LARENKS YASSI EPİTEL HÜCRELİ KANSERİN, T regülatör (CD4
advertisement
T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI BAKIRKÖY DR. SADİ KONUK EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ KULAK BURUN BOĞAZ KLİNİĞİ KLİNİK ŞEFİ: Doç. Dr. FATMA TÜLİN KAYHAN LARENKS YASSI EPİTEL HÜCRELİ KANSERİN, T regülatör (CD4+CD25+Foxp3highCD127dim) ve İMMÜN SİSTEM DİĞER ALT GRUP HÜCRELERİNE ETKİSİ UZMANLIK TEZİ Dr. AHMET ADNAN CIRIK İSTANBUL OCAK 2009 T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI BAKIRKÖY DR. SADİ KONUK EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ KULAK BURUN BOĞAZ KLİNİĞİ KLİNİK ŞEFİ: Doç. Dr. FATMA TÜLİN KAYHAN LARENKS YASSI EPİTEL HÜCRELİ KANSERİN, T regülatör (CD4+CD25+Foxp3highCD127dim) ve İMMÜN SİSTEM DİĞER ALT GRUP HÜCRELERİNE ETKİSİ UZMANLIK TEZİ Dr. AHMET ADNAN CIRIK İSTANBUL OCAK 2009 ÖNSÖZ Uzmanlık eğitimimiz süresince bilimsel bir çalışma ortamı ve eğitimimiz için her türlü imkanı önümüze seren, tıp etiği ve engin tecrübeleri ile bize yol gösteren saygıdeğer hocalarım; klinik şefim Doç Dr. Fatma Tülin Kayhan ve Doç. Dr. Ali Okan Gürsel ‘e şükranlarımı sunarım. Asistanlığımın ilk yarısında beraber çalışma fırsatı bulduğum, sabır, özveri ve engin tecrübeleriyle eğitimime katkıda bulunan şef yardımcılarımız ve başasistanlarımız Sayın Op. Dr. Orhan Sanisoğlu, Op. Dr. Nihat Ayan, Op. Dr. Bülent Yılmaz ve Op. Dr. Yusuf Eren ’e teşekkürlerimi sunarım. Bilgi ve birikimleriyle yanımda olan Op. Dr. Recai Kadakal, Op Dr. A. Ahmet Şirin, Op. Dr. K. Hakan Kaya, Op. Dr. Arzu K. Koç, Op. Dr. Ayşenur Meriç, Op. Dr. Z. Mine Yazıcı, Op. Dr. İbrahim Sayın ‘a teşekkür ederim. Kendileriyle çalışmaktan ve ismimi isimlerinin yanına koymaktan mutluluk duyduğum, eğitimlerini tamamlayıp aramızdan ayrılmış olanlar ve hala beraber çalıştığım sevgili arkadaşlarım M. Serhad Toprak, Öztürk Aktaş, Lütfi Kanmaz, Taliye Çakabay, Efser Gürer, Ömer Erdur, Eyüp Bozkurt ve Sultan B. Erol ‘a teşekkür ederim. Kliniğimiz hemşirelerine, tıbbi sekreterlerine, personellerine ve isimlerini yazamadığım diğer tüm çalışanlara teşekkür ederim. Desteklerini esirgemeyen sayın Prof. Dr. Orhan Özturan ve sayın Doç. Dr. Orhan Gedikli ‘ye ve çalışmam sayesinde bir arkadaş yakınlığını hissettiğim, emeği ve yardımı ile işimi güzelleştirip kolaylaştıran sayın Dr. Bayram Kıran’a teşekkür ederim. Canıma can katan Aileme teşekkür ederim. İÇİNDEKİLER GİRİŞ ve AMAÇ 1 GENEL BİLGİLER 3 Larenks Histolojisi/ Topografik Anatomisi 3 Larenks Kanserleri 4 Kanser İmmünolojisi 9 Baş-Boyun Kanserlerinde İmmünite 20 GEREÇ VE YÖNTEM 21 BULGULAR 23 TARTIŞMA 42 SONUÇ 48 ÖZET 50 KAYNAKLAR 51 KISALTMALAR Treg: T regülatör hücre FoxP3: Transcription factor forkhead box P3 KİDEM: İzmir Kanser Denetim ve İzlem Merkezi AJCC: American Joint Committee on Cancer (Amerikan kanser karma komisyonu) THR: T hücre reseptörü, MHC: Major histokompatibilite kompleks ASH: Antijen sunan hücreler ADCC: Antikor-bağımlı hücresel sitotoksisite NK: Doğal öldürücü hücreler LAK: Lenfokinle aktive olmuş öldürücü hücreler TRAIL: TNF related apoptosis-inducing ligand AİHÖ: Aktivasyonla indüklenen hücre ölümü EKY: Ekstrakapsüler yayılım PN-PV İ.: Perinöral-perivasküler İnvazyon GİRİŞ VE AMAÇ Baş boyun yassı hücreli kanserleri en sık görülen beşinci kanser türüdür ve gelişmekte olan ülkelerde insidansı artış göstermektedir (1). Larenks kanseri erişkinlerde tüm kanserlerin % 2’sini oluşturur (2). Ülkemizde sağlık bakanlığı verilerine göre larenks kanseri dördüncü en sık kanserdir (3). Baş boyun yassı epitel hücreli kanser hastalarına yönelik tedavide büyük bir mesafe kat edilmesine rağmen yaşam beklentisini arttırmaya yönelik uzun yıllar bir sonuç elde edilememiştir. Bu amaçla birçok yönde araştırmalar sürdürülmektedir. Son zamanlarda özellikle T lenfositler olmak üzere konak immün yanıt ve kanser ilişkisi üzerinde durulmaya başlanmıştır. Kanserle mücadele görevini sürdüren immün sistem kanser kliniği ortaya çıktıktan sonra kanser tarafından manipüle edilmektedir. T hücreleri tümörlere karşı efektör, yardımcı ve regülatör (düzenleyici) olarak kritik rol oynamaktadır. Tümörle ilişkili CD4+ ve CD8+ T lenfositler olarak adlandırılan ve doğal olarak işlenip sunulan çeşitli antijenler bulunmuştur (4). CD8+ T hücrelerin anti tümör immünitede aracılık ettiği gösterilmiştir (5). CD4+ T hücre alt kümelerini anti kanser immün cevabın başlatılması ve devamıyla ilişkili iken aynı zamanda bu cevabın aşağı çekilmesinde de görev alırlar (6). Kanserli hastalarda genellikle T hücre fonksiyonlarında bir bozulma, dolaşımdaki immün yetenekli hücrelerde değişim veya kansere karşı oluşan immünitede bir yetersizlik söz konusudur. İmmün sistem aktivitesindeki azalma ile tümör büyümesindeki artma bağıntılıdır. Baş boyun yassı hücreli kanseri olan hastalarda antitümör immün yanıt baskılanmıştır ve bu immün yanıt bozukluğu sonucu tümörün ilerlemesi veya tekrarlaması oluşur (7). CD4+ T hücreler arasında CD4+CD25+ hücrelerin alt kümesi olan immün sistemi düzenleyen ve bu yüzden de regülatör T (Treg) hücreler olarak atfedilen bir grup 1 tanımlanmıştır (8). Kanserlerde Treg hücrelerinin önemi artmaktadır; çünkü Treg hücrelerinin miktarındaki yükselme kanserin gelişme ve büyümesi yönünde bir etki yaparak hastalığın gidişatını değiştirmektedir (9). Son çalışmalar, Treg’in tedaviye karşı yanıtları önemli oranda etkileyebildiğini ortaya koymaktadır (10). İnsan CD4+CD25+ T hücreleri süpresör CD4+CD25high T hücreleri ve aynı zamanda non-süpresör CD4+CD25low T hücreleri içeren karışık bir gruptur. Treg hücrelerinin ayrıştırılması için özgün yüzey işaretleyicileri bulmaya yönelik araştırmalar devam etmektedir. En tanımlayıcı Treg işaretleyicisi FoxP3 (transcription factor forkhead box P3) olarak kabul edilmektedir (11,12). Bu işaretleyicinin tanımlanması hücre geçirgenliği gerektirdiğinden kültürü ve boyamayı zorlaştırmaktadır. FoxP3 Treg hücreleri için daha özgün olmasına rağmen efektör T hücrelerinin aktivasyonunu takiben arttırılıyor olabilirler (13). Son zamanlarda IL–7 reseptörün α zinciri olan CD127 tanımlanmıştır. Bu çalışmada CD127 nin Treg üzerine azaltıcı yönde etkili olduğunu göstermişlerdir. Sonuçta bu çalışmalarla CD127’nin Treg hücrelerin ayrıştırılmasında ve seçici zenginleştirilmesinde kullanılabileceği gösterilmiştir (14). İmmünohistokimyasal kanser araştırmalarında Treg hücrelerin ayrıştırılmasında CD127 yakın zamanlarda kullanılmaya başlanmıştır ve bu şekilde yapılmış çok bir çalışma yoktur. Bu çalışmada diğer işaretleyicilere ek olarak CD127 kullanılarak Treg hücrelerinin ayrıştırılması planlandı. Yine kanser immünolojisi araştırmalarında baş boyun kanserleri bütün olarak çalışılmış olup özelikle larinks kanserleri pek az çalışılmıştır. Bu çalışmada larinks yassı epitel hücreli kanserlerinin Treg (CD4+CD25+Foxp3highCD127dim) ve immün sistem diğer alt grup hücreleri üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. 2 GENEL BİLGİLER LARENKS HİSTOLOJİSİ Epiglot üst kısmı ve arka yüzünü, aritenoid ve ariepiglottik kıvrımı, bant ventrikülün ve gerçek vokal kordun serbest kısmını nonkeratinize çok katlı yassı epitel örter. Ventriküler bantların alt kenarı, ventrikül ve subglottisi pseudostratifiye siliyalı solunum yolları epiteli örter. Seromüköz bezler epiglottisin alt üçte ikisinde ve ventriküler submukozada bulunur (15). Larengeal yüzde epiglottisin tabanına doğru epitel silyalı yalancı çok katlı prizmatik epitele dönüşür. LARENKS TOPOĞRAFİK ANATOMİSİ Supraglottik kısım: Epiglotun larengeal yüzü, ariepiglottik foldlar, aritenoid kartilajın larengeal yüzü, yalancı vokal kordlar ve ventrikülleri içerir. Supraglottis ve glottis arasındaki anatomik olarak gerçek sınır, kord vokalin yassı epiteli ile ventrikülün respiratuar mukozasıdır. Pratik olarak sınır, ventrikülün apeksidir. Ventrikül tabanı, glottik alanın parçası olarak düşünülür. Glottik kısım: İki gerçek kord vokal, anterior ve posterior komissürleri içerir Ventrikül apeksi ile bu noktanın l cm altından geçen horizontal plan arasındaki bölgedir. Vokal kord yapısında vokal ligament, vokal kas ve mukoza katları bulunur. Subglottik kısım: Glottis ve subglottis arası sınır, gerçek kord vokallerin önde l cm, arkada 0,5 cm altından geçen hattır. Subglottisin alt sınırı krikoid kartilajın alt kenarıdır. Larenks lenfatikleri: Larenks lenfatikleri genellikle derin servikal nodüllere drene olurlar. Supraglottik lenfatiklerinin büyük çoğunluğu üst ve orta juguler zincire drene olurlar. Geri kalanı alt servikal zincir ve spinal aksesuar zincire dökülürler. Gerçek vokal kıvrımlar lenfatik yönden diğer kısımlara oranla daha fakirdirler. Reinke 3 aralığına invaze olmuş tümör lenfatik sisteme girmiş demektir. Subglottik larenks lenfatikleri; inferior tiroid damarları takip edip subklavyen, paratrakeal, trakeaozafageal zincirler gibi derin juguler zincire veya krikotiroid membranı delerek larenksin her iki yanından lenfatikler alıp bilateral olarak orta derin servikal nodlara ve prelarengeal nodlara yayılır (16). Sekil 1: Larenksin üç anatomik bölgesi ve alt bölgeleri: supraglottis, glottis (C32.0) ve subglottis (C32.2) ve piriform sinüs (C12.9). Supraglottis alt bölgelerinde, suprahiyoid epiglot (i), ariepiglottik fold, larengeal giriş (ii), infrahiyoid epiglot (iv) ve ventriküler bandlar veya yalancı kordlar (v) (17). LARENKS KANSERLERİ Baş boyun yassı hücreli kanserleri en sık görülen beşinci kanser türüdür ve gelişmekte olan ülkelerde insidansı artış göstermektedir (1). Larenks kanseri erişkinlerde tüm kanserlerin % 2’sini oluşturur. Erkeklerde bu oran % 2,2, kadınlarda ise % 0,4’ tür (2). Ülkemizde Sağlık Bakanlığı kayıtları incelendiğinde 1999 yılı verilerine göre larenks kanserinin tüm kanserlerin %5,62’sini oluşturduğu ve dördüncü en sık kanser olduğu görülmektedir (3). İzmir bölgesi kanser analizi yapan KİDEM adlı kuruluşun kayıtlarına göre; larenks kanseri yaş standardize insidansı %10,8 olarak 4 saptanmıştır (18). Larenks kanseri görülme sıklığı ülkelere göre değişiklik göstermek üzere 3–10/100000 aralığında insidanslar bildirilmiştir. Erkek ve kadın arasındaki görülme oranı, ülkelere göre 4: 1 ile 30: 1 arasında değişir (19). Görülme sıklığı, 5–7. dekadlar arasında yoğunlaşmaktadır (2). Etyoloji: Karsinojen oldugu kesinlikle ispatlanan en mühim etmen sigaradır. Sonra tütün ile birlikte sinerjik etkisi görülen alkol gelir (20,21). Diğer faktörler larengofarengeal reflü, meslek-çiftçiler, nikel ve odun isçileri, makinistler ve asbest tozu ile yakın işi olanlar, marangozlar, dietilsülfat kullanarak etil alkol üretimi ile uğraşanlar riskli gruptur-, diyet- sebze ve meyveden zengin, lifli gıda tüketimi yüksek bireylerde A ve C gibi antioksidan vitaminlere bağlı olarak larinks kanserinin daha az görüldüğü düşünülmektedir-, viral faktörler (Epstein Barr virüs, Human Papilloma Virüs), radyasyon ve kalıtımdır (21). Histopatoloji: Histopatolojik olarak larenks kanserlerinin % 90-95’i yassı epitel hücreli karsinomdur. Bunların da % 60-65’i glottik, % 30–35’ i supraglottik, % 5’den azı transglottik ve % 5’den azı subglottik yerleşimlidir. Diferansiasyon derecesi, pleomorfizm ve mitotik aktivitelerine göre göre larenks kanserleri; iyi (grade 1), orta (grade 2) ve az diferansiye (undiferansiye) (grade3) olarak sınıflandırılır (2). Larenks kanserleri lokalizasyonlarına göre supraglottik, glottik, subglottik ve transglottik olarak dört grupta incelenir. Glottik Kanserler: Bu tümörler uzun süre sınırlandırılmış kalma eğilimindedirler. Buna karşılık ‘Reinke boşluğu’nu invaze ettikleri andan başlayarak öne veya arkaya doğru yayılabilir ve derinde vokal kası tutabilirler. Anterior yayılımla ön komissüre ve buradan karşı ses telinin anterior bölümüne, superior yayılımla supraglottik bölgenin ventrikül tavanına, inferior yayılımla subglottik bölgeye yayılır (2). Glottik bölge 5 kanserleri genellikle erken belirti verir, lenf nodu metastaz riski düşüktür ve daha iyi prognozludur. Ancak ön komissür tutulumu olan vakalarda prognoz daha kötüdür (21). Supraglottik kanserler: Epiglottis, ventriküler bant, ariepiglottik kıvrım, aritenoid bölgelerden kaynaklanabilir. En sık epiglotun fenestralarından geçerek preepiglottik alana yayılırlar (2). Supraglottik bölge lenfatikten zengindir. Lenf nodu metastaz riski yüksektir. Kolayca tiroid kıkırdağa penetre olabildiklerinden ve preepiglotik alana yayılabildiklerinden prognozu kötüdür. Subglottik (İnfraglottik) kanserler: Vokal kordlardan 1cm aşağıdan başlayan tümörlere veya gerçek kordu tutup subglottik bölgeye 1cm’den fazla yayılım gösteren tümörlere denir. Genelde enine yayılarak vokal kordun intrensek kaslarını invaze eder. Krikoid ve tiroid kıkırdağa yayılma oranı yüksektir. Krikoid membran yolu ile larenks dışına yayılabilirler. Sıklıkla Delphian lenf bezi metastazı yaparlar. Yukarı doğru ilerleyerek glotttik ve supraglottik bölgeleri, aşağıya doğru ilerleyip trakeayı tutabilir. Geriye doğru ilerleyerek krikoid kıkırdağın altından özofagusa doğru yayılabilir. Direk yayılımla hipofarenks ve tiroid bezine yayılabilirler (22). Transglottik kanserler: Bu terim larengeal ventrikülü vertikal yönde geçen olgular için kullanılır. Supraglottik-glottik ya da glottik-subglottik bölgeyi tutup larengeal ventrikül boyunca uzanıp ventrikülü vertikal olarak geçen veya her üç bölgeyi de tutup vertikal geçiş gösteren kanserlerdir. Erken dönemde paraglottik alana yayıldıklarından prognozları kötüdür. Servikal lenf bezi metastazı oranları yüksektir (2,21). Evreleme: AJCC’nin (American Joint Committee on Cancer) 2002 yılında yayınlamış olduğu evreleme kullanılmaktadır (17). Tanı: Larenks kanserlerinde kesin tanı, alınan biyopsinin histopatolojik incelemesi sonucu konulur. 6 Tedavi: Cerrahi en sık başvurulan tedavi şeklidir (23). İdeal yaklaşım şekli multidisipliner olarak her hastanın ayrı olarak değerlendirilmesi ve tedavi yönteminin belirlenmesidir. Uygulanacak tedavi tüm bu kriterler göz önüne alınarak primer radyoterapi, primer cerrahi veya cerrahi + radyoterapi olarak seçilebilir. Prognostik Faktörler: Temelde prognostik faktörler; Tümöre ait özellikler Histopatolojik ve makraskopik özellikler Biyolojik özellikler Hastaya ait özellikler Tedaviye bağlı özellikler olarak sınıflandırılabilir. Tümöre Ait Histopatolojik ve makraskopik özellikler T evresi: Tümörün T evresinin sağ kalım üzerine çok fazla etkisinin olmadığını belirten yayınlar olduğu gibi anlamlı bulan yayınlar da mevcuttur. Ancak tümör lokalizasyonu prognostik olarak önemli bulunmuştur (24,25). N evresi: Tümör N evresi bağımsız ve güvenilirliği kabul edilmiş en önemli prognostik faktördür. Metastatik lenf bezi pozitif olgularda ekstrakapsüler yayılımda uzak metastaz oranı artar ve sağ kalım süresi düşer (21). M evresi: Uzak organ metastazı kötü prognoz göstergesidir. Perinöral/ perivasküler invazyon: Hem perinöral hem de perivasküler invazyonun prognostik önemi üzerine fikir birliği yoktur. Histolojik grade: Tümör grade’inin prognostik olarak belirleyici olduğu gösterilmiştir (21). Histolojik hücre tipi: Küçük hücreli nöroendokrin tümörlere oranla verrüköz karsinomlarda yaşam beklentisi çok daha uzundur. 7 Cerrahi sınırlar: Cerrahi sınır pozitifliği mutlak kötü prognoz göstergesidir (26). Tümörün büyüme paterni: Ekzofitik tümörler genel olarak infiltratif tümörlere göre daha iyi prognozludur ancak bu konuda görüş birliği yoktur. Tümör invazyon derinliği: İnvazyon derinliği tümör agresivitesini gösterir. Derine invaze olan tümörlerde yüzeysel olanlara göre prognoz daha kötüdür. Kıkırdak invazyonu: Kıkırdak invazyonunda metastaz riski artmaktadır (21). Tümöre ait özellikler biyolojik özellikler DNA ploidisi: Tümör hücrelerindeki DNA kapsamını gösterir. Anaploidi saptanan tümörlerde bölgesel tekrarlama riskinin arttığı gösterilmiştir (2). Proliferatif aktivite: Yüksek çoğalma (proliferasyon) hızına sahip tümörler daha kötü prognoz gösterirler. PCNA (Hücre çoğalması nükleer antijeni): DNA replikasyonu ile ilgili nükleer bir proteindir. Azalmış PCNA bölgesel tümör tekrarı için prognostik bir kıstas olarak saptanmıştır. Ki–67: Hücre siklusu aktif bölümlerinde salgılanan nonhiston nükleer proteindir. Hücrenin çoğalma aktivitesini gösterir. Ki67 ekspresyonunun lenf nodu metastazı ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür (27). Onkogenler: P53: 17. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunan tümör baskılayıcı gendir. Aşırı ekspresyonu kısa sağ kalım, tümör proliferasyonunda hızlanma, tümörün erken zamanda tekraroluşması ile ilişkilidir. Epidermal growth faktör reseptörü (EGFR): Büyüme faktörleri için tirozin kinaz aktivitesi taşıyan reseptördür. Larenks yassı hücreli kanserinde sık ve erken aşırı ekspresyonu hızlı ilerlemeyi ve invaziv özellikleri gösteren işaretleycidir (28). 8 Konak hücre yanıtı: Tümör içinde veya çevresinde yoğun lenfositik infiltratın varlığının nüks riskini azalttığı, S–100 proteni pozitif langerhans hücre infiltrasyon yoğunluğunun fazla olmasının iyi prognostik faktör olduğu belirtilmiştir. Hastaya ait özellikler Yaş ve cinsiyet: Literatürde yaşın ve cinsiyetin prognoz üzerine etkisi olup olmadığı konusunda fikir birliği bulunmamaktadır. Beslenme: Negatif nitrojen dengesinde olan hastalarda genel durum daha kötüdür ve yapılacak tedaviye yanıt daha düşüktür. Genel durum: Hastanın genel durumumda onun immünitesini etkileyecek bir bozulmanın prognozu olumsuz etkileyeceği düşünülmektedir. Sosyoekonomik düzeyi düşük, sigara ve alkol kullanan, erkek, bekâr ve yaşlılarda baş boyun kanserlerinin daha ileri evrede yakalandığını, bunun da prognozu olumsuz yönde etkilediğini belirtilmiştir (24). Prognostik faktör olarak sigaranın incelenmesi zor olmakla birlikte kötü prognozla ilişkili gibi görünmektedir. Tedaviye bağlı özellikler Erken evre kanserlerde radyoterapi birinci seçenek olabilirken ileri evre kanserlerde cerrahi birinci seçenektir. Glottik ön komissür tutulumunda radyoterapi prognozu düşüreceğinden cerrahi ilk seçenek olmalıdır. KANSER İMMÜNOLOJİSİ Kanser, organ nakli ve otoimmün hastalıklar immün sistemin rolünün büyük ilgi çektiği klinik durumlardır. Kanser tedavisinde, tümörlere karşı immün yanıtın arttırılmasının büyük umut vaat ettiğine inanılmaktadır. Organ nakli ve otoimmün hastalıklarda ise durum bunun tam tersidir. 9 İmmün sistemin özellikle de hücresel immünitenin, onkogenezin kontrolünde büyük önem taşıdığı bilinmektedir. Modern immün gözetim teorisi; konak immün sistemin tümör hücrelerini saptama ve yok etme yeteneği üzerinde durur. Bunun yanında tümör hücrelerinin immün sistem için pasif hedefler olmadığını, kaçma ve konak immün sistemini etkisiz bırakabilme yeteneği olduğunu da savunur. Bu teori, tümör hücresi ile immün hücre ya da bunların ürünlerinin birbirleri ile etkileşimlerindeki karmaşıklığı kabullenmektedir. Bu etkileşimler sonucunda da sıklıkla tümör hücresinin değil, immün hücrenin öldüğü tahmin edilmektedir. İmmün sistemde başlıca T ve B lenfositler, doğal öldürücü (NK) hücreler, monosit/makrofajlar, fagositler, dendritik hücreler görev almaktadır. Doğal immün yanıt patojene erken reaksiyonu kapsar ve edinsel immün yanıt başlangıcı için kritiktir. Tümör hücrelerinin tanınması ve karşı savunmaya geçilmesi edinsel immüniteyle sağlanır. İki türlü edinsel immünite vardır; hümoral ve hücresel immünite. Hümoral immünite B lenfositlerin ürettiği antikor denilen proteinler tarafından oluşturulur. T lenfosit hücreleri tarafından oluşturulan immüniteye hücresel immünite denir. Hümoral ve hücresel immünitenin karakteristik özellikleri ve farklılıkları tablo 1’de özetlenmiştir. Tablo1: Hücresel ve hümoral immünite arasındaki farklar Hücresel immünite (T hücreleri) Hümöral immünite (B hücreleri) Hücre içi patojenlere karşı savunma. Hücre dışı patojenlere karşı savunma. Antijen sunumuna gereksinimi vardır. Antijen sunumuna gereksinim duymaz. Makrofajları aktifler. Antijeni doğal konformasyonunda tanır. Enfekte hücreleri öldürür. Antikor salgılar THR ile antijen/MHC kompleksini tanır. Yalnızca peptit yapılı antijenleri tanır. THR: T hücre reseptörü, MHC: Major histokompatibilite kompleks İmmün sistemin işleyiş evreleri: Antijen tanınması, lenfositlerin aktivasyonu, 10 antijenin ortadan kaldırılması, immün cevabın sonlandınıması ve bellek evreleridir. İmmün Sistem Hücreleri: Başlıca lenfositler, antijen sunan hücreler(ASH), efektör hücrelerden oluşur. (Tablo 2 ‘de özetlenmiştir) Efektör hücreler: Yabancı olarak algılanan maddeleri yok eden hücreler efektör hücreler olarak adlandırılır. Lenfositler ve diğer lökositler bu gruba girerler. Lenfositler: Antijenlere özgün reseptörler taşıyan tek hücre grubudur. Günümüzde bu hücreler, monoklonal antikor panelleri ile tanınabilen yüzey proteinleri aracılığı ile birbirlerinden ayırt edilmektedir. Bu proteinlerin standart adlandırılması "CD" (ayırım kümesi, "cluster of differentiation") sayısal tanımlaması şeklindedir. Antijen sunan hücreler(ASH): Protein antijenlerini tanımaları için T hücrelerine sunan dendritik hücreler ve makrofajlar gibi hücrelerdir. Tablo 2: İmmün Sistemin Hücreleri Hücre Tipi Lenfositler (edinsel immüniteyi düzenleyen anahtar hücrelerdir.) Efektör Hücreler Başlıca İşlevi B lenfositler: Hümoral immünite T lenfositler: Hücresel immünite NK hücreleri: Doğal immünite T lenfositler Yardımcı T lenfositler (enflamasyon, makrofaj, T ve B lenfosit aktivasyonu) Sitotoksik T lenfositler (enfekte hücrelerin öldürülmesi) Makrofaj ve Monositler Granülositler Antijen Sunan Hücreler(ASH) Dentritik Hücre Makrofaj Foliküler Dentritik Hücre NK: Doğal öldürücü hücreler(Natural killer) TÜMÖR ANTİJENLERİ Çoğunlukla ekspresyon paternlerine göre sınıflandırılırlar. Tümör antijenleri hem hümöral hem de hücresel tümör selektif immün yanıtı tetikleme potansiyeline sahiptir. Bu antijenlerin çoğu tümörle ilişkilidir ve tümör hücre yüzeyinde eksprese 11 (ifade) edilmektedir. Tümör özgün (spesifik) antijenler (TSA): Normal hücrelerde bulunmayıp tümör hücrelerinde eksprese edilirler ve konak immün cevabını stimüle ederler. Tümör ilişkili antijenler (TİL): Normal konak hücrelerinde de eksprese edilen bu antijenlerin bir kısmı, konak immün cevabını indükleyebilmelerine karşın öz yanıtsızlık (tolerans) nedeniyle seyrek olarak immün cevap oluşturur. Tümör antijenleri özetle; monoklonal antikor hedefi olarak tümör antijenleri, onkogen veya tümör-süpresör gen ürünleri, mutant normal gen ürünleri, T hücrelerince hedeflenen tümör antijenleri(kanser/testis antijenleri ve farklılaşma (diferansiasyon) antijenleri) ve tümöre özgün transplantasyon antijenleri (TSTA) olarak sayılabilir. ANTİTÜMÖR T HÜCRELERİ Anti- tümör immün yanıtta T hücreleri kritik rol oynamaktadır (29). T hücreleri otolog tümör hücrelerini lize ederek ve ayrıca interlökin–2 (IL–2), interferon-γ (IFN- γ), granülosit/makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) ve tümör nekroz faktör-α (TNFα) gibi sitokinleri sekrete ederek de rol oynamaktadır. Antijen Sunan Hücreler ve Tümör Antijenlerinin T Hücrelerine Sunumu: Antijenleri yakalayıp T lenfositlerin tanıması için gösteren özelleşmiş hücrelerdir. Tümör antijenlerinin tanınabilmesi, peptid antijenlerini T lenfositlerinin tanıması için gösteren protein olan MHC molekülleri tarafından T hücrelerine sunulmasını gerektirir. İnsan MHC proteinleri insan lökosit antijenleri adını alır. MHC bağlanma boyutuna uygun olarak kanser antijenleri hazırlanmaktadır (30). Antijen sunan hücreler aynı zamanda, T hücrelerinin etkinleşmesi için gereken "ikinci sinyal"leri sağlayan eş uyaranları eksprese ederler. 