DOMUZ YETĠġTĠRME ÇĠFTLĠĞĠNĠN ÇEVRESĠNDE
advertisement
T.C. GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ MĠKROBĠYOLOJĠ ANA BĠLĠM DALI DOMUZ YETĠġTĠRME ÇĠFTLĠĞĠNĠN ÇEVRESĠNDE BULUNAN TOPRAK ÖRNEKLERĠNDEN ĠZOLE EDĠLEN ANTĠBĠYOTĠK DĠRENÇLĠ BAKTERĠLERĠN FENOTĠPĠK VE GENOTĠPĠK ÖZELLĠKLERĠ DOKTORA TEZĠ MELĠKE EKĠZOĞLU Tez DanıĢmanı Prof.Dr. Nedim Sultan ANKARA Temmuz 2007 i ĠÇĠNDEKĠLER Kabul ve Onay i Ġçindekiler ii Resimler v ġekiller vi Tablolar vii Grafikler viii Semboller, Kısaltmalar ix 1. GĠRĠġ 1 2. GENEL BĠLGĠLER 4 2.1.Antibiyotik Direnci ve Önemi 4 2.2.Hayvancılıkta Antibiyotik Kullanımı ve Direnç GeliĢimine 6 Olan Etkisi 2.3.Antibiyotik Kullanımını Sınırlamaya Yönelik Politikalar ve 12 Uygulamalar 2.3.1.Ülkemizdeki Durum 12 2.3.2.Avrupa Birliğine Üye Ülkelerdeki Durum 13 2.3.3.Amerika BirleĢik Devletleri‟ndeki Durum 13 2.4.Antibiyotik Direncinin Transferi 14 2.4.1.Horizontal Gen Transfer Mekanizmaları 14 2.4.1.1.Transformasyon 15 2.4.1.2.Transdüksiyon 16 2.4.1.3.Konjugasyon 17 2.4.2.Yer DeğiĢtirebilen Genetik Elementler 18 2.4.2.1.Plazmidler 20 2.4.2.2.Transpozonlar (Tn) 20 2.4.2.3.Ġntegronlar 22 2.5.Direnç Mekanizmaları 23 2.6.Tez ÇalıĢmasında Kullanılan Antibiyotikler Hakkında 25 ii Genel Bilgiler 2.6.1.Tetrasiklinler 27 2.6.2.Eritromisin 27 2.7. Çevresel Ġzolatlarda Antimikrobik Direncin Ölçülmesi 28 3. GEREÇ ve YÖNTEM 30 3.1.Toprak Örneklerinin Toplanması 30 3.2.Tezde Kullanılan Antibiyotikler 32 3.3.Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu 32 3.4.Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi 35 3.4.1.Agar Dilüsyon Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini 35 3.4.2.E-Test Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini 36 3.5.Genomik DNA‟nın Ġzolasyonu 36 3.6.Bakterilerin Tanımlanması 38 3.6.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA 38 Geninin Amplifikasyonu 3.6.2.Dizi Analizi ÇalıĢmaları 41 3.6.3.BLAST Programı 41 3.7.Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik 42 3.7.1.Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması 42 3.7.2.Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması 45 Özellikleri 4. BULGULAR 4.1.Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu 47 47 4.2.Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi 49 4.3.Genomik DNA‟nın Ġzolasyonu 53 4.4.Bakterilerin Tanımlanması 54 4.4.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA 54 Geninin Amplifikasyonu 4.4.2.Dizi Analizi ÇalıĢmaları 55 4.4.3.BLAST Programı 55 4.5.Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik 58 iii Özellikleri 4.5.1.Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması 58 4.5.2.Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması 59 5.TARTIġMA 61 6.SONUÇ 71 7.ÖZET 73 8.SUMMARY 75 9.KAYNAKLAR 77 10.EKLER 90 11.TEġEKKÜR 94 12.ÖZGEÇMĠġ 95 iv RESĠMLER Resim Sayfa no. 1: E-test yöntemiyle antibiyotik duyarlılığı ölçülmüĢ iki bakteri 49 2: Genomik DNA‟nın agaroz jel elektroforezinde görülen bantları 54 3: 16S rRNA geninin V3 fragmanının PZR ile amplifikasyonu 55 4: Ġki farklı izolatta tet(Q) gen bölgelerinin agaroz jel elektroforezi 58 görüntüleri v ġEKĠLLER ġekil Sayfa no. 1: Seçici baskı altında mikropların antimikromikrobiyal 8 maddelere direnç geliĢtirmesinin ve bu direncin yayılımının Ģematik olarak gösterilmesi. 2: Antimikrobik direncin çevrede yayılımı 12 3: Direnç genlerinin aktarım mekanizmaları: 15 A: Transdüksiyon B: Konjugasyon C: Transformasyon 4: Bakteri hücreleri arasında DNA transferi 19 5: Bakteriyel kompozit transpozonların yapısı 21 6: Ġnsersiyon sekanslarının yapısı 21 7: Doğada konjugatif transpozonlar yoluyla aktarılan genler 22 ve geniĢ konak hücre spektrumları 8: Kare biçimindeki tarladan örneklerin toplandığı noktalar 31 9: Dirençli bakterilerin topraktan izolasyonu aĢamaları 34 10:Bakterilerin tanımlanması deneyleri akıĢ Ģeması 42 vi TABLOLAR Tablo Sayfa no. 1: Antibiyotik kullanımında kilometre taĢları 5 2: Antibiyotikler ve kullanıldıkları alanlar 11 3: Tetrasiklin (tet) ve oksitetrasiklin direnç (otr) genleri ve ilgili 27 oldukları direnç mekanizmaları 4: Toprak örneklerinin alındığı günler 31 5: tet genlerinin PZR ile amplifikasyonu için kullanılan primerler ve 44 özellikleri 6: erm genlerinin PZR ile amplifikasyonu için kullanılan primerler ve 46 özellikleri 7: Toprak ve gübre örneklerinden izole edilen antibiyotik dirençli 48 bakterilerin elde edildikleri bölge ve zaman bakımından dağılımı 8: Topraktan ve gübreden izole edilen bakterilerin filogenetik 57 özellikleri 9: Tetrasiklin direnç genlerinin bakteri suĢlarına ve örneklerin alınma 60 zamanına göre dağılımı 10: Tanımlanan tüm izolatların antibiyotik duyarlılıkları ve filogenetik 89 özellikleri vii GRAFĠKLER Grafik Sayfa no. 1: Topraktan izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri 50 2: Gübreden izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri 51 viii SEMBOLLER, KISALTMALAR BLAST Basic local alignment search tool Bp: Baz çifti CLSI Clinical and laboratory standards institute DNA: Deoksiribonükleik asit DNBA Dilüe nutrient broth agar dNTP: Deoksiribonükleotittrifosfat ddNTP: Dideoksiribonükleotittrifosfat EDTA: Etilendiamin tetra asetik asit FDA: Food and drug administration GPS: Global positioning system Ha: Hektar Kb: Kilobaz LC-MS Liquid chromatography-mass spectroscopy MĠK: Minimum inhibisyon konsantrasyonu NCCLS: National committee for clinical laboratory standards PZR: Polimeraz zincir reaksiyonu rRNA Ribozomal ribonükleik asit TAE: Trisasetat EDTA TBE: Trisborat EDTA Tris: Trihidroksietanolamin VRE: Vankomisin dirençli enterokok ix 1. GĠRĠġ Antibiyotiklerin keĢfinin ardından enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde yeni bir dönemin baĢladığı ve bulaĢıcı hastalıklar çağının sona erdiği düĢünülmüĢ olsa da piyasaya sürüldükten sadece 4 yıl sonra penisilin dirençli enfeksiyonlar klinikte önem kazanmaya baĢlamıĢtır. Günümüzde pek çok bakteri, birden fazla antibiyotiğe dirençli olabilmekte ve tedavi edilemeyen enfeksiyonlara yol açabilmektedir. Antibiyotik direnci antibiyotik kullanımının doğal sonucudur. Bu nedenle antibiyotikler sadece gerektiği durumlarda, uygun konsantrasyonda ve sürede kullanılmalıdırlar1. Antibiyotiklerin yaygın olarak kullanıldığı alanlardan biri de hayvancılık sektörüdür. Antibiyotikler hayvancılıkta tedavi, profilaksi ve büyümeyi hızlandırma amacıyla kullanılmaktadır1,2,3. Dünyada üretilen antibiyotiklerin yaklaĢık olarak edilmektedir. yarısının ABD‟de besi üretilen hayvanlarında antibiyotiklerin kullanıldığı ise %70‟inin tahmin besi 4 hayvanlarında ve tavuklarda kullanıldığı bildirilmektedir . Bu yaygın kullanım ile insanlarda görülen antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların artıĢı arasında bir bağ olduğu öne sürülmektedir1-7. Direncin, antibiyotiğe maruz kalan hayvanlardan elde edilen gıdaların iĢlenmesi ve tüketilmesi ile ve toprak ve yeraltı suları gibi çevresel ortamlar aracılığıyla insanlara geçtiği belirtilmektedir7. Tavukçulukta florokinolonlar kullanılmaya baĢlandıktan sonra Hollanda, Ġngiltere ve ABD‟de tavuk, tavuk eti ve insanlardan izole edilen florokinolon dirençli Campylobacter jejuni suĢlarının sayısında belirgin bir artıĢ görülmüĢtür8,9. 1 Hayvancılıkta kullanılan antimikrobik maddelerin dirençli non-tifoidal Salmonella serotiplerinin seçimine neden olduğu birçok araĢtırmacı tarafından bildirilmiĢtir10,11. Florokinolonların hayvanlarda kullanılmaya baĢlanmasının ardından insanlardan bu ilaçlara düĢük duyarlılığa sahip Salmonella serotipleri izole edilmeye baĢlanmıĢtır12. Bunun yanında vankomisin dirençli enterokokların (VRE) sayısındaki artıĢ, vankomisinin tarımda kullanılmasının sorgulanmasına neden olmaktadır. VRE suĢları hayvanlar, hayvansal gıdalar ve daha önce vankomisin tedavisi almamıĢ olan gönüllü insanlardan izole edilmiĢtir13. Terapötik dozun altındaki konsantrasyonlarda antibiyotik kullanımının direncin seçimine ve yayılımına olan etkisini aydınlatmak üzere pek çok çalıĢma yapılmaktadır14. Gübre içinde bulunan patojen ve/veya kommensal bakterilerin taĢıdığı direnç genlerinin ve bunların yanı sıra serbest halde bulunan direnç genlerinin toprak ve yeraltı suları gibi çevresel ortamlarda bakteriler arasında aktarımı halen araĢtırılan önemli bir diğer konudur15,16. Bu çalıĢmada yaygın antibiyotik kullanımının toprak ve gübrede bulunan bakterilerin fenotipik direnç paternlerine etkisi ve dirençten sorumlu genetik elemanların belirlenmesi amaçlanmıĢtır. Bu amaçla bir domuz yetiĢtirme çiftliği çevresinde bulunan tarlaya hayvan dıĢkısının uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik dirençlerine olan etkisi araĢtırılmıĢtır. Topraktan izole edilen eritromisin ve tetrasiklin dirençli bakterilerin MĠK (minimum inhibitor konsantrasyon) değerleri belirlenmiĢ, 16S rRNA geninin V3 bölgesi (Escherichia coli‟ de 341-534 nükleotidler arası) polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile amplifiye edilerek cins ve hatta tür düzeyinde tayin yapılmıĢtır. Genotipik direncin belirlenebilmesi için tetrasiklin efluks direnç mekanizmasından [tet(C), tet(H), tet(Z)] ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu 2 genlerin [tet(M), tet(O), tet(Q), tet(W)] ve eritromisin direncinden sorumlu rRNA metilaz genlerinin [erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(G), erm(Q)] varlığı araĢtırılmıĢtır. Elde edilecek sonuçların antibiyotik direnci ile çevresel ortam arasındaki iliĢkinin açıklanması bakımından tarımsal endüstride son derece önemli olacağı, konu hakkında daha fazla bilgi edinilmesinin kanun koyucular ve üreticilere tarımsal endüstride antibiyotiklerin bilinçli kullanılması konusunda rehberlik edecegi açıktır. Ayrıca elde edilecek bilgilerin klinikte karĢılaĢılan direnç mekanizmalarına ıĢık tutabileceği düĢünülmektedir. 3 2. GENEL BĠLGĠLER 2. 1. Antibiyotik Direnci ve Önemi Antibiyotikler, belli mikroorganizmalar tarafından üretilen, diğer mikroorganizmaları öldüren veya üremesini durduran doğal bileĢenlerdir. Antibiyotiklerin doğal yapısında oluĢturulan değiĢikliklerle yarı-sentetik ve tam-sentetik türevleri geliĢtirilmektedir ve bunlar kemoterapötik maddeler olarak adlandırılmaktadırlar17. Antibiyotik direnci, daha önce duyarlı olduğu bilinen bir bakterinin aynı dozda ve aynı süre boyunca uygulandığı halde bu antibiyotikten etkilenmemesidir17. 1940‟lı yıllarda klinikte kullanılmaya baĢlanmasının ardından antibiyotikler tedavide yeni bir çığır açmıĢ ve enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde baĢarıyla kullanılmıĢtır. Ancak klinik kullanıma girmelerinden kısa bir süre sonra dirençli bakterilerin ortaya çıkmasıyla tedavide tekrar sorunlar yaĢanmaya baĢlanmıĢtır. Günümüzde antibiyotik direnci tüm dünyada yaygın olarak görülen ve hastalıkların tedavisinde karĢılaĢılan çok ciddi bir sorun olarak karĢımıza çıkmaktadır. Antibiyotik kullanımıyla ilgili önemli tarihler ve olaylar Tablo 1’de gösterilmiĢtir18. Dirençli bakteriler tedavisi çok daha zor olan, daha pahalı ve toksik antibiyotiklerin kullanımını gerektiren enfeksiyonlara neden olmaktadırlar. Bazı vakalarda dirençli bakteri suĢları mevcut tüm antibiyotiklere karĢı dirençli olabilmektedir. Bu enfeksiyonları durdurmak için güvenilir antibiyotikler olmazsa enfeksiyonlar hastanelere ve topluma yayılacak ve 4 kontrolü çok zor olan epidemilere neden olacaktır. Afrika‟da görülen dizanteri, Güney Amerika‟daki kolera ve Amerika BirleĢik Devletleri‟ndeki (ABD) enterokok salgınları dirençli bakterilerin neden olduğu bu tip salgınlara örnek olarak gösterilebilir1. Tablo 1: Antibiyotik kullanımında kilometre taĢları 18 Önemli geliĢmeler Sülfonamitler sığırlarda mastitis tedavisinde kullanılmaya baĢlandı. Penisilin klinik olarak bulunur hale geldi Klortetrasiklin ilk defa yemlerde büyümeyi artırıcı olarak kullanıldı Ġnsanlarda penisilin dirençli enfeksiyonlar klinik olarak önem kazandı Ġngiltere penisilin ve tetrasiklinin hayvanlarda büyüme artırıcı olarak kullanımını yasakladı Antibiyotiklerin büyümeyi artırıcı olarak kullanılmaya baĢlaması Ġngiltere'de Swann Raporu, hayvanlarda insan antibiyotiklerinin kullanılmaması gerektiğini belirtti 1930 1930 1940 1950 1960 Penisilin Ġlk sulfonamid Basitrasin Eritromisin, ilk makrolid Sefalotin, ilk sefalosporin Kloramfenikol Vankomisin Nalidiksik asit, ilk kinolon Klortetrasiklin Streptomisin, ilk aminoglikosid ABD'de Tıp Enstitüsünün büyüme artırıcı olarak tetrasiklinler ve penisilin hakkındaki raporu 5 antimikrobiyale dirençli Salmonella Typhimurium DT104'ün ortaya çıkıĢı 1970 1980 Florokinolon dirençli Campylobacter kümes hayvanlarında ve insanlarda görüldü Florokinolonların kümes hayvanlarında kullanımı onaylandı Danimarka bütün hayvanlarda antimikrobiyal kullanımını durdurdu FDA insanlarda görülen hastalıklara dayanarak tavuklarda florokinolon kullanımını yasakladı. 1990 2000 Amoksisilinklavulanik asit (beta-laktamaz inhibitor) Siprofloksasin, ilk florokinolon KeĢfedilen antibiyotikler Trimetoprim Antibiyotik direnci, çok ciddi bir sağlık sorunu olmasının yanında ekonomik açıdan da önemli bir problemdir1. Bir çalıĢmada ABD‟deki hastanelerde antibiyotik direncinden kaynaklanan tedavi masraflarının 100 milyon ile 10 milyar dolar arasında olduğu bildirilmiĢtir18. US Office of Technology Assessment tarafından 1995 yılında yayınlanan bir rapora göre ABD‟deki hastanelerde antibiyotik dirençli 6 bakterinin oluĢturduğu enfeksiyonların ek maliyeti her yıl 1,3 milyar doları bulmaktadır19. Dünya 5 çapında bu enfeksiyonların tedavi maliyetinin ise her yıl milyarlarca dolar olduğu tahmin edilmektedir. Antibiyotik direncinin üstesinden gelmek için araĢtırmacılar iki yol olduğunu belirtmektedirler6. Yeni veya değiĢik yapıda ilaçlar geliĢtirmek: 1990‟lı yıllardan bu yana yeni bir antibiyotik sınıfı geliĢtirilmemekte, mevcut olan antibiyotiklerin kimyasal yapıları değiĢtirilmektedir. Direnç geliĢimini yavaĢlatmak için antibiyotiği sınırlı kullanmak (Bilinçli antibiyotik kullanımı): Antiyotik direnci antibiyotik kullanımına bağlı olarak görülen doğal bir sonuçtur. Bu nedenle antibiyotiklerin bilinçli kullanımı direncin geliĢimini önlemede veya yavaĢlatmada çok önemlidir. Ülkemiz de dahil olmak üzere dünyada hem hastanelerde hem de hayvancılık alanında antibiyotiklerin bilinçsizce kullanıldığı bilinmektedir. Pek çok ülkede antibiyotiklerin kullanımını sınırlamak amacıyla politikalar oluĢturulmaktadır. 2.2. Hayvancılıkta Antibiyotik Kullanımı ve Direnç GeliĢimine Olan Etkisi Antimikrobik maddelerin kullanımı son 50 yılda hızla artmıĢtır. Antibiyotikler profilaksisinden insanlarda akne enfeksiyon tedavisine hastalıklarının kadar çeĢitli tedavisi ve endikasyonlarda 1 kullanılmaktadırlar . Hayvancılıkta ise antibiyotikler enfeksiyonları tedavi etmek, besi hayvanlarında büyümeyi hızlandırmak ve profilaktik amaçlarla yaygın olarak kullanılmaktadır20. ABD‟de üretilen tüm antibiyotiklerin %70‟inin besi 6 hayvanlarında ve tavukçulukta, dünyada üretilen antibiyotiklerin ise yaklaĢık yarısının besi hayvanlarında kullanıldığı tahmin edilmektedir 4. 