Sıçanlarda Bazı Genel Anestezik Ajanların Mitokondriyal K ATP

Sıçanlarda Bazı Genel Anestezik Ajanların Mitokondriyal KATP Kanalları
Üzerindeki Rolünün Araştırılması
Resul BİRCAN, Arda ERDUT, H. Doğukan ÖZKAN, Melike YARDIMCI
Danışman: Doç. Dr. Müge TECDER-ÜNAL
GİRİŞ:
Anestezi, duyusal fonksiyonları geçici olarak ortadan kaldırma, sinir sistemini baskılayarak
bilinç kaybı yaratma işlemidir.
Deney hayvanlarında anestezi:
Deney hayvanlarına yapılan girişimler ağrı veya endişeye neden olduğundan deney sonucunu
etkilemeyecek uygun anestezik, analjezik veya trankilizan ajanların kullanımı gereklidir.
Deney hayvanının korkusunu azaltmak, hayvanın cerrahi girişime bağlı olarak ağrı
hissetmesini önlemek, araştırıcıyı korumak, deney girişimlerinin güvenli ve rahat yapılmasını
sağlamak için deney hayvanlarına anestezi uyguluyoruz.
Deneyin amacı, cerrahi işlem tipi ve süresi, hayvan türü, araştırmacı deneyimi gibi birçok
faktör deney hayvanına uygulanacak anestezi tekniğinin seçiminde rol oynar.
Kemirgenler boyutları küçük ve metabolizmaları hızlı olduğundan sanılanın aksine, büyük
hayvanlara ve insanlara göre daha yüksek dozda anestezik madde ile anesteziye alınırlar.
Bazal metabolizma hızlarının yüksek olması nedeniyle hipoglisemiye girme ihtimalleri fazla
olan bu hayvanlarda, aksi gerekmedikçe gıda verilmesi anesteziden yalnız 1-2 saat önce
(erişkin hamster ve kobaylarda 4-6 saat önce) kesilmelidir. Su kısıtlaması ise yapılmamalıdır.
Genel anestezinin evreleri ve izlenmesi:
Genel anestezi uygulamaktaki amaç, bilinç kaybına bağlı analjeziyi ve narkoz halini
sağlamaktır. Anestezik ajanlara ek olarak verilen sekresyonları azaltan ajanların yanı sıra,
hiporefleksi, hatta arefleksi sağlayan hem otonomik reflekslerin baskılayan hem de kasılan
iskelet kaslarını gevşeten nöromusküler bloker ilaçlar, invasiv girişimi kolaylaştırır. İyi bir
anestezik geniş güvenlik aralıklı, hızlı bayılma ve hızlı ayılma vaad eder ve minimal
komplikasyona yol açacak bir ajan olmalıdır.
Evre I (Analjezi): Ağrıya duyarsızlık evresidir, amnezi gelişir.
Evre II (Disinhibisyon): Reflekslerde artma, öğürme, inkontinans, irregüler respirasyon gibi
eksitasyon evresidir, deliryuma kadar gidebilir. Mümkün olduğunca hızlı atlatılması gereken
bir dönemdir.
Evre III (Cerrahi Anestezi): Bilinç kaybı, ağrı reflekslerinin yok olması, regüler
respirasyonun yeniden sağlanması ve kan basıncıının korunması sağlanır. Cerrahi girişim için
en uygun evredir.
Evre IV (Meduller Depresyon): Ventilasyon ve farmakolojik destek gerektiren respiratuvar ve
kardiyovasküler depresyon evresidir, diriltici önlem alınmazsa ölümle sonuçlanır.
Deney hayvanlarında ise uygulanan yöntemden bağımsız olarak anestezinin izlenmesinde
şunlara dikkat edilir:
Palpebral refleks; göz kapaklarına dokunma gözde kırpışmaya neden olur, gözlerini
kırpıyorsa anestezi hafiftir. Korneal refleks; pamukla veya iplikle korneaya dokunma göz
kırpmaya neden olur. Hayvan kornea refleksini kaybetmişse anestezi derindir. Bu evreye
bıyık refleksinin kaybolması izler. Daha sonra gelişen pençe refleksinde; ayak pençesinin
çimdiklemesi ağrıya neden olur. Hayvan ayağını çekiyorsa anestezi hafiftir, yeterince derin
değildir. Kas tonusu; alt çene veya ekstremitelerin çekilmesi ile kontrol edilir, rijit tonus
anestezinin derinliğinin yeterli olmadığını gösterir. Hayvanın anestezisi derinleşirken
solunum ve kardiyak debi azalır; kanın oksijenazasyonu ve doku perfüzyonu bozulur, kan
basıncı ve sıcaklık azalır.
