bakteri endotoksinlerinin viral aşı üretiminde kullanılan devamlı
advertisement
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAKTERİ ENDOTOKSİNLERİNİN VİRAL AŞI ÜRETİMİNDE KULLANILAN DEVAMLI HÜCRE HATLARINA ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Züleyha ERGÜN MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI YUKSEK LISANS TEZI DANIŞMAN Prof. Dr. HAKAN YARDIMCI 2013 - ANKARA TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAKTERİ ENDOTOKSİNLERİNİN VİRAL AŞI ÜRETİMİNDE KULLANILAN DEVAMLI HÜCRE HATLARINA ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI Züleyha ERGÜN MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI YUKSEK LISANS TEZI DANIŞMAN Prof. Dr. HAKAN YARDIMCI 2013 - ANKARA İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii Ġçindekiler iii Önsöz vi Simgeler ve Kısaltmalar vii ġekiller viii Çizelgeler x Resimler xi 1. GİRİŞ 1 1.1. Endotoksinlerin Genel Özellikleri ve Önemi 2 1.2. Endotoksin AraĢtırmalarının Tarihçesi 4 1.3. Endotoksinlerin Fiziko-Kimyasal Özellikleri 5 1.4. Endotoksinlerin Etki Mekanizması 8 1.5. Endotoksinlerin Tespit Yöntemleri 10 1.6. Hücre Hatları ve Bakteri SuĢları 12 1.6.1. Vero Epitelyal Hücre Hattı 12 1.6.2. Baby Hamster Kidney (BHK-21) Fibroblast Hücre Hattı 13 1.6.3. Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) Epitelyal Hücre Hattı 13 1.6.4. Pseudomonas aeruginosa SuĢu 14 1.6.5. Escherichia coli SuĢu 15 2. GEREÇ VE YÖNTEM 17 2.1. Gereç 17 2.1.1. Bakteri SuĢları 17 2.1.1.1. Pseudomonas aeruginosa SuĢu 17 2.1.1.2. Escherichia coli SuĢu 17 2.1.2. Hücre Hatları 18 2.1.2.1. Vero Epitelyal Hücre Hattı 18 2.1.2.2. Baby Hamster Kidney (BHK-21) Fibroblast Hücre Hattı 18 iii 2.1.2.3. Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) Epitelyal Hücre Hattı 2.1.3. Besiyerleri 18 2.1.3.1. Nutrient Agar 18 2.1.3.2. Nutrient Broth 19 2.1.3.3. Kanlı Agar 19 2.1.3.4. Hücre Üretme Vasatı 19 2.1.4. Tripsin ve EDTA 20 2.1.5. Trypan Blue Boyası 20 2.1.6. LAL Test Kiti 20 2.1.7. ELISA Reader Cihazı ve Kitleri 20 2.1.8. Sarf Malzemeleri 21 2.2. Yöntem 21 2.2.1. P. aeruginosa ve E. coli SuĢlarının Çoğaltılması 21 2.2.2. Mikro API Cihazı ile SuĢların Saflığının Gösterilmesi 21 2.2.3. SuĢların Çoğaltılması 22 2.2.4. Koloni Sayım Yöntemi ile Bakteri Sayımı 22 2.2.5. Endotoksinlerin Açığa Çıkarılması 23 2.2.6. Sterilite Kontrolü 23 18 2.2.7. Jel Klot LAL Testi ile Stok Solüsyonlarında Endotoksinlerin Tespiti 2.2.8. Jel Klot LAL Testi ile Endotoksin Yoğunluğunun 23 Saptanması 2.2.9. Hücre Kültürlerinin Çoğaltılması 24 24 2.2.10. Hücre Üretme Vasatları Ġçerisinde Stok Solüsyonlardan Endotoksinli Seri Dilüsyonların Hazırlanması 25 2.2.11. Hücre Kültürlerinin 96 Gözlü Pleytlere ve Hücre Kültürü Flasklarına Aktarılması 25 2.2.12. 96 Gözlü Pleytler ve Flasklardaki Vasatların Endotoksinli Vasatlar ile DeğiĢtirilmesi 26 2.2.13. Morfolojik DeğiĢikliklerin Saptanması 26 2.2.14. Kristal Viyole Boyama yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre 27 iv Canlılığına Etkisinin Tespiti 2.2.15. Trypan Blue Boyama yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Sayısına Etkisinin Tespiti 28 3. BULGULAR 29 3.1. Bakterilerin Çoğaltılması 29 3.2. Mikro API Cihazı ile SuĢların Saflığının Gösterilmesi 29 3.3. Koloni Sayım Yöntemi ile Bakteri Sayımı 29 3.4. Endotoksinli Stok Solüsyonlarının Sterilite Testleri 30 3.5. Jel klot LAL testi ile Endotoksin Kontrolü 30 3.6. ÇalıĢmada Kullanılacak Dilüsyon Basamaklarının Belirlenmesi 31 3.7. Hücre Hatlarının Endotoksinle Muamele Öncesi Sayısal Değerleri 31 3.8. Hücre Morfolojisindeki DeğiĢiklikler 32 3.9. Kristal Viyole Boyama Yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Canlılığına Etkisinin Tespiti 34 3.10. Trypan Blue Boyama Yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Sayısına Etkisinin Tespiti 37 4. TARTIŞMA 42 5. SONUÇ 49 ÖZET 51 SUMMARY 53 KAYNAKLAR 55 v ÖNSÖZ Bakteriyal endotoksinler hücre kültürlerinde kullanılan ana materyallerin sıkça rastlanan kontaminantlarıdır. Bu endotoksinler çeĢitli sebeplerle su, serum ve vasatlara karıĢtığında biyolojik maddelerin kalitesini olumsuz etkileyebildiği bilinen bir gerçektir. Bunun baĢlıca sebebi olarak, özellikle aĢı hazırlamada kullanılan hücre kültürlerinde meydana getirdiği toksik etki, ve sulandırma sıvılarına karıĢması durumunda da kullanıcıya olan etkisi gösterilebilir. Bu çalıĢmada, bakteri endotoksinlerinin varlıkları Jel klot LAL testi ile tespit edilerek, aĢı üretiminde kullanılan Vero, MDBK, BHK-21 gibi hücre hatlarına etkilerinin deneysel olarak araĢtırılması ve bunun yanı sıra, çalıĢma süresince hücre hatlarında meydana gelen sayısal ve morfolojik değiĢikliklerin belirlenmesi ve kıyaslanması hedeflenmiĢtir. Bu tezin konusunun ortaya çıkmasında katkısı bulunan ve tezin her aĢamasında beni tüm içtenliği ile destekleyen ve değerli önerileri ile bana yön veren danıĢman hocam Sayın Prof. Dr. Hakan YARDIMCI'ya ve Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı Sayın Prof. Dr. Serdar DĠKER'e, Yüksek Lisans eğitimim ve tez çalıĢmam boyunca bilgi tecrübe ve önerilerinden yararlandığım Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyeleri Sayın Prof. Dr. Müjgan ĠZGÜR, Sayın Prof. Dr. Mehmet AKAN'a ve Sayın Doç. Dr. BarıĢ SAREYYÜPOĞLU'na, ve Tez Savunmasındaki olumlu katkılarından dolayı Viroloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Doç. Dr. Taner KARAOĞLU'na; Tez çalıĢmam süresince manevi desteklerini esirgemeyen, çalıĢma ortamı hazırlayan, bilgi, tecrübe ve önerilerinden yararlandığım Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Viral AĢı Üretim Laboratuvarı ġefi Sayın Dr. Özden KABAKLI'ya, tez çalıĢması boyunca benden yardımlarını esirgemeyen, özveri ile yanımda olan değerli çalıĢma arkadaĢlarıma, ayrıca çalıĢmalarım sırasında sonsuz özveri ile yanımda olan sevgili annem Emine ERGÜN'e ve kardeĢlerime teĢekkürü bir borç bilirim. vi SİMGELER VE KISALTMALAR MDBK : Madin Darby Bovine Kidney BHK-21 : Baby Hamster Kidney – 21 LAL : Limulus Amebocyte Lysate E. coli : Escherichia coli P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa Gram (-) : Gram Negatif Bakteri LPS : Lipopolisakkarit EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid EU/kg/sa : Endotoksin Unit / kilogram / saat tNF : Tümör Nekrozis Faktör kDA : Kilodalton °C : Santigrat derece Lip A : Lipit A KDO : 3- deoksi-D-manno-2 oktulosonik asit MDCK : Madin Darby Canine Kidney FT-IR : Kırmızı altı spektrometresi NMR : Nükleer Manyetik Rezonans Mm : Milimetre Dk : Dakika M : Molar Ng/ml : Nanogram / mililitre µm : Mikrometre µl : Mikrolitre OD : Optik Dansite Gr : Gram Yy : Yüzyıl GMP : Good Manufacturing Practice FCS : Fötal Kan Serumu vii ŞEKİLLER Şekil 1. Lipopolisakkaritlerin yapısı Şekil 2.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ Vero hücresinde tespit edilen ELISA sonuçları Şekil 2.B. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücresinde tespit edilen ELISA sonuçları Şekil 2.C. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücresinde tespit edilen ELISA sonuçları Şekil 3.A. E. coli endotoksini uygulanmıĢ Vero hücresinde tespit edilen ELISA sonuçları Şekil 3.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücresinde tespit edilen ELISA sonuçları Şekil 3.C. E. coli endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücresinde tespit edilen ELISA sonuçları Şekil 4.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre kültürünün 1 ml’sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Şekil 4.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre kültürünün 1 ml’sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Şekil 5.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre kültürünün 1 ml’sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Şekil 5.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre kültürünün 1 ml’sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Şekil 6.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücre kültürünü 1 ml’sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Şekil 6.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücre kültürünün 1 ml’sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları viii ÇİZELGELER Çizelge 1. ÇeĢitli maddelerde kabul edilebilir endotoksin konsantrasyonları Çizelge 2. Jel Klot LAL test protokolüne göre testin değerlendirmesi Çizelge 3. P. aeruginosa ve E. coli için bakteri sayım sonuçları Çizelge 4. Vero hücresinde canlı/ölü hücre sayıları ve toplam hücre sayısına göre yüzdesi Çizelge 5. MDBK hücresinde canlı/ölü hücre sayıları ve toplam hücre sayısına göre yüzdesi Çizelge 6. BHK-21 hücresinde canlı/ölü hücre sayıları ve toplam hücre sayısına göre yüzdesi ix RESİMLER Resim 1: (A) P. aeruginosa (10-1 dilüsyon) endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattının görüntüsü x 100. (B) Vero hücre kontrol x 100. Resim 2: (A) E. coli (10-1 dilüsyon) endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattının görüntüsü x 100. (B) Vero hücre kontrol x 100. Resim 3: (A) P. aeruginosa (10-1 dilüsyon) endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre hattının görüntüsü x 100. (B) MDBK hücre kontrol x 100. x 1 1. GİRİŞ Endotoksinler Gram negatif bakterilerin dıĢ membranından köken alan, bakteri Ģeklinin organizasyonu ve stabilitesinden sorumlu, lipopolisakkarit olarak bilinen moleküllerdir (Joiner ve ark., 2002; Ryan, 2004). Farmasötik endüstrilerinde üretim süreçleri boyunca veya final üründe endotoksinleri bulmak mümkündür. Her ne kadar endotoksinler bakteri hücre duvarına bağlı bulunsalar da, çevreye sürekli salınırlar. Bu salınım, sadece bakteri ölümü ile değil, aynı zamanda üreme ve bölünme sırasında da meydana gelir. Bakteriler su, tuz ve tampon gibi zayıf besleyiciliğe sahip ortamlarda da üreyebildiğinden, endotoksinler hemen hemen her yerde bulunurlar. Tek bir Escherichia coli, hücre baĢına yaklaĢık 2 milyon lipopolisakkarit (LPS) molekülü içerir. Endotoksinler pek çok değiĢik fizyopatolojik etkilere sahiptir. Organizma LPS‟lere fazla miktarda veya sistematik olarak (LPS kan dolaĢım sistemine küçük miktarlarda sürekli girdiğinde) maruz kaldığında sistemik bir yangısal reaksiyon meydana gelebilir ve bu da endotoksin Ģoku, doku hasarı ve ölüm gibi çoklu fizyopatolojik etkilere sebep olabilir (Anspach, 2001; Ogikuba ve ark., 2004). Bununla birlikte, endotoksinler hücre ve organlara direkt etki etmezler (Heilman, 1965; Heilman, 1968), bunun yerine immun sistemin aktivasyonu, özellikle de monosit ve makrofajlar baĢta olmak üzere immun sistem hücrelerinin aktive edilmesi ve dolayısıyla immun yanıtın artırılması ile etki gösterirler. Bu hücrelerin sentezledikleri maddeler özellikle tümör nekroz faktörü (tNF), birçok interlökinler, prostoglandinler, koloni sitümüle edici faktörler, trombosit aktive edici faktör ve serbest radikaller gibi mediyatörlerdir (Forehand ve ark., 1989; Rietschel ve ark., 1994). Memelilerde endotoksinlerin düĢük konsantrasyonlarının bile (1ng/ml) intravenöz enjeksiyonunu takiben pirojenik reaksiyonları ve Ģoku indüklediği bildirilmiĢtir (Fiske ve ark., 2001; Magalhães ve ark., 2007). Endotoksinler, yoğunluklarına bağlı olarak, farklı hücre hatları ve hücre kültürleri üzerine oldukça değiĢken toksik etki gösterebilmektedir (Dawson, 1998; 2 Ryan, 2002). Endotoksinler, su, serum ve vasatlara karıĢtığında aĢıların kalitesini olumsuz etkileyebilir (Geier ve Geier, 2002). Bunun baĢlıca sebebi olarak, özellikle aĢı hazırlamada kullanılan hücre kültürlerinde meydana getirdiği toksik etki, ve sulandırma sıvılarına karıĢması durumunda da kullanıcıya olan etkisi gösterilebilir (David ve Mark, 2002). Laboratuvar çalıĢmalarında ve biyolojik ürünlerin endotoksin ile kontaminasyonu sonucunda; zaman ve para kaybının yanı sıra, hücre kültürü üzerine olumsuz etkileri, deney sonuçlarının yanlıĢ ve hatalı olması, değerli ürünlerin kaybı ve/veya personel iĢ gücü kaybı görülebilir (Ryan, 2002). Bu olumsuzlukların önüne geçmek için, GMP (Ġyi Üretim Uygulamaları) laboratuvar Ģartlarının bir maddesi, endotoksin varlığının tespit edilmesi gerektiğini vurgulamaktadır. Dolayısıyla endotoksinlerin laboratuvar çalıĢmalarında ve biyolojik ürünlerde tespit edilmesi çok önemlidir. Endotoksinden kaynaklanan kontaminasyon tamamen elimine edilmeyebilir, fakat hem olayların sıklığını hem de kontaminasyon sonuçlarının ciddiyetini azaltmak için özellikle aĢı ve biyolojik ürün üretim safhası iyi yönetilebilmelidir (Ryan, 2004). 1.1. Endotoksinlerin Genel Özellikleri Endotoksinlerin boyutu yaklaĢık 10 kDa - 1.000 kDa arasındadır (Bui, 2012). Birimi Endotoksin Unit (EU)‟tir. Sıcağa dayanıklıdırlar. 