SSP 2013 slaytlar

HLA Tiplendirmesi
PCR-SSP
Türker Duman PhD
Büyük Doku Uygunluk Kompleksi
(Major Histocompatibility Complex MHC)
• İlk olarak farklı fare suşlarında deri naklinin reddiyle tanımlanan
genetik bölgedir
• Alloreaktiviteden de sorumlu hücre yüzey glikoproteinlerini
kodlayan bir gen kümesini içerir.
• MHC insanlarda human leukocyte antigens (HLA), olarak da
bilinir ve
– yapısı
– dokulardaki dağılımı
– fonksiyonuna göre sınıflara ayrılır
• HLA A-B-C
•
HLA DR-DQ-DP
MHC Sınıf I
MHC Sınıf II
bölgesinden kodlanmaktadır.
HLA SINIF I
•
Sınıf I molekülleri olan HLA-A HLA-B ve HLA-C benzer özelliklere
sahiptirler ve yan yana 6. kr sıralanmıştırlar.
•
Bu moleküller, bir ağır zincir ve bir hafif zincir (beta-2-mikroglobulin)
oluşan bir heterodimerdir.
•
Beta2 microglobulin başka bir kromozom tarafından kodlanır. 15q21q22.2
•
Ağır zincir zar içinde sabitlenmiştir.
•
Sınıf I molekülleri, endoplazmik retikulum lümeninde türetilen peptidleri
sunarak bağışıklık sisteminde önemli bir rol oynamaktadır.
•
Neredeyse bütün hücrelerde ifade edilir.
•
•
•
•
Ağır zincir, yaklaşık 45 kDa
Kodlayan gen 8 ekson içerir.
Ekson 1 lider peptidi kodlayan,
Ekson 2 ve 3 alfa1 ve alpha2
domainleri
• Ekson 4 alfa3 domaini
• Ekzon 5 transmembran bölge,
• Ekzon 6 ve 7 sitoplazmik kuyruğu
kodlar.
Ekzon 2 ve 3 sınıf I moleküllerinde
peptid bağlama özgünlüğü
sorumludur.
HLA-Sınıf II
DRB1 DQB1 DPB1
•
Hücre dışı proteinlerden oluşan peptidleri sunarak
immün sistemede önemli bir rol oynar
•
Dentritik hücreler, makrofajlar, B lenfositler gibi
antijen sunan hücreler
•
Sınıf II molekülleri, Alfa (DRA) ve Beta (DRB)
zincirlerinden oluşan memrana tutunmuş bir
heterodimerdir
•
DR Beta zinciri peptide bağlanma özgüllüğünü
veren polimorfizmileri içerirr
•
HLA-DRB1, HLA class II beta zincir genlerindendir.
•
•
•
•
•
•
•
Beta zinciri yaklaşık 26-28 kDa. protein kodlar.
6 ekzonu vardır.
Ekon 1 lider peptidi
Ekon 2 ve 3, 2 hücre dışı domaini
Ekon 4 transmembrane domain
Exon 5 sitoplazmik kuyruğu kodlar
Sınıf II allelerinde,pp zincirin birinci domaini kodlayan 2. ekzonlar alel
farklılıklarının büyük kısmından sorumludur. Bu yüzden HLA klas II
tiplendirmesi genellikle 2. ekzondaki farklılıklara odaklanmıştır
• DRB1 kesinlikle bulunur.
• DRB1 alellik varyantları DRB3,
DRB4 and DRB5 genlerinin biriyle
bağlantılı olabilir
• DRB1, DRB3, DRB4 ve DRB5 ten 5
kat fazla eksprese olur
•
6. kromozomun kısa kolunda (6p21.31) yerleşmiş
3.600 kilobazlık bir bölgedir
•
MHC genleri kodominanttır, genlerinin birbirine
yakın olması beraber kalıtılmasına yol açar ve bir
HLA haplotipi oluşturur.
• HLA sistemi bilinen en polimorfik
bölgedir.
