktığını göstermişlerdir10,11. Resveratrolün endotel bağımlı gevşetici etkisinin dokuda süperoksit oluşumunun ana kaynağı olarak bilinen NAD(P)H oksidaz üzerindeki inhibitör etkisine bağlanmıştır72. Başka bir çalışmada Akar F. ve arkadaşları, resveratrolün (70uM) noradrenalin ile prekontrakte edilmiş safen ven ve internal meme arterinde yaklaşık %35 gevşemeye sebep olduğunu ve endotel tabakası uzaklaştırılmış ya da L-NOARG (NOS inhibitör) önceden verilen insan 28 meme arterinde ve safen vende resveratrolün oluşturduğu gevşeme etkisinin ortadan kalktığını göstermişlerdir73. Akar F. ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada nitrat toleransı oluşturulmuş insan meme arteri dokusunda 1-10 uM resveratrol bazal veya NADPH ile stimüle olan süperoksit oluşumunu neredeyse ortadan kaldırdığını göstermişlerdir74. Resveratrolün hücre içi Ca+2 ’nın aşırı yükselmesini azaltarak aritmiyi önlediği ve koroner vazodilatasyonu sağlayıp ya da K ATP kanal açıcı olarak farmakolojik önkoşullamada etki gösterdiği ileri sürülmüştür. Wu SN’nin yaptığı çalışmada resveratrolün büyük-Ca+2 ’la aktive edilen K+ kanallarının (BK) direkt aktivasyonu ile vasküler endotel hücrelerde hiperpolarizasyon yaptığını göstermiştir12. Calderone ve arkadaşlarının sıçan torasik aortunda resveratrol’ün vazodilatör etki mekanizmalarının incelendiği çalısmada, Ca+2-bağımlı K+ kanal aktivatörü olduğu bilinen NS1619 kullanılmış ve resveratrolün bu madde ile benzer etki gösterip Ca+2-bağımlı K+ kanallarını aktive ederek NO salınımına neden olduğu gösterilmiştir75. 2.5. 5-Hidroksi Dekanoat (5-HD) 5-HD mitokondriyal KATPaz blokajından dolayı langendorff perfüzyon çalışmalarında önkoşullama ve ardkoşullama sinyalizasyon mekanizmalarının araştırmalarında sık kullanılan bir maddedir76. 29 Tanno ve arkadaşlarının sarkolemmal KATP ve mitoKATP kanallarının rollerini açığa çıkarmak için, pinacidil ve diazoksid ile infarkt boyutunu sınırlandırılması üzerine, kanal subtiplerine selektif blokörlerin (Sarkolemmal için HMR1098 ve mitokondriyal için 5-HD) etkilerini tespit etti. Bu çalışmada “pinacidil” ve diazoksidin infarkt boyutunu sınırlayan etkilerininin; HMR1098 ile azaltıldığını ve 5-HD ile tamamen inhibe edildiği rapor edilmiştir77. 5-HD’nin yapısal olarak glibenklamide benzememesine rağmen kobay miyositlerinde mitoKATP kanal blokörü ve köpek kalbinde iskemi-reperfüzyonda mitoKATP kanal blokörü olduğu bildirilmiştir78. 5- HD’nin köpek, tavşan ve rat kalpleri üzerinde yapılan çalışmalarda miyolardiya iskemik önkoşullamada infarkt alan boyutunun düşürülmesini önlediği gösterilmiştir79. Jin C ve arkadaşları yaptıkları çalışmada mitokondriyal Ca+2K+ (mito k(Ca)) ve mitoATP duyarlı potasyum kanallarının farmakolojik önkoşullamada etkili olduğunu ve bu kanalların iskemik ard koşullamadaki etkileri araştırılmıştır. Sıçan kalpleri üzerinde 45 dakika iskemi süresi ardından 30 dakikalık bir reoksijenasyon uygulanmış. Ard koşullayıcı olarak paksilin ve 5-HD verilmiştir. Yapılan çalışma sonucu kontrol gurubu ile karşılaştırılmış ve infarkt alan boyutunun paksilin ve 5-HD uygulanmasıyla büyüdüğünü bildirmişlerdir. Aynı çalışmada kanal açıcı olarak NS1619 (mitoK(Ca) açıcı) ve diazoksit (mitoK(ATP) açıcı) uygulanmış ve infarkt alanın boyutunun azaldığı gösterilmiştir80. Notsu ve arkadaşları tarafından kobay kalpleri üzerinde yaptıkları çalışmada yeni bir antiaritmik ajan olan 5-HD’nin mitoKATP 30 kanalları üzerine inhibe etkisi araştırılmıştır. Yapılan bu çalışmada kobay ventrikül miyositlerinin elektriksel aktiviteleri incelenmiş ve hücre dışı K + konsantrasyonunun hücre içi K+ konsantrasyonuna kıyasla düştüğünü göstermişlerdir78. 31 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. Gereçler 3.1.1. Kullanılan Deney Hayvanları Gazi Üniversitesi Rektörlüğü Deney Hayvanları Etik Kurul Başkanlığından G.Ü. ET-10.047 kod numarası ile etik kurul izni alınmıştır. Deneylerde Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığından temin edilen Wistar cinsi 300-350g ağırlığında erkek ratlar kullanılmıştır. 3.1.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler Ketamin hidroklorür (Pfizer), ksilazin (Alfasan), Resveratrol (Sigma), 5-Hidroksidekanoat (Sigma), Trifeniltetrazolium klorür (TTC) (Sigma), Formol (Sigma), NaH2PO4 (Merck), Na2HPO4 (Merck), Heparin (Mustafa Nevzat), Absolü etanol (Merck). Krebs-Heinsleit Çözeltisi (pH7.4) NaCl 118,0 mM 32 KCl 4,5 mM KH2PO4 4,4 mM MgSO4 1,2 mM NaHCO3 25 mM CaCl2 1,4 mM Glukoz 11 mM 3.1.3. Kullanılan Aletler Hassas terazi (Shimadzu) Mikropipet (Eppendorff Research) Vortex (Firlabo) Langendorff cihazı (MAY LS06 seri no:3006-005) MP 35 veri kayıt sistemi (Biopac systems, INC) Sirkülatör (MAY WBC 3044V3) pH metre (JENCO) %95 O2, %5 CO2 içeren gaz karışım tüpü Cerrahi malzeme (Makas, pens, buldog) Süzme aparatı Kan Basıncı Transducer (Commat Ltd., Türkiye) 33 3.2. Yöntem 3.2.1. Sıçan İzole Kalp Preparatının Hazırlanması ve Ölçülen Hemodinamik Parametreler Deney hayvanları ketamin hidroklorür (50mg/kg-ip) ve ksilazin (10 mg/kg/ip) ile anesteziye edilmiş ve femoral ven yoluyla (500IU/kg) heparin verilmesini takiben, toraks hızlı bir şekilde açılarak kalp çıkartılmış ve buzlu Krebs-Heinseleit çözeltisinin içerisine alınmıştır. İzole kalp, hızlı bir şekilde sıcaklığı 37°C ve %95 O2, %5 CO2 gaz karışımı ile havalandırılan Krebs-Heinseleit çözeltisi ile sabit basınçlı Langendorff cihazına aorttan asılarak retrograd olarak perfüze edilmiştir. Krebs Henseleit rezervuarı izole organ banyosundan 100 cm yukarıda olacak şekilde yerleştirilerek, perfüzyon boyunca istenilen sabit basınç (100 cm H20=75 mmHg) sağlanmıştır. Sol ventrikül basıncı kalbin sol ventrikülüne yerleştirilen bir lateks balon yardımıyla ölçülmüştür. Deneyler sırasında transduser aracılığıyla perfüzyon basıncı, sol ventrikül sistolik ve diyastolik basıncı eş zamanlı olarak veri kayıt sistemi (MP 35 biopac systems, INC) yardımıyla kaydedilmiştir. Deney süresince sol ventrikül gelişen basıncı (SVGB), sol ventrikül diyastol sonu gelişen basıncı (SVDSB), kalp atım hızı ölçülmüştür. SVGB, ventriküler sistolik basınçdan ventriküler diyastolik basıncın çıkartılması ile hesaplamıştır. Deney sonunda +dP/dt (kontraksiyon hızının göstergesidir ve inotropizm indeksi olarak kullanılmaktadır)81 ve –dP/dt (gevşeme indeksi olarak kullanılmaktadır) hesaplanmıştır81. 