60°C‟ın üzerinde dahi toksik etkilerini kaybetmeden saatlerce dayanabilmektedirler. Interleukin-1 ve diğer mediyatörlerin salınmasıyla konakta ateĢ yaparlar. Dolayısıyla pirojendirler (Bates ve ark., 1998). OluĢturdukları immünojenite zayıftır ve bunlara karĢı oluĢan immun yanıt toksini nötralize etmekte yetersiz kalır. Formaldehitle muamele edilince toksoid elde edilmez (Bui, 2012). Endotoksinlerin toksisitesi zayıftır, nadiren öldürücüdürler fakat endotoksin miktarı artıkça septik Ģok gibi ölümcül sonuçlar doğurabilirler. Her 3 hücrede endotoksinlere ait spesifik reseptör bulunmaz. Lipopolisakkaritler bakterilerin kromozomal genleri tarafından yönetilirler ve antijenik kodları sadece kromozomlardadır. Ġntravenöz olarak uygulanan biyolojik ve farmasötik ürünlerde, uygulama sırasında organizmanın alabileceği maksimum endotoksin seviyesi tüm farmakopilerde 5 endotoksin ünitesi (EU)/kg/saat olarak belirlenmiĢtir. Buradaki EU terimi, bir endotoksinin biyolojik aktivitesini tanımlamaktadır. Bu eĢik değerinin geçilmesi biyolojik araĢtırmaların ve farmasötik endüstrinin her zaman bir sorunu olmuĢtur (Berthold ve Walter, 1994; Petsch ve Anspach, 2000). Endotoksinlerin oldukça stabil moleküller olmaları ve dolayısı ile aĢırı sıcaklık ve pH değerlerine dayanıklı olmaları sebebiyle, bunları ortamdan uzaklaĢtırmak için pek çok teknik geliĢtirilmiĢtir. Bunlar arasında 2 fazlı ekstraksiyonlar, ultra filtrasyon, hidrofobik etkileĢim kromotografisi, iyon değiĢim kromotografisi ve membran absorbanlarının kullanılması yer alır (Lin ve ark., 2005). Her ne kadar biyolojik madde endüstrilerinde ve laboratuvar çalıĢmalarında kullanılan serum ve diğer besiyerleri filtreden geçirilerek veya ısı ile steril edilse de, endotoksinler filtrelerden geçebilirler ve sterilizasyon Ģartlarına dayanıklıdırlar (Freshney, 2005). Böylece endotoksinler çeĢitli potansiyel kaynaklar ile hücre kültürlerine ve diğer biyolojik ürünlere bulaĢabilirler. Endotoksinlerin potansiyel kaynakları arasında; gerek vasat ve solüsyon yapmak için gerekse yıkama yapmak için kullanılan su, ticari olarak üretilen ve kullanılan vasat veya serum, vasat bileĢenleri ve katkı maddeleri, laboratuvar cam ve plastik malzemeleri sayılabilir (Case-Gould, 1984; Ryan, 2004). Bunların herhangi biri ile endotoksinin hücre hatlarında etkinliğine bakıldığında, endotoksin yoğunluğunun seviyesine bağlı olarak; tek tek hücrelerin morfolojisinde değiĢim, hücrede düĢük endotoksin varlığında hafif ĢiĢme, endotoksin miktarı arttıkça hücrede büzüĢme ve dalgalı yüzey (Brown, 1982; Berker ve Hold, 1983), hücre sayısında azalma, intraselüler 4 granülasyonda artma ve sitoplazmada vakuol oluĢumları görülebilmektedir (Takiguchi ve Koga, 1988; Dawson, 1998; Magalhães ve ark., 2007). 1.2. Endotoksin Araştırmalarının Tarihçesi Belli solüsyonların intravenöz uygulamasından sonra neden ateĢ görüldüğü hakkındaki çalıĢmalar 19 yy‟dan önce kaydedildi. 1912 yılında, organizmaya enjekte edildiğinde hipertermiye sebep olan suları tanımlamak için „pirojenik‟ tanımı kullanılmaya baĢlanmıĢtır. Bu tip tanımlama 1923‟te daha da geliĢtirilerek, gerek ölü/sağlam gerekse parçalanmıĢ bakterileri içeren, patojenik olsun veya olmasın ya da denatürize olmuĢ endotoksin/ekzotoksin gibi bakteriyel ürünlerin hepsini hipertermize edici maddeler olarak adlandırılmıĢtır. (Probey ve ark., 1945; Magalhães ve ark., 2007). Daha sonraları pirojen teriminin sıklıkla kullanılmasının üzerine bu terim daha popüler olmuĢtur. Pirojenleri daha iyi anlamak amacıyla en büyük çaba 1925 ve 1945 arasında gerçekleĢtirildi. Özellikle Co-Tui, Gram negatif bakterilerin en tehlikeli pirojen üreticisi olduğunu göstermiĢtir (Co ve ark., 1944). Daha sonra, farmasötik preperasyonlara bulaĢmasından korkulan pirojenlerin Gram negatif bakterilerin endotoksinleri olduğu ve lipopolisakkarit kompleksleri olan bu endotoksinlerin bakteri hücre duvarının dıĢ katmanında bulunduğu tespit edildi (Westphal, 1975). Yine Westphal (1975), aslında pirojenlerin Enterobacteriaceae ailesindeki mikroorganizmalardan köken aldığını ve uygun bir dezenfeksiyon ve sterilizasyon süreci olmaksızın hazırlanan enjekte edilebilir solüsyonların ana kontaminantı olduğunu öne sürmüĢtür. YaklaĢık 20 yıl sonra, solüsyonların pirojenitesini değerlendirmek için, 14 farmasötik enstitü tarafından hayvan sistemleri geliĢtirilmiĢtir. Bu çalıĢma, 1942‟de tavĢanlarda ilk resmi pirojen testinin geliĢtirilmesiyle sonuçlandı. Aynı zaman sürecinde, endotoksinlerin 5 karakterizasyonu ve saflığı üzerine birçok çalıĢma yapıldı ve çok çeĢitli pirojen türleri izole edildi (Westphal, 1975; Magalhães ve ark., 2007). Westphal ve Jann (1965), endotoksinleri saflaĢtıran ilk araĢtırıcılar olmuĢtur. Bu araĢtırıcılar değiĢik Gram negatif bakterilerden sıcak fenol-su ekstraksiyon yöntemini kullanarak yüksek oranda saf, biyolojik olarak aktif endotoksin elde etmiĢlerdir. Elde ettikleri ürün, proteinden yoksun olup, sadece karbonhidrat, yağ asiti ve fosfor içermekte idi. Bu araĢtırıcılar aynı zamanda endotoksinleri tanımlamak için "lipopolisakkarit" (LPS) terimini ilk kullananlardır (Westphal ve Jann, 1965). Günümüzde LPS'lerin Gram negatif bakterilerin dıĢ katmanı içerisinde gömülü olduğu ve LPS biyosentezinin erken basamaklarında defektlere sahip bakteriyel mutantların yaĢayamadıklarını biliyoruz. Tüm bu araĢtırmaların sonunda, endotoksinlerin olumlu ve olumsuz etkilerinin altında yatan mekanizmalar ve bunların moleküler organizasyonunu dahi iyi anlamak adına çok büyük geliĢmeler kaydedilmiĢtir (Petsch ve Anspach, 2000; Heumann ve Roger, 2002). 1.3. Endotoksinlerin Fiziko-Kimyasal Özellikleri Lipopolisakkaritler olarak da adlandırılan endotoksinler, Gram negatif bakterilerin dıĢ membranının ana bileĢenidir (Kirikae ve ark., 1998). Bakterilerin sitoplazmik membranında lipopolisakkarit veya lipoprotein yapısında bulunurlar. Bu bileĢikler, bakterileri dıĢ ortama karĢı korumak ve yarı geçirgen bir membran oluĢturmak için tasarlanmıĢlardır. Bunlar hidrofobik bir lipid parçasına kovalent olarak bağlanan bir hidrofilik polisakkarit parçasından oluĢmuĢtur (Raetz ve ark., 1991; Hirayama ve Sakata, 2002; Ogikuba ve ark., 2004). Pek çok türün lipopolisakkaridi 3 farklı bölgeden oluĢur (ġekil 1): 0 - antijen bölgesi, Oligasakkarit bir çekirdek Lipid A (Lip A) 6 Bakteri yüzeyi Şekil 1. Lipopolisakkaritlerin yapısı Lipid A, endotoksinlerde en yoğun bulunan ve en sağlam bölgedir (Vaara ve Nurminen 1999; Petsch ve Arspach, 2000) ve birçok yağ asiti ile her biri eĢleĢmiĢ iki fosforilat gruptan (glukozamin) oluĢur (Ryan, 2004). Bu bölge, toksisite de dahil olmak üzere endotoksinin pek çok biyolojik aktivitesinden sorumludur. Endotoksinler 12-16 karbon atomuna sahip bir 3-hidroksi asil grubuna amin ve ester bağlarıyla bağlanmıĢ b-1, 6-D glikozamin rezidülerinden oluĢurlar. Bunlar doymuĢ yağ asitleriyle esterlenebilirler. Endotoksinlerin bu hidrofobik kısmı hekzagonal bir düzen içerisinde bulunur. Bu da molekülün geri kalan kısmına göre daha sert bir yapı oluĢmasına sebep olur (Stanislavsky ve ark., 1997; Petsch ve Anspach, 2000; Lin ve ark., 2005). Lipid A veya endotoksinden yoksun suĢ bilinmemektedir. Çekirdek oligosakkariti bir iç 3-deoksi-D-manno-2-oktulosonik asit (KDO) - heptoz bölgesi ve bir dıĢ hekzoz bölgesinden oluĢan bir yapıyla korunur. E. coli türlerinde 5 değiĢik çekirdek tipi bilinmektedir. Çekirdek bölgesi Lipid A‟ya çok yakındır ve Lipid A‟nın kendisi kısmen fosforilatlanmıĢtır. Böylelikle endotoksin molekülleri protein solüsyonları içinde net elektriksel negatif yük sergilerler (Hou ve Zaniewski, 1990; Petsch ve Anspach, 2000). 0 - antijeni genellikle identik oligosakkaritlerin bir dizininden oluĢurlar. Bunlar suĢlara spesifiktir ve serolojik kimliğin belirleyicisidirler (Petsch ve Anspach, 7 2000). Memelilerde Gram negatif etkenlerin neden olduğu enfeksiyonlarda bağıĢıklık sağlanması sırasında spesifik antikor yanıtından sorumludur (Kessel ve ark., 1966). Bir endotoksin monomerinin molar kütlesi oligosakkarit zincirinin değiĢkenliğine bağlı olarak 10-20 kDa arasında değiĢir. Endotoksinlerin amfipatik yapıları sebebiyle akıĢkan solüsyonlar içerisinde değiĢik supramoleküler agregatlar (çöküntü) oluĢturduğu iyi bilinmektedir. Bu agregatlar lipid zincirleri arasındaki kutupsal olmayan etkileĢimlerin yanısıra fosfat grupları arasında oluĢturulan köprülerin bir sonucu olarak da meydana gelebilirler (Anspach, 2001). Bu agregatların yapıları elektron mikroskobu, X-ray difraksiyonu, FT-IR spektroskopisi ve NMR gibi değiĢik tekniklerle çalıĢılmıĢtır. Bu çalıĢmaların sonucunda akıĢkan sıvılarda endotoksinlerin lamel, kübik, ve hekzagonal gibi değiĢik Ģekillerde, 0,1 mm çapında ve 1000 kDa büyüklüğüne kadar değiĢik Ģekillerde bulunabileceği ve bu Ģekillerin solüsyonun özelliklerine (pH, iyonlar, sürfaktantlar vs.) bağlı olarak yüksek stabilitede olabileceği ortaya konmuĢtur (Darkow ve ark., 1999). Moleküler dinamik kurallarına göre endotoksinin 3 boyutlu yapısı, özellikle uzun yüzey antijeni proteinlerin globüler yapısına göre çok daha esnektir. Endotoksinler bakteri ölümünün yanı sıra bakteri bölünmesi ve üremesi sırasında da yüksek miktarda salınırlar. Bunlar yüksek oranda ısıya dayanıklıdırlar ve bilinen sterilizasyon koĢullarında yok edilemezler. Endotoksinler 250°C'de 30 dakikadan fazla veya 180°C'de 3 saatten fazla tutuldukları zaman inaktive olurlar (Ryan, 2004; Gorbet ve Sefton, 2006). E. coli LPS‟i 170-250°C‟de kuru sıcak hava ile yok edilebilir (Tsuji ve Harrison, 1978). Hecker ve ark. (1994) ise, bakteriyal endotoksinlerin kuru sıcak havada 200°C‟de 60 dk bekletilmesiyle yoğunluklarının 3 log düĢtüğünü tespit etmiĢlerdir. En az 0,1 M oranındaki asit ve alkaliler de endotoksinleri yok etmek için kullanılabilir (Magalhães ve ark., 2007). 8 1.4. Endotoksinlerin Etki Mekanizması Endotoksinlerin oluĢturduğu doku hasarı, Ģok ve ölüm gibi fizyopatolojik etkileri oldukça çeĢitlilik gösterir (Ogikubo ve ark., 2004). Endotoksinler hücre ve organlar üzerine direkt etki etmezler, fakat bunun yerine, monosit ve makrofajlar baĢta olmak üzere immun sistemin aktive edilmesiyle ve dolayısıyla immun yanıtın artırılması ile etki gösterirler. Bu durum, aktive edilen immun sistem hücrelerinden özellikle tümör nekroz faktör (tNF), birçok interlökinler, prostoglandinler, koloni sitümüle edici faktörler, trombosit aktivite edici faktörler ve serbest radikaller gibi mediyatörlerin salınmasına sebep olur (Forehand ve ark., 1989; Rietschel ve ark., 1994; Magalhães ve ark., 2007). Bu mediyatörler güçlü biyolojik aktiviteye sahiptir ve endotoksinlerin oluĢturduğu yan etkilerden sorumludur. Organ ve hücrelerin yapı ve fonksiyonlarında meydana getirdiği değiĢiklikler arasında metabolik fonksiyonda değiĢiklikler, vücut ısısında artma, koagülasyon aktivitesi, hemodinamiklerin değiĢimi ve Ģok indüksüyonu sayılabilir. Ġmmun sistem hücreleri üzerine endotoksinlerin zararlı etkilerini önlemek veya tedavi etmek, bunun yanı sıra anti-endotoksin antikorlarının kullanımını ve endotoksin reseptör antagonistlerini bloklamak için birçok araĢtırma yapılmıĢtır (Loppnow ve ark., 1989; Golenbock ve ark., 1991; Pugun ve ark., 1995). Bununla birlikte endotoksinlerin immun hücreler ile etkileĢimine sadece spesifik reseptörler aracılık etmez. Hücre etkileĢimleri aynı zamanda hedef hücrelerinin membranlarının içine endotoksin moleküllerinin non spesifik interkalasyonu ile de meydana gelebilir (Schromm ve ark., 2000). LPS'lerin moleküler aktiviteleri, LPS molekülünün kendisinden kaynaklanmaz. Bunun yerine endotoksinin, LPS'lere duyarlı hücrelerle etkileĢimi sonucu üretilen medyatörler tarafından indirekt olarak indüklenir (Galanos ve Freudenberg, 1993). Maktofajların, LPS molekülünün Lipid A bölümü tarafından indüklenen aktivasyonu, biyoaktif lipidlerin, reaktif oksijen türlerinin ve özellikle de tümör nekroz faktörü α (TNF α), interleukin-1 (IL-1), IL-6, IL-8 ve IL-10 gibi peptit mediyatörlerinin üretilmesine yol açar (Vogel ve Hogan, 1990). Yapılan çalıĢmalar LPS'in tam bir endotoksik aktivite gösterebilmesi için Lipid A bölgesinin iki 9 heksozamin rezidüsü (D-gluko olarak konfigüre olmuĢ), iki fosforil grubu, 3-asiloksiasil grupları içeren 6 adet yağ asidi (doymuĢ, kısmen 3-hidroksilatlanmıĢ) içermesi gerektiğini ortaya koymuĢtur (Rietschel ve ark., 1994). Konakçının endotoksinlere bağlanma özelliğine sahip bazı plazma proteinleri, endotoksinlerin aktivitesini etkileyebilir (artırabilir veya baskılayabilir). Bu plazma proteinleri arasında yüksek ve düĢük yoğunluklu lipoproteinler (HDL ve LDL) ve LPS-bağlanma proteini sayılabilir (Schuhmann ve ark., 1990). Enfeksiyondan kaynaklanan endotoksin Ģoku durumlarında, enfeksiyonu meydana getiren mikroorganizmadan salgılanan LPS'nin toksik etkisi, Omp A gibi bakteriyel proteinlerden de etkilenebilir (Freudenberg ve ark., 1991). Endotoksinlerin az miktarları, memelilerin normal intestinal florası olarak yaĢayan Gram (-) bakterilerden salındığında organizmalar için olumlu etkiye sahip olabilir. Enfeksiyona karĢı vücut ısısında artma, bakteriyal, viral enfeksiyonlar, tümör nekrozuna karĢı savaĢma gibi yararlı etkiler görülür (Bui, 2012). Sonuç olarak, endotoksinlerin yararlı etkilere de sahip olabileceği göz ardı edilmemelidir. Bu yararlı etkiler yüksek ateĢin tedavisinde, tümörlerin yok edilmesinde ve non-spesifik olarak immun yanıtın geliĢtirilmesinde kullanılmaktadır (Golenbock ve ark., 1991; Pugun ve ark., 1995). Öte yandan komplikasyonların önüne geçmek için endotoksine herhangi bir Ģekilde maruz kalınmasından kesinlikle kaçınılmalıdır. Bu durum özellikle damar içi verilen ilaçlar için geçerlidir. 