tc ankara ün vers tes bl msel araştırma projes kes n raporu

T.C.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ
KESİN RAPORU
Proje Başlığı
AKUT, ARALIKLI VE ADAPTİF HİPOKSİNİN
KALPTE HIF-1 ALFA VE VEGF’DEKİ DEĞİŞİMLERE ETKİSİ
Proje Yürütücüsünün İsmi
Doç. Dr. Demet Tekin
Proje Numarası
2006-0809032HPD
Başlama Tarihi
1 Nisan 2007
Bitiş Tarihi
1 Nisan 2008
Rapor Tarihi
25 Nisan 2008
Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Ankara - " 2008 "
I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri
AKUT, ARALIKLI VE ADAPTİF HİPOKSİNİN
KALPTE HIF-1 ALFA VE VEGF’DEKİ DEĞİŞİMLERE ETKİSİ
ÖZET
Oksijenin mitokondriyal solunum zincirinde terminal elektron akseptörü olarak enerji
üretiminde temel göreve sahip olması nedeniyle memelilerde hipoksiye karşı çeşitli korunma
mekanizmaları gelişmiştir. Yüksekliğe maruziyet (dağcılar, yükseklerde yaşayanlar ve pilotlar),
akut dağ hastalığı, uyku apnesi ve diğer hipoksik hipoksi nedenleri ile ortaya çıkan hipoksilerde
bu mekanizmalar sistemik , hücresel ve moleküler düzeylerde araştırılmaktadır.
HIF-1 alfa, hipoksinin yol açtığı hücresel yanıtlarda rol alan 100’den fazla enzim ve proteinin
transkripsiyonunu sağlayan ve hipoksi ile indüklenen bir transkripsiyon faktörüdür. VEGF, HIF1 alfa tarafından transkripsiyonu gerçekleşen ve hipoksi yanıtında rol alan anjiyogenetik
faktördür. Günümüzde çeşitli yüksekliklerde, insanlarda fizyolojik parametrelerin
değerlendirilmesinin yanı sıra iskelet kası ve kan örneklerinde bu iki faktör ve hipoksiye yanıtta
önemli diğer bazı faktörler araştırılmaktadır. Ayrıca deney hayvanları ile hipoksi kamaralarında
çeşitli yükseklikler oksijen oranı değiştirilerek taklit edilmekte, çeşitli dokular incelenmektedir.
Kalp dokusu da hipoksik hasara uğrayabilmekte, verdiği hücresel yanıtlar oksijen desteği ile
ihtiyacı arasındaki dengeye göre değişebilmektedir.
HIF-1 alfa ve VEGF ile ilgili çalışmalar farklı dokularda, umbilikal ven endotel hücrelerinde,
lökositlerde ve plazmada yapılmıştır ve çelişkili sonuçlar elde edilmiştir. Kalp dokusunda bu iki
faktör ile ilgili sınırlı sayıda çalışma mevcuttur ve uygulanan hipoksi protokolleri standart
değildir.
Sunulan proje önerisinde, 5000 metre yüksekliğe karşılık gelen %11 O2’li ortama farklı
sürelerde maruz kalan deney hayvanlarının kalp dokularında HIF-1 alfa ve VEGF mRNA
ekspresyonları incelenmiştir.
Laboratuarımızda yapılan daha önceki çalışmalarda, Yeni Zelanda türü erkek tavşanlar dört
gruba ayrılmıştır. Kontrol grubu hayvanlarının, 1 haftalık uygun bakım ve 12 saatlik
aydınlık/karanlık döngüsü uygulaması sonrasında anestezi altında kalp dokuları alınmıştır. Akut
hipoksi grubunda akut 4 saat hipoksi sonrasında dokular toplanmıştır. Aralıklı hipoksi grubunda
14 gün boyunca 4 saat/gün hipoksi sonrasında 15. gün dokular alınmıştır. Adaptif grupta ise ilk
10 gün , her gün 10’ar dk artırılarak hipoksi verilmiş, 11. günden itibaren 40. güne kadar 4
saat/gün hipoksiye maruz bırakılmış ve ertesi gün dokular alınmıştır. Tüm hipoksi uygulamaları
oda sıcaklığında, %11 oksijenli, normobarik ortamda, hipoksi kamarası içinde
gerçekleştirilmiştir.
Çalışmanın ikinci aşamasında sol ve sağ ventrikül olarak ayrılan tavşan kalbi dokularından total
RNA izolasyonu sonrası, HIF-1 alfa ve VEGF’ye spesifik primerler kullanılarak RT- PCR
yöntemi ile mRNA’larının ekspresyonları incelenmiştir. Sonuçlar, gerek hipoksinin etkileri
açısından kontrol grubu ile ve gerekse hipoksi maruziyetinin süresi açısından gruplar arasında
karşılaştırılmıştır. Ayrıca hipoksinin sol ve sağ ventriküldeki etkilerinde farklılık olup olmadığı
da incelenmiştir.
Sonuçlar aşağıdaki gibi özetlenebilir:
1. Sol ventrikül VEGF mRNA ekspresyonları akut hipoksi ve aralıklı hipoksi uygulamaları ile
istatistiksel olarak anlamlı oranda artış göstermiştir fakat HIF-1 alfa mRNA ekspresyonları
anlamlı ölçüde değişikliğe uğramamıştır.
2. Sağ ventrikül HIF-1 alfa mRNA ve VEGF mRNA ekspresyonları üç farklı hipoksi
uygulaması ile anlamlı ölçüde değişikliğe uğramamıştır.
3. HIF-1 alfa mRNA ekspresyonları sol ve sağ ventrikülde karşılaştırıldığında sadece kontrol
gruplarında sağ ventrikülde daha yüksek bulunmuştur.
4. VEGF mRNA ekspresyonları sol ve sağ ventrikülde karşılaştırıldığında anlamlı bir farklılık
görülmemiştir.
THE EFFECTS OF ACUTE, INTERMITTAN AND ADAPTIVE HYPOXIA
ON CARDIAC HIF-1 ALPHA AND VEGF EXPRESSIONS
SUMMARY
The mammals have developed several protective mechanisms against hypoxia because of the
oxygen has crucial function in energy production as a terminal electron acceptor in
mitochondrial respiratory chain. These protective mechanisms are largely investigated
considering the hypoxia caused by high altitude exposure (as in living high, mountaineers, and
pilots), acute mountain sickness, sleep apnea and etc.
