ankara üniversitesi fen bilimleri enstitüsü yüksek lisans tezi
advertisement
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BRODİFACOUM’UN SIÇAN DALAĞI ÜZERİNE HİSTOKİMYASAL ETKİSİ Burcu BAYRAMLI BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2016 Her hakkı saklıdır. ÖZET Yüksek Lisans Tezi BRODİFACOUM’UN SIÇAN DALAĞI ÜZERİNE HİSTOKİMYASAL ETKİSİ Burcu BAYRAMLI Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Nursel GÜL Bu çalışmada kemiricilere karşı kimyasal mücadelede kullanılan Brodifacoum’un dalak üzerine hisyokimyasal etkileri CD4 ve CD8 histokimyasal boyama yöntemi ile ışık mikroskobunda araştırıldı. Deneylerde sıçanlar beş gruba ayrıldı (n:6 birey): kontrol grubu, 24 saat, 72 saat, 14 gün, 30 gün brodifacoum uygulamalı grubu. Brodifacoum’un 0,2 mg’lık tek dozu Dimetil sülfoksitte (DMSO) çözdürülerek, ergin erkek sıçanlara oral yoldan bir kez verildi. Deney grubundaki sıçanlardan uygulamadan 24 saat,72 saat, 14 gün ve 1 ay sonra ve kontrol grubundaki sıçanlardan 14 gün sonra eter anestezi ile dalakları alındı. Dokular tespit edildi, dehidre edildi ve parafine gömüldü. Parafin bloklardan 5 mikron kalınlığında kesitler alınıp, ışık mikroskobunda histokimyasal yöntemlerle incelendi. Yapılan ışık mikroskobu çalışmasında kontrol grubu sıçan dalağındaki kapsül, beyaz pulp ve kırmızı pulp bölgelerinin normal yapıda olduğu ve doğal yapısındaki gibi primer ve sekonder foliküllerin (germinal merkez) az sayıda olduğu ayrıca CD4 ve CD8 lenfositlerin normal yapılarına uygun olarak yuvarlak oldukları gözlendi. 24 saat brodifaoum uygulanmış sıçan dalakların da CD4 ve CD8 hücrelerinde bozulmaların başladığı ve germinal merkezlerin çaplarında büyüme olduğu gözlendi. Zaman artışına bağlı olarak (72 saat ve 14 gün) primer foliküller artarken, germinal merkezlerin çaplarında artış ve doku kayıpları tespit edildi. Bunun yanı sıra brodifacoum uygulamasından 30 gün sonra sıçanlarda alınan dalaklarda CD4:CD8 oranının kontrol grubuna yaklaştığı, hücre şekillerinde düzelme iyileşmenin etkisi olarak rapor edildi. Yapılan bu çalışmayla brodifacoum’un sıçan dalağında immünohistokimyasal olarak anormalliklere yol açtığı tespit edilmiştir. Ağustos 2016, 46 sayfa Anahtar kelimeler: Brodifacoum, dalak hücresi, histokimya, antikoagülant, CD4, CD8, ışık mikroskobu, sıçan, Rattus norvegicus ii ABSTRACT Master Thesis HİSTOCHEMİCAL EFFECTS OF BRODİFACOUM ON RAT SPLEEN Burcu BAYRAMLI Ankara University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Biology Supervisor: Prof.Dr. Nursel GÜL In this study, histochemical effects of Brodifacoum, an anticoagulant used against rodents, on spleen are examined under light microscope by using CD4 and CD8 histochemical staining method. On the experiments rats were divided into five groups (n:6 individual): control group, 24 hours, 72 hours, 14 days and 30 days Brodifacoum applied groups. Single dose of 0.2 mg Brodifacoum was dissolved in Dimethyl Sulfoxide (DMSO) was given orally to mature male rats. Spleen samples were collected under ether anaesthesia after 24 hours, 72 hours, 14 days and 1 month from the rats in the experimental groups and after 14 days from the rats in the control group. Tissues were fixed, dehydrated and embedded into paraffin. Sections with 5 micron thick were taken from paraffin blocks and examined under light microscope by using histochemical methods. In this light microscope study, it was observed that capsule, white pulp and red pulp zones in the rat spleen were constructed normally and as their natural structure primary and secondary follicles (germinal center) they were few in number and CD4 and CD8 lymphocytes were spherically structured. In the 24 hours spleens of the rats, the diameters of germinal centers were expanded and deterioration of the structure of CD4 and CD8 cells was observed. Related to the increase in time (72 hours and 14 days) it was determined that primary follicles increased in number and the diameters of germinal centers expanded. In addition to this, after30 days, the rate of CD4:CD8 of the brodifacoum apllied rat spleens was approximate to the rate of the control group and the improvement of the structures of the cells were reported as an effect of regeneration. With this presented study, it was identified that brodifacoum caused immunohistochemically abnormalities on rat spleen. August 2016, 46 pages Key Words: Brodifacoum, spleen cell, histochemistry, anticoagulant, CD4, CD8, light microscoby, rat, Rattus norvegicus iii TEŞEKKÜR Bu tez çalışmasında bana bilgi ve tecrübeleriyle katkı sağlayan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nursel GÜL’e (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı); tez önerisinde teori kurmamızda bize yol gösteren Sayın Prof. Dr. Nuri YİĞİT’e (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), kesit alınmasında tez çalışmamda katkısı olan Gazi Üniversitesinden Sayın Prof. Dr. Zekiye SULUDERE (Gazi Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı) ve Sayın Uzman Damla AMUTKAN (Gazi Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı) hocalarıma sonsuz teşekkür ederim. Tez çalışmalarım sırasında bana manevi destek sağlayan Hakan ESKİZENGİN’e, Ceren GÜLER’e teşekkür ederim. Benden manevi ve maddi desteklerini esirgemeyen annem Songül BAYRAMLI, babam Ekber BAYRAMLI ve ablam Özge BAYRAMLI’ya saygıyla teşekkür ederim. Burcu BAYRAMLI Ankara, Ağustos 2016 iv İÇİNDEKİLER TEZ ONAY SAYFASI ETİK .................................................................................................................................. i ÖZET................................................................................................................................ ii ABSTRACT ....................................................................................................................iii TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iv KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................................................. vi ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................... vii ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................. ix 1.GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2.KAYNAK ÖZETLERİ ................................................................................................ 6 2.1 Rodentler.................................................................................................................... 6 2.2 Antikoagülant rodentisitler ...................................................................................... 7 2.3 Brodifacoum .............................................................................................................. 9 2.4 Dalak......................................................................................................................... 11 2.5 T Lenfositleri ........................................................................................................... 15 3.MATERYAL ve METOD......................................................................................... 18 3.1 Deney Hayvanları .................................................................................................... 18 3.2 Hayvanlara Brodifacoum Uygulanması ................................................................ 18 3.3 Işık Mikroskobu Preparasyonu ............................................................................. 19 4.ARAŞTIRMA BULGULARI .................................................................................... 21 5.TARTIŞMA ................................................................................................................ 38 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 41 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 46 v KISALTMALAR DİZİNİ PPX Propoxure insektisit NK Natural Killer hücreleri Ig İmmunoglobulin ASH Antijen Sunan Hücreler MHC Major Histocompatibility Complex DMSO Dimetilsülfoksit BW Body Weight (vücüt ağırlığı) PBS Phosphate Buffered Saline vi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Rattus norvegicus ......................................................................................................................... 6 Şekil 2.2 Birinci nesil antikoagülantlara örnek ........................................................................................... 7 Şekil 2.3 İkinci nesil antikoagülantlar ve piyasada bulunuş şekilleri .......................................................... 8 Şekil 2.4 Antikoagülant rodentisitlerin ilk kullanıldıkları tarihler ve kimyasal yapıları ............................. 9 Şekil 2.5 Dalağın yapısı ............................................................................................................................ 12 Şekil 2.6 Dalak genel ................................................................................................................................ 13 Şekil 4.1 Hematoksilen ile boyanan kontrol grubu sıçan dalağı genel görüntüsü ..................................... 21 Şekil 4.2 Hematoksilen ile boyanan kontrol grubu sıçan dalağı ............................................................... 