10 1.5. Endotoksinlerin Tespit Yöntemleri Endotoksinler, su, serum ve vasatlara karıĢtığında aĢı ve biyolojik maddelerin kalitesini olumsuz etkilemektedir (Geier ve Geier, 2002). Bunun baĢlıca sebebi olarak, özellikle aĢı ve biyolojik madde hazırlamada kullanılan hücre kültürlerinde meydana getirdiği toksik etki ve sulandırma sıvılarına karıĢması durumunda da kullanıcıya olan etkisi gösterilebilir. Bu olumsuzlukların önüne geçmek için, GMP laboratuvar Ģartlarının bir maddesi, endotoksin varlığının tespit edilmesi gerektiğini vurgulamaktadır. Dolayısıyla endotoksinlerin üretim aĢamasının baĢında tespit edilmesi çok önemlidir. Endotoksin kontaminasyonların tespiti için ilk metot, insanlara enjekte edilecek su ve solüsyonların taranması için 1940‟larda geliĢtirilen TavĢan Pirojen Testidir. Bang 1956 yılında, Gram negatif bakterilerin öldürüldüklerinde dahi at nalı yengecinin kanını yarı katı bir kütle haline çevirdiğini bildirmiĢtir. Bu geliĢmeden sonra, 1970‟lerde bu mekanizmaya dayanan Limulus Amebocyte Lysate (LAL) testi geliĢtirilmiĢtir. (Ryan, 2004; Sargent, 2002). Geier ve ark. (1978) beĢeri uygulamalar için hazırlanmıĢ çiçek, rubella, poliomyelitis, kuduz, influenza, kabakulak, difteri ve kolera aĢılarından oluĢan 20 örneğin 16'sında endotoksin miktarının 0,1 ng/ml‟den daha fazla olduğunu ve bu aĢılarda endotoksin içeriğinin 10-5 dilüsyona kadar varlıklarını koruduğunu LAL testi ile göstermiĢlerdir. Bu durumun aĢılarda yan etki oluĢturabileceğini ve en az endotoksin varlığına sahip aĢı lotlarının seçiminin, bu yan etkileri azaltacağını vurgulamıĢlardır. Limulus polyphemus adı verilen at nalı yengecinin kanından (amoebocytes) elde edilen ekstraktın Gram negatif bakterilerin endotoksinleri ile reaksiyona girmesi ve pıhtı meydana getirmesi testin ana prensibini oluĢturmaktadır (Bui, 2012). 11 Günümüzde biyolojik materyallerde endotoksinlerin tespiti, tavĢan pirojen testi, jel klot LAL yöntemi, türbidimetrik LAL yöntemi, kromojenik LAL yöntemi ve floresan yöntemi ile yapılabilmektedir. LAL testinin endotoksinlerin tespitinde kullanılan en hassas test olduğu bilinmektedir (Hussaini ve Ready, 1981). Dahası bu test 0,03 EU/ml altındaki miktarları tespit edebilme özelliğindedir (Bates ve ark., 1998; Ryan, 2004). Test sonuçlarının kolay okunabilir olması, pH değiĢikliklerine ve glikanlara karĢı dirençli olması ve ticari olarak ihtiyaca yönelik değiĢik miktarlarının var olması ve en önemlisi testin duyarlılığının yüksek olması sebebiyle günümüzde endotoksinlerin tespitinde LAL testi daha çok tercih edilmektedir. Trivedi ve ark. (2003), standardize edilmiĢ 14 allerjen aĢının endotoksin içeriğini LAL testi ile incelemiĢler ve aĢıların endotoksin içeriklerinin çok farklı olduğunu bulmuĢlardır. Geier ve Geier (2002), ticari aĢılarda endotoksin tespitine yönelik yaptıkları bir çalıĢmada endotoksin düzeylerini LAL testi ile tespit etmiĢler ve endotoksin düzeyi ile yan etkilerin korelasyonunu incelemiĢlerdir. Sonuç olarak, aĢılardaki endotoksin miktarları ile oluĢan yan etkilerin insidensi arasında doğru orantı olduğunu göstermiĢlerdir. Sonuç olarak; ticari aĢılarda ve biyolojik maddelerde endotoksinlerin varlığını takip etmek ve bunları bildirmek, bu ürünleri kullanan bireylerde oluĢabilecek yan etkilerin kaynağını daha iyi anlamak açısından yararlı olacağı düĢünülmektedir. Bunun yanı sıra, endotoksin içeriği az olan aĢıların tercih edilmesi, oluĢabilecek yan etkilerin önüne geçmeye yardımcı olacaktır (Bilgehan, 2000). Biyolojik maddelerdeki kabul edilebilir endotoksin yoğunlukları de gösterilmiĢtir (Hoffmann ve ark., 2005). Çizelge 1. 12 Çizelge 1. ÇeĢitli maddelerde kabul edilebilir endotoksin miktarları. Madde Plastik kültür ekstraktları Ticari hücre kültürü vasatı Makrofaj kültürleri Endotelyal hücre kültürleri 1.6. EU / ml 0,5 ˂ 1,0 0,8 ˂ 0,5 Hücre Hatları ve Bakteri Suşları 1.6.1. Vero Epitelyal Hücre Hattı Japonya‟da 1962 yılında Yasumura ve Kawakika tarafından normal, yetiĢkin Afrika yeĢil maymununun böbrek hücrelerinden türetilmiĢtir. Epitelyal hücre hattıdır. Mikroskopta genellikle düz, kübik Ģekilli, tek nükleuslu, hücre boyunca uzamıĢ sitoplazmik görüntüye sahip, düzgün hatlı hücreler Ģeklinde görülür (Montagnon, 1989; Hay, 1991; Govorkova ve ark., 1995; Lindl ve Steubing, 2013). Bu hücre hattı pek çok amaçla kullanılmaktadır. Vero hücrelerinin diğer hücre hatlarına göre daha sık kullanılmasının ana nedenlerinden biri kolay depolanabilmesi ve karakterize edilebilmesidir. Bu da üretimin partiler halinde üretilmesi sırasında primer hücre kültürlerinin taze olarak hazırlanıp kullanılmasından kaynaklanabilecek kontaminasyonların önüne geçer. Diploid hücre kültürlerine göre daha fazla kullanılırlar. Bunun sebebi ise Vero hücreleri biyoreaktörler içerisinde üretilmeleri sırasında kolay adapte olurlar ve bunun sonucunda daha fazla virüs elde edilir. Daha fazla virüs elde edilmesi de aĢının daha saf olmasına neden olur (hücre atıkları daha az olur). AĢının üretim partileri büyür, sonuç olarak da aĢı ekonomik olarak üretilir. Tüm bu anlatılanlar göz önüne alındığında Vero hücreleri virüs üretimi için konak hücresi konumundadır. Bunlara ek olarak, E. coli toksinlerinin taranmasında kullanılmaktadır (Montagnon, 1989; Geier ve ark., 2002). 13 Konowalchuk ve ark., (1977), E. coli sitotoksinine karĢı Vero hücresinin yanıtını incelemiĢler ve Vero hücresinde oluĢan önemli değiĢiklikleri göstermiĢlerdir. Carbonell ve ark., (1997), Serratia marcescens‟in klinik izolatlarının Vero hücresinde sitotoksik aktivitenin etkilerini araĢtırmıĢlar ve Vero hücrelerinde büzüĢme olmadan yuvarlaklaĢma, birbirinden ayrılma gibi sitotoksik etkiler saptamıĢlardır. 1.6.2. Baby Hamster Kidney (BHK-21) Fibroblast Hücre Hattı Macpherson ve Staker tarafından 1962‟de geliĢtirilen fibroblast karakterde bir hücre hattıdır. Mikroskopta genellikle düz, oval Ģekilli bir nükleuslu, hücre boyunca uzamıĢ stoplazmik görünüme sahip, mekik Ģekilli hücreler Ģeklinde görülür (Drexlor ve ark., 1998; Lindl ve Steubing, 2013). 1.6.3. Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) Epitelyal Hücre Hattı YetiĢkin bir sığırın (Bos Taurus) böbrek dokusundan 1957 yılında geliĢtirilen epitelyal hücre hattıdır. Özellikle viral kontaminantların tespitinde kullanılan bir hücre hattıdır. Bu epitel hücre hattı dünya çapında çok değiĢik uygulamalar için laboratuvarlarda kullanılmaktadır. Fakat belki de bunlar içerisinde en belirgin olanı aĢı üretimi için attenue virusları çoğaltmak için kullanılmasıdır (Hay, 1991; Forrester ve ark., 1992; Erdem, 1999). 14 1.6.4. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Gama protobacteria sınıfının bir üyesidir. Pseudomonadaceae familyasının Pseudomonas cinsinin en iyi tanımlanan türüdür (Sears ve Kaper, 1996; Vahapoğlu ve Akhan, 2002). P. aeruginosa, Gram negatif, zorunlu aerobik, çomak Ģeklinde (Koneman ve ark., 2006), düz veya hafif kıvrık yapıda, sporsuz, 0,5-0,8×1,5-3,0 μm boyutlarında, uçlarında tek nadiren 2-3 adet flagellası olan hareketli bir organizmadır (Berker ve Hold, 1983; Dawson, 1998; Akalın, 2004). Adi besiyerinde kolayca üreyebilen P. aeruginosa‟nın kültürdeki aromatik meyve kokusu karakteristiktir (Dawson, 1998). Nötral pH da mavi veya yeĢilimsi mavi görülür. Bu pigmentten dolayı aeruginosa adı verilmiĢtir (Berker ve Hold, 1983; Hoffmann ve ark. 2005). P. aeruginosa, MacConkey agarda laktoz negatif koloniler oluĢturur (Dawson, 1998). Ġzolasyonu için 24-48 saat yeterlidir. P. aeruginosa su, toprak ve bitkiler üzerinde bulunan çevresel kaynaklı saprofitik bir etkendir (Hoadley ve McCoy, 1968; Akalın, 2004; Esendal, 2006). P. aeruginosa enfeksiyonları, etkenin oportunistik olması nedeniyle, genellikle yara (yaralarda mavi yeĢil irin), yanık, kornea zedelenmesi, deride oluĢan paraziter ve mikotik enfeksiyonlar, özellikle koyunlarda yapağının aĢırı ıslanması, kötü hijyenik koĢullar gibi faktörlerin varlığında ortaya çıkmaktadır (Akalın, 2004; Freshney, 2005). Endotoksin sentezleyerek sığır, koyun, keçi, domuz, at, kedi ve köpeklerde hastalık oluĢturur. Özellikle sığırlarda mastitis, endotoksemi ve bazen ölüm; infertilite, sporadik abort görülür (Johne ve ark., 1987). Koyun ve keçilerde ise yapağı çürüdüğünde tel tel ayrılır, dermatit geliĢir ve kötü koku oluĢur. P. aeruginosa‟nın yaĢam skalasının geniĢ olması ve oluĢturduğu infertilite ve ölümler sebebiyle ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır (Hay, 1991). 15 Mushin ve Ziv (1973), sığırlar ve diğer hayvanlar üzerinde yaptıkları çalıĢmada, hastalıkların hayvanlarda meydana gelme nedeninin P. aeruginosa ile kontamine olmuĢ suların sebep olduğunu bildirmiĢlerdir. 1.6.5. Escherichia coli E. coli, Enterobacteriaceae ailesi içinde yer alan Escherichia cinsinin en önemli türüdür. Gram negatif, çomak Ģeklinde, sporsuz, 1-2 × 0,1-0,5 µm boyutlarında, peritrik flagellaya sahip olması sebebiyle hareketli, bazen hareketsiz, fakültatif anaerob bir bakteridir. Optimum üreme ısısı 37°C‟dir. Özellikle 44°C‟de üremesiyle diğer bakterilerden ayrılmasını sağlarlar. Peng ve ark., (2013), E. coli‟nin çeĢitli suĢlarının özellikle çiğ sütlerde ısı ile inaktivasyon derecelerini incelemiĢlerdir. Bu araĢtırıcılar, araĢtırmaların sonucunda E. coli‟nin çoğu suĢunun 67.5°C ve bunun üzerindeki sıcaklıklarda inaktive olduğunu göstermiĢlerdir. Endotoksinler E. coli‟nin bütün suĢlarında bulunur. E. coli‟nin antijenik yapısı çok komplike olup, patojen suĢlarda bu yapılar önem taĢımaktadır. Bu yapılardan biri somatik “O” antijenidir. Bu antijen lipopolisakkarit özelliğinde olup, ısıya dirençli yüzey antijenleridir. Protein – fosfolipit – polisakkarit yapısında olan “O” somatik antijeninin polisakkarit fraksiyonları antijeniteyi belirlerken, lipoproteinler toksisiteyi belirlerler (Ġzgür, 2006). E. coli, normal bağırsak florası olarak memeli ve kanatlıların kalın bağırsaklarında bulunurlar. Fakat canlı savunma gücünün azaldığı durumlarda doku ve kana yayılarak enfeksiyon etkeni özelliği taĢırlar Canlı vücudunda ve doğada yaygın bulunması sebebiyle suları kontamine etme riski yüksektir. Bu mikroorganizmanın çevresel sularda tespit edilmesi dıĢkı kirlenmesinin bir belirtisi olarak kabul edilir (Bekar, 1997). 16 E. coli ve P. aeruginosa, doğada çok yaygın bulunmaları ve zayıf besi yeri koĢullarında bile kolayca üreyebilmeleri sebebiyle baĢlıca laboratuvar kontaminantları olarak kabul edilmektedir. Hele ki bu özelliklerini hücre kültürü çalıĢmalarının yürütüldüğü laboratuvar koĢullarında gösterdiklerinde, gerek araĢtırma ve gerekse hücre kültürü kökenli biyolojik ürünlerin üretilmesi sırasında ciddi problemlere yol açmaktadır. Özellikle sterilizasyon, dezenfeksiyon ve sanitasyon koĢullarının yetersiz olduğu laboratuvar koĢullarında kolayca üreyerek hücre hatlarının kontamine olmasına yol açmakta ve bu da ciddi maliyet ve iĢ gücü kaybına yol açabilmektedir. Bu çalıĢmada, bakteri endotoksinlerinin varlıkları Jel klot LAL testi ile tespit edilerek, aĢı üretiminde kullanılan Vero, MDBK, BHK-21 gibi hücre hatlarına etkilerinin deneysel olarak araĢtırılması ve bunun yanı sıra, çalıĢma süresince hücre hatlarında meydana gelen sayısal ve morfolojik değiĢikliklerin belirlenmesi ve kıyaslanması hedeflenmiĢtir. 17 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. GEREÇ 2.1.1. Bakteri Suşları 2.1.1.1. P. aeruginosa Suşu Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kültür Koleksiyonu'ndan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 suĢu olarak temin edildi. 2.1.1.2. E. coli Suşu E. coli O55:B5 suĢu Etlik Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Bakteriyoloji Laboratuvarı Kültür Koleksiyonu'ndan saf kültür olarak temin edildi. P. aeruginosa ve E. coli suĢlarının saflığının gösterilmesi amacıyla Mikro API cihazı, P. aeruginosa 32 GN (Kat. no: 32100) (BIOMERIEUX) ve E. coli ID 32 E (Kat no: 32400) kiti (BIOMERIEUX) kullanıldı. 18 2.1.2. Hücre Hatları 2.1.2.1.Vero Epitelyal Hücre Hattı Etlik Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Viral AĢı Üretim Laboratuvarı Hücre Koleksiyonu'ndan Vero CIRAD-EMVT-Fransa (174. pasaj) temin edildi. 2.1.2.2. Baby Hamster Kidney (BHK-21) Fibroblast Hücre Hattı Etlik Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Viral AĢı Üretim Laboratuvarı Hücre Koleksiyonu'ndan BHK-21 ATCC (Kat no: CCL-10) (60. pasaj) temin edildi. 2.1.2.3. Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) Epitelyal Hücre Hattı Etlik Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Viral AĢı Üretim Laboratuvarı Hücre Koleksiyonu'ndan MDBK ATCC (Kat no: CCL-22) (11. pasaj) temin edildi. 2.1.3. Besiyerleri 2.1.3.1. Nutrient Agar P. aeruginosa ve E. coli suĢlarının üretimi amacıyla genel besiyeri olarak OXOID CM003 kullanıldı. Besiyeri 28 gr / 1000 ml olacak Ģekilde hazırlandı. PH 7.4±0,2‟ye ayarlandı. Otoklavda 121°C‟de 15 dk sterilize edildi. Besiyeri sıcaklığı 56ºC‟ye gelince petrilere dağıtıldı. Hazırlanan petrilerin sterilite kontrolü için 37°C etüvde 24 saat inkübasyondan sonra kullanılıncaya kadar +4°C‟de buzdolabında muhafaza edildi. 19 2.1.3.2. Nutrient Broth P. aeruginosa ve E. coli suĢlarının üretimi amacıyla genel besiyeri olarak OXOID CM001 kullanıldı. Besiyeri 13 gr / 1000 ml olacak Ģekilde hazırlandı. pH 7.4±0,2‟ye ayarlandı. Tüplere eĢit miktarda dağıtıldı. Otoklavda 121°C‟de 15 dk sterilize edildi. Hazırlanan broth'ların sterilite kontrolü için 37°C etüvde 24 saat inkübasyondan sonra kullanana kadar +4°C‟de buzdolabında muhafaza edildi. 2.1.3.3. Kanlı Agar E. coli suĢunun üretimi amacıyla genel besiyeri olarak nutrient agar (OXOID CM003) kullanıldı. Besiyeri 28 g / 1000 ml olacak Ģekilde hazırlanarak ve pH‟ı 7.3‟e ayarlandı ve 121ºC‟de 15 dk sterilize edildi. Besiyeri sıcaklığı 45–50ºC‟ye gelince içerisine %25‟lik glikozdan %5 oranında ilave edildi. Benmaride 10 dk bekledikten sonra %7 oranında defibrine taze koyun kanı eklendi. Petrilere eĢit Ģekilde dağıtıldı. Etüvde 24 saat inkübasyona bırakılarak kontaminasyon kontrolü yapıldı. +4°C‟de buzdolabında saklandı. 2.1.3.4. Hücre Üretme Vasatı Hücrelerin çoğalmasını desteklemek amacıyla vasat olarak %10 fötal dana serumu (FCS) (BIOCHROM AG) destekli Eagle Minimal Essential Medium (EMEM) (SIGMA – ALDRICH) kullanıldı. 20 2.1.4. Tripsin ve EDTA Hücre hatlarının çoğaltılması iĢlemlerinde flask içinde üremiĢ hücrelerin, üreme yüzeyinden kaldırılmasını sağlamak amacıyla %0,4 EDTA‟lı (Ethylenediaminetetraacetic acid) tripsin (SIGMA–ALDRICH) kullanıldı. BHK-21 hücre hattının çoğaltma iĢlemlerinde ise EDTA içermeyen tripsin kullanıldı. 2.1.5. Trypan Blue Boyası Endotoksinlerin hücre sayısına etkisinin tespiti amacıyla trypan blue boyası (BDH stains) 25 g / 1000 ml olacak Ģekilde hazırlandı. 2.1.6. LAL Test Kiti Bu çalıĢmada endotoksin varlığının tespiti için ġap Enstitüsü Müdürlüğü‟nden temin edilen LAL test (Pyrotell) kiti ve non pirojen su (Pyrotell) kullanıldı. Kit kullanım aĢamasına kadar -20°C‟de saklandı. 2.1.7. ELISA Reader Cihazı Hücre kültürü tabletlerin her bir gözündeki hücrelerin canlılığının belirlenmesi için ELISA reader cihazı (OLYMPUS IX71) kullanıldı. Pleytler 630 nm‟de okutuldu. 21 2.1.8. Sarf Malzemeleri ÇalıĢma sırasında kullanılan tüm sarf malzemeler (su, serum, vasat, pipet, pipet ucu, dilüsyon tüpleri, konteynerlar vs.) non pirojen özellikte kullanıldı. 2.2. YÖNTEM 2.2.1. P. aeruginosa ve E. coli Suşlarının Çoğaltılması Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kültür Koleksiyonu'ndan temin edilen P. aeruginosa suĢunun Macconkey agara ve Nutrient agara ekimi yapıldı. Etlik Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Bakteriyoloji Laboratuvarı Kültür Koleksiyonu'ndan temin edilen E. coli suĢunun EMB agara ve Nutrient agara ekimi yapıldı. Etüvde 24 saat inkübasyona bırakıldı. 2.2.2. Mikro API Cihazı ile Suşların Saflığının Gösterilmesi Çoğaltılan bakteri kültürlerinin saflığının gösterilmesi amacıyla Mikro API cihazı kullanıldı. Bakteri kültürleri kit prosedürüne uygun olarak iĢleme alındı. Buna göre aĢağıdaki adımlar uygulandı. Nutrient agarda üreyen P. aeruginosa olduğu düĢünülen bakteri öze ile alınarak özel solüsyonunda, Mc Farland 0,5 yoğunluğuna göre ayarlandı. KarıĢım vortexlendi. Kitteki her bir göze ayarı yapılmıĢ sıvıdan (Mc Farland) 135 µl hacminde konuldu. 24 ± 2°C‟de etüvde 24 saat inkübe edildi. Mikro API cihazı ile sonuçlandırıldı. Çıkan özellikler olması gereken özelliklerle kıyaslanarak sağlaması yapıldı. 22 2.2.3. Suşların Çoğaltılması Mikro API cihazı ile saflığı gösterilen E. coli ve P. aeruginosa suĢlarını çoğaltmak için nutrient agarlara ekimleri yapıldı. Ekimi yapılan petriler 37°C etüvde 24 saat inkübe edildi ve çoğaltma iĢlemi tamamlandı. 2.2.4. Koloni Sayım Yöntemi ile Bakteri Sayımı P. aeruginosa ve E. coli‟nin stok kültüründe 1 ml'de ortalama ne kadar bakteri olduğunu hesaplamak için P. aeruginosa ve E. coli suĢları nutrient broth'da çoğaltıldı ve orijinal kültür olarak kabul edildi ve 1 ml nutrient broth içindeki yaklaĢık bakteri sayısı, koloni sayım tekniğine göre hesaplandı. Bu tekniğe göre 9 ml nutrient broth bulunan dilüsyon tüpleri hazırlandı. Birinci dilüsyon tüpüne 1 ml bakteri üremiĢ nutrient brothdan eklendi ve her bir bakteri için 10-1‟den 10-9‟a kadar 10 katlı sulandırmalar yapılarak dilüsyon iĢlemi tamamlandı ve her iki bakteri için iĢlem tekrar edildi. Yapılan 10 katlı dilüsyonlar iyice karıĢtırıldı. 10-1‟den 10-7 dilüsyona kadar her dilüsyon 0,1 ml nutrient agara ekildi. Son üç dilüsyonun (10-7, 10-8, 10-9) her birinden ayrı ayrı pipet ucu kullanmak kaydıyla 3‟er adet nutrient agara 0,1 ml miktarında ekimler yapıldı ve besiyeri üzerine yüzeyi kaplayacak Ģekilde yayıldı. ĠĢlem gören petri kutuları 37°C‟de 24 saat inkubasyona bırakıldı. Yirmidört saat sonunda her dilüsyon için yapılan 3 petri kutusundaki bakteriler sayıldı ve ortalaması alındı. Orijinal kültürdeki P. aeruginosa ve E. coli sayısını hesaplamada aĢağıdaki formülden yararlanıldı (Arda, 2011). Burada; = Orijinal stok kültürdeki (sulandırılmamıĢ) bakteri sayısı = Petri kutularına ekilen inokulum miktarı (0,1 ml) = Ortalama bakteri sayısı = Dilüsyonunun ters logaritması 23 Her dilüsyonun 1 ml‟sinde koloni miktarı bulunduktan sonra sonuçların ortalaması alındı. Böylece, P. aeruginosa ve E. coli‟nin stok kültüründe 1 ml'de ortalama ne kadar bakteri olduğu belirlendi. 2.2.5. Endotoksinlerin Açığa Çıkarılması Nutrient agarda çoğaltılan P. aeruginosa ve E. coli suĢlarının her biri öze yardımıyla agar üzerinden tamamen toplandı. Her bir bakteri birer tüp içerisindeki 50 ml non pirojen su içinde süspanse edildi. Önceden 95°C‟de ısıtılmıĢ benmari içerisine bu iki tüp yerleĢtirildi. Benmaride 95°C‟de 30 dk bekletildi ve sonunda tüpler benmariden çıkartıldı. Soğumaya bırakıldı (Ludwig ve Avis, 1988). 2.2.6. Sterilite Kontrolü Vasat üretme suyunda parçalanmadan kalan bakteriler hazırlanan hücrede kontaminasyona sebep olacağından dilüsyon iĢleminden önce bakteri kontrolü yapılması gerekmektedir. Endotoksin çıkartma iĢlemi tamamlandıktan sonra soğuyan P. aeruginosa ve E. coli endotoksinlerine sahip stok solüsyonlarından öze yardımıyla nutrient agara ekim yapıldı. 37°C etüvde 24 saat inkübe edildi. Ġnkübasyon sonunda üreme olup olmadığına bakıldı. 2.2.7. Jel Klot LAL Testi ile Stok Solüsyonlarında Endotoksinlerin Tespiti Bu çalıĢmada, P. aeruginosa ve E. coli stok solüsyonu içindeki açığa çıkan endotoksini tespit etmek için stok solüsyonlarına Jel Klot LAL testi uygulandı. ĠĢlem, kit prosedüründe belirtilen talimatlara uygun olarak yapıldı. 24 2.2.8. Jel klot LAL Testi ile Endotoksin Yoğunluğunun Saptanması Bu amaçla, stok solüsyonlarından non pirojen tüpler içerisine, non pirojen su ile 10 katlı seri dilüsyonlar hazırlandı. Dilüsyon iĢlemi boyunca non pirojen pipet ucu kullanıldı ve 900 µl non pirojen su içinde 100 µl bakteri endotoksinli stok dilüe edildi. Böylelikle her bir bakteri suĢu endotoksini için 10 katlı seri dilüsyonlar hazırlanmıĢ oldu. Daha sonra, hazırlanan bu endotoksin dilüsyonlarında endotoksin yoğunluğunu tespit etmek amacıyla Limulus amebocyte lysate (LAL) testi kullanıldı. Test, kit protokolüne uygun Ģekilde yapıldı. Buna göre aĢağıdaki adımlar uygulandı. Limulus amebocyte lizatı içine 2 ml non pirojen su eklendi. 0.1 ml test örneği veya kontrol içeren her bir reaksiyon tüpüne 0.1 µl LAL lizatı eklendi. Ekleme sırasında iyi bir karıĢımın olması için tüpler 20-30 sn boyunca çalkalandı. Reaksiyon tüpleri 37°C±1°C‟de bir su banyosu veya etüvde 1 saat bekletildi. Test numunesine LAL lizatı eklendiği anda reaksiyon baĢladı. Fakat karıĢımın optimum orana ulaĢabilmesi için 37°C‟ye gelmesi beklendi. 60 dk'nın sonunda tüpler alındı. OluĢan jel görünümüne göre endotoksin değerlendirildi (Çizelge 2). Çizelge 2. Jel Klot LAL test protokolüne göre testin değerlendirmesi Endotoksin miktarı 0.5 EU/mL 0.25 EU/mL 0.125 EU/mL 0.06 EU/mL Endotoksin varlığı + + - 2.2.9. Hücre Kültürlerinin Çoğaltılması Vero, MDBK ve BHK-21 hücreleri %10 FCS içeren EMEM vasatı içerisinde 75 cm2‟lik hücre kültürü kaplarına konuldu. Monolayer hücre üremesi sağlandı. 25 2.2.10. Hücre Üretme Vasatları İçerisinde Stok Solüsyonlardan Endotoksinli Seri Dilüsyonların Hazırlanması Jel Klot LAL testi ile belirlenen endotoksin varlığının olmadığı son dilüsyon basamağının bir üstünü de kapsayacak Ģekilde (10-1, 10-2, 10-3, 10-4) hücre üretme vasatı ile logaritma 10 tabanına göre endotoksin dilüsyonları her kullanımdan önce hazırlandı. 2.2.11. Hücre Kültürlerinin 96 Gözlü Pleytlere ve Hücre Kültürü Flasklarına Aktarılması Daha önceden 75 cm2‟lik flasklarda monolayer üremesi tamamlanmıĢ hücre hatlarının, endotoksinli vasatlarla subkültürleri yapılarak 96 gözlü pleytlere ve 25 cm2 lik flasklara dağıtılması sağlandı. Bu amaçla, her bir bakteri endotoksini için, endotoksin varlığının olmadığı son dilüsyon basamağının bir üstünü de içerecek Ģekilde 96 gözlü pleyt ve 25 cm2'lik flask sayısı belirlendi. Hücrelerin hücre üretme vasatıyla subkültürü yapılarak pleyt ve flasklara pay edilmesi sağlandı. Prosedür Ģu metodolojiye göre gerçekleĢtirildi. Monolayer durumda bulunan ve 75 cm2‟lik flasklarda üretilmiĢ hücre kültürlerinin (Vero, MDBK, BHK-21) içerisindeki hücre üretme vasatı döküldü. Vasat ile hücrelerin yüzeyleri yıkandı. Hücrelerin tripsin ile flask yüzeyinden ayrılması sağlandıktan sonra EMEM ile pipetasyonu yapılarak birbirlerinden ayrılması sağlandı. Daha sonra hemositometrik yöntem ile Thoma lamında sayılan hücreler, (MDBK, BHK-21 ve Vero için ayrı ayrı) 125.000 hücre/ml olacak Ģekilde EMEM ve %10 FCS‟li hücre üretme vasatı içinde sulandırıldı. Hazırlanan hücreler 96 gözlü pleytlerin her bir gözüne 0,1 ml hacminde ve 25 cm2 lik flasklara ise 10 ml hacminde dağıtıldı (Freshney, 2005). 26 2.2.12. 96 Gözlü Pleytler ve Flasklardaki Vasatların Endotoksinli Vasatlar ile Değiştirilmesi Hücre hatlarının E. coli ve P. aeruginosa endotoksinlerine sürekli maruz kalmasını sağlamak amacıyla pleyt ve flasklardaki hücreler hergün endotoksinli taze vasatlarla değiĢtirildi. ĠĢlem, Pöllänen ve ark. (2000)'nın belirttiği yönteme göre yapıldı. Bu amaçla; öncelikle flask ve pleytlere dağıtılan hücrelerin (MDBK, BHK-21 ve Vero için ayrı ayrı) pleyt ve flask yüzeyine yapıĢmasını sağlamak amacıyla 24 saat boyunca 37°C ve %5 CO2‟li etüvde inkübe edildi. Ġnkübasyon sonunda pleyt ve flasklardaki hücre üretme vasatları steril bir pipet ile çekildi ve bunların yerine, her bir bakteri endotoksini için % 2 FCS içeren 10-1, 10-2, 10-3 ve 10-4 oranlarında endotoksin ihtiva eden vasatlar ilave edildi. Endotoksinli vasatlar ile yapılan bu değiĢim iĢlemi 5 gün boyunca devam etti. 2.2.13. Morfolojik Değişikliklerin Saptanması Endotoksinli vasatlarla vasat değiĢimi yapılan hücre hatları hergün doku kültürü mikroskobunda morfolojik değiĢiklikler yönünden kontrol hücreleriyle karĢılaĢtırılarak incelendi ve değiĢiklikler kaydedildi. Hücrelerde meydana gelen toksik etkiler, Brown‟ın (1982) bildirdiği yönteme göre değerlendirildi. Bu yönteme göre; 0 = Negatif yanıt. Normal hücre morfolojisi. +1 = Kontrolle kıyaslanabilir görüntü mevcut fakat granülasyonda azalma veya %25‟den daha az hücrelerin azalması (hafif ĢiĢme veya krenasyon), granüllerin varlıkları yokken tek tek hücrelerin morfolojik değiĢimi. +2 = YaklaĢık bütün Monolayer hücrelerde büzüĢme ve krenasyon, genellikle hücrelere granülasyon eĢlik eder; yüzen ölmüĢ hücreler mevcut olabilir. +3 = AĢırı granülasyon veya büzüĢme veya krenasyon. Her durumda da %50-75 hücre kaybı 27 +4 = Hücrelerde %75‟den daha fazla kayıp ve ciddi morfolojik değiĢim (bu kültür hala metabolik aktivite sergileyebilir) 2.2.14. Kristal Viyole Boyama Yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Canlılığına Etkisinin Tespiti Canlı hücrelerin tespiti ve bunların kantitatif miktarsal olarak tayinini gerçekleĢtirmek amacıyla 96 gözlü pleytlerde üretilen hücreler boyandı ve her bir gözdeki boya miktarı ELISA okuyucu ile Optik Dansite (OD) birimi olarak belirlendi. Deney prosedürü Pöllänen ve ark. (2000) belirttiği yönteme göre yapılmıĢtır. Hücre kültürü tabletlerindeki hücre üretme vasatı döküldü. 96 gözlü pleytlerin her bir gözüne 100 µl %5 sükroz içeren PBS içerisinde hazırlanmıĢ %4‟lük formaldehit solüsyonu içerisinde 1 gece boyunca fikzasyona bırakıldı. Fikzasyon sonunda pleytlerin içerisindeki solüsyon boĢaltıldı. 4 kez distile su ile yıkandı, durulandı ve kurutuldu. 