1997 yılında Avrupa Birliği ülkelerinde 10.493 ton aktif antimikrobik ilaç kullanıldığı; bu miktarın %52‟sinin insanlar, %33‟ünün terapötik amaçlarla hayvanlar için ve %15‟inin de hayvanlarda büyümeyi hızlandırmak amacıyla kulllanıldığı bilidirilmiĢtir1. ABD‟de 1990‟lı yılların ortalarında çiftlik hayvanlarında sadece tetrasiklin 3.5x 106 kg/yıl düzeyinde kullanılmıĢtır21. Antibiyotikler genellikle hayvanların yemine ve içme suyuna terapötik dozlarının altında bir düzeyde hergün eklenmektedir. Herhangi bir denetim olmaması nedeniyle neredeyse her çiftliğin kendi dozunu belirlediği düĢünülmektedir ancak büyümeyi hızlandırmak amacıyla kullanılan dozun teorik olarak 10-100 ppm/kg olduğu belirtilmektedir1. Çevresel ortamlarda yaĢayan bakterilerdeki antibiyotik direncinin artmasına neden olan asıl etkenin hayvancılıkta aĢırı antibiyotik kullanımı olduğu belirtilmektedir22. Bu etkinin değerlendirilmesi için yapılan çalıĢmalar daha çok hayvan dıĢkısının gübreleme yoluyla toprağa uygulanmasının sonuçlarını değerlendirmeye yöneliktir23-34. Gübre içindeki antibiyotik konsantrasyonunun eser miktarlardan litrede 200 mg/L düzeyine kadar ulaĢabildiği gösterilmiĢtir35. Antibiyotiklerin %75‟inin hayvanlar tarafından absorblanmayıp idrar ve feçesle atılmaları çevrenin antimikrobik maddelerle kontaminasyonuna yol açan önemli faktörlerdendir36,37. Antibiyotikler gübreleme yoluyla toprağa ve doğal kaynak sularına geçmektedirler15,16,38. Toprağa bağlandıktan sonra tetrasiklin, taylosin, sülfonamidler ve kinolonların bakterilere karĢı aktivitelerini, toprak partiküllerine sıkıca bağlanmıĢ olsalar da, korudukları yapılan çalıĢmalarla gösterilmiĢtir39,40. Ayrıca virginyamisin, sarafloksasin, oksitetrasiklin, klortetrasiklin ve siklosporin A gibi antibiyotiklerin de toprakta çok yavaĢ parçalandıkları gösterilmiĢtir39. Hamscher ve ark.ları sıvı gübreleme iĢleminden 6 ay sonra toprağın 30 cm altında tetrasiklinin 170 µg/kg düzeyinde bulunduğunu göstermiĢlerdir41. BaĢka bir 7 araĢtırmada toprakta bulunan tetrasiklin konsantrasyonu 0,3 mg/kg olarak bulunmuĢtur41. Gübreleme yoluyla çiftliklere yakın bölgelerde toprak ve çevreye yayılmalarının yanında antimikrobik maddeler, hastaneler ve üretildikleri fabrikaların çevresinde de yoğun olarak bulunmaktadırlar. Bu maddelerin çoğu toprakta birikebilmekte ve minimum inhibisyon konsantrasyonu (MĠK) değerlerine ulaĢabilmektedir1,39. Bu Ģekilde antimikrobik maddelere terapötik dozun altındaki konsantrasyonlarda uzun süre maruz kalan patojen ve/veya kommensal bakteriler seçici etki nedeniyle zamanla direnç geliĢtirebilmektedirler33,42 ,43. Bu etki ġekil 1’ de Ģematik olarak gösterilmektedir44. Ġki farklı bakteri popülasyonu. A ve B aynı fiziksel koĢullarda çoğalıyor. B suĢu X antimikrobiyal maddesine dirençlidir. A ve B suĢları arasinda mobil genetik elementlerin alıĢ veriĢi Seçici baskı X maddesi varlığında direnç genine sahip A suĢları yaĢarken diğerleri ölür ġekil 1: Seçici baskı altında Antimikrobik X maddesine maruziyet mikropların A suĢu X maddesine dirençten sorumlu gen olan a genini mobil genetik elementler yoluyla b suĢundan alır antimikrobik maddelere direnç 44 geliĢtirmesinin ve bu direncin yayılımının Ģematik olarak gösterilmesi . 8 Bilinçsiz ve aĢırı antibiyotik kullanımı sonucu domuzların intestinal kanalındaki kommensal veya patojen pek çok bakterinin dirençli hale geldiği ve bu hayvanların dıĢkılarının toprağa gübre olarak uygulanmasıyla direnç genlerinin ve/veya direnç geni taĢıyan bu bakterilerin çevreye yayıldığı düĢünülmektedir11,45-47. Sengelov ve ark.ları kısa bir süre için de olsa (3-5 gün) domuz dıĢkısı uygulanan topraktaki tetrasiklin dirençli bakteri sayısının arttığını 23 göstermiĢlerdir . AraĢtırmacılar yine domuz dıĢkısı uygulanmıĢ bir toprakta antibiyotik dirençli Pseudomonas türleri ve Bacillus cereus izolatlarının arttığını ortaya koymuĢlardır24. Onan ve LaPara ise gübre uygulanmıĢ toprakta uygulanmayana göre yüksek oranda taylosin dirençli bakteri olduğunu göstermiĢtir25. Ayrıca gübrenin ve sülfadiyazinin toprak bakterileri üzerine etkisinin araĢtırıldığı bir çalıĢmada gübrenin bakteriler arasında antibiyotik direncinin yayılımına neden olduğu ve sülfadiyazinin bu etkiyi iki ay boyunca arttırdığı gösterilmiĢtir32. Bunun yanında direnç genleri veya dirençli bakterilerle kontamine hayvansal gıdalar düĢünülmektedir. yoluyla Hayvansal direnç genlerinin gıdalar, insanlara non-tifoidal bulaĢtığı salmonella, kampilobakter, Yersinia, E. coli 0157 ve diğer patojenlerin neden olduğu sindirim yoluyla bulaĢan bakteriyel enfeksiyonların ana kaynağıdır. Bakteriler ekosistemler, hayvanlar ve insanlar arasında hareket edebilmektedirler. Bu nedenle bu bakteriler patojen ise veya direnç genlerinin patojen bakterilere taĢınmasında rol oynuyorlarsa önemli sağlık sorunları ortaya çıkmaktadır1. Bu bakteriler insanlara gıda ve direkt temas yoluyla geçmektedirler. Bazı non-tifoidal Salmonella enfeksiyonu vakaları antibiyotik tedavisi gerektirmektedir ve direnç tedavi olanaklarını büyük ölçüde sınırlamaktadır. Hayvancılıkta kullanılan antimikrobik maddelerin dirençli non-tifoidal Salmonella serotiplerinin seçimine neden olduğu birçok 9 araĢtırmacı tarafından bildirilmiĢtir37. Ġnsanlarda ve hayvanlarda bulunan S.Typhimurium DT 104 klonu ampisilin, streptomisin, kloramfenikol ve sülfonamidlere dirençlidir ve birçok ülkede görülmektedir1. Hayvancılıkta florokinolonların kullanılmaya baĢlanması ile insanlardan bu ilaçlara düĢük duyarlılığa sahip Salmonella serotiplerinin izole edilmesi arasında açık bir iliĢki vardır. Tavukçulukta florokinolonlar kullanılmaya baĢlandıktan sonra Hollanda, Ġngiltere ve ABD‟de tavuk, tavuk eti ve insanlardan izole edilen florokinolon dirençli Campylobacter jejuni suĢlarının sayısında belirgin bir artıĢ görülmüĢtür. Bunun yanında vankomisin dirençli enterokokların (VRE) sayısındaki artıĢ, vankomisinin tarımda kullanılmasının sorgulanmasına neden olmaktadır. VRE suĢları hayvanlar, çeĢitli gıdalar ve daha önce vankomisin tedavisi almamıĢ gönüllü insanlardan izole edilmiĢlerdir6. Önemli diğer antibiyotiklerin, bir aynı faktör zamanda de hayvancılık insanlarda da alanında kullanılan kullanılan ve bazı enfeksiyonların tedavisinde klinikte son çare olarak görülen antibiyotiklerle aynı olmasıdır. Tablo 2’de bu antibiyotikler ve kullanım alanları gösterilmektedir48. 10 Tablo 2: Antibiyotikler ve kullanıldıkları alanlar 48 Hayvancılıkta kullanım Antibiyotik sınıfı Hayvanın cinsi Aminoglikozidler sığır, kümes h.,koyun, (gentamisin, neomisin, domuz Tedavi Profilaksi ✓ ✓ Büyümeyi Ġnsanda Bakteriyal Arttırıcı Kullanım Direnç ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ streptomisin) Beta-Laktamlar sığır, kümes h.,koyun, Penisilinler domuz ✓ ✓ Sefalosporinler sığır, kümes h., koyun, ✓ ✓ (3. jenerasyon) domuz Iyonoforlar sığır, kümes h., koyun Makrolidler sığır, kümes h. Domuz ✓ (amoksisilin, ampisilin) ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ kümes h. Domuz ✓ ✓ ✓ sığır, kümes h., ✓ ✓ Sülfonamidler sığır, kümes h. Domuz ✓ Tetrasiklinler sığır, kümes h., koyun, ✓ (eritromisin, ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ ✓ tilmikosin, taylosin) Polipeptidler (basitrasin) Florokinolonlar (enrofloxacin) ✓ domuz Bu nedenle antibiyotik direnç mekanizmalarının anlaĢılmasında ekolojik ve global bakıĢ açıları çok önemlidir. Mikroorganizmalar rüzgar ve suyla kolayca yerkürede yer değiĢtirebildikleri gibi ekosistemler arasında da kolayca hareket ederler. Bu hareket insanlar ve hayvanlardan toprağa ve suya veya tersi yönde sürekli gerçekleĢmektedir49. Bu nedenle antibiyotik direncine sadece klinik açıdan yaklaĢmak hatalı olur. Çünkü sadece enfeksiyon tedavisi alan hastalar değil hasta olmayan, antibiyotik almayan kiĢiler de çeĢitli çevresel bölgelerden antibiyotiklere, dirençli genlere ve dirençli bakterilere maruz kalmaktadırlar49,50. Bu nedenle direncin değerlendirilmesinde çevresel faktörlerin önemi büyüktür. Antibiyotik 11 direncinin çevresel kompartımanlar arasında yayılımı Ģematik olarak ġekil 2’de gösterilmektedir51. ġekil 2: Antimikrobik Direncin Çevrede Yayılımı 51 Ġçme suyu Ġçme suyu Çöp Gübreleme Çiftlik atıkları Çiftlik artığı Temas Hazırlama Tüketim Besi hayvanlarının iĢlenmesi Et Hayvan Yemi Temas 2.3. Antibiyotik Kullanımını Sınırlamaya Yönelik Politikalar ve Uygulamalar 2.3.1.Ülkemizdeki Durum Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı 9.7.1999 tarih ve 14428 sayılı yazısı ile 30.6.1999 tarihinden itibaren söz konusu antibiyotiklerden avoparsin, spiramisin, virginyamisin, taylosin fosfat, karbadoks, olakuindoks ve çinko basitrasinin ülkemizde yem katkı maddesi olarak kullanımını yasaklamıĢtır. 12 2.3.2. Avrupa Birliğine Üye Ülkelerdeki Durum Bu konuyla ilgili olarak hazırlanmıĢ bilinen en eski rapor Ġngiltere‟de 1969 yılında yayınlanmıĢtır. Bu raporda, profilaksi ve büyümeyi arttırma amacıyla antibiyotik kullanımında o günün koĢullarında yürürlükte olan yönetmeliklere bağlı kalınması konusunun üzerinde önemle durulmuĢtur5. Avrupa Birliği‟ne üye ülkelerde 1995 yılında vankomisin, 1997‟de avoparsin, 1999‟da taylosin, spiramisin, basitrasin ve virginyamisin aynı yıl toksik etkileri nedeniyle olakuindoks ve karbadoks, 2006 yılında ise bu amaçla kullanılan tüm antibiyotikler yasaklanmıĢtır11. 2.3.3. Amerika BirleĢik Devletleri‟ndeki Durum ABD‟de tarım ve hayvancılıkta antibiyotik kullanımını sınırlayan yasa taslağı Amerikan Kongresi‟nde halen görüĢülmektedir. FDA (Food and Drug Administration) tavukçulukta kullanılan florokinolon yapıda iki antibiyotiğin onayını geri almıĢtır. Çünkü florokinolon dirençli tavuk etleri insanda görülen florokinolon dirençli Campylobacter enfeksiyonlarının esas sebebi olarak görülmektedir20. Ayrıca Dünya Sağlık Örgütü (WHO) insanlar için kullanılan antibiyotiklerin hayvanlarda büyümeyi arttırmak amacıyla kullanılmaması gerektiğini bildirmiĢtir52. 13 2.4. Antibiyotik Direncinin Transferi Antibiyotiklere dirençli bakteri suĢları duyarlı olanlardan, ürettikleri spesifik proteinlerle ayrılırlar. Bu proteinler direnç genleri tarafından eksprese edilirler. Direnç genleri mutasyonlar sonucu oluĢur veya bakteri bu genleri dirençli diğer bir bakteriden alır53. Eğer direnç geni aynı veya farklı türlerden bakteri suĢları arasında paylaĢılıyorsa buna horizontal gen transferi adı verilir54. Gübre bakteriler için oldukça besleyici bir ortam olduğundan ve çok sayıda bakteriyi barındırdığından direnç genlerinin horizontal gen transferi yoluyla aktarılmasını kolaylaĢtırmaktadır26. Belirli bir bakterinin bir antimikrobik maddeye direnç geliĢtirmesi Ģu faktörlere bağlıdır1: Bakterinin fizyolojisi OluĢan genetik mutasyonların özelliği Kazanılacak direnç geninin prevalansı Antimikrobik maddeye maruz kalma süresi ve düzeyi 2.4.1. Horizontal Gen Transfer Mekanizmaları Bakteriler hücreler arası genetik bilgi transferini transformasyon, transdüksiyon ve konjugasyon olarak adlandırılan 3 farklı mekanizma ile gerçekleĢtirirler. Bu mekanizmalar ġekil 3’te gösterilmektedir55. 14 A B C 55 ġekil 3: Direnç genlerinin aktarım mekanizmaları : A: Transdüksiyon B: Konjugasyon C: Transformasyon 2.4.1.1. Transformasyon Bilinen en eski mekanizma olan transformasyon verici (donör) hücreden DNA‟nın salınması ile baĢlar. DNA çevrede bulunan baĢka bir bakteri tarafından gıda olarak alınabilir, eğer iki bakteri çok yakınsa homolog rekombinasyon ile DNA, alıcı hücrenin kromozomuna integre olur (ġekil 3). Transformasyonun gerçekleĢmesi için her iki bakteri hücresinin (alıcı ve verici) homolog genlere sahip olması gerekmektedir, çünkü heterolog genler alıcı hücrenin nükleazları tarafından parçalanır. Penisilin direncinden sorumlu kromozamal mutasyonların transformasyon yoluyla pnömokoklar arasında yayıldığı bilinmektedir 44,49,54-56. 15 Nükleaz enzimine duyarlı olmasına rağmen DNA neredeyse tüm çevresel kompartımanlarda yaygın olarak bulunur ve canlı bakteriler tarafından çevreye bırakılır veya bakterinin otolizisi sonucu açığa çıkar. DNA kum ve kil partiküllerine adsorbe olarak stabilize olabilir. Böylece DNase enzimine 100-1000 kat daha dirençli hale gelir. Adsorbe olan DNA transforme olabilme özelliğini haftalar hatta aylar boyunca koruyabilir 56,57. Transformasyon farklı ekosistemlerde çok çeĢitli bakteriler için gösterilmiĢtir. Acinetobacter calcoaceticus‟ un tranformasyonunu etkileyen faktörler farklı toprak tiplerinde araĢtırılmıĢ ve besleyici madde içeriği yüksek topraklarda transformasyon sıklığının arttığı görülmüĢtür56,58. Cooper ve ark. ları yaptıkları bir çalıĢmada, Bacillus sphaericus‟ta bulunan ermG geni ile Bacteroides‟ten izole edilen konjugatif transpozonlar arasında benzerlik olduğunu saptamıĢlar ve bunun toprak bakterileri ile insan gastrointestinal sistem bakterileri arasında direnç genlerinin transfer edildiği yönünde bir kanıt olduğunu belirtmiĢlerdir59. Bunun yanında konjugal ve mobilize plazmidlerin çevreden izole edilen bakterilerde yüksek sıklıkta bulunduğu bildirilmiĢtir. 2.4.1.2. Transdüksiyon Transdüksiyonda bakteriyofaj adı verilen bakteri virusları rol oynar (ġekil 3). Bakteriyofajlar aracılığı ile verici bakteriden alıcı bakteriye genetik materyal veya bir DNA segmenti aktarılır. Transdüksiyon baĢlıca iki Ģekilde görülmektedir (ġekil 4)44,56,60: 1. Lokalize (kısıtlı) transdüksiyon: Bakteriyofaj girdiği bakterinin kromozomunun hep aynı bölgesine entegre olduğu için, yeni bakteriye daima aynı DNA segmentini aktarır. 16 2. Jeneralize (kısıtlanmamış) transdüksiyon: Konak bakterinin tüm genleri alıcı bakteriye eĢit Ģansla aktarılır. Transdüksiyon yoluyla genellikle toksin yapımı ve virülansla ile ilgili diğer genler aktarılmakta iken antibiyotik direnç genlerinin aktarımı daha az sıklıkta görülmektedir54. Bakteriyofajlar sınırlı konak çeĢitliliğine sahiptir, bazı bakteriyofajlar tek bir bakteri türüne spesifiktir. Bununla beraber fajların çevrede yaygın olarak bulunduğu, protein mantosu ile korunduğu ve nispeten stabil olduğu da bilinmektedir56. Fajlar kompakt yapıdadır ve çıplak DNA‟ya oranla difüzyon yetenekleri daha fazladır. Ancak toprak bakterileri arasındaki gen transferinde transdüksiyonun rolü henüz tam olarak bilinmemektedir44,56. 2.4.1.3. Konjugasyon Konjugasyon doğada ve normal insan florasında görülen baĢlıca direnç geni aktarım mekanizmalarından biridir. Transformasyon ve faj aracılı transdüksiyon homolog rekombinasyona gereksinim duyması nedeniyle daha dar konak bakteri aralığında görülmekte iken konjugasyonun konak hücre aralığı çok daha geniĢtir54. Konjugasyon büyük (> 30 kb), çift iplikli DNA plazmidleri (çembersel veya lineer) ve konjugatif transpozonlar tarafından gerçekleĢtirilir. Konjugasyonun gerçekleĢmesi için verici ve alıcı hücre arasında fiziksel temas gerekmektedir (ġekil 3 ve 4)54,62. Büyüklükleri 18-150 kb arasında değiĢen DNA segmentleri olan konjugatif transpozonlar genellikle bakteri genomuna integre olurlar. Konjugatif transpozonlar, konvansiyonel transpozonlardan çembersel 17 yapılar oluĢturabilme, konjugasyonla aktarılabilme ve integrasyonları sırasında hedef bölge duplikasyonu yapmama özellikleri ile ayrılırlar 62. Konjugatif transpozonların özellikle Bacteroides türleri ve gram pozitif bakteriler arasında direnç genlerinin yayılmasında önemli bir rol oynadıkları düĢünülmektedir48,56. Tn916 ailesinin üyeleri 24 farklı cinsten 50 türden fazla bakterinin gen aktarımından sorumludur45. Konjugatif plazmidler (RP4 gibi) konjugatif transpozonlar gibi çok geniĢ konak hücre çeĢitliliğine sahiptir. Toprak bakterileri arasında plazmidlerin konjugasyon yoluyla aktarıldığını gösteren pek çok çalıĢma bulunmaktadır. Bunun yanında konjugatif plazmidler daha küçük ve konjugatif olmayan plazmidlerin aktarımında da rol oynayabilirler. Buna mobilizasyon denir54,56,60. Bu hücreler arası gen aktarımı mekanizmaları dıĢında hücre içi gen hareketini sağlayan transpozisyon ve kaset integrasyonu olarak adlandırılan iki farklı mekanizmanın daha varlığından söz edilmektedir. Transpozisyon bir genin kromozom veya plazmid üzerinde bir yerden baĢka bir yere hareketidir. Gen kasetleri konak hücre DNA‟sına veya integrona integre olabilen gen topluluklarıdır. Kaset integrasyonu ise antibiyotik direncinden sorumlu her bir genin ard arda dizilerek biraraya gelmesi ve ekspresyonu ile görülür54 (ġekil 4). 2.4.2.Yer DeğiĢtirebilen Genetik Elementler Antibiyotik direncinin insan ve hayvanlarda önem arzeden bazı bakteri cinsleri arasında hızla yayılmasından sorumludurlar. Bu elementler, kromozomlar arasında, aynı kromozom üzerindeki farklı bölgeler arasında, kromozomdan plazmide veya iki plazmid arasında yer değiĢtirebilen, kendi 18 transferlerini gerçekleĢtirebilen, küçük, lineer, çift iplikli DNA sekanslarıdır60,62. Verici hücre Alıcı hücre Kromozom Kromozom Lokalize Profaj Transdüksiyon Mobilize plazmid Jenaralize Konjugatif plazmid Mobil gen kasetleri ġekil 4: Bakteri hücreleri arasında DNA transferi. Transdüksiyon (1). Faj DNA’sı (sarı) bakteri kromozomuna (koyu mavi) integre olur. Daha sonra jeneralize transdüksiyon ile sadece verici hücre DNA’sıyla veya faj DNA’sıyla beraber alıcı hücre kromozomuna (kırmızı) rekombine olur. Konjugasyon (2). DüĢük kopya sayısına sahip büyük konjugatif transpozon (turuncu) ve integrated konjugatif elementler (ICE, gösterilmiyor) pilusu kullanarak alıcı hücreyle bağlantı sağlar ve kendi transferini gerçekleĢtirir. Plazmidin bir kopyası, genomik adalar veya bakteriyel kromozomun tamamının kopyası naif hücreye aktarılabilir. Bu genetik elementler kromozom içine yerleĢebilir veya naif hücrenin plazmidi (açık yeĢil) ile geçimli ise bağımsız olarak replike olabilir. Gram pozitif bakterilerin konjugatif transpozonları ve plazmidleri piliye ihtiyaç duymazlar. Transpozisyon (3). Transpozonlar (pembe), kromozomlar veya plazmidler üzerindeki yeni sahalara non-homolog rekombinasyon ile integre olurlar. Ġntegronlar (koyu yeĢil) gen kaseti (kahverengi) alıĢ-veriĢinde aynı 60 mekanizmayı kullanırlar . 