HIF-1 alpha is a transcription factor, which induces the transcription of more than hundred
enzymes and proteins playing roles in cellular responses to hypoxia. VEGF (vascular endothelial
growth factor) is one of the angiogenic factors, which plays a role in hypoxia response and the
transcription of which is performed by HIF-1 alpha. Nowadays, in human studies, these two
factors and other important factors which respond to hypoxia are investigated in blood samples
and skeletal muscle samples in addition to analysis of physiological parameters of humans at
several heights. In animal models, several tissue samples are being evaluated by changing the
percentage of oxygen and so that simulating the different heighten. Among these tissues, heart
tissue as well responses to hypoxia and demonstrates cellular injury and the balance between the
oxygen support and demand affects these cellular responses.
The previous studies on HIF-1 alpha and VEGF were performed in different kind of tissues,
umbilical vein endothelial cells, leukocytes and plasma. The obtained results were contradictory.
There are limited numbers of studies in heart tissue and the applied hypoxia protocols of these
studies were not standard.
In the presented project, we evaluated the HIF-1 alpha and VEGF mRNA expressions in heart
tissue samples of experimental animals, who were exposed to a condition of 11 % O2
corresponding to the height of 5000 m for different durations.
New Zealand male rabbits were randomly assigned to four groups. Following proper care and
adaptation with 12 h of dark/light cycle for one week, animals in control group were
anesthetized and the heart tissues were taken. Acute hypoxia group were exposed to 4 hours of
hypoxia. The tissue samples were collected immediately after hypoxia. In intermittent hypoxia
group, 4 h hypoxia per day was applied for 14 days. At the fifteenth day, the heart samples were
collected. In adaptive group, hypoxia exposure duration was increased 10 minutes every day for
the first ten days. From the day 11 to the day 40, it was maintained as 4 hours of hypoxia. Tissue
sampling was performed at the next day. All hypoxia applications were executed under room
temperature, in a normobaric hypoxia (11%) chamber.
The total RNA isolation was performed in the heart samples, separated into right and left
ventricles. The expressions of HIF-1 alpha and VEGF mRNAs were investigated in the samples
using specific primers and RT-PCR method. The results were compared both between control
and hypoxia groups to explore the effects of hypoxia and between different hypoxia groups in
terms of the duration of hypoxia exposure. In addition, if there was a difference in the effect of
hypoxia on left and right ventricles were also evaluated.
The results were as follows:
1. The VEGF mRNA expressions of left ventricles in acute hypoxia and intermittent hypoxia
groups were significantly higher than the control groups. The expression of HIF-1 alpha mRNA
was not different in these groups.
2. The VEGF mRNA and HIF-1 alpha mRNA expressions of right ventricles were not changed in
the three hypoxia groups.
3. When the left and right ventricles were compared, only HIF-1 alpha mRNA expression in right
ventricle of control group was higher than the one in left ventricle of control group.
4. VEGF mRNA expressions were not significantly different between left and right ventricles of
all experimental groups.
II. Amaç ve Kapsam
Sunulan proje önerisinde, farklı sürelerde uygulanan sistemik, normobarik hipoksinin; kalp
dokusunda hipoksi ile indüklendiği bilinen HIF-1 alfanın ve VEGF’nin artışına yol açabileceği
ve bu artışın özellikle aralıklı hipoksi grubunda kümülatif etki nedeniyle daha belirgin
olabileceği, adaptif hipoksi grubunda ise bu etkinin daha düşük düzeyde gözlenebileceği
hipotezlerinin test edilmesi amaçlanmıştır.
Bu amaçla, sistemik olarak uygulanan akut, aralıklı ve adaptif normobarik hipoksi ile kalp
dokusunda HIF-1 alfa ve VEGF ekspresyonundaki değişimler incelenmiştir.
Aralıklı hipoksinin patolojik durumlardan çapraz korunmada (1,2) ve atletlerde egzersiz
performansının artırılmasında önemli etkileri vardır (3). Hipoksi ile HIF-1 ekspresyonu dokuya
özgüdür. Beyin ve dalak, karaciğer ve böbrekten daha duyarlıdır (4). Vogt ve ark. tarafından
yapılan bir çalışmada (5) 3850 m yüksekliğe karşılık gelen aralıklı normobarik hipoksi ile insan
iskelet kasında HIF-1 alfa mRNA’sında artış bulunmakla birlikte Lundby ve ark. (6) 4100
metrede 2 hf ve 8 hf kalan insanlarda iskelet kası örneklerinde HIF-1 alfa, VEGF ve
kapillarizasyonda herhangi bir artış bulamamışlardır. Altı saatlik %10 hipoksi uygulaması (7) ve
3 saatlik %6-9 normobarik hipoksi uygulaması (8) ile rat beyninde VEGF mRNA artışı bulanlar
da mevcuttur. Kalpte hipoksik hasar, oksijen desteği ile ihtiyacı arasındaki dengenin
bozulmasıyla gerçekleşir. Akut ve kronik hipoksiye kardiyovasküler adaptasyonda çeşitli
mekanizmalar öne sürülmektedir. Kronik aralıklı hipokside kan basıncının ve kalp
büyüklüğünün arttığı bulunmuştur (9). İmmünhistokimyasal çalışmalarda HIF-1 alfanın kalp
dokusunda 12 saat/gün 12 gün aralıklı hipoksi ile ekspresyonunun artmadığı fakat nüklear
translokasyonunun gerçekleştiği, buna paralel olarak da VEGF ekspresyonunun arttığı
bulunmuştur (10). Birot ve ark. (11) hipobarik hipoksi ile sol ventrikülde birinci günde, sağ
ventrikülde 18. günde VEGF mRNA’sında artış bulmuş fakat takiben protein seviyesinde
değişiklik gözlememişlerdir. Önceki çalışmalarda uygulanan hipoksilerin süreleri incelendiğinde
çalışmamızda uygulanan protokolden farklılıklar gözlenmektedir. HIF-1 alfa’nın sol ve sağ
ventrikülde ayrı ayrı incelendiği bir çalışma yoktur. Diğer dokularda yapılan çalışmalar da
çelişkili sonuçlar vermektedir. Sunulan proje önerisinin bu açılardan daha önceki bulgulara
katkıda bulunacağı düşünülmektedir. Kalp dokularında moleküler çalışmalarını
gerçekleştirdiğimiz aynı deney hayvanlarının karaciğer dokuları da alınmış ve ayrı bir çalışmada
immünhistokimyasal olarak ısı şoku proteinleri (HSPs) incelenmiştir. Akut ve adaptif hipoksi
gruplarında total hasar ile paralel olarak HSP70’ te diffüz artış saptanmıştır. Bu bulgular
uygulanan hipoksi protokolünün karaciğer hücrelerinde stres oluşturabilecek düzeyde olduğunu
göstermektedir (12).