96 gözlü pleytlerin her bir gözü, %0,1 borik asit içeren 100 µl hacmindeki kristal viyole ( 200mM, pH 6,0 ) ile boyandı. Oda sıcaklığında 30 dk bekletildi. Süre sonunda gözlerdeki boya boĢaltıldı. 4 kez distile su ile yıkandı, durulandı ve kurutuldu. Pleytlerin her bir gözüne konulan boya miktarı kadar (100µl) %10 asetik asit konularak boya almıĢ canlı hücrelerdeki boya çözdürüldü. Çözünen boya miktarı ELISA reader ile 630 nm‟de okutuldu. Değerlendirme; Boya alan hücre sayısı ile orantılı olarak OD değerleri yüksek olan gözlerde canlı hücre miktarının daha yüksek olduğu kabul edildi. 28 2.2.15. Trypan Blue Boyama Yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Sayısına Etkisinin Tespiti 25 cm2‟lik flasklarda üretilen monolayer hücre kültürlerinin endotoksin uygulanmadan önceki ve uygulamadan sonraki canlı/ölü hücre sayısının belirlenmesi ve karĢılaĢtırması için hücreler trypan blue boyama yöntemiyle sayıldı. Test prosedürü Altman ve ark. (1993) bildirdiği yönteme göre yapıldı. Prosedüre göre; Trypan blue boyası (BDH stains) 25 g / 1000 ml olacak Ģekilde hazırlandı. 25 cm2‟lik flasklarda monolayer hücre kültürü olarak çoğaltılan hücrelerin yüzeyinden vasat yavaĢça boĢaltıldı. Vasat ile yüzeyi yıkandı ve yıkama vasatı boĢaltıldı. Yüzeye 4 ml tripsin eklendi ve 37°C‟de 2 dk etüvde inkübe edildi. Flask içerisine 2 ml vasat eklendi ve hücrelerin birbirinden ayrılması için pipetasyon yapıldı. 500 µl hücre ve 500 µl trypan blue boyası ile bir tüp içerinde karıĢtırıldı. 5 dk oda sıcaklığında bekletildi. (Canlı hücreler boya almazken ölü hücreler boya alır). Hemositometre üzerine 1‟er damla damlatıldı. Doku kültürü mikroskobunda 100X‟lük objektifle ölü ve canlı hücrelerin sayımı gerçekleĢtirildi. 1 ml‟deki canlı ve ölü hücre sayısı aĢağıda verilen formüle göre hesaplandı. Canlı/ölü hücre sayısı = Sayılan canlı/ölü hücre x Dilüsyon faktörü x Toplam hacim 29 3. BULGULAR 3.1. Bakterilerin Çoğaltılması Nutrient agara ekilen ve inkübasyona bıraklan P. aeruginosa ve E. coli O55:B5 suĢları 24 saat sonunda koloni oluĢumları gösterdi. 3.2. Mikro API Cihazı ile Suşların Saflığının Gösterilmesi Üreyen kolonilerin saflığını göstermek için Mikro API cihazı kullanıldı. SuĢların P. aeruginosa suĢu ve E. coli suĢu olduğu tespit edildi. 3.3. Koloni Sayım Yöntemi ile Bakteri Sayımı Koloni Sayım Yöntemi ile gerçekleĢtirilen bakteri sayımı sonucunda; P. aeruginosa için mililitredeki bakteri sayısı; 10-9 dilüsyonun 0,1 ml sinde yaklaĢık olarak ortalama koloni 270 sayıldı. Orijinal süspansiyonun 1 ml sinde, ortalama; göre 109= 270 x 1010 = 2700 x 109 cfu bakteri /ml E. coli için mililitredeki bakteri sayısı ise; 10-9 dilüsyonun 0,1 ml sinde yaklaĢık olarak ortalama koloni 53 olarak sayıldı. Orijinal süspansiyonun 1 ml sinde, ortalama; 30 109= 53 x 1010 = 530 x 109 cfu bakteri / ml göre olarak bulundu. Gerek P. aeruginosa ve gerekse E. coli için bakteri sayım sonuçları Çigelge 3. de özetlenmiĢtir. Çizelge 3. P. aeruginosa ve E. coli için bakteri sayım sonuçları Bakteri P. aeruginosa E. coli Diüsyon -9 1. petri 2. petri 3. petri Toplam Ortalama Koloni Koloni Bakteri sayısı (cfu bakteri/ml) 10 248 164 400 812 270,6 2700x109 10-9 56 60 44 160 53,3 530x109 3.4. Endotoksinli Stok Solüsyonlarının Sterilite Testleri Endotoksinlerin açığa çıkartılması sırasında parçalanmadan kalan bakteriler, hazırlanan hücre sistemlerinde kontaminasyona sebep olabileceğinden, tekrar nutrient agara ekimleri sonucunda; her iki suĢa ait besiyerlerinde 24 saat sonunda üreme olmadığı, bütün bakterilerin parçalanmıĢ olduğu ve süspansiyonların steril olduğu saptandı. 3.5. Jel Klot LAL testi ile Endotoksin Kontrolü Testin sonucu pozitif olarak bulundu ve stok solüsyonlarında endotoksin varlığı teyid edildi. 31 3.6. Çalışmada Kullanılacak Dilüsyon Basamaklarının Belirlenmesi Her bir sulandırma basamağına uygulanan Jel Klot LAL testi sonucunda; kullanılan her bir bakteri suĢu için endotoksin tespit edilen son sulandırma basamağı 10-3 olarak belirlendi. Bir diğer deyiĢle 10-3 dilüsyon basamağındaki endotoksin miktarı yaklaĢık 0.25 EU/mL olarak belirlendi. Her bir hücre hattı için iĢleme alınacak endotoksin yoğunlukları ise; her iki bakteri için endotoksin varlığının bittiği son basamak (10-1,10-2, 10-3) ve onun bir üstü (10-4) olarak belirlendi. Bütün çalıĢmalar kontrollü deney metodolojisine uygun olarak gerçekleĢtirildi. 3.7. Hücre Hatlarının Endotoksinle Muamele Öncesi Sayısal Değerleri Kristal viyole boyama ve ELISA reader ile canlılığın tespit edilmesi için ayrılan 96 gözlü pleytlerde gerek Vero (174. pasajda), gerek MDBK (11. pasajda) ve gerekse BHK-21 (60. pasajda) hücre hatlarında hücre miktarı, 125.000 hücre/ml olarak kullanıldı. Trypan blue boyama ve hemositometrede ölü/canlı hücre sayımı yapılması için ayrılan 25 cm2 flasklarda ise hücre hatlarının endotoksinlere maruz bırakılmadan önceki miktarları aĢağıdaki gibi tespit edildi: Vero P174 hücresi 590.000 hücre/ml MDBK P11 hücresi 670.000 hücre/ml BHK-21 P60 hücresi 370.000 hücre/ml 32 3.8. Hücre Morfolojisindeki Değişiklikler Bütün iĢlem görmüĢ Vero, MDBK ve BHK-21 hücreleri her gün kontrol hücresiyle kıyaslanarak, 100X, 200X ve 400X‟lük büyütme ile doku kültürü mikroskobunda morfolojik yönden incelendi. Buna göre; en fazla morfolojik değiĢimin görüldüğü hücre hattının Vero (+2) hücre hattı olduğu tespit edildi. Morfolojik değiĢikliklerin 2. günde (+1) meydana gelmeye baĢladığı ve 5. günde en üst seviyeye ulaĢtığı gözlemlendi. P. aeruginosa endotoksini ile muamele edilen Vero hücrelerinde hücre duvarında ve sitoplazmasında silikleĢme, intrasitoplazmik granülasyon ve vakuol oluĢumları gözlemlenirken (Resim 1), E. coli endotoksini ile muamele edilen hücrelerde üst üste katlanmalar ve yine intrastoplazmik granülasyonlar gözlemlendi (Resim 2). Resim 1: (A) P. aeruginosa (10-1 dilüsyon) endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattının görüntüsü x 100. (B) Vero hücre kontrol x 100. A Vakuol Granülasyonlar Silikleşme B 33 Resim 2: (A) E. coli (10-1dilüsyon) endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattının görüntüsü x 100. (B) Vero hücre kontrol x 100. A Katlanmalar B Her iki bakterinin endotoksini ile muamele gören MDBK hücreleri incelendiğinde ise; morfolojik açıdan herhangi bir değiĢiklik (0) gözlemlenmedi (Resim 3). Resim 3: (A) P. aeruginosa (10-1 dilüsyon) endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre hattının görüntüsü x 100. (B) MDBK hücre kontrol x 100. A B BHK-21 hücresi incelendiğinde ise; endotoksin uygulanan hücreler ile kontrol hücreleri arasında morfolojik olarak belirgin bir fark görülmemekle birlikte (0), P. aeruginosa endotoksinine maruz kalan BHK-21 hücrelerinin (10-1 dilüsyon basamağı) kontrol hücrelerine nazaran mekik Ģekilli görüntünün kısaldığı ve flask yüzeyini kaplama oranında farklılık olduğu gözlemlenmiĢtir. 34 3.9. Kristal Viyole Boyama Yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Canlılığına Etkisinin Tespiti Yapılan testlerin sonucunda, P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ Vero, MDBK, BHK-21 hücreleri için ELISA sonuçları ġekil 2.A, 2.B ve 2.C‟de verilmiĢtir. Grafikler incelendiğinde OD değerlerinin Vero hücrelerinde 2,426 ile 1,772 arasında değiĢtiği ve en belirgin farkın (0.654) 10-1 ve kontrol hücreleri arasında olduğu belirlendi. MDBK da ise Vero‟ya benzer bir Ģekilde doğrusal bir azalma olduğu ve yine belirgin farkın (0.166) 10-1 ve kontrol hücreleri arasında olduğu belirlendi. Ancak BHK-21 hücrelerine ait OD değerleri incelendiğinde herhangi bir doğrusal azalma olmadığı ve OD değerleri arasındaki farkların ve dolayısıyla hücre canlılığının endotoksin yoğunluğundan etkilenmediği saptandı. Şekil 2.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattında tespit edilen ELISA sonuçları Aktüel OD OD Değeri 0,654 1,772 -1 Kontrol arası fark 0,401 0,157 0,077 2,025 2,269 2,349 2,426 -2 -3 -4 Kontrol Endotoksin Konsantrasyonu 35 Şekil 2.B. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre hattında tespit edilen ELISA sonuçları OD Değeri Aktüel OD Kontrol arası fark 0,015 0,014 0,006 1,909 1,91 1,918 1,924 -2 -3 -4 Kontrol 0,166 1,758 -1 Endotoksin Konsantrasyonu Şekil 2.C. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücre hattında tespit edilen ELISA sonuçları OD Değeri Aktüel OD 1,078 0,973 0,929 -1 -2 -3 0,939 0,931 -4 Kontrol Endotoksin Konsantrasyonu E. coli endotoksini uygulanmıĢ Vero hücrelerinde ELISA sonuçları incelendiğinde de benzer Ģekilde, OD değerlerinde endotoksin yoğunluğu ile hücre sayısı arasında ters orantı olduğu ve kontrol hücresiyle kıyaslandığında en az hücre canlılığının 10-1 dilüsyon basamağında olduğu tespit edildi (ġekil 3.A). MDBK ve BHK-21 hücre hatlarına ait OD değerleri incelendiğinde ise herhangi bir doğrusal azalma olmadığı ve OD değerleri arasındaki farkların dilüsyondan dilüsyona değiĢtiği saptandı (ġekil 3.B ve 3.C). 36 Şekil 3.A. E. coli endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattında tespit edilen ELISA sonuçları OD Değeri Aktüel OD Kontrol arası fark 0,085 0,066 0,02 2,159 2,178 2,224 2,244 -2 -3 -4 Kontrol 0,305 1,939 -1 Endotoksin Konsantrasyonu Şekil 3.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre hattında tespit edilen ELISA sonuçları Aktüel OD OD Değeri 0,026 Kontrol arası fark 0,031 0,057 0,049 1,885 1,859 -1 1,854 -2 1,828 1,836 -3 -4 Endotoksin Konsantrasyonu Kontrol 37 Şekil 3.C. E. coli endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücre hattında tespit edilen ELISA sonuçları OD Değeri Aktüel OD 0,966 1,002 0,934 0,906 0,833 -1 -2 -3 -4 Kontrol Endotoksin Konsantrasyonu 3.10. Trypan Blue Boyama Yöntemi ile Endotoksinlerin Hücre Sayısına Etkisinin Tespiti Trypan Blue Boyama yöntemiyle boyanan ve Thoma lamında hemositometrik yöntemle sayılan Vero, MDBK, BHK-21 hücre hatlarına ait canlı/ölü hücre sayıları ve bunların toplam hücre sayısına göre yüzdeleri Çizelge 4, 5 ve 6‟te verilmiĢtir. Çizelge 4. Vero hücre hattında canlı/ölü hücre sayıları ve toplam hücre sayısına göre yüzdesi Ġnokulum Vero Hücre Sayısı Sulandırma Canlı hücre P. aeruginosa Stok Solüsyonu Sulandırmaları Stok Solüsyonu Sulandırmaları hücre 10 -1 36 (%92) 3 (%8) 10 -2 41 (%93) 3 (%7) 10 -3 48 (%96) 2 (%4) 10-4 60 (%95) 3 (%5) -1 37 (%93) 3 (%7) 10-2 45 (%94) 3 (%6) -3 50 (%96) 2 (%4) 10-4 63 (%94) 4 (%6) 10 E. coli Ölü 10 Kontrol Canlı hücre Ölü hücre 65 (%98) 1 (%2) 65 (%98) 1 (%2) 38 Bunun yanı sıra, Thoma lamında sayılan canlı ve ölü hücre sayısı her iki bakteri suĢuna ait endotoksinler ile muamele edilmiĢ Vero, MDBK ve BHK-21 hücre hatlarına ait mililitredeki canlı ve ölü hücre sayıları herbir dilüsyon basamağı için ayrı ayrı hesaplanmıĢtır. Buna göre her iki endotoksine ait Vero hücre hattındaki veriler Çizelge 4, ġekil 4.A ve B de verilmiĢtir. Şekil 4.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattının 1 ml‟sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Endotoksin konsantrasyonu -1 Canlı hücre sayısı Ölü hücre sayısı 360.000 30.000 410.000 -2 30.000 480.000 -3 20.000 600.000 -4 30.000 650.000 Kontrol 10 1 ml'deki canlı ve ölü hücre sayısı Şekil 4.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ Vero hücre hattının 1 ml‟sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Endotoksin konsantrasyonu Canlı hücre sayısı -1 -2 -3 -4 Kontrol Ölü hücre sayısı 370.000 30.000 450.000 30.000 500.000 20.000 630.000 650.000 1 ml'deki canlı ve ölü hücre sayısı 40.000 30.000 39 Çizelge 5. MDBK hücre hattında canlı/ölü hücre sayıları ve toplam hücre sayısına göre yüzdesi Ġnokulum Vero Hücre Sayısı Sulandırma Canlı hücre Ölü hücre 10-1 26 (%93) 2 (%7) Stok 10 -2 35 (%97) 1 (%3) Solüsyonu 10-3 43 (%93) 3 (%7) 10 -4 44 (%88) 6 (%12) 10 -1 33 (%97) 1 (%3) 10 -2 31 (%94) 2 (%6) Solüsyonu 10 -3 30 (%97) 1 (%3) Sulandırmaları 10-4 33 (%97) 1 (%3) P. aeruginosa Sulandırmaları E. coli Stok Kontrol Canlı hücre Ölü hücre 44 (%100) 0 33 (%100) 0 Yukarıdaki tablo sonuçları ele alınarak 25 cm2 flask içerisinde monolayer üretilen P. aeruginosa ve E. coli endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücresinin 1 ml'deki canlı ve ölü hücreleri ġekil 5.A, 5.B gösterilmiĢtir. Şekil 5.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre hattının 1 ml‟sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Endotoksin konsantrasyonu Canlı hücre sayısı -1 -2 260.000 Ölü hücre sayısı 20.000 350.000 -3 430.000 -4 440.000 Kontrol 440.000 10.000 1 ml'deki canlı/ölü hücre sayısı 30.000 60.000 40 Şekil 5.