22 Şekil 4.3 Brodifacoum uygulanan sıçan dalağında kontrol grubunun genel dalak görüntüsü ................... 22 Şekil 4.4 CD4 Yardımcı T lenfositi kontrol grubunun beyaz pulp bölgesi ............................................... 23 Şekil 4.5 CD8 kontrol grubu sıçanların dalak yapısı ................................................................................. 23 Şekil 4.6 CD4 Yardımcı T lenfositi kontrol grubunun beyaz pulp bölgesi ............................................... 24 Şekil 4.7 Sıçanlara 24 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü .......................................................................................................... 24 Şekil 4.8 Brodifacoum uygulandıktan 24 saat sonar hematoksilen ile boyanan dalaklarda kırmızı pulp ............................................................................................................................................ 25 Şekil 4.9 Sıçanlara 24 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD 4 grubunun dalak yapısı................. 25 Şekil 4.10 Sıçanlara 24 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD4 grubunun dalağındaki beyaz pulp yapısı .................................................................................................................... 26 Şekil 4.11 Brodifacoum uygulanan 24 saatlik CD 8 sıçan grubunun genel görünümü ............................. 27 Şekil 4.12 Brodifacoum uygulandıktan 24 saat sonraki dalaklarda kırmızı pulp. ..................................... 27 Şekil 4.13 Sıçanlara 72 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü ........................................................................................................ 28 Şekil 4.14 Brodifacoum uygulandıktan 72 saat sonar hemotoksilen ile boyanan dalaklarda kırmızı pulp bölgesi ............................................................................................................................. 28 Şekil 4.15 Sıçanlara 72 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD4 grubunun dalak yapısı ............... 29 Şekil 4.16 72 saatlik Brodifacoum uygulanmış dalakta kırmızı pulp bölgesindeki CD4 T lenfositleri ................................................................................................................................ 29 Şekil 4.17 Brodifacoum uygulanan 72 saatlik CD 8 sıçan grubunun genel görünümü ............................. 30 Şekil 4.18 Brodifacoum uygulandıktan 72 saat sonraki dalaklarda kırmızı pulp. ..................................... 30 vii Şekil 4.19 Sıçanlara 14 gün Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü ........................................................................................................ 31 Şekil 4.20 Brodifacoum uygulandıktan 14 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp ...................................... 31 Şekil 4.21 14 günlük Brodifacoum uygulanmış dalağın genel görüntüsü ................................................. 32 Şekil 4.22 Brodifacoum uygulandıktan 14 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp ...................................... 32 Şekil 4.23 Brodifacoum uygulanan 14 günlük CD 8 sıçan grubunun genel görünümü ............................ 33 Şekil 4.24 Brodifacoum uygulandıktan 14 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp ...................................... 33 Şekil 4.25 Sıçanlara 30 gün Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü ........................................................................................................ 34 Şekil 4.26 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp ...................................... 34 Şekil 4.27 Sıçanlara 30 gün Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD4 grubunun dalak yapısı ................ 35 Şekil 4.28 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp ...................................... 35 Şekil 4.29 Brodifacoum uygulanan 14 günlük CD 8 sıçan grubunun genel görünümü ............................. 36 Şekil 4.30 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp ...................................... 36 viii ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1 Brodifacoum uygulanmış sıçan gruplarında yardımcı T lenfositleri (CD4) hücre sayısı ........................................................................................ 37 Çizelge 4.2 Brodifacoum uygulanmış sıçan gruplarında yardımcı T lenfositleri (CD4) hücre sayısı ........................................................................................ 37 ix 1. GİRİŞ Rodentisitler, halk arasında sıçan zehiri olarak bilinmektedir, haşere ve kemirgen popülasyon kontrolü için kullanılan bir kimyasaldır (Meerburg vd. 2008). Piyasada satılan iki grup rodentisit vardır. Bunlar; akut rodentisitler ve antikoagülant rodentisitlerdir. Akut rodentisitler, kısa sürede etki gösterirler ve bu yönden antikogulant rodentisitlere göre avantajlı durumdadırlar. Ancak hedef dışı canlılara yüksek derecede zehir etkisi yaparlar ve çok azının spesifik antidodu mevcuttur. Ayrıca yem çekingenliği adı verilen ve kemirgenlerin yeniden yeme dönüşünü engelleyen olumsuz etkileri mevcuttur (Vural 2005). Antikoagülant rodentisitler, karaciğer hepatositlerinin mikrozomlarında vitamin K sentezini engelleyerek ölümcül iç kanamalara yol açarlar. Akut zehirlerle karşılaştırıldığında etkilerini biraz daha uzun sürelerde göstermeleri ve insan dahil hedef dışı canlıların kazara temas etmeleri durumlarında spesifik antidotu olan vitamin K1 ile tedavi edildiği için daha güvenlidir (Vural 2005). Antikoagülant rodentisitler vitamin K epoksid redüktazı inhibe ederler. Pıhtılaşma faktörlerinden II, VII, IX ve X’un aktifleşebilmesi için post-translasyonel gama karboksilasyonuna ihtiyaç vardır. Gama karboksilasyonunun gerçekleşebilmesi içinde vitamin K’nın redükte vitamin K’ya dönüşmesi gerekmektedir. Bu dönüşümü yapan enzim ise vitamin K epoksid redüktazdır (Valchev vd. 2008). Oral yoldan verilen antikoagülant rodentisitler karboksilasyonun meydana gelmesini engeller ve kan pıhtılaşmasını önler (Valchev vd. 2008). Bunun sonucunda rodentler kan kaybından ölürler (Mosterd ve Thijssen 1991). Antikoagülant rodentisitler birinci nesil ve ikinci nesil olmak üzere ikiye ayrılır. Birinci nesil antikoagülant rodentisitler Warfarin, Chlorophacinone, Diphacinone, Coumatetryl, Pindone olarak adlandırılırlar. Warfarin gibi birinci nesil antikoagülantlar 1950’lerden itibaren yaklaşık ilk 10 yıl başarıyla kullanılmıştır. Ancak daha sonradan rodentlerde bu rodentisitlere karşı bir direnç meydana geldiği gözlenmiştir. 1 Difenacoum’un da yer aldığı ikinci nesil antikoagülantların geliştirilmesiyle dirençli populasyonların kontrolü sağlanmıştır. İkinci nesil antikoagülant rodentisitlerden flocoumafen ve brodifacoum diğerlerine göre daha toksiktir ve tek doz yeterlidir fakat geç ölüm meydana gelmektedir ve çok şiddetli semptomlar oluşmamaktadır(Gutrie ve Rufus 1972). Brodifacoum ‘superwarfarins’ olarak bilinen ikinci nesil antikuagülant rodentisitlerin üyesidir. İkinci nesil antikoagülant rodentisitler (bromadiolone, difenacoum, chlorophacinone) warfarine direnç gösteren rodentler için üretilmiştir (Hollinger ve Pastoor 1993). Brodifacoum 4-hydroxycoumarin antikoagulanttır. Brodifacoum Kuzey Amerika, Avrupa, Avusturalya ve Yeni Zelanda’nın da içinde bulunduğu birçok ülkede ticari olarak pazarlanmaktadır. Brodifacoum birçok hayvanın üzerinde denenmiştir ve bunun sonucu olarak rodent seçici bir toksin olmadığı ortaya çıkmıştır. Fatal (ölümcül) brodifacoumun diğer omurgalıları da zehirlediği görülmüştür. Bunlara köpek (Kieboom ve Rammell 1981), kümes hayvanları, kedi (Hunter 1983), koyun, büyükbaş hayvanlar (Kieboom ve Rammell 1981), lama (Ray vd. 1989) ve insanlar da (Ray vd. 1989, Helmuth vd. 1989) dahildir. Non-fatal (ölümcül olmayan) brodifacoumun da insanlar üzerinde zehir etkisi olduğu rapor edilmiştir (Siedelmann vd. 1995). Brodifacoum da birinci nesil antikoagülant rodentisitler gibi K vitamini epoksid redüktaz inhibisyonu yoluyla pıhtılaşma önleyici olarak görev yapmaktadır (Majerus vd. 1996). Brodifacoum vitamin K epoksid redüktaz enzimini inhibe eder. Bu enzim vitamin K-epoksiti çevrimi için K vitamininin sulandırılmasına ihtiyaç duyar. Brodifacoum ise kandaki aktif K vitamini seviyesini düşürür. K vitaminine protrombinin gibi kan pıhtılaşmasında rol oynayan önemli maddelerin sentezi için gereklidir. Brodifacoumun etkisi giderek şiddetlenir ve kan pıhtılaşma yeteneğini kaybeder. Buna ek olarak brodifacoum kılcal damarların geçirgenliğini artırır ve kan plazması küçük kan damarlarından sızmaya başlar. Zehirlenen bir hayvanda iç kanama, bilinç kaybı ve son olarak ölüme neden olan şok gözlenir. Brodifacoum memeliler, kuşlar ve balıklar için aşırı derecede zehirlidir. Kümülatif bir zehir olup aynı zamanda yüksek lipofiliktir ve eliminasyonu oldukça zordur. 