Uzm. Dr. Klara Dalva

Uzm. Dr. Klara Dalva
17/04/2010
Lenfosit Alt Tipleri
T
B
NK
Modified from Wraith, D. Immunologic tolerance. In:
Immunology, 6th Ed, Roitt, I, Brostoff, J, Male, D (Eds), Mosby,
London 2001. p.193
İmmunfenotiplendirmenin amacı,
belli lenfosit serilerinin ve
bunların alt gruplarını oluşturan lenfositlerin tanımlanması,
sayısal değerlerinin tesbit edilmesidir
Analizler genellikle kanda yapılır, diğer vücüt sıvıları
da analiz edilebilir.
Dolaşımdaki Lenfositler vücüttaki lenfositlerin ~
%2sini oluşturur
Lenfoid Olmayan
Organlar ve kan
Primer Lenfoid Organlar
Sekonder Lenfoid
Organlar
K.S. Blum, R. Pabst / Immunology Letters 108 (2007) 45–51
K.S. Blum, R. Pabst / Immunology Letters 108 (2007) 45–51
T ve B hücre Migrasyonu
Lenfositlerin hareketleri çeşitli kontrol
mekanizmaları ile denetlenmektedir
Ancak bu mekanizmalarda aksaklıklar varsa
organlardaki lenfosit artışı hakkında çevre kanı
incelemesi ile bir fikir sahibi olabiliriz
Çevre kanında yapılan incelemeler, bireyin immun
durumu hakkında sadece kabaca bilgi verebilir.
Dolaşımdaki lenfosit sayılarının normal olması
patolojik bir durumun varlığını dışlamaz
Lenfosit Alt Gruplarının Belirlenmesi
Örnek
Mutlak değerlerin saptanması:
“Dual”/ “single” platform analiz
“Dual platform” analizlerde örnek
24 saat içinde incelenecekse EDTA,
48 saat içinde incelenecekse ACD, Heparin tercih edilmelidir
“Single platform” analizler için EDTA kullanılmalıdır
Örnekler oda ısında taşınmalıdır(18-22°C)
30°C< <4°C kaçınılmalıdır.
Pıhtılı, hemolizli, bozulma belirtileri olan kan örnekleri
kullanılmamalıdır. Tekrar örnek alma şansı yoksa gözlenen
sorun raporda not olarak belirtilmelidir.
Dual platform analizler için canlılığın en az %85 olması gerekir.
Örneğin İncelenmesi
CD45-SSC grafikleri ile lenfositler seçilmelidir
Tam kan lizis yöntemi ile “single platform” analizler yapılması tercih edilmelidir.
Antikor üreticilerinin önerdiği lizis reaktifleri kullanılmalıdır.
“Dual platform” kullanılacaksa güvenilir bir TKS (DIFF dahil) sayımı bulunmalıdır.
Buradaki lökosit sayılarına göre 106h/tüp olacak miktarlarda örnek kullanılmalıdır.
Tüm tüplerde CD45 bulunmalıdır
İzotipik kontrol kullanılması zorunlu değildir.
Panelde CD45/CD3/CD4/CD8,
CD16 ve/veya CD56/CD19/CD45 bulunması önerilir.
Üreticinin önerdiği yöntemlere sadık kalınmalı, değişiklik yapılmışsa bu
değişikliğin sonuçlar üzerine etkili olmadığı kanıtlanmalıdır.
Her tüpte en az 2500 lenfosit sayılacak kadar veri toplanmalıdır.
KONTROL
Örneklerle birlikte bir kontrol örneği de eş zamanlı çalışılmalıdır.
En azından yeni bir antikor açıldığında yapılması gerekir
Lenfositleri Tanımlamak için sık
Kullanılan İşaretler
CD45: Pan Lökosit (pozitif kontrol)
CD14: Monosit
CD3: Total T Hücre
CD45RO: “Memory” Lenfosit
CD45RA: “Naive” Lenfosit
CD57: LGL (CD3+)
CD16+56+: NK Hücre(CD3-)
CD19: Total B Hücre
Naive:Membran IgD
high
Membran IgM high
CD20: Total B Hücre
CD69: Aktif Hücreler
CD25: IL-2R p55ag, Aktif Hücreler
HLA-DR: HLA-Sınıf II, B lenfositler, Aktif Hücreler
CD14: Negatif Kontrol
“Gate” alma
“Gate” alma
CD45
SSC
CD45
SSC
Her tüpte en az 2500 lenfosit sayılacak kadar hücre
verisi toplanmalıdır.