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ MDBK hücre hattının 1 ml‟sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Endotoksin konsatrasyonu Canlı hücre sayısı 330.000 -1 310.000 -2 -3 Ölü hücre sayısı 300.000 10.000 20.000 10.000 -4 330.000 10.000 Kontrol 330.000 10.000 1 ml'deki canlı/ölü hücre sayısı Çizelge 6. BHK-21 hücre hattında canlı/ölü hücre sayıları ve toplam hücre sayısına göre yüzdesi Vero Hücre Sayısı Ġnokulum P. aeruginosa Stok Solüsyonu Sulandırmaları E. coli Stok Solüsyonu Sulandırmaları Sulandırma Canlı hücre Ölü hücre 10-1 9 (%92) 2 (%8) -2 7 (%70) 3 (%30) 10-3 12 (%71) 5 (%29) 10 -4 23 (%79) 6 (%21) 10 -1 17 (%81) 4 (%19) 10 -2 16 (%80) 4 (%20) 10 -3 9 (%69) 4 (%31) 19 (%83) 4 (%17) 10 10-4 Kontrol Canlı hücre Ölü hücre 28 (%100) 0 11 (%92) 1 (%8) Yukarıdaki çizelgeye göre P. aeruginosa ve E. coli endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücresinin 1 ml'deki canlı ve ölü hücrelere ait veriler ġekil 6.A ve B de gösterilmiĢtir. 41 Şekil 6.A. P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücre hattının 1 ml‟sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Endotoksin konsantrasyonu Canlı hücre sayısı -1 -2 -3 90.000 70.000 Ölü hücre sayısı 20.000 30.000 120.000 50.000 230.000 -4 60.000 280.000 Kontrol 1 ml'deki canlı/ölü hücre sayısı Şekil 6.B. E. coli endotoksini uygulanmıĢ BHK-21 hücre hattının 1 ml‟sinde tespit edilen canlı ve ölü hücre sayıları Endotoksin konsantrasyonu Canlı hücre sayısı 170.000 -1 90.000 40.000 40.000 190.000 -4 Kontrol 40.000 160.000 -2 -3 Ölü hücre sayısı 110.000 10.000 1 ml'deki canlı/ölü hücre sayısı 40.000 42 4. TARTIŞMA Bakteriyal endotoksinler hücre kültürlerinde kullanılan ana materyallerin sıkça rastlanan kontaminantlarıdır. Bu endotoksinler çeĢitli sebeplerle su, serum ve vasatlara karıĢtığında biyolojik maddelerin kalitesini olumsuz etkileyebildiği bilinen bir gerçektir (Geier ve Geier, 2002). Özellikle oluĢabilecek ürün kayıpları neticesinde ciddi ekonomik kayıplar meydana gelebileceği gibi iĢ gücü kaybına da yol açabilmektedir. Bu maddelerin organizmadaki varlığı ise, yoğunluğuna bağlı olarak hafifden ağıra kadar değiĢen fizyopatolojik sonuçlar doğurur (Bui, 2012). Bu fizyopatolojilerin ana sebebini endotoksinlerin immün sisteminden çeĢitli medyatörlerin salınmasına sebep olması oluĢturur (Forehand ve ark., 1989; Rietschel ve ark., 1994). Bu çalıĢmada, bakteri endotoksin varlıkları jel klot LAL testi ile tespit edilerek, aĢı üretiminde kullanılan Vero, MDBK, BHK-21 gibi hücre hatlarına etkisinin deneysel olarak araĢtırılması ve bunun yanı sıra çalıĢma süresince hücre hatlarında meydana gelen sayısal ve morfolojik değiĢikliklerin belirlenmesi ve kıyaslanması da amaçlanmıĢtır. Günümüzde gerek biyolojik materyallerde ve gerekse biyolojik araĢtırmalarda kullanılan maddelerde endotoksinlerin varlığını tespit etmek için birçok test kullanılmakta ve var olanların üzerine yenileri geliĢtirilmektedir. Bunların baĢında ELISA prensibini kullanılarak geliĢtirilen endotoksin testleri ve organizmada pirojenlere verilen yanıtı taklit eden monosit aktivasyon testleri yer almaktadır. Ancak bu tip testler spesifik ve hassas olmakla birlikte maliyetleri yüksektir. Endotoksinleri ve diğer pirojenleri tespit etmek için kullanılan bu teknikler birçok araĢtırmanın konusunu oluĢturmuĢ ve testlerin kendi aralarında karĢılaĢtırmaları yapılmıĢtır. Yapılan bu bilimsel araĢtırmalar ve bunlardan elde edilen veriler değerlendirildiğinde, biyolojik materyallarde endotoksin tespiti için jel klot LAL testinin gerek spesifik ve hassas olması ve gerekse kısa sürede yanıt alınarak gözle değerlendirilebilmesi ve maliyetinin düĢük olması sebebiyle halen en değerli araç 43 olduğu anlaĢılmaktadır (Asakawa ve ark. 1994; Joiner ve ark., 2002; Park ve ark., 2005; Schindler ve ark., 2009). Bu gerçek, araĢtırmamızda endotoksinlerin tespiti için jel klot LAL testinin kullanılmasında belirleyici faktör olmuĢtur. ÇalıĢmamızda endotoksinlerini kullandığımız P. aeruginosa ve E. coli suĢlarının nutrient agarda çoğaltılması sonucunda stok kültürde bakteri sayıları mililitrede sırasıyla 2700x109 ve 530x109 cfu bakteri/ml olarak hesaplandı. Çoğaltılan bu bakterilerin inaktive edilerek endotoksinlerinin açığa çıkarılması sonucunda gerçekleĢtirilen jel klot LAL testi, hazırlanan süspansiyonlarda 10-3 dilüsyon basamağına kadar endotoksin varlığını tespit etmiĢtir. Dolayısı ile jel klot LAL testinin hassasiyetine bağlı olarak, 10-3 dilüsyon basamağındaki endotoksin miktarı yaklaĢık 0.25 EU/mL olarak kabul edilmiĢtir. ÇalıĢmamızda toksik etkilerini araĢtırdığımız endotoksinlerin tüm sulandırmalarının (10-1, 10-2 ve 10-3) uluslararası kabul edilebilir limitlerin üzerinde endotoksin içerdiği ve yukarıda sayısal değerleri verilen bakteri yoğunluklarının Hoffmann ve ark. (2005)'nın belirttiği kabul edilebilir limitlerin çok üzerinde endotoksin içerdiği sonucuna varılmıĢtır. AraĢtırmamızda Vero hücre hattının P. aeruginosa ve E. coli‟nin endotoksinlerinin farklı yoğunluklarına karĢı verdiği morfolojik ve fizyolojik cevaba iliĢkin bulgular değerlendirildiğinde; Vero hücre hattında morfolojik olarak, 1. gün hücre morfolojisinde gözle görülür bir değiĢiklik saptanmamakla birlikte, 2. günden itibaren kontrol hücreleri ile kıyaslandığında, endotoksin uygulanmıĢ hücrelerde, endotoksinin yoğunluğu ile doğru orantılı olarak hücre stoplazmasında vakuol oluĢumları ve granülasyonlar gözlemlenmiĢtir (Resim 1). Ayrıca P. aeruginosa endotoksini Vero hücrelerinde silikleĢme Ģeklinde etki gösterirken, E. coli endotoksini uygulanan hücrelerde ise üst üste katlanmalar gözlemlenmiĢtir (Resim 2). Elde edilen bu bulgular Konowalchuk ve ark. (1977)'nın bulduğu sonuçlarla paralellik göstermektedir. Bu araĢtırıcılar E. coli sitotoksinine karĢı Vero hücre hattının yanıtını incelemiĢler ve Vero hücrelerinde benzer değiĢikliklerin olduğunu göstermiĢlerdir. Dawson (1998) ise 44 hücre membranları ile endotoksinlerin etkileĢimleri sonucunda hücrede meydana gelebilecek değiĢimleri, özellikle hücre membranında dalgalanma, sitoplazmada büyük vakuol oluĢumları ve hücre membranında ciddi hasarlar meydana geldiğini göstererek vurgulamıĢtır. Benzer Ģekilde, Carbonell ve ark. (1997), Serratia marcescens‟in klinik izolatlarının Vero hücresinde sitotoksik aktivitesinin etkilerini araĢtırmıĢlar ve Vero hücrelerinde büzüĢme olmadan yuvarlaklaĢma, birbirinden ayrılma gibi sitotoksik etkiler saptamıĢlardır. Vero hücre hattının E. coli ve P. aeruginosa endotoksinine verdiği fizyolojik yanıtı belirlemek için kullanılan kristal viyole ve trypan blue boyama teknikleriyle elde edilen veriler incelendiğinde; Kristal viyole testinde ortaya çıkan OD değerleri (ġekil 2.A ve 3.A); endotoksin yoğunlukları ile canlı hücre yoğunluğunun arasında ters orantı olduğunu ortaya koymuĢtur. Dolayısıyla, kontrol hücreleriyle kıyaslandığında en az hücre yoğunluğunun yoğun endotoksin konsantrasyonuna maruz bırakılmıĢ hücrelerde olduğu gözlenmiĢtir. Bu veriler doğrultusunda kontrol gözlerindeki canlı hücre yoğunluğunun, yüksek endotoksin konsantrasyonu uygulanmıĢ hücrelere göre daha fazla olduğu sonucuna varılmıĢtır. Diğer taraftan, endotoksinlerin Vero hücre hattında trypan blue boyama ile hemositometrik canlı/ölü hücre sayımı sonucunda meydana gelen ölüm ve canlılık oranlarına ait veriler, E. coli ve P. aeruginosa endotoksini uygulanmıĢ Vero hücrelerinde en az canlı hücre sayısının 10-1 dilüsyon basamağında olduğu tespit edilmiĢtir. Bununla birlikte, ilginç olarak, değiĢik endotoksin yoğunluklarında ölü hücre sayısında herhangi bir değiĢim meydana gelmediği gözlenmiĢtir (ġekil 4.A ve 4.B). Vero hücrelerinin endotoksin varlığına verdiği bu yanıtlar göz önüne alındığında, özellikle hücre sayısının azalmasına rağmen ölü hücre oranın değiĢmemesi, endotoksinlerin bu hücre hattında hücre ölümüne değil de, hücre mitozuna olumsuz etki ettiğini düĢündürmektedir. 45 AraĢtırmamızda MDBK hücre hattının P. aeruginosa ve E. coli‟nin endotoksinlerinin farklı yoğunluklarına karĢı verdiği morfolojik ve fizyolojik cevaba iliĢkin bulgular değerlendirildiğinde; Morfolojik olarak endotoksinlerin farklı yoğunluğuna maruz bırakılmıĢ MDBK hücre hatlarında mikroskobik olarak hücre morfolojisinde gözle görülür bir değiĢiklik saptanmamıĢtır (Resim 3). MDBK hücre hattının E. coli ve P. aeruginosa endotoksinine verdiği fizyolojik yanıtı belirlemek için kullanılan kristal viyole ve trypan blue boyama teknikleriyle elde edilen veriler incelendiğinde ise, gerek hücre yoğunlukları ve gerekse canlı/ölü hücre oranları baz alındığında, bu iki endotoksinin MDBK hücreleri üzerine olan etkisinin farklı olduğu tespit edilmiĢtir (ġekil 2.B, 3.B, ġekil 5.A, 5.B). Buna göre, P. aeruginosa endotoksinine maruz bırakılan MDBK hücrelerinin, dilüsyon basamakları arasındaki OD değerlerinin birbirine yakın olduğu tespit edilmekle birlikte, hücre yoğunluklarının Vero‟ya benzer bir Ģekilde doğrusal bir azalma gösterdiği ve yine belirgin farkın 10-1 ve kontrol hücreleri arasında olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 2B). Yine P. aeruginosa endotoksinlerinin aynı hücre hattında meydana getirdiği ölüm ve canlılık oranının saptanması amacıyla yapılan trypan blue boyama yöntemi ile sayılan canlı hücre sayısının, endotoksin yoğunluğunun artmasıyla birlikte azaldığı saptanmıĢtır. Ölü hücre sayısının değiĢmemesi ise yine dikkat çekici bir bulgu olarak kaydedilmiĢtir (ġekil 5A). Bu verilere paralel olarak Fujioka ve Akema (2010) çalıĢmalarında, lipopolisakkaritlerin, olgun sıçanların dental gyruslarındaki nöral öncü hücrelerin ölümünü artırmadığını, fakat çoğalmasını engelleyerek akut olarak baskıladığını göstermiĢlerdir. Forbes (1965), endotoksinlerin makrofajların mitoz bölünmesine etkisini araĢtırdığı çalıĢmasında, endotoksinlerin veya bunların metabolizması sonucu oluĢan ürünlerin makrofajlarda geri dönüĢümsüz hasara yol açtığını öne sürmüĢtür. Malik ve ark. (1995)'nın Salmonella serovarlarının sitotoksik etkisini araĢtırdığı çalıĢmalarında ise, MDBK ve Vero hücre hatlarında farklı serovarların farklı sitotoksik etki gösterdiğini ve hücrelerdeki bu etkilerin doza bağlı olduğunu gözlemlemiĢlerdir. 46 Aynı hücre hattının E. coli endotoksinin değiĢik yoğunluklarına verdiği cevabın değiĢken olduğu gözlenmiĢtir. Yapılan testler sonucunda gerek kristal viyole ve gerekse trypan blue boyama yöntemi sonucunda canlı hücre yoğunluklarının ve ölü/canlı hücre sayısının endotoksin yoğunluklarına bağlı olmaksızın değiĢken olduğu belirlenmiĢtir (ġekil 4B, 6B). Buna göre, MDBK hücre hattının E. coli endotoksinine karĢı daha dirençli olduğu düĢünülmüĢtür. Varılan bu sonucu destekler nitelikte, yapılan araĢtırmalarda çeĢitli bakteri endotoksinlerinin farklı hücre hatlarında etki derecesinin değiĢken olduğu bildirilmiĢtir. (Harlan ve ark. 1983; Reitmeyer ve Peterson, 1988; Dawson, 1998). Bunlara ek olarak, Berjis ve Green (1986) tümorojenik MDCK (Madin-Darby canine kidney) T1 hücrelerinde L- canavin‟in seçici sitotoksitite çalıĢmalarında, toksin uygulanan tumorojenik MDCK T1 hücrelerinin büyüme oranlarında herhangi farklılık olmadığını bildirilmiĢtir. ÇalıĢmada BHK-21 hücre hattının endotoksine verdiği morfolojik ve fizyolojik cevap diğer iki hücre hattına göre daha değiĢken olmuĢtur. Bu hücre hattının her gün doku kültürü mikroskobunda yapılan incelemelerinde morfolojik olarak kontrol hücrelerine nazaran mekik Ģekilli görüntünün kısaldığı ve normalde olması gereken baĢak tarlası görünümünün yerine hücrelerde kısalmaya bağlı olarak flask yüzeyini kaplama oranında farklılık olduğu gözlemlendi. Aynı hücre hattının endotoksinlere verdiği fizyolojik cevap incelendiğinde, Hücre canlılığınına ait OD değerlerinin endotoksin yoğunluğuna bağlı olmaksızın test gözleri arasında değiĢkenlik gösterdiği saptanmıĢtır. Dolayısıyla hücre canlılığının endotoksin yoğunluğundan etkilenmediği saptandı (ġekil 2C, 3C). Yine BHK-21 hücre hattının trypan blue boyama yöntemi ile canlı/ölü hücre sayısına bakıldığında da dilüsyon flaskları ve kontrol flaskı dahil olmak üzere canlı ve ölü hücre sayısı endotoksin miktarına bağlı olmaksızın birbirinden farklı olduğu belirlendi. Bu bulgu da, endotoksinlerin BHK-21 hücre hattı üzerinde hücre ölümü veya canlılığına etki etmediğini düĢündürmüĢtür. Masuzawa ve ark. (1990), in vitro olarak 500 µg/ ml dozunda PAgslar‟ın (koruyucu antijenler), fare makrofajlarının peritonal eksudatları üzerine zayıf bir sitotoksik etki gösterdiği, ancak BHK-21 47 hücreleri üzerine herhangi bir toksik etki göstermediği tespit etmiĢtir. Bu çalıĢmada BHK-21 hücrelerine ait elde edilen veriler çalıĢmamızda elde ettiğimiz bulguları destekler niteliktedir. TartıĢılan tüm bu veriler, sonuç olarak Vero, MDBK ve BHK-21 hücre hatlarının E. coli ve P. aeruginosa endotoksinine karĢı değiĢken cevaplar verdiğini göstermiĢtir. Vero hücre hattı, her iki endotoksine karĢı gerek morfolojik ve gerekse fizyolojik olarak en duyarlı hücre hattı olarak bulunmuĢ iken, bu endotoksinlerin MDBK hücre hattında morfolojik bir değiĢikliğe yol açmamakla birlikte, P. aeruginosa endotoksininin hücre yoğunluğunda azalmaya sebep olduğunu, E. coli'nin ise hücre yoğunluğunu etkilemediğini göstermiĢtir. BHK-21 hücre hattında ise morfolojik değiĢiklikler gözlemlenmesine karĢın, yapılan diğer testlerin sonucunda her iki endotoksine karĢı anlamlı sonuçlar elde edilememesi, bu hücre hattının E. coli ve P. aeruginosa endotoksinine daha dirençli olduğunu düĢündürmüĢtür. Morrisson ve ark. (1994) ve Ryan (2004) endotoksinlerin tüm hücre hatlarını aynı Ģekilde etkilemediğini, bazı hücre hatlarını daha çok etkilerken bazılarını daha az etkilediğini bilmiĢlerdir. Bunun sebebi olarak da bazı hücre hatlarının endotoksin reseptörlerinden yoksun olabileceğini ve bunun sonucunda da endotoksinlerden daha az etkilenebileceğini öne sürmüĢlerdir. Diğer bir sebep olarak da uzun yıllar boyunca seri pasajları yapılan hücre hatlarının bu uzun süreç içerisinde endotoksinlere karĢı doğal direnç kazanmıĢ olabileceklerini öne sürmüĢlerdir. Adı geçen endotoksinlere ait BHK-21, MDBK, Vero hücre hatlarında yapılan tüm testlerin sonucunda, tüm parametreler Ģu veya bu Ģekilde değiĢmiĢ iken, değiĢmeyen tek parametre kullanılan tüm hücre hatlarında meydana gelen ölü hücre sayısının değiĢmemesi dikkat çekici bir bulgu olarak karĢımıza çıkmıĢtır. Bu dikkat çekici bulgu, endotoksinlerin hücre hatlarında özellikle mitoz bölünme sürecine etki ettiğini düĢündürmektedir. 