2 Sağlıklı bir beslenme ancak hijyenik ortamlarda üretilen gıdalarla mümkün olabilmektedir. Gıda maddelerinin üretiminde hammaddeden tüketiciye ulasana kadar bir dizi tedbirin alınması hijyenik bir gıda üretimi için büyük önem taşımaktadır. Bu tedbirlerden biri de gıdalara ve tüketiciye çeşitli yönlerden zarar veren Rodentlere(kemiricilere) karsı etkin bir mücadele yöntemidir. Gıda işletmelerine büyük zarar veren rodentlerin basında Rattus norvegicus (Norveç sıçanı, Göçebe sıçan), Rattus rattus (Ev sıçanı, Gemi faresi, Çatı faresi) ve Mus musculus (Ev faresi) gelmektedir. Rattus norvegicus çoğunlukla insanların barındığı ev ve binaların alt katlarında ve bodrumunda ve de kanalizasyon sistemlerinde yaşar. Kırsal alanlarda yasayanlar ise su kaynaklarına yakın ahır, çöplük, depo ve kanallara yerleşirler. Rattus norvegicus çöplüklerden yiyeceğini sağlayabilir. Rattus norvegicus, su yokluğundan çok etkilenir. Yetişkin Rattus norvegicus bir günde 20-25 gr kuru yiyecek, ev faresi ise 2-3 gr yiyecek tüketir. İri fareler diğerlerine göre daha düzenli yeme alışkanlığına sahiptir (Vural 2005). Dalak, karnın sol tarafında, mide ile diyafram arasında yer alan, süngerimsi yapıdadır. Dalak ağırlığı ve büyüklüğü türden türe farklılık göstermektedir (Losco 1992). Dalak, konak savunmasında önemli bir rol oynar. Kandan gelen antijenlerin temizlendiği organdır (Smith ve Johnston 1979). Dalak savunmanın yanında kan homeostasisi için de gerekli bir organdır (Bohnsack ve Brown 1986). Bu fonksiyonlar, dalağın yapısal ve hücresel olarak birbirinden farklı iki komponenti beyaz pulp ve kırmızı pulp ile gerçekleştirilmektedir. Dalak, kan filtresi olarak görev aldığından damarlı bir organdır. Arter dallanmaları lenfoid dokularca çevrelenmiştir. Ana arterler kırmızı pulpu, daha küçük arterler de beyaz pulpu beslemektedir (Cesta 2006). Kediler üzerinde 1999’da yapılan bir çalışmada, bir deniz kabuklusu olan Saxidomus giganteus’tan izole edilen ve toksik bir madde olan Saxitoxin’in kedilerin çeşitli organları üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Araştırmada beyin, safra kesesi, medulla oblongata, karaciğer ve dalakta saxitoxin’in birikme miktarlarına bakılmıştır. En fazla toksik etkinin görüldüğü organlardan ilkinin dalak, ikincisinin ise karaciğer olduğu rapor edilmiştir (Andrinolo vd. 1999). 3 Bir başka çalışmada ise chlorophamın, sıçanların dalaklarında toksisite sonucu oluşan değişiklikleri incelemek amacıyla sıçanlara uygulanmış ve değişiklikler gözlemlenmiştir. Deney hayvanlarının dalak ağırlıkları, kontrol grubuna göre belirli biçimde artış göstermiştir ve kapsülde fibrozis, parankimada da lezyonlar görülmüştür.(Fujitani vd. 2004). Bu sonuçlar dalağın kan filtresi görevi gördüğünü kanıtlar niteliktedir. Dalak T lenfositlerinin antijenlerle ( mikroorganizmalar ve bunların toksik proteinleri, karbonhidratları, yağları vb.) karşılaşıp onlara karşı mücadele verip, antijenin ortadan kaldırıldığı organdır (Aytekin ve Solakoğlu, 2006). İmmün sistemde görev alan lenfositler, B ve T olmak üzere iki ana gruptan oluşur. T lenfositleri isimlerini, oluşturuldukları timus organından alırlar ve periferal kandaki tüm lenfositlerin yaklaşık %80’ini oluştururlar. T lenfositleri çeşitli alt gruplara sahiptir. Bu gruplardan biri olan yardımcı T lenfositleri, yüzeylerinde bulunan CD4 marker proteini ile tanınırken, bir diğer grup sitotoksik T lenfositleri CD8 marker proteini ile tanınmaktadır. Bu hücreler organizmanın bağışıklığında önemli görevlere sahiptir. Yardımcı T lenfositleri, immün sistem reaksiyonlarının başlamasını sağlayan sitokin hormonunu salgılarlar. Sitotoksik T lenfositleri ise salgıladıkları bazı enzimlerle patojen organizma veya molekülleri etkisiz hale getirirler. T lenfositlerinin görev aldığı primer immün yanıtın gelişmesi, antijenin yapısına ve organizmaya girdiği bölgeye göre 14 gün sürebilir (Ademokun ve Dunn-Walters 2010). Dalakta %30-40 oranında T lenfositi bulunmaktadır. Langeveld ve arkadaşlarının (2006) yaptığı araştırmaya göre, insan dalağında CD8 T lenfositlerinin CD4 T lenfositlerine göre daha fazla olduğu öne sürülmüştür. Bu hücrelerin popülasyonunda aktif hücrelerin çoğunlukta olduğu ve CD8 T hücrelerinin daha çok sitotoksik CD27(-)CD45RA(+) bellek hücre fenotipinde olduğu tespit edilmiştir (Langeveld vd. 2006). Dalakta bulunan lenfosit alt gruplarının, periferal kanda bulunan lenfosit alt gruplarına göre farklılık göstermesinin, dalaktaki CD4 ve CD8 T lenfosit aktivasyonunun önemli ve ayrı bir yeri olduğu anlamına geldiği gösterilmiştir (Langeveld vd. 2006). 4 Propoxure (PPX) insektisiti C57-bl/6 farelere verilerek humoral ve hücresel bağışıklık incelenmiştir. Çalışma sonucunda 10 mg/kg dozda PPX’in gecikmiş tip hipersensitivite cevabını baskıladığı ve CD4(-)/CD8(+) T hücre yüzdesini arttırdığı rapor edilmiştir (Neishabouri vd. 2003). Bir diğer çalışmada kokainin in vitro olarak, dalakta bulunan sitokin salgılayan CD4(+) T lenfositlerini arttırdığı bildirilmiştir (Falchetti vd. 1995). CD4 ve CD8 T hücrelerinin virüs enfeksiyonuna sitokin cevapta önemli bir rol oynadığı, antiviral ve düzenleyici sitokinlerin salınımı görevinin bu iki T lenfosit alt grubu arasında paylaşıldığı bildirilmiştir (Falchetti vd. 1996). Yapılan araştırmaların doğrultusunda bu yüksek lisans çalışmasında Brodifacoum rodentisitinin sıçanların dalağındaki bağışıklık reaksyonlarını başlatan T lenfositlerine etkisinin ne olacağı histokimyasal yöntemle tespit edilecektir. 5 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Rodentler Rodentler memeli sınıfıının en geniş takımını oluşturur. Dişleri kemirmeye uygun olarak gelişmiştir ve dişler sürekli bir büyüme gösterir. Köpek dişleri bulunmaz. Herbivor ya da omnivor olarak beslenirler. Koku alma duyuları çok gelişmiştir. Sciurus vulgaris ( Kırmızı sincap ), Castor fiber (Kunduz), Mus musculus (Ev faresi) ve Rattus norvegicus (Kahverengi sıçan) örnek türler olarak verilebilir. Rattus norvegicus, boyları 26 cm, kuyrukları 22 cm, ağırlıkları ise yaklaşık 500 g olan rodent türüdür ( Kuru, 2009). Kanalizasyonlar ve binaların bodrum katları gibi izbe ve pis alanlarda bulunurlar. Çok hızlı çoğalırlar. Yılda 7 kez yavru doğurabilir ve her doğumda 7-11 yavru meydana getirirler. Doğumdan 22 gün sonra yavrular anneden bağımsız olarak yaşamını sürdürebilir (Kuru, 2009). Kuduz, tifus ve veba gibi hastalıkları insanlara bulaştırarak ölüme neden olabilirler. Bu nedenle tehlikeli haşereler olarak kabul edilirler. Laboratuvar ortamında deney hayvanı olarak kullanılmak üzere üretilen Wistar Albino sıçanlar da Rattus norvegicus’tan üretilmiştir. Laboratuvar ortamında uygun şartlar altında uzun süreler yaşayabilirler. Şekil 2.1. Rattus norvegicus (http://www.criver.com, 2015) 6 2.2 Antikoagülant rodentisitler Rodendisitler, sıçan ve fare gibi kemirici hayvanların kontrolünde kullanılır. Anorganik ve organik yapıda birçok kimyasal maddeleri içeren rodentisitler, fizyolojik bakımdan insana benzeyen hayvan tiplerinde (kemircilerde) toksik olmalarina karşın toksisiteleri insanda daha farklıdır. Bu farklılık, kemiricileri primatlardan ayıran fizyolojik ayrılığa dayanarak selektive gösterebilir. Antikoagülant rodentisitler Dünya Sağlık Teşkilatı tarafından 1. ve 2. nesil olarak sınıflandırılmıştır. Warfarin gibi 1. nesil rodentisitler arka arkaya birkaç kez yem tüketilmesi sonrası iç kanamaları başlatmaktadır. 2. nesil olarak adlandırılan rodentisitler (Difenacoum, Brodifacoum, vb), birinci nesil rodentisitlere dirençli fare ve sıçanlarla mücadele etmek için geliştirilmekle beraber, bir kez yem tüketme ile öldürücü dozu verme imkânı tanırlar. İkinci nesil antikoagülant rodentisitler, süperwarfarinler olarak adlandırılırlar. Bunlar 4-Hidroksikumarin yapısındaki Brodifacoum, Bromadiolone, Difenacoum, Flocoumafen ve İndanedione türevleri ve Diphacinone’dur (Vural, 2005). Şekil 2.2 Birinci nesil antikoagülantlara örnek; Warfarin 7 Şekil 2.3 İkinci nesil antikoagülantlar (Watt vd. 2005) ve piyasada bulunuş şekilleri 8 Birinci ve ikinci nesil antikoagulant rodentisitler kimyasal olarak indandion ve kumarinleri içerirler ( Fisher vd. 2005) Şekil 2.4 Antikoagülant rodentisitlerin ilk kullanıldıkları tarihler ve kimyasal yapıları (Fisher 2005). Tez çalışmasında kullanılan superwarfarinli rodentisitte brodifacoum etken maddesi vardır. 2.3 Brodifacoum Deneyimizde kullandığımız brodifacoum “süperwarfarinler” olarak bilinen ikinci jenerasyon antikoagülant rodentisitlerin bir üyesidir(Hollinger BR, 1993). Bu bileşen de diğerleri gibi ( örneğin, bromadiolone, difenacoum, chlorophacinone vb.) rodentlerin warfarine karşı direnç geliştirmesi üzerine geliştirilmiştir. Sıçanlar üzerinde yapılan bir araştırmada, warfarinin yarı ömrü 17 saat olarak saptamışken, superwarfarinli rodentisit olan brodifacoumun yarı ömrü 156 saat olarak saptamıştır (Binks, 2007). Superwarfarinin vücuttan atılması haftalarca sürebilmektedir. Weitzel brodifacoum ile yaptığı bir araştırmada, bu sürenin 6-8 haftayı bulabildiği gösterilmiştir (Weitzel, 1990). 