34 3.2.2. Deney Protokolü Araştırmamızda hayvanlar dört gruba ayrılmıştır. Grup 1 (Kontrol): 25 dk’lık dengeleme periyodunu takiben 30 dakikalık global iskemi ve ardından 120 dakikalık reperfüzyon yapılmıştır. Grup 2 (Resveratrol): 15 dk’lık dengeleme periyodunu takiben 10 dakika 10µM konsantrasyonda resveratrol infüzyon ile verilmiştir. Ardından 30 dakika global iskemi 120 dakika reperfüzyon yapılmıştır. Grup 3 (5-HD+Resveratrol): 5 dakikalık Krebs perfüzyonu ile dengeleme periyodundan sonra 10 dakika Krebs Henseleit çözeltisi içerisinde kalp kendi çalışma hızına bağlı olarak 10-1-10-4 µM konsantrasyonda 5-HD ile perfüzyonunu sonrasında 10 dakika Krebs Henseleit çözeltisi içerisinde 10 µM resveratrol ile perfüzyon takiben 30 dk’lık global iskemi ve Krebs Henseleit çözeltisi ile kalp kendi çalışma hızına bağlı olarak reperfüze edilmiştir. İskemiden sonra reperfüzyon süresi toplam 120.dk’dır. Her bir deney boyunca perfüzyon basıncı, kalp atım hızı, SVGB ve SVDSB kaydedilmiştir. ±dP/dt SVGB ‘nin türevi alınarak MP35 veri kayıt sistemi aracılığıyla hesaplanmıştır. Tüm deney gruplarında iskemi öncesi, iskemi sonrası reperfüzyonun 30.dakika, 60. dakika ve 120. dakikalarındaki perfüzyon basıncı, sol ventrikül basıncı değerleri karşılaştırılmıştır (Şekil 4). 35 Şekil 4: Deney protokolü: açık alan; perfüzyon periyodu, kapalı alan, iskemi periyodu, taralı alan; reperfüzyon periyodudur. 36 3.2.3. İnfarkt Alan Değerlendirilmesi Trifeniltetrazolyum klorür’ün (TTC) pH’sı 7.4’e ayarlanmış, 1 L 0,1 M NaH2PO4 ve 2L 0,1 M Na2HPO4 karıştırılarak hazırlanan, fosfat tamponunda çözülerek %1 ‘lik çözeltisi hazırlanır. Kalpler Langendorf düzeneğinde reperfüzyondan sonra %1’lik TTC içeren fosfat tamponu ile 37°C’de 20 dk süreyle infüze edilir. Dokuda canlılığını koruyan alanlar, TTC ile koyu kırmızı renkte boyanırken nekrotik bölge ise soluk sarımsı renkte boyanır. Kalpler Lagendorf düzeneğinden alınıp alimunyum folyoya sarılarak -20°C ‘de dondurulduktan sonra, bistüri ile 2-3 mm kalınlıkta olacak şekilde dilimlenir. Kalp dilimleri % 10 formol çözeltisinde boyayı fiske etmek amacıyla 30 dk bekletilir. Boyama işlemini takiben infarkt alan iki cam levhanın arasına yerleştirilen ve fotograflanan kalplerde Image j yöntemi ile infarkt alan/tüm alan olarak hesaplanır. 3.2.4. İstatistiksel analiz Tüm gruplarda elde edilen SVGB, SVDSB, ±dP/dt, infarkt alan değerleri, ortalama ± ortalamaların standart hatası şeklinde ifade edilmiştir. Gruplar arasındaki anlamlılık tek yönlü varyans analizi ANOVA yapılarak karşılaştırıldı ve P<0,05 olan değerler anlamlı kabul edildi. 37 4. BULGULAR 4.1. İnfarkt Alan 30 dakika iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrası resveratrol (10µM) uygulaması infarkt alan büyüklüğünü kontrole göre anlamlı olarak azaltmıştır. 5-HD 10-1 µM ve 10-2 µM konsantrasyonda, resveratrolün oluşturduğu bu etkiyi anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır. 5HD’in bu inhibitör etkisi 10-3 ve 10-4 µM dozlarda görülmemektedir (Şekil 5). 50 45 Infarkt Alan (%) 40 35 30 * * 25 20 15 10 ▪ 5 0 Şekil 5: 30 dakika global iskemi ve 120 dakika reperfüzyon sonrasında kontrol, resveratrol, 5-HD uygulamasının infarkt alan üzerine etkileri. ■ kontrole göre, * resveratrole göre anlamlı, p<0.05. 38 Şekil 6: Kontrol, resveratrol ve 5HD uygulanmasını takiben 30 dakika global iskemi, 120 dakika reperfüzyon sonrası TTC boyası ile boyanan kalplerden örnekler. 4.2.Hemodinamik Parametreler 4. 2. 1 Sol Ventrikül Gelişen Basıncı (SVGB) Resveratrol 30 dakikalık iskemi sonrasında SVGB’nı reperfüzyonun 90. ve 120. dakikalarında kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir (Şekil 7). Resveratrol’ün oluşturduğu koruma reperfüzyonun sonlarında ortadan kalkmıştır. 5-HD, resveratrolün oluşturduğu korumayı verilen 10 -1 iskemi-reperfüzyon ve 10 -2 hasarına karşı µM dozlarda anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 7). 39 SVGB (başlangıcın %) 120 100 ● ● 80 60 * 40 * * * 20 0 30 60 İskemi 90 120 180 Zaman (dk) Reperfüzyon Şekil 7: SVGB üzerine kontrol, resveratrol, 5-HD+resveratrol uygulamasının etkisi. * resveratrole göre, ● kontrole göre anlamlı p<0.05. 40 Şekil 8: Kontrol, resveratrol’ün tek başına ve 5-HD ile kombine kullanıldığı gruplardaki SVGB kayıtları. 4.2.2. Sol Ventrikül Diyastol Sonu Basıncı (SVDSB) Resveratrol 30 dakikalık iskemi sonrasında SVDSB’nın reperfüzyon süresince kontrole göre sağlamıştır. 5-HD 10-1, 10-2 ve 10-3 anlamlı olarak korunmasını µM dozlarda ise resveratrolün oluşturduğu korumayı anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 9). 41 500 SVDSB (başlangıcın %) 450 400 350 * * 300 * * 250 200 ● 150 ● 100 50 0 30 60 90 İskemi İskemi 120 180 Zaman (dk) Reperfüzyon Şekil 9: SVDSB üzerine kontrol, resveratrol, 5-HD+resveratrol etkisi. * resveratrole göre, ● kontrole göre anlamlı p<0.05. 