19 2.4.2.1.Plazmidler Hücrenin kromozomundan bağımsız olarak replike olabilen ekstrakromozomal DNA segmentleridir. ÇeĢitli bakteriler arasında seks pilusları aracılığıyla taĢınabilirler. Plazmidler replikasyon yöntemleri ve bakteri hücresindeki kalıcılıklarına göre geçimlilik (inkompatibilite,Inc) gruplarına ayrılırlar. Plazmidlerin bakteri için yaĢamsal önemi yoktur ancak taĢıdıkları virulans determinantları ve antimikrobik direnç genleri ile bakteriye avantaj sağlarlar. Direnç genlerini taĢıyan plazmidler R plazmidler veya R faktör olarak adlandırılır. 1950 yılında keĢfedilmelerinden bu yana giderek artan oranda patojen veya kommensal gram negatif ve gram pozitif bakterilerin direncinden sorumludurlar. Plazmidlerin taĢıdığı direnç genleri klinikte kullanılan antimikrobik maddelere direncin baĢlıca sorumlusudur49,54,60. Direnç genlerini taĢımalarının yanı sıra plazmidler, transpozon ve integronlar gibi diğer mobil genetik elementlerin taĢınmasında da rol oynarlar49. 2.4.2.2.Transpozonlar (Tn) Transpozonlar, kromozom üzerindeki bir bölgeden baĢka bir bölgeye veya kromozom üzerinden plazmidlere atlayabilen gen sekanslarıdır. Transpozonlar insersiyon sekanslarından (ĠS) ve transposase adı verilen transpozisyondan sorumlu genden oluĢur. Bunun yanında transpozonlar çok daha kompleks yapıda da olabilirler. Bu tip komleks yapıdaki transpozonlara kompozit transpozonlar denir61. Bu transpozonların iki 20 ucunda ĠS-sekansı bulunur (ġekil 5 ve 6). Farklı bakteri türleri arasında pek çok direnç determinantının kompozit transpozonlar ile taĢındığı bilinmektedir. Bu transpozonlar konjugatif bir plazmide veya kongujatif bir transpozona integre olarak bir hücreden diğerine geçerler 49. Konjugatif transpozonlar, transpozonlar ve plazmidler arasındaki hibrid yapılardır ve gram negatif bakterilerde olduğu kadar gram pozitif bakterilerde de bulunurlar49,54,62. Transpozisyon genleri Tersine tekrarlanan sekanslar Yapısal genler Tersine tekrarlanan insersiyon sekansları ġekil 5: Bakteriyel kompozit transpozonların yapısı 63 Transpozisyon genleri Tersine tekrarlanan sekanlar 64 ġekil 6: Ġnsersiyon sekanslarının yapısı Pek çok direnç geni (tetM, tetQ, ermF, ermG) konjugatif transpozonlar tarafından taĢınırlar. ġekil 7’de konjugatif transpozonlar yoluyla aktarılan genler ve bakteri cinsleri Ģematik olarak gösterilmiĢtir45. 21 Bacillus türleri Clostridium türleri Staphylococcus türleri Enterococcus türleri Streptococcus türleri Staphylococcus türleri Clostridia türleri Enterococcus türleri Streptococcus türleri Staphylococcus türleri Clostridia türleri Actinomyces türleri Bifidobacterium türleri ermG Bacteroides türleri ermB Bacteroides türleri Campylobacter türleri Fusobacterium nucleatum Gardenella vaginalis Haemophilus türleri Neisseria türleri Veillonella türleri tetM Firmicute Eubacterium tetQ ermF Bacteroides türleri Prevotella türleri Porphorymonas türleri ġekil 7: Doğada konjugatif transpozonlar yoluyla aktarılan genler ve geniĢ konak hücre spektrumları 45 2.4.2.3.Ġntegronlar Ġntegronlar, antibiyotik direnç gen kasetlerinin integre olabileceği, merkezinde spesifik yapıda 2 korunmuĢ segment taĢıyan hareketli DNA segmentleridir. Ġntegronlar ve transpozonlar özelleĢmiĢ 2 tip rekombinasyondan sorumlu genleri kodlayan DNA parçalarıdır. Her iki element de kendi kendine replike olamaz, fajlar ve plazmidlerde olduğu gibi hücreler arası aktarımlarını sağlayacak genleri kodlayamazlar49,54,65. Süper integronlar dıĢında integronlar 3 sınıfa ayrılırlar. Sınıf 1 integronlar gen kasetleri içermezler, bununla birlikte int-attl yapısını taĢırlar. İnt integron üzerinde bulunan ve integraz enzimini kodlayan gendir. Attl ise int genine komĢu rekombinasyon bölgesidir. Sınıf 2 22 integronlar Tn7‟nin bir parçası olup trimetoprim ve streptomisin direncinden sorumludur. Sınıf 3 integronlar konusunda eldeki bilgiler sınırlıdır65. Ġntegronlar genellikle besi hayvanlarından ve insanlardan izole edilen streptomisin ve trimetoprim-sülfametaksazol dirençli bakterilerde bulunmaktadır66. Ġntegron aracılığı ile antimikrobik direncin hızla yayılımına örnek olarak Salmonella Thyhimurium faj tip DT104 (R-tip ACSSuT olarak da bilinir) verilebilir. Bu faj tipi halk sağlığını olumsuz yönde etkilemiĢ ve global bir problem halini almıĢtır49. BaĢlangıçta sadece enterobakterilerle sınırlı oldukları düĢünülen integronlar bugün Salmonella, Camphylobacter, Enterococcus ve Staphylococcus gibi pek çok türden izole edilmiĢtir65. 2.5. Direnç Mekanizmaları Bakteriler 3 temel direnç fenotipinden birine sahip olabilirler67: 1. Duyarlı 2. Doğal dirençli 3. KazanılmıĢ dirençli Doğal direnç, bir türün tüm üyelerinde görülen, bu türün fizyolojik veya biyokimyasal özelliklerini belirleyen bir fonksiyondur. Enterokokların penisilin bağlayan proteinlere düĢük afinitesi nedeniyle sefalosporinlere dirençli olması gibi67. KazanılmıĢ direnç, düzenleyici veya yapısal genlerin mutasyonu, yabancı direnç genlerinin kazanılması veya bu iki mekanizmanın 23 kombinasyonu yoluyla ortaya çıkabilir. Türe ait tüm bireylerde gözlenmez67. Nokta mutasyonlar sonucu ortaya çıkan direnç fenotipleri genellikle antibiyotiğin hedefinin değiĢtirilerek bağlanma kapasitesinin düĢürülmesi yoluyla ortaya çıkar. Örneğin DNA girazı kodlayan gendeki nokta mutasyonu kinolonların bakteriye bağlanma afinitesini azaltarak dirence neden olur67. Mutasyondan baĢka direnç, antimikrobik maddenin enzimatik modifikasyonu, ilacın bakteri içinde birikmesinin önlenmesi, ilacın hedefi olan yapıların değiĢtirilmesi veya korunması gibi baĢlıca 3 yolla ortaya çıkabilir. Antimikrobik maddenin yapısının değiĢtirilmesi veya degradasyonu yoluyla oluĢan direnç çok yaygın olarak görülmektedir. Bu Ģekilde antimikrobik maddenin etkinliği azalır veya tamamen durur. Bakterilerin ürettiği β-laktamaz enziminin enzimatik yolla β-laktam halkasını parçalaması bu direnç mekanizmasına örnek verilebilir. Son yıllarda saptanan bir diğer direnç mekanizması da florokinolonları asetilleyerek aktivitesinin azalmasına yol açan aminoglikozit asetil transferaz (AAC(6‟)-Ib) enzimi ile oluĢan plazmid aracılı dirençtir. Bu varyant enzimlerin bazı kinolonları etkilemesi ve aminoglikozitlere karĢı direnç geliĢiminde rol oynaması bu enzimleri yapan genlerin de çoklu direnç için seçime uğradığını göstermektedir68. Ayrıca makrolidler ve streptograminlerde de enzimatik inaktivasyon yoluyla oluĢan dirençten söz etmek mümkündür. Aminoglikozit asetil transferaz antimikrobik maddelere asetil gruplar ekleyerek inaktive etmesinin yanı sıra, ribozomun A bölgesine bağlanarak translasyonu ve kodon anti-kodon translasyon mekanizmasını etkiler67. 24 Bir diğer direnç mekanizması da porin değiĢikliği aracılığı ile gram negatif bakterilerde hücrenin geçirgenliğinin azaltılmasıdır. DıĢ zar proteinleri (omp) antibiyotikler de dahil olmak üzere pek çok molekülün yük, büyüklük ve yapısına bağlı olarak hücre içine alınmasını sağlarlar. Bu porinlerin herhangi birinde mutasyon yoluyla görülen fonksiyon bozukluğu sonucu çok çeĢitli antimikrobik maddeye karĢı direnç geliĢimi gözlenir. Ayrıca dıĢ zar lipoproteinlerini kodlayan genlerde görülen mutasyonlar sonucu da direnç geliĢebilmektedir. Lipopolisakkaritin O antijen yan zincirinde görülen değiĢtirebilmekte ve değiĢiklikler molekülün katyonik antibiyotiklerin yapısını ve bağlanma yükünü yeteneğini azaltmaktadır69. Hücre içinde biriken antibiyotiğin enerji bağımlı bir mekanizma olan aktif pompa sistemi ile hücre dıĢına atılması da diğer bir direnç mekanizmasıdır. BoĢaltım (efluks) pompaları dirençli olsun olmasın bakterilerde bulunan doğal bir mekanizmadır. Efluks pompaları belirli bir antimikrobik maddeye, sınıfa veya pek çok antimikrobik maddeye karĢı çoklu direnç oluĢumundan sorumlu olabilir. Efluks pompaları çoğunlukla bakteri kromozomunda kodlanan, genetik elementler üzerinde taĢınan veya çeĢitli çevresel uyaranlar yoluyla tetiklenebilen mekanizmalardır67. 2.6. Tez ÇalıĢmasında Kullanılan Antibiyotikler Hakkında Genel Bilgiler 2.6.1.Tetrasiklinler 1950 yılında kullanıma girmelerinin ardından tetrasiklinler insanlarda ve hayvanlarda tedavi amacıyla, büyüme faktörü olarak hayvancılıkta ve profilaksi amacıyla bitkilerde kullanılmaktadır. Tetrasiklinler gram negatif ve gram pozitif bakteri enfeksiyonlarında, intrasellüler bakteriyel 25 enfeksiyonlarda ve protozoon enfeksiyonlarında olduğu kadar enfeksiyon dıĢı durumlarda da kullanılan geniĢ spektrumlu antibiyotiklerdir. Bunun yanında tetrasiklinler hayvancılıkta en sık kullanılan antibiyotiklerdir. Günümüzde görülmesinin tüm bu bakteri cinslerinde yaygın tetrasiklinlere kullanımdan karĢı direnç kaynaklanabileceği düĢünülmektedir21. Tetrasiklin grubu antibiyotikler tetrasiklin, oksitetrasiklin, klortetrasiklin ve minosiklinden oluĢur ve bu antibiyotikler geniĢ spektrumludurlar. Gram pozitif ve gram negatif bakterilerde aminoaçil tRNA‟nın 30S ribozomal alt üniteye bağlanmasını engelleyerek protein sentezinin inhibisyonuna neden olurlar. Tetrasiklinlere karĢı baĢlıca iki mekanizma ile direnç oluĢmaktadır: Ribozomların büyük sitoplazmik proteinlerce korunması ve enerji aracılı efluks pompaları ile ilacın hücre dıĢına atılması. Üçüncü bir mekanizma olarak tetrasiklinlerin enzimatik inaktivasyonundan bahsedilebilir. Tablo 3’te bu mekanizmalardan sorumlu genler gösterilmektedir21. Fırsatçı patojen ve patojen bakterilerde olduğu gibi kommensal bakteriler de aynı plazmidler, transpozonlar ve integronlarla taĢınan tetrasiklin direnç (tet) genlerine sahiptirler. Tet genleri insan, hayvan ve çevreden izole edilen pek çok bakteride bulunmaktadır. Tet genlerinin çoğunun konjugatif ve mobil elementler yoluyla taĢınması çok çeĢitli bakteriler arasındaki yayılımı açıklamaktadır70. Bir domuz çiftliğinde gübre toplama bölgesindeki ve çevresindeki yeraltı sularında tetrasiklin direnç genlerinin varlığını, dağılımını ve miktarını uzun dönemde belirlemek üzere yapılan bir çalıĢmada bu genlerin yeraltı suyuna kadar ulaĢtıkları gösterilmiĢtir16. 26 Bir baĢka çalıĢmada tet(M), tet(O), tet(W) ve tet(Q) genleri yeraltı sularından ve gübreden en sık elde edilen ribozomal koruma genleri olarak bulunmuĢtur15. Tablo 3: Tetrasiklin (tet) ve oksitetrasiklin (otr) direnç genleri ve ilgili oldukları direnç mekanizmaları 70 Genler Efluks tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), tet(G), tet(H), tet(I), tet(J), tet(Z), tet(30), tet(31) tet(K), tet(L), Otr(B), tcr3, tetP(A), tet(V), tet(Y), otr(C), tet(33), tet(35) tet(38), tet(39) Ribozomal korunma tet(M), tet(O), tet(S), tet(W), tet(Q), tet(T), otr(A), tetP(B), tet(32), tet(36) Enzimatik tet(X), tet(34), tet(37) Bilinmeyen tet(U) 2.6.2.Eritromisin Eritromisin, pek çok gram negatif ve gram pozitif bakterilere, mikoplazma ve klamidya‟lara etki gösteren genellikle bakteriyostatik etkili bir antibiyotiktir. Makrolid-linkozamid-streptogramin B grubunda bulunan antibiyotiklerden olan eritromisin ve taylosinin etki mekanizmaları ve karĢılaĢılan direnç mekanizmaları aynıdır. 50S alt ünitenin 23S ribozomal RNA‟sına bağlanır. Translasyonun elongasyon fazını, translokasyonun veya peptid transferinin inhibisyonu sonucu, durdurarak etki eder. 27 Bugüne kadar eritromisin için üç farklı direnç mekanizması saptanmıĢtır: Hedef bölgede N-metiltransferaz enziminin oluĢturduğu modifikasyonlar; fosforilaz, glikosilaz ve esteraz enzimleri ile eritromisinin yapısında oluĢturulan değiĢiklikler ve antibiyotiğin taĢınmasında görülen degiĢiklikler sonucu direnç oluĢur. Hedef bölgedeki değiĢiklik, stafilokok ve streptokoklarda metilaz enzimini kodlayan erm (eritromisin ribozomal metilaz) genini taĢıyan bir plazmidin kazanılmasıyla ya da S. pneumoniae’ de olduğu gibi kromozom üzerindeki bir transpozon aracılığı ile olur71,72. Eritromisin hayvancılık alanında kullanılmasa da baĢka bir makrolid antibiyotik olan taylosin sıklıkla kullanılmaktadır. Taylosin ve eritromisinin etki ve direnç mekanizmaları aynıdır. Bu nedenle pek çok çevresel izolatta erm geninin de saptanmasının nedeninin bu olabileceği düĢünülmektedir. En yaygın görülen erm geni olan erm(B) taylosin ve diğer makrolid antibiyotiklere de direnç geliĢiminden sorumludur72-74. Yapılan bir çalıĢmada taylosin kullanılan bir çiftlikte eritromisin dirençli streptokok ve stafilokoklar hem hayvanlardan hem de üreticilerden izole edilmiĢtir12. Topraktan izole edilen bakteriler arasında, antibiyotik üreten Streptomyces ve Bacillus türleri de dahil olmak üzere, eritromisin direncine yüksek oranda rastlanmaktadır75. Yakın zamanda yayınlanan bir çalıĢmada toprak örneklerinde efluks tip tetrasiklin direnç genlerinden sonra en sık erm(V) ve erm(E) genlerinin izole edildiği bildirilmiĢtir74. 2.7. Çevresel Ġzolatlarda Antimikrobik Direncin Ölçülmesi Patojenler ve kommensal mikroplar çerçevesinde antimikrobik direnci ölçmek üzere kullanılabilecek yöntemler ve bunların hangisinin daha doğru 28 sonuç verdiği üzerinde uzun süredir tartıĢmalar yapılmaktadır. Bu kapsamda fenotipik veya genotipik antibiyotik direncini tespit etmeye yönelik yöntemler kullanılabilmektedir. Patojen bakterilerde antibiyotik direncinin ölçülmesi amacıyla disk difüzyon veya sıvı dilüsyon gibi inhibisyona dayalı testleri kullanarak fenotipik direncin belirlenmesi konusunda bir mutabakat vardır. Ancak CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, eski adıyla NCCLS)‟nın 2002 dökümanı bir çok hayvan patojeni bakterinin antibiyotik direncinin belirlenmesi için gereken standartları içermemektedir2,39. Bazı antibiyotik direnç fenotiplerinin belirli antibiyotik direnç genlerinin taĢınması yoluyla değil, bakterideki fizyolojik değiĢiklikler sonucu görüldüğü anlaĢılmıĢtır. Gen rezervuarları olarak iĢlev yapabilecek olan kommensal organizmalarda geninin direnç bulunması önemli görülmemektedir. Önemli olan hususun, gen ve bu genin diğer bakterilere aktarılıp aktarılmadığı olduğu düsünülmektedir. Bu nedenle, kommensal mikroorganizmalarda, fenotipik ölçümden çok, belirli gen(ler)i taĢıma yeteneğinin olup olmamasının saptanması önemlidir. Bu bakımdan, “antibiyotik direnci” kavramı kısmen mikroorganizmanın kendisi tarafından belirlenmekte ve fenotipik direnç ölçümü, yalnızca bir patojenle ilgili tedavinin sonucuyla bağlantılı ise klinik önem arz etmektedir2. Bu tez çalıĢmasının antibiyotiklerin yaygın amacı, direnç kullanıldığı bir geni domuz taĢıyan bakterilerin çiftliğinden çevreye yayılımının belirlenmesidir. Elde edilecek sonuçlar antibiyotik direnci ile çevresel ortam arasındaki iliĢkinin açıklanması bakımından tarımsal endüstride son derece önemli olacaktır. Potansiyel antibiyotik direnci rezervleri ve çevreye geçiĢ yolları hakkında daha fazla bilgi elde edinilmesinin kanun koyucular ve üreticilere tarımsal endüstride antibiyotiklerin bilinçli kullanılması hususunda rehberlik edecegi açıktır2. 29 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Toprak Örneklerinin Toplanması Toprak örnekleri, hayvancılık yapılan bir çiftliğin yakınında bulunan soya fasulyesi tarlasından alınmıĢtır. Söz konusu çiftlikte hayvanların yemlerine sürekli eklenmek suretiyle klortetrasiklin; tedavi ve profilaksi amacıyla gerektiğinde penisilin ve taylosin kullanılmaktadır. Ortaya çıkan gübre de adı geçen tarlada zenginleĢtirici olarak kullanılmaktadır. Tarla örneklerin toplanması için kuzey ve güney olmak üzere iki parsele ayrılmıĢtır. Tarla sürüldükten sonra toprağa yayılan gübre yaklaĢık 20 cm derinliğe ulaĢmaktadır. Tarlanın güney parçasına uygulanan gübre (57000 litre/hektar) domuzların bulunduğu yapının altında bulunan gübrelerin toplandığı çukurdan, kuzey kısmına uygulanan (114000 litre/hektar) ise lagün‟den alınmıĢtır. Lagün bu binanın dıĢında yer alan, çukurda biriken gübrenin 6 haftada bir boĢaltıldığı gölete verilen isimdir. Parsellerin yaklaĢık 40‟ar hektarlık kısımlarından örnekler toplanmıĢtır. Her iki parselde de belirlenen bu alanlar için 4x4‟lük Ģablonlar hazırlanmıĢtır (ġekil 8). Dolayısı ile her Ģablon 16 örnek alma noktasını kapsamaktadır. Her bir örnek alma noktasının en fazla 1 m uzağından ve 0-20 cm derinlikten 4‟er örnek toplanmıĢtır. Bu 4 örnek plastik torbada birleĢtirilmiĢ tek bir örnek halinde buzdolabında saklanmıĢtır. Laboratuvara ulaĢan örnekler torbalardan alınıp steril koĢullarda vidalı kapaklı steril plastik deney tüplerine alınmıĢtır. Bu tüplerin bir bölümü toprak bakterilerinin kültürlerinin hazırlanması için 4 ºC‟de, kalan tüpler de daha sonra yapılacak iĢlemler için -20 ºC‟de saklanmıĢtır. 