48 Gelecekte bu verilerin, endotoksinlerin değiĢik hücre hatlarında hücre mitozuna etkisinin araĢtırılacağı ve bunlara iliĢkin süreçlerin inceleneceği daha detaylı çalıĢmalara ıĢık tutacağı düĢünülmektedir. 49 5. SONUÇ AraĢtırmada, bakteri endotoksinlerinin aĢı üretiminde kullanılan Vero, MDBK, BHK-21 gibi hücre hatlarına etkisinin deneysel olarak araĢtırılması amaçlanmıĢtır. Bu amaçla, çalıĢma süresince hücre hatlarında meydana gelen sayısal ve morfolojik değiĢikliklerin belirlenmesi ve birbiriyle kıyaslanması gerçekleĢtirilmiĢtir. Yapılan çalıĢma sonucunda elde edilen veriler değerlendirildiğinde Ģu sonuçlara varılmıĢtır. 1) Vero, MDBK ve BHK-21 hücre hatlarında üzerine endotoksinlerin değiĢken etki gösterdiği ve aynı zamanda farklı endotoksinlerin farklı hücre hatları üzerine etkisinin de değiĢiklik gösterdiği saptanmıĢtır. 2) Hücre morfolojisi ve in vitro ortamda hücre sayısal değerleri baz alındığında: Vero, MDBK, BHK-21 hücre hatları içerisinde gerek P. aeruginosa gerek E. coli endotoksininin değiĢik yoğunluklarından en çok etkilenen hücre hattının Vero hücre hattı olduğu tespit edilmiĢtir. 3) BHK-21 hücre hattında ise hücre canlılığı ve canlı/ölü sayısının endotoksin yoğunluğuna bağlı olmaksızın değiĢenlik gösterdiği saptanmıĢtır. 4) MDBK hücre hattının ise, her iki bakteri endotoksinin değiĢik yoğunluklarına karĢı cevabı değiĢken olmuĢtur. Buna göre P. aeruginosa endotoksinine maruz kalmıĢ hücrelerin yoğunluğu ile endotoksin konsantrasyonu arasında ters orantı olduğu sonucuna varılmıĢtır. Aynı hücre hattı E. coli endotoksinin farklı yoğunluklarına yine değiĢken yanıt vermiĢtir. Yukarıda anlatılan sonuçlar tek tek değerlendiğinde; adı geçen üç hücre hattı içerisinde endotoksine en fazla duyarlı hücre hattının Vero olduğu anlaĢılmıĢtır. Bu da endotoksinlerin hücrelere etkisinin araĢtırıldığı çalıĢmaların büyük bir kısmının neden Vero hücreleriyle yapıldığını açıklamaktadır. Bunun yanı sıra diğer hücre hatları belirli endotoksin yoğunluklarına maruz kaldıklarında, verilen cevabın 50 yoğunluk oranı ile iliĢkili olmaksızın değiĢken olması, bu hücre hatlarının endotoksinlere daha dirençli olduğunu düĢündürmektedir. Ancak, Vero hattının her iki endotoksinin farklı yoğunluklarına verdiği cevap incelendiğinde; özellikle hücrenin ölüm oranında bir değiĢiklik meydana gelmemesine karĢın sayısal bir azalma meydana gelmesi, endotoksinlerin Vero hücrelerinin özellikle mitoz bölünme sürecine etki ettiğini düĢündürmektedir. Gelecekte bu verilerin, endotoksinlerin hücre mitozuna etkisinin araĢtırılacağı ve bunlara iliĢkin süreçlerin inceleneceği daha detaylı çalıĢmalara ıĢık tutacağı düĢünülmektedir. 51 ÖZET Bakteri Endotoksinlerinin Aşı Üretiminde Kullanılan Devamlı Hücre Hatlarına Etkisinin Araştırılması Bu çalıĢmada, bakteri endotoksinlerinin aĢı üretiminde kullanılan devamlı hücre hatlarına etkisi deneysel olarak araĢtırılmıĢtır. Bu amaçla, çalıĢma süresince hücre hatlarında meydana gelen sayısal ve morfolojik değiĢiklikler belirlenmiĢ ve hücre hatları arasındaki farklar kıyaslanmıĢtır. Devamlı hücre hatları olarak Vero, MDBK ve BHK-21 hücre hatları tercih edilmiĢtir. Aynı zamanda endotoksin elde edilecek bakteriler olarak, doğada yaygın bulunması sebebiyle P. aeruginosa ve E. coli tercih edilmiĢtir. AraĢtırmada kullanılan P. aeruginosa ve E. coli'ye ait endotoksinlerin varlıkları tüm stok solüsynlarında ve dilüsyon oranlarında jel klot LAL testi ile teyid edilmiĢtir. Endotoksinlerin bu hücre hatları üzerine morfolojik etkisini incelemek amacıyla Vero, MDBK ve BHK-21 hücreleri doku mikroskobunda hergün incelendi. Vero hücresinde vakuol ve granülasyon oluĢumları tespit edildi. Endotoksine maruz kalan hücrelerin hücre canlılığını tespit etmek amacıyla yapılan ELISA testi sonucunda Vero, MDBK ve BHK-21 hücrelerinin değiĢen miktarlarda endotoksinden etkilendiği tespit edilmiĢtir. En fazla etkilenen hücre hattının da Vero hücre hattı olduğu tespit edilmiĢtir. Endotoksinlerin hücre hatlarında hücre sayısına etkisinin belirlenmesi için yapılan trypan blue boyama yönteminde ise hücre hatlarında farklı veriler elde edilmiĢtir. En belirgin olarak Vero hücre hattında canlı hücre sayısı endotoksin 52 miktarı ile ters orantılı olarak azalıĢ göstermiĢtir. Diğer hücre hatlarında ise canlı hücre oranı değiĢkenlik göstermiĢtir. Elde edilen verilere göre bu üç hücre hattı içerisinde endotoksine en fazla duyarlı hücre hattının Vero hücre hattı olduğu ortaya çıkarılmıĢtır. Bunun yanı sıra diğer hücre hatları belirli endotoksin yoğunluklarına maruz kaldıklarında verilen cevabın yoğunluk oranı ile iliĢkili olmaksızın değiĢken olması endotoksinlere karĢı daha dirençli olduğunu düĢündürmektedir. Ayrıca hücre hatlarında endotoksinlerin hücre ölüm oranına etki etmediği sonucuna varılmıĢtır. Anahtar Kelimeler: BHK-21, Endotoksin, Escherichia coli, Jel klot LAL testi, MDBK, Pseudomonas aeruginosa, Vero. 53 SUMMARY The aim of this study was to determine the effects of bacterial endotoxins on various cell lines used in vaccine production and other biyological products. For this purpose quantitative and morphlogical changes at various cell lines had been determined and compared. Vero, MDBK and BHK-21 cell lines was prefered as continous cell lines. On the other hand, P. aeruginosa and E. coli was prefered as bacteria to derive endotoxins since they have been found abundantly in nature. Existance of P. aeruginosa and E. coli endotoxins used in this research were confirmed by gel clot LAL test in all stock solutions and dilutions. Vero, MDBK and BHK-21 cell cultures were daily examined microscopically in order to detect the morphological effects of endotoxins on cell cultures. Granulation and vacuolisation has been detected on Vero cell line. The results of the ELISA technique which was used for detection of cell viabiliy on cell lines objected to bacterial endotoxines revealed that, all the cell lines were effected from endotoxines at varying levels. The most effected cell line was found to be the Vero among others. In order to determine the effect of endotoxins on over all cell number in culture enviroment, trypan blue staining method was performed. Although data achieved from these studies exhibit inconsistancy, live cell numbers in Vero cell line had declined as endotoxin concentration increased. On the contrary, in other cell lines, live cell ratio exhibit inconsistancy. 54 According to these data achieved, it is concluded that the most susceptible cell line against endotoxins among tested was Vero. On the other hand, it seems that other cell lines were more resistant to endotoxins since they exhibit various response to endotoxins regardless the concentration of endotoxin. Furthermore it is concluded that endotoxins do not effect the overall cell death ratio in these cell lines. Key Words: BHK-21, Endotoksin, Escherichia coli, Gel clot LAL test, MDBK, Pseudomonas aeruginosa, Vero. 55 KAYNAKLAR AKALIN, H. (2004). Pseudomonas infeksiyonları. 6. Antimikrobik Kemoterapi Günleri, Program ve Özet kitabı, Ġstanbul., 124-130. ALTMAN, S.A., RANDERS, L., RAO, G. (1993). Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell viability determinations. Biotechnol. Prog, 9:671-74. ANSPACH, F.B. (2001). Endotoxin removal by affinity sorbents. J. Biochem. and Biophy. Met., 49:665-681. ARDA, M. (2011). Temel Mikrobiyoloji Kitabı. 4.Baskı Medisan Yayınları71/Ankara. 218-220. ASAKAWA, S., FUJIWARA, H., NAITO, S., HOMMA, R., ISHIDA, S., CHINO, F., TSUCHIYA, M., MATSUURA, S., TANAKA, S., OHKI, M. (1994). Application of the Limulus test for practical quality control on endotoxin content in commercial human serum albumin (HSA) products. In comparison with the rabbit pyrogen test.Yakugaku Zasshi., 114(11):888-93. BATES, D.W, PARSONNET, J., KETCHUM, P.A., MILLER, E.B., NOVITSKY, T.J., SANDS, K., HIBBERD, P.L., GRAMAN, P.S., LANKEN, P.N., SCHWARTZ, J.S., KAHN, K., SNYDMAN, D.R., MOORE, R., BLACK, E. VE PLATT, R. for the AMCC Sepsis Project Working Group (1998). Limulus amebocyte lysate assay for detection of endotoxin in patients with sepsis syndrome. Clin Infect Dis. 27(3): 582-591. BEKAR, M. (1997). Enterobacteriaceae familyası mikroorganizmaları genel karakterleri ve tanı yöntemleri. Vet. Kont. ve ArĢ. Enst. Müd. Etlik-Ankara Yayın No. 97-1, P:17,53. BERKER, K.A. ve HOLD, S.A. (1983). The invitro effect of actinobacillus actinomycetemcomitans strain Y4 lypopolisaccaride on murine peritoneal macraphages. Can. J. Microbiol., 29:1552-1563. BERJIS, M. ve GREEN, M.H. (1986). Selective cytotoxicity of L-canavanine in tumorigenic Madin-Darby canine kidney T1 cells. Chem. Biol. Interact. 60(3): 305-15. 56 BERTHOLD, W., WALTER, J. (1994). Protein purification: aspects of processes for pharmaceutical products. Biologicals 22:135-150. BILGEHAN, H. (2000). Fermentasyon yapmayan gram olumsuz bakteriler "Bilgehan, H., (ed): Klinik Mikrobiyoloji Özel Bakteriyoloji ve Bakteri Ġnfeksiyonları" kitabı, Fakülteler Kitapevi, Ġzmir, 422. BROWN, S.A. (1982). Cell culture the methods: A symposium. American Society for Testing and Metarials. Library of Congress Catalog Card Number : 8370421. BRUNN, G.J., PLATT, J.L. (2006). The etiology of sepsis: turned inside out. Trends in Mol. Med. 12:10-16. BUI, A. (2012). Structual characteristics of bacterial endotoxins. Doktora tezi. University of PECS. Doctoral School of Chemistry PECS / Denmark. CASE-GOULD, M.J. (1984). Endotoxin in Vertebrate Cell Culture: Its Measurement and Significance in Uses and Standardization of Vertebrate Cell Lines, (Tissue Culture Association, Gaithersburg, MD,) 125-136. CARBONELL G.V. ALFIERI A.F., ALFIERI A.A., VIDOTTO M.C., LEVY C.E., DARINI A.L., YANAGUITA R.M. (1997). Detection of cytotoxic activity on Vero cells in clinical isolates of Serratia marcescens. Brazilian J. Med. Biol. Res., 30:1291-1298. CO, T.U.I., HOPE, D., SCRĠFT, M.H. VE POWERS, J., (1944). Purified pyrogen from Eber thella typhosa. A preliminary report on its preparation and its chemical and biologic characterization. J. Lab. Clin. Med., 29:58-62. DARKOW, R., GROTH, T., ALBRECHT, W., LÜTZOW, K., PAUL, D. (1999). Functionalized nanoparticles for endotoxin binding in aqueous solutions. Biomaterials. 20(14):1277-83. DAVID, A.G, MARK, R.G. (2002). Clinical implications of endotoxin concentrations in vaccines. Ann Pharmacother; 36:776-780. DAWSON, M.E. (1998). The significance of endotoxin to cell culture and biotechnology. Associates of cape cod incorporated. Vol. 16, No.1. DREXLOR, I., HELLER, K., WAHREN, B., ERFLE, V., SUTTER, G. (1998). Higly attenuated modified vaccinia virus Ankara replicates in Baby Hamster 57 Kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells. J. Gen. Virol. 79:347-352. ERDEM, B. (1999). Pseudomonaslar, " Ustaçelebi ġ. (ed): Temel ve Klinik Mikrobiyoloji" kitabı, GündeĢ Kitapevi, Ankara, 551-557. ESENDAL Ö.M. (2006). Pseudomonas Enfeksiyonları. "Aydın N. ve Paracıklıoğlu J., (eds): Veteriner mikrobiyoloji (Bakteriyel Hastalıklar)" kitabı, Ġlke emek yayınları. 