HLA Sınıf I Genleri ve Alel
Sayıları
HLA Sınıf II Genleri ve Alel
Sayıları
HLA TİPLENDİRMESİ
• HLA bölgesindeki polimorfizmleri belirlemek
için çeşitli yöntemler kullanılmıştır.
• Terasaki ve Mc Clelland tarafından bulunan
1964 serolojik yöntemler yaklaşık 50 yıldır
kullanılmaktadır
HLA alellerinin belirlenmesinde
kullanılan yöntemler
• Serolojik
– Fazla kan gerekli
– Canlı lenfosit gereklidir
– Farklı toplumlardaki seyrek antijenler
için kaliteli antiserum bulmak zor
olabilmektedir
– Olağanüstü polimorfikliği belirlemede
yetersiz kalması
• Moleküler yöntemler
Moleküler Yöntemler
• En yaygın kullanılan tekniklerdir.
• DNA temellidir
• Serolojik olarak ayırt edilemeyen fakat
fonksiyonel olarak ayrı olan HLA alellerini
tiplendirmek için geliştirilmiştir.
• 1987 yılında Southern Blot ve RFLP yöntemiyle
başlamıştır
• 1990 ların başında PCR tekniğinin
bulunmasından sonra giderek yaygınlaşmıştır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PCR)
• İn vitro klonlama yöntemi olan PCR,
spesifik DNA bölgelerinin çoğaltılarak
üzerinde çalışılmasına olanak vermektedir.
• PCR temelli tiplendirme yöntemleri
– Hızlı,
– Güvenilir
– Düşük ya da yüksek çözünürlükte tiplendirme
yapabilir
– Kolay uygulanabilir ve tekrarlanabilir
PCR
Basamaklar
• Denatürasyon
• Bağlanma
• Uzama
•
•
•
•
•
Bileşenleri
DNA
Primer çifti
dNTP ler
Taq Polimeraz
Tampon (uygun pH
ve iyon (Mg+2))
PCR sayesinde 35 döngü sonunda yaklaşık 68
milyar kopya oluşabilmektedir
PCR- SSP (Sequence Specific
Primer)
• PCR-SSP incelenen lokusta, alele özgü primerler kullanılarak
amplifikasyonun varlığını araştıran bir yöntemdir.
• Alele-özgü PCR veya amplification refractory mutation system
(ARMS) olarakta bilinir
• HLA üzerindeki polimorfik DNA dizileri, amplifikasyon primerleri
olarak kullanılır.
• Primer çiftinin bir tanesi genetik olarak korunmuş diziye uygunken,
diğer primer hedeflenen alele özgü baz değişikliğini 3’ ucunda
taşıyacak şekilde sentezlenir.
• Burada primerin 3’ ucu hedeflenen dizideki komplementer baza
özgüdür.
• İpliğin polimeraz tarafından uzatması için primerin 3’ ucunun kalıba
sıkıca bağlanmış olması gerekmektedir.
• Bu durumda sadece hedef polimorfik diziyi taşıyan aleller çoğalır.
PCR-SSP
• İncelenen örnekte primere
özgü dizi yoksa PCR
gerçekleşmez.
• Her tüpte PCR ı kontrol etmek
amacıyla her örnekte
çoğalması gereken (insan
büyüme hormonu geni) bir çift
primer, internal kontrol olarak
kullanılır.
• Kontrol primerlerinin
konsantrasyonu spesifik
primerlerden düşüktür
• Bir çok allelin bulunduğu lokusları
tiplendirmek için kitlerde ayrı reaksiyonlarda
bir çok primer seti kulanılır.
• HLA Sınıf I için 2,3. ekzon
• HLA Sınıf II için 2. ekzon
• Bütün reaksiyonların aynı termalcycler
cihazında gerçekleşmesi için primerlerin
bağlanma derecelerinin optimizasyonu gerekir.
• SSP yöntemiyle kullanılan primer setlerine
bağlı olarak düşük yada yüksek çözünürlükte
tiplendirme yapılabilir.