III. Materyal ve Yöntem
Hayvan deneyleri
Yeni Zelanda türü, 40 adet erkek tavşan ( ağırlıkları: 2012 ± 17 gr) çalışmaya alınmıştır. Yeterli
su ve tavşan yemi sağlanarak ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü uygulanarak,
havalandırması uygun laboratuar koşullarında bir hafta – 10 gün alışma sürecinden sonra
deneylere başlanmıştır. Bu tavşanlar rasgele 4 gruba ayrılmışlardır:
1. Kontrol grubu: Alıştırma sürecinden sonra hipoksi grupları ile aynı dönemlerde anestezi
altında dokuları çıkarıldı.
2. Akut hipoksi grubu : 4 saatlik akut hipoksi uygulamasından sonraki bir saatte dokular alındı
(13).
3. Aralıklı hipoksi grubu 14 gün boyunca günde 4 saat hipoksi uygulandı. 15. gün dokular
toplandı (14).
4. Adaptif grup: Hipoksi süresi birinci gün 10 dk ve her gün 10’ar dk artırılarak 10. gün 100
dk’ ya ulaşıldı. 11. günden itibaren 30 gün boyunca günde 4 saat hipoksi uygulandı. 24 saat
sonra dokular alındı (15).
Tüm hipoksi deneyleri hipoksi kamarasında, normobarik ortamda, 5000 m yüksekliğe karşılık
gelen %11 O2 ile dengelenmiş % 89 N2 karışımı verilerek gerçekleştirildi. 4 saatlik uygulama
sırasında kamaradaki CO2 düzeyi sürekli olarak gözlendi, %0,03’ün üzerine çıkması halinde
kamaranın ventilasyonu ile normale dönmesi sağlandı.
Doku alınması aşamasında tavşanlara intramüsküler Xylazin HCl, ve ketamin anestezisi
uygulandı. Ağrılı uyarana yanıt vermedikleri zaman toraks açılarak çok hızlı bir şekilde kalp
dokusu çıkarıldı. Kalp dokuları sol ve sağ ventriküllerine ayrılarak sıvı azotta şoklama
sonrasında – 80 derecede daha sonraki çalışmalar için saklandı.
Bu çalışmanın sistemik hipoksi uygulamaları ve dokuların alınmasını içeren hayvan deneyleri
daha önce Ankara Üniversitesi BAP tarafından 20020809090 numaralı münferit araştırma
projesi olarak desteklenmiştir ve Dr. Gökhan Karaorman’ın Fizyoloji doktora tezi olarak
yayınlanmıştır (16). Bu proje ile ilgili olarak Ankara Üniversitesi Etik Kurulundan alınan onay
kararının örneği ekte sunulmuştur ( 11.03.2002, karar no: 15-2002/260).
Anılan projede öngörülmeyen moleküler çalışmalar, hipoksi uygulamaları esnasında yapılan
literatür çalışmaları sonucunda planlanmış ve doku örnekleri toplanmıştır.
Moleküler Çalışmalar
RNA İzolasyonu
Kalp sol ve sağ ventriküllerinden total RNA’lar, total RNA izolasyon kiti kullanılarak izole
edildi. Doku homojenizasyonundan sonra spin kolon yöntemi ile kit üreticisinin önerdiği
aşamalar takip edildi. Total RNA konsantrasyonu 260 nm’de ölçüldü. Yeterli konsantrasyonda
olmayan ya da RNA saflığını gösteren A260/280 ve A260/230 oranları 1,8-2 aralığına uymayan
doku örneklerinden total RNA izolasyonları tekrar yapıldı. Tüm örneklerin total RNA bütünlüğü
Şekil 1’de bu uygulama ile ilgili bir örnek görülmektedir.
Şekil 1. %1’lik agaroz jel elektroforezinde Total RNA’lar.
Sırasıyla soldan sağa: K4sağ Ak2sağ Ak5sol Ak5sağ Ak8sol Ak8sağ Ak7sol Ak7sağ.
K: Kontrol grubu Ak: Akut hipoksi grubu
RT-PCR
Her örnekten 2µg total RNA, reverse transkriptaz ile cDNA’ ya çevrildi. Bunun için reverse
transkripsiyon (RT) kiti kullanıldı. RT ürünleri ile tavşan HIF-1α, VEGF ve 18SrRNA’sına
spesifik primerler kullanılarak PCR yapıldı. Primer baz dizilimleri tavşan dokusuna özgü olacak
şekilde Patel ve arkadaşlarının çalışmasından yararlanılarak belirlendi (17). Bu dizilerin seçildiği
gen
bölgeleri
“Entrez
Nucleotide
database”
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Nucleotide&itool=toolbar) kullanılarak kontrol
edildi ve elde edilen PCR ürünlerinin baz sayıları hesaplandı. Ayrıca primerlerin baz dizisi
dikkate alınarak PCR sıcaklıkları ayarlandı. PCR ürünleri (10µl) %2’lik agaroz jelde, etidyum
bromid ile boyanarak 100 voltta 1 saat yürütüldü. Tablo 1’de ayrıntılar görülmektedir.
Tablo 1. HIF-1 alfa, VEGF ve 18S rRNA için primer dizileri ve PCR şartları.