Deney sırasında deney hayvanının nabzının zayıf olması, kan basıncının düşük olması, kalp
ritminin bozuk olması, kapillerlerin yeniden doluşunun yavaş olması, solunumun düzensiz
olması, müköz membranlar ve / veya derinin soluk ya da siyanotik olması, kas-iskelet,
gastrointestinal, kardiyovasküler, santral sinir sistemine ait reflekslerin azalması anestezide
doz aşımının göstergeleri arasında yer alır.
Anestezik ajanlar
Lokal anestezi, küçük bir bölgede yapılan girişimler sırasında ağrı duyusunu ortadan
kaldırmaya yönelik yapılan bir uygulamadır. Bilinci açık, refleks ve duyuları yerindedir.
Lokal anestezik ajanlar selektif olarak inaktif ve kapalı Na+ kanalına bağlanır ve membran
stabilizan etki gösterir.
Genel anestezik ajanlar inhalasyon yoluyla ya da parenteral yollar ile uygulanabilirler. Deney
hayvanlarında daha hızlı, kolay uygulanabilmeleri ve doz kontrolünün rahat olması nedeniyle
daha çok parenteral genel anestezik ajanlar tercih edilir. Etki mekanizmaları ise santral etkili
glutamat, nACh ve NMDA reseptörlerinin inhibisyonu ve / veya inhibitör GABA reseptör
aktivitesinin potansiyalizasyonu şeklindedir.
Deney hayvanlarında yaygın olarak kullanılan parenteral anestezik ajanlardan biri
barbitüratlardır. Yağda çözünürlükleri yüksek olan barbitüratlar hızlı bir anestezi
indüksiyonu sağlarlar, ancak kısa etki sürelidirler. Doz-bağımlı olarak santral sinir sisteminde
depresyon, respiratuvar depresyon ve kardiyak atım gücünde azalma yaparlar. Deney
hayvanlarında en yaygın olarak kullanılan barbitürat tipi genel anestezik ajan tiyopentaldir.
Tiyopental aritmiye neden olmaması nedeniyle özellikle kardiyovasküler sistem ile ilgili
deneylerin dizaynında sıklıkla tercih edilir. Ancak sistemik kan basıncını düşürdüğü,
kardiyak atım gücünü azalttığı, kalp atım hızı artırdığı ve solunum hızını azalttığı
bilinmektedir.
Deney hayvanlarında yaygın olarak kullanılan bir diğer parenteral anestezik ajan ise
ketamindir. Visseral analjezik etkisi bulunmayan ketamin disosiyatif bir ajandır. Ketamin
anestezisinde kalp atım hızı, sistemik kan basıncı, pulmoner arter basıncı, kalp debisi artar.
Oküler, oral, faringeal, laringeal refleksler korunurken, tükrük sekresyonu ve kas tonusu
artar, istemsiz hareketler görülür. İyi bir anestezi için tüm bu olumsuz etkilerini azaltmak
amacıyla ketamin, ksilazin ile kombine edilerek kullanılır. Sedatif ve analjezik etkili olan
ancak genel anestezik olarak kabul edilmiyen ksilazin, α2 adrenoseptör agonisti disosiyatif
bir ajandır. Ketamin + ksilazin kombinasyonu; ketaminin istenmeyen etkilerini (deliryum,
sekresyon artışı) ortadan kaldırmak amacıyla kullanılır. Kas gevşemesini, analjeziyi sağlar
ve anestezi süresini, immobilizasyonu uzatmak amacıyla kullanılır. Tablo 1‟de bazı deney
hayvanları için önerilen anestezik ajanların uygulama yolları ve dozları verilmiştir.