4.2.3. -dP/dt, +dP/dt Değerleri Resveratrol 30 dakikalık iskemi sonrasında -dP/dt değerini reperfüzyon süresince kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir. 5-HD’nin resveratrol ile kombine kullanıldığı 10-1 ve 10-2 µM dozlarda ise yine 42 reperfüzyon süresince resveratrolün iskemi-reperfüzyon hasarına karşı oluşturduğu korumayı anlamlı olarak ortadan kaldırmıştır (Şekil 10). 120 ● ● 80 ● 60 * -dp/dt (başlanğıcın %) 100 40 * * * 20 * * 0 30 İskemi 60 90 120 Reperfüzyon 180 Zaman (dk) Şekil 10: -dP/dt kontrol, resveratrol, 5-HD+resveratrol etkisi * resveratrole göre, ● kontrole göre anlamlı p<0.05. Resveratrol 30 dakikalık iskemi sonrasında +dP/dt değerini reperfüzyon süresince kontrole göre anlamlı olarak düzeltmiştir. 5-HD, resveratrol ile kombine kullanıldığı verilen 10-1 ve 10-2µM konsantrasyonda resveratrolün reperfüzyon süresince oluşturduğu korumayı ortadan kaldırmıştır (Şekil 11). 43 120 ● 100 ● ● +dp/dt (başlangıcın %) 80 60 * * 40 * * 20 * * 0 30 60 İskemi 90 120 180 Zaman (dk) Reperfüzyon Şekil 11: +dP/dt kontrol, resveratrol, 5-HD+resveratrolün etkisi. * resveratrole göre, ● kontrole göre anlamlı p<0.05. 44 5. TARTIŞMA Biz bu araştırmamızda resveratrolün miyokardiyal iskemi reperfüzyon hasarında oluşturduğu koruyucu etkide mitokondriyal K ATP kanallarının rolünü inceledik. Araştırmamızda resveratrol 30 dk ‘lık miyokardiyal iskemi sonrasında gerek infarkt alanda gerekse hemodinamik parametrelerin korunmasında kontrol grubuna göre anlamlı koruma oluşturmuştur. Resveratrol kontrol grubunda azalmış olan SVGB’nı ve artmış olan SVDSB’nın iskemi öncesi değerlerinde kalmasını sağlamıştır. Resveratrolun oluşturduğu bu koruyucu etkide mitoKATP kanallarının etkilerini araştırmak için mitoKATP kanal blokörü 5-HD’ı (10-1-10-4 µM) farklı dozlarda kullandık. 5-HD 10-1 ve 10-2µM dozlarda resveratrolün infarkt alanda oluşturduğu azalmayı ortadan kaldırmıştır. Ayrıca 5-HD aynı dozlarda resveratrolün SVGB‘ı, SVDSB’ı ve ±dP/dt değerlerinde iskemi sonrası yaptığı düzeltmeyi de ortadan kaldırmıştır. Resveratrolün önkoşullama oluşturma potansiyeline dair yapılmış çok sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmalarda resveratrol ile yapılan ön koşullamanın koruyucu etkisinde iskemi ile tetiklenme sonucu intrasellüler bazı mediyatörlerin rol oynadığı gösterilmiştir. Bunlardan en önemli ikisi; KATP kanalı ve protein kinaz C’nin spesifik izoformlarıdır82,83. ATP duyarlı potasyum kanalları (KATP) hem mitokondriyal membranda hem de kardiyak miyositlerin sakolemmalarında bulunmaktadır. KATP kanallarının yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi için moleküler ve elektrofizyolojik teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte mitoKATP kanallarının varlığı farmakolojik olarak 45 gösterilmiştir. Özelikle diazoksit bu kanalın selektif açıcısı olarak tanımlanırken 5-HD selektif inhibitörü olarak tanımlanmıştır. Gross ve Fryer yaptıkları çalışmada diazoksidin iskemik önkoşullamayı taklit ettiğini ve 5-HD’ın bu etkiyi ortadan kaldırdığını göstermişlerdir84. Mitokondri diazoksidin oluşturduğu kardiyak korumada efektör olarak etki göstermiştir. mitoKATP kanallarının çalışıldığı ve izole mitokondriyal preparatların ve intakt kardiyak miyositlerin kullanıldığı çalışmalarda diazoksit selektif açıcı ve 5-HD’ın selektif blokör olduğu gösterilmiştir. Örneğin tavşan kardiyak miyositlerinin kullanıldığı bir çalışmada diazoksidin mitoKATP kanal aktivasyonunun indeksi olarak kullanılan flavoprotein floresansını arttırdığı, buna karşılık sarkolemmal KATP akımını değiştirmediği gösterilmiştir. 5-HD bu etkiyi ortadan kaldırmıştır85. mitoKATP kanallarının iskemiye karşı oluşturduğu kardiyak korumanın mekanizması ve büyüklüğü belli değildir. İzole kardiyak mitokondriler ile yapılan çalışmalar saf mitoKATP kanal açıcılarının matriksten Ca+2 girişini sağlayan ve respirasyonu stimüle eden iç (inner) membranı polarize ettiğini göstermişlerdir86. mitoKATP kanallarının aktivasyonu ile inner mitokondriyal membranın depolarizasyonunun geciktirilmesi Ca+2’un aşırı birikmesine bağlı olarak meydana gelecek zararlı etkilerden bu organelleri koruyabilir. Bir diğer alternatif yol mitoKATP kanallarının açılması ön koşullama kaskatının son effektörü olmadığı, fakat reaktif oksijen türlerinin (ROT) salınımı ile meydana gelen kardiyak korumada tetikleyici olarak etki gösterebildiğidir87. 46 Hannley ve arkadaşlarının kobay ventrikül miyositlerinde yaptıkları çalışmada diazoksidin süksinat oksidasyonunu inhibe ettiği ve 5HD’ nın da elektron transport zincirini destekleyen 5-hidroksildekanoil-koA için substrat olduğunu ileri sürmüşlerdir. Yaptıkları çalışmada diazoksidin oluşturduğu farmakolojik ön koşullamada solunum zincir kompleksinin kısmen inhibe edilmesinin rolü olduğu ileri sürülmektedir88. mitoKATP kanallarının açılmasının önkoşullama kaskadında son effektör olmadığını aynı zamanda ROT ve nitrit oksit üretimini arttıran protein kinazların aktivasyonuna aracılık eden zincir reaksiyonlarını tetiklediği de ileri sürülmektedir89. Matejikova ve arkadaşları sıçan miyokardında iskemi sırasında oluşan ventriküller aritmileri ve miyokardiyal disfonksiyon üzerinde mitoKATP kanallarının ve ROT’nin etkilerini araştırmışlardır. Çalışmada sıçan miyokardında mitoKATP kanallarının açılmasının önkoşullayıcı fazda geçici ROT’nin oluşumunda artışa neden olduğu, bunun da miyokardiyumdaki pro/antioksidan