Primer Dizisi
HIF-1α
forward: 5’–CCACAGGACAGTACAGGATG - 3’
reverse: 5’–TCAAGTCGTGCTGAATAATACC -3’
VEGF
forward: 5’- CGAGACCTTGGTGGACATC - 3’
reverse: 5’ –CTGCATGGTGACGTTGAAC - 3’
18S rRNA
(kontrol geni)
forward: 5’– CGGCGACGACCCATTCGAAC - 3’
reverse: 5’–GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC-3’
Baz
Sayısı
150
bp
151
bp
99
bp
PCR Programı
(30 siklus)
94˚C (3dk) / 94˚C (30sn) - 57˚C (30sn) - 72˚C
(1dk) / 72˚C (5dk)
94˚C (3dk) / 94˚C (30sn) - 54˚C (30sn) - 72˚C
(1dk) / 72˚C (5dk)
94˚C (3dk) / 94˚C (30sn) - 64˚C (30sn) - 72˚C
(1dk) / 72˚C (5dk)
mRNA Analizi
Agaroz jeldeki mRNA bantları UV altında görüntülenerek dijital kamera ile bilgisayara
aktarıldı. Elde edilen bantların aranan spesifik mRNA’ya ait olup olmadığı, daha önce
hesaplanan baz sayılarının baz sayısı bilinen DNA marker’ı ile karşılaştırılması sonucu
kesinleştirildi. Bunun için “PhiX174 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker, 9” kullanıldı. Şekil 2’de
marker’a ait önerilen görüntü verilmiştir. Bant yoğunlukları dansitometre programı (Image J) ile
ölçülerek, VEGF ve HIF-1α’nın rölatif miktarları; 18S rRNA yoğunluğuna oranlanarak bulundu.
Tüm ölçümler farklı zamanlarda üçer kez yapılarak ortalamaları alındı.
Şekil 2. “PhiX174 DNA/BsuRI (HaeIII)
Marker, 9” un %1.7’lik agaroz jeldeki (sol)
ve %5’lik poliakrilamid jeldeki (sağ )
görüntüsü.
IV. Analiz ve Bulgular
İstatistiksel Analiz
Elde edilen sonuçlar hem kontrol ve farklı sürelerdeki hipoksi grupları arasında, hem de sol ile
sağ ventrikülün kendi arasında karşılaştırıldı. Dört grubu ve üç grubu içeren ANOVA testleri ile
hipoksi grupları birbirleri ile ve kontrol grubu ile karşılaştırıldı. P değerinin 0,05’e eşit ya da
küçük olduğu durumlarda Post Hoc testlerle (Tukey, Bonferroni) gruplar arası ilişkiler kontrol
edildi. Aynı deney hayvanlarının kalplerinin sol ve sağ ventriküllerindeki ekspresyon değerleri
Paired t testi ile karşılaştırıldı. Değerler arasında standart hatanın yüksek olduğu durumlarda
analizler nonparametrik testlerle kontrol edildi.
Bulgular
1. Sol ventrikül HIF-1 alfa mRNA ekspresyonları deney grupları arasında karşılaştırıldığında
akut hipoksi ve aralıklı hipoksi gruplarında kontrol grubuna göre bir artış gözlenmiştir. Fakat bu
artış istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Adaptif grupta kontrol seviyelerine geri dönülmüştür
(Şekil 3, A ve B).
2. Sol ventrikül VEGF mRNA ekspresyonları deney grupları arasında karşılaştırıldığında akut
hipoksi ve aralıklı hipoksi gruplarında kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış
gözlenmiştir. Adaptif grupta değişiklik olmamıştır (Şekil 4, A ve B).
3. Sağ ventrikülde her iki gen ekspresyonu deney grupları arasında karşılaştırıldığında anlamlı
bir değişim gözlenmemiştir (Şekil 3 B, 4 B, 5 A ve B).
4. İki ventrikül her bir deney grubunda aynı genlerin ekspresyonları açısından birbirleriyle
karşılaştırıldığında sağ ventrikül HIF-1 alfa mRNA’sı kontrol gruplarında sol ventriküle göre
anlamlı ölçüde yüksek bulunmuştur. Sağ ventrikül VEGF mRNA’sında da kontrol grubunda
aynı eğilim olmakla birlikte anlamlı değildir. Diğer deney gruplarında bu iki gen, iki ventrikül
arasında farklı eksprese olmamıştır (şekil 6A, 6B ve 7).
A)
1353
1078
872
603
HIF-1 alfa
(150 bp)
310
281
234
194
18S rRNA
(99 bp)
118
72
M bp K AH ArH
K
AH
ArH
B)
Şekil 3. (A) Deney gruplarında sol ventrikül HIF-1 alfa mRNA ekspresyonlarının
görüntülendiği %2’lik agaroz jel örneği.
M: Marker, bp: base pair, AH: Akut Hipoksi, Ar H: Aralıklı Hipoksi
(B) Sol ventrikül ve sağ ventrikülde, dört deney grubunda HIF-1 alfa mRNA ekspresyonlarının
18S rRNA ekspresyonlarına oranları. Değerler ortalama ± standart hata olarak verilmiştir.
A)
VEGF
(151 bp)
18S rRNA
(99 bp)
M
K
AH
ArH
K
AH
ArH
B)
Şekil 4. (A) Deney gruplarında sol ventrikül VEGF mRNA ekspresyonlarının görüntülendiği
%2’lik agaroz jel örneği. M: Marker, AH: Akut Hipoksi, Ar H: Aralıklı Hipoksi
(B) Sol ventrikül ve sağ ventrikülde , dört deney grubunda VEGF mRNA ekspresyonlarının 18S
rRNA ekspresyonlarına oranları. Değerler ortalama ± standart hata olarak verilmiştir.
* P< 0,05 (t testi ve ANOVA ile kontrol grubuna göre farklılık vardır).
A)
HIF-1 alfa
(150 bp)
18S rRNA
(99 bp)
M
K
AH ArH
K
AH ArH
VEGF
(151 bp)
18S rRNA
(99 bp)
B)
M
K
AH ArH
K
AH ArH
Şekil 5. Deney gruplarında sağ ventrikül HIF-1 alfa mRNA (A) ve VEGF mRNA (B)
ekspresyonlarının görüntülendiği %2’lik agaroz jel örnekleri.