12 Antijenin Sunum İçin Majör Histokompatibilite Kompleks Sınıf I ve II Moleküllerince İşlenmesi: Tümör antijenleri de MHC molekülüne bağlanarak ve hücre yüzeyine iletilerek T lenfositlere sunulur. MHC sınıf I ve II moleküllerinin farkları tablo 3 ‘te özetlenmiştir. Peptidler ayrıca ısı şok proteinlerine (HSP) bağlanabilir ve hücreden HSP-peptit kompleksi olarak ayrılıp sınıf I yolağına katılır (31). Tablo 3: MHC Sınıf I ile Sınıf II arasındaki başlıca farklılıklar Özellik Yapısal özellik ASH tipleri MHC Sınıf I MHC Sınıf II α Polimorfik α zinciri, 2 Polimorfik mikroglobulin, peptit zincirleri, peptit Tüm çekirdekli hücreler Dentritik ve β hücreler, makrofaj, B lenfositleri, endotel hücreleri Antijen sunduğu hücre CD8+ T lenfosit Protein antijenlerin kaynağı Endozomal/lizozomal proteinler CD4+ T lenfosit Sitozolik proteinler (çoğunlukla hücrede sentezlenir) (çoğunlukla dışarıdan alınır) İnterferon-γ’ın Rolü: Sınıf I molekül fonksiyon ile ilişkili TAP ve proteazom komponent molekülleri IF-γ ile regule edilir. Peptit transfer edici moleküller, sınıf I ağır zincir ve β2- mikroglobulin gibi proteazom komponenti ya da regulatuvar peptitler IF-γ tarafından upregule edilir (32). Bazı HSP ler de IF-γ ile indüklenebilir. Birçok hücre ve doku tipinde MHC sınıf II molekül ekspresyonları da IF-γ tarafından indüklenir (33). Antijenler İçin T hücre reseptörleri(THR): THR antijene özgün olup THR ile tanınan antijene “Cognate antijen” denir. MHC moleküllerin sunduğu peptid antijenler için T hücre reseptörü bir α ve bir β zincirinden oluşan bir heterodimerdir (34). Membran yüzeyinde, CD3 molekülü ve ζ zinciri diye adlandırılan bir grup proteinle ilişkili olarak bulunur ve hepsi beraber THR kompleksini oluşturur. 13 Antitümör T Hücre Aktivasyonunda Antijen Sunan Hücrelerin Rolü: T hücrelerin aktivasyonu ASH’deki eş uyaranların tanınmasına bağlıdır. B7–1 (CD80) ve B7–2 (CD86) gibi ko-stimulatör moleküller naif T hücrelerinin aktivasyonu için kritik öneme sahiptir ve T hücreleri için en iyi tanımlanmış eş-uyaranlardır. Dendritik Hücreler: DH’ler naif T lenfositlerin aktivasyonu için etkin antijen sunumu yaparlar. Naif CD4+ T lenfositleri aktive ederek Th1 CD4+ yardımcı T lenfositleri ile hücresel, Th2 CD4+ yardımcı T lenfositleri ile de hümoral immüniteyi uyarır ya da regulatuvar T hücrelerini aktive ederek antijene yanıtsızlığa neden olur (35). DH aracılı T hücre inaktivasyonu oluşabilir. Makrofajlar: Tümör oluşumu genellikle makrofaj artışı ile birlikte gider. Makrofaj ilişkili antijenleri tanıyan Th1 alt grubunun efektör T lenfositleri CD40 ligand-CD40 etkileşimi ile ve makrofaj aktive edici sitokin interferon- γ (IFN-γ) salgılayarak makrofajları aktive eder. Makrofajlar tıpkı DH gibi hücreleri fagositozla alır ve MHC sınıf II ile sunar. B hücreleri: B hücreleri protein antijenleri yutar ve bunları yardımcı T hücrelerine sunar. B lenfositler solubl ve yoğunluğu az olan antijenlere yüzey immünoglobulin (Ig) reseptörleriyle bağlanır ve endositoz gelişir. B lenfositler yapısal olarak MHC sınıf II molekülü ve yüksek oranda B7–1 ve B7–2 eksprese ederler. Antitümör korunmada B hücrelerinin etkinliği sınırlıdır. Oluşan antikorlar, kompleman aktivasyonu veya antikor-bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) aracılığı ile tümöre karşı savaşabilir. Doğal öldürücü hücreler(NK): NK hücreleri, T ve B lenfositlerden farklı olan, hücre içi mikroorganizmalara karşı, etkilenen hücreleri öldürerek ve makrofajları aktive eden sitokini, IFN-γ’ yı salgılayarak mücadele veren kemik iliği kaynaklı küçük bir 14 lenfosit popülasyonunudur (36). Sitotoksik T lenfositlerden farklı biçimde, önceden duyarlaşmış olmaksızın tümör hücrelerine saldırırlar ve bu hücreleri tanımada MHC bağımlı değildirler. Anti-tümör doğal immünitenin başlıca efektör yapıları olan NK hücreleri, az sayıdaki tümör hücrelerini dolaşımdan etkin biçimde temizleyerek sistemik metastazların gelişmesine direnç gösterirler. NK hücrelerinin hafıza yanıtı yoktur. Lenfokinle aktive olmuş öldürücü hücreler (LAK): Özgün olmayan savunmanın önemli bir başka komponenti LAK’lardır. Lenfositlerin Olgunlaşması Anti tümör yanıtta görev alacak potansiyel T lenfosit prokürsörleri kemik iliğinden timusa göç eder ve olgunlaşmaya başlar (37). Timusta olgunlaşmasının ilk basamağı antijen tanınması için MHC sınırlandırılması ve CD4 ya da CD8 yüzey molekül ekspresyonudur. Normal doku antijenleriyle reaksiyon giren olgunlaşmamış çift pozitif T hücreleri ve öz antijenlere karşı yüksek afiniteli potansiyel tümör reaktif T lenfositler negatif seçime uğrar. Olgunlaşmamış lenfositler kendi MHC moleküllerini tanımak üzere seçilir; bu sürece pozitif seçim denir. Olgun Anti tümör T Lenfositlerin Aktivasyonu Tümörlere karşı T lenfosit yanıtları, naif T hücresinden efektör hücrelere dönüşen T lenfositlerin sayısında artışa neden olan bir dizi süreci içerir. THR tetiklenmesi T lenfosit aktivasyonu için ilk sinyal olarak bilinir. Antijen tanıma ve eş uyarım: Antijen özgün T lenfosit yanıtı için THR/CD3 kompleksinin antijenik liganda ve CD4 ya da CD8 molekülünün de MHC molekülüne bağlanması gerekir. Adezyon molekülleri T hücrelerinin ASH’e bağlanmasını arttırır ve eş uyaran reseptörler ASH tarafından sağlanan ikinci sinyalleri tanırlar. 15 Adezyon moleküllerinin rolü: Lenfositlerin hedef hücreye bağlanmasını artıran CD28, CD2, CD5, LFA-1, CD44, CD69, CD4 ve CD8 benzeri moleküllere adezyon molekülleri adı verilmektedir. T hücrelerindeki adezyon molekülleri ASH’deki ligandlarını tanıyarak T hücre-ASH bağlanmasını sabitler. Sitokin salgılanması ve sitokin reseptörlerinin ekspresyonu: Antijen ve eşuyaranlara yanıt olarak, özellikle CD4+ T hücreleri olmak üzere T lenfositleri hızlıca farklı etkili olan farklı sitokinleri salgılarlar. Üretilen ilk sitokin interlökin–2 (IL–2)’dir. IL–2 T lenfositler için başlıca büyüme faktörüdür. Antijenle karşılaşan naif T lenfositler IL–2 yokluğunda anerjik kalabilir. Olgun T lenfositler: Olgun T lenfositler antijen repertuarlarına göre naif, efektör ve hafıza hücreleri olmak üzere üç gruba ayrılır (38). Ayrıca T lenfosit alt tipi olarak yeni tanımlanan CD8+ Treg hücreler supresif etki göstererek görev yapmaktadır. CD4+ Lenfositlerin Efektör Fonksiyonları: CD4+ T lenfositler yardımcı T lenfositler ve regulatuvar T lenfositler olmak üzere iki kısma ayrılabilir. Yardımcı T lenfositlerin başlıca aktivitesi THR-peptit-MHC çiftleşmesiyle self aktivasyonu, CD40/CD40L çiftleşmesiyle ASH aktivasyonunu arttırmaktır. Bu hücreler ayrıca sitotoksik T lenfosit aktivasyonu için gerekli IL–12 gibi sitokinlerin yapımını da sağlar. CD4+ T lenfositlerin yardımı olmaksızın hafıza hücrelerinin yaşam süreleri kısalır ve antijene yanıt azalır. CD4+ yardımcı T lenfositler sekrete ettikleri sitokinlere göre Th1 ve Th2 olarak iki gruba ayrılır (39). Th1 hücreler hücresel immün yanıtta, Th2 hücreler ise hümoral immün yanıtta görev alır. Makrofaj ilişkili antijenleri tanıyan Th1 alt grubunun Efektör T lenfositleri IFN-γ salgılayarak makrofajları aktive ederler böylece makrofajların mikrobisidal aktiviteleri arttırılır. CD4+ T lenfositleri Th2 alt grubu, 16 eozinofillerden zengi enflamasyonu uyarır ve makrofaj aktivasyonunun zarar verici etkilerini kontrol altına almaya çalışır. Regülatör T lenfositler: Antijenle karşılaşma sonucu IL–10 bağımlı olarak periferden kaynaklanan CD4+CD25lowFoxp3low tip1 T regülatör (Tr1) hücreler; doğal olarak direk timusta oluşan ve CD4+CD25- ve CD8+CD25- T hücrelere karşı temas bağımlı, sitokin bağımsız ve özgün olmayan davranışlı süpresör yanıt yeteneğindeki CD4+CD25highFoxp3+ T hücreler (nTreg)(doğal Treg hücreler), fonksiyonel farklılaşma için IL–4 bağımlı olan Th3 hücreler ve CD8+ Treg hücreleri olmak üzere değişik tip Treg hücreleri mevcuttur (40,41,42). İnsan ve hayvan kanser modellerinde yapılan çalışmalar, bu hücrelerin tümör progresyonunu arttırdığını doğrulamıştır(43, 44). CD4+CD25+ Treg hücreler: CD4+CD25+ Treg hücreler hem CD4 hem de CD8 T lenfositlerin aktivitelerini inhibe etme yetisine sahiptir. Bu hücreler CD4+ ,CD25+, CD69-, CTLA–4+, CD45RO- olmalarıyla tanınırlar. Bu hücreler özgün olarak foxp3 diye bilinen transaktivatör bir gen ekprese ederler (44). CD8+ Treg hücreler: Daha az çalışılmış olan ve CD4+ hücreleri in vitro olarak baskıladığı rapor edilen hücrelerdir. Bu sonuç CD8+ hücrelerin anti-CD3 antikorları ile stimülasyonu esnasında CD4+ hücrelerin proliferasyonun baskılanmasına dayanmaktadır. Bu hücreler yaygın olarak kabul gören Treg işaretleyicileri olan CD25 ve FoxP3’ü sergilerler (45). CD8+ Treg olarak ASH ile antijen sunumundan sonra hücre-hücre iletişimi aracılığıyla antijen özgün immün süpresyona neden olmasıyla karakterize olan bir grup ve antijen özgün olmayan T lenfosit proliferasyonunun supresyonunu sağlayan ikinci grup olmak üzere iki tip CD8+ Treg hücresi tanımlanmıştır. Bu ikinci grup hücreler etkilerini IFN-γ ve IL–6 gibi solubl faktörler 17 aracılığıyla gösterir (46). CD8+ Treg hücreler fenotipik olarak CD45RA eksprese etmekte ve CD45RO eksprese etmemektedir. CD8+ Sitotoksik T lenfositler: CD8 sitotoksik T lenfositler hücre üzerindeki sınıf I MHC ilişkili peptidleri tanırlar ve granül içeriklerinin hedef hücre membranında delikler oluşturması ve hedef hücrelerde DNA parçalanmasına ve apopitoza yol açarak hücreleri öldürürler. Antitümör sitotoksik efektör hücreler sitotoksik