dengeyi değiştirdiği ve sonraki uzun süreli iskemide ROT oluşumunu azalttığı ileri sürülmüştür. Araştırmacılar iskemik önkoşullama yapılmasını uzun süreli iskemi öncesi diazoksit uygulanan kalplerde reaktif oksijen oluşumunun arttığını ve 5HD’ın birlikte uygulanmasının bu artışı ortadan kaldırdığını göstermişlerdir90. KATP kanal aktivasyonunun kardiyak korumasına aracılık eden bir diğer mekanizma hem mitokondri hem de sarkolemma da bulunan ve KATP kanallarının açılmasını sağlayan proteinkinaz C, nitrik oksit, MAPK aracılık eden yapılardır91,92,93. Bu yapılar önkoşullamada hem 47 tetikleyici hem de mediyatör olarak görev yapan KATP kanallarının açılmasını sağlarlar. Mitokondriyal inner membranın depolarizasyonu ve KATP kanallarının açılması mitokondriye Ca+2 girişini sınırlandırır; mitokondrinin hacim regülasyonunu ve hızını, ROT üretimini düzenler. mKATP kanallarının yaptığı korumaya aracılık eden bir diğer mekanizma mitokondriyal permeabilite ve apoptozis ilişkili sitokrom C’nın salımını sınırlandıran antiapoptotik protein (bcl-2)’nın düzenlenmesidir94. Gök ve arkadaşları sıçan izole kalbinde yaptıkları çalışmada 5-HD uygulamasının apoptozise neden olduğunu göstermişlerdir95. mitoKATP daralması kanallarının nedeniyle açılması mitokondriyal mitokondriyal yapının ve matriksin fonksiyonlarının korunmasına aracılık eder ve uzun süreli iskemi sırasında kompleks 2’nın reversible aktivasyonunu sağlar96. Notsu ve arkadaşları kobay kalpleri üzerinde yaptıkları araştırmada yeni bir antiaritmik ajan olan 5-HD’nin mitoKATP kanallarının inhibe ettiğini araştırmışlar. Yapılan bu çalışmada kobay ventrikül miyositlerinin elektriksel aktiviteleri incelenmiş ve hücre dışı K+ konsantrasyonunun hücre içi ATP konsantrasyonuna kıyasla düştüğünü belirterek nedenini 5-HD ‘a bağlamışlardır81. KATP kanallarının uzak organ önkoşullamasında da rolü olduğu gösterilmiştir. Shahid ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada sıçan arka bacağı femoral arterinde oklüzyon yapılarak miyokardiyal iskemiye karşı oluşan korumada KATP kanallarının rolü incelenmiştir. Uzak organ önkoşullaması yapılması ve diazoksit uygulaması sol koroner arteri bağlanan hayvanlarda infarkt alanı anlamlı olarak azaltırken 5-HD bu 48 korumayı ortadan kaldımıştır. Benzer koruma serum kreatinkinaz, laktat dehidrogenaz seviyelerinde de gözlenmiştir. Arka bacakta oluşturulan iskemi reperfüzyon ve diazoksit uygulaması sol koroner arter bağlanması ile bozulan sol ventrikül fonksiyonlarını düzeltmiştir. Bu düzelme her iki grupta da 5-HD uygulaması ile ortadan kalkmıştır97. You-Ren Chen’in uzun süreli resveratrol uygulamasının ventriküler aritmi üzerine etkilerini inceledikleri çalışmada resveratrol’ün miyokardiyal infarktüsün neden olduğu aritmiyi, kardiyak hipertrofiyi ve yaşam süresini iyileştirdiğini göstermişlerdir 10,98 . Bizim çalışmamızda da resveratrol (10µM) 30 dakikalık iskemi 120 dakikalık reperfüzyon sonrasında infarkt alanı kontrole göre anlamlı olarak azaltmıştır. Ayrıca resveratrol SVGB, SVDSB’ı ve ±dP/dt değerlerinin kontrole göre anlamlı olarak korunmasını sağlamıştır. Jin C. ve arkadaşları yaptıkları çalışmada mitokondriyal Ca-K (mito k(Ca)) ve mitoKATP kanallarının farmakolojik önkoşullamada etkili olduğunu ve bu kanalların iskemi ard koşullamadaki etkileri araştırılmıştır. Sıçan kalpleri üzerinde 45 dakika iskemi süresi ardından 30 dakikalık bir reoksijenasyon uygulanmış. Ard koşullayıcı olarak paksilin ve 5-HD verilmiştir. Yapılan çalışma sonucu kontrol gurubu ile karşılaştırılmış ve infarkt alan boyutunun paksilin ve 5-HD uygulanmasıyla büyüdüğünü bildirmişlerdir. Aynı çalışmada kanal açıcı olarak NS1619 (mitoK(Ca) açıcı) ve diazoksit (mitoK(ATP) açıcı) uygulanmış ve infarkt alan boyutunun azaldığını belirtmişlerdir80. Biz de çalışmamızda mitoKATP kanallarının bu etkisinden yola çıkarak resveratrol’ün oluşturduğu korumaya etkisi olup olamadığını araştırdık. 5-HD 10-1 ve 10-2 µM dozlarda resveratrol’ün oluşturduğu koruyucu etkiyi reperfüzyon süresi boyunca ortadan kaldırırken, 10-3 ve 10-4 µM dozlarda bu etki gözlenmemiştir. 49 6.SONUÇ Araştırmamızda resveratrolün miyokardiyal iskemi- reperfüzyon hasarına karşı oluşturduğu koruyucu etkide mitoKATP kanallarının etkisini araştırdık. Çalışmamızda infarkt alan, SVGB, SVSDB, ±dP/dt değerleri incelendiğinde; resveratrolün (10µM) kontrole göre anlamlı olarak bu değerleri koruduğunu bulduk. Ayrıca 5-HD uygulamasının 10-1 ve 10-2 µM dozlarda resveratrolün infarkt alan, SVGB, SVSDB, ±dP/dt değerlerinde oluşturduğu korumayı doz bağımlı bir şekilde anlamlı olarak azalttığını bulduk. Bu bulgular ışığında resveratrol’ün miyokardiyal iskemireperfüzyon hasarına karşı oluşturduğu korumada mitoKATP kanallarının rolü olduğunu söyleyebiliriz. Bu da bize mitoKATP kanal açıcılarının miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının önlenmesinde ve/veya azaltılmasına kullanılabileceğini göstermektedir. 50 7.ÖZET Bu çalışmanın amacı resveratrol’ün miyokardiyal iskemireperfüzyonda oluşturduğu koruyucu etkide mitoKATP kanallarının etkisini incelemek. Bunun için 250-300g ağırlığında wistar ratlar ketamin hidroklorür ve ksilazin ile anesteziye edildikten sonra toraks hızla açılarak kalp buzlu Krebs-Heinseleit çözeltisi içerisine alınarak hızlıca Langendorff sistemine asılmıştır. SVGB kalbin sol ventrikülüne yerleştirilmiş lateks balon yardımıyla ölçülmüştür. Deneylerde infarkt alan ve MP35 kayıt sistemiyle hemodinamik parametreler (SVDSB, SVGB, ±dP/dt) ölçülmüştür. Deney hayvanları 3 gruba ayrılmıştır. 