A)
HIF-1 alfa
(150 bp)
18S rRNA
(99 bp)
M Ksol Ksol Ksağ Ksağ Ksol Ksol Ksağ Ksağ
B)
Şekil 6. (A) Kontrol grubunda sol ventrikül ve sağ ventrikülde HIF-1 alfa mRNA
ekspresyonlarının görüntülendiği %2’lik agaroz jel örneği. M: Marker, K: Kontrol
(B) Sol ventrikül ve sağ ventrikülde, dört deney grubunda HIF-1 alfa mRNA ekspresyonlarının
18S rRNA ekspresyonlarına oranları. Değerler ortalama ± standart hata olarak verilmiştir.
* P< 0,05 (kontrole göre).
Şekil 7. Sol ventrikül ve sağ ventrikülde , dört deney grubunda VEGF mRNA ekspresyonlarının
18S rRNA ekspresyonlarına oranları. Değerler ortalama ± standart hata olarak verilmiştir.
V. Sonuç ve Öneriler
Sunulan çalışmanın anlamlı sonuçlarını özetlemek gerekirse 1. Akut sistemik hipoksi
uygulaması ile tavşan kalpleri sol ventriküllerinde VEGF mRNA ekspresyonları, normoksik
kontrol gruplarına göre anlamlı derecede artış göstermiştir. 2. Aralıklı hipoksi uygulaması ile
akut hipoksinin etkisi azalmış olmakla birlikte VEGF mRNA ekspresyonlarında farklı derecede
artış devam etmektedir. 3. Sağ ventrikülde bazal HIF-1 alfa mRNA seviyesi solunkinden
anlamlı ölçüde yüksek bulunmuştur.
Kalbin hipoksik hasarı, oksijen desteği ile talebi arasındaki dengesizlik nedeniyle olur. Oksijen
ihtiyacı, kalp kasının kontraktilitesi, sistolik duvar gerimi, bazal metabolik hız ve kalp hızı gibi
faktörler tarafından belirlenir. Oksijen desteğini ise miyokardiyal kan akımı ve/veya kanın
oksijen taşıma kapasitesi ve parsiyel oksijen basıncı etkiler (18). Bu faktörlerden biri olan
koroner anjiyogenezin akut ve /veya kronik aralıklı hipoksi ile indüklendiği ve bu etkide HIF-1
alfa/VEGF sinyal mekanizmasının rol aldığı bir çok araştırıcı tarafından bildirilmiştir. Örneğin
klinik bir çalışmada koroner kalp hastalığı olan hastalar maksimum 4200 metreye ulaşacak
şekilde simüle edilen aralıklı hipoksiye maruz kaldıklarında 6 ay sonra myokardiyal
perfüzyonlarında artış saptanmıştır (19). Kalpte fonksiyon bozukluğu oluşturmayan ve enerji
durumunda major değişime yol açmayan kısa sikluslu ve ılımlı, aralıklı hipoksi uygulaması ile
tavşan kalbinde HIF-1 alfa yolağı uyarılmıştır (20).
Nitekim koroner arter hastalarında yapılan çok yeni bir çalışmada koroner kollateralizasyonu
olan hastalarda lökosit HIF-1 alfa ekspresyonları yüksek bulunmuştur ve iskemik anjiyogenezde
bu yolun etkili olduğunu savunmuşlardır (21).
Çalışmamızda farklı sürelerde uygulanan deney gruplarında kalpte her iki ventrikülde de HIF-1
alfa mRNA ekspresyonlarında artış gözlenmemiştir.
Bunun sebeplerinden birisi HIF 1 alfanın stabilitesindeki güçlük nedeniyle deneysel olarak
gösterilmesindeki zorluktan kaynaklanabilir. HIF-1 alfa, oksijenin yeterli olduğu durumlarda
inaktiftir. Hipoksi ile degredasyonu önlenir ve akümüle olarak nüklear translokasyona uğrar.
Nükleusta transkripsiyon görevini gerçekleştirir. Bununla birlikte bazal seviyede de HIF-1 alfa
eksprese olur. Hipoksi uygulaması sonrasında kalp dokularının alınmasına kadar geçen sürede
dokuların reoksijenasyona maruz kalması HIF-1 alfanın ani degredasyonuna yol açmış olabilir.
12 gün boyunca ve günde 12 saat uygulanan aralıklı hipoksi çalışmasında HIF-1 alfa
ekspresyonu artmamış, fakat immunhistokimyasal olarak incelendiğinde miyokard hücrelerinin
çekirdeğine transloke olduğu gösterilmiştir. Ardından VEGF ekspresyonu da artmış olarak
bulunmuştur (10). Çalışmamızda sol ventrikülde HIF-1 alfa ekspresyonunun artamayıp VEGF
ekspresyonunun artmasının nedenlerinden biri bu olabilir. Bunu açığa çıkarmak için ileriki
çalışmalarda histolojik yöntemlerle HIF-1 alfanın hücre içindeki davranışı incelenebilir.
HIF-1 alfanın değişimlerini fark etme zorluğu uygulanan yöntemde değişiklikler yapılarak
aşılabilir. Tüm deneylerin standart ve aynı şartlarda gerçekleştirilmesine çok dikkat edilmiştir.
RT-PCR ve agaroz jel, bilinen ve çok kullanılan bir yöntem olmakla birlikte çalışmanın agaroz
jelde yürütme ve bantların sayısallaştırılması aşamasında her ne kadar tüm ölçümler 3’er kere
yapıldıysa da standardizasyon çok yeterli olmamaktadır. Bu da kullanılan yöntemin
hassasiyetini azaltmaktadır. Böylece ölçümler arasındaki standart hatalar arttığından eğilim
olmakla birlikte istatistiksel anlamlılığa ulaşılamamıştır. Örneğin HIF-1 alfa’nın sol ventrikülde
ve sağ ventriküldeki gruplar arası değişim trendi aynı olmakla birlikte p değeri 0,05’ten
büyüktür.