Tablo 1- Bazı deney hayvanlarında sıklıkla uygulanan parenteral anestezik ajan ve ajan
kombinasyonları, bunları uygulama yolları ve uygulama dozları.
Mitokondriyal KATP Kanalları (mito KATP)
ATP duyarlı potasyum kanalları ilk kez kobay ventriküler miyositlerinde daha sonra beyin,
düz kas, iskelet kası ve pankreas dokularında da izole edilmiştir. Noma ve arkadaşları
miyokardiyal KATP kanallarının açılmasının endojen bir kardiyoprotektif mekanizma olarak
çalışabileceği fikrini öne sürmüştür, bu daha sonraki çalışmalarla da doğrulanmıştır (6).
Günümüzde KATP kanallarının iskemik önkoşullamanın koruyucu etkisinin de önemli bir
bölümünü oluşturduğu bilinmektedir (3). Sarkolemmal KATP‟ye ilave olarak, mitokondri iç
membranında bulunan mito KATP„nin aktivasyonunun da iskemik önkoşullama /
kardiyoproteksiyonda subselüler farklı mekanizmalar aracılığıyla önemli roller oynadığını
göstermektedir (4).
Yapılan çalışmalar mito KATP kanallarının mitokondriyal Ca2+ ve K+ iyonlarının homeostazı
(1), reaktif oksijen türlerinin üretimi, aksiyon potansiyeli oluşumu, intraselüller olaylara
rehberlik eden birçok kimyasal ya da mekanik uyarıya aracılık etme (5), vazodilatasyon ve
nöron eksitabilitesinde rolü olduğunu göstermiştir. Mito KATP kanallarının açılması
mitokondriyal hacmi değiştirmeye yeterli olan, fakat membran potansiyelinde önemli bir
depolarizasyona neden olamayan, K+ akımı artışına sebep olur (2,7). Hacimdeki bu değişimin
hücre enerji “coupling”i üzerinde önemli etkileri olduğu düşünülmektedir.
5-hidroksidekanoat (5-HD) yüksek seçicilikle mito KATP kanallarını bloke ederek (8-10),
kalbin iskemik ve farmakolojik önkoşullamasını bloke eder. 5-HD‟nin sarkolemmal KATP
kanallarını da bloke ettiğini öne süren bazı çalışmalar olmasına rağmen 5-HD‟nin mito KATP
kanalları üzerindeki etkisinin daha potent olduğu yönündeki çalışmalar ağırlıktadır (11-12).
Amaç:
Ketamin ve tiyopentalin kardiyovasküler sistemde meydana getirdiği değişiklikler üzerine
mitokondriyal KATP kanallarının rolünün araştırılması.
Hipotez:
Birçok patolojik olayda rolü olan serbest radikallerin oluşumunda hem kaynak, hem de hedef
organel olan mitokondrinin üzerinde bulunan KATP kanalları, günümüzde yaygın olarak
kullanılan anestezik ajanların kardiyovasküler sistem üzerindeki etkisini değiştirir.
GEREÇ ve YÖNTEM:
Çalışma Başkent Üniversitesi, Hayvan Deneyleri Etik Kurulu‟nun onayı alındıktan sonra (DA
10/11) Başkent Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma
Merkezi‟nden sağlanan sıçanlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Çalışmada ağırlıkları 250-450
gr arasında değişen 24 adet erkek Wistar Albino sıçan kullanılmıştır. Sıçanlar oda sıcaklığının
21±1°C olduğu ve 12 saat aydınlık/karanlık siklusunun sağlandığı odalarda barındırılmış ve
standart laboratuar diyeti ve ad libitum çeşme suyu ile beslenmişlerdir.