9 Binks ve Davies’in (2007) bildirdiği olguda, superwarfarinin toksik etkilerinin haftalarca hatta aylarca devam edebildiği, deriden emiliminin gerçekleştiği ve çözüm için K vitamini tedavisinin gerektiği bildirilmiştir. Brodifacoum, reçetesiz olarak marketlerde çok sayıda marka isimleriyle Kuzey Amerika, Avrupa , Avusturalya ve Yeni Zelanda’da kolayca ulaşılabilen bir bileşiktir. Brodifacoum içeren üç yaygın Birleşik Devletler markası Talon®, d-Con Mouse PrufeII®, and Havoc® şeklindedir. Taylor ve Thomas belli bir hedef alan oluşturarak buralara tablet halinde 2.nesil antikoagülant olan Brodifacoum koymuşlardır. Bu deneyleri sonucunda bölgede ki bir çok sıçanın ( 25-50 sıçan) öldüğünü tespit etmişlerdir. Brodifacoum dünyanın çoğu yerinde fare, sıçan, tavşan, opossum ve valabi gibi zararlı kontrolünde kullanılmaktadır(Kieboom 1981). Bununla birlikte, Brodifacoum’un rodent seçici bir zehir olmadığı iyice tespit edilmiştir. Köpeklerin (Kieboom ve Rammell 1981,Hunter 1983), kümes hayvanlarının (Hunter 1983), kedilerin (Hunter 1983), koyunların (Kieboom ve Rammell 1981), sığırların (Kieboom ve Rammell 1981), lamaların (Ray vd. 1989) ve insanların (Ray vd. 1989, Helmuth vd. 1989) da içinde bulunduğu diğer omurgalı gruplarında ölümcül Brodifacoum zehirlenmesi rapor edilmiştir (Hollinger ve Pastoor 1993, Siedelmann vd. 1995, Lipton 1984). Zehirlenme kontrol merkezlerinde 1995 senesinde insanların süperwarfarine maruz kaldığı 13.000’den fazla vaka bildirilmiştir (Litovitz vd. 1996). Antikogülantlarla zehirlenen rodentlerle beslenen baykuşların karaciğerleri incelendiğinde antikoagülant kalıntıları tespit edildi (Albert vd. 2010). Süperwarfarin ve Brodifacoum’a maruz kalma vakalarının büyük çoğunluğu ölümcül olmayan, çocukların kazara bileşeni yutması şeklindedir. Yetişkinlerin bileşeni yuttuğu vakalar ise sıklıkla intihar girişimi olup ölümcül olabilir (Helmuth vd. 1989, Kruse ve Carlson 1992). Warfarin gibi Brodifacoum’un da antikoagülant etkilerini K vitamininin epoksit redüktazının inhibe ederek gösterdiği düşünülmektedir. 10 Antikoagülant rodentisitler vitamin K epoksid redüktazı inhibe ederler. Pıhtılaşma faktörlerinden II, VII, IX ve X’un aktifleşebilmesi için post-translasyonel gama karboksilasyonuna ihtiyaç vardır. Gama karboksilasyonunun gerçekleşebilmesi içinde vitamin K’nın redükte vitamin K’ya dönüşmesi gerekmektedir. Bu dönüşümü yapan enzim ise vitamin K epoksid redüktazdır (Valchev vd. 2008). Oral yoldan verilen antikoagülant rodentisitler karboksilasyonun meydana gelmesini engeller ve kan pıhtılaşması meydana gelmez (Valchev vd. 2008). Bunun sonucunda rodentler kan kaybından ölürler (Mosterd ve Thijssen 1991). 2.4 Dalak İmmün sistem primer ve sekonder lenfoid organlardan oluşmaktadır. Primer lenfoid organlar immün sistemin bileşenlerini üretirler. Kemik iliği ve timüs primer lenfoid organlardır. Sekonder lenfoid organlar immün yanıtın oluştuğu yerlerdir. Lenf düğümleri, dalak, tonsiller ve lenfositler ile antijen-sunucu hücrelerin akciğerdeki ve sindirim kanalı mukozasındaki (peyer plakları) topluluklarıdır (Kierszenbaum, 2006). İmmün sistemin bir bileşeni olarak, lenfoid organların ana fonksiyonu vücudu, istilacı patojenlere ya da antijenlere karşı korumaktır (bakteriler, virüsler ve parazitler). Bu savunma mekanizmasının ya da immün yanıtın temelini, kendine ait ve yabancı herhangi bir noktadan girebileceği için, lenfatik sistem vücutta yaygın olarak yayılmıştır (Kierszenbaum 2006). Dalak, vucüttaki sekonder lenfoid organların en büyüğüdür. Kan dolaşımında ki antijenlere karşı immün cevap oluşturmakta büyük rol oynamaktadır. Dalak kan filtresi görevi yapmaktadır. Dalak ayrıca kanda dolaşan antijenleri tanır, sistemik enfeksyonlara cevap verir. Lenf nodüllerinin aksine, dalak lenf damarları içermez. Bununla birlikte kanda oluşan antijenler ve lefositler dalak arteriyle dalağa taşınır. Radyoaktif olarak işaretlenmiş lenfositlerle yapılan deneyler göstermektedir ki dalakta lenf nodüllerinden daha çok lenfosit devridaim bulunmaktadır (Richard vd. 2000) . 11 Dalak, elastik lifler ve düz kas hücreleri içeren sıkı, düzensiz bağ dokusu yapısında bir kapsülle sarılıdır. Bu kapsülden uzanan trabeküller dalağa giren ve dalaktan çıkan kan damarlarını ve sinirlerini taşır. Spleneik arter hilumdan girer ve dalak pulpuna bağ dokusu yapısındaki trabeküller boyunca dağılan trabeküler arterleri oluşturur. Arter trabekülden ayrılınca periarteriyoler lenfotik kılıf (PALS)’ı oluşturan bir T hücresi kılıfı ile sarılır ve lenf folikülünü (beyaz pulp) deler. Bu damar, sentral arter(beyaz pulpun nodüler ya da foliiküler düzenlenmesi nedeniyle foliküler arteriyolde denen) olarak adlandırılır(Richard vd. 2000). Şekil 2.5 Dalağın yapısı (Richard vd. 2000) 12 Dalak; korteks ve medulladan yoksundur.Bunun yerine, dalak farklı görevleri olan iki ana bileşene sahiptir: Kırmızı pulp ve beyaz pulp. Kırmızı pulp beyaz pulptan marjinal zon ile ayrılır. Şekil 2.6 Dalak genel. (http://www.proteinatlas.org 2010 ) Beyaz pulp, dalağın immün elemanıdır. Beyaz pulpanın hücresel elemanları, antijenlerin dalağa lenf yerine kan yoluyla ulaştırmaktadır. Beyaz pulp bir T hücre kılıfı tarafından çevrelenmiş (PALS) sentral arter ve B hücreleri içeren lenf foliküllerini içerir. Beyaz pulpta antijen sunucu hücreler ve makrofajlar da bulunur (Kierszenbaum 2006). Kırmızı ve beyaz pulpun arasında sentral arter ya da arteriyordan çıkan radyal arteriyollerin ulaştığı marjinal sinüs bölgesi vardır. Bu marjinal sinüs bölgesi marjinal zonun dış kısmında yerleşmiş küçük sinüzoidlere açılır. Kan, fagositik makrafojlar ve antijen sunucu hücreler ve dalağa girmiş ancak özel yerleşimlerine henüz dağılmamış T ve B hücrelerini içeren marjinal zonda, dalak parankimasıyla temas eder (Kierszenbaum 2006). 13 Kırmızı pulp, dolaşımdaki kandan yaşlanmış ve hasarlı kırmızı kan hücreleri ve mikroorganizmaları uzaklaştıran bir kan filtresidir. Aynı zamanda kan hücrelerinin depolanma yeridir. Bakteriler kırmızı pulp makrofajları tarafından tanınabilirler ve doğrudan ya da kompleman proteinleri ve immunoglobulinlerle kaplandıktan sonra ortadan kaldırılırlar. Kırmızı pulp kordonları, tümü retiküler hücre ve liflerden oluşan bir stroma tarafından desteklenen plazma hücreleri, makrofajlar ve kan hücreleri içerir. Makrofajların sitoplazmik uzantıları sinüzoidlere komşudur ve parçacıklı maddeleri yakalamak üzere interendoteliyal yarıklardan sinüzoid lümenine doğru da uzanabilir (Kierszenbaum 2006). Dalak sinüzoidleri, sinüzoidlerin uzun ekseni boyunca paralel düzenlenmiş kaburga biçimli endotel hücreleriyle döşeli, kesintili damar boşluklarıdır. Endotel hücrelerinin ince uçlarında bağlantı kompleksleri bulunabilir. Her dalak sinüzoidi endotel hücreleri çevresinde kaburga ya da fıçı kasnağı gibi düzenlenmiş kesintili bir bazal lamina ile sarılmıştır. Komşu kasnaklar birbirine bazal lamina benzeri bantlarla tutunmuştur. Ek olarak, dalak sinüzoidlerini gevşek bir retiküler lif ağı da sarar. Buna bağlı olarak kan hücreleri, sinüzoide iğ biçimli endotel hücreleri arasındaki dar yarıklar ve gevşek bazal lamina-retiküler lif ağı arasından engellenmemiş bir erişime sahiptir (Kierszenbaum 2006). Kırmızı pulpta iki tür kan dolaşımı tanımlanmıştır. Arteriyal damarların doğrudan dalak sinüzoidlerine bağlandığı bir kapalı dolaşım; ve kan damarlarının doğrudan kırmızı pulp boşluklarına açıldığı, kanın bu boşluklar arasından ve daha sonra interendoteliyal hücre yarıklarından geçerek dalak sinüzoidlerine ulaşmasıyla tanımlanan bir açık dolaşım. Dalak aynı zamanda T lenfositlerinin antijenlerle karşılaşıp onlara karşı mücadele verip, antijenin ortadan kaldırıldığı organdır (Aytekin ve Solakoğlu, 2006). 14 2.5 T Lenfositleri Konak savunma mekanizması enfeksiyonlara karşı ilk koruyucu engeli oluşturan, mikroorganizmaları tanıyıp onları yıkıma uğratmak için doğal olarak organizmada hazır bulunan “doğal direnç - doğal bağışıklık" ve herhangi bir patojenle karşılaştıktan sonra doğal direnci takiben ortaya ç›kan, enfeksiyonlara karşı daha etkili savunma sağlayan “spesifik bağışıklık” dan oluşmaktadır. Doğal direncin başlıca yapıtaşları epitel tabakası, doğal öldürücü hücreler (natural killer-NK hücreleri), kompleman sistemi, fagositik hücreler ve sitokinlerdir (Kierszenbaum 2006). Spesifik bağışıklığın yapı taşları ise T ve B lenfositleri ile birlikte bu hücrelerin ürettikleridir. T lenfositleri hücresel immünite, B lenfositleri ise hümoral immüniteden sorumlu hücrelerdir. Humoral immün yanıtlar antijen ile reaksiyona girebilen antikorların oluşumu ile sonuçlanır. “immünoglobulin” (Ig) olarak adlandırılan tüm antikorlar benzer yapıda proteinlerdir ve serum enjeksiyonu ile bir baflka kifliye pasif olarak transfer edilebilir. Hümoral immün sistemin aksine hücresel immünite sadece hücreler aracılığı ile transfer edilebilir. İmmün yanıt iki fazdan oluşur; tanıma fazında antijen sunan hücreler (ASH) ve T lenfositleri, efektör fazda ise antikorlar ve efektör T lenfositleri antijenin yok edilmesinde etkilidir (Deniz 2007). Organizmada kendi olmayını tanıyıp yanıt verme işlevi immün sistemde T hücrelerinin görevidir. Periferdeki lenfositlerin %70 ini oluşturan T lenfositleri belirli bi yerde yerleşmeyip sürekli doku ile kan arasında dolaşırlar. Kemik iliğinde üretilen ve timus bezinde olgunlaşan bu hücreler öncelikle sekonder lenfoid dokuda yerleşir ve çoğunlukla orada aktifleşir. T lenfosit öncülleri önce kemik iliğinden göç eder ve dolaşım yoluyla timusa gelip korteksinden girer ve olgun halde medulla bölgesinden timusu terkeder. Timusda bulunan lenfositler timosit olarak adlandırılır. Bu hücreler gelişimlerinin farklı aşamalarında bulunabilir. Timustaki bu gelişim sırasında timositler epitelyal hücrelerine özgü yüzey molekülleri ve reseptörleri taşımayan timositler hızla çoğalır ve yüzeylerinde taşıyacakları T hücre reseptörleri (THR) genlerinin yeniden düzenlenmesi bu aşamada olur (Direskeneli 2013). 