Daha ileriki çalışmalarda PCR ürünlerinin direkt olarak sayısal değerlere dönüştürülebildiği
real-time PCR gibi yöntemlere geçilmesi planlanmaktadır. Bununla birlikte insanlarda yapılan
benzer bir çalışmada deniz seviyesinden 4100 m yüksekliğe çıkarılan denekler 2 ya da 8 hafta
boyunca hipoksik hipokside kalmışlar ve iskelet kası örneklerinde kas lifi değişiklikleri,
kapillarizasyon, HIF-1 alfa ve VEGF ekspresyonları incelenmiştir. Aklimatizasyonla bu
parametrelerin hiçbirinde bir değişim gözlenmemiştir. Üstelik “fluorescence-based real-time
PCR” gibi daha sensitif ve “ATPase histochemistry analysis” gibi daha görsel yöntemler de
kullanılmıştır (6).
Tüm bunlara ek olarak uygulanan hipoksinin ılımlı düzeyde (%11) olması ve HIF-1 alfa’nın
indüklenmesine yeterli olmaması da bir neden olabilir. Bununla birlikte bu gerekçe VEGF deki
artış ile çelişmektedir.
Hipoksiye hücresel yanıtta VEGF’ nin farklı dokularda rol aldığı bilinmektedir. Yüksek irtifa
deneylerinde ve dağcılıkta ortaya çıkan akut dağ hastalığında akciğer ve beyin ödeminde VEGF’
nin aracı olduğu çeşitli çalışmalarda öne sürülmüştür. Böyle bir çalışmada ratlara 4 saat 8000 m
akut hipoksi ve 4 saat /gün 2 hafta 5000 m aralıklı hipoksi uygulanmış ve plazma ve akciğerde
VEGF seviyesi ve mRNA’sının hipoksiyle artmış olduğu bulunmuştur. VEGF, akut hipokside
aralıklı hipoksiden daha fazla artmış ve bununla paralel olarak akut hipoksi grubunda
akciğerden sıvı kaçışı gözlenmiştir. Ratların aklimatize oldukları süreler uzadıkça VEGF
ekspresyon seviyesi düşmüş ve sıvı kaçışı da azalmıştır. Bu çalışmada ve bir diğerinde hipoksik
akciğer ödeminde hipoksinin indüklediği VEGF artışının rolü tartışılmıştır (22, 23).
Çalışmamızda VEGF’ nin tavşan kalbinde gösterdiği artış benzer bir patern göstermektedir.
Akut hipoksi grubunda belirgin ve aralıklı hipoksi grubunda daha az olup adaptif grupta
normoksik seviyelere dönmüştür. Bu patern aklimatizasyonla açıklanabilir. Hipoksik hipoksiye
bağlı beyin ödemi ve akut dağ hastalığında da vasküler dinamik değişikliklerle serum VEGF
seviyeleri ilişkili bulunmuştur (24, 25).
HIF-1 alfa, VEGF’ nin ve benzeri diğer anjiyogenik faktörlerin transkripsiyon faktörüdür.
VEGF’ deki değişikliklerin HIF-1 alfadaki artışı takip etmesi beklenir. Bunun yanında VEGF
artışında başka aracı yollar etken olabilir. Çalışmamızda HIF 1 alfa’da değişim gözlenmezken
VEGF’ deki anlamlı artış VEGF’ nin başka aracı mekanizmalarla da uyarılabileceğini akla
getirmektedir. En son Nature dergisinde yayınlanan bir çalışmada iskelet kasında oksijen ve
besin eksikliğinde uyarılan ve VEGF artışına ve vaskülarizasyona yol açan, PGC-1alpha (
peroxisome-proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha) adı verilen yeni bir
transkripsiyonal koaktivatör ortaya çıkarılmıştır (26). Gelecekteki çalışmalarda bu etkileşim kalp
dokusunda incelenebilir.
Sunulan çalışmada kalp dokusunu sol ve sağ ventriküllerine ayırarak incelemedeki amaçlar, hem
sol ventrikülün metabolik olarak daha aktif olması ve daha fazla oksijen tüketmesi nedeniyle
sağdan farklı olabileceği hem de sağ ventrikülün uzamış hipoksilerde hipertrofiye uğrayarak
hipoksiye adaptasyonda soldan farklı yanıtlar verebileceği olasılıkları nedeniyledir. VEGF artışı
sadece sol ventrikülde ve akut ve 14 günlük aralıklı hipoksi gruplarında görülmüştür.
Hipoksik anjiyogenezde HIF/VEGF yolağı ile ilgili tüm çalışmalar birbiriyle uyumlu değildir.
Beklenmedik sonuçlar bazen elde edilebilmektedir. Birot ve arkadaşları VEGF mRNA’ sında
hipoksinin birinci gününde sol ventrikülde, 18. gününde sağ ventrikülde artış bulmuşlardır.
Fakat takiben protein ekspresyonunda artış görememişlerdir (11).
Çalışmamızda ayrıca tüm deney gruplarında sağ ventrikül HIF-1 alfa mRNA ekspresyonları sol
ventriküle göre yüksek bulunmuştur. Bunlardan sadece kontrol grubundakiler istatistiksel olarak
anlamlıdır. Diğer gruplardaki eğilim de bu bazal yükseklikten kaynaklanmaktadır. Çünkü zaten
bu çalışmada hipoksi uygulamasıyla HIF ekspresyonunda değişiklik olmamıştır. Bazal
değerlerdeki bu farklılığın nedeni de bilinmemektedir. Sağ ventrikül HIF-1 alfa ekspresyonu
sola göre kontrol ve akut hipoksi gruplarında değişmeyip aralıklı ve adaptif hipoksi gruplarında
anlamlı farklı bulunsaydı, bu artış kronik hipoksinin sağ ventrikül üzerindeki hipertrofik etkisi
ile ilişkilendirilebilirdi.