1. Grupta (kontrol) grubunda 30 dk’lık dengelenme. 2. grupta resveratrol 20 dk’lık dengelenme ardından 10 dk. resveratrol (10µM) infüzyonu yapılmıştır. 5HD ve resveratrol’ün kombine kullanıldığı -1 3. grupta 10. dk’lık -4 dengelenmeden sonra 10 dk. 5-HD (10 -10 ) ardından 10 dk. resveratrol (10µM) uygulanmıştır. Bütün deney gruplarında 30 dk. iskemi ve 120 dk. reperfüzyon yapılmıştır. Deney sonunda kalpler TTC ile boyanarak infarkt alan tayini yapılmıştır. Resveratrolün infarkt alanda yaptığı azalma 5HD’nin 10-1ve 10-2 µM konsantrasyonda anlamlı olarak ortadan kalkmıştır. Ayrıca 5-HD’nin 10-1 ve 10-2 µM konsantrasyonda resveratrol’ün SVGB, SVSDB ve ±dP/dt değerlerinde iskemi-reperfüzyon hasarına karşı yaptığı korumayı reperfüzyon süresinde anlamlı olarak ortadan kaldırılmıştır. Bu sonuçlar resveratrolün mitoKATP kanallarını aktive ederek iskemi- reperfüzyon hasarına karşı kalbi koruyabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelime: Resveratrol, ATP duyarlı mitokondriyal K+, önkoşullama, iskemi-reperfüzyon 51 8. SUMMARY The aim of the present study was to investigate the role of mKATP channel at the protective effect of resveratrol in the myocardial ischemia-reperfusion injury. Wistar rats were anesthesia with ketamine+ksilazin and hearts were put into solution after thorax was immediately opened. Finally, the hearts were mounted on the Langendorff system quickly. Left ventricular pressure was measured with a water-filled balloon. In all experiments, the infarct size and hemodynamic parameters (LVDP, LVEDP, ±dP/dt) were measured and evaluated by MP35 recording system. In the first group (control) after isolation of the hearts 10 min stabilization period followed by 20 min normal perfusion was applied. In the 5- hydoxydecanoate (10-1-10-4 µM) and resveratrol (10 µM) group, after 10 min stabilization period, heart was perfused 5-hydroxydecanoate and resveratrol separately 10 min. In the resveratrol group or 5- hydroxydecanoate group, 10 min stabilization, 10 min perfused and 10 min resveratrol or 5-HD perfused. All hearts were subjected to 30 min global ischemia followed by 120 min of reperfusion. The hearts were dyed with TTC for infarct size measurement When resveratrol was applied infarct size significantly decreased against control and 5-HD. 5-HD was significantly decreased this protective effect with dose-dependent. In resveratrol group LVSP, LVEDP and ±dP/dt value during the reperfusion were not change when compared before ischemia values. 5-HD markedly reduced LVSP, LVEDP and ±dP/dt value at during the reperfusion when compared resveratrol. These results show that mKATP channel has potential role in resveratrol protective effect. Keyword: Resveratrol, ATP sensitive mitochondrial K+, preconditioning, ischemia-reperfusion 52 9. KAYNAKLAR 1. Association AH. Heart Disease and Stroke Statistics-2011 update. Dallas, Texas: American Heart Association 2011. 2. World health organization: Health statistics and health information system, The global burden of disease: 2004 update [Cite 2009 Sep 17]Availablefrom:http://wwwwhoint/health/global_global_burden_dis ease/GBD_report_2004update_fullpdf. 3. Huffmyer J, Raphael J. Physiology and pharmacology of myocardial preconditioning and postconditioning. Semin Cardiothorac Vasc Anesth, 2009; 13(1): 5-18. 4. Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ishemic myocardium. Circulation. 1986; 74/(5): 1124-36. 5. Murry CE, Richard VJ, Reimer KA, Jenning RB. Ischemik preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode Circ Res. 1990: 66(4): 913-36. 6. Kloner RA, Bolli R, Marban E, Reinlib L, Braunwald E. Medical and cellural implications of stunning, hibernation and preconditioning: an NHLBI workshop. Circulation. 1998; 97(18): 1848-67. 7. Yellon DM, Dana A. The preconditioning phenomenon: A tool for the scientist or a clinical reality? Circ Res. 2000; 87(7): 543-50. 8. Vinten-Johansen J, Zhao ZQ, Zatta AJ, Kin H, Halkos ME, Kerendi F. Postconditioning A new link in nature’s armor against myocardial ischemia-reperfusion injury. Basic Rescardial 2005; 100(4): 295310. 9. Renaud SC, Geuguen R, Schenker J, d’Houtaud A. Alcohol and mortality in middle-aged men from eastern France. Epidemiology 1998; 9: 184-8. 10. Chen WP, Su MJ, Hung LM. In vitro electrophysiological mechanisms for antiarrhythmic efficacy of resveratrol, a red wine antioxidant. Eur J Pharmacol 2007; 554: 196-214. 11. Chen YR, Yi FF, Li XY, Wang CY, Chen L, Yang XC, Su PX, Cai J. Resveratrol attenuates ventricular arrhythmias and improves the long-term survival in rats with myocardial infarction. Cardiovasc Drugs Ther 2008; 22(6): 479-85. 12. Oldenburg O, Cohen MV, Yellon DM, Downey JM. Mitochondrial KATP channels: role in cardioprotection. Cardiovasc Res 2002; 55;429-437. 13. Guyton AC, Hall JE. Tıbbı Fizyoloji. Çavuşoğlu H, Çağlayan Yeğen B, Aydın Z, Alican İ (Çev), 9.Basım, İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri; 1996. 53 14. Guyton AC, Hall JE. Tıbbı Fizyoloji Cep Kitabı. Solakoğlu Z (Çev), 10. Basım, İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri; 2003. 15. Hausenloy DJ, Yellon DM. New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway. Cardiovasc Res 2004; 61(3): 448-60. 16. Ferdinandy P, Schulz R, Baxter GF. Interaction of Cardiovascular Risk Factors with Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury, Preconditioning and Postconditioning. Pharmacol Rev 2007; 59(4): 418-458. 