15 THR genlerinin(fragmalarının) olası tüm kombinasyonlarının gerçekleştiği ve rastgele eksprese edildiği (20 x 109) öngörülmektedir. Timusda timik epitel kökenli hücreler ve kemik iliği kökenli dendritik hücreler timosit etkileşimi bu süreci belirlemektedir. THR ardından yüzeyde CD4 ve CD8 moleküllerinin de ekspresyonu başlar (Direskeneli 2013). Hücrelerin yüzeyinde bulunan MHC II, CD4 T lenfositi ile MHC I molekülünün ise CD8 T lenfosti ile bağlantı kuran hücre zarı molekülleridir. T hücre THR’si, MHC’nin yarığında bağlı antijeni tanıdığı zaman CD4 ya da CD8 yardımcı-reseptörleri T hücre işlevlerini uygulamasına yardımcı olurlar (Direskeneli 2013). İmmünoglobulin süper-ailesinin üyeleri değişen sayıda ekstrasellüler immünoglobulin benzeri birimler içerir. CD4’ün iki uç immünoglobulin benzeri birimi MHC klas II’nin β2 birimine bağlanır. CD8’in tek immünoglobulin benzeri birimi MHC klas I’in α3 birimine bağlanır. Bu nedenle, CD4 yardımcı T hücresi MHC klas II ile bağlı antijenleri tanır, CD8 sitotoksik T hücreler ise (sitolitik timüs kökenli lenfositler, CTL’ler) MHC I trafından sunulan antijenlere cevap verirler. T hücreleri olgunlaşması sırasında timusda iki önemli olay gerçekleşir; THR’nin protein bileşenlerini kodlayan genin yeniden düzenlenmesi, THR’la ilişkili CD4 ve CD8 yardımcı reseptörlerinin geçici birlikteliği. Kemik iliğinden köken almış öncül hücreler timüs korteksine girdiğinde olgun T hücresinde olan yüzey moleküllerinden yoksundur. Henüz CD4 ve CD8 eksprese etmediklerinden ‘çift negatif’ T hücresi olarak adlandırılır. Timüs epitel hücreleriyle ilişki kurduktan sonra çift negatif T hücreleri çoğalırlar, farklılaşırlar ve ilk T hücre özgün moleküllerini eksprese ederler: timüs hücre reseptörü, TCR ve yardımcı-reseptörler CD4 ve CD8 (Direskeneli 2013). 16 T hücre maturasyonu, hem CD4 hem de CD8 yardımcı reseptörleri ve düşük seviyede THR’ın aynı hücrede eksprese edildiği bir evre ile sürer. Bu hücreler ‘çift pozitif’ T hücreleri olarak adlandırılırlar. Çift pozitif T hücreleri kendi MHC’lerini tanıyabilir ya da tanıyamazlar. Kendi MHC’lerini tanıyan hücreler sonunda olgunlaşır ve yardımcı reseptör moleküllerden birini (CD4 ya da CD8) birini eksperese ederler ve ‘tek pozitif’ T hücresi olurlar. Kendi MHC’sini tanımayan çift pozitif hücreler pozitif seçimde başarısız olurlar ve elenirler. T hücreleri bu şekilde olgunlaşır. 17 3. MATERYAL ve METOD 3.1 Deney Hayvanları Deneylerde ağırlıkları 200- 250 gram olan, 24 tanesi deney grubu, 6 tanesi de kontrol grubu olmak üzere toplam 30 adet erkek albino sıçan (Rattus norvegicus) kullanıldı. Deneylere başlamadan önce deney hayvanları yedi gün karantinaya alındı. Hayvanların her biri ayrı kafeslerde olmak üzere uygun laboratuvar şartlarında (22±2˚C; 12sa:12sa fotoperiyot, %60 nispi nem) tutuldu. Deney boyunca hayvanlar katı yemle ad libitum beslendi ve suluklara erişimleri serbestti (Sakai vd. 2004). 3.2 Hayvanlara Brodifacoum Uygulanması Deney hayvanları CD4 ve CD8 öncelikle beş gruba ayrıldı. Bu gruplar: Grup 1: Kontrol grubu hayvanlar ( n:6 hayvan) Grup 2: 24 saat 0,2mg/kg Brodifacoum uygulanan hayvanlar ( n:6 hayvan) Grup 3: 72 saat 0,2mg/kg Brodifacoum uygulanan hayvanlar ( n:6 hayvan) Grup 4: 14 gün 0,2mg/kg Brodifacoum uygulanan hayvanlar ( n:6 hayvan) Grup 5: 30 gün (1 ay) 0,2mg/kg Brodifacoum uygulanan hayvanlar ( n:6 hayvan) Hayvanların grupları belirlendikten sonra, sıçanların ağırlıkları ölçülerek uygun ilaç dozları hesaplandı. DMSO (Dimetilsülfoksit) /polietilenglikol-400/su (0.02ml/1ml/1ml) çözeltisi ile hazırlanan 0.2 mg/kg BW Brodifacoum dozu sıçanlara oral yoldan gastrik gavaj yöntemiyle verildi. Kontrol grubu hayvanlara 1ml/kg BW DMSO (Dimetilsülfoksit) /polietilenglikol-400/su (0.02ml/1ml/1ml) çözeltisi bir kez verildi (Mosterd ve Thijssen, 1991) . Brodifacoum (0.2 mg/kg BW) uygulandıktan 24 saat, 72 saat, 14 gün ve 30 gün sonra eter anestezisi altında dalak örnekleri hayvanlardan alındı (Hadler ve Bukle 1992). 18 3.3 Işık Mikroskobu Preparasyonu Kontrol grubu (14 gün sonra) ve Brodifacoum (0.2 mg/kg BW) uygulanan ( 24 saat, 72 saat, 14 gün ve 30 gün) sıçanlardan eter anestezisi altında alınan dalak örnekleri aşağıdaki işlemlerden geçirilerek, ışık mikroskobunda incelenmeye hazırlandı: i. Çıkarılan dalak örnekleri hassas terazide tartıldı. ii. Örnekler distile suyla yıkandı. iii. Yıkanan örneklerin %10’ luk Formaldehitte (0.1 M Sodyum fosfat tamponunda hazırlanmış) ilk tespiti yapıldı (2 saat, +4 °C’de). iv. Tespit işleminden sonra örnekler aynı tampon ile yıkandı (1 saatte 3 kez solüsyon değişimi yapılarak yıkandı). v. Fiksasyon işlemlerinden sonra, örnekler çeşitli derecelerdeki alkol serilerinde (%80’lik, %90’lık %96’lık ve %100’lük) 5’er dakika bekletilerek dehidre edildi. vi. Örnekler ksilolden geçirilerek parafin bloklarına gömüldü. vii. Parafin bloklarındaki örneklerden 5µ kalınlığında kesitler alındı. viii. CD4 ve CD8 antikorları immünoboyama (immunostaining) yöntemiyle boyandı. Serum: 1. karıştırma şişesinde (mavi kapaklı) 75 µl normal blocking serum stoğu ve 5 ml PBS(phosphate buffered saline) karıştırıldı. Biotinylated Secondary Antibody: 2. karıştırma şişesinde (yeşil kapaklı) 75 µl normal blocking serum stoğu, 5 ml PBS ve 25 µl biotinylated secondary antibody karıştırıldı. AB enzim ayıracı(reagent): AB karıştırma şişesinde (mor kapaklı) 50 µl A ayıracı, 50 µl B ayıracı ve 2.5 ml PBS karıştırıldı ve 30 dk bekletildi. 19 Peroksidaz Substrat: Substrat karıştırma şişesinde (sarı kapaklı) 1.6 ml distile su, 5 damla 10x substrat tamponu, 1 damla 50x DAB chromogen ve 1 damla 50x peroksidaz substratı karıştırıldı. Primer Antikor (CD4-CD8) Hazırlama: 20 µl CD4/CD8 + 980 µl PBS/dH2O = 1000 µl (karışımdan 10 µl damlatılacak) Boyama İşlemi Doku kesitleri preparasyonundan sonra lamlar üzerine PBSle dilüe edilmiş %0.1-1 ‘lik hidrojen peroxide damlatıldı ve 7 dk bekletildi. Distile su ile iki kez yıkandı. Primer Antikor seçilen kesitlerin üzerine damlatıldı ve 45 dk bekletildi. PBS ile 3 kez yıkandı. Kesitler üzerine biotinli sekonder antikor damlatıldı ve 30 dk bekletildi. PBS ile 3 kez yıkandı. Kesitler üzerine AB enzim ayıracı damlatıldı ve 30 dk bekletildi. PBS ile 3 kez yıkandı. Kesitler üzerine 1-3 damla peroksidaz substrat damlatıldı ve 8 dk bekletildi. Kesitler çeşme suyu ile 5 dk yıkandı. Boyanan kesitler üzerine hematoxylin damlatıldı ve 15 dk bekletildi. Kesitler çeşme suyuyla yıkandı. Kesitler kuruduktan sonra entellan ile kapatıldı. x. Dalağın çeşitli kısımlarına ait kesitler,Leica marka ışık mikroskobu altında incelendi ve fotoğrafları çekildi. 20 4. ARAŞTIRMA BULGULAR Yapılan Yüksek Lisans Tez çalışmasında Brodifacoum’ un sıçanların dalak ağırlıkları ve dalağın histolojik yapısına nasıl etki ettiği araştırıldı. Kontrol grubundaki sıçanların ortalama dalak ağırlığı 0.65 gram olarak tespit edildi. Brodifacoum uygulanan 24 saatlik sıçanların dalağı 0.62 gram, 72 saatlik sıçanların dalağı 0.60 gram, 14 günlük sıçanların dalağı 0.48 gram ve 30 günlük sıçanların dağlı 0.57 gram ölçüldü. Yapılan dalak ağırlık ölçümlerine göre kontrol grubuna göre 24 saat, 72 saat, 14 gün Brodifacoum uygulanan sıçanların dalak ağırlığı azaldığı halde 30 günlük uygulama süresinde kontrol grubuna yakın ağırlık tespit edildi. Çalışmada sıçanların dalaklarındaki beyaz pulp bölgesindeki bağışıklıkta antijen varlığında diğer hücreleri sitokin salgılayarak uyaran CD4 (yardımcı T lenfositleri) lenfositlerine ve bağışıklıkta yabancı organizma ve toksik maddeleri enzimleriyle ortadan kaldıran CD8 (yardımcı T lenfositleri) lenfositlerine Brodifacoum’ un etkisi histokimyasal yöntemle incelendi. Yapılan yüksek lisans tez çalışması histolojik yönden incelendiğinde deneylerdeki kontrol grubu hayvanların dalağındaki kapsül, beyaz pulp ve kırmızı pulp bölgelerinin normal yapıda olduğu ve doğal yapısındaki gibi primer ve sekonder foliküllerin (germinal merkez) az sayıda olduğu ışık mikroskobunda tespit edildi (Şekil 4.1). Şekil 4.1 Hematoksilen ile boyanan kontrol grubu sıçan dalağı genel görüntüsü. Beyaz pulp bölgesi (BP), kırmızı pulp bölgesi (KP), primer folikül (beyaz ok) x40 21 Kontrol grubu dalakta kırmızı pulp bölgesinde normal yapıda ve fazla sayıda eritrositler ve bunların arasına yerleşmiş lenfositler ile makrofaj hücrelerine rastlandı (Şekil 4.2). Şekil 4.2 Hematoksilen ile boyanan kontrol grubu sıçan dalağında eritrosit ve makrofaj grupları Eritrosit (beyaz ok) , makrofaj (çift siyah ok) x1000 Yardımcı T lenfositleri bakımından CD 4 Kontrol grubu sıçanların dalağının normal yapıda olduğu ve beyaz pulp, kırmızı pulp, primer foliküllerin düzgün bir şekilde yerleştiği gözlendi. Ayrıca control grubu sıçanlardan alınan dalak örneklerinde primer foliküllerin çok belirgin olmadığı bir kaç tane olduğu dikkati çekti (Şekil 4.3). Şekil 4.3 Brodifacoum uygulanan sıçan dalağında CD4 Yardımcı T lenfositi kontrol grubunun genel dalak görüntüsü. Beyaz pulp bölgesi (BP), Kırmızı Pulp bölgesi (KP), primer folikül (beyaz ok) x40 22 Kontrol grubundaki sıçanların dalağında timus kökenli T lenfositlerinin yerleştiği beyaz pulp bölgesindeki CD4 T lenfositlerinin küresel şekle sahip olduğu tespit edildi. Bu bölgede