T lenfositler ve NK lenfositlerdir. Etki mekanizmalarından biri hedef hücre reseptörlerini tetikleyecek ligandların ekspresyonudur. Bu ligandlara örnek Fas ligand ve TNF related apoptosisinducing ligand (TRAIL)’dır (47). Anti tümör T lenfosit yanıtının azaltılması mekanizmaları Anerji Periferik tolerans Tümör Özgün Olgun T Lenfositlerin Delesyonu ve Anerji T hücresinin bir antijenle karşılaşmasından sonra işlevsel inaktivasyonunu tanımlar ve genellikle T hücresinin tam aktivasyonu için gereken ikinci eş-uyaranların yokluğuna bağlıdır. Aktivasyon sonrası olgun T lenfositler yüksek antijen konsantrasyonu ile tekrarlayan stimulasyonlar sonucu apopitozla delesyona uğrayabilir. Bu süreç aktivasyonla indüklenen hücre ölümü(AİHÖ) olarak adlandırılır. TÜMÖRLERİN İMMÜN YANITLARDAN KAÇIŞ MEKANİZMALARI İmmün yanıtlar tümör büyümesine karşı çoğunlukla başarısızdır, çünkü bu yanıtlar etkisizdir veya tümörler, immün saldırıdan kurtulacak şekilde gelişirler. Çeşitli nedenleri olan bu olay, başlıca şu mekanizmalarla gerçekleştirilmektedir. Tümör Hücrelerince Salgılanan Solubl Faktörler Sitokinler 18 Transforming Growth Faktör- β (TGF-β): Kanser hastalarında TGF-β’nın NK hücre sitotoksisitesini azalttığı gösterilmiştir (48). Prostaglandinler(PG): PG’ler IL–10 yapımını indüklemektedir (49). Kanser hastalarında artan PG yapımı immünsupresif etki göstermektedir (50). İnterlökin–10 (IL–10): IL–10 kanser hastalarında yüksek düzeyde bulunur ve bu düzey anti tümör immünitede azalma ve kötü prognozla birliktedir (51). Tümör hücreleri tarafından yapılan ve VEGF adı verilen sitokinin dendritik hücre gelişmesini, T hücre büyümesini ve CTL farklılaşmasını inhibe ederek anti-tümör cevabı baskılayabileceği belirlenmiştir (52). İmmün Hücrelerin Sinyalizasyon Defektleri Bozulmuş T Hücre Reseptör ζ Zincir Ekspresyonu: ζ zincir ekspresyonu T hücre aktivasyonu için esansiyeldir (53). İnsanda çeşitli kanser tiplerinde TİL, periferik T ve NK hücrelerinde düşük ζ ekspresyonu saptanmıştır (54). İleri evre kanser hastalarında periferik T hücre apopitoz indüklenmesi ve kaspaz–3 aktivitesiyle ζ zincir ekspresyonunda azalma arasında korelasyon saptanmıştır (55). Nükleer faktör κB (NFκB) yolağının süpresyonu: Böbrek hücreli karsinomlu bazı hastalarda nükleer faktör κB (NFκB) yolağının süprese olduğu gösterilmiştir (56). Sitotoksisiteden kaçma: Kanser hücreleri apopitotik işleyiş sistemini değiştirerek apopitoza dirençli hale gelebilirler. İmmün Efektör Hücrelerin Eliminasyonu Aktivasyonla İndüklenen Hücre Ölümü(AİHÖ): AİHÖ tümör infiltre eden lenfositlerdeki apopitozun en önemli nedenlerinde biri olduğu düşünülmektedir (57). . Tümör Kontratağı: Birçok kanser türünün Fas eksprese eden T hücrelerinin apopitozunu induklediği gösterilmiştir (58). 19 Antijenik modülasyon: Antikor bağlanmasının bir sonucu olarak meydana gelen tümör antijenlerinin yüzey ekspresyonunun kaybolmasına ve immün efektör mekanizmalara direnç kazanılmasına neden olan bir olaydır. BAŞ-BOYUN KANSERLERİNDE İMMÜNİTE Baş boyun kanserlerinde immünolojik çalışmalar başlıca T hücrealt grupları arasındaki düzensizlik, kanserin ve kanser tedavisi ile immün sistem etkileşimi veimmün sistem parametrelerinin prognoz üzerine etkisi üzerinde durulmaktadır. Aktif hastalığı olan baş-boyun kanserli hastalarda CD3+, CD4+ ve CD8+ T hücrelerin miktarında azalma olduğu ve hastalarda mutlak T lenfosit değerlerinin sağlıklı gruba göre anlamlı düşüş gösterdiği saptanmıştır (59). Yine bu hastalarda dolaşımdaki CD4+CD25+ T hücre oranının anlamlı olarak yüksek bulunduğu ve hastalarda CD4+CD25+ T-hücre havuzunun potansiyel süpresör fonksiyonu olan CD4+CD25high Treg hücrelerden zengin olduğu ve bunun hastalık aktivitesi ile anlamlı bir şekilde ilişkili olduğu gösterilmiştir (60). CD3+ T hücrelerdeki veya alt gruplarındaki ζ zincir ekspresyonunda azalma olduğu saptanmış ve bu azalmanın prognoz tayininde kulanılabilirliği tartışılmıştır (7). Baş boyun kanserli hastalarda periferik kan lenfosit NK aktivitesini kontrol grubuna göre anlamlı şekilde düşük saptamışlardır (61). Tüm bu çalışmaların henüz başlangıç olduğu immünolojik parametrelerin kanserlerde kullanılabilmesi için daha ileri çalışmaların gerekliliği üzerinde fikir birliği mevcuttur. 20 GEREÇ VE YÖNTEM Tez çalışmasına Bakırköy Dr. Sadi Konuk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz Kliniği’nde Ocak 2008 - Ekim 2008 tarihleri arasında larenks yassı epitel hücreli kanser tanısı almış ve daha önce tedavi almamış 19 olgu (Hasta Grubu) alındı. Kontrol grubu olarak yaş ve cinsiyet uyumlu olan sağlıklı 15 gönüllü birey seçildi. Bilinen oto immün bir hastalığı, HIV enfeksiyonu, mikobakterial ve diğer kronik enfeksiyonu olan, immünsüpresif tedavi alan, kemik iliği tutulumu olan veya kabul etmeyen olgular çalışmaya alınmadı. Çalışmaya alınan her olgunun aydınlatılmış onamı alındı. Hastaların anamnez ve ayrıntılı fizik ve endolaringoskopik muayene bulguları kaydedildi. Bilgisayarlı tomoğrafi (BT) veya magnetik rezonans (MRI) görüntüleme ile hastalığın sınırları ve boyun lenfatik metastaz durumu değerlendirildi. Olguların preoperatif, operatif ve postoperatif verileri ile patolojik sonuçları diğer tüm verilerle birlikte değerlendirildi. Larenks tümör evrelemesinde TNM sınıflaması (American Joint Commite on Cancer – Cancer Staging Manual 2002) kullanıldı. Çalışmamız Bakırköy Dr. Sadi Konuk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Yerel Etik Kurulu 2007–22 numaralı kararı ile uygun görülmüştür. Flow Sitometrik çalışma: Flow sitometrik inceleme İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Viroloji ve Temel İmmunoloji Bilim Dalı Laboratuarında yapıldı. Flow sitometrik çalışmada FACS Canto, Becton Dickinsen, San Jose, CA. flow sitometri cihazı ve FACS Diva bilgisayar yazılımı kullanıldı. Kan alımı ve örnek hazırlanması: Hasta ve kontrol kanları antekubital venden alınmış ve heparinle yıkanmış düz kan tüpüne koyuldu. Hasta kanları operasyondan önce ve bir ay sonra olmak üzere iki kez alındı. Tüpe alınan kan üç saat içinde örnek 21 hazırlamak üzere işleme alındı. Periferik kandan şekilli elemanlar Histopaque (Sigma Katalog No:1077) ile density gradient (1840 devirde en az 25 dakika) kullanılarak yoğunluk farklarına göre ayrıldı. Orta fazdan pastör pipeti ile çekilen lenfositler 2 kez cell wash (BD catalog no: 349524) ile yıkanarak lenfositler elde edildi. Elde edilen kan örneklerinde fenotipik olarak farklı 7 lenfosit alt kümesi flow sitometri kullanılarak değerlendirildi. Yüzey Antijen Boyaması: Lenfosit profili CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK (IMK-Plus kit BD, Biosciences) ve Treg (CD4-FITC, CD25-PE-CY7, APC anti-human Foxp3 (Ebioscience, kat. no :17–4776–73), Phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) anti-human CD127 (Interleukin–7 Receptor alpha, IL–7 Receptor alpha, IL-7Ra)( Ebioscience kat. No: 15–1278–73)) yüzde oranları flow sitometri kullanılarak saptandı. Tüm kan örnekleri özgün monoklonal antikorlarla 5 – 20 µl (BD and Pharmingen-San Diego, CA) inkübe edilmiş ve cihazda her bir kan örneğinden uygun lenfosit kapısında FSC/SSC hücre dağılımı üzerinde 10.000 hücre sayılıp FACS Diva Software kullanılarak analiz sonucu hücrelerin yüzde değeri hesaplandı. İstatistiksel değerlendirme: Çalışmada elde edilen bulgular değerlendirilirken, istatistiksel analizler için NCSS 2007 & PASS 2008 Statistical Software, Utah, USA, programı kullanıldı. Çalışma verileri değerlendirilirken tanımlayıcı istatistiksel metodların (Ortalama, Standart sapma) yanı sıra niceliksel verilerin karşılaştırılmasında normal dağılım gösteren parametrelerin gruplar arası karşılaştırmalarında student testi, grup içi değerlendirmelerde Paired samples t test kullanıldı. Normal dağılım göstermeyen parametrelerin gruplar arası karşılaştırmalarında Mann Whitney U test, grup içi değerlendirmelerinde ise Wilcoxon işaret testi kullanıldı. Sonuçlar % 95’lik güven aralığında, anlamlılık p<0.05 düzeyinde değerlendirildi. 22 BULGULAR Çalışma ve kontrol grubuna ait demografik özellikler özetlendi (Tablo 4). Grupların yaş ve cinsiyet dağılımları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Tablo 4: Demografik özelliklerin gruplara göre değerlendirmesi Hasta grubu Kontrol grubu p 55,21±8,46(42–74)* 50,33±7,91(37–66)* 0,096 n** (%) n** (%) †p Kadın 2 (%10,5) 6 (%40,0) Erkek 17 (%89,5) 9 (%60,0) Yaş* Cinsiyet : student t test † : Ki kare test 0,100 * : ortalama±standart sapma(yaş aralığı; minimum-maksimum) ** n: sayı Tümör olguların % 15,8’inde transglottik; %63,2’sinde supraglottik ve %21,2’sinde glottik yerleşimli olarak gözlendi (Tablo 5). Patolojik inceleme sonucu olguların %15,8’i iyi; %73,7’ü orta ve % 10,5’i az diferansiye olarak rapor edildi (Tablo 5). Tablo 5: Tümör yerleşimi ve diferansiasyonu dağılımı (n=19) Yerleşim Diferansiasyon n % Transglottik 3 15,8 Supraglottik 12 63,2 Glottik 4 21,1 İyi diferansiye 3 15,8 Orta diferansiye 14 73,7 Az diferansiye 2 10,5 23 1.Kan 2.Kan 1.Kan 1 E 54 37 T İD T3 N1 2 E 46 25 S OD T2 3 E 53 20 G OD T2 N0 4 E 53 48 S OD 5 E 42 30 S 6 E 61 30 7 E 56 8 E 9 Treg NK CD19 CD8 CD4 CD3 CD45 Cerrahi sınır + PN-PV İ. EKY TNM evre N T Diferansia syon Yerleşim Sigara Yaş Cinsiyet No Tablo 6: Çalışma grubu olgularına ait veriler 2.Kan 1.Kan 2.Kan 1.Kan 2.Kan 1.Kan 2.Kan 1.Kan 2.Kan 1.Kan 2.Kan III - - - 100 99 87 84 42 41 37 37 6 7 7 8 23 21 N2b IVa + + - 92 99 75 77 48 51 23 22 13 12 12 11 18 16 - - - 98 101 73 65 45 35 27 26 13 15 15 27 14 11 T2 N2c IVa + + - 100 99 90 74 53 53 32 21 4 11 6 12 29 25 OD T2 N0 II - + - 98 96 70 71 35 38 30 31 12 15 20 17 15 18 G İD T2 N0 II - - - 97 100 75 88 35 48 41 36 4 4 5 9 17 15 30 S OD T1 N0 I - - - 98 97 73 65 48 43 24 25 15 16 13 15 15 13 43 15 T OD T3 N0 III - - - 81 82 79 72 57 47 26 20 3 4 4 7 19 15 E 54 30 S OD T4 N0 IVa - - - 91 90 68 67 39 40 28 25 8 12 15 14 21 19 10 K 53 35 S OD T1 N0 I - - - 98 99 75 70 49 38 19 17 14 14 9 15 12 13 11 E 57 60 S OD T2 N0 II - - - 97 102 83 77 54 55 28 22 5 16 9 9 13 11 12 E 74 50 S AD T3 N2c IVa + + + 100 98 74 73 53 36 17 35 19 13 7 6 19 23 13 E 54 70 S OD T4 N0 - - 97 89 82 76 50 53 25 21 4 11 11 12 28 16 14 E 66 30 S İD T1 N0 I - - - 100 99 76 72 47 41 25 25 11 9 13 18 17 13 15 E 55 60 G AD T1 N0 I - - - 90 96 66 71 31 38 24 31 9 15 15 17 15 13 16 K 53 40 T OD T3 N2c IVa + + + 98 99 88 74 50 53 29 21 4 7 6 5 21 27 17 E 51 25 S OD T2 N2c IVa + + + 95 94 87 75 51 51 30 25 7 9 11 15 27 20 18 E 73 100 S OD T2 N0 II - - - 91 97 70 72 35 42 40 23 5 9 9 16 18 14 19 E 51 30 G OD T3 N0 III - - - 95 88 65 76 31 39 37 35 6 4 9 6 16 12 Yerleşim: T: Transglottik / S: Supraglottik /G: Glottik EKY: Ekstrakapsüler yayılım 1.kan: Operasyon öncesi / 2. kan: operasyon sonrası II IVa - Diferansiasyon: İD/OD/AD: iyi/orta/az diferansiye PN-PV İ. : Perinöral/ perivasküler invazyon Sigara: paket. yıl 24 Yerleşim Yeri Transglottik 15,8% Glottik 21,1% Supraglottik 63,2% Şekil 2: Tümör yerleşim yerine göre dağılımı Diferasiasyon Az 10,5% İyi 15,8% Orta 73,7% Şekil 3: Olguların diferansiasyon derecesine göre dağılımı T evresi dağılımı incelendiğinde % 21,1 olgu T1; %42,1 olgu T2, % 26,3 olgu T3 ve % 10,5 olgu T4 evresindedir. N evresi; % 68,4 olgu NO, % 5,3 olgu N1; % 5,3 olgu N2b ve % 21,1 olgu N2c evresindedir. Olguların tamamı M0 olarak değerlendirildi. Neticede hastalar TNM evrelemesine göre oranlandığında %21,1 olgu Evre I; %26,3 olgu evre II, % 15,8 olgu Evre III ve % 36,8 olgu Evre IVa’ da saptandı (Tablo 7). 