30 Her bir örnek alma gününde tarlanın kuzey parselinden 16, güney parselinden 15 adet toprak örneği alınmıĢtır. Her iki parsel için de 3‟er temsili nokta belirlenmiĢ ve çalıĢmalarda bu örnekler kullanılmıĢtır. Çünkü bu 3‟er noktadan alınan toprak örnekleri aynı zamanda kimyasal bileĢenler (antibiyotik, Cl, NH4, K, Na) yönünden de analiz edilmektedir. K 82 m 82 m ġekil 8: Kare biçimindeki tarladan örneklerin toplandığı noktalar Belirli aralıklarla toplanan örneklerin her seferinde aynı noktalardan alınabilmesi amacıyla GPS (global positioning system) cihazı kullanılmıĢtır. Örnek alma tarihleri Tablo 4‟te gösterilmektedir. Tablo 4: Toprak örneklerinin alındığı günler Örneğin Adı Örnek alma tarihleri Alım* (Gübre uygulanmasından bir gün önce) 5/10/05 Alım1 (Gübre uygulanmasından bir gün sonra) 6/10/05 Alım2(Gübre uygulanmasından üç hafta sonra) 27/10/05 Alım3 (Gübre uygulanmasından üç ay sonra) 11/1/06 *Tarlanın güney kısmına ait alım örnekleri bulunmamaktadır. 31 Ayrıca 5 Ekim 2005 tarihinde tarlaya uygulanmadan hemen önce hem gübrelerin toplandığı çukurdan hem de lagün‟den gübre örnekleri alınmıĢtır. 3.2. Tezde Kullanılan Antibiyotikler ÇalıĢmada kullanılan tetrasiklin ve eritromisin Sigma-Aldrich (S. Lois, MO-ABD) firmasından, besiyerlerindeki mantar kontaminasyonunu önlemek için kullanılan pimarisin (natamisin) ise Calbiochem (San Diego, CA -ABD) firmasından elde edilmiĢtir. Tetrasiklin ve eritromisin için stok çözeltiler hazırlanmıĢtır. Tetrasiklinin distile su ile hazırlanan stok çözeltisi -20 ºC‟de, eritromisinin etanol içinde hazırlanan stok çözeltisi 2-8 ºC‟de saklanmıĢtır. 3.3. Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu Toprak örneklerini süspansiyon haline getirmek için Winogradsky Tuz Çözeltisi kullanılmıĢtır. Bu çözelti aĢağıda belirtildiği gibi hazırlanmıĢtır76: Winogradsky Tuz Çözeltisi (pH 6,8-7,0) K2HPO4 MgSO4. 7H2O NaCl MnSO4.H20 NH4NO3 Distile su 0,4 g 0,13 g 0,13g 1,52 mg 0,5 g 1000 ml‟ye tamamlanır. Bu çözelti membran filtreden süzülerek sterilize edilmiĢ ve 4 ºC‟de saklanmıĢtır. 1:20 oranında seyreltildikten sonra soğuk halde kullanılmıĢtır. 32 Bakteri suĢlarının izolasyonu Ģu Ģekilde yapılmıĢtır77: Her bir toprak örneğinden 1 g alınmıĢ ve 100 ml Winogradsky Tuz Çözeltesi içinde süspansiyonu hazırlanmıĢtır. Daha sonra magnetik karıĢtırıcı kullanılarak 200 rpm hızda yarım saat süreyle karıĢtırılmıĢtır. Aynı çözelti içinde 10 kat azalan seri dilüsyonlar hazırlanmıĢ ve 10-5-10-8 dilüsyonlardan 100‟ er µl alınarak R2A ve Dilue nutrient broth agar (DNBA) besiyerlerine steril cam boncuk yardımıyla inoküle edilmiĢtir. Toprak koĢullarını taklit etmek amacıyla plaklar 24ºC‟de karanlıkta inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon 2 hafta sürmüĢ ve bu süre zarfında elde edilen koloniler 20 µg/ml tetrasiklin ve aynı miktarda eritromisin içeren besiyerlerine ayrı ayrı ekilmiĢtir. Bu besiyerlerinde üreyen bakteriler ilgili antibiyotiklere dirençli bakteriler olarak değerlendirilmiĢtir. Besiyerlerinin hazırlanması aĢamasında mantar kontaminasyonunu önlemek için pimarisin (natamisin) final konsantrasyonu 25 µg/ml olacak Ģekilde tüm besiyerlerine eklenmiĢtir78. Bakterilerin gübreden izolasyonu için toprak bakterileri için kullanılan yöntem uygulanmıĢ ancak farklı olarak R2A besiyeri yanında zengin besin içeriği olan triptik soy agar (TSA) da kullanılmıĢtır. Triptik soy agar plakları 37 ºC‟de 24-48 saat inkübe edilmiĢtir. Son olarak, elde edilen bakteri kolonileri subkültürler yapılarak saflaĢtırılmıĢ ve %25 gliserol içeren çözeltilerde -80 ºC‟de saklanmıĢtır. Kullanılan katı besiyerlerinin formülleri aĢağıda belirtilmiĢtir: Dilüe nutrient broth agar77 Nutrient broth CaCl2.2H2O Agar Distile su 0,08 g 0,6 mmol 15 g 1000 ml‟ye tamamlanır. R2A agar besiyeri (Becton-Dickinson, NJ- ABD) 33 Maya ekstraktı 0,5 g Proteoz pepton No. 3 0,5 g Kazoamino asitler 0,5 g Dekstroz 0,5 g Çözünebilir niĢasta 0,5 g Di sodyum pirüvat 0,3 g Di potasyum fosfat 0,3 g Magnezyum sülfat 0,05 g Agar 15 g Distile su 1000 ml‟ye tamamlanır. R2A ve dilüe nutrient sıvı ve katı besiyerleri otoklavda steril edilmiĢ ve 4 ºC‟de saklanmıĢtır. Besin değeri düĢük olan bu iki besiyerinin topraktan daha fazla sayıda ve daha çeĢitli bakterinin izolasyonuna olanak sağladığı bilinmektedir77,79,80. Bakterilerin topraktan izole edilip saflaĢtırılarak stoklanmalarına dek uygulanan bu iĢlemler ġekil 9’da Ģematize edilerek özetlenmiĢtir. R2A veya DNBA Antibiyotik içermeyen besiyeri % 25 gliserol stok Stoklama 500 µl sıvı besiyeri Direncin ilk tespiti aşaması Saflaştırma Antibiyotik içeren besiyeri 250 µl % 50 gliserol ġekil 9: Dirençli bakterilerin topraktan izolasyonu aĢamaları 34 III.4. Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi Bakterilerin antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesinde agar dilüsyon ve E-test yöntemleri kullanılmıĢtır. 3.4.1.Agar Dilüsyon Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini Agar dilüsyon testinde test edilecek antimikrobik ilacı farklı konsantrasyonlarda içerecek Ģekilde hazırlanmıĢ besiyerleri kullanılır 81. Bu yöntem, test edilecek antibiyotik sayısı az, antibiyotik duyarlılığı belirlenecek mikroorganizma sayısı fazla olduğunda tercih edilebilecek bir testtir. Besiyerlerinin Hazırlanması Antibiyotik duyarlılığının belirlenmesinde bakterilerin izolasyonunda kullanılan besiyerleri olan R2A agar ve DNBA besiyerleri kullanılmıĢtır. Besiyeri içinde son konsantrasyonu 8, 16, 32, 64, 128, 256 µg/ml olacak Ģekilde antibiyotikler sıcaklığı 45-50 ºC‟ye getirilmiĢ besiyerlerine eklenmiĢtir. Besiyerleri kullanılıncaya dek 4 ºC‟de saklanmıĢtır. Ġnokülümün hazırlanması 35 Ġnokülum süspansiyonu, saf olarak elde edilen bakteri kültür hücrelerinden tek koloni alınarak sıvı besiyerinde (R2A sıvı besiyeri ve DNB) hazırlanan bakteri kültürleri kullanılmak suretiyle hazırlanmıĢtır. Kültürlerin bulanıklığı 0.5 McFarland standardına ayarlanmıĢ ve daha sonra kuru besiyerlerinin üzerine her bir örnekten 2 µl damlatılmıĢtır (son inokülum 105 CFU/ µl). Ġnokülum noktaları agara absorbe olduktan sonra plaklar ters çevrilerek oda sıcaklığında 2-3 gün inkübe edilmiĢtir. Üremeyi inhibe eden en düĢük antimikrobik ilaç konsantrasyonu MĠK olarak belirlenmiĢtir. Kontrol suĢları olarak S. aureus ATCC 25923 ve P. aeruginosa ATCC 27853 kullanılmıĢtır. Ayrıca bakteri süspansiyonları antibiyotik içermeyen besiyerlerine ekilerek üreme kontrolleri yapılmıĢtır. 3.4.2.E-Test Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini E-test, difüzyon temeline dayanan ancak diskler yerine belirli ve sürekli bir konsantrasyon değiĢimi olacak Ģekilde antibiyotik içeren plastik Ģeritlerin kullanıldığı bir yöntemdir. Ġnkübasyon süresi sonunda, elips Ģeklindeki inhibisyon alanının Ģeriti kestiği konsantrasyon MĠK (minimum inhibitor konsantrasyon) olarak belirlenir. Ġnokülümün hazırlanması Her bir bakteri için alınan tek koloni 5 ml R2A ve 5 ml DNBA sıvı besiyerine ekilmiĢ ve McFarland 0,5 bulanıklığına ulaĢan bakteri süspansiyonu katı besiyerine steril eküvyon yardımıyla inoküle edilmiĢtir. Bir süre besiyeri yüzeyinin kuruması beklendikten sonra ticari olarak hazırlanmıĢ eritromisin ve tetrasiklin E-test® Ģeritleri (AB Biodisc, Solna, 36 Ġsveç) besiyerine yerleĢtirilmiĢ ve 24 ºC‟de 48 saat inkübe edildikten sonra MĠK değerleri belirlenmiĢtir (Resim 1). III.5. Genomik DNA’nın Ġzolasyonu Tüm genomik DNA‟nın bakteri hücresinden izolasyonu, bu amaç için hazırlanmıĢ ticari kit (MoBio PowerSoil™ DNA Isolation Kit, MoBio Laboratories, CA-ABD) kullanılarak yapılmıĢtır. Bu kitin çalıĢma prensibi sırasıyla Ģu basamaklardan oluĢur: Örneğin homojenizasyonu Mekanik ve kimyasal yöntemlerle hücrenin lizisi Tüm genomik DNA‟nın silika membran tarafından tutulması DNA‟nın yıkanarak membrandan elüsyonu Üretici firmanın önerdiği protokol doğrultusunda kullanılan ticari kit ile DNA izolasyonu Ģu Ģekilde gerçekleĢtirilmiĢtir: Sıvı besiyerinde kültürü yapılan bakteriler santrifüj yardımıyla çöktürülerek konsantre edilmiĢ ve besiyerinin tamamen uzaklaĢması sağlanmıĢtır. DNA‟yı stabilize ve disperse eden tuzlardan oluĢan tampon çözeltisi ile DNA pelleti yeniden süspansiyon haline getirilmiĢtir. Daha sonra hücrelerin lizisi için, SDS (sodyum dodesil sülfat) içeren çözelti bakteri süspansiyonuna eklenmiĢtir. Etkin bir lizis için bu karıĢım 65 ºC‟lik su banyosunda 10 dakika (3 dakikada bir vortekslenerek) tutulmuĢtur. Böylece mikrobiyal hücreden nükleik asitlerin lizisi için kimyasal ve mekanik yöntemler birlikte kullanılmıĢtır. Santrifüj sonrası süpernatan toplanmıĢ ve DNA dıĢı organik ve inorganik materyallerin presipite edilerek uzaklaĢtırılması için yeni bir çözelti eklenmiĢtir. Vortekslendikten sonra karıĢım 5 dakika boyunca 4 ºC‟de bekletilmiĢtir. Santrifüj sonrası süpernatan toplanmıĢtır. Yüksek konsantrasyonda tuz çözeltisi ile tekrar vortekslenen çözelti filtre içeren özel tüplere aktarılmıĢtır. Santrifüj iĢlemi ile DNA, filtre içindeki silika 37 membrana tutturulmuĢtur. Etanol içeren bir çözelti ile filtre yıkanmıĢtır. Daha sonra filtreye elüsyon tamponu damlatılmıĢ ve santrifüj ile DNA filtreden uzaklaĢtırılmıĢtır. Elde edilen genomik DNA örnekleri daha sonraki iĢlemlerde kullanılmak üzere -20 ºC‟de saklanmıĢtır. Her bir örnek, daha sonraki amplifikasyon iĢlemlerinde kullanılmadan önce, jel elektroforez yöntemine tabi tutulmuĢ ve jel üzerinde uygun büyüklükte tek bir bandın görülmesiyle izolasyon iĢleminin uygunluğu teyit edilmiĢtir (Resim 2). 3.6. Bakterilerin Tanımlanması Bakteriler 16S rRNA gen fragmanlarına ait nükleotid sekanslarının belirlenmesi yoluyla tanımlanmıĢtır. Her bakteri türü yüksek değiĢkenlik ve korunurlukta nükleik asit sekansı içeren en az bir 16S rRNA gen kopyası içerir97. Bu yüksek değiĢkenlikteki bölge hedeflenerek bakteriler tür düzeyinde tanımlanabilmektedir. ÇalıĢmalar göstermektedir ki bu kısa rRNA gen sekanslarının kullanılması bakterinin tanımlanmasında genellikle baĢarılı olmaktadır25,82. Bakterilerin sıvı besiyerinde kültürü hazırlandıktan ve genomik DNA‟ları izole edildikten sonra tanımlanmaları için 16S rRNA geninin V3 bölgesi (Escherichia coli’de 341-534 nükleotidler arası) PZR yöntemi kullanılarak amplifiye edilmiĢtir82. 3.6.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA Geninin Amplifikasyonu 16S rRNA geninin V3 bölgesinin amplifikasyonu için LaPara ve ark. larının tanımladığı primerler kullanılmıĢtır82. Primer dizileri Ģu Ģekildedir: 38 V3-341F:5‟-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3‟ (E. coli pozisyonu 341-358) V3-534R: 5‟-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3‟ (E. coli pozisyonu 534-517) PZR son reaksiyon karıĢımı 25 µl olacak Ģekilde kullanılan reaktifler aĢağıda gösterildiği Ģekilde hazırlanmıĢtır: PZR tamponu (10X) dNTP mix (herbiri 2,5 mM) Primer -1 (25 pmol/µl) Primer - 2 (25 pmol/µl) Ex Taq polimeraz (TaKaRa Bio) Kalıp DNA Apirojen distile su 2,5 µl 2,0 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,1 µl 1 µl 18, 40 µl PZR protokolü, 94 ºC‟de 10 dakika baĢlangıç denatürasyon fazından sonra, 94 ºC‟de 30 saniye, 62 ºC‟de 30 saniye, 72 ºC‟de 2 dakika 28 döngü, son basamakta da 72 ºC‟de 8 dakika ve 4 ºC‟de saklama basamaklarından oluĢmaktadır. PZR, GeneAmp 9600 termal cycler (Applied Biosystems, Forster City, CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. PZR ürünleri agaroz jel elektroforezi iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Bu amaçla %2 (a/h)‟lik agaroz jel hazırlanmıĢtır. Jelin hazırlanması sırasında kullanılan 1X Tris-Borik asit-EDTA (TBE) tamponu aĢağıda formülü verilen 50X TBE tamponu dilüe edilerek hazırlanmıĢtır. 50X TBE tamponu Ģu Ģekilde hazırlanmıĢtır83: 50X Tris-Borik asit-EDTA (TBE) Tamponu83 Tris baz Borik asit (Sigma) 0,5 M EDTA (pH 8,0) Steril distile su 54 g 27,5 g 20 ml 1000 ml‟ ye tamamlanır. 39 0,5 M EDTA (pH 8,0) Tamponu83 EDTA (Sigma) Steril distile su 186,1 g 1000 ml‟ ye tamamlanır. Uygun miktarlarda karıĢtırılan agaroz ve 1X TBE tamponu mikrodalga fırında çözelti haline getirilmiĢ ve polimerleĢmesi için elektroforez tepsisine dökülmüĢtür. Yüklemenin yapılacağı çukurların oluĢması için tarak jel içine yerleĢtirilmiĢtir. Polimerizasyon tamamlanınca tarak çıkarılmıĢ ve tepsi 1X TBE çözeltisi içeren elektroforez tankına alınmıĢtır. Üçer µl PZR ürünü ve yükleme tamponu (Orange G) karıĢtırılarak her bir çukura konmuĢ ve 130 V akım uygulanarak elektroforez gerçekleĢtirilmiĢtir. DNA‟nın boyanıp görüntülenebilmesi için jel etidyum bromür çözeltisi içinde 20 dakika tutulmuĢtur. Daha sonra ultraviyole ıĢığı altında bilgisayar ortamında görüntülenmiĢtir. Elde edilen PZR ürünleri QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAABD) kullanılarak saflaĢtırılmıĢtır. Bu kit ile 100 bp–10 kb büyüklüğünde tek/çift zincirli DNA fragmanları içeren PZR ürünleri saflaĢtırılabilmektedir. Üretici firmanın önerdiği protokol doğrultusunda PZR ürünleri aĢağıda anlatıldığı Ģekilde saflaĢtırılmıĢtır: PZR ürününe guanidin hidroklorür ve izopropanol içeren bir tampon eklenmiĢ ve çözeltinin renginin sarı olup olmadığı kontrol edilmiĢtir (Sarı renk çözeltinin pH‟sının ≤7,5 olduğunu göstermektedir. pH değeri metodun verimli çalıĢabilmesi açısından önemlidir. Çözeltinin rengi sarı değil ise 3 M sodyum asetat çözeltisi, pH 5.0, ile ayarlanmalıdır.). Daha sonra PZR ürünü üretici tarafından sağlanan kolona eklenmiĢ ve DNA‟nın kolona bağlanması sağlanmıĢtır. Yıkama tamponu eklenmiĢ, santrifüjlenmiĢ ve süpernatan atılmıĢtır. Kolon temiz baĢka bir ependorf tübüne aktarılmıĢtır. Kolondan DNA‟yı elüe etmek için elüsyon tamponu (10mM Tris-Cl, pH 7.0- 8.5) eklenmiĢtir. Santrifüj sonrası 40 saf DNA elde edilmiĢtir. Bu örnekler kullanılıncaya kadar -20 ºC‟de saklanmıĢtır. Dizi analizi yapılmadan önce her bir örnekteki DNA konsantrasyonu DU7500 spektrofotometresi (Beckman, CA-ABD) kullanılarak belirlenmiĢtir. 3.6.2. Dizi Analizi ÇalıĢmaları SaflaĢtırılan PZR ürünlerinin dizi analizi tek zincir için (primer V3-341 Forward) Illinois Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi tarafından gerçekleĢtirilmiĢtir. Bu merkezde dizi analizleri Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemi ile gerçekleĢtirilmektedir. ĠĢlem dizi analizi yapılacak DNA'nın hazırlanması, reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi olmak üzere üç ana aĢamadan oluĢmaktadır. Bu yöntemde asimetrik amplifikasyon ile elde edilen tek iplikçikli DNA, DNA polimeraz enzimi, 2',3'Dideoksinükleozidtrifosfat (ddNTP) ve radyoaktif olarak iĢaretlenmiĢ dinükleozidtrifosfat (dNTP) kullanılır. 2',3'Dideoksinükleozidtrifosfat (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP'lerden farklı olarak deoksiriboz'un 3' noktasında hidroksil grubu taĢımamaktadır. 3' hidroksil grubunun olmaması ardından gelen dNTP'lerin fosfodiester bağı oluĢturmasını engeller. Doğal olarak DNA zincirinin daha fazla uzaması engellenir. Bir ddNTP ile klasik dört dNTP aynı reaksiyon karıĢımının içine konulduğunda, DNA zincir uzaması için aralarında bir yarıĢma olur ve ddNTP‟nin bağlanması ile reaksiyon sonlanır. Bu reaksiyon sonucunda, uzunluğu primer sonundan sonlanmaların olduğu bölgeye kadar olan DNA parçaları ortaya çıkar. Her bir reaksiyon için bir ddNTP kullanılarak (A,C,G,T için) dört farklı enzimatik reaksiyon elde edilir84-86 . 