CD4’ lerin diğer hücrelere göre daha çok olduğu tespit edildi (Şekil 4.4). Şekil 4.4 CD4 Yardımcı T lenfositi kontrol grubunun beyaz pulp bölgesi Makrofaj (çift siyah ok), CD4 Lenfositler (beyaz ok). x 1000 Dalaktaki CD8 T lenfositlerinin Brodifacoum’ a karşı nasıl bir reaksiyon gösterdiğini tespit etmek amacıyla control grubunun dalak örnekleri incelendi. CD8 kontrol grubu dalak yapısında beyaz pulp ve kırmızı pulp bölgelerinin belirgin olduğu ve yok denecek kadar az sayıda primer ve sekonder folikül gözlendi (Şekil 4.5). Şekil 4.5 CD8 kontrol grubu sıçanların dalak yapısı Kırmızı pulp bölgesi (KP), Beyaz pulp bölgesi (BP), Sekonder folikül (beyaz ok), Primer folikül (beyaz daire) x40 23 Kontrol grubu CD8 lerin yuvarlak veya ona yakın köşeli şekilde olduğu ve diğer hücrelerle aynı oranda bulunduğu gözlendi (Şekil 4.6). Şekil 4.6 CD8 Yardımcı T lenfositi kontrol grubunun beyaz pulp bölgesi Makrofaj (beyaz daire), CD8 Lenfositler (beyaz ok). x 1000 Çalışmadaki 24 saat Brodifacoum uygulaması yapılan sıçanlardan alınan dalak örneklerinde büyük çaplı germinal merkezlerin oluştuğu ve eritrositlerin çoğaldığı ışık mikroskobunda gözlendi (Şekil 4.7). Şekil 4.7 Sıçanlara 24 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), Germinal Merkez ( beyaz ok) x40 24 Brodifacoum uygulanmasından 24 saat sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde kontrol grubuna gore lenfosit sayısında artış gözlenirken, eritrositlerin normalden küçük olduğu gözlendi (Şekil 4.8). Şekil 4.8 Brodifacoum uygulandıktan 24 saat sonar hematoksilen ile boyanan dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki eritrositler ve makrofajlar Eritrositler (beyaz ok), Makrofaj (çift beyaz ok) x1000 Brodifacoum uygulanmasından 24 saat sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde bağışıklığın belirtisi olarak primer foliküllerin yanı sıra germinal merkezlerin belirginleştiği gözlendi (Şekil 4.9). Şekil 4.9 Sıçanlara 24 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD 4 grubunun dalak yapısı Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), Germinal Merkez (beyaz daire), primer folikül (beyaz ok). x40 25 Brodifacoum 24 saat uygulanmış sıçanların dalaklarındaki beyaz pulp bölgesinde kontrol grubuna göre CD4 T lenfosit hücrelerin de şekil bozulmalarının meydana geldiği ve sayılarında azalma olduğu gözlendi (Şekil 4.10). Şekil 4.10 Sıçanlara 24 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD4 grubunun dalağındaki beyaz pulp yapısı CD4 lenfositler (beyaz ok), Makrofaj (çift siyah ok). x1000 26 Brodifacoum uygulanmış 24 saatlik sıçanların dalak örneklerinde kırmızı ve beyaz pulp bölgelerinin belirgin olduğu gözlendi. Çok sayıda yeni gelişen primer folikül ve bir kaç tane sekonder foliküle ( germinal merkez) rastlandı (Şekil 4.11). Şekil 4.11 Brodifacoum uygulanan 24 saatlik CD 8 sıçan grubunun genel görünümü Kırmızı pulp bölgesi (KP), Beyaz pulp bölgesi (BP), Primer foliküller (Beyaz ok), germinal merkez (beyaz daire) x 40 24 saatlik Brodifacoum CD8 grubunun dalaklarındaki kırmızı pulp bölgesinde CD8 sitotoksik T lenfositlerinin morfolojilerinin kontrol grubundakine göre yuvarlak şekilden üçgen ya da beşgen şekline dönüştüğü ve diğer hücrelere göre azaldığı gözlendi (Şekil 4.12). Şekil 4.12 Brodifacoum uygulandıktan 24 saat sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki CD8 T lenfositleri ve diğer hücreler CD8 T lenfositleri (beyaz ok). x1000 27 Deney gruplarından ikincisi olan 72 saat Brodifacoum uygulanmış sıçanların dalak örnekleri hem hematoksilen ile boyandı hem de CD8 ve CD4 antikor boyalarıyla boyandı. Brodifacoum uygulamasından 72 saatte sonra sıçandan alınan dalak örneğinde primer ve sekonder foliküllerin varlığı ve çaplarının genişliği dikkat çekti (Şekil 4.13). Şekil 4.13. Sıçanlara 72 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), Sekonder folikül (beyaz ok) x40 Brodifacoum uygulanmasından 72 saat sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde eritrositlerin lenfositlere gore daha çok olduğu ve normal yapılarından küçük oldukları gözlendi (Şekil 4.14). Şekil 4.14. Brodifacoum uygulandıktan 72 saat sonar hemotoksilen ile boyanan dalaklarda kırmızı pulp bölgesi Eritrositler (beyaz ok), makrofaj (çift siyah ok) x1000 28 Brodifacoum uygulanmasından 72 saat sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde kapsülle yakın bölgelerde küçük çaplı primer foliküller görünürken sekonder foliküllere rastlanmadı (Şekil 4.15). Şekil 4.15. Sıçanlara 72 saat Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD4 grubunun dalak yapısı Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), primer folikül (beyaz ok). x40 Brodifacoum 72 saat uygulanmış sıçanların dalak örneklerinde CD4lerin kontrol grubuna gore çaplarının küçülüp farklı şekillerde olduğu gözlendi. Aynı zamanda CD4 dışında hücrelerin sayısının az oldugu dikkati çekti (Şekil 4.16). Şekil 4.16 72 saatlik Brodifacoum uygulanmış dalakta kırmızı pulp bölgesi CD4 T lenfositleri (beyaz ok). x 1000 29 Brodifacoum uygulanmış 72 saatlik sıçanların dalak örneklerinde germinal merkez çaplarının geniş olduğu gözlendi (Şekil 4.17). Şekil 4.17 Brodifacoum uygulanan 72 saatlik CD 8 sıçan grubunun genel görünümü Kırmızı pulp bölgesi (KP), Beyaz pulp bölgesi (BP), sekonder foliküller (Beyaz daire), primer folikül (beyaz ok) x40 72 saatlik Brodifacoum CD8 grubunun dalaklarındaki diğer hücrelerin azaldığı CD8lerin şekil değişikliğine ugrayıp irili ufaklı olduğu ve makrofajların fazla sayıda olduğu gözlendi (Şekil 4.18). Şekil 4.18 Brodifacoum uygulandıktan 72 saat sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki CD4 T lenfositleri ve diğer hücreler CD4 T lenfositleri (beyaz ok), Makrofajlar (M). x1000 30 Deney gruplarından üçüncüsü olan 14 gün Brodifacoum uygulanmış sıçanların dalak örnekleri hem hematoksilen ile boyandı hem de CD8 ve CD4 antikor boyalarıyla boyandı. Kontrol, 24 saat, 72 saatlik deneylerde ki dalak yapılarına göre bağışıklığın en yoğun olduğu 14.günde dalakta primer ve sekonder foliküllerin organın tamamını kapladığı gözlendi (şekil 4.19). Şekil 4.19 Sıçanlara 14 gün Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), Primer folikül (beyaz ok), Sekonder folikül (beyaz daire) x40 Brodifacoum uygulanmasından 14 gün sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde lenfositlerle aynı büyüklükte olması gereken eritrositlerin, kontrol grubuna gore giderek küçüldüğü gözlendi (Şekil 4.20). Şekil 4.20 Brodifacoum uygulandıktan 14 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki eritrositler, makrofajlar, lenfositler Eritrositler (beyaz ok) x1000 31 Brodifacoum uygulanmasından 14 gün sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde yer yer dokuda erimeler ve hücre gruplarına rastlandı (Şekil 4.21). Şekil 4.21 14 günlük Brodifacoum uygulanmış dalağın genel görüntüsü Kırmızı pulp bölgesi (KP), Doku kaybı (yıldız) .x 40 Brodifacoum 14 gün uygulanmış sıçanların dalaklarındaki beyaz pulp bölgesinde kontrol grubuna göre CD4’ lerin üçgen veya dikdörtgen şekillerine değiştiği gözlendi hatta zaman zaman birbirleriyle şekillerinin tamamen bozulduğu kaynaştığı gözlendi (Şekil 4.22). Şekil 4.22 Brodifacoum uygulandıktan 14 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki CD4 T lenfositleri ve diğer hücreler CD4 T lenfositleri (beyaz ok), birbirleriyle kaynaşmış CD4 T lenfositleri (beyaz daire) x1000 32 Bağışıklığın yüksek olması beklenen 14.günde germinal merkezlerin bol sayıda olması gerekirken doku harabiyeti dikkati çekti (Şekil 4.23). Şekil 4.23 Brodifacoum uygulanan 14 günlük CD 8 sıçan grubunun genel görünümü Kırmızı pulp bölgesi (KP), Beyaz pulp bölgesi (BP), Doku harabiyeti (beyaz ok), primer folikül (beyaz daire). x40 Brodifacoum uygulamasından 14 gün sonra sıçandan alınan dalak örneğinde CD8lerin az sayıda olduğu, şekil değişikliğine uğrayarak küçüldüğü ve gruplar oluşturduğu dikkati çekti.Buna karşılık CD8lerin dışındaki hücrelerin sayıca fazla olduğu dikkati çekti (Şekil 4.24). Şekil 4.24 Brodifacoum uygulandıktan 14 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki CD4 T lenfositleri ve diğer hücreler CD4 T lenfositleri (beyaz ok), x1000 33 Deney gruplarından dördüncüsü ve sonuncusu olan 30 gün Brodifacoum uygulanmış sıçanların dalak örnekleri hem hematoksilen ile boyandı hem de CD8 ve CD4 antikor boyalarıyla boyandı. Brodifacoum uygulamasından 30 gün sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde kontrol grubu gibi dalakta primer ve sekonder folüküller az sayıda olduğu gözlendi (Şekil 4.25). Şekil 4.25 Sıçanlara 30 gün Brodifacoum uygulandıktan sonraki hematoksilen ile boyanan sıçan dalağının genel görüntüsü Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), Primer folikül (beyaz ok) x40 Brodifacoum uygulanmasından 30 gün sonra sıçanlardan alınan dalak örneğinde çok sayıda lenfosit, lenfositlere gore az sayıda şekilleri bozuk birbirine yapışmış eritrositler gözlendi (Şekil 4.26). Şekil 4.26 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki eritrositler, makrofajlar, lenfositler Eritrositler (beyaz ok), Makrofaj (beyaz daire) x1000 34 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonra iyileşmenin olup olmadığını tespit etmek amacıyla dalak örnekleri incelendi. Dalağın