25 Tablo 7: Olguların TNM evrelerine göre dağılımı (n=19) T N M Evre n % T1 4 21,1 T2 8 42,1 T3 5 26,3 T4 2 10,5 N0 13 68,4 N1 1 5,3 N2b 1 5,3 N2c 4 21,1 M0 19 100 I 4 21,1 II 5 26,3 III 3 15,8 IVa 7 36,8 Evrelere Göre Dağılım Evre I 21,1% Evre IV a 36,8% Evre III 15,8% Evre II 26,3% Şekil 4: Olguların evrelere göre dağılımı 26 Ekstrakapsüler yayılım (EKY) olguların % 26,3’ünde, Perinöral-Perivasküler İnvazyon (PN-PV İ.) %31,6’sında, cerrahi sınır pozitifliği ise % 15,8’inde görüldü (Tablo 8). Tablo 8: EKY, PN-PV İ. ve cerrahi sınır pozitifliği dağılımı (n=19) n % EKY 5 26,3 PN-PV İ 6 31,6 Cerrahi Sınır pozitifliği 3 15,8 Hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg düzeyleri değerlendirildiğinde çalışma grubu olguları Treg düzeyleri kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek saptandı (p<0,01). Çalışma grubunda operasyon öncesine göre operasyon sonrasında Treg düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş saptandı (p<0,05). CD3 düzeyleri operasyon öncesinde çalışma grubu olgularında kontrol grubuna göre daha yüksek olarak görülmesine rağmen istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). Operasyon sonrası CD3 ölçümlerinde çalışma ve kontrol grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Çalışma grubunda operasyon öncesi ve operasyon sonrası CD3 düzeylerindeki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). Operasyon öncesi ve operasyon sonrası CD4 ve CD8 ölçümlerinde çalışma ve kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Çalışma grubunda operasyon öncesi ve operasyon sonrası CD4 ve CD8 düzeylerindeki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). Operasyon öncesi ve operasyon sonrası CD19 ve NK ölçümlerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmemekle (p>0,05) birlikte çalışma 27 grubunda operasyon öncesine göre operasyon sonrasında CD19 ve NK düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı yükseliş saptandı (p<0,05) ( Tablo 9). Tablo 9: Çalışma ve kontrol grubunun CD ölçümlerine göre değerlendirmeleri Çalışma Grubu(Ort±SD) CD45 Operasyon öncesi 95,57±4,78 Operasyon 96,00±5,19 sonrası †p CD 3 0,653 Operasyon öncesi 76,63±7,63 Operasyon 73,63±5,66 sonrası †p CD4 0,104 Operasyon öncesi 44,89±8,21 Operasyon 44,31±6,67 sonrası †p CD 8 0,743 Operasyon öncesi 28,52±6,56 Operasyon 26,21±6,09 sonrası †p CD19 0,171 Operasyon öncesi 8,52±4,67 Operasyon 10,68±4,09 sonrası †p NK 0,026* Operasyon öncesi 10,31±4,16 Operasyon 12,57±5,43 sonrası †p Treg 90,66±5,05 p 0,007** 0,005** 71,40±7,28 0,052 0,322 40,80±7,11 0,136 0,148 29,93±4,33 0,480 0,054 8,33±2,43 0,878 0,059 11,13±2,66 0,514 0,319 0,019* Operasyon öncesi 18,78±4,97 Operasyon 16,57±4,75 sonrası †p : student t test Kontrol Grubu(Ort±SD) 0,025* *p<0,05 **p<0,01 8,26±2,31 0,001** 0,001** † : Paired samples t test 28 TREG ort+SD 25 20 15 10 5 0 Çalışma Grubu Operasyon öncesi TREG Çalışma Grubu Operasyon sonrası TREG Kontrol Grubu TREG Şekil 5: TREG düzeylerinin çalışma ve kontrol grubuna göre dağılımı ort+SD 120 100 80 60 40 20 CD 45 CD 3 CD4 CD 8 Kontrol grubu Operasyon sonrası Operasyon öncesi Kontrol grubu Operasyon sonrası Operasyon öncesi Kontrol grubu Operasyon sonrası Operasyon öncesi Kontrol grubu Operasyon sonrası Operasyon öncesi Kontrol grubu Operasyon sonrası Operasyon öncesi 0 CD 19 Şekil 6: Çalışma grubu olgularda CD düzeylerinin dağılımı 29 NK ort+SD 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Çalışma Grubu Operasyon öncesi NK Çalışma Grubu Operasyon sonrası NK Kontrol grubu Şekil 7: NK düzeylerinin çalışma ve kontrol grubuna göre dağılımı T evresi taban alınarak çalışma grubu erken T evre (T1-T2) ve ileri T evre (T3T4) olarak ayrıldığında operasyon öncesinde Treg ölçümleri ileri T evrede erken evreye göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olarak bulundu (p<0,05). Operasyon sonrası Treg ölçümleri arasında ise istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Erken T evre de operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki Treg düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı düşüş saptanırken (p<0,01); ileri evrede operasyon öncesi ve sonrasında Treg düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı değişim görülmedi (p>0,05). Erken ve geç T evreleri arasında operasyon öncesi ve sonrasında gruplar arasında CD3, CD4, CD8 düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05)(Tablo 10). Operasyon öncesinde CD19 ve NK ölçümlerinde T evrelemesine göre gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmazken(p>0,05); operasyon sonrası 30 CD19 ve NK düzeylerinde erken T evrede istatistiksel olarak anlamlı yükseklik saptandı (p<0,05). Yine aynı şekilde erken T evre de operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki CD19 ve NK düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı yükselme saptandı (p<0,05); ileri T evrede operasyon öncesine göre operasyon sonrasında CD19 ve NK düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim saptanmadı (p>0,05) ( Tablo 10). Tablo 10: Çalışma grubu olgularında CD düzeylerinin T evresine göre değerlendirilmesi Erken T Evre Ort±SD (medyan) CD 45 CD 3 CD4 CD 8 CD 19 NK TREG İleri T Evre Ort±SD (medyan) Operasyon öncesi 96,16±3,40 (97,5) 94,57±6,75 (97) 0,864 Operasyon sonrası 98,25±2,30 (99) 92,14±6,61 (90) 0,048* †p 0,052 0,128 Operasyon öncesi 76,08±7,13 (75) 77,57±8,96 (79) 0,767 Operasyon sonrası 73,08±6,09 (72) 74,57±5,15 (74) 0,420 †p 0,219 0,339 Operasyon öncesi 44,25±8,02 (47,5) 46,00±9,05 (50) 0,553 Operasyon sonrası 44,41±6,85 (42,5) 44,14±6,89 (41) 0,966 †p 0,937 0,591 Operasyon öncesi 28,58±6,61 (27,5) 28,42±7,02 (28) 0,932 Operasyon sonrası 25,33±5,17 (25) 27,71±7,63 (25) 0,831 †p 0,098 0,834 Operasyon öncesi 9,33±4,16 (10) 7,14±5,49 (6) 0,202 Operasyon sonrası 12,08±3,75 (13) 8,28±3,72 (7) 0,050* †p 0,027* 0,501 Operasyon öncesi 11,41±4,18 (11,5) 8,42±3,64 (7) 0,136 Operasyon sonrası 15,08±4,85 (15) 8,28±3,40 (7) 0,003** †p 0,009** 0,853 Operasyon öncesi 17,50±5,26 (16) 21,00±3,78 (21) 0,034* Operasyon sonrası 15,16±4,08 (13,5) 19,00±5,13 (19) 0,089 †p 0,009** 0,403 : Mann Whitney U test *p<0,05 **p<0,01 † : Wilcoxon Signed Rank test 31 T Evrelemesi Ort+SD 120 100 80 60 40 20 0 Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. CD 45 CD 3 CD4 CD 8 Erken Evre CD 19 NK TREG Geç Evre Şekil 8: Çalışma grubu olgularda T evrelemesine göre dağılımlar N evresine göre hastalar kıyaslandığında hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg ölçümleri N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek bulundu (p<0,01). N0 olgularda operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki Treg düzeylerindeki düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,01); N+ olgularda istatistiksel olarak anlamlı bir değişim saptanmadı (p>0,05) (Tablo 11). Operasyon öncesi ve operasyon sonrası N0 ve N+ hastalar arasında CD4, CD8, CD19 ve NK düzeyleri istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmedi (p>0,05). N0 hastalarda operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki CD19 ve NK düzeylerindeki yükselme istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,05), diğer 32 parametrelerde operasyon öncesi ile sonrası arasında anlamlı bir değişiklik saptanmadı (Tablo 11). Tablo 11: Çalışma grubu olgularında N evresine göre değerlendirmeler N Evresi CD 45 CD 3 CD4 CD 8 CD 19 NK TREG N0 N+ Ort±SD Ort±SD p Operasyon öncesi 94,69±5,20 (97) 97,50±3,33 (99) 0,130 Operasyon sonrası 95,07±5,99 (97) 98,00±2,00 (99) 0,422 †p 0,052 0,128 Operasyon öncesi 73,46±5,68 (73) 83,50±7,06 (87) 0,014* Operasyon sonrası 72,46±6,05 (72) 76,16±4,07 (74,5) 0,071 †p 0,219 0,339 Operasyon öncesi 42,76±8,86 (45) 49,50±4,13 (50) 0,094 Operasyon sonrası 42,84±6,14 (41) 47,50±7,20 (51) 0,234 †p 0,937 0,591 Operasyon öncesi 28,76±6,62 (27) 28,00±7,04 (29) 0,930 Operasyon sonrası 25,92±5,78 (25) 26,83±7,27 (23) 0,965 †p 0,098 0,834 Operasyon öncesi 8,38±4,21 (8) 8,83±5,98 (6,5) 1,000 Operasyon sonrası 11,07±4,68 (12) 9,83±2,56 (10) 0,377 †p 0,027* 0,501 Operasyon öncesi 11,30±4,44 (11) 8,16±2,63 (7) 0,122 Operasyon sonrası 14,00±5,59 (15) 9,50±3,83 (9,5) 0,065 †p 0,009** 0,853 Operasyon öncesi 16,92±4,13 (16) 22,83±4,40 (22) 0,009** Operasyon sonrası 14,07±2,46 (13) 22,00±3,89 (22) 0,001** †p 0,009** 0,403 : Mann Whitney U test † : Wilcoxon Signed Rank test *p<0,05 **p<0,01 Operasyon öncesinde CD3 düzeyleri N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olarak saptandı (p<0,05). Operasyon sonrasında ise CD3 ölçümlerinde N evreleri arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmedi 33 (p>0,05). N0 ve N+ olgularda operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki CD3 düzeylerindeki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05)(Tablo 11). N Evresi ort+SD 120 100 80 60 40 20 0 Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. CD 45 CD 3 CD4 CD 8 N0 CD 19 NK TREG N(+) Şekil 9: Çalışma grubu olgularda N evrelemesine göre dağılımlar TNM evrelemesine göre erken evre (evre I-II) ve geç evre (evre III-IV) olgular kıyaslandığında operasyon öncesinde Treg ölçümleri geç evrede istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek olarak bulundu (p<0,01). Aynı şekilde operasyon sonrası Treg ölçümleri de geç evrede istatistiksel olarak anlamlı yüksek olarak saptandı (p<0,01)(Tablo 12). Erken evre de operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki Treg düzeylerindeki düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,01); geç evrede operasyon öncesine göre operasyon sonrasında Treg düzeylerindeki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). 34 CD3, CD4, CD8, CD19 ve NK düzeylerinde operasyon öncesi ve operasyon sonrasında evrelere göre istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Aynı şekilde hem erken evre hem de geç evrede operasyon öncesine göre operasyon sonrasında CD3, CD4 ve CD8 düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir değişim saptanmadı (p>0,05). Operasyon öncesine göre operasyon sonrasında sadece erken evrede olmak üzere CD19 ve NK düzeylerindeki yükselme istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05) (Tablo 12). Operasyon öncesi Treg ölçümleri EKY & PN-P İnvazyon pozitifliği veya negatifliğine göre anlamlı farklılık gözlenmedi (p>0,05). EKY(+) ve ek olarak PN ve/veya PV İnvazyon pozitif olan olguların operasyon sonrası Treg ölçümleri anlamlı düzeyde düşük olarak saptandı (p<0,01) (Tablo 13). 