Bu sayıya sadık kalınırsa tekrarlar arası fark <%2
Şiddetli lenfopenisi olan hastalarda bu hedefe
ulaşılamayabilir.
Sonuçların Raporlanması
Kimlik Bilgileri
Sonuçları CD numaralarını kullanarak bildirmek gerekir.
Her bir CDnin hangi hücre ile reaktif olduğuna dair ufak
notlar eklenmelidir.
Tam kan analizlerinde sonuçlar % oran ve mutlak değer
olarak raporlanmalıdır.
Her laboratuvarın kendi referans aralıklarını belirlemesi
gerekir
Kalite Kontrolü
Sonuçların internal bir kontrol gibi değerlendirilmesi
CD3+, CD19+, CD3-CD16+ ve /veya CD56+ hücre oranlarının
toplamı gate içindeki lenfosit oranına esit olmalı (±%5 )
CD4+ ile CD8+ hücre oranlarının toplamı CD3+ oranına denk
olmalı ( max:-%10 sapma). Sapma varsa ek inceleme
gerekebilir TCRgd↑, CD4 CD8 Ko-ekspresyonu söz konusu
olabilir
Aynı panel içinde tekrarlanmış olan testlerin sonucu arasındaki
fark %3 den az olmalı
A.Ü.T.F Hematoloji B. D Lab.
26
4
0.3
2.4
96.99
79
35
42
3
10
4+81,4+13= 98,4
35+42= 77, %5,4 sapma
A.Ü.T.F Hematoloji B. D Lab.
A.Ü.T.F Hematoloji B. D Lab.
A.Ü.T.F Hematoloji B. D Lab.
Kalite Kontrolü
Her tüp için ışık saçılım özelliklerine bakılarak “gate”in sapma
göstermediğinden emin olunmalı, Gate kaymış ise hedef
hücreler analiz dışında kalacaktır.
Diğer potansiyel hata kaynakları kontrol edilmelidir.ör: “gate”
doğru mu?, okumlar sırasında cihaza yanlış tüp yerleştirilmiş
olabilir mi?SS
Cihazların periyodik bakım, kalibrasyonları düzenli yapılmalı,
kayıtları saklanmalıdır. Yöntemde yapılan değişiklik varsa kayıtları
tutulmalıdır. Kullanılan malzemeler, kullanıcılara ait bilgiler kayıtlı
olmalıdır
Laboratuvarın bir dış-kalite kontrol programına üye olması gerekir
Referans Değerlerin Belirlenmesi
Her Laboratuvarın kendi kullandığı yöntemle belirlenmiş değerleri
kullanması gerekir
Toplumu temsil edebilecek sağlıklı bireylerden en az 50 kişinin seçilmesi
önerilir. İdeal olan paramerik testler için > 300; NP olanlarda>120 bireyle
çalışma yapılması (Veri/örnek paylaşımı şart)
Kan bankasına bağış yapan bireyler seçilmemelidir (alt grup dağılımı
kan verdikten önce ve sonra farklı).