41 3.6.3. BLAST Programı Elde edilen diziler gen bilgi bankasında bulunan ilgili en yakın sekanslarla nükleotid-nükleotid Blast programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır87,99 ġekil 10’da bakteri suĢlarının tanımlanması amacıyla yapılan iĢlemler Ģematik olarak gösterilmiĢtir. DNA‟nın ekstraksiyonu Bakteri kültürü PZR 341F VS 534R Dizi analizi BLAST programına aktarma Bakteri suĢunun tanımlanması ġekil 10: Bakterilerin tanımlanması deneyleri akıĢ Ģeması. 3.7. Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik Özellikleri 3.7.1. Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması 42 Ġzole edilen bakterilerden 46 tanesi temsili olarak seçilmiĢtir. Seçim yapılırken, bilinen bakterilerle benzerlik oranı düĢük ve aynı zamanda MĠK değerleri yüksek olan izolatlara öncelik verilmiĢtir. Bu izolatlarda tetrasiklin direncinden sorumlu efluks genlerinden olan tet(C), tet(H), tet(Z) ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu tet(W), tet(M), tet(O), tet(Q) genlerinin varlığı araĢtırılmıĢtır. PZR-inhibe edici maddelerin negatif etkisini kontrol etmek amacıyla 16S rRNA da diğer örneklerle birlikte amplifiye edilmiĢtir. PZR son reaksiyon karıĢımı 25 µl olacak Ģekilde kullanılan reaktifler aĢağıda gösterildiği Ģekilde hazırlanmıĢtır15: PZR tamponu (10X) dNTP mix (herbiri 2,5 mM) MgCl2 Primer-1 (25 pmol/µl) Primer-2 (25 pmol/µl) Amplitaq gold polimeraz Biosystems) Kalıp DNA Apirojen distile su (Applied 2,5 µl 2,0 µl 2,0 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,25 µl 1 µl 16, 25 µl Kullanılan PZR döngü programı Ģu Ģekildedir (tet(Z) ve tet (H) hariç)15: 1. 94 ºC‟de 10 dakika 2. 94 ºC‟de 30 saniye 3. Bağlanma sıcaklığı (Tablo 5) 30 saniye 4. 72 ºC‟de 2 dakika 5. 2-4. basamakların 40 kez tekrarlanması 6. 72 ºC‟de 10 dakikadan oluĢmaktadır. 7. 4 ºC‟de saklama Tet(Z) ve tet (H) geni için kullanılan PZR döngü programı Ģu Ģekildedir15: 1. 94 ºC‟de 2. 94 ºC‟de 3. 68 ºC‟de 10 dakika 30 saniye 30 saniye 43 4. 72 ºC‟de 30 saniye 5. 2-4. basamakların 35 kez tekrarlanması 6. 94 ºC‟de 30 saniye 7. 63 ºC‟de 30 saniye 8. 72 ºC‟de 30 saniye 9. 6 -8. basamakların 15 kez tekrarlanması 10. 72 ºC‟de 30 saniye 11. 4 ºC‟de saklama PZR, GeneAmp 9600 termal cycler (Applied Biosystems, Forster City, CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Elektroforez ve DNA‟nın boyanıp görüntülenmesi iĢlemleri III.6.1. bölümünde anlatıldığı gibi gerçekleĢtirilmiĢtir. Hedeflenen her bir tetrasiklin direnç geni için kullanılan primerler ve özellikleri Tablo 5’de gösterilmiĢtir. Tablo 5: Tet genlerinin PZR ile amplifikasyonunda kullanılan primerler ve 88 özellikleri 44 Primer Hedef gen Dizilim (5´-3´) Bağlanma (annealing) Amplikon sıcaklığı (ºC) büyüklüğü (bp) tetC-FW tet(C) tetC-RV tetH-FW tet(H) tet(M) tet(O) tet(Q) tetW-RV 185 ACAGAAAGCTTATTATATAAC 55 171 ACGGARAGTTTATTGTATACC 60 170 AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG 63 166 60 203 64 167 CGGAGTGTCAATGATATTGCA tet(Z) tetZ-RV tetW-FW 66 TGGCGTATCTATAATGTTGAC tetQ-RV tetZ-FW CAGTGAAAATTCACTGGCAAC TGGCGTGTCTATGATGTTCAC tetO-RV tetQ-FW 206 ATCCAAAGTGTGGTTGAGAAT tetM-RV tetO-FW 70 GCGTAGAGGATCCACAGGACG tetH-RV tetM-FW GCGGGATATCGTCCATTCCG CCTTCTCGACCAGGTCGG ACCCACAGCGTGTCCGTC tet(W) GAGAGCCTGCTATATGCCAGC GGGCGTATCCACAATGTTAAC 3.7.2. Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması On sekiz örnekte primerler 6 farklı eritromisin rRNA metilaz direnç genini (erm A,B,C,F,G,Q) amplifiye etmek için kullanılmıĢtır. Eritromisin direnç genlerinin belirlenmesi için multipleks PZR yöntemi kullanılmıĢtır. PZR son reaksiyon karıĢımı 25 µl olacak Ģekilde kullanılan reaktifler aĢağıda gösterildiği Ģekilde hazırlanmıĢtır: 2X qiagen multipleks PZR master mix 10X primer karıĢımı (2µM herbir primerden) Kalıp DNA 12,5 µl 2,5 µl 1 µl 45 9 µl Apirojen distile su (RNase free) Kullanılan PZR döngü programı Ģu Ģekildedir : 1. 95 ºC‟de 15 dakika 2. 94 ºC‟de 30 saniye 3. 60 ºC‟de 90 saniye 4. 72 ºC‟de 90 saniye 5. 2-4. basamakların 27 kez tekrarlanması 6. 72 ºC‟de 10 dakika 7. 4 ºC‟de saklama PZR, GeneAmp 9600 termal cycler (Applied Biosystems, Forster City, CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Elektroforez ve DNA‟nın boyanıp görüntülenmesi iĢlemleri 3.6.1. bölümünde anlatıldığı gibi gerçekleĢtirilmiĢtir. Farklı olarak %4 (a/h)‟lük agaroz jel hazırlanmıĢtır ve elektroforez tamponu olarak kullanılan 1X TAE tamponu kullanılmıĢtır. 1X TAE tamponu 50X stok çözeltiden dilüe edilerek hazırlanmaktadır. 50X Tris-Asetat-EDTA (TAE) tamponu Ģu Ģekilde hazırlanmaktadır83: 50X Tris-Asetat-EDTA (TAE) Tamponu83 Tris baz Glasiyal asetik asit 0,5 M EDTA (pH 8,0) Steril distile su 242 g 51,1 ml 100 ml 1000 ml‟ ye tamamlanır. Hedeflenen her bir eritromisin direnç geni için kullanılan primerler ve özellikleri Tablo 6‟da gösterilmiĢtir. Tablo 6: Erm genlerinin PZR ile amplifikasyonunda kullanılan primerler ve 89 özellikleri 46 Primer Hedef gen Dizilim (5´-3´) Bağlanma (annealing) Amplikon sıcaklığı (ºC) büyüklüğü (bp) ermA-FW erm(A) ermA-RV ermB-FW erm(B) Erm(C) Erm(F) ermQ-RV 65 191 AATCGTGGAATACGGGTTTGC 63 293 TCTGGGAGGTTCCATTGTCC 65 424 63 255 68,60 154 TTCAGGGACAACTTCCAGC Erm(G) ermG-RV ermQ-FW GGTTGCTCTTGCACACTCAAG CGTCAATTCCTGCATGTTTTAAGG ermF-RV ermG-FW 157 CAGTTGACGATATTCTCGATTG ermC-RV ermF-FW 63 CAAGAACAATCAATACAGAGTCTAC ermB-RV ermC-FW AGTCAGGCTAAATATAGCTATC GTGAGGTAACTCGTAATAAGCTG CCTCTGCCATTAACAGCAATG erm(Q) CACCAACTGATATGTGGCTAG CTAGGCATGGGATGGAAGTC 4. BULGULAR 4.1. Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu Tarlanın her iki parselinden (kuzey ve güney) Tablo 4„te belirtilen tarihlerde alınan toprak örneklerinden izole edilen ve subkültürleri yapılarak saf olarak elde edilen bakterilerin gliserol stokları hazırlanmıĢ ve -80 ºC‟de saklanmıĢtır (ġekil 9). 47 Bakterilerin topraktan izolasyonunun ilk aĢamasında dilüsyon çözeltisi olarak Winogradsky tuz çözeltisi kullanılmıĢtır. Tetrasiklin ve eritromisin dirençli bakterilerin seçilebilmesi için bu antibiyotikleri içeren (20 µg/ml) R2A agar ve dilüe nutrient broth agar besiyerleri kullanılmıĢtır. Ayrıca besiyerlerine 25 µg/ml natamisin (primarisin) mantar kontaminasyonunu önlemek üzere eklenmiĢtir. Bu besiyerlerinde görülen üreme bakterilerin ilgili antibiyotiğe dirençli olduğunun ilk göstergesi olarak kabul edilmiĢ ve daha sonra MĠK profilleri antimikrobik duyarlılık testleriyle belirlenmiĢtir. Tarlaya gübre uygulamasından bir gün önce (Alım), uygulamadan bir gün sonra (Alım1) , 3 hafta sonra (Alım2) ve 3 ay sonra (Alım3) tarlanın her iki parselinden alınan toprak örneklerinden izole edilen bakterilerin sayısı Tablo 7‟de verilmiĢtir. Tablodan da anlaĢıldığı gibi gübre ve topraktan toplam 325 örnek izole edilmiĢtir. Bu izolatların %65‟i tanımlanmıĢtır. Tablo 7: Toprak ve gübre örneklerinden izole edilen antibiyotik dirençli bakterilerin elde edildikleri bölge ve zaman bakımından dağılımı A. Toplam izolat sayısı GÜNEY PARSEL *X KUZEY PARSEL 20 ALIM1 (1 GÜN SONRA) 38 34 72 ALIM2 (3 HAFTASONRA) ALIM3 (3 AY SONRA) 54 74 23 41 76 115 TOPLAM 166 118 284 TOPRAK ALIM TOPLAM 20 48 GÜBRE Çukur gübresi Lagün gübresi TOPLAM 26 15 41 GÜNEY PARSEL KUZEY PARSEL ALIM X 20 20 ALIM1 (1 GÜN SONRA) 22 32 59 ALIM2 (3 HAFTA SONRA) 36 16 55 ALIM3 (3 AY SONRA) 21 33 53 TOPLAM 79 101 180 GÜBRE Çukur gübresi Lagün gübresi 22 11 B. TanımlanmıĢ izolatların sayısı TOPRAK TOPLAM TOPLAM 33 *: Güney parseline ait Alım örnekleri bulunmamaktadır. 4.2. Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi Dirençli bakterilerin seçimi bakterilerin antibiyotik içeren plaklara (20 µg/ml) ekilmesi yoluyla izolasyon aĢamasında yapılmıĢtır. Ancak hem kontrol hem de direncin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MĠK) düzeyinde belirlenmesi amacıyla agar dilüsyon ve E-test antibiyotik duyarlılık testleri uygulanmıĢtır. Resim 1‟de duyarlı ve dirençli iki farklı izolata ait E-test plakları görülmektedir. Elips Ģeklindeki inhibisyon alanının Ģeriti kestiği bölgede okunan değer MĠK değeri olarak belirlenmiĢtir. 49 Resim 1: E-test yöntemiyle antibiyotik duyarlılığı ölçülmüĢ iki bakteri TanımlanmıĢ tanımlanmamıĢ izolatlar 4 izolatın içinden seçilen antibiyotik 124 duyarlılığı izolatın (%58) ve belirlenmiĢtir. Bu örneklerden 101‟i topraktan 27‟si gübreden izole edilen örneklerdir. CLSI‟ nın dökümanları referans alınarak tetrasiklin için yorumlama kriteri (breakpoint değeri) ≥16 µg/ml kabul edilmiĢtir. Toprak örneklerinin %68‟i ve gübre örneklerinin %70‟i tetrasikline dirençli bulunmuĢtur. Ayrıca çukur gübresinden alınan örneklerde direnç oranı %74‟tür ve lagünden alınan örneklerin direnç oranından (%62.5) daha yüksektir. Bununla beraber toprak örneklerinin %42‟sinin MĠK değeri ≥256 µg/ml olarak bulunmuĢtur. w Eritromisin için yorumlama kriteri CLSI‟nın dökümanları referans kabul edilerek ≥8 µg/ml olarak alınmıĢ ve toprak örneklerinin %97‟sinin ve gübre örneklerinin %67‟sinin eritromisine dirençli olduğu bulunmuĢtur. Toprak örneklerinin %88‟inin MĠK değeri ≥256 µg/ml olarak bulunmuĢtur. Toprak örneklerinin %69‟u, gübre örneklerinin ise %44‟ ü eritromisin ve tetrasiklinin her ikisine birden dirençlidir. 50 Grafik 1 ve 2‟de bakterilerin eritromisin ve tetrasiklin duyarlılık profilleri görülmektedir. 100 Bakteri Sayısı (%) 80 60 40 20 0 ≤8 9-16 % tet direncli bakteri % erm direncli bakteri 17-32 33-64 MĠK Değerleri (µg/ml) 65128 129≥256 Grafik 1: Topraktan izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri Bakteri sayısı (%) 100 80 60 40 20 0 ≤8 9-16 17-32 33-64 % tet direncli bakteri % erm direncli bakteri 65128 129≥256 MİK Değerleri (µg/ml) Grafik 2: Gübreden izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri Sonuçlar türler açısından değerlendirilmiĢ ve Ģu bulgulara ulaĢılmıĢtır: Antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ 22 gram pozitif bakterinin 20‟si (%90‟ı), 51 102 gram negatif bakterinin ise %94‟ü eritromisine karĢı dirençlidir. Bu gram negatif bakterilerden 10 tanesi gübreden izole edilmiĢtir. Topraktan ve gübreden izole edilen bakteriler eritromisin direnci yönünden cins düzeyinde değerlendirildiğinde, tüm cinslerde (Haloenella hariç) dirençli suĢların bulunduğu görülmektedir. AĢağıda sayılan cinslere ait tüm izolatlar eritromisine dirençlidir: Stenotrophomonas, Lysobacter, Cellvibrio, Variovorax, Bradyrhizobium, Phenylobacterium, Rhodocista, Caulobacterium, Chryseobacterium, Burkholderia, Sphingomonas, Ahrensia, Flavobacterium, Bacteroidetes, Empedobacter, Corynebacterium, Flexibacteriaceae, Mycobacterium, Enterococcus, Salinibacterium, Agrococcus ve Streptomyces, Staphylococcus. Bunun yanında Pseudomonas suĢlarının %93‟ü, Dyella ve Acinetobacter suĢlarının %83‟ü, Microbacterium suşlarının %75’i ve Bacillus suĢlarının %50‟si eritromisine dirençlidir. Sonuçlar tetrasiklin için değerlendirildiğinde antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ 22 gram pozitif bakterinin 18‟i (%82), 102 gram negatif bakterinin ise %66‟sı tetrasikline dirençli bulunmuĢtur. Topraktan ve gübreden izole edilen bakteriler tetrasiklin direnci yönünden cins düzeyinde değerlendirildiğinde, tüm cinslerde dirençli izolatların bulunduğu görülmektedir. tetrasikline dirençli olduğu Stenotrophomonas, Hatta bazı cinslerde tüm suĢların görülmektedir. Lysobacter, Phenylobacterium, Caulobacterium, Chryseobacterium, Haloanella, Flexibacteriaceae, Mycobacterium, Bu Ģunlardır: cinsler Acinetobacter, Variovorax, Bradyrhizobium, Rhodocista, Cellvibrio, Bacteroidetes, Streptomyces, Salinibacterium, Agrococcus, Bacillus ve Staphylococcus‟u kapsamaktadır. Bunun yanında Burkholderia suĢlarının Microbacterium %88‟i, suĢlarının Flavobacterium %75‟i, Enterococcus suĢlarının suĢlarının %66‟sı, %60‟ı, 52 Corynebacterium ve Dyella suĢlarının %50‟si ve Pseudomonas suĢlarının %35‟i tetrasikline dirençli bulunmuĢtur. Sonuçlar tarlanın parseli ve örnek alınma zamanı açısından değerlendirildiğinde tetrasiklin direnci ile ilgili olarak Ģu değerlendirmeler yapılabilir: Toprağa gübre uygulanmasından önce ve sonra izole edilen bakteri suĢlarında tetrasiklin direnç oranı değerlendirildiğinde, gübre uygulanmadan önce (Alım) bu oran %87,5 iken uygulamadan bir gün sonra (Alım1) %94,4; 3 hafta sonra (Alım2) %67 ve 3 ay sonra (Alım3) ise %56 olduğu görülmektedir. Gübre örneklerinden izole edilen bakterilerde direnç oranı %68‟dir. En fazla sayıda dirençli izolat sırasıyla güney parselinden alınan Alım2 (%20), kuzey parselinden alınan Alım3 (%18) ve kuzey Alım1 (%16) toprak örneklerinde saptanmıĢtır. Toprağa gübre uygulamasından önce ve sonra izole edilen bakteri suĢlarında eritromisin direnç oranı değerlendirildiğinde, gübre uygulanmadan önce (Alım) eritromisine direnç %100 iken uygulamadan bir gün sonra (Alım1) %94; 3 hafta sonra (Alım2) %97 ve 3 ay sonra (Alım3) ise %100‟e çıktığı görülmektedir. Gübre örneklerinden izole edilen bakterilerde direnç oranı %71‟dir. En fazla sayıda dirençli izolat kuzey parselinden alınan Alım3 (%30), güney parselinden alınan Alım2 (%23) ve kuzey parselinden alınan Alım1 (%16) toprak örneklerinde saptanmıĢtır. 4.3. Genomik DNA’nin Ġzolasyonu Genomik DNA izolasyonu ticari bir kit (MoBio PowerSoil™ DNA Isolation Kit, MoBio Laboratories, CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Daha 53 sonra agaroz jel elektroforezine tabi tutularak DNA‟nın kalitesi kontrol edilmiĢtir. Resim 2‟de izole edildikten sonra genomik DNA‟nın agaroz jel elektroforezinde verdiği bantlar görülmektedir. 1 18 A Genomik DNA B Sıra 1 ve 18: 1 kb DNA marker (A) (B) Sıra 2 : E16 T11 Sıra 3 : E15 ET16 Sıra 4: E14 ET10 Sıra 5: E13 ET9 Sıra 6: E12 ET8 Sıra 7: E11 ET7 Sıra 8: E10 ET2 Sıra 9: E9 E12 Sıra 10: E8 E24 Sıra 11: E7 E23 Sıra12: E6 E22 Sıra 13: E5 E21 Sıra 14: E4 E20 Sıra 15;E3 E19 Sıra 16:E2 E18 Sira 17:E1 E17 Resim 2: Genomik DNA’nin agaroz jel elektroforezinde görülen bantları 4.4. Bakterilerin Tanımlanması Bakteriler 16S rRNA gen fragmanlarına ait nükleotid sekanslarının belirlenmesi yoluyla tanımlanmıĢtır. 4.4.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA Geninin Amplifikasyonu 16S rRNA geninin V3 bölgesi (Escherichia coli’ de 341-534 nükleotidler arası) PZR yöntemi kullanılarak amplifiye edilmiĢtir. PZR ürünlerinin uygun büyüklükte olup olmadığı agaroz jel elektroforezi yöntemi ile örnekler ve marker karĢılaĢtırılarak saptanmıĢtır. Uygun yerde band vermeyen veya 54 zayıf band veren örnekler için PZR tekrarlanmıĢtır. Elde edilen PZR ürünleri QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA-ABD) kullanılarak saflaĢtırılmıĢtır. Resim 3‟ te PZR yöntemi ile amplifikasyonu yapılmıĢ bazı örneklerin bir agaroz jel elektroforezi fotoğrafı görülmektedir. 1 14 1636 bp 506 bp V3 Fragmanı 220 bp Sıra 14: 1 kb DNA marker Sıra 1 : Pozitif kontrol Sıra 2 : Negatif kontrol Sıra 3 : T2 Sıra 4: T1 Sıra 5: E31 Sıra 6: E29 Sıra 7: E19 Sıra 8: ET16 Sıra 9: ET10 Sıra 10: ET6 Sıra 11: ET4 Sıra12: ET2 Sıra 13: ET1 Resim 3: 16S rRNA geninin V3 fragmanının PZR ile amplifikasyonu 4.4.2. Dizi Analizi ÇalıĢmaları SaflaĢtırılan PZR ürünlerinin dizi analizleri Illinois Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi (https://unicorn.biotec.uiuc.edu) tarafından Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemi kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. 4.4.3. BLAST Programı Elde edilen diziler, GenBank bilgi bankasında bulunan bilinen en yakın dizilerle nükleotid-nükleotid Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) programı kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır. Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes olmak üzere 4 farklı Ģubeden toplam 213 bakteri tanımlanmıĢtır. 55 Topraktan izole edilen tüm bakterilerin % 69‟ u Proteobacteria Ģubesine ait olup bu Ģubenin 4 takımına (alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria, gamma-proteobacteria, epsilon delta-proteobacteria) ait bakteriler bulunmaktadır. Ġzole edilen diğer gram negatif bakteriler Bacteroidetes Ģubesine ait olup bu Ģubeden 2 aileye ait bakteriler izole edilmiĢtir. Gram pozitif bakteriler Actinobacteria ve Firmicutes olmak üzere iki farklı Ģubeye aittir. Actinobacteria Ģubesinden 5 aileye ait izolatlar elde edilmiĢtir. Firmicutes Ģubesi Lactobacillales ve Bacillales takımlarına ait bakterilerden oluĢmaktadır. Gram negatif bakteriler toplam 180 toprak örneğinin % 84‟ünü, çukur ve lagün olmak üzere toplam 33 gübre örneğinin % 41‟ini oluĢturmaktadır. Bu dağılım toprak bakterilerinin normal dağılımı ile parelellik göstermektedir90. Tablo 8„de 16S rRNA geninin amplifikasyonu ile tanımlanan izolatların dağılımı verilmektedir. 