Aralıklı hipoksi, oksijen taşınımını ve enerji kullanımını modifiye eder, solunum ve kan basıncı
kontrol mekanizmalarını değiştirir ve kardiyovasküler sistemde kalıcı değişikliklere neden
olabilir. Deneysel hipobarik aralıklı hipoksiye örnek dağcılık ve havacılıkta olduğu gibi yüksek
irtifadır. Yüksek irtifada hipoksi ile kalbin gerçekleştirdiği işte artış ortaya çıkar. Bu
kardiyovasküler etkiler, kalp hastalığı olan hastaların yüksekliğe toleransı ile ilgili sorunlar
ortaya çıkarabilir. 2500-3000 metrelerde stabil koroner hastalığı olanlar için sorun oluşmazken
adaptasyonun ilk 3-4. günlerinde özellikle fiziksel aktiviteler deniz seviyesindeki kadar
olamayabilir. Yolcu uçaklarında yaklaşık 1500 - 2400 metre yükseklikler yaşanmaktadır. Çoğu
kalp hastaları bunu tolere edebilirken 2-3 haftalık kalp operasyonu hikayesi olanlar, son 6
haftada MI geçirenler tehlike arz edebilir. 3500 metre ve üstü hakkında yeterli bulgu yoktur
(27). Bu hastaların yükseklikte egzersiz kapasitesi araştırıldığında akut koroner olay sonrası
revaskülarizasyondan en az 6 hafta sonra, düşük riskli hastalarda, yükseklikteki egzersizde
oksijen talebi ve laktat seviyeleri daha yüksek olmasına rağmen 3454 metrede hızlı çıkış ve
submaksimal egzersiz güvenli olarak belirlenmiştir (28).
Yükseklik çalışmaları hipoksinin zararlarını minimuma indirerek ve faydalarını öne çıkararak
devam etmektedir. Son zamanlarda “living high training low (LHTL)” olarak adlandırılan ve
atletik performansı artırmaya yönelik araştırmalarda aerobik performansı ve eritrosit volümünü
yüksek tutmak amaçlanırken diğer zararlı etkilerin (immün sistem baskılanması, pulmoner
ödem, beyin ödemi gibi kardiyovasküler yan etkiler) oluşmayacağı hipoksi derecesi ve süresi
belirlenmeye çalışılmaktadır.
Bu çalışmalardan birinde maksimum 3000 metre yükseklikte (önceki bir kaç gün daha aşağıda
bulunarak) en az 18 gün, ve günde minimum 12 saat bulunmanın performansa etkili ve zararsız
olabileceği sonucuna ulaşılmıştır (29).
Hipoksi çalışmalarında araştırılan klinik yararlardan biri de kalpteki koruyucu etkidir. Aralıklı
hipoksik adaptasyon miyokard hasarını koruyucu etkiye sahiptir (2) ve bu etki kronik sürekli
hipokside de gözlenebilir. Fakat kronik sürekli hipokside yan etkiler daha fazladır. Yükseklerde
yaşamayanlar için aralıklı hipoksi uygulaması daha kolaydır. Kalbi koruyucu etkinin altında
yatan mekanizmalar geniş olarak araştırılmaktadır. Örneğin, aralıklı hipoksi ile daha etkin hale
gelen miyokardda damarlanma, koroner kan akımı, kalp miyoglobini aracılığı ile kalbin oksijen
alımının etkilenmesi, ve enerjetik metabolizma değişiklikleri kalp koruyucu etki mekanizmasını
açıklayabilir. Çeşitli sinyal iletimi yolları; adrenoreseptörler, prostaglandinler, adenosinerjik
sistemler, antioksidan enzimleri stres proteinleri ve hipoksi ile indüklenen faktörler gibi, aralıklı
hipoksinin kalpteki koruyucu etkisinde rol alabilir (30). Ayrıca Asemu ve arkadaşları aralıklı
hipoksi ile kalbin iskemik ventriküler aritmilere daha dayanıklı hale geldiğini bulmuşlardır (31).
Hipoksinin etkilerinde kalpteki bu aracı mekanizmaları ortaya çıkarmak ve fayda/zarar
dengesini fayda yönüne kaydıracak şekilde optimal uygulama koşullarını belirlemek açısından
çalışmamızın sonuçları literatürdeki diğer çalışmalara katkıda bulunacaktır.
VI. Kaynaklar
1. Meerson FZ, Ustinova EE, Manukhina EB. Prevention of cardiac arrhythmias by adaptation
to hypoxia: regulatory mechanisms and cardiotropic effect. Biomed Biochim Acta 48(2-3): S83S88, 1989.
2. Xi L, Tekin D, Gursoy E, Salloum F, Levasseur JE, Kukreja RC. Evidence that iNOS acts as
a trigger and mediator of late preconditioning induced by acute systemic hypoxia: lack of role
for eNOS, COX-2, and HSP90. Am J Physiol-Heart Circ Physiol 283(1): H5-H12, 2002.
3. Fulco CS, Rock PB, Cymerman A. Improving athletic performance: is altitude residence or
altitude training helpful? Aviat Space Environ Med 71(2): 162-171, 2000.
4. Stroka DM, Burkhardt T, Desbaillets I, Wenger RH, Neil DA, Bauer C, Gassmann M,
Candinas D. HIF-1 is expressed in normoxic tissue and displays an organ-specific regulation
under systemic hypoxia. FASEB J 15(13): 2445-2453, 2001.
5. Vogt M, Puntschart A, Geiser J, Zuleger C, Billeter R, Hoppeler H. Molecular adaptations in
human skeletal muscle to endurance training under simulated hypoxic conditions. J Appl
Physiol 91(1): 173-182, 2001.
6. Lundby C, Pilegaard H, Andersen JL, van Hall G, Sander M, Calbet JA. Acclimatization to
4100 m does not change capillary density or mRNA expression of potential angiogenesis
regulatory factors in human skeletal muscle. J Exp Biol 207(Pt 22): 3865-3871, 2004.
7. Chavez JC, Agani F, Pichiule P, LaManna JC. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha
in the brain of rats during chronic hypoxia. J Appl Physiol 89(5): 1937-1942, 2000.
8. Xu F, Severinghaus JW. Rat brain VEGF expression in alveolar hypoxia: possible role in
high-altitude cerebral edema. J Appl Physiol 85(1): 53-57, 1998.
9. Kraiczi H, Magga J. Hypoxic pressor response, cardiac size, and natriuretic peptides are
modified by long-term intermittent hypoxia. J Appl Physiol 87(6): 2025-2031, 1999.