Anestezi sonrası sıçanlara trakeotomi yapıldı ve trakea yapay solunum için kanüle edildi
(UGO BASILIE 7025 Rodent Ventilator, 5ml/100 gr hacimde, 34 vurum/dk hızda oda
havası). Sağ juguler ven kanüle edilerek infüzyon pompası (JMS SP-100s) aracılığıyla damar
yolu açık kalacak şekilde 0,8ml/saat serum fizyolojik uygulandı. Sol karotid arter kanüle
edilerek arteriyel kan basıncı, içi heparinize serum fizyolojil ile dolu Polietilen PE-50 katater
kullanılarak ve bir basınç transdüserine (TSD104A, BIOPAC Systems, Inc., Kaliforniya,
ABD) bağlanmış olarak monitorize edildi. Subkütan iğne elektrodlarla standart II. derivasyon
EKG kayıtları data acquisition system (MP100, BIOPAC Systems, Inc., Kaliforniya, ABD)
kullanılarak deney süresince sürekli olarak kaydedildi. Hayvanların vücut sıcaklığı rektal
prob (TSD202A BIOPAC Systems, Inc., Kaliforniya, ABD) ile ölçüldü ve bir lamba
aracılığıyla 37±1°C olması sağlandı. 10dk.‟lık protol süresince kaydedilen değerler
bilgisayar yazılım programı (AcqKnowledge BIOPAC Systems, Inc., Kaliforniya, ABD)
aracılığıyla kaydedilmiştir. Deney protokolü sonrasında sıçanlar yüksek doz anestezik ajan
ile sakrifiye edildi.
Deney hayvanları aşağıdaki şekilde gruplara ayrıldı (her bir grup için n=5-6):
I.
II.
Tiyopental sodyum (75mg/kg i.p.) ile anesteziye edilmiş sıçanlar grubu (TP kontrol),
Ketamin / ksilazin (60-10 mg/kg i.p.) ile anesteziye edilmiş sıçanlar grubu (K/K
kontrol),
III.
5-hidroksidekanoat (10mg/kg i.p.) + Tiyopental sodyum (75mg/kg i.p.) grubu (5-HD
+ TP),
IV.
5-hidroksidekanoat (10mg/kg i.p.) + Ketamin-ksilazin (60-10 mg/kg i.p.) grubu (5HD + K/K).
5-hidroksi dekanoat ilgili gruplarda, anestezik ajandan (TP ya da K/K) 5 dakika önce i.p.
olarak enjekte edilmiştir.
İstatistik:
Kan basıncı (KB) ve kalp atım hızı (KAH) ortalama ± standart hata olarak ifade edilmiştir,
tekrarlayan değerler için ANOVA, post-hoc Tukey yapılmıştır, *P < 0,05 istatistiksek olarak
anlamlı kabul edilmiştir. Aritmi insidansı: Fisher‟in kesin ki-kare testi ile değerlendirilmiştir,
*P < 0,05 istatistiksek olarak anlamlı kabul edilmiştir.
BULGULAR:
*
*
*
*
*
*
*
Şekil 1. Tiyopental kontrol (TP kontrol, n=5), ketamin/ksilazin kontrol (K/K kontrol, n=5), tiyopental + 5hidroksidekanoat (TP+5 HD, n=6) ve ketamin/ksilazin + 5-hidroksidekanoat (K7K+5-HD, n=6) gruplarında 10
dakikalık deney protokolü boyunca ortalama kan basıncında (mmHg) meydana gelen değişiklikler. *; diğer
gruplar ile karşılaştırıldığında P < 0,05.
5-HD’nin hemodinamik parametrelere etkisi:
Mitokondriyal KATP kanallarının kapanması tiyopental anestezisindeki deney hayvanında kan
basıncında yükselmeye neden olurken; ketamin/ksilazinin anestezisinde hemodinamik
parametreleri etkilememektedir (Şekil 1).
Şekil 2. Tiyopental kontrol (TP kontrol, n=5), ketamin/ksilazin kontrol (K/K kontrol, n=5), tiyopental + 5hidroksidekanoat (TP+5 HD, n=6) ve ketamin/ksilazin + 5-hidroksidekanoat (K7K+5-HD, n=6) gruplarında 10
dakikalık deney protokolü boyunca kalp atım hızında meydana gelen değişiklikler.
5-HD’nin kalp atım hızına etkisi:
Mitokondriyal KATP kanallarının kapanması kalp atım hızında gruplar arasında anlamlı bir
fark yaratmamıştır (Şekil 2).