17. Hill MA, Yang Y, Ella SR, Davis MJ, Braun AP. Large conductance, Ca+2-activated K+channels(BKCa) and arteriolar myogenis signaling. Elsevıer 2010; 584: 2033-2042. 18. Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial Reperfusion Injury. N Engl J Med 2007; 357: 1121-35. 19. Hausenloy DJ, Yellon DM. Preconditioning and postconditioning: Underlying mechanisms and clinical application. Atherosclerosis 2009; 204(2): 334-41. 20. Anderson WAD, Kısa Patoloji. Aykan TB, Tüzüner N, Sav A, İnce Ü (Çev), 2. Basım, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi; 1987. 21. Aksulu HE, Ercan ZS, Türker RK. Further studies on the antiarrhytmic effects of iloprost. Arch Int Pharmacodyn ther 1985; 277(2): 233-34. 22. Braunwald E, Kloner RA. Myocardial reperfusion: a double-edged sword? J Clin Invest 1985; 76(5): 1713-19. 23. Kloner RA, Jennings RB. Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 1. Circulation 2001; 104(24): 2981-89. 24. Ruiz-Meana M and Garcia-Dorado D. Pathophysiology of IschemiaReperfusion Injury: New Therapeutic Options for Acute Myocardial Infarction. Rev Esp Cardiol 2009; 62(2): 199-209. 25. Zweier JL. Measurement of superoxide-derived free radicals in the reperfused heart: evidence for a free radical mechanism of reperfusion injury. J Biol Chem 1988; 263(3): 1353-57. 26. Hearse DJ, Humphrey SM, Chain EB. Abrupt reoxygenation of the anoxic potassium-arrested perfused rat heart: a study of myocardial enzyme release. J Mol Cell Cardiol 1973; 5: 395-407. 27. Zweier JL, Talukder MA. The role of oxidants and free radicals in reperfusion injury. Cardiovasc Res 2006; 70: 181-90. 28. Penna C, Mancardi D, Rastaldo R, Pagliaro P. Cardioprotection: A radical view Free radicals in pre and postconditioning. Biochim. Biophys. Acta 2009; 1787(7): 781-93. 29. Kevin LG, Camara AK, Riess ML, Novalija E, Stowe DF. Ischemic preconditioning alters real-time measure of O2 radicals in intact hearts with ischemia and reperfusion. Am. J. Physiol, Heart Circ. Physiol. 2003; 284: H566-H574. 54 30. Pacher P, Beckman JS, Liaudet L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 2007; 87: 315-424. 31. Vinten-Johansen J. Involvement of neutrophils in the pathogenesis of lethal myocardial reperfusion injury. Cardiovasc Res 2004; 61: 481-97. 32. Kim JS, Jin Y, Lemasters JJ. Reactive oxygen species, but not Ca 2+ overloading, trigger pH- and mitochondrial permeability transitiondependent death of adult rat myocytes after ischemia-reperfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006; 290: H2024-H2034. 33. Bolli R, Becker L, Gross G, Mentzer R Jr, Balshaw D, Lathrop DA. Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy. Circ Res 2004; 95: 125-34. 34. Ma X, Zhang X, Li C, Luo M. Effect of postconditioning on coronary blood flow velocity and endothelial function and LV recovery after myocardial infarction. J Interv Cardiol 2006; 19: 367-75. 35. Nakano A, Cohen MV, Downey JM. Ischemic preconditioning: from basic mechanisms to clinical applications. Pharmacol Ther 2000; 86(3): 263-75. 36. Lemasters JJ, Theruvath TP, Zhong Z, Nieminen AL. Mitochondrial calcium and the permeability transition in cell death. Biochimica et Biophysica Acta 2009; 1787: 1395-1401. 37. Hawaleshka A, Jacobsohn E. Ischemic preconditioning: mechanisms and potential clinical applications. Can J. Anesth 1998; 45,670-682. 38. Cohen MV, Liu GS, Downey JM. Preconditioning causes improved wall motionas well as smaller infarcts after transient coronary occlusion in rabbits. Circulation 1991; 84, 341-349. 39. Liu Y, Downey JM. Ischemic preconditioning protects against infarction in rat heart. Am. J. Ph ysiol 1992; 263, H1107-1112. 40. Van Winkle DR, Thornton JD, Downey DM, Downey JM. The natural history of preconditioning: cardioprotection depends on duration of transistent ischemia and time to subsequent ischemia. Coron. Arter y Dis 1991; 2, 613-619. 41. Li Y, Whittaker P, Kloner RA. The transient nature of the effect of ischemi preconditioning on myocardial infarct size and ventricular arrhythmia. Am. Heart. J 1992; 123, 346-353. 42. Murry CE, Richard VJ, Jennings RB, Reimer KA. Myocardial protection is lost before contractile function recovers from ischemic preconditioning. Am. J. Physiol 1991; 260, H796-H804. 43. Penna C, Mancardi D, Raimondo S, Geuna S, Pagliaro P, The paradigm of postconditioning to protect the heart. J. Cell. Mol. Med. 2008; 12: 435-458. 44. Granfeldt A, Lefer DJ, Vinten-Johansen J. Protective ischaemia in patients: preconditioning and postconditioning. Cardiovasc Res 2009; 83: 234-246. 55 45. Raphael J, Drenger B, Rivo J, Berenshtein E, Chevion M, Gozal Y. Ischemic preconditioning decreases the reperfusion-related formation of hydroxyl radicals in a rabbit model of regional myocardial ischemia and reperfusion: the role of K(ATP) channels. Free Radic Res. 2005; 39: 747-754. 46. Zhao Z-Q, Corvera JS, Halkos ME, Kerendi F, Wang NP, Guyton RA, Vinten-Johansen J. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003; 285: H579H588. 47. Zhao ZQ, Scott M, Chiechio S, Wang JS, Renner K, Gereau RW, Johnson R, Deneris, Chen ZF. Lmx1b is required for maintenance of central serotonergic neurons and mice lacking central serotonergic system exhibit normal locomotor activity. J. Neurosci 2006; 26(49): 12781-88. PMID: 17151281. 48. Cohen MV, Yang XM, Downey JM. The pH hypothesis of postconditioning: staccato reperfusion reintroduces oxygen and perpetuates myocardial acidosis. Circulation 2007; 115: 1895-1903. 