A. Molecular and morphological modifications occurring in rat heart exposed to intermittent
hypoxia: role for protein kinase C alpha. Exp Gerontol 39(3): 395-405, 2004.
11. Birot OJ, Peinnequin A, Simler N, van Cuyck-Gandre H, Hamel R, Bigard XA. Vascular
endothelial growth factor expression in heart of rats exposed to hypobaric hypoxia: differential
response between mRNA and protein .J Cell Physiol 200(1): 107-115, 2004.
12. Tokyol C, Karaorman G, Bastug M. Effects of Acute and Adaptive Hypoxia on Heat Shock
Protein Expression in Hepatic Tissue. High Alt Med Biol 6(3): 247-255, 2005.
13. Böning D, Maassen N, Thomas A, Steinacker JM. Extracellular pH defense against lactic
acid in normoxia and hypoxia before and after a Himalayan expedition. Eur J Appl Physiol 84(12): 78-86, 2001.
14. Clanton TL Klawitter PF. Invited review: Adaptive responses of skeletal muscle to
intermittent hypoxia: the known and the unknown. J Appl Physiol 90(6): 2476-2487, 2001.
15. Manukhina EB, Mashina SYu, Smirin BV, Lyamina NP, Senchikhin VN, Vanin AF,
Malyshev IYu. Role of nitric oxide in adaptation to hypoxia and adaptive defense. Physiol Res
49(1):89-97, 2000.
16. Akut ve aralıklı hipoksi uygulamasının tavşanlarda trombosit fonksiyonları üzerine etkisi;
antioksidan savunma mekanizmalarının rolü” 2005, ANKARA, BAP proje destek no:
200208090090
17. Patel TH, Kimura H, Weiss CR, Semenza GL, Hofmann LV. Constitutively active HIF-1a
improves perfusion and arterial remodeling in an endovascular model of limb ischemia.
Cardiovasc Res 68:144–154, 2005.
18. Ardehali A, Ports TA. Myocardial oxygen supply and demand. Chest 98:699-705, 1990.
19. del Pilar Valle M, García-Godos F, Woolcott OO, Marticorena JM, Rodríguez V, Gutiérrez
I, Fernández-Dávila L, Contreras A, Valdivia L, Robles J, Marticorena EA. Improvement of
myocardial perfusion in coronary patients after intermittent hypobaric hypoxia. J Nucl Cardiol
13(1):69-74, 2006.
20. Ning XH, Chen SH, Buroker NE, Xu CS, Li FR, Li SP, Song DS, Ge M, Hyyti OM, Zhang
M, Portman MA. Short-cycle hypoxia in the intact heart: hypoxia-inducible factor 1alpha
signaling and the relationship to injury threshold. Am J Physiol Heart Circ Physiol 292(1):H333H341, 2007.
21. Song-Ming C, Yu-Guang L, Hong-Xuan Z, Guo-Hong Z, Jia-Ru L, Chun-Jiang T, DongMing W, Xiao-Yi F, Rui-Qin M. Hypoxia-inducible factor-1alpha induces the coronary
collaterals for coronary artery disease. Coron Artery Dis 19(3):173-179 2008.
22. Yang X, Xie Y, Zhang D. Research on the relationship between expression of VEGF and
high altitude pulmonary edema. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 80(12):931-5, 2000.
23. Kaner, Robert J., and Ronald G. Crystal. Pathogenesis of high altitude pulmonary edema:
Does alveolar epithelial lining fluid vascular endothelial growth factor exacerbate capillary leak?
High Alt. Med. Biol. 5:399–409, 2004.
24. Palma J, Macedonia C, Deuster P, Olsen C, Mozayeni BR, Crutchfield KE. Cerebrovascular
dynamics and vascular endothelial growth factor in acute mountain sickness. Wilderness Environ
Med 17(1):1-7, 2006.
25. Tissot van Patot MC, Leadbetter G, Keyes LE, Bendrick-Peart J, Beckey VE, Christians U,
Hackett P. Greater free plasma VEGF and lower soluble VEGF receptor-1 in acute mountain
sickness. J Appl Physiol 98: 1626–1629, 2005.
26. Arany Z, Foo SY, Ma Y, Ruas JL, Bommi-Reddy A, Girnun G, Cooper M, Laznik D,
Chinsomboon J, Rangwala SM, Baek KH, Rosenzweig A, Spiegelman BM. HIF-independent
regulation of VEGF and angiogenesis by the transcriptional coactivator PGC-1alpha. Nature
21;451 (7181):1008-12, 2008.
27. Bernheim A. High altitude and cardiac disease. Schweiz Rundsch Med Prax 9;94(45):17604, 2005.
28. Schmid JP, Noveanu M, Gaillet R, Hellige G, Wahl A, Saner H. Safety and exercise
tolerance of acute high altitude exposure (3454 m) among patients with coronary artery disease.
Heart 92(7):921-5, 2006.
29. Brugniaux JV, Schmitt L, Jeanvoine PRH, Nicolet HZG, Fouillot ADJ-P, Richalet J-P.
Living high-training low: tolerance and acclimatization in elite endurance athletes Eur J Appl
Physiol 96: 66–77, 2006.
30. Zhuang J, Zhou Z. Protective effects of intermittent hypoxic adaptation on myocardium and
its mechanisms. Biol Signals Recept 8(4-5):316-22, 1999.
31. Asemu G, Neckár J, Szárszoi O, Papousek F, Ostádal B, Kolar F. Effects of adaptation to
intermittent high altitude hypoxia on ischemic ventricular arrhythmias in rats. Physiol Res
49(5):597-606,2000.
VII. Ekler
Bu proje ile sarf malzemesi alınmış ve tamamına yakını kullanılmıştır. M makine ve
teçhizat malzeme alınmamış, laboratuarımızda var olan koşullardan faydalanılmıştır.
Çalışmamız bir yıllık hızlandırılmış kapsamda olduğundan sonuçlar henüz elde
edilmiştir. Önümüzdeki dönemde 1. Türk Fizyolojik Bilimler Derneği 2008 Ulusal
Kongresine bildiri olarak götürülecektir. 2. “High Altitude Medicine” ya da benzeri bir
hakemli yurt dışı dergiye göndermek üzere makale olarak hazırlanacaktır.