129-133. FISKE, J.M., ROSS, A., VANDERMEID, R.K., MCMICHAEL, J.C., ARUMUGHAM, (2001). Method for reducing endotoxin in Moraxella catarrhalis Usp A2 protein preparations. J. Chrom. B., 753:269-278. FORBES, I.J., (1965). Induction of mitosis in macrophages by endotoxin. J. Immunol., 94:37-9. FOREHAND, J.R., PABST, M.J., PHILLIPS, W.A., JOHNSTON, J.R.B., (1989). Lipopolysaccharide priming of human neutrophils for an enhanced respiratory burst. Role of intracellular free calcium. J. Clin. Invest., 83:74-83. FORRESTER, A., FARRELL, H., WILKINSON, G., KAYE, J., DAVISPOYNTER, N., MINSON, T. (1992). "Construction and properties of a mutant of herpes simplex virus type 1 with glycoprotein H coding sequences deleted". J. Virol., 66(1):341–8. FRESHNEY, R.I. (2005). Culture of Animal Cells: a Manual of Basic Technique, 5th edition, Wiley-Liss. FREUDENBERG, M.A., MEIER-DIETER, U., STAEHELIN, T., GALANOS, C. (1991). Analysis of LPS released from Salmonella abortus equi in human. Microb. Pathogen., 10:93-104. FUJIOKA, H., AKEMA, T. (2010). Lipopolysaccharide acutely inhibits proliferation of neural precursor cells in the dentate gyrus in adult rats. Brain Res. 1352:3542. GALANOS, C., FREUDENBERG, M.A., (1993). Mechanisms of endotoxin shock and endotoxin hypersensitivity. Review. Immunobiol., 187(3-5):346-56. GEIER, D. ve GEIER, M. (2002). Clinical implications of endotoxin concentrations in vaccines. Ann Pharmacother; 36:776-780. 58 GEIER, M.R., STANBRO, H., MERRIL, C.R. (1978). Endotoxins in commercial vaccines. App. Env. Microbiol., 36(3):445-449. GOLENBOCK, D.T., HAMPTON, R.Y., QURESHI, N., TAKAYAMA, K., RAETZ, C.R.H. (1991). Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes. J. Biol. Chem., 266:19490-19498. GORBET, M.B., SEFTON, M.V. (2006). Endotoxin: The uninvited guest. Biomaterials, 26:6811-6817. GOVORKOVA, E.A., KAVERIN, N.V., GUBOREVA, L.V., MEIGNIER, B., WEBSTER, R.G. (1995). Replication of Influenza A viruses in a Green Monkey Kidney continious cell line (Vero). J. Infect. Dis., 172(1):250-253. HARLAN, J.M., HARKER, L.A., STRIKER, G.E., WEAVER, L.J. (1983). Effects of lipopolysaccharide on human endothelial cells in culture. Thromb Res., 29(1):15-26. HAY, R.J. (1991). Cell line preservation and characterisation. In Masters, J.R.W. (Ed.). Animal Culture, A practical approach. Oxford, U.K, IRL Press at Oxford University Press., 95-148. HECKER, W., WITTHAUER, D., STAERK, A. (1994). Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA J. Pharm. Sci. Technol., 48(4):197204. HEILMAN, D.H. (1965). In vitro studies on changes in the reticuloendothelial system of rabbits after an injection of endotoxin. J. Reticuloendothel. Soc., 2(2):89-104. HEILMAN, D.H. (1968). In vitro toxicity of endotoxin for macrophages of young guinea pigs and rabbits. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 33(5):501-10. HEUMANN, D., ROGER, T. (2002). Initial responses to endotoxinas and Gramnegative bacteria. Clin. Chim. Acta, 323:59-72. HIRAYAMA, C., SAKATA, M. (2002). Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. J. Chrom. B., 781:419-432. HOADLEY, A.W. ve MCCOY, E. (1968). Some observations on the ecology of Pseudomonas aeruginosa and its occurrence in the intestinal tract of animals. Cornell Vet., 58:354. 59 HOFFMANN, S., PETERBAUERE, A., SCHINDLERA, S., FENNRICHA, S., POOLEB, S., MISTRYB, Y., MONTAG-LESSINGC, T., SPREITZERC, I., LOSCHNERC, B., AALDEREND, M.V., BOSD, R., GOMMERD, M., NIBBELINGD, R., WERNER-FELMAYERE, G., LOITZLE, P., JUNGIF, T., BRCICF, M., BRUGGERG, P., FREYG, E., BOWEH, G., CASADOH, J., COECKEH, S., LANGEH, J., MOGSTERI, B., NÆSSI, L.M., AABERGEI, I.S., WENDELA, A., HARTUNGA, T. (2005). International validation of novel pyrogen tests based on human monocytoid cells. J. Immunol. Methods. 298(1-2):161-73. HOU, K.C. ve ZANIEWSKI, R. (1990). Depyrigenation by endotoxin removal with positively charged depth filter cartridge. J. Parent. Sci. Tech., 44:204-209. HUSSAINI, S.N. ve READY, R.A. (1981). Studies on Escherichia coli vaccines: estimation of endotoxins in veterinary vaccines. Vet. Res. Commun., 5(2):1715. IZGUR M. (2006). Enterobakteri infeksiyonları. " Aydın N. ve Paracıklıoğlu J., (eds): Veteriner mikrobiyoloji (Bakteriyel Hastalıklar)" kitabı, Ġlke emek yayınları. 110,112. JAFFE, E.A., NACHMAN, R.L., BECKER, G.C., NININCK, C.R. (1973). Culture of human endothelial cells derived from umblical veins. J. Clin. Invest., 53:2745-2756. JOHN D.L. ve KENNETH E.A. (1988). Validation of a heating cell for precisely controlled studies on the thermal destruction of endotoxin in glass. J. Parenteral Sci. Technol., 42:9-14. JOHNE, B., GAUDERNACK, G. ve MORLAND, B. (1987). Effect of endotoxins from Bacteriodes intermedius and Escherichia coli on human monocytes invitro. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand., 95(Sec C):241-250. JOINER, T.J., KRAUS, P.F., PHD KUPIEC, T.C. (2002). Comparison of endotoxin testing methods for pharmaceutical products. Int. J. Pharm. Compound., 6(6):408-409. KESSEL, R.W., BRAUN, W., PLESCIA, O.J. (1966). Endotoxin cytotoxicity: role of cell-associated antibody. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 121(2):449-52. 60 KIRIKAE, T., KIRIKAE, F., SAITO, S., TOMINAGA, K., TAMURA, H., UEMURA, Y., YOKOCHI, T., NAKANO, M. (1998). Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother., 42(5):101521. KONEMAN, E., STEPHAN, D.A., WILLIAM, M.J., SCHRECKENBERGER, P.C., WINN, C.W. J.R. (2006). The nonfermentative Gram-negative bacilli. Konoman‟s Colour Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology 6th Edition. Philadelphia, Lippincott: 303-391. KONOWALCHUK J., SPEIRS J. I. VE STAVRIC S. (1977). Vero Response to a Cytotoxın of Escherichia coli. Infect. and Ġmmun., 18:775-779. LIN, M.F., WILLIAMS, C., MURRAY, M.V., ROPP, P.A. (2005). Removal of lipopolysaccharides from protein-lipopolysaccharide complex by nonflammable solvents. J. Chrom. B., 816:167-174. LINDL, T., STEUBING, R. (2013). Animal cell lines. 328-472. "Atlas of Living cell cultures" kitabı. John Wiley & Sons. West Sussex England. ISBN: 3527769930. LOPPNOW, H., BRADE, H., DUÈRRBAUM, I., DINARELLO, C.A., KUSUMOTO, S. RIETSCHEL, E.Th. (1989). IL-1 induction-capacity of defined lipopolysaccharide partial structures. J. Immunol., 142:3229-3238. MAGALHÃES, P.O., LOPES, A.M., MAZZOLA, P.G., RANGEL-YAGUI, C., PENNA, T.C., PESSOA, A.JR. (2007). Methods of endotoxin removal from biological preparations: a Review. J. Pharm. Pharmaceut. Sci. (www. cspsCanada.org), 10(3):388-404. MALIK, P., SHARMA, V.D., CHANDRA, R. (1995). Cytotoxigenicity in Salmonella serovars. Indian J. Exp. Biol., 33(3):177-81. MASUZAWA, T., NAKAMURA, R., SHIMIZU, T., YANAGIHARA, Y. (1990). Biological activities and endotoxic activities of protective antigens (PAgs) of Leptospira interrogans. Zentralbl. Bakteriol., 274(1):109-17. MONTAGNON, B.J. (1989). Polio rabies vaccines produced in continious cell lines: a reality for Vero cell line. dev. Biol. Stand., 70:27-47. 61 MORRISON, D.C., DINARELLO, C.A., MUNFORD, R.S., NATANSON, C., DANNER, R., POLLACK, M., SPITZER, J.J., ULEVITCH, R.J., VOGEL, S.N. ve MCSWEEGAN, E. (1994). Current status of bacterial endotoxins. ASM News, 60:479-484. MUSHIN, R. ve ZIV, G. (1973). An epidemiological study of Pseudomonas aeruginosa in cattle and other animals by pyocine typing. J. Hyg. (Lond). 71(1):113-22. OGIKUBO, Y., OGIKUBO, Y., NORIMATSU, M., NODA, K., TAKAHASHI, J., INOTSUME, M., TSUCHIYA, M., TAMURA, Y. (2004). Evaluation of the bacterial endotoxin test for quantification of endotoxin contamination of porcine vaccines. Biologicals. 32:88-93. PARK, C.Y., JUNG, S.H., BAK, J.P., LEE, S.S., RHEE, D.K. (2005). Comparison of the rabbit pyrogen test and Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay for endotoxin in hepatitis B vaccines and the effect of aluminum hydroxide. Biologicals. 33(3):145-51. PENG, S., HUMMERJOHANN, J., STEPHAN, R., HAMMER, P. (2013). Short communication: Heat resistance of Escherichia coli strains in raw milk at different subpasteurization conditions. J. Dairy. Sci., 96(6):3543-6. PETSCH, D., ANSPACH, F.B. (2000). Endotoxin removal from protein solutions. J. Biotech., 76:97-119. POLLANEN, M.T., SALONEN, J.I., GRAINER,D., VITTO, V.J. (2000). Epithelial cell responce to challange of bacterial lipoteichoic acids and lipopolysaccharides in vitro. J. Med. Microbiol., 49:245-252. PROBEY, T.F. ve PITTMAN, M. (1945). The pyrogenicity of bacterial contaminants found in biologic products. J. Bacteriol., 50:397-411. PUGIN, J., ULEVITCH, R.J., TOBIAS, P.S. (1995). Mechanism of cellular activation by endotoxin. Prog. Surg. 20, 8-17 RAETZ, C.R., ULEVITCH, R.J., WRIGHT, S.D., SIBLEY, C.H., DING, A., NATHAN, C.F. (1991). Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal transduction. The FASEB J., 5(12):26522660. 62 REITMEYER, J.C. ve PETERSON, J.W. (1988). Invitro cytotoxicity of lipopolysaccharides for chineese hamster ovary cells. FEMS Microbiol. Lett., 49:393-396. RIETSCHEL, E.T., KIRIKAE, T., SCHADE, F.U., MAMAT, U., SCHMIDT, G., LOPPNOW, H., ULMER, A.J., ZÄHRINGER, U., SEYDEL, U., DI PADOVA, F., SCHREIER, M., BRADE, H. (1994). Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. Review. FASEB J., 8(2):217-25. RYAN, J.A. (2002). Understanding and Managing Cell Culture contamination. Corning, Inc. Technical Publication, CLS-AN-020. (Corning Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences.) RYAN, J.A. (2004). Endotoxins and cell culture. Corning, Inc. Technical Bulletin. 18. (Corning Life Sciences web site at www.corning.com/lifesciences.) SARGENT, W. (2002). Crab wars: a tale of horseshoe crabs, bioterrorism, and human health. Unıversity Press of New England. P:108-114. SCHROMM A.B., BRANDENBURG K., LOPPNOW H., MORAN A.P., KOCH M.H.J., RIETSCHEL E.T., SEYDEL U. (2000). Biological activities of lipopolysaccharides are determined by the shape of their lipid A portion. European J. Biochem., 267:2008-2013. SEARS, C.L. ve KAPER, J.B. (1996). Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion. Microbiol. Rev., 60:167-215. SCHINDLER, S., VON AULOCK, S., DANESHIAN, M., HARTUNG, T. (2009). Development, validation and applications of the monocyte activation test for pyrogens based on human whole blood. ALTEX., 26(4):265-77. SCHUHMANN, R.R., LEONG, S.R., FLAGGS, G.W., GRAY, P.W., WRIGHT, S.D., MATHISON, J.C. (1990). Structure and function of lipopolysaccharidebinding protein. Science; 249:1429-1431. STANISLAVSKY, E.S.,MAKARENKO, T.A., KHOLODKOVA, E.V., LUGOLSKI, C. (1997). R-form lipopolysaccharides (LPS) of Gram-negative bacteria as possiblevaccineantigens. FEMS Immun. Med. Microbiol., 18:139:145. 63 TAKIGUCHI, S. ve KOGA, A. (1988). Effect of bile acids and endotoxin on the function and morphology of cultured hamster Kupffer cells. Virchows Arch. B. Cell Pathol., 54:303-311. TRIVEDI, B., VALERIO, C., SLATER, J.E., (2003). Endotoxin content of standardized allergen vaccines. J, Allergy Clin, Immunol., 111(4):777-83. TSUJI, K. ve HARRISON, S.J. (1978). Dry-heat destruction of lipopolysaccharide: dry-heat destruction kinetics. Appl. Environ. Microbiol., 36(5):710-4. VAARA, M., NURMINEN, M. (1999). Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis. Antimicrob. Agents and Chemother., 43:1459-1462. VAHAPOĞLU, H., AKHAN, S.Ç. (2002). Pseudomonas aeruginosa ve diğer Pseudomonas türleri. " Topçu AW., Söyletir G., Doğanay M. (eds): Ġnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi " kitabı, Nobel Tıp Kitapevleri, Ġstanbul. VOGEL, S.N., ve HOGAN, M.M. (1990). The role of cytokines in endotoxinmediated host responses. " Oppenheim, J.J., and Shevack, E.M., (eds): In Immunopharmacology-the Role of Cells and Cytokines in Immunity and Inflammation. " 238-258, Oxford University Press, New York. WESTPHAL, O. (1975). Bacterial endotoxins. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 49:1-43. WESTPHAL, O., ve JANN, K. (1965). Bacterial lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure. Methods Carbohydr. Chem., 5:83-91. 64 ÖZGEÇMİŞ I- Bireysel Bilgiler Adı : Züleyha Soyadı : Ergün Doğum yeri ve tarihi : Ankara, 28.06.1986 Uyruğu : TC Medeni durumu : Bekar ĠletiĢim adresi ve telefonu : Keklikpınarı mah. 900. cad. 897.sok. No:13/11 Dikmen / Ankara (0312) 426 79 29 ll- Eğitimi 2011-2013 AÜ. Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji A.B.D. Yüksek Lisans 2007-2010 Kırıkkale Üniversitesi Biyoloji Bölümü 2004-2006 Hacettepe Üniversitesi Laboratuvar Teknikerliği Bölümü 2000-2004 Ankara Mustafa Kemal Sağlık Meslek Lisesi 1992-2000 Nedred Arif Ġlköğretim Okulu Yabancı Dili Ġngilizce lll- Ünvanları Biyolog lV- Mesleki Deneyimi 2006 yılından itibaren Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü'nde Biyolog 65 2011 yılından itibaren A.Ü. Veteriner Fakültesi, Mikrobiyoloji A.B.D. Yüksek Lisans öğrencisi V- Bilimsel Etkinlikleri Seminerler 1.Taylorella equigenitalis'in Laboratuvar Tanısı (2012). Sempozyum 1. Bati Nil Virüsü Sempozyumu Yer Aldığı Projeler Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Viral AĢı Üretim Laboratuvarı tarafından yürütülen "Attenüe BT-9 ve BT16 SuĢlarının Orjini Olan Saha SuĢları Ġle VP2 Gen Segmenti Düzeyinde KarĢılaĢtırılması" isimli proje (Yardımcı araĢtırıcı), (Proje Ocak 2014 itibari ile baĢlayacak). Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma Enstitüsü Viral AĢı Üretim Laboratuvarı tarafından yürütülen TAGEM/HSGYAD/13/A07/P02/25 no'lu " Isıya Dirençli Küçük Ruminant Vebası AĢısı (PPR) Üretimi " isimli proje (Yardımcı araĢtırıcı), 2012.