56 Tablo 8: Topraktan ve gübreden izole edilen bakterilerin filogenetik özellikleri ġube Takım Ġzolat sayısı Aile grupları 31 Bradyrhizobiaceae Phyllobacteriaceae Caulobacteraceae Sphingomonadaceae Rhodospirillaceae Rhodobacteraceae Rhizobiaceae Beijerinckiaceae Methylobacteriaceae Brucellaceae Aile gruplarının izolat sayısı 8 6 4 1 1 1 1 1 1 1 Betaproteobacteria 37 Burkholderiaceae Comamonadaceae Rhodocyclaceae 29 3 1 Gammaproteobacteria 80 Pseudomonadaceae Xanthomonadaceae Moraxellaceae 42 25 8 Bacteroidetes Epsilonproteobacteria Sphingobacteria 1 8 Campylobacteraceae Flexibacteraceae Sphingobacteriaceae 1 4 4 Actinobacteria Flavobacteria Actinobacteridae 8 32 Lactobacillales Bacillales 16 Flavobacteriaceae Microbacteriaceae Mycobacteriaceae Corynebacteriaceae Nocardioidaceae Streptomycetaceae Enterococcaceae Staphylococcaceae Bacillaceae 8 10 7 5 5 4 6 4 4 Proteobacteria Alphaproteobacteria Firmicutes 57 Paenibacillaceae 2 4.5. Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik Özellikleri 4.5.1.Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması Seçilen 46 izolatta tetrasiklin direncinden sorumlu efluks genlerinden olan tet(C), tet(H), tet(Z) ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu tet(M), tet(O), tet(Q), tet(W) genlerinin varlığı araĢtırılmıĢtır. tet(H) ve tet(Z) genleri için farklı PZR programı ve reaksiyon karıĢımları hazırlanmıĢtır. PZR-inhibe edici maddelerin negatif etkisini kontrol etmek amacıyla 16S rRNA diğer örneklerle birlikte tüm reaksiyonlara eklenmiĢtir. Tetrasiklin direnç fenotipleri belirlenmek üzere seçilen 46 örnekte 6 farklı direnç geni araĢtırılmıĢ ve 24 suĢta direnç genine rastlanmıĢtır. Resim 4‟te PZR sonrası elde edilen ürünlerin agaroz jel elektroforezinde tet(Q) geni için verdiği bantlar görülmektedir. 58 Pozitif kontrol CN14G-2 Negatif kontrol CN3G-11 Pozitif kontrol Resim 4: Ġki farklı izolatta tet(Q) gen bölgelerinin agaroz jel elektroforez görüntüleri Tablo 9‟da tetrasiklin direnç genlerinin bakteri suĢlarına ve örneklerin alınma zamanına göre dağılımı görülmektedir. Tabloda da görüldüğü gibi tet(C), tet(O) altıĢar izolattan olmak üzere en sık saptanan tetrasiklin direnç genleridir. tet(Z) 4 farklı izolatta; tet(H), tet(W) ve tet(Q) 2 ayrı izolatta ve tet(M) de 1 izolatta saptanmıĢtır. Gübre izolatlarından biri (PM-1) tet(C), tet(H), tet(O) genlerini, bir diğeri de (PMae) tet(M), tet(O), tet(W) genlerini birlikte taĢımaktadır. Toprak ve gübre örnekleri taĢıdıkları direnç genleri yönünden karĢılaĢtırıldıklarında; tet(Q) direnç geni sadece toprak izolatlarında ve tet(W) ve tet(M) direnç genleri ise sadece gübre izolatlarında bulunmakta iken diğer tüm tetrasiklin direnç genlerinin hem toprak hem gübre izolatlarında saptandığı görülmüĢtür. 59 Tetrasiklin direnç genleri, gübrenin toprağa uygulanması öncesi (alım), bir gün sonra (Alım1), 3 hafta sonra (Alım2) ve 3 ay sonra (Alım3) alınan örneklerden izole edilen dirençli suĢlarda bulunmuĢtur. Gübre izolatlarında tetrasiklin direnç genlerini β-proteobacteria takımına ait bakteriler ve gram pozitif bakteriler taĢımaktadır. 4.5.2.Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması Toplam 18 izolat eritromisin direnç genleri yönünden değerlendirilmiĢ ve her ikisi de gübreden izole edilmiĢ olan 2 izolatta erm(Q) genine rastlanmıĢtır. Tablo 9: Tetrasiklin direnç genlerinin bakteri suĢlarına ve örneklerin alınma zamanına göre dağılımı Gen Tet(C) Tet(H) Tet(Z) Pseudomonas sp Toprak Örnek alım zamanı alım3 Pseudomonas sp Toprak alım1 Burkholderia pyrrocinia Toprak alım1 Beta proteobacteria Gübre Acinetobacter baumannii Toprak alım1 Lysobacter Toprak alım Agrococcus Toprak alım1 Burkholderia pyrrocinia Toprak alım 1 Beta proteobacteria Gübre Burkholderia pyrrocinia Toprak Streptomyces spp. Gübre Streptomyces atrovirens Toprak Microbacterium Gübre Bakteriler Örnek alım 1 alım 2 60 Tet(M) Staphylococcus simulans Gübre Tet(O) Burkholderia stabilis Toprak Beta proteobacteria Gübre Dyella japonica Toprak alım Flavobacterium Toprak alım3 Staphylococcus simulans Gübre Bradyzobium elkanii Toprak alım3 Burkholderia pyrrocinia Toprak alım Chryseobacterium joostei Toprak alım Staphylococcus simulans Gübre Enterococcus sp Gübre Tet(Q) Tet(W) alım3 5. TARTIġMA Antibiyotik direnci tüm dünyada yaygın olarak görülen ve hastalıkların tedavisinde karĢılaĢılan çok ciddi bir sorundur. Antibiyotiklerin bilinçli kullanımı direncin geliĢimini önlemede veya yavaĢlatmada son derece önemlidir. Ülkemiz de dahil olmak üzere tüm dünyada antibiyotik tüketiminde akılcı yaklaĢımlara kullanımını antibiyotiklerin ihtiyaç sınırlamak vardır. Pek çok amacıyla ülkede politikalar oluĢturulmaktadır. Avrupa Birliği‟ne üye ülkelerde antibiyotiklerin hayvancılık alanında terapötik amaçlar dıĢında kullanımı yasaklanmıĢ iken Amerika BirleĢik Devletleri‟nde tarım ve hayvancılıkta antibiyotik kullanımını sınırlayan yasa taslağı Amerikan Kongresi‟nde halen görüĢülmektedir. Ülkemizde de Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı‟nca yem katkı maddesi olarak bazı antibiyotiklerin kullanımını yasaklanmıĢtır. Hayvancılıkta antibiyotik 61 kullanımının antibiyotik direncine olan direkt etkisinin gösterilmesinde çeĢitli zorluklar vardır. Bu nedenle bu konu dünyada halen tartıĢılmaktadır ve çok sayıda çalıĢmalar yürütülmektedir. Antibiyotikler hayvancılıkta tedavi, profilaksi ve büyümeyi hızlandırmak amacıyla kullanılmaktadır1-7. Bu antibiyotiklerin %75‟lere varan oranda hayvanlar tarafından absorblanmayıp idrar ve feçesle atıldığı bilinmektedir36,95. Bu nedenle ahır gübrelerinin, toprak ve yer altı sularının antibiyotik ile kontaminasyonuna yol açtığı düĢünülmektedir15,16,27. Bu kontaminasyonun çevresel ortamlarda yaĢayan mikroorganizmaların antibiyotik direnci geliĢtirmelerine yönelik seçici etkisi araĢtırmacıların üzerinde önemle durdukları konulardan biridir 33,42,43. Hayvanların yemine ve içme suyuna terapötik dozlarının altında belli bir düzeyde hergün eklenen antibiyotiklerin özellikle hayvanların sindirim sisteminde bulunan bakteriler arasında direncin seçimine ve yayılımına olan etkisini aydınlatmak üzere pek çok çalıĢma yapılmaktadır11,45-47,96. Önemli bir diğer konu da, gübre içinde bulunan patojen ve/veya kommensal bakterilerin taĢıdığı direnç genleri ve bunların yanı sıra serbest halde bulunan direnç genlerinin toprak ve yeraltı suları gibi çevresel ortamlarda bakteriler arasında aktarımıdır67. Tüm bu etkenlerin değerlendirilmesi amacıyla yapılan çalıĢmaların büyük bir kısmı da hayvan dıĢkısının gübreleme yoluyla toprağa uygulanmasının sonuçlarını değerlendirmeye yöneliktir23-26,75,91. Bu çalıĢmada domuz yetiĢtirme çiftliği çevresinde bulunan bir tarlaya gübre uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik direnç durumlarına olan etkisi araĢtırılmıĢtır. Sonuçlar yukarıda sayılan bu iki faktör ıĢığında değerlendirilmiĢtir. 62 Toprak örnekleri, hayvancılık yapılan bir çiftliğin yakınında bulunan soya fasülyesi tarlasından alınmıĢtır. Bu çiftlikte hayvanların yemlerine sürekli eklenmek suretiyle klortetrasiklin; tedavi ve profilaksi amacıyla gerektiğinde penisilin ve taylosin kullanılmaktadır. Hayvanlardan elde edilen gübre tarlaya uygulanmaktadır. Tarla, örneklerin toplanması için kuzey ve güney olmak üzere iki parsele ayrılmıĢtır. Toprak örnekleri, 20052006 yıllarında gübre tarlaya uygulanmadan bir gün önce, bir gün sonra, 3 hafta sonra ve 3 ay sonra alınmıĢtır. Ayrıca toprağa uygulanmadan önce gübre örnekleri de alınmıĢtır. Bakteriler topraktan seçici (selektif) olmayan, besin maddeleri yönünden zayıf R2A ve dilüe nutrient broth agar (DNBA) kullanılarak izole edilmiĢtir. Reasoner ve Geldreich tarafından geliĢtirilen R2A agarın, uzun inkübasyon koĢullarında ve düĢük inkübasyon sıcaklığında üreyen heterotrof bakterilerin izolasyonunda kullanımı tavsiye edilmektedir79. DNBA besiyeri belli oranda sulandırılmıĢ nutrient sıvı besiyerine agar eklenerek hazırlanan bir besiyeridir. Janssen ve ark.ları yaptıkları bir çalıĢmada bu besiyerinin topraktan nadiren izole edilebilen bakterilerin kültüre edilebilme özelliğini arttırdığını söylemiĢlerdir77. Gübre örnekleri için ek olarak triptik soy agar (TSA) besiyeri gübrenin zengin besin içeriğine benzer bir ortam sağlaması için izolasyon çalıĢmalarına eklenmiĢtir. Topraktan ve gübreden sırasıyla 284 ve 41 bakteri izole edilmiĢ, saflaĢtırılarak stok çözeltileri hazırlanmıĢtır. Tetrasiklin hayvancılıkta en sık kullanılan antibiyotiklerin baĢında gelmektedir. Bir makrolid antibiyotik olan taylosinin de bu alanda kullanımı çok yaygındır. Bu nedenle bu çalıĢmada tetrasiklin ve taylosin ile etki ve direnç mekanizmaları aynı olan eritromisin kullanılmıĢtır. Tetrasiklin ve 63 eritromisine dirençli bakterilerin seçimi öncelikle son konsantrasyonu 20 µg/ml olacak Ģekilde antibiyotik eklenmiĢ besiyerlerine ekim yapılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. Daha sonra agar dilüsyon ve E-test duyarlılık testleri yapılarak minimum inhibisyon konsantrasyonları (MĠK) belirlenmiĢtir. Bu Ģekilde tanımlanan bakterilerin %58‟inin antibiyotik direnç fenotipi belirlenmiĢtir. Örnekler toprak ve gübre olarak ayrılıp bakterilerin direnci değerlendirildiğinde hem toprak hem de gübre izolatlarında eritromisin ve tetrasikline karĢı yüksek oranda direnç tespit edilmiĢtir. Gübreden izole edilen bakterilerde saptanan eritromisin ve tetrasikline direnç oranı birbirine yakındır (sırasıyla %67 ve %70); ancak toprak örneklerinde %97 düzeyinde bulunan eritromisin direnci tetrasiklin direncinin çok üzerindedir. CLSI‟nın dökümanları referans alınarak tetrasiklin için yorumlama kriteri (breakpoint değeri) ≥16 µg/ml ve eritromisin için ≥8 µg/ml olarak kabul edilmiĢtir. Toprak izolatlarının %69‟u, gübre izolatlarının ise %44‟ ü eritromisin ve tetrasiklinin ikisine birden dirençlidir. Patojenler ve kommensal mikroorganizmalar çerçevesinde antimikrobik direnci ölçmek üzere kullanılabilecek yöntemler ve bunların hangisinin daha doğru sonuç verdiği üzerinde uzun süredir tartıĢmalar yapılmaktadır. Bu kapsamda fenotipik veya genotipik antibiyotik direncini tespit etmeye yönelik yöntemler kullanılabilmektedir2,39. Bu çalıĢmada fenotipik direncin ölçümünde CLSI standartlarına uygun olarak agar dilüsyon testi ve üretici firmanın önerileri doğrultusunda E test yöntemleri uygulanmıĢtır. Ancak topraktan izole edilen kommensal bakteriler için test standartlarının ve bu bakteriler için belirlenmiĢ yorumlama kriteri değerlerinin olmaması deneylerin yapılmasında ve sonuçların değerlendirilmesinde zorluklara neden olmuĢtur. Antibiyotik içeren besiyerinde üremelerine rağmen bazı 64 bakterilerin MĠK değerlerinin duyarlılık düzeyinde bulunmasında bu faktörlerin rol oynadığı düĢünülmektedir. Yapılan bir çalıĢmada klinik ve çevresel örneklerden izole edilen bazı Bacillus türlerinin çeĢitli antibiyotiklere direnci araĢtırılmıĢ ve E test yönteminin agar dilüsyon testi ile karĢılaĢtırıldığında daha uygun olduğu belirtilmiĢtir92. Bu çalıĢmanın amacı antimikrobik duyarlılık testlerini karĢılaĢtırmak değildir. Ancak her iki yöntemin de uygulanması sırasında bakterilerin inkübasyon sürelerinin uzunluğu nedeniyle sonuçların okunmasında zorluklar yaĢanmıĢtır. Gübre içindeki antibiyotik miktarının eser miktarlardan litrede 200 mg/L düzeyine kadar bulunabildiği gösterilmiĢtir35. Bu antibiyotiklerin gübreleme sırasında toprağa ve doğal kaynak sularına geçtiğini gösteren çalıĢmalar bulunmaktadır. Toprağa bağlandıktan sonra tetrasiklin ve taylosinin bakterilere karĢı aktivitelerini, toprak partiküllerine sıkıca bağlanmıĢ olsalar da korudukları yapılan çalıĢmalarla gösterilmiĢtir40. Hamscher ve ark.ları sıvı gübreleme iĢleminden 6 ay sonra toprağın 30 cm altında tetrasiklinin 170 µg/kg düzeyinde bulunduğunu göstermiĢlerdir41. Bu durumda çevrede bulunan antibiyotik kalıntılarının dirençli bakteriler üzerinde seçici etkilerinin olması olasıdır. Bu çalıĢmada tarla örneklerin toplanması için kuzey ve güney olmak üzere iki parsele ayrılmıĢtır. Her örnek alma gününde kuzey parselinden 15 ve güney parselinden 16 örnek toplanmıĢtır. Her bir parselden 3‟er örnek alım noktası saptanmıĢ ve buradan alınan örneklerde antibiyotik konsantrasyonlarının ölçümü yapılmıĢtır. Bu çalıĢmada herbir parselde belirlenmiĢ olan bu 3 bölgeden alınan toprak örnekleri kullanılmıĢtır. Bu ölçümler LC-MS (liquid chromotography-mass spectroscopy) yöntemi kullanılarak yapılmıĢtır. Bu yöntem ile ilgili ayrıntılar Krapac ve ark. ları tarafından detaylı bir Ģekilde açıklanmıĢtır29. Elde edilen sonuçlara göre 65 güney parseline uygulanan gübrede 37.5 g/ha tetrasiklin grubu antibiyotik (tetrasiklin, klortetrasiklin ve oksitetrasiklin) bulunmuĢtur. Bu toprakta 13.7 ng/g‟a tekabül etmektedir. Gübre uygulandıktan 1 gün sonra (Alım1) ve 3 hafta sonra (Alım2) kuzey parselinden alınan toprakta saptanan tetrasiklin konsantrasyonu sırasıyla 3.8-12.7 ve 1.3-8.9 ng/g‟dır. Kuzey parseline uygulanan gübrede ise 2 g/ha tetrasiklin grubu antibiyotik (tetrasiklin, klortetrasiklin) bulunmuĢtur. Bu miktar toprağa uygulandığında 0.7 ng/g olmaktadır. Gübre uygulandıktan 1 gün sonra (Alım1) ve 3 hafta sonra (Alım2) kuzey parselinden alınan toprakta saptanan klortetrasiklin konsantrasyonu sırasıyla 1.5-3.1 ve 1.9-5.3 ng/g‟dır. Topraktaki antibiyotik miktarının bakterilqerin tetrasiklin direnç oranına etkisini araĢtırmak üzere gübre uygulaması sonrası bu iki parselden izole edilen bakterilerin tetrasiklin MĠK değerleri karĢılaĢtırılmıĢtır. Güney parselinden izole edilen antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ bakterilerin %61‟inin ve kuzey parseli izolatlarının da %73‟ünün tetrasikline dirençli olduğu bulunmuĢtur. Ancak MĠK50 değerleri sırasıyla güney parseli için >256 µg/ml ve kuzey parseli için 160 µg/ml‟dir. Kuzey tarlasından gübre uygulanmadan önce (Alım) alınan örneklerde direnç oranı %86‟dır. Bu bulgular ıĢığında toprakta bulunan antibiyotik konsantrasyonu ile dirençli bakteri sayısı arasında bir paralellik bulunamamıĢtır. Sengelov ve ark.ları domuz gübresi uygulanmadan önce ve uygulandıktan sonra topraktan izole ettikleri bakterilerdeki antibiyotik direnç düzeyini belirlemeye yönelik yaptıkları çalıĢmalarında benzer sonuçlarla karĢılaĢmıĢlardır23. BaĢlangıçta kısa süreli (3-5 gün) bir artıĢ görülse de zaman içinde bu oranın gübre uygulanmamıĢ toprakla aynı seviyeye geldiğini belirtmiĢlerdir. Sonuç olarak gübre ve toprakta bulunan antibiyotik kalıntılarının toprak içinde 66 antimikrobiyal direncin seçiminde rol oynadığı söylenmemektedir. Gübre uygulamasının topraktan izole edilen bakterilerin tetrasiklin direnç oranına etkisi değerlendirildiğinde genel olarak toprağa gübre uygulanması sonrası kısa bir süre için de olsa direnç oranının %87.5‟dan çıktığı %94.4‟e görülmüĢtür. Genlerin saptanması konusunda da benzer bir durum gözlenmiĢtir. Alım-1 örneklerinden diğerlerine oranla daha fazla sayıda tet geni saptanmıĢtır. Uygulanan gübre miktarının bakterilerin tetrasiklin direnç oranına etkisi değerlendirildiğinde ise gübre miktarının dirençli bakteri düzeyini arttırdığı belirtilmektedir. Bu çalıĢmada daha fazla miktarda gübre uygulanan kuzey parselinde daha yüksek oranda dirençli bakteri saptanması Sengelov ve ark.larının23 yaptıkları çalıĢmanın sonuçlarını destekler niteliktedir. Her bakteri türü yüksek değiĢkenlikte ve korunurlukta nükleik asit sekansı içeren en az bir 16S rRNA gen kopyası içerir97. Bu bölge hedeflenerek bakteriler tür düzeyinde tanımlanabilmektedir25,82. Bu çalıĢmada da genomik DNA izolasyonu yapıldıktan sonra tüm bakteriler 16S rRNA geninin V3 bölgesine (Escherichia coli’ de 341-534 nükleotidler arası) ait nükleotid dizilerinin polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilmesi yoluyla tanımlanmıĢtır. Amplifikasyon ürünleri QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA-ABD) kullanılarak saflaĢtırılmıĢtır. SaflaĢtırılan ürünlerin dizi analizleri Illinois Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi tarafından Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemi kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir. Elde edilen diziler gen bilgi bankasında bulunan ilgili en yakın sekanslarla nükleotid-nükleotid Blast programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır87,93. Ġzolatların dağılımına bakıldığında, Proteobacteria (n=149), Bacteroidetes (n=16), Actinobacteria (n=32), Firmicutes (n=16) olmak 67 üzere 4 farklı Ģubeden toplam 213 bakteri izole edildiği görülmektedir. Bu dağılım toprakta yaĢayan bakterilerin dağılımıyla paralellik göstermektedir. Ġzole edilen bakterilerin nükleotid dizileri bilinen bakterilerle karĢılaĢtırıldığında %91-100 aralığında değiĢen benzerlik oranı elde edilmiĢtir. Antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ 22 gram pozitif bakterinin 18‟i (%82‟si); 102 gram negatif bakterinin ise %66‟sı tetrasikline karĢı dirençlidir. Eritromisin için bu değerler sırasıyla %90 ve %94‟tür. Bu sonuçlar eritromisin direncinin her iki grupta da daha yüksek olduğunu göstermektedir. Topraktan ve gübreden izole edilen bakterilerin antibiyotik direnci cins düzeyinde değerlendirildiğinde, tüm cinslerde dirençli suĢların bulunduğu görülmektedir. Gübre içinde bulunan patojen veya kommensal bakterilerin taĢıdığı direnç genlerini ve bu genlerin toprak bakterileri arasında aktarımını incelemek amacıyla gübreden ve topraktan izole edilen 46 örnekte 7 farklı tetrasiklin direnç geni (efluks genlerinden tet(C), tet(H), tet(Z) ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu tet(M), tet(O), tet(Q), tet(W)) ve 18 izolatta eritromisin direnç genleri [erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(G), erm(Q)] araĢtırılmıĢtır. Toplam 24 suĢta tetrasiklin direnç genlerinden en az birine rastlanmıĢtır. Bunlar arasında 13 tanesi efluks direnç genleri iken 11‟i ribozomal koruma genleridir. Tet(Q) direnç geni sadece toprak izolatlarında ve tet(W) ve tet(M) direnç genleri ise sadece gübre izolatlarında bulunmakta iken diğer tüm tetrasiklin direnç genleri hem toprak hem gübre izolatlarında saptanmıĢtır. Ayrıca her ikisi de gübreden izole edilmiĢ olan 2 izolatta (enterokok türleri ve S. simulans) erm(Q) genine rastlanmıĢtır. Sonuçlar direnç mekanizmaları yönünden 68 değerlendirildiğinde gübre izolatlarında her iki direnç mekanizması eĢit oranda belirlenmiĢtir. Toprak izolatlarında ise efluks pompası genleri daha yüksek oranda saptanmıĢtır. Her iki direnç mekanizması gübreden, gübre uygulandıktan önce ve sonra topraktan izole edilen bakterilerde mevcuttur. Çevresel ortamlarda antibiyotik direnç genlerinin nasıl aktarıldığını aydınlatmak amacıyla bu genleri taĢıyan bakteri türlerini saptamaya yönelik olarak birçok çalıĢma yapılmaktadır30,74,94. Bu çalıĢmada elde edilen sonuçlar, tet(Z) genini taĢıyan streptomiçes suĢunun hem gübrede hem de toprakta bulunmasının bu bakteri türünün tet(Z) geni için taĢıyıcı bakteri görevi yapabileceğini düĢündürmektedir. Diğer taraftan toprağa gübre uygulanmasının horizontal gen transferine yol açıp açmadığı konusu en çok araĢtırılan konulardandır. Gübreden izole edilen intestinal bir bakteride ve kommensal toprak bakterilerinde aynı genin bulunması horizontal gen trasferinin bir göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Sonuçlar bu çerçevede değerlendirildiğinde tet(C), tet(O) ve tet(Z) genlerinde bu Ģekilde bir yayılım olduğu görülmektedir. Gübre uygulandıktan sonra Acinetobacter ve Pseudomanas gibi barsak bakterilerinde bulunan tet(C) geninin toprakta yaĢayan bakterilere aktarılması olasıdır. Tet(O) geni gübrede stafilokok cinsi bakterilerde bulunurken toprakta yaĢayan Burkholderia stabilis türü bakterilerin de bu geni taĢıdığı saptanmıĢtır. Aynı Ģekilde tet(Z) geninin de gübredeki Streptomyces ve Microbacteria‟lardan toprakta bulunan Burkholderia cinsi bakterilere aktarılması muhtemeldir. Bu konuda kesin yargıya varmak için toprak ve gübrede saptanan bu genlerin aynı olduğunun gösterilmesi gerekmektedir. Tetrasiklin direnç genlerini taĢıyan bakterilerin çeĢitliliği hızla artmaktadır. 2001 yılında 39 cins bu genleri taĢırken, 2005 yılında bu sayı 115‟e çıkmıĢtır70. 2007 yılında yayınlanan bir çalıĢmaya göre topraktan 69 izole edilen Burkholderia, Flexibacter, Dyella ve Lysobacter cinsi bakterilerde tetrasiklin direnç genlerinin ilk kez gösterildiği belirtilmektedir30. Bu tez çalıĢmasında, yüksek düzeyde tetrasiklin direnci toprak izolatı olan bu 4 cins bakteride saptanmıĢtır. Tetrasiklin direnç genleri, gübrenin toprağa uygulanması öncesi (alım), bir gün sonra (alım1), 3 hafta sonra (alım2) ve 3 ay sonra (alım3) alınan örneklerden izole edilen dirençli suĢlarda bulunmuĢtur. Eritromisin ve tetrasiklin direnç genlerinin, gübreden ve topraktan alınan örneklerde gösterilmesi, bu antibiyotiklerin kullanımı ile direncin çevreye yayılımı arasındaki iliĢkinin gösterilmesinde ilk önemli basamaktır. Ġleri çalıĢmalarla bu direnç genlerinin aynı olup olmadığının gösterilmesi ile bu bulgu daha da güçlenecektir. Mikrobiyal ekosistemler arasındaki gen transferini ve transfer hızını olduğu kadar burada rol oynayan genlerin ve bakterilerin de saptanması amacıyla çevresel genetik metodlara olan ihtiyaç çok büyüktür98. Bu nedenle antibiyotik direnci araĢtırmalarında moleküler ekolojik yöntemlerin kullanımı önem kazanmıĢtır. Ġleri çalıĢmalarda bu yöntemler de kullanılarak antibiyotik direnci ve çevre etkileĢimleri aydınlatılmaya çalıĢılacaktır. 70 6. SONUÇ Antibiyotiklere dirençli bakteriyel patojenlerin sayısındaki artıĢ hem insan hem de hayvanlarda gelecekte enfeksiyon hastalıklarından korunma ve bu hastalıkları tedavi etmede giderek baĢarısız olunacağının bir göstergesidir. Antibiyotik direnci konusunda bilimsel pek çok bilgi olsa da direncin geliĢimi ve yayılımı hakkındaki ekolojik yaklaĢımlar hala netlik kazanmamıĢtır. Bilinen Ģudur ki; bakteriyel antimikrobiyal direncin ortaya çıkıĢı ve yayılımı antimikrobiyal maddeler, mikroorganizmalar ve onları kuĢatan çevre arasındaki çok çeĢitli etkileĢimlerin sonucudur. Bu nedenle antimikrobiyal maddelerin hayvancılıkta kullanımının doğurduğu sonuçlara dair bilimsel tabanlı verilere ihtiyaç vardır. Bu çalıĢmada tetrasiklin ve eritromisin antibiyotiklerine dirençli toprak ve gübre örnekleri incelenmiĢtir. 71 Topraktan ve gübreden izole edilen toplam 213 izolat cins ve tür düzeyinde belirlenmiĢ ve 128 tanesinin antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢtir. Antibiyotik olarak hayvancılıkta yoğun olarak kullanılan tetrasiklin seçilmiĢtir. Ayrıca eritromisin de yaygın kullanılan ve eritromisin ile aynı etki ve direnç mekanizmalarına sahip taylosinin etkilerini incelemek amacıyla çalıĢmada kullanılmıĢtır. Her iki antibiyotik için izole edilen bakteriler arasında yüksek düzeyde direnç saptanmıĢtır. Bununla beraber hem gübre hem de toprak izolatlarında eritromisin direnç düzeyinin daha yüksek olduğu görülmüĢtür. Gübre içinde konsantrasyonları bulunan ile ve bakterilerin toprağa uygulanan antibiyotik direnç antibiyotik düzeyleri karĢılaĢtırıldığında bu iki faktör arasında bir bağlantı bulunamamıĢtır. Gübrenin uygulanmasının antibiyotik direnç genlerinin dağılımına ve yayılımına olan etkisi değerlendirildiğinde streptokok türlerinin tet(Z) geni için taĢıyıcı bakteri rolü oynayabileceği düĢünülmektedir. Ayrıca tet(C), tet(O) ve tet(Z) genlerinin hem gübreden izole edilen intestinal bakterilerde hem de kommensal toprak bakterilerinde bulunması bu genlerin horizontal gen transferi yoluyla aktarılmıĢ olabileceğini düĢündürmektedir. Bu çalıĢmada antibiyotik direncinin ekolojik etkileri araĢtırılmıĢtır. Elde edilen sonuçlar antibiyotiklerin kullanımı ile direncin çevreye yayılımı arasındaki iliĢkinin gösterilmesinde önemli bir basamaktır. 72 7. ÖZET Domuz YetiĢtirme Çiftliğinin Çevresinde Bulunan Toprak Örneklerinden Ġzole Edilen Antibiyotik Dirençli Bakterilerin Fenotipik ve Genotipik Özellikleri Antibiyotiklerin tarımda kullanımı ile antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların artıĢı arasında bir bağ olup olmadığı son zamanlarda antibiyotik direnci ile ilgili olarak en çok tartıĢılan konulardan biridir. Bu çalıĢmada antibiyotik direncinin artıĢında çevresel faktörlerin rolü değerlendirilmiĢtir. Bu amaçla bir domuz yetiĢtirme çiftliği çevresinde bulunan tarlaya hayvan dıĢkısının uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik dirençlerine olan etkisi araĢtırılmıĢtır. Gübreden, gübre uygulanmadan önce ve uygulandıktan sonra topraktan izole edilen bakterilerin tetrasiklin ve eritromisin minimum inhibisyon konsantrasyonları agar dilüsyon ve E test yöntemleriyle belirlenmiĢtir. Toprak izolatlarının %68‟i tetrasikline, %97‟si eritromisine dirençli bulunmuĢtur. Gübre izolarında ise bu oran sırasıyla %70 ve 73 %67‟dir. Topraktan ve gübreden izole edilen suĢların sırasıyla %69‟u ve %44‟ü her iki antibiyotiğe de dirençlidir. Polimeraz zincir reaksiyonuyla 16S rRNA geninin V3 bölgesi amplifiye edilmiĢ ve bu bölgenin dizi analizleri Sanger'in dideoksi yöntemi kullanılarak Illinois Üniversitesi‟nde gerçekleĢtirilmiĢtir. Diziler bilinen en yakın dizilerle nükleotid blast programı kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır. Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes olmak üzere 4 farklı Ģubeden 213 bakteri izole edilmiĢtir. Kırkaltı izolatta efluks direnç genlerinden olan mekanizmasından tet(C), sorumlu tet(H), tet(Z) tet(M), tet(O), ve ribozomal tet(Q) ile 18 korunma izolatta erm(A,B,C,F,G,Q) genlerinin varlığı araĢtırılmıĢtır. Tet(Q) sadece toprak izolatlarında, tet(W) ve tet(M) ise sadece gübre izolatlarında bulunmakta iken diğer tüm tetrasiklin direnç genleri hem toprak hem gübre izolatlarında saptanmıĢtır. Ayrıca 2 gübre izolatında erm(Q) genine rastlanmıĢtır. Sonuç olarak eritromisin ve tetrasiklin direnç genlerinin, gübreden ve topraktan alınan örneklerde gösterilmesi, bu antibiyotiklerin kullanımı ile direncin çevreye yayılımı arasındaki iliĢkinin gösterilmesinde ilk önemli basamaktır. 74 8. SUMMARY Phenotypic and Genotypic Characterization of Antibiotic Resistant Soil Bacteria Adjacent to Swine Production Facilities The question of possible correlation between the agricultural antibiotic use and the increase in the rate of antibiotic resistant infections has been debated. In this study, the environmental factors in the increase of antibiotic resistance were investigated. Especially, the effect of manure application from swine confinement facility to the fields was evaluated. Samples have been collected from manure and soil, before and after manure application. Erythromycin and tetracycline susceptibility was determined by agar dilution and E-test methods. 68 per cent of the soil isolates was detected as resistant to tetracycline and 97 per cent to erythromycin. This ratios were found to be 70 per cent and 67 per cent in manure isolates respectively. The 69 per cent of the strains isolated from soil and 44 per cent of that from manure were double resistant to both antibiotics. 75 Polymerase chain reaction was used to amplify the V3 region of the 16S rRNA gene fragment and sequence analysis was performed at the University of Illinois. The phylogenic positions of the isolates were determined by searching the GenBank database. 213 bacteria were isolated from 4 different phylum, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes. Class-specific primers were used to amplify each of the six erythromycin resistance genes erm(A,B,C,F,G,Q) and 4 tetracycline resistance genes encoding efflux pumps tet(C), tet(H), tet(Z), tet(W) and 3 genes encoding ribosomal protection proteins tet(M), tet(O), tet(Q). Whereas tet(Q) gene was detected in only soil isolates, tet(W) and tet(M) were solely in manure isolates. Other tet genes were identified in soil and manure isolates. Furthermore, erm(Q) gene was found in only two manure isolates. In conclusion, the demonstration of the resistance genes in soil and manure isolates, constitutes the initial phase of linking the antibiotic use with the spread of resistance to the environment. 76 9. KAYNAKLAR 1.American Academy of Microbiology. Antimicrobial resistance an ecological perspective. Washington: American Society for Microbiology; 1999. 2.American Academy of Microbiology. The role of antibiotics in agriculture; Washington: American Society for Microbiology; 2002. 3.Antibiotic resistance: a societal problem [online]. 2004 [cited 2006 Jul 8]. Available from: URL: http://www.tufts.edu/med/apua/Q&A/Q&A_soc.html 4.Mellon M, Benbrook C, Benbrook K. Hogging it: Estimates of antibiotic abuse in livestock. Union of Concerned Scientist (UCS) Publications. Cambridge, MA, [online]. 2001. [cited 2006 March 3]. Available from: URL: http://www.ucsusa.org/food_and_environment/antibiotics_and_food/marga ret-mellon-on-hogging-it.html 5.Swan MM. Report of the joint committee on the use of antibiotics in animal husbandry and veterinary medicine. Her Majesty‟s Stationary Office, London; 1969. 77 6.McEwen SA. Antibiotic use in animal agriculture: what have learned and where are we going? Anim Biotechnol 2006; 17: 239-50. 7.Witte W. Medical cosequences of antibiotic use in agriculture. Science 1998; 279: 996-7. 8.Gaunt PN, Piddock LJV. Ciprofloxacin resistant Campylobacter spp. in humans: an epidemiological and laboratory study. J Antimicrob Chemother 1996; 37: 747-57. 9.Lipsitch M, Singer RS, Levin BR. Antibiotics in agriculture: when is it time to close the barn door? PNAS 2002; 99: 5752-4. 10.Threlfall EJ, Ward LR, Rowe B. Multiresistant Salmonella Typhimurium DT 104 and salmonella bacteraemia. Lancet 1998; 352(9124): 287-8. 11.Collignon P. A review-the use of antibiotics in food production animalsdoes this cause problems in human health [online]. 2003 [cited 2007 Feb 15]. Available from: URL: http://www.keepantibioticsworking.com/new/resources_library.cfm?RefID= 36469 12.Feinmen SE. Antibiotics in animal feed: drug resistance revisited. Am Soc Microbiol News 1998; 64: 24-30. 13.Singer RS, Finch R, Wegener HC, Bywater R, Walters J, Lipsitch M. Antibiotic resistance-the interplay between antibiotic use in animal and human beings. The Lancet Infectious Diseases 2003; 3: 47-51. 14.Witte W. Selective pressure by antibiotic use in livestock. Int J Antimicrob Agents 2000; 16(Suppl 1): 10-24. 15.Koike S, Krapac IG, Oliver HD, Yannarell AC, Chee-Sanford JC, Aminov RI, Mackie RI. Monitoring and source tracking of tetracycline resistance genes in lagoons and groundwater adjacent to swine 78 production facilities over a three-year period. Appl Environ Microbiol 2007 Jun 1. 16.Chee-Sanford JC, Aminov RI, Krapac IJ, Garrigues-Jeanjean N, Mackie RI. Occurrence and diversity of tetracycline resistance genes in lagoons and groundwater underlying two swine production facilities. Appl Environ Microbiol 2001; 67(4):1494-502. 17.Russell AD. Types of antibiotics and synthetic antimicrobial agents. In: Hugo WB, Russel AD, editors. Pharmaceutical Microbiology, 6th ed, London: Blackwell Science; 1998. s. 91-129. 18.Get Smart: Know When Antibiotics Work on the Farm: Educational Activities to Promote Appropriate Use of Antimicrobial Agents in Animals :Landmarks in antibiotic use [online]. 2004 [cited 2006 May 15]. Available from: URL :http://www.cdc.gov/narms/get_smart.htm 19.US Office of Technology Assessment. Impacts of antimicrobial resistant bacteria. Washington: US Government Printing Office, 1995. 20.Updated information on FDA's proposed withdrawal of approval of poultry fluoroquinolones [online]. 2003 [18 May 2007]. Available from: URLhttp://www.fda.gov/cvm/NOOHB.htm 21.Chopra I, Roberts M. Tetracycline antibiotics: Mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol Mol Biol Rev 2001; 65: 232-60. 22.Jorgensen SE, Halling-Sorensen B. Editorial, Drugs in the environment. Chemosphere 2000; 40: 691-699. 23.Sengelov G, Agerso Y, Halling-Sorensen B, Baloda SB, Andersen JS, Jensen LB. Bacterial antibiotic resistance levels in Danish farmland as a 79 result of treatment with pig manure slurry. Environ International 2003; 28: 587-595. 24.Jensen LB, Baloda S, Boye M, Aaestrup FM. Antimicrobial resistance among Pseudomonas spp. and the Bacillus cereus group isolated from Danish agricultural soil. Environ International 2001; 26: 581-587. 