49. Xu KY, Zweier JL, Becker LC. Hydroxyl radical inhibits sarchoplasmic reticulum Ca21-ATPase function by direct attack on the ATP binding site. Circ Res 1997; 80: 76-81. 50. Harman AW, Maxwell MJ. An evaluation of the role of calcium in cell injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995; 35: 129-44. 51. Zhu J, Ferrier GR. Ischemic preconditioning: Antiarrhythmic effects and electrophysiological mechanisms in isolated ventricle. Am J Physiol 1998; 274: H66-H75. 52. Wu SN. Large-Conductance Ca+2-Activated K+ Channels: Physiological Role and Pharmacology. Current Med Chem 2003; 10(8) : 649-661. 53. Kerendi F, Kin H, Halkos ME, Jiang R, Zatta AJ, Zhao ZQ, Guyton RA, Vinten-Johansen J.Basic Res Cardiol. 2005; 100(5): 404-12. 54. Gross ER, Hsu AK, Gross GJ. Opioid induced cardioprotection occurs via glycogen synthase kinase beta inhibition during reperfusion in intact rat hearts. Circ Res 2004; 94(7): 960-66. 55. Kızıltepe U, Turan NN, Han U, Ulus AT, Akar F. Resveratrol, a red wine polyphenol, protects spinal cord from ischemia-reperfusion injury. J Vasc Surg 2004; 40(1): 138-45. 56. Turan NN, Csonka C, Csont T, Giricz Z, Fodor G, Bencsik P. The role of peroxynitrite in chemical preconditioning with 3nitropropionic acid in rat hearts. Cardiovascular Research 2006; 70(2): 384– 90. 57. Auchampach JA, Gross GJ. Reduction in myocardial infarct size by the new potassium channel opener bimakalim. J Cardiovasc Pharmacol 1994; 23: 554-561. 58. Burley DS, Ferdinandy P, Baxter GF. Cyclic GMP and protein kinase-G in myocardial ischaemia-reperfusion: opportunities and 56 obstacles for survival signaling. Br J Pharmacol 2007; 152(6): 83334. 59. Chiari PC, Bienengraeber MW, Pagel PS, Krolikowski JG, Kersten JR, Warltier DC. Isoflurane protects against myocardial infarction during early reperfusion by activation of phosphatidylinositol-3kinase signal transduction: evidence for anesthetic-induced postconditioning in rabbits. Anesthesiology 2005; 102: 102-109. 60. Obal D, Dettwiler S, Favoccia C, Scharbatke H, Preckel B, Schlak W. The influence of mitochondrial KATP channels in cardioprotection of preconditioning and postconditioning by sevoflurance in the rat in vivo. Anesth Analg 2005; 101(5): 1252-60. 61. Aribal Kocaturk P, Ozelci Kavas G, Iren Buyukkagnici D. Pretreatment Effect Of Resveratrol On Streptozotocin-Induced Diabetes, Biol. Trace Elem. Res 2007; 118(3): 244-249. 62. Aribal Kocaturk P, Ozelci Kavas G. Resveratrol effects on streptozotcin-induced diabetes. Trace Elem Electrolytes 24 (2), 112-116. 63. Ozelci Kavas G, Aribal Kocaturk P, Iren Buyukkagnici D. Resveratrol: Is There Any Effect On Healthy Subject? Biol. Trace Elem. Res 2007: 118(3): 250-254. 64. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG, Boss O, Gwinn D, Wang M, Ramaswamy S, Fishbein KW, Spencer RG, Lakatta EG, Le Couteur D, Shaw RJ, Navas P, Puigserver P, Ingram DK, De Cabo R, Sinclair DA. Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet, Nature 2006; 444: 337-342. 65. Pal S, Ho N, Santos C, Dubois P, Mamo J, Croft K, Allister E. Red Wine Polyphenolics Increase LDL Receptor Expression and Activity and Suppress the Secretion of ApoB100 from Human HepG2 Cells. J. Nutr 2003; 133,700-706. 66. Olas B, Nowak P, Kolodziejczyk J, Ponczek M, Wachowicz B. Protective effects of resveratrol against oxidative/nitrative modifications of plasma proteins and lipids exposed to peroxynitrite, J. Nutr. Biochem 2006; 17, 96-102. 67. De la Lastra CA, Villegas I. Resveratrol as an antioxidant and prooxıdant agent: mechanisms and clinical implications. Biochem Soc Trans 2007; 35(5): 1156-60. 68. El-Mowafy AM, White RE. Resveratrol inhibits MAPK activity and nuclear translocation in coronary artery smooth muscle: Reversal of endothelin-1 stimulatory effects. FEBS Lett. 1999; 45: 63-67. 69. Sato M, Maulik G, Bagchi D, Das DK. Myocardial protection by protykin, a novel extract of trans-resveratrol and emodin. Free Radic Res 2000; 32: 135-144. 57 70. Das DK, Maulik N. Resveratrol in Cardioprotection: A Therapeutic Promise Alternative Medicine Molecular Interventions. Card Res 2006; 6(1): 36-47. 71. Budak B, Seren M, Turan NN, Sakaoğulları Z, Ulus AT. The protective effects of resveratrol and L-NAME on visceral organs following aortic clamping. Ann Vasc Surg 2009; 23(5): 675-85. 72. Orallo F, Alvarez E, Camina M, Leiro JM, Gomez E, Fernandez P. The Possible İmplication of trans-resveratrol in the cardioprotective effects of long term moderato wine consumption. Mol Pharmacol 2002; 61(2): 294-302. 73. Rakıcı Ö, Kızıltepe U, Coşkun B, Aslamacı S, Akar F. Effect of Resveratrol on Vascular Tone and Endothelial Function of Human Saphenous Vein and Internal Mammary Artery. Int J Cardiol 2005; 105(2): 209-15. 74. Coşkun B, Söylemez S, Parlar AI, Ulus AT, Katırcıoğlu SF, Akar F. Effect of resveratrol on nitrat tolerance in isolated human internal mamary artery. J Cardiovasc Pharmacol 2006; 47(3): 437-45. 75. Calderone V, Martelli A, Testai L, Martinotti E, Breschi MC. Functional contribution of the endothelial component to the vasorelaxant effect of resveratrol and NS 1619, activators of the large-calcium-activated potassium channels. NaunynSchmiedeberg’s Arch Pharmacol 2007; 375(1): 73–80. 76. Tanaka Y, Koike K, Toro L. MaxiK channel roles in blood vessel relaxation induced by endothelium-derived relaxing factors and their molecular mechanisms J. Smooth Muscle Res 2004; 40(4-5): 12553. 