genel görüntüsünde germinal merkezlerin yok denecek kadar azaldığı buna karşılık irili ufak çaplı primer foliküllerin çok sayıda olduğu iyileşmenin belirtisi olarak düşünüldü (Şekil 4.27). Şekil 4.27. Sıçanlara 30 gün Brodifacoum uygulandıktan sonraki CD4 grubunun dalak yapısı Kırmızı pulp (KP), Beyaz pulp (BP), primer folikül (beyaz ok). x40 Brodifacoum uygulanmasından otuz gün sonra kırmızı pulp bölgesinde kontrol grubunda olduğu gibi CD4 T lenfositlerinin yuvarlak şekilli ve hepsinin yaklaşık aynı boyutta olduğu gözlendi.Bu durumun geriye doğrıu bir iyileşmenin belirtisi olduğu düşünüldü (Şekil 4.28). Şekil 4.28 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki CD4 T lenfositleri ve diğer hücreler CD4 T lenfositleri (beyaz ok), Makrofajlar (beyaz daire) x1000 35 Brodifacoum uygulanmış 30 günlük sıçanların dalak örneklerinde iyileşmenin belirtisi olarak az sayıda folikül gözlendi (Şekil 4.29). Şekil 4.29 Brodifacoum uygulanan 14 günlük CD 8 sıçan grubunun genel görünümü Kırmızı pulp bölgesi (KP), Beyaz pulp bölgesi (BP) x40 Brodifacoum uygulamasından 30 gün sonra sıçandan alınan dalak örneğinde CD8lerin kontrol grubuna yakın boyutlarda olduğu ve yine kontrol grubundaki gibi hücrelerle aynı şekilde olduğu gözlendi (Şekil 4.30). Şekil 4.30 Brodifacoum uygulandıktan 30 gün sonraki dalaklarda kırmızı pulp bölgesindeki CD4 T lenfositleri ve diğer hücreler CD4 T lenfositleri (beyaz ok), Makrofajlar (beyaz daire). x1000 36 Brodifacoum’un CD8 ve CD4 lenfosit hücre sayıları üzerinde ki etkisi aşağıdaki tablolarda verilmiştir. Çizelge 4.1 Brodifacoum uygulanmış sıçan gruplarında yardımcı T lenfositleri (CD4) hücre sayısı. Konrol grubu CD4 88,25 24 saat CD4 grubu 63,75 72 saat CD4 grubu 133,33 14 gün CD4 grubu 125 14 gün CD4 grubu 97,08 Çizelge 4.2 Brodifacoum uygulanmış sıçan gruplarında sitotoksik T lenfositleri (CD8) hücre sayısı. Konrol grubu CD8 90,33 24 saat CD8 grubu 65,83 72 saat CD8 grubu 120 14 gün CD8 grubu 100 14 gün CD8 grubu 117,5 Çizelge 4.1- 4.2'de de görüldüğü gibi Brodifacoumun T lenfosit çeşitlerine etkisi bakımından CD4 ve CD8’lerin aynı oranda arttığı tespit edildi. 37 5. TARTIŞMA İkinci nesil rodentisitlerden brodifacoum’un sıçan dalağına 24 saatlik, 72 saatlik, 14 günlük ve 30 günlük toksik etkisi histokimyasal yönden ışık mikroskobunda incelendi. Guo vd. (2003) tavukların bağışıklık sistemini güçlendirmek amacıyla tavuklara βglukanı oral yoldan uygulamışlardır. β-glukan yemlerde katkı maddesi olarak kullanılan bir glikoz polimerdir. Araştırma sonucunda tavuklardaki makrofajların etkisinin, antikor miktarının ve lenfoproliferatif yanıtın arttığını rapor etmişlerdir. İntestinal intraepitelyal lökositlerdeki yardımcı T Lenfositleri (CD4), Sitotoksik T lenfositlerinin (CD8) çoğaldığını ve CD4/CD8 yüzdesinin arttığını, bunun yanı sıra bursa fabricious, timus ve dalak gibi primer ve sekonder lenfoid organların kontrol grubuna göre ağırlıklarının arttığını öne sürmüşlerdir (Guo vd. 2003). Çalışmamızda sıçanlara uyguladığımız brodifacoumun kontrol grubuna göre deney gruplarındaki sıçanların dalak ağırlıklarında azalmaya sebep olduğu yönüyle Guo vd. (2003) çalışma sonuçlarına ters düşmüştür. Ayrıca araştırmamızda kontrol grubuna göre CD 4 ve CD 8 lenfosit sayısında artışın olması benzer bir durum göstermiştir. Ateş vd. (2005) yaptığı araştırmada, Ailesel Akdeniz Ateşi hastalarında T ve B lenfosit sayılarında ve bazı sitokinlerin salınımındaki değişiklikleri incelemişlerdir. Ailesel Akdeniz Ateşi olan hastalarda lenfosit alt gruplarında bir değişiklik olup olmadığını ortaya çıkarmak için yaptıkları ölçümlerde, remisyon ve atak dönemlerinde lenfosit alt gruplarında istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler saptamışlardır. Total lenfosit popülasyonu içindeki CD8 T lenfosit, aktive T lenfosit (CD3HLA DR) ve CD4/CD8 oranı kontrol grubuna göre düşük, CD4 T lenfosit oranı ise yüksek tespit etmişlerdir. Ancak remisyon dönemindeki CD4 T lenfosit oranı kontrol grubuna göre anlamlı yüksek saptanırken, CD8 T lenfosit oranı remisyon ve atak dönemlerinde kontrol grubuna göre anlamlı düşük saptanmıştır. Her ne kadar lenfosit alt grup oranlarında farklılık tespit edilmiş olsa da, bu farklılıklar normal kabul edilen sınırlar içerisinde olduğunu gözlemlemişlerdir (Ateş vd. 2005). Yapılan bu araştırmada ise hem CD 4 hem de CD8 lerin sayısal artışları aynı oranda olmuştur. 38 Viral enfeksyonlardan bağışıklık sistemi değişik şekillerde etkilenmektedir. Sprent ve Webb’in (1987) fareler üzerinde yaptıkları araştırmaya göre viral enfeksiyonlarda hem CD4 hem de CD8 rol almaktadır. Virüslerin farelerde CD4 T lenfositleri ve B lenfositleri uyararak antikor sentezine neden olduğunu bildirmişlerdir. CD8 T lenfositlerinin ise hem doğrudan virüse zarar verdiğini hem de virüs yanında virüsün infekte ettiği hücrelere zarar verdiğini rapor etmişlerdir (Sprent ve Webb 1987). Çalışmamızda CD8 T lenfositlerinin CD4 T lenfositlerine göre brodifacouma karşı daha etkin olduğu Sprent ve Webb (1987)’in sonuçlarıyla benzerlik göstermektedir. Thomas vd. (1982) akut tip hepatit virüslü hastalarda baskılayıcı T lenfositlerinin konsantrasyon artışına bağlı olarak sitotoksik T/baskılayıcı T lenfositi sayısının azaldığını bildirmişlerdir. Bizim çalışmamızda Sitoksik T lenfositlerinin brodifacoumun uygulandığı sürelerde (24 saat, 72 saat, 14 gün ve 30 gün ) sayısal olarak artış göstermesiyle Thomas vd. (1982) diğerlerinin elde ettikleri bulgularla uyumlu değildir. Koşar vd. (1995) hemodiyalizli anti-HCV (Hepatit C virüsüne karşı vücut tarafından oluşturulan antikor) pozitif hastalarla çalışmışlar ve bu hastaların lenfosit sayılarında büyük bir değişiklik olmadığını ayrıca CD8:CD4 oranının düştüğünü tespit etmişlerdir. Normalde 2 civarında seyreden CD4:CD8 oranının 1.5 altına inmesi bu hastalarda immün yetersizliğe neden olmaktadır (Koşar vd. 1995). Brodifacoum uygulanan sıçanlarda CD8:CD4 oranının 1 olması bakımından Koşar vd. (1995), bulgularıyla benzerlik göstermediği anlaşılmıştır. Fisher vd. (2011), Güney Yeni Zellanda da brodifacoum içeren yemlerin taşınırken göle döküldüğünü tespit etmişlerdir. Aylar sonra göl canlılarında; sedimentlerde, bentik omurgasızlarda, yılan balığı örneklerinde brodifacoum kalıntılarına rastlanmıştır. Bu göl canlılarda antikoagülant zehirlenmesine bağlı olarak iç kanama gözlemlemişlerdir. Yaptığımız deneysel çalışmamızda da bazı hayvanların iç kanamadan ölmesi Fisher vd. (2011) tespit ettiği bulgularla uyum halinde olduğu düşünüldü. 39 Littin vd. (2000), Norveç sıçanları ve keseli sıçanlara brodifacoum uygulamışlardır. Yapılan denemeler sonunda brodifacoumun tek dozunun bile toksik etki yarattığını ve dolayısıyla deney hayvanlarında davranış bozukluklarının, patalojik değişikliklerin olduğunu ve çoğunun da iç kanamadan öldüğünü tespit etmişlerdir. Buna benzer bulgular Lechevin ve Vigıe (1992) yaptığı araştırmada da elde edilmiştir. Araştırıcılar, 20 köpeğe brodifacoumun ölümcül dozu (LD50 0,25) 0,14 mg/kg uygulamışlar ve köpeklerin iç kanamadan dolayı öldüğünü tespit etmişler. Brodifacoum uygulanan bir grup köpeğede 2 mg/kg K vitamini vererek hayvanların iyileştiklerini rapor etmişlerdir (Lechevin ve Vigie 1992). Brodifacoumun 0.2 mg/kg’lık dozunun benzer şekilde sıçanlara etki ettiğini yaptığımız Yüksek Lisans Tez çalışmasında da tespit edildi. Yapılan bu tez çalışmasıyla brodifacoumun hücresel düzeyde hasar verici etkisinin histokimyasal olarak mikroskobik yönden tespit edilmesi hem brodifacoum ile yapılan araştırmalara destek olacağı hem rodentlerle yapılan mücadelelere bilimsel yönden katkı sağlayacağı düşünülmektedir. 40 KAYNAKLAR Ademokun, A.A. and Dunn-Walters, D. 2010. Immune Responses: Primary and Secondary. eLS.. Albert, C.A., Wilson, L.K., Mineau, P., Trudeau, S. and Elliott, JE. 2009. Anticoagulant Rodenticides in Three Owl Species from Western Canada, 1988–2003. Arch Environ Contam Toxicol (2010) 58;451–459. Andrinolo, D., Michea, L.F. and Lagos, N., 1999. Toxic effects, pharmacokinetics and clearance of saxitoxin, a component of paralytic shellfish poison (PSP), in cats. Toxicon 37(3); 447-464.7 Anonymous.2015.http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-amodel/wistar-han-igs-rat, 15.07.2016 Anonymous.2010.http://www.proteinatlas.org/learn/dictionary/normal/spleen, 15.07.2016 Ateş Y., Ergün H., Tüzün A., Bağcı S., Kurt İ. ve İnal A., 2005. Ailesel Akdeniz Ateşi olan hastalarda lenfosit alt grupları ve serum adenozin deaminaz düzeyleri. Akademik Gastroenteroloji Dergisi; 2: 112-16. Aytekin, Y. ve Solakoğlu S., 2006. Temel Histoloji. Nobel Tıp Kitap Evleri, s.332-334 İstanbul. Basehore L.M. and Mowry J.M., 1987. Death following ingestion of superwarfarin rodenticide: a case report. Vet Hum Toxicol 1987;29:459 Binks S. and Davies P., 2007 Case of the month: "Oh! Drat!--A case of transcutaneous superwarfarin poisoning and its recurrent presentation". Emerg Med J. 2007 Apr;24(4):307-8. Bohnsack, J.F. and Brown, E.J. 1986. The Role of the Spleen in Resistance to Infection. Annual Review of Medicine 37;49-59. Breckenridge, A.M., Cholerton, S., Hart, J.A., Park, B.K. and Scott, A.K. 1985. A study of the relationship between the pharmacokinetics and the pharmacodynamics of the 4-hydroxycoumarin anticoagulants warfarin, difenacoum and brodifacoum in the rabbit. Br J Pharmacol. 