35 Tablo 12: Çalışma grubu olgularında TNM evresine göre değerlendirmeler Evre CD 45 CD 3 CD4 CD 8 CD 19 NK TREG Erken Evre Geç Evre Ort±SD Ort±SD p Operasyon öncesi Operasyon sonrası 96,33±3,42 (98) 98,55±2,18 (99) 94,90±5,85 (96) 93,70±6,11 (96) †p 0,502 0,128 Operasyon öncesi 73,44±4,77 (73) 79,50±8,78(80,5) 0,120 Operasyon sonrası 72,33±6,92 (71) 74,80±4,28(74,5) 0,093 †p 0,219 0,339 Operasyon öncesi 42,11±8,14 (45) 47,40±7,82 (50) 0,120 Operasyon sonrası 42,00±6,16 (41) 46,40±6,71 (49) 0,204 †p 0,937 0,591 Operasyon öncesi 28,66±7,38 (27) 28,40±6,14 (28) 0,838 Operasyon sonrası 26,22±5,67 (25) 26,20±6,76(23,5) 0,593 †p 0,098 0,834 Operasyon öncesi 9,77±4,20 (11) 7,40±4,99 (6) 0,189 Operasyon sonrası 12,55±4,21 (15) 9,00±3,33 (10) 0,040* †p 0,027* 0,501 Operasyon öncesi 12,00±4,47 (13) 8,80±3,39 (8) 0,109 Operasyon sonrası 15,88±5,32 (16) 9,60±3,62 (9,5) 0,005** †p 0,009** 0,853 Operasyon öncesi 15,11±1,96 (15) 22,10±4,50 (21) 0,001** Operasyon sonrası 13,44±2,12 (13) 19,40±4,74(19,5) 0,005** †p 0,009** 0,403 Fark 1,66±2,29 (2) 2,70±5,07 (3) : Mann Whitney U test † : Wilcoxon Signed Rank test *p<0,05 0,803 0,081 0,447 **p<0,01 36 Evrelere Göre Dağılımlar ort+SD 120 100 80 60 40 20 0 Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. Op.Ö. Op.S. CD 45 CD 3 CD4 CD 8 Erken Evre CD 19 NK TREG Geç Evre Şekil 10: Çalışma grubu olgularda evrelere göre dağılımlar Tablo 13: Treg düzeyleri ile EKY & PN-PV İnvazyon ilişkisi Treg EKY (+) & PN-PV İ(+) (Ort±SD) EKY (-) & PN-PV İ(-) (Ort±SD) p Operasyon öncesi 17,53±4,40 (17) 21,50±5,43 (20) 0,103 Operasyon sonrası 14,30±2,95 (13) 21,50±4,23 (21,50) 0,003** Fark 3,23±2,97 (2) 0,00±5,09 (-0,50) 0,238 : Mann Whitney U test **p<0,01 37 Şekil 11:Çalışma grubundaki olgunun flow sitometri örneği(Treg-mab-FoxP3) 38 Şekil 12: Çalışma grubundaki olgunun flow sitometri örneği (Treg-ISOFoxP3) 39 Şekil 13: Kontrol grubuna ait flow sitometri örneği(Treg-ISO-FoxP3) 40 Şekil 14: Kontrol grubuna ait flow sitometri örneği(Treg-mab-FoxP3) 41 TARTIŞMA Endojen regülatör hücreleri (Treg), kanserli hastalarda antitümör immün yanıtları azaltmada büyük ölçüde sorumludur (10). İnsan ve hayvan kanser modellerinde yapılan çalışmalar, bu hücrelerin tümör progresyonunu arttırdığını doğrulamıştır (43,44). Strauss ve arkadaşları yapmış oldukları çalışmalarda, süpresör fonksiyonu olan CD25high Treg popülayonlarının, baş boyun kanserli hastaların dolaşımında yayıldığını ve Treg’lerin tümör bölgesinde toplanma eğiliminde olduğunu, ayrıca, bu hastaların periferik kanında dolaşan artmış Treg sayısının varlığının pozitif olarak metastazla ilişkili olduğunu göstermişlerdir (62). Günümüzde, insan Treg hücrelerinin fonksiyonel, hastalıkla ilişkili T-hücre alt tipleri içinde izolasyonu ve gelişmesi periferik komponentte kolayca elde edilebilen Treg hücrelerinin yetersizliği, iyi tanımlanmış özgün işaretçilerin az oluşu ve CD4+CD25interm./low non-Treg hücrelerin varlığı dışında, süpresör aktivitesi olan saf CD4+CD25high Treg hücrelerinin hızla büyümesine ilişkin protokollerin yokluğu gibi nedenlerle zordur (10). Baş boyun yassı epitel hücreli kanser hastalarında Treg hücreleri hücre yüzeyinde yüksek CD25 düzeylerine ek olarak, Foxp3high, ayrıca CTLA-4high ve CD45 R0+ ve CD62L+, örn., hafıza T-hücre fenotipini eksprese eder, şeklinde tanımlanmıştır (63,64). CTLA–4 veya GITR benzeri hücre işaretleyicileri nTreg hücreleri efektör T-hücre popülasyonundan ayırt etmede kullanılamazlar. Çünkü Treg hücrelerde eksprese edildiği gösterilen CTLA–4 ve GITR benzeri bazı işaretleyiciler aynı zamanda potansiyel efektör hücrelerde de eksprese edilmektedir. Bu durum immünofenotipik ve fonksiyonel tanımlama için sorun teşkil etmektedir (65,66). Akıllarda tüm Treg hücrelerin FoxP3 pozitif olup olmadığı veya tüm FoxP3+ T hücrelerin regülatör olup olmadığı soruları bulunsa da güncel bilgilerle FoxP3 Treg 42 hücreleri için en özgün ve en iyi işaretleyici olarak kabul edilmektedir (67). Baş boyun yassı epitel hücreli kanser hastalarının CD4+CD25high T hücrelerinde Foxp3 ekspresyonunun arttığını ve bu Foxp3high T hücrelerinin, önemli oranda bir süpresör fonksiyonu gösterdiğini ortaya konmuştur (62). Groth ve Bluestone adlı araştırıcıların eş zamanlı olarak yeni yakın yapmış oldukları çalışmada CD127’nin Treg üzerine aşağı düzenleyici olduğunu gösterdiler. Bu çalışmada aktive T hücrelerinin -ki bu hücreler hızlıca CD127 re-eksprese eder- ve hafıza T hücrelerinin -yüksek düzey CD127 eksprese eder- tersine Treg hücreleri CD127lo/- olduğu ve CD127’nin in-vitro çalışmalar ve in-vivo tedavi potansiyeli için Treg hücrelerin selektif zenginleştirilmesinde kullanılabileceği gösterilmiştir (14). Şu ana kadarki yapılan araştırmalarda Treg hücreleri çoğunlukla klasik yüzey işaretleyicileri kullanılarak çalışılmıştır. Bu çalışmada ise yeni sayılan bir işaretleyici olan CD127 kullanılarak Treg hücreleri tanımlandı ve diğer T hücre alt kümelerinden ayrıştırıldı. Bizim çalışmamızda larenks kanserli olgularda hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg düzeyleri değerlendirildiğinde; Treg düzeyleri kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek saptandı (p<0,01) Çalışma grubunda operasyon öncesine göre operasyon sonrasında Treg düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş saptandı (p<0,05). Sasada ve arkadaşları ile Ichihara ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmalarda gastrointestinal malignitelerinde Treg hücrelerinde göreceli bir artış saptanmış ve bu artış, kötü prognoz ve düşük sürvi ile sıkı ilişkili bulunmuştur (68,69). Küratif rezeksiyondan sonra Treg hücre frekansı anlamlı düzeyde düştüğü tam tersi tedavi sonrası tümör nükslerinde ise Treg frekansının yükselme gösterdiği saptanmıştır (70). Schaefer ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada baş boyun yassı hücreli kanserli hastalarda FoxP3+GITR+Treg hücreleri anlamlı derecede yüksek 43 bulunmuştur (7). Wolf ve arkadaşları epitelyal malignitelerde periferik kan CD4+CD25+ T hücrelerin ve Treg hücrelerin artışını göstermişlerdir. Buna benzer sonuçlar değişik çalışmalarda rapor edilmiştir (7,71). Curiel ve arkadaşları yapmış oldukları çalışmada kanserde Treg hücrelerinin periferik kanda miktarının arttığını ve bunun sonucu hastanın ortalama sağ kalım beklentisinde anlamlı bir düşüş meydana geldiğini saptamışlardır (11). CD4+ regülatör T hücre frekansının tümör progresyonu esnasında arttığını gösteren araştırmalar mevcuttur (11,72). Yapmış olduğumuz çalışmada Treg düzeyleri yalnızca T, yalnızca N ve TNM evrelerine göre ve ekstrakapsüler yayılım, perinöral-perivasküler invazyon olup olmamasına göre değerlendirildi. Operasyon öncesinde Treg ölçümleri ileri T evrede erken evreye göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olarak bulundu (p<0,05). Operasyon sonrası Treg ölçümleri arasında ise istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Larenks kanserlerinde histopatolojik olarak doğrulanmış bölgesel lenf bezi metastazının varlığı en önemli prognostik bulgulardan biridir (50). Nodal durum göz önüne alındığında çalışmamızda hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg ölçümleri N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek bulundu (p<0,01). TNM evreleme dikkate alındığında operasyon öncesinde Treg ölçümleri geç evrede istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek olarak bulundu (p<0,01); aynı şekilde operasyon sonrası Treg ölçümleri de geç evrede istatistiksel olarak anlamlı yüksek olarak saptandı (p<0,01). Tüm bu değerler bize Treg düzeylerinin hastalarda kontrol grubuna göre yüksek saptanmanın yanında hastalığın evresi ile birebir korale olduğunu göstermektedir. 44 Hastalarımızda operasyon öncesi Treg ölçümleri EKY & PN-PV İnvazyon pozitifliği veya negatifliğine göre anlamlı farklılık görülmedi (p>0,05). N0 olgularda operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki Treg düzeylerindeki düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,01) N+ olgularda istatistiksel olarak anlamlı bir değişim saptanmadı (p>0,05). Strauss L ve arkadaşları kemoterapi ve radyoterapi almayıp sadece cerrahi tedavi alan baş boyun kanserli hastaların periferik kan Treg hücrelerinin frekansının hala yüksek kalabildiğini gözlemlemişler ve bu durumu inflamatuar sitokinlerin ve diğer immün süpresörlerin tümör kalıntılarından salınmaya devam ettiği şeklinde yorumlamışlardır. Bizim çalışmamızda operasyon sonrası kanlar erken dönemde-birinci ay- alınmış olduğu için nüks diyebilmemiz mümkün gözükmemektedir (60). Erken evre de operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki Treg düzeylerindeki düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,01); geç evrede operasyon öncesine göre operasyon sonrasında Treg düzeylerindeki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). Aynı şekilde N0 olgularda operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki Treg düzeylerindeki düşüş istatistiksel olarak anlamlı bulunurken (p<0,01); N+ olgularda istatistiksel olarak anlamlı bir değişim saptanmadı (p>0,05). Bu durum bize tümör yükünün fazla olması durumunda Treg düzeylerinin periferik kandan temizlenmelerinin daha uzun bir süre alacağını gösterebilir. Fakat bu durumun nedeni tam olarak açıklanabilmiş değildir. Kuss ve arkadaşları yaptıkları çalışmada tümörün herhangi bir lenfoablativ tedavi olmamasına rağmen cerrahiden çok zaman sonra bile lenfosit hemostazı üzerine etkili olabileceğini göstermişlerdir (59). Çalışmamızda CD3 düzeyleri operasyon öncesinde çalışma grubu olgularında kontrol grubuna göre daha yüksek olarak görülmesine rağmen istatistiksel olarak 45 anlamlı bulunmadı (p>0,05). CD3 düzeyleri nodal durum hariç diğer parametrelere göre de istatistiksel anlamlı bir farklılık göstermemektedir. Operasyon öncesinde CD3 düzeyleri N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olarak saptandı (p<0,05). Operasyon sonrasında ise CD3 ölçümlerinde N evreleri arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmedi (p>0,05). N0 ve N+ olgularda operasyon öncesine göre operasyon sonrasındaki CD3 düzeylerindeki değişim istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). Yapılan çalışmalar çeşitli malignitelerde görülen immün defisitin T hücre reseptörü veya CD3 ilişkili sinyal çevirici moleküllerinin değişken ekspresyonu ve fonksiyonu ile ilişkili olduğunu göstermişlerdir (53,73,74). Reichert ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada TİL hücrelerinde CD3ζ eksikliğinin nodal metastaz ve azalmış yaşam beklentisi ile ilintili olduğu ve hastalıksız geçen süredeki kısalmayı öngörmede en büyük faktörün CD3 cevabının ölçülmesi olduğu saptanmıştır (75). Kuss ve arkadaşları baş-boyun yassı hücreli kanser hastalarında kontrol grubuna göre CD3+, CD4+ ve CD8+ T hücrelerin miktarında anlamlı bir azalma gözlemlemişlerdir (76). Gonzalez ve arkadaşları daha önce tedavi almamış 29 larinks karsinomlu erkek hasta ve 24 sağlıklı erkek kontrol grubunun periferik kan Tlenfositlerini fonksiyonel cevabını ve fenotipik karakterizasyonu ve bunların klinik evre ile ilişkisini incelemişler. Kontrol grubuna göre hastalarda periferik kan CD2, CD3 düzeylerinde anlamlı düşüş saptamışlar (77). Bizim çalışmamızda CD3+, CD4+ ve CD8+ düzeylerinde çalışma ve kontrol grupları arasında olsun, çalışma grubu içerisinde evrelere göre olsun istatistiksel anlamlı bir farklılık bulunmadı ( p>0,05) . 