5-HD’nin aritmi parametrelerine etkisi: Mitokondriyal KATP kanallarının kapanması
tiyopental ve ketamin/ksilazinin anestezisindeki deney hayvanında şiddetli aritmojenik etki
oluşturmaktadır (Şekil 3). Deney hayvanlarımızdan alınan EKG kayıtlarında aritmi
parametresi “Lambert Combention”la değerlendirilmiştir. İlgili gruplarda ventriküler ektopik
atım, ventriküler taşikardi, ventriküler fibrilasyon görülme insidansları hesaplanmıştır.
Ventriküler ektopik atım insidansı, anestezik maddelerin tek başlarına uygulandığı gruplarda
sıfır bulunmuştur. 5-HD uygulandıktan 5 dakika sonra intraperitoneal olarak anestezik madde
verilen gruplarda ise ventriküler ektopik atımda kontrol gruplarına göre anlamlı olarak artış
görülmüştür. 5-HD ve ardından tiyopental sodyum verilen deney hayvanlarının tümünde
ventriküler ektopik atım insidansı %100‟dür. (bkz. tablo...) Yani mitokondrial KATP
kanallarının kapatılması tiyopental ve ketamin-ksiliazin anestezisi altındaki deney
hayvanlarında şiddetli aritmojenik etki oluşturmuştur. Yine ilgili gruplarda ventriküler
taşikardi insidansı, tiyopental anestezisi, ketamin-ksilazin anestezisi ve 5-HD uygulaması
sonrası ketamin-ksilazin anestezisi uygulanan hayvanlarda sıfır bulunurken, 5-HD sonrası
tiyopental sodyum anestezisi uyguladığımız deney hayvanlarında ventriküler taşikardi
insidansı %88,3 olarak saptanmıştır. Deney gruplarımızdaki hayvanların hiçbirinde
ventriküler fibrilasyon görülmemiştir.
*+
100
90
*
İnsidans (%)
80
*
70
60
TP
50
K/K
40
TP + 5HD
30
K/K + 5HD
20
10
0
VEA
VT
VF
Şekil 3. Tiyopental kontrol (TP kontrol, n=5), ketamin/ksilazin kontrol (K/K kontrol, n=5), tiyopental + 5hidroksidekanoat (TP+5 HD, n=6) ve ketamin/ksilazin + 5-hidroksidekanoat (K7K+5-HD, n=6) gruplarında 10
dakikalık deney protokolü boyunca aritmi insidansında (%; ventriküler ektopik atım (VEA), ventriküler
taşikardi (VT), ventriküler fibrilasyon (VF)) meydana gelen değişiklikler. *; Kendi kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında, †; K/K + 5 HD grubu ile karşılaştırıldığında P < 0,05.
Deney esnasında yapılan gözlem sonucunda, tiyopental ve 5-HD uygulanmış sıçanların en
küçük insizyonlarda bile kendi kontrol grubuna ve diğer gruplara göre daha fazla kanadığı;
buna bağlı hemostazın zor sağlandığı görülmüştür. Bu gözlemin ileri araştırma ve deneylerle
kanıtlanması gerekmektedir.
Çalışmanın eksiklikleri:
BÜTF Araştırma Merkezi‟nde yürüttüğümüz bu çalışmada sıçanların vücut sıcaklıklarını
istenilen düzeyde tutamadık. İn vivo çalışmaların güvenirliliğinin artırılması için küçük deney
hayvanlarına uygun sabit ısıtıcı sistemlerin (heating pad, vs.) merkezimizde de kullanılması
gereklidir.
Çalışmada bulunan sonuçlar bildiğimiz kadarıyla literatürde şimdiye dek gösterilmemiştir.
Ancak bizim çalışmamız da “mekanizmaya yönelik” ileri çalışmalar ile geliştirilmelidir.
TARTIŞMA:
Başlangıçta çalışmamız iskemi-reperfüzyon hasarına yönelik diğer projeler için önçalışma
niteliğinde şekillendirilmiştir. Bize bundan sonraki çalışmalarımızda yol gösterici olmasının
da dışında, bildiğimiz kadarıyla literatürde şimdiye dek gösterilmemiş bazı sonuçları da
ortaya çıkarmıştır.