Uygulanışı
DNA İzolasyonu
• Çekirdekli hücrelerden (kan, dalak, lenf gibi) DNA elde edilir.
• DNA izolasyonu için
–
–
–
–
fenol kloroform,
tuzla çöktürme
DNA izolasyon kitleri
Tam otomatik DNA izolasyon cihazları kullanılarak da yapılabilir.
PCR
• HLA alellerin belirlenmesi için ayrı tüplerde hedef alellere özgü
primerler ve internal kontrol primerleriyle PCR yapılır.
– Primerler tüplerde liyofilize halde
– PCR komponentleri (MgCl2, nükleotidler, tampon) ayrı bir tüpte karışım
halinde bulunur,
– Taq Polimeraz ilave edilerek primer ekilmiş tüplere dağıtılır.
– DNA
• PCR tüpleri sıcaklık döngülerini sağlayan termal cycler aletine
konularak genomik DNA nın ilgili bölgesinin çoğaltılması sağlanır.
Elektroforez
– PCR sonrasında agaroz jel elektroforezi yapılır.
– Kuyucuklara yüklenen örnekler uygun voltajda TBE
(Tris Borat EDTA) gibi iletkenliğini sağlayan bir
tampon varlığında yürütülür.
– Agaroz jel ethidium bromide ile boyanır.
Değerlendirme
– Her kuyucukta bir kontrol bandı ve eğer varsa
çoğaltılan diziye özgü PCR ürünü kendi moleküler
ağırlığına uygun yürümüş olarak görülür.
– Pozitif örneklerin kit ile beraber gelen çözümleme
tablosuyla ya da bilgisayar programıyla
değerlendirilmesiyle HLA tiplendirmesi yapılır
1
2
3
4
5
6
7
9
10
11
12
13
14
15
17
18
19
20
21
25
26
27
28
29
33
34
35
36
41
42
43
44
8
M
49
16
M
57
50
58
51
52
53
59
60
61
68
69
Olerup SSP HLA-A-B-DR
M
54
55
56
62
63
64
70
71
72
22
23
24
30
31
32
M
73
74
75
76
77
78
79
80
37
38
39
40
M
81
82
83
84
85
86
87
88
45
46
47
M
89
90
91
48
65
66
67
92
%2 agaroz jel elektorforezi
93
94
95 96
140 V -15dk
1
2
3
4
5
6
7
9
10
11
12
13
14
17
18
19
20
21
26
27
28
29
25
8
M
49
15
16
M
57
22
23
24
M
65
30
31
32
M
73
50
51
52
53
58
59
60
61
66
67
68
69
74
75
76
77
54
55
56
62
63
64
70
71
72
78
79
80
1-24 HLA-A*
24, 33
33
34
35
36
37
38
39
40
M
81
82
83
84
85
86
87
88
25-72 HLA B*
08, 14
41
42
43
44
45
46
47
48
M
89
90
91
92
93
94
95 96
73-96 HLA
DRB1*
01, 03
DRB3
Dikkat edilmesi gerekenler
• Negatif kontrol kullanılmalıdır
• Analiz sırasında çalışılan kitin lot numarası
kontrol edilmelidir.
• Değerlendirme yapılırken internal kontrol
bantlarının olması gerektiği unutulmamalıdır.
• Elektroforez esnasında bir DNA ağırlık
markırının kullanılması önemlidir.
– PCR bantların zayıf veya şüpheli olduğu bazı
durumlarda, bantların DNA ağırlık markırıyla
karşılaştırılarak büyüklüğünün kontrol edilmesi
yanlış pozitifliklere engel olacaktır.
PCR SSP
•
•
•
•
•
Artılar
Canlı hücre gerekmez
Güvenilir
Örnekler aynı gün lab gelmek zorunda
değildir
Diğer yöntemlerle oluşabilen belirsizliklerde
kullanılabilir
Düşük veya yüksek çözürlüklü
Eksiler
• Kaliteli DNA
• Fazla miktarda primer kullanımı zahmetli
olabilmektedir
• Alel dizilerinin bilinmesi gerekli- SBT