77. Tanno M, Miura T, Tsuchida A, Miki T, Nishino Y, Ohnuma Y, Shimamoto K. Contribution of both the sarcollemmal ATP and mitochondrial KATP channels to infarct size limitation by KATP channel openers: Differencec from preconditioning in the role of sarcolemmal KATP channels. Naunyn Schmiedebergis Arch Pharmacol 2001; 346(3): 226-32. 78. Notsu T, Ohhashi K, Tanaka I, Ishikawa H, Niho T, Fukutake K, Mizota M. 5-Hydroxydecanoate inhibits ATP-sensitive K+ channel currents in guinea-pig single ventricular myocytes. Eur J Pharmacol. 1992; 220(1): 35-41. 79. Sakamoto K, Yamazaki J, Nagao T. 5-Hydroxydecanoate selectively reduces the initial increase in extracellular K in ischemic guinea-pig heart. European Journal of Pharmacology. 1998; 348(1): 31-35. 80. Jin C, Wu J, Watanabe M, Okada T, Iesaki T. Mitochondrial K(+) channels are involved in ischemic postconditioning in rat hearts J Physiol Sci. 2012; 62(4): 325-32. 81. Ülker S, McKeown PP, Bayraktutan U. Aprotinin impairs coronary endothelial function and down-regulates endothelial NOS in rat 58 coronary microvascular endothelial cells. Cardiovasc Res 2002; 55(4): 830-37. 82. Downey JM, Cohen MV. Mitochondrial K(ATP) channel opening during index ischemia and following myocardial reperfusion in ischemic rat hearts. J Mol Cell Cardiol 2001; 33(4): 651-3. 83. Kuzmin AI, Gourine AV, Molosh AI, Lakomkin VL, Vassort G. Effects of preconditioning on myocardial interstitial levels of ATP and its catabolites during regional ischemia and reperfusion in the rat. Basic Res Cardiol 2000; 95: 127-36. 84. Gross G.J, Fryer R.M. Sarcolemmal versus mitochondrial ATPsesitive K channels and myocardial preconditioning. Circulation Research 1999; 84: 973-979. 85. Liu Y, Sato T, O’Rourke B, Marban E. Mitochondrial ATPdependent ptassium channels: noel effectros of cardioprotection? Circulation 1998; 97: 2463-2469. 86. Holmuhammedov E L, Wang L, Terzıc A. ATP sensitive K channel openers prevent Ca overload in rat cardiac mitochondria. Journal of Physiology 1999; 519: 374-360. 87. Pain T, Yang X M, Critz S D, Yue Y, Nakano A, Liu G S, Heusch G, Cohen M V, Downey J M. Opening of mitochondrial KATP channels triggers the preconditional state by generating free radicals Circulation Research. 2000; 87: 460-466. 88. Hanly P J, Mickel M, Loffler M, Brandt U, Daut J. KATP channeindeoendent targets of diazoxide and 5-hydroxydecanoate in the heart Journal of physiology. 2002; 542 (3): 735-741. 89. Yue Y, Qın Q, Cohen MV, Downey JM, Critz SD. The relative order of MKATP channels, free radicals and p38 MAPK in preconditioning’s protective pathway in rat heart. Cardiovasc Res. 2002; 55: 681-689. 90. Matejikova j, Kucharska j, Pinterova M, Pancza D, Ravingerova T. Protection against ischemia-induced ventricular arrhytmias and myocardial dysfunction conferred by preconditioning in the rat heart: involvement of mitochondrial KATP channels and reactive oxygen species. Physiol Res. 2009; 58: 9-19. 91. Pain T, Yang X M, Critz S D, Yue Y, Nakano A, Liu G S, Heusch G, Cohen M V, Downey J M. Opening of mitochondrial KATP channels triggers the preconditional state by generating free radicals. Circulation Research. 2000; 87: 460-466. 92. Murphy E. Primary and secondary signaling pathways in early preconditioning that converge on the mitochondria to produce cardioprotection. Circ Res. 2004; 94: 7-16. 93. Sato T, O’Rourke B, Marban E. Modulation of mitochondrial ATP dependent K channels by protein kinase C. Cir Res. 1998; 83: 110114. 59 94. Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y, Bcl-2 family proteins regulate the release of opoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC. VDAC. Nature. 1999; 399: 483-487. 95. Gok S, Vatansever S, Vural K, Sekuri C, İzanlı A, Tezcan A, Claker S. The role of ATP sensitive K channels and of nitric oxide synthase on myocardial ischemia/reperfusion-induced apoptosis. Acta histochemica. 2006; 108: 95-104. 96. Pasdois P, Beauvoit B, Tariosse L, Adele S B, Vinassa B, Santos P D. Mito KATP-dependent changes in mitochondrial volume and in complex II activity during ischemic and pharmacological preconditioning of langendorff-perfused rat heart. J Bioenerg Biomembr. 2006; 38: 101-112. 97. Shahid M, Tauseef M, Sharma KK, Fahim M. Brief femoral artery ischemia provides protection against myocardial ischemiareperfusion injury in rats: the possible mechanisms. Exp. Ohysiol 2008; 93 (8): 954-968. 98. Wallace C, Baczko I, Jones L, Fercho M, Light PE. Inhibition of cardiac voltage-gated sodium channels by grape polyphenols. Br J Pharmacol 2006; 149: 657–65. 60 10. ÖZGEÇMİŞ Adı Mohammadreza Soyadı LAK ZADEH Doğum Yeri ve Tarihi 23.09.1980-Koşaçay (Miyandoab) Eğitimi Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi 2001-2008 Amir Kabir Özel Lisesi 1995-1999 Yabancı Dili Türkçe (Azerbaycan Türkçesi, Türkiye Türkçesi) İngilizce Farsça Arapça 61 TEŞEKKÜR Yüksek Lisans eğitimim sırasında başta Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Sayın Nurettin ABACIOĞLU’na ve bölümdeki bütün hocalarıma, tez dönemim boyunca benden desteğini esirgemeyen, tecrübeleri ile her türlü yardımda bulunan tez danışmanım Doç. Dr. Sayın Nilüfer N. TURAN’a sonsuz teşekkür ederim. Öğrencilik hayatım ve tez dönemim boyunca benden maddi manevi desteğini esirgemeyen aileme özellikle annem Fatemeh Fateh ve babam Ajdar LAK ZADEH’e ve eğitim hayatımda her zaman yanımda olan eşim Dr.Sheida Daneshvar’a sonsuz teşekkür ederim. Tez dönemim boyunca bana, her türlü yardımda bulunan ve destekleyen sevgili arkadaşlarım Ecz.Sayın Gizem ARDIÇ ve Sayın Hassan ALIZADEH’e sonsuz teşekkür ederim. 62