46 Chikamatsu ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada kontrol grubuna göre hastalarda toplam CD4+ T yüzdesi anlamlı olarak düşük bulunmuştur. IL–4+CD8+ (Tc2) hücre oranı ile nodal durum arasında anlamlı ilişki saptanmış; nod+ olan hastalarda nod- olanlara kıyasla Tc2 oranı daha yüksek bulunmuştur (78). Çalışmamızda operasyon öncesi ve operasyon sonrası CD19 ve NK ölçümlerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmemekle (p>0,05) birlikte çalışma grubunda operasyon öncesine göre operasyon sonrasında CD19 ve NK düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı yükseliş saptandı (p<0,05). NK hücreleri tümör hücrelerinin büyümesine karşı hem primer bölgede hem de metastatik bölgede konak savunmasında önemli rol üstlenmektedir (79). Mickel ve arkadaşları 22 baş-boyun yassı hücreli kanser hastasında periferik kan ve lenf nodu NK hücresi aktivitesini değerlendirmişler ve kanserli hastalarda periferik kan lenfosit NK aktivitesini kontrol grubuna göre anlamlı şekilde düşük saptamışlardır (61). Kou ve arkadaşları larinks kanserli hastalarda NK aktivitesini normal gruba ve kord vokal polipli gruba kıyasla anlamlı bir şekilde düşük saptamışlardır (80). Gödekmerdan ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada erken evre, ileri evre ve matastatik hastalarda NK düzeyleri arasında fark gözlenmemiştir. Aynı çalışmada B lenfosit (CD19) düzeyi kanserli hastalarda kontrol grubuna kıyasla daha yüksek bulunmuştur. B lenfosit düzeyi erken evre hastalarda ileri evre ve metastatik hastalara kıyasla istatistiksel anlamlı olmasa da daha yüksek çıkmıştır (81). Bizim çalışmamızda erken evre ve geç evre olgular kıyaslandığında CD19 ve NK düzeylerinde operasyon öncesi ve operasyon sonrasında evrelere göre istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05). Ancak erken evre olgularda operasyon 47 öncesine göre operasyon sonrasında CD19 ve NK düzeylerindeki yükselme istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05). Kuss ve arkadaşları yapmış oldukları bir başka çalışmada hastalık evresi ile lenfosit miktarı arasında istatistiksel anlamlı bir ilişki bulmamışlar fakat özellikle aktif hastalığı olan hastalarda kontrol grubuna göre CD8+ T lenfosit mutlak miktarında anlamlı düşüş saptamışlar (59). SONUÇ Bu çalışmada larenks kanserli olgularda hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg düzeyleri çalışma grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek saptandı. Operasyon öncesine göre operasyon sonrasında Treg düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş saptandı. Hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg ölçümleri N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek bulundu. TNM evrelemesine göre kıyaslandığında operasyon öncesinde ve operasyon sonrasında Treg ölçümleri geç evrede istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek olarak bulundu. Çalışma grubunda operasyon öncesine göre operasyon sonrasında CD19 ve NK düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı yükseliş saptandı. Özellikle NK hücreleri Treg hücrelerin azalmasına karşın bir artış göstermektedir ki bu tümör yükünün azalmasını ve antitümör immünitedeki artışı göstermektedir. Bu sonuçlar, bize Treg düzeylerinin hastalarda kontrol grubuna göre yüksek olmasının yanında hastalığın evresi ile birebir ilişkili olduğunu, dolayısıyla immün sistem ile kanser arasında sıkı bir ilişkinin varlığını göstermektedir. 48 Sonuçta, tümörün immün sistem üzerindeki yapmış olduğu bu değişiklikler hastalığın tanı, takip ve tedavisinde yardımcı olabilir. Larenks kanseri protokollerinde bu immünolojik değişkenlerin dikkate alınması tanı, prognoz ve tedavide yeni açılımların gündeme gelmesini sağlayabilir. 49 ÖZET GİRİŞ VE AMAÇ: Bu çalışmada Treg hücrelerinin ayrıştırılmasında klasik işaretleyicilere ek olarak yeni bir işaretleyici olan CD127 kullanılarak, larinks yassı epitel hücreli kanserinin Treg (CD4+CD25+Foxp3highCD127dim) ve immün sistem diğer alt grup hücreleri üzerine etkisinin araştırılması amaçlandı. GEREÇ VE YÖNTEM: Çalışma Bakırköy Dr. Sadi Konuk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz Kliniği’nde Ocak 2008 - Ekim 2008 tarihleri arasında larenks yassı epitel hücreli kanser tanısı almış ve daha önce tedavi almamış 19 olgu üzerinde yürütüldü. Hasta kanları antekubital venden operasyondan önce ve bir ay sonra olmak üzere iki kez alındı. Elde edilen kan örneklerinde CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK ve Treg lenfosit alt kümeleri flow sitometri kullanılarak değerlendirildi. BULGULAR: Larenks kanserli olgularda hem operasyon öncesi hem de operasyon sonrası Treg düzeyleri çalışma grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek saptandı. Operasyon öncesine göre operasyon sonrasında Treg düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş saptandı. Treg ölçümleri operasyon öncesinde ileri T evresinde erken T evresine göre, hem operasyon öncesi hem de sonrası N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak ileri düzeyde anlamlı yüksek bulundu. TNM evrelemesine göre kıyaslandığında Treg ölçümleri geç evrede anlamlı düzeyde yüksek olarak bulundu. CD3 düzeyleri operasyon öncesinde N+ olgularda N0 olgulara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olarak saptanması dışında diğer parametrelere göre de istatistiksel anlamlı bir farklılık görülmedi. CD4+ ve CD8+ düzeylerinde çalışma ve kontrol grupları arasında olsun, çalışma grubu içerisinde evrelere göre olsun istatistiksel anlamlı bir farklılık bulunmadı. Çalışma grubunda operasyon öncesine göre operasyon sonrasında CD19 ve NK düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir yükseliş saptandı. TARTIŞMA VE SONUÇ: Treg düzeyleri hastalarda kontrol grubuna göre yüksek olmasının yanında hastalığın evresi ile de birebir ilişkilidir. NK hücreleri Treg hücrelerin azalmasına karşın bir artış göstermektedir ki bu tümör yükünün azalmasını ve antitümör immünitedeki artışı göstermektedir. Bu sonuçlar, bize immün sistem ile kanser arasında sıkı bir ilişkinin varlığını göstermektedir. Sonuçta, tümörün immün sistem üzerindeki yapmış olduğu bu değişiklikler hastalığın tanı, takip ve tedavisinde yardımcı olabilir. Larenks kanseri protokollerinde bu immünolojik değişkenlerin dikkate alınması tanı, prognoz ve tedavide yeni açılımların gündeme gelmesini sağlayabilir. Anahtar kelimeler: Larenks yassı epitel hücreli kanseri, T regülatör hücre, CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, NK, flow sitometri. 50 KAYNAKLAR 1. Parkin DM, Bray F, Ferlay J et al. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 2001; 94: 153–156, 2. Rosai J. Respiratory tract. In: Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. Volume 1. 9 th ed. Elsevier, China, 2004: 335–359. 3. T.C. Sağlık Bakanlığı: Kanser istatistikleri. 1999, erişim tarihi: 25.11.2008 http://www.saglik.gov.tr/extras/istatistikler/apk2001/094.htm 4. Chikamatsu K, Albers A, Stanson J, et al. P53(110–124)-specific human CD4+ Thelper cells enhance in vitro generation and antitumor function of tumorreactive CD8+ Tcells. Cancer Res. 2003; 63: 3675–81. 5. Benchetrit F, GazagneA, Adotevi O, et al. CytotoxicT lymphocytes: role in immunosurveillance and in immunotherapy. Bull Cancer 2003; 90: 677–85. 6. Ho WY, Yee C, Greenberg PD. Adoptive therapy with CD8(+) Tcells: it may get by with a little help from its friends. JClin Invest 2002;110:1415–7. 7. Schaefer C, Kim GG, Albers A, Hoermann K, Myers EN, Whiteside TL. Characteristics of CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral circulation of patients with head and neck cancer. Br J Cancer. 2005 Mar 14;92(5):913–20. 8. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL–2 receptor alpha-chains (CD25): breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 1995; 155:1151–1164. 9. Curiel TJ, Coukos G, Zou L, et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med 2004; 10: 942 – 9. 10. Strauss L, Bergmann C and Whiteside TL. Functional and phenotypic characteristics of CD4+CD25highFoxp3+ Treg clones obtained from peripheral blood of patients with cancer. Int. J. Cancer: 2007; 121: 2473–2483. 11. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological self tolerance to self and non-self. Nat. Immunol. 2005;6(4):345–352. 12. Fontenot JD, Rasmussen JP, Williams LM, Dooley JL, Farr AG, Rudensky AY. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor Foxp3. Immunity. 2005;22: 329–341. 13. GodfreyWR, Spoden DJ, GeYG, et al. Cord blood CD4(+)CD25(+)-derived T regulatory cell lines Express FoxP3 protein and manifest potent suppressor function. Blood 2005;105: 750–8. 51 14. Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, Szot GL, Lee MR, Zhu S CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 2006 Jul 10;203(7):1701–11. 15. Paul FC, Spector G, Kaiser NT. Larenks ve Larengofarenksin Tümörleri. In: Ballenger JJ, Snow BJ. Otorinolaringoloji Baş ve Boyun Cerrahisi. (Şenocak D. Türkçe Çevri editörü). 15. baskı, Nobel Tıp Kitabevi İstanbul 2000; 32: 585–652. 16. Ballenger JJ, Snow JB, Otolaringoloji Bas ve Boyun Cerrahisi çev. Şenocak D, 15. Baskı İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri 2006; 422–437. 17. Frederick L. Greene, AJCC Cancer Staging Atlas 6th ed.Chicago: Springer, 2006. 18. KİDEM (İzmir Kanser Denetim ve İzlem Merkezi) http://www.ism.gov.tr/kidem/Tdoc3.htm##d erişim tarihi: 25.11.2008 19. Gallus S, Bosetti C, Franceschi S et al. Laryngeal cancer in women: tobacco, alcohol, nutritional and hormonal factors. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2003 June; 12(6)514–7. 20. Schlecht NF, Franco EL, Pintos J, Negassa A, Kowalski LP, Oliveira BV, Curado MP. Interaction between tobacco and alcohol consumption and the risk of cancers of the upper aero-digestive tract in Brazil. Am J Epidemiol. 1999 Dec 1;150(11):1129–37. 21. Engin K, Erişen L: Baş-Boyun Kanserleri. İç: Çoşkun H. Larenks Kanserleri. Nobel Tıp Kitapevleri: İstanbul 2003; 345–384 22. Janfaza P, Montgomery WW, Randolf EW: Baş ve Boyunun Cerrahi Anatomisi. Cansız H, Yüksel S,(ed.) İstanbul. 2002, 629–674. 23. Baserer N. Larenks malign neoplazmlarında tedavi. İç: Çelik O, ed. Kulak Burun Boğaz Hastalıkları ve Bas-Boyun Cerrahisi. Turgut Yay. İstanbul 2002; 667–683. 24. Teppo H, Koivunen P, Hyrynkangas K, Alho OP. Diagnostic delays in laryngeal carcinoma: Professional diagnostic delay is a strong independent predictor of survival. Head Neck 2003; 25: 389–94. 25. Johansen LV, Grau C, Overgaard J. Laryngeal carcinoma-multivariate analysis of prognostic factors in 1252consecutive patients treated with primary radiotherapy. Acta Oncol. 