Yaş, Cinsiyet, Irk farklılıkları var
Verilerin dağılımına göre uygun istatistiksel yöntemler ile %5-95 güven
aralığı tesbit edilmelidir
Referans Değerlerin Belirlenmesi
Önemli faktörler
Seçilen grubun büyüklüğü
Kan örneği alınan tüpler
Lizisde kullanılan reaktifler (her lot için performans
değişebiliyor)
Yaş, gün-içi dalgalanmalar, stres, diyet, sigara, egzersiz,
kullanılan ilaçlar
Ufak gruplar çalışılıp verileri birbirine eklenecekse
ardışık iki grup için hesaplanan değerlerin benzer
olması, yöntemin güvenirliğini arttıracaktır
Lenfosit Dağılımını/Oranları Etkileyen
Faktörler
İlaçlar
Irk
Kullanılan Farklı Teknikler
Yaşam Tarzına
baglı faktörler
Yaş
Sirkadian Ritim
Fiziksel aktivite
Cinsiyet
Stres
Ör:
Cinsiyet: Kadınlarda NK hücre oranı daha düşük, CD4 oranı ↑
Psikolojik stres: Nötrofil, monosit, CD19+B hücre, CD8+T hücre oranı ↑,CD4+↓
Sirkadian Ritim: Gündüz Nötrofil, monosit, TCRgd, CD8+, gece TCRab, CD4+ ↑, CD20+ ↑
CD45: Pan Lökosit
CD14: Monosit
CD3: Total T Hücre
CD16+56+: NK Hücre
CD19: Total B Hücre
CD20: Total B Hücre
CD45RA: Naive Lenfosit
CD45RO: Memory Lenfosit
Cd25: IL-2R p55ag, Aktif H
HLA-DR: HLA-Sınıf II Aktif H
“T”
“B”
“NK”
Hücreler
ve
İmmun fenotipik Özellikleri
T Lenfositler
Humoral İmmun Yanıttan sorumlu
Hücresel İmmun Yanıttan Sorumlu
Hücre dışı patojenlerle mücadele
Otoimmunite ile ilşki
Doğal immunite ile ilişkili
Antijene Özgün T hücreler
Alel
Peptid
Antijen
Alel
Peptid
c
c
Antijen
Alel
Peptid Antijen
CMV -Tetramer Kullanımı
A.Ü.T.F Hematoloji B. D Lab.
B Lenfositler
NK Hücreler
MHC den
bağımsız
etkileşim
CD56 bright- CD16dim/- immune regulatör NK-hücreler (%10)
CD56dim- CD16bright : Sitotoksik NK-hücreler (%90)
MHC aracılı
etkileşim
Aktivatör KIR:
CD158h (KIR2DS1)
CD158j (KIR2DS2)
CD158d (KIR2DL4)
CD158i (KIR2DS4)
(KARp50.3)
CD158g (KIR2DS5)
CD158e2 (KIR3DS1)
CD94/NKG2-C –E -F –H:
HLA E ile etkileşimde
İnhibitör KIR:
CD158a (KIR2DL1)
(KIRp58.1/KIRp50.1)
CD158b1 (KIR2DL2)
(KIRp58.2/KIRp50.2)
CD158b2 (KIR2DL3)
CD158f (KIR2DL5)
CD158e1 (KIR3DL1) (KIRp70)
CD158k (KIR3DL2)
CD158z (KIR3DL7)
ILT-2(CD85j): HLAG ile etkileşen bir Res.
CD94/NKG2A-B:
CD94/NKGD: MHC den bağımsız etkileşim (MICA-B)
Natural Cytotoxicity Receptor (NCR). NKp30, NKp44 ve NKp46.
HKHN sonrasında NK hücrede KIR ifadesi azalmış olan olgularda yasam daha kısa, NK
Hücre IFNg sekresyonu, GVHD ile ilişkili bulunmuş
Hematopietik Kök Hücre Nakli Sonrası
Lenfosit Yapılanması
Storek et al
Mutlak sayım değerlerinin önemli olduğu olgularda standart
yöntemler ile standart formatta sonuçlar vermek gerekir
Ör: İmmun Yetmezlikler,
AIDS olgularında CD4+ hücre sayımları
ATG uygulamalarında mutlak T hücre sayımları
Araştırma amacı ile yapılan diğer tüm çalışmalarda sunulan
verilerin dikkatle değerlendirilmesi , doğrulanmayan, tekrar
edilemeyen bulgular ile erken sonuçlara varılmaması önem
taşır
SCID: severe combined immunodeficiency; AR SCID: autosomal
recessive SCID; ADA def: adenosine deaminase deficiency; PNP def:
purine nucleoside phosphorylase deficiency; CD3 def: deficiency of a
component of CD3 (gamma, epsilon); ZAP-70 def: deficiency of the
CD3 zeta-associated 70 kd tyrosine kinase; NK def: primary natural
killer cell deficiency; XLA: X-linked agammaglobulinemia; WAS:
Wiskott-Aldrich syndrome; AT: ataxia-telangiectasia; CVID: common
variable immunodeficiency; AIDS: acquired immunodeficiency
syndrome.