84(1);81-91. Cesta, F.M., 2006. Normal Structure, Function, and Histology of the Spleen. Toxicologic Pathology 34; 455-465. Deniz, G. 2007., T, B, NK Hücrelerin Değerlendirilmesinde Pratik Yaklaşımlar. Türkiye Klinikleri J Int Med Sci 2007;3(43):18-25 41 Direskeneli G., 2013. T hücre gelişimi ve İşlevleri (Hücresel İmmün Yanıt). Bağışıklık sistemi ve Yetersizlikleri Sempozyumu (Sempozyum no:80) 6-7 Mayıs 2013, Bildiri Özeti Kitabı 41-46, İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, İstanbul. Dubock, A.C., and Kaukeinen, D.E., 1978. Brodifacoum (Talon™ rodenticide) a novel concept. In: Proceedings Eighth Vertebrate Conference (R.E. Marsh ed.), Sacramento, California, pp 127-137. Eason, C.T., Murphy, E.C., Wright, G.R.G. and Spurr E.B. 2002. Assesment of risks of brodifacoum to non-target birds and mammals in New Zealand. Ecotoxicology, 11 (2002), pp.35-48. El-Daly, A.A. and Nassar, S.A. 2014. Anticoagulant Difenacoum-induced Histological and Ultrastructurcal Alterations in Liver of Albino Rats. International Journal of Advanced Research 2(2);782-792. Elliott, J.E., Hindmarch, S., Albert, C.A., Emery, J., Mineau, P. and Maisonneuve, F. 2014. Exposure pathways of anticoagulant rodenticides to nontarget wildlife. Environ Monit Assess 186;895-906. Falchetti, R., Di Francesco, P., Lanzilli, G., Gaziano, R., Casalinuovo, I.A., Ravagnan, G. and Garaci, E. 1995. In Vitro Effects of Cocaine on Cytokine Secretion Induced in Murine Splenic CD4+ T Cells by Antigen-Specific Stimulation. Cellular Immunology 164; 57-64. Falchetti, R., Lanzilli, G., Casalinuovo, I.A., Palamara, A.T., Di Francesco, P., Ravagnan, G. and Garaci, E. 1996. Splenic CD4+ and CD8+ T Cells from Influenza Immune Mice Concurrently Produce in Vitro IL2, IL4, and IFN-γ. Cellular Immunology 170; 222-229. Fisher P., Eason C.T., O’Connor C.E., Lee C.H., Smith G.B. and Endepols S. 2003. Coumatetralyl residues in rats and hazard to barn owls. Australian Centre for International Agricultural Research Canberra p.457-460. Fujitani, T., Tada Y.and Yoneyama M., 2004. Chlopropham-induced splenotoxicity and its recovery in rats. Food and Chemical Toxicology 42; 1469-1477. Guo Y, Ali R.A. and Qureshi M.A., 2003. The influence of β-glucan on immune responses in broiler chicks. Immunopharmacol Immunotoxicol, 25 (3): 461-472. Guthrie and Rufus K. 1972 Food Sanitation. Westport, Conn: AVI Pub. Co, 1972 Hadler, M.R. and Buckle, A.P. 1992. Forty five years of anticoagulant rodenticides – past, presentand future trends. Vertebrate Pest Conference Proceedings collection, Proceedings of the Fifteenth Vertebrate Pest Conference, pp. 149155. Hadler, M.R., Redfern, R.and Rowe, F.P. 1975. Laboratory evaluation of difenacoum as a rodenticide. J Hyg, 74(3), 441-448. 42 Hadler, M.R. and Shadbolt, R.S. 1975. Ovel 4-hydroxycoumarin anticoagulants active against resistant rats. Nature 253;275-7. Helmuth R.A., McCloskey D.W., Doedens D.J. and Hawley D.A. 1989 Fatal ingestion of a brodifacoum-containing rodenticide. Lab Med, 1:25–7 Hollinger BR and Pastoor TP 1993. Case management and plasma half-life in a case of brodifacoum poisoning. Arch Intern Med 1993;153:1925–8 Hunter K. Determination of coumarin anticoagulant rodenticide residues in animal tissue by high performance liquid chromatography. 1. Fluorescence detection using post-column techniques. J Chromatogr 1983;270:267–76. Kieboom A.J. and Rammell C.G. Determination of brodifacoum in animal tissues by HPLC. Bull Environm Contam Toxicol 1981;26:674–8. Kierszenbaum A. 2006. Histoloji ve Hücre Biyolojisi. Palme Yayınları.618. New York. Koşar A.,Dalmaz,Yeksan, Şengil, Duman. Hemodiyaliz hastalarinda total lenfosit, cd4, cd8 ve cd4/cd8 oranina değişik faktörlerin etkileri. Türk Nefroloji Diyaliz ve Transplantasyon Dergisi Official Journal of the Turkish Nephrology, Assosiation 1995; 3:146-150 Kruse J.A. and Carlson R.W. Fatal rodenticide poisoning with brodifacoum. Ann Emerg Med 1992;21:331–6. Kuru M., 2009. Omurgalı Hayvanlar. Palme Yayıncılık, 646, Ankara. Langeveld M., Gamadi, L.E., ten Berge I.J. 2006. T-lymphocyte subset distribution in human spleen. Eur J Clin Invest. 36(4);250-6. Lechevin J.C. ve Vigie A., 1992. Which useful toxcicological information can be drawn from studies on the hepatic fixation of anticoagulant rodenticides. Proceeding of the fifteenth vertebrate pest. Conference paper 45. Litovitz T.L., Felberg L., White S. and Klein-Schwartz W. 1995 annual report of the american association of poison control centers toxic exposure surveillance system. Am J Emerg Med. 1996;14:487–537. Littin K.E., O’Connor C.E. and Eason C.T., 2000. Comparative effects of brodifacoum on rats and posum. New Zealand Plant Protection vol. 53 pp.310-315. Losco P. 1992. Normal Development, Growth, and Aging of the Spleen. In: Pathobiology of the Aging Rat (U. Mohr, D. L. Dungworth and C. C. Capen, eds.), Vol. 1, pp. 75–94. ILSI Press, Washington, D.C. Majerus P.W., Broze G.J. Jr, Miletich J.P. and Tollefsen DM. 1996. Anticoagulant, thrombolytic and antiplatelet drugs. In: Hardman JG, Limbird LE, Molinoff PB, Ruddon RW, Gilman AG, editors. Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed. New York: McGraw-Hill, 1996;1341-59. 43 Meerburg B.G., Brom F.W.A. and Kijlstra A. 2008. "The ethics of rodent control". Pest Manag Sci 64: 1205–11. Mosterd, J.J. and Thijssen, H.H.W. 1991. The long-term effects of rodenticide, brodifacoum, on blood coagulation and vitamin K metabolism in rats. Br J Pharmacol 104;531-5. Neishabouri, E.Z., Hassan, Z.M. and Ostad, S.N. 2003 Humoral and Cellular Immunomodulation Induced by Propoxure in C57-bl/6 Mice. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 3: 41-45. Ray A.C., Murphy M.J., DuVall M.D. and Reagor J.C. 1989. Determination of brodifacoum 1989;50:546–50. Rich, R.R. 2008.The human immune response. Clinical Immunology, Principles and Practice. Elsevier, ABD, 3-17. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne. Kuby Immunology, 4th Edition, Publishers: WH Freeman and Company (2000), 650 http://www.whfreeman.com/immunology, (Amherst College), (NIH, Bethesda), (University of Massachusetts at Amherst). Illustrations: 482. Printed in the USA. ISBN: 0-7167-33315. Sakai, Y., Tanaka M. and Shirakawa M. 2004. Lymphocyte changes in peripheral blood, spleen, and liver in DMBA-induced squamous cell carcinoma of mouse cheek skin. Odontology 92:36-42. Siedelmann S., Kubic V., Burton E. and Schmitz L. 1995. Combined superwarfarin and ethylene glycol ingestion: a unique case report with misleading clinical history. Am J Clin Pathol 1995;104:663–6. Smith, T.F. and Johnston, R.B. Jr. 1979. Functions of the spleen in host defense against infection. Am J Pediatr Hematol Oncol 1(4);355-62. Sprent J. and Webb S.R. Function and specifity of T cell subsets in the mouse. Adv Immunol 1987; 41: 39-133. Standland B.E. and Winkel P. 1978. Physiological variability ofleucocytes in healthy subjects. In: Koepke JA, ed. Differential Leucocyte Counting. Skokie. Illinois: Colloge of American Pathology 1978; 66: 159-162. Stansley W., Cummings M., Vudathala D. and Murphy, L.A. 2013. Anticoagulant Rodenticides in Red-Tailed Hawks, Buteo jamaicensis, and Great Horned Owls, Bubu virginianus, from New Jersey, USA, 2008-2010. Bull Environ Contam Toxicol 92:6-9. Thomas H.C., Brown D., Routhier G., Kung P.C. and Sherlpck S., 1982. Inducer and suppressor T cells in hepatitis B virus induced liver disease. Hepatology 1982; 2 (2): 202-204. 44 Tosh D.G., McDonald R.A., Bearhop S., Lllewellyn N.R, Fee S. and Sharp, E.A., 2011. Does small mammal prey guild affect the exposure of predators to anticoagulant rodenticides? Environ Pollut, 159,pp.3106-3112. Valchev I., Bınev R., Yardanova V., Nıkolov Y., 2008. Anticoagulant rodenticide intoxication in animals- a review. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 32(4):237-243. Van Dam-Mieras M.C.E., Muller A.D., van Dejik, W.A. and Hemker, H.C. 1985. Clotting factors secreted by monocytes and macrophages: Analytical considerations. Thrombosis Reseach 37(1);9-19. Vural, N. ‘Toksikoloji’, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları No: 73, Ankara, 2005 Watts R.G., Castleberry R.P., Sadowski J.A. 1989. Accidental Poisoning With a Superwarfarin Compound (Brodifacoum) in a Child. Pediatrics 86(6);883-887. Weitzel J. N., Sadowski J. A., Furie B. C., Moroose R., Kim H., Mount M.E., Murphy M.J., ve Furie B., 2012. Surreptitious Ingestion of a Long-Acting Vitamin K Antagonist/Rodenticide, Brodifacoum: Clinical and Metabolic Studies of Three Cases. Blood, Vol76, No 12 (December 15). 1990: pp 2555-2559. Zimmerman A. and Matschiner J.T., 1974. Biochemical basis of hereditary resistance to warfarin in the rat. Biochem Pharmacol 23; 1033–1040. 45 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Burcu BAYRAMLI Doğum Yeri : Ankara Doğum Tarihi : 24/09/1990 Medeni Hali : Bekar Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl ) Lise : 75.Yıl Anadolu Lisesi (2007) Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü (2012) Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı (2013 Şubat- Eylül 2016) 46