2003;42(7):771–8. 26. Kowalski LP, Franco EL, prognostic factors in laryngeal cancer patient sumitted to surgical treatment. J surg onco. 48: 87, 1991. 27. Liu M, Lawson G, Delos M, Jamart J, Chatelain B, Remacle M, Marbaix E. Prognostic value of cell proliferation markers, tumour suppressor proteins and cell adhesion molecules in primary squamous cell carcinoma of the larynx and hypopharynx. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2003 Jan;260(1):28–34. Epub 2002 Jul 24. 52 28. Almadori G, Bussu F, Cadoni G, Galli J, Paludetti G, Maurizi M. Molecular markers in laryngeal squamous cell carcinoma: towards an integrated clinicobiological approach. Review. Eur J Cancer. 2005 Mar;41(5):683–93. 29. Van Der BP, Zhang Y, Chaux P, Stroobant V, Panichelli C, Schultz ES, Chapiro J, Van Den Eynde BJ, Brasseur F and Boon T. Tumor-specific shared antigenic peptides recognized by human T cells. Immunol Rev 2002; 188: 51–64. 30. Smith KJ, Pyrdol J, Gauthier L, Wiley DC and Wucherpfennig KW. Crystal structure of HLA-DR2 (DRA*0101, DRB1*1501) complexed with a peptide from human myelin basic protein. J Exp Med 1998; 188: 1511–1520. 31. Castelli C, Rivoltini L, Rini F, Belli F, Testori A, Maio M, Mazzaferro V,Coppa J, Srivastava PK and Parmiani G. Heat shock proteins: biological functions and clinical application as personalized vaccines for human cancer. Cancer Immunol Immunother 2004; 53: 227–233. 32. Rock KL, York IA, Saric T and Goldberg AL. Protein degradation and the generation of MHC class I-presented peptides. Adv Immunol 2002; 80: 1–70. 33. Ting JP and Trowsdale J. Genetic control of MHC class II expression. Cell ; 109 Suppl: S21-S33. 34. Allison TJ and Garboczi DN. Structure of gammadelta T cell receptors and their recognition of non-peptide antigens. Mol Immunol 2002; 38: 1051–1061. 35. Lanzavecchia A and Sallusto F. Regulation of T cell immunity by dendritic cells. Cell 2001; 106: 263–266. 36. Basse PH, Whiteside TL, Chambers W and Herberman RB. Therapeutic activity of NK cells against tumors. Int Rev Immunol 2001; 20: 439–501. 37. von Boehmer H, Aifantis I, Gounari F, Azogui O, Haughn L, Apostolou I, Jaeckel E, Grassi F and Klein L. Thymic selection revisited: how essential is it? Immunol Rev 2003; 191: 62–78. 38. Ahmed R and Gray D. Immunological memory and protective immunity: understanding their relation. Science 1996; 272: 54–60. 39.Constant SL and Bottomly K. Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Annu Rev Immunol 1997; 15: 297–322. 40. Jonuleit H, Schmitt E, Stassen M, Tuettenberg A, Knop J, Enk AH. Identification and functional characterization of human CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood. JExpMed. 2001; 193:1285–94. 53 41. Dieckmann D, Plottner H, Berchtold S, Berger T, Schuler G. Ex vivo isolation and characterization of CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties from human blood. JExpMed. 2001; 193:1303–10. 42. CarrierY, YuanJ, KuchrooVK, Weiner HL.Th3 cells in peripheral tolerance: I. Induction of Foxp3-positive regulatory T cells by Th3 cells derived fromTGF-h Tcelltransgenic mice. J Immunol. 2007; 178:179–85. 43. Sakaguchi SN, Sakaguchi J, Shimizu S, Yamaguchi T, Sakaguchi S. Regulatory T cells in immune surveillance and treatment of cancer. Semin Cancer Biol 2006;16: 115– 23. 44. Shevach EM. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nat Rev Immunol 2002;2: 389–400. 45. Bisikirska B, Colgan J, Luban J, Bluestone JA, Herold KC. TCR stimulation with modified anti-CD3 mAb expands CD8+ T cell population and induces CD8+CD25+ Tregs. J. Clin. Invest. 2005;115:2904–2913. 46. Filaci G, Bacilieri S, Fravega M, Monetti M, Contini P, Ghio M, Setti M, Puppo F and Indiveri F. Impairment of CD8+ T suppressor cell function in patients with active systemic lupus erythematosus. J Immunol. 2001; 166: 6452- 6457, 47. Russell JH and Ley TJ. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol.2002; 20: 323–370 48. Lee JC, Lee KM, Kim DW and Heo DS. Elevated TGF-beta1 secretion and downmodulation of NKG2D underlies impaired NK cytotoxicity in cancer patients. J Immunol. 2004; 172: 7335–7340. 49. Huang M, Sharma S, Mao JT and Dubinett SM. Non-small cell lung cancerderived soluble mediators and prostaglandin E2 enhance peripheral blood lymphocyte IL–10 transcription and protein production. J Immunol. 1996; 157: 5512- 5520. 50. Menetrier-Caux C, Bain C, Favrot MC, Duc A and Blay JY. Renal cell carcinoma induces interleukin 10 and prostaglandin E2 production by monocytes. Br J Cancer 1999; 79: 119–130. 51. Neuner A, Schindel M, Wildenberg U, Muley T, Lahm H and Fischer JR. Prognostic significance of cytokine modulation in non-small cell lung cancer. Int J Cancer 2002; 101: 287–292. 52. Badur S, Deniz G, Polat GN. İmmünolojideki Gelişmeler-II. Nobel Tıp Kitapevleri: 2000; 139–153 53. Kersh EN, Shaw AS and Allen PM. Fidelity of T cell activation through multistep T cell receptor zeta phosphorylation. Science 1998; 281: 572–575. 54 54. Schule J, Bergkvist L, Hakansson L, Gustafsson B and Hakansson A. Downregulation of the CD3-zeta chain in sentinel node biopsies from breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2002; 74: 33–40. 55. Takahashi A, Kono K, memiya H, Iizuka H, Fujii H and Matsumoto Y. Elevated caspase–3 activity in peripheral blood T cells coexists with increased degree of T-cell apoptosis and down-regulation of TCR zeta molecules in patients with gastric cancer. Clin Cancer Res 2001; 7: 74–80 56. Li X, Liu J, Park JK, Hamilton TA, Rayman P, Klein E, Edinger M, Tubbs R, Bukowski R and Finke J. T cells from renal cell carcinoma patients exhibit an abnormal pattern of kappa B-specific DNA-binding activity: a preliminary report. Cancer Res 1994; 54: 5424–5429. 57. Radoja S, Saio M and Frey AB. CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes are primed for Fas-mediated activation-induced cell death but are not apoptotic in situ. J Immunol 2001; 166: 6074–6083. 58. Niehans GA, Brunner T, Frizelle SP, Liston JC, Salerno CT, Knapp DJ, Green DR and Kratzke RA. Human lung carcinomas express Fas ligand. Cancer 1997; Res 57: 1007–1012. 59. Kuss I, Hathaway B, Ferris RL, Gooding W, Whiteside TL. Decreased Absolute Counts of T Lymphocyte Subsets and Their Relation to Disease in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck. Clin Cancer Res. 2004 Jun 1;10(11):3755–62. 60. Strauss L, Bergmann C, Gooding W, Johnson JT, Whiteside TL. The frequency and suppressor function of CD4+CD25highFoxp3+ T cells in the circulation of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res.2007 Nov 1;13(21):6301–11. 61. Mickel RA, Kessler DJ, Taylor JM, Lichtenstein A. Natural killer cell cytotoxicity in the peripheral blood, cervical lymph nodes, and tumour of head and neck cancer patients. Cancer Res. 1988; 48(17):5017-22. 62. Strauss L, Bergmann C, Johnson JT, Whiteside TL. Functional CD4+CD25highFoxp3+ T cells in the circulation of head and neck patients (HNSCC) and correlation with advanced disease and treatment. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2006;132:883–4. 63. Sallusto F, Geginat J, Lanzavecchia A. 2004. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu Rev Immunol 2004;22:745–63. 64. Geginat J, Sallusto F, Lanzavecchia A. Cytokine-driven proliferation and differentiation of human naive, central memory and effector memory CD41 T cells. Pathol Biol 2003;51:64–6. 55 65. Tang, Q., E.K. Boden, K.J. Henriksen, H. Bour-Jordan, M. Bi, and J.A.Bluestone. Distinct roles of CTLA-4 and TGF-β in CD4+CD25+regulatory T cell function. Eur. J. Immunol. 2004; 34:2996–3005. 66. Ronchetti, S., O. Zollo, S. Bruscoli, M. Agostini, R. Bianchini, G. Nocentini, E. Ayroldi, and C. Riccardi. GITR, a member of the TNF receptor superfamily, is costimulatory to mouse T lymphocyte subpopulations. Eur. J. Immunol. 2004; 34:613– 622. 67. Ziegler, S.F. FOXP3: Of Mice and Men. Annu. Rev. Immunol.2006; 24:209–226. 68. Sasada T, Kimura M, Yoshida Y, Kanai M, Takabayashi A. CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with gastrointestinal malignancies: possible involvement of regulatory T cells in disease progression. Cancer. 2003;98:1089-1099. 69. Ichihara F, Kono K, Takahashi A, Kawaida H, Sugai H, Fujii H. Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers. Clin Cancer Res. 2003;9: 4404-4408. 70. Kono K, Kawaida H, Takahashi A, et al. CD4(+) CD25(high) regulatory T cells increase with tumor stage in patients with gastric and esophageal cancers. Cancer Immunol Immunother. 2006;55: 1064–1071. 71. Wolf AM, Wolf D, Steurer M, Gastl G, Gunsilius E, Grubeck-Loebenstein B. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients. Clin Cancer Res. 2003;9(2):606- 12. 72. Yu P, Lee Y, LiuW, et al. Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors. J Exp Med 2005;201:77991. 73. Finke, J. H., Zea, A. H., Stanley, J., Longo, D. L., Mizoguchi, H., Tubbs, R. R., Wiltrout, R. H., O’Shea, J. J., Kudon, S., Klein, E., Bukowski, R. M., and Ochoa, A. C. Loss of T-cell receptor zeta chain and p56lck in T-cells infiltrating human renal cell carcinoma. Cancer Res. 1993; 53: 5613–5616,. 74. Zea, A. H., Curti, B. D., Longo, D. L., Alvord, W. G., Strobl, S. L., Mizoguchi, H., Creekmore, S. P., O’Shea, J. J., Power, G. C., Urba, W. J., et al. Alterations in T-cell receptor and signal transduction molecules in melanoma patients. Clin. Cancer Res. 1995; 1: 1327–1335. 75. Reichert, T. E., Rabinowich, H., Johnson, J. T., and Whiteside, T. L. Mechanisms responsible for signaling and functional defects. J. Immunother. 1998; 21: 295–306. 76. Kuss I, Hathaway B, Ferris RL, Gooding W, Whiteside TL Imbalance in absolute counts of T lymphocyte subsets in patients with head and neck cancer and its relation to disease. Adv Otorhinolaryngol. 2005;62: 161–72. 56 77. Gonzalez FM, Vargas JA, Gea-Banacloche JC, Garcia JR, Berrocal E, Gorriz C et al. Functional and phenotypic analysis of T-lymphocytes in laryngeal carcinoma. Acta Otolaryngol.1994;114(6):663-8. 78. Chikamatsu K, Sakakura K, Whiteside TL, Furuya N. Relationships Between Regulatory T Cells And Cd8+ Effector Populations In Patıents Wıth Squamous Cell Carcınoma Of The Head And Neck. Head Neck. 2007 Feb;29(2):120-7. 79. Greenberg PD. Mechanisms of Tumour Immunology. In: Parslow TG, Stites DP, Terr Al, Imboden JB,eds. Medical Immunology. 10th Lange/ McGraw-Hill Companies; 2001: 568-577. 80. Kou F, Qi S. Changes of NK cell's activity and T lymphocyte subpopulation in peripheral blood of patients with laryngocarcinoma. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 2001; 15(11):505-6. 81. Godekmerdan A, Kaygusuz I, Sakallıoglu O, İlhan F,Demir N. Evaluation Of The Cellular Immune Response In Patients With Head And Neck Cancer. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2007April; 1(2):50–54. 57