25.Onan LJ, LaPara TM. Tylosin-resistant bacteria cultivated from agricultural soil. FEMS Microbiol Lett 2003; 220: 15-20. 26.Götz A, Smalla K. Manure enhances plasmid mobilization and survival of Pseudomonas putida introduced into field soil. Appl Environ Microbiol 1997; 63: 1980-86. 27.Mackie RI, Koike S, Krapac I, Chee-Sanford J, Maxwell S, Aminov RI. Tetracycline residues and tetracycline resistance genes in groundwater impacted by swine production facilities. Anim Biotechnol 2006;17(2):15776. 28.Jindal A, Kocherginskaya S, Mehboob A, Robert M, Mackie RI, Raskin L, Zilles JL. Antimicrobial use and resistance in swine waste treatment systems. Appl Environ Microbiol 2006;72(12):7813-20. 29.Krapac IG, Koike S, Meyer MT, Snow DD, Chou S-FJ, Mackie RI, Roy WR, Chee-Sanford JC. Long term monitoring of the occurrence of antibiotic resistance genes in groundwater near swine confinement facilities. Proceeding of the 4th International Conference of Pharmaceuticals and Endocrine Disrupting Chemicals in Water; 2004 Minneapolis, MN; National Groundwater Association: 158-72. 30.Kobashi Y, Hasebe A, Nishio M, Uchiyama H. Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria isolated from various agricultural environments. Microbes Environ 2007;22:44-51. 80 31.Agersø Y, Sandvang D. Class 1 integrons and tetracycline resistance genes in Alcaligenes, Arthrobacter, and Pseudomonas spp. isolated from pigsties and manured soil. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 7941-7. 32.Heuer H, Smalla K. Manure and sulfadiazine synergistically increased bacterial antibiotic resistance in soil over at least two months. Environ Microbiol. 2007; 9(3): 657-66. 33.Ghosh S, LaPara TM. The effects of subtherapeutic antibiotic use in farm animals on the proliferation and persistence of antibiotic resistance among soil bacteria. The ISME Journal 2007; 1: 191–203. 34.Schmitt H, Stoob K, Hamscher G, Smit E, Seinen W. Tetracycline and tetracycline resistance in agricultural soils: microcosm and field studies. Microbiol Ecology 2006; 51: 267-76. 35.Kumar K, Thompson A, Singh AK, Chander Y, Gupta SC. Enzyme linked immunosorbent assay for ultratrace determination of antibiotics in aqueous samples. J Environ Qual 2004; 33: 250-256. 36.Elmund GK, Morrison SM, Grant DW, Nevins SM. Role of excreted chlortetracycline in modifying the decomposition process in feedlot waste Bull Environ Contam Toxicol 1971; 6(2):129-32. 37.Mølbak K, Baggesen DL, Aarestrup FM, Ebbesen JM, Engberg J, Frydendahl K, Gerner-Smidt P, Petersen AM, Wegener HC. An outbreak of multidrug-resistant, quinolone-resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium DT104. N Engl J Med 1999(4); 341(19): 1420-5. 38.Peak N, Knapp CW, Yang RK, Hanfelt MM, Smith MS, Aga DS, Graham DW. Abundance of six tetracycline resistance genes in wastewater lagoons at cattle feedlots with antibiotic use strategies. Environ Microbiol 2007; 9(1): 143-51. 81 39.Kümmerer K. Resistance in environment. J Antimicrob Chemother 2004; 54: 311-20. 40.Chander Y, Kumar K, Goyal SM, Gupta SC. Antibacterial activity of soil-bound antibiotics. J Environ Qual 2005; 34: 1952-7. 41.Hamscher G, Sczesny S, Höper H, Nau H. Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by highperformance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal Chem 2002; 74: 1509-18. 42.Rysz M, Alvarez PJJ. Amplification and attenuation of tetracycline resistance in soil bacteria: aquifer column experiments. Water Res 2004; 38: 3705-12. 43.Brønstad K, Drønen K, Øvreås L, Torsvik V. Phenotypic diversity and antibiotic resistance in soil bacterial communities. J Ind Microbiol 1996; 17: 253-9. 44.Veterinary surveillance: Surveillance for antimicrobial resistance Figure 1 [online]. 2005 [18 Apr 2007]. Available from : URL : http://www.defra.gov.uk/animalh/diseases/vetsurveillance/antimicrobialres-fig.htm 45.Salyers A, Shoemaker NB. Reservoirs of antibiotic resistance genes. Anim Biotechnol 2006; 17: 137-46. 46.Aaerestrup FM. Veterinary drug usage and antimicrobial resistance in bacteria of animal origin. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005; 96: 271-81. 82 47.Summers AO. Generally overlooked fundamentals of bacterial genetics and ecology. Clin Infect Dis 2002; 34(Suppl 3): S85-92. 48.McEwen SA, Fedorka-Cray PJ. Antimicrobial use and resistance in animals. Clin Infection Dis 2002; 34(Suppl 3): S93-106. 49.Nwosu WC. Antibiotic resistance with particular reference to soil microorganisms. Res Microbiol 2001; 152: 421-30. 50.van den Bogaard AE, Willems R, London N, Top J, Stobberingh EE. Antibiotic resistance of faecal enterococci in poultry, poultry farmers and poultry slaughterers. J Antimicrob Chemother 2002; 49(3): 497-505. 51.Harbottle H, McDermott PF, Zhao S, Walker RD, White DG, Mechanisms of antimicrobial resistance. Pork Industry Conference on Antibiotic Use in Animal Agriculture 2006 April 27-28; Urbana, Illinois-USA. 1-8 52.World Health Organization. WHO global principles for the containment of antimicrobial resistance in animals intended for food. Geneva: World Health Organization; 2000. 53.O‟Brien TF. Emergence, spread, and environmental effect of antimicrobial resistance: how use of an antimicrobial anywhere can increase resistance to any antimicrobial anywhere else. Clin Infect Dis 2002; 34(Suppl 3): S78-84. 54.Summers AO. Genetic linkage and horizontal gene transfer, the roots of the antibiotic multi-resistance problem. Anim Biotechnol 2006; 17: 125135. 83 55.Khachatourians GG. Agricultural use of antibiotics and the evoluation and transfer of antibiotic- resistant bacteria. CMAJ 1998; 159: 1129-36. 56.Davison J. Genetic exchange between bacteria in the environment. Plasmid; 42: 73-91. 57.Lorenz MG, Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev; 58: 563-602. 58.Nielsen KM, van Weerelt MD, Berg TN, Bones AM, Hagler AN, van Elsas JD. Natural transformation and availability of transforming DNA to Acinetobacter calcoaceticus in soil microcosms. Appl Environ Microbiol 1997; 63: 1945-52. 59.Cooper AJ, Shoemaker NB, Salyers AA. The erythromycin resistance gene from the Bacteroides conjugative transposon TcrEmr 7853 is nearly identical to ermG from Bacillus sphaericus. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 506-8. 60.Frost LS. Leplae R, Summers AO, Toussaint A. Mobile genetic elements: the agents of open source evaluation. Nature Reviews Microbiology. 2005; 722-32. 61.Arda M. Temel Mikrobiyoloji. Ġkinci baskı. Ankara: Medisan Yayın Serisi; 2000. 62.Salyers AA, Amabile-Cuevas CF. Why are antibiotic resistance genes so resistant to elimination. Antimicrob Agent Chemother 1997; 41: 232125. 63.Insertion sequence [online]. 2007 [1 June 2006]. Available from : URL : http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Insertion_sequence.jpg 84 64.Composite_transposon [online]. 2007 [1 June 2006]. Available from : URL : http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Composite_transposon.jpg 65.Bennett PM, Genome plasticity Insertion sequence elements transposons and integrons, and DNA rearrangement. In: Woodford N, Johnson AP, editors. Genomics, Proteomics, and Clinical Bacteriology. 1st ed, Totowa New Jersey: Humana Press Inc; 2004. s. 71-112. 66.Zhao S, Qaiyumi S, Friedman S, Singh R, Foley SL, White DG, McDermott PF, Donkar T, Bolin C, Munro S, Baron EJ, Walker RD. Characterization of Salmonella enterica serotype newport isolated from humans and food animals. J Clin Microbiol 2003; 41: 5366-71. 67.Harbottle H, McDermott PF, Zhao S, Walker RD, White DG. Genetics of antimicrobial resistance. Anim Biotechnol 2006; 27-28. 68.Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby GA, Macielag M, Abbanat D, Park CH, Bush K, Hooper DC.Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycosideacetyltransferase.Nat Med 2006;12(1):83-8. 69.Gootz TD. The forgotten gram-negative bacilli: what genetic determinants are telling us about the spread of antibiotic resistance. Biochem Pharmacol 2006; 71: 1073-84. 70.Roberts MC. Update on aquired tetracycline resistance genes. FEMS Microbiology Letters 2005; 245: 195-203. 85 71.Weisblum B. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39(3):577-85. 72.Roberts MC streptogramin, Resistance trimethoprim, to tetracycline, and sulfonamide macrolide-lincosamidedrug classes. Mol Biotechnol 2002; 20(3):261-83. 73.Jost BH, Trinh HT, Songer JG, Billington SJ. A second tylosin resistance determinant, Erm B, in Arcanobacterium pyogenes. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(3):721-7. 74.Patterson AJ, Colangeli R, Spigaglia P. Scott P. Distribution of specific tetracycline and erythromycin resistance genes in environmental samples assessed by macroarray detection. Environ Microbiol 2007; 9: 703-15. 75.Jensen LB, Agerso Y, Sengelov G. Presence of erm genes among macrolide resistant Gram-positive bacteria isolated from Danish farm soil. Environ Int 2000; 28: 487-91. 76.Winding A, Binnerup JS, Sørensen J. Viability of Indigenous soil bacteria assayed by respiratory activity and growth. Appl Environ Microbiol 1994; 60(8): 2869–75. 77.Janssen PH, Yates PS, Grinton BE, Taylor PM, Sait M. Improved culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of novel members of the divisions Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, and Verrucomicrobia. Appl Environ Microbiol 2002; 68(5): 2391-6. 78.Pedersen JC. Natamycin as a fungicide in agar media. Appl Environ Microbiol 1992; 58: 1064-6. 86 79.Reasoner DJ, Geldreich EE. A new medium for enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol 1985; 49:1-7. 80.Davis KER, Joseph SJ, Janssen PH. Effects of Growth medium, inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil bacteria. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 826-34. 81.Wayne PA. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), 4th Ed.: Approved Standard. M7-A4,. (1997). 82.LaPara TM, Nakatsu CH, Pantea L, Alleman JE. Phylogenetic analysis of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors treating pharmaceutical wastewater. Appl Environ Microbiol 2000; 66: 3951-9. 83.Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. s. 5.1-5.90. 84.Brown TA.Gene Cloning & DNA Analysis An Introduction. 5 th ed.Malden, MA: Blackwell Publishing; 2006. s.181-195. 85.Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York: WH Freeman and Company, 2000. s. 207-253. 86.Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. s. 12.10-12.114. 87 87.Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J. Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-10. 88.Aminov GI, Garrigues-Jeanjean, Mackie R. Molecular ecology of tetracycline resistance: development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins. Appl Environ Microbiol 2001; 67(1): 22-32. 89.Oliver HD, Koike S, Krapac IG, Chee-Sanford JC, Aminov RI, Mackie RI. Molecular monitoring of tylosin-and erythromycin-resistance genes in lagoons and groundwater of two swine production facilities. (yazım aĢamasında). 90.Janssen PH. Identifying the Dominant Soil Bacterial Taxa in Libraries of 16S rRNA and 16S rRNA Genes. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 171928. 91.Aminov RI, Chee-Sanford JC, Garrigues N, Teferedegne B, Krapac IJ, White BA, Mackie RI Development, validation, and application of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding tetracycline efflux pumps in gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 178693. 92.Turnbull PC, Sirianni NM, LeBron CI, Samaan MN, Sutton FN, Reyes AE, Peruski LF.MICs of selected antibiotics for Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, and Bacillus mycoides from a range of clinical and environmental sources as determined by the Etest. J Clin Microbiol 2004;42(8):3626-34. 88 93.Madden TL, Tatusov RL, Zhang J. Application of network BLAST server. Methods Enzymol 1996; 266: 131-41. 94.Heuer OE, Hammerum AM, Collignon P, Wegener HC. Human health hazard from antimicrobial-resistant enterococci in animals and food. Clin Infect Dis 2006; 43: 911-6. 95.Thiele-Bruhn S. Pharmaceutical antibiotic compounds in soil: A review. J Plant Nutr Soil Sci 2003; 166: 145-167. 96.van den Bogaard AE, Stobberingh EE. Epidemiology of resistance to antibiotics links between animals and humans. Int J Antimicrob Agents 2000; 14(4): 327-35. 97. Woese CR. Bacterial evoluation. Microbiol Rev 1987; 51: 221-71. 98.Aminov RI, Mackie RI. Evolution and ecology of antibiotic resistance genes.FEMS Microbiol Lett 2007; 271(2):147-61. 99.Woodford N, Public databases retrieving and manipulating sequences for beginners. In: Woodford N, Johnson AP, editors. Genomics, Proteomics, and Clinical Bacteriology. 1st ed, Totowa New Jersey: Humana Press Inc; 2004. s. 17-28. 89 10. EKLER Tablo 10. Tanımlanan tüm izolatların antibiyotik duyarlılıkları ve filogenetik özellikleri 90 91 92 93 -: Yapılmadı, A: Alım, K:Kuzey, G:Güney, ÇG:Çukur gübresi, LG:Lagün gübresi 94 11. TEġEKKÜR Tez çalıĢmalarım sırasında bilimsel katkıları ile bana yardımcı olan, eğitimim ve yetiĢmemde emek veren, bu tezin gerçekleĢmesini sağlayan tez danıĢmanım ve hocam G.Ü. Tıp Fak. Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı sayın Prof. Dr. Nedim Sultan‟a, Akademik hayatım boyunca ve tez çalıĢmalarım sırasında her zaman bana önder ve yol gösterici olan, yetiĢmemde çok emeği olan H.Ü. Ecz. Fak. Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı sayın Doç. Dr. Meral Özalp‟e, AraĢtırmalarım süresince büyük yardımlarını gördüğüm, bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım ve ilham aldığım Illinois Üniversitesi Hayvan Bilimleri Laboratuvarı Mikrobiyoloji Bölümü hocalarından sayın Prof. Dr. Roderick I Mackie‟ye, Tezin her aĢamasında yardımlarını benden esirgemeyen tez komitesindeki değerli hocalarım sayın Prof. Dr. Sevgi Türet ve sayın Prof. Dr. Aysel Arıcıoğlu‟na, Eğitimim ve yetiĢmemde katkıları olan sayın hocalarım Prof. Dr. Turgut Ġmir, sayın Prof. Dr. Semra KuĢtimur ve sayın Prof. Dr. Seyyal Rota‟ya ve ayrıca anabilim dalında öğretim üyesi olan diğer değerli hocalarıma ve asistan arkadaĢlarıma, Birlikte çalıĢıyor olmaktan çok mutlu olduğum sevgili arkadaĢlarım Uzm. Ecz. Ekrem Kılıç‟a ve Bio. Didem Öztürk‟e, Ve maddi-manevi her konuda beni sabırla destekleyen, yardımını esirgemeyen çok kıymetli eĢim Mehmet Ekizoğlu baĢta olmak üzere kızım ve tüm aileme, En içten teĢekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim. 95 12. ÖZGEÇMĠġ Melike Ekizoğlu AYDIN, 1975 Adres: Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 06100 Sıhhiye/ANKARA-TÜRKĠYE Telefon : 0 312 305 14 99 Faks : 0 312 311 47 77 e-posta: [email protected] Eğitim: 2000 2000 1998 1996 Doktora Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara Yüksek Lisans Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı, Ankara Lisans Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Ankara Mesleki Deneyim: 2005-2006 Misafir AraĢtırmacı Illinois Üniversitesi, Tarım-Tüketici ve Çevre Bilimleri Koleji, Hayvan Bilimleri Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Urbana-Illinois, USA 1997- AraĢtırma Görevlisi Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara Yabanci Dili: Ġngilizce Üye Olduğu Bilimsel KuruluĢlar: Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Farmasötik Bilimler Ankara Derneği (FABAD) Türk Farmasötik Teknoloji AraĢtırmacıları Derneği (TÜFTAD) Yapılan ÇalıĢmalarla Ulusal ve Uluslararası Düzeyde Alınan Ödüller 1. 1998-1999 Hacettepe Üniversitesi AraĢtırma Grubu BaĢarı Ödülü Yeni ilaç dağıtım Sistemi Mikropartiküler AraĢtırma Grubu: 96 Romatoid artrit tedavisinde kullanılan antiinflamatuvar ilaç içeren mikropartiküler sistemler üzerine araĢtırma 2.Kılıç, E., Ekizoğlu, M., Özalp, M., Hasçelik, G., “Hastanede Yatan Hastalardan Ġzole Edilen ÇeĢitli Gram Negatif Bakterilerin Klorhekzidine Duyarlılıkları. III.Sterilizasyon Dezenfeksiyon Kongresi, Samsun, 2003. (Poster ödülü) Projeler Bazı dezenfektanların hastane kaynaklı ve antibiyotiklere dirençli/duyarlı bakteriler üzerindeki etkinliklerinin araĢtırılması, Yardımcı araĢtırmacı. Hacettepe Üniversitesi AraĢtırma Fonu Projesi. 0:01023010008. 2001. (Rapor aĢamasında) 97