Deney hayvanlarıyla çalışmalar dizayn ederken kullanacağımız anestezik ajanların
hemodinamik parametreleri ya da aritmi parametrelerini farklı şekillerde etkileyebileceğini
akılda tutmalıyız. Özellikle kardiyovasküler sistemle ilgili projeler oluştururken bu daha da
önemli sonuçlar doğurabilir.
Mitokondriyal KATP kanallarının inhibe edilmesi KVS fonksiyonlarında olumsuz bazı
mekanizmaları tetiklemektedir ve / veya koruyucu mekanizmaları bozmaktadır. Bu normal
mitokondriyal fonksiyonlar, dolayısıyla hücre homeostazının bozulmasıyla gerçekleşiyor
olabilir. Bu etki kullanılan anestezik ajana göre farklı şiddetlerde meydana gelmektedir.
Anestezik ajanların kendi kardiyoprotektif ya da KVS üzerinde olumsuz etki güçlerinin de
değerlendirilmesi gerekliliğinin bir kez daha altını çizilmelidir.
Kaynakça:
1.
Beavis AD, Brannan RD, Garlid KD. Swelling And Contraction Of The Mitochondrial
Matrix. I. A Structural Interpretation Of The Relationship Between Light Scattering And
Matrix Volume. J Bıol Chem 1985; 260.25; 13424-13433.
2.
Dos Santos P, Kowaltowski AJ, N. Laclau M, Seetharaman S, Paucek P, Boudina S,
Thambo JB, Tariosse L, Garlid KD. Mechanisms By Which Opening The Mitochondrial
ATP- Sensitive K+ Channel Protects The Ischemic Heart. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 283.1: 284-295, 2002.
3.
Garlid KD. On The Mechanism Of Regulation Of The Mitochondrial K+/H+ Exchanger.
The Journal of Biological Chemistry 1980; 255 (23); 11273-11279.
4.
Garlid KD. Opening Mitochondrial KATP In The Heart – What Happens, And What Does
Not Happen. Basic Res Cardiol 2000; 95;4.
5.
Hanley Peter J, Gopalan K. V, Lareau RA, Srivastava D. K, von Meltzer M, Daut J. βOxidation Of 5-Hydroxydecanoate: A Putative Blocker Of Mitochondrial ATP-Sensitive
Potassium Channels. J Physiol 547.2: 387–393, 2003.
6.
Hanley Peter J, Dröse S, Brandt U, Lareau RA, Banerjee AL, Srivastava DK, Banaszak
LJ, Barycki JJ, Van Veldhoven PP, Daut J. 5-Hydroxydecanoate Is Metabolised In
Mitochondria And Creates A Rate-Limiting Bottleneck For β-Oxidation Of Fatty Acids.
J Physiol 562.2: 307-318, 2005.
7.
Hausenloy DJ, Maddock HL, Baxter GF, Yellon DM. Inhibiting Mitochondrial
Permeability Transition Pore Opening: A New Paradigm For Myocardial
Preconditioning?
April 29, 2002
Oxford Journals Medicine Cardiovascular Research 55.3, 534-543,
8.
Kaasik A, Safiulina D, Zharkovsky A, Veksler V. Regulation Of Mitochondrial Matrix
Volume. Am J Physiol Cell Physiol 2007; 292; 157-163.
9.
Szewczyk A, Wojtczak L. Mitochondria As A Pharmacological Target. Pharmacol Rev
2002; 54.1; 101–127.
10. Tanno M, Miura T, Tsuchida A, ve ark. Contribution Of Both The Sarcolemmal KATP
And Mitochondrial KATP Channels To Infarct Size Limitation By KATP Channel Openers:
Differences From Preconditioning In The Role Of Sarcolemmal KATP Channels. NaunynSchmiedeberg‟s Arch Pharmacol 2001.; 364; 226–232.
11. Testai1 L, Rapposelli S, Calderone V. Cardiac ATP-Sensitive Potassium Channels: A
Potential Target For An Anti-Ischaemic Pharmacological Strategy. Basic Res Cardiol
2000; 95; 275 – 279.
12. Vajda S, Baczkó I, Leprán I. Selective Cardiac Plasma-Membrane KATP Channel
Inhibition Is Defibrillatory And Improves Survival During Acute Myocardial Ischemia
And Reperfusion. Eur J Pharmacol 2007; 577; 115–123.