Antikor Papain

ANTİKOR TARAMA VE
TANIMLAMADA
KARŞILAŞILAN
SORUNLAR
L. Tufan KUMAŞ
Tarihçe
1901, Landsteiner
Tarihçe
1907, Ludwig Hektoen
“Homolog transfüzyon, bazı özel durumlarda,
kan verilen kişinin damarlarında aglütinasyona
yol açarak tehlikeli olabilir.”
“Bağışçı ve alıcı kanları karşılaştırılmalıdır.”
Tarihçe
1908, Ottenberg
Kayıtlardaki ilk serolojik çapraz karşılaştırma:
Karı (bağışçı) - koca (alıcı) arasında 17 dakikalık
sorunsuz bir “doğrudan” transfüzyon
Tarihçe
Şüpheli yaklaşımlar
George Crile:
“Yaygın inanışın aksine, herhangi bir bireyin kanı
bir başkasınınki ile aynıdır. Akrabalık özel bir
avantaj sağlamaz.”
Tarihçe
Çapraz karşılaştırma testi, cerrahlar ve kadındoğumcular arasında yavaş yavaş kabul
görerek sonraki dört dekat boyunca ABD’de
hastanelerde yaygınlaştı.
ABO uyumsuzluklarına bağlı hemolitik
transfüzyon reaksiyonları (HTR) önlenirken
önceden duyarlanmış alıcılarda nadiren akut
ya da geç HTR’ler görülmekte idi.
Tarihçe
1945, Coombs
AHG ile “tam olmayan” antikorların saptanmasını
sağladı.
Ek yenilikler
Albümin
Tripsin
Papain
Dekstran
Fisin
Bromelin
LISS
PEG
Tarihçe
Standarts for a Blood Transfusion Service
(AABB, 1958)
Majör CRM zorunlu, minör CRM opsiyonel
En az iki yöntem kullanılmalı:
1.
2.
Salin aktif antikorlar,
“Tam olmayan” (bloke edici) antikorlar gösterilmeli
Tarihçe
1950’lerin sonu ile 1960’ların başlarında, kan
grubu antikorlarının taranması amacı ile
ticari reajen eritrosit panelleri pazarlanmaya
başladı.
Standarts (üçüncü baskı, 1962): Reajen
eritrositler, hasta serumlarındaki antikorların
saptanmasında, CRM testine ek olarak
kullanılabilir.
Tarihçe
Tüp ve lam (slide) yöntemlerine alternatif
yöntemler geliştirildi ve uygulamaya girdi.
Kapiller tüp
Mikroplak
Katı-faz
Jel aglütinasyon
Kullanılan test yöntemleri
2008’de Jel yöntemi %62.3, tüp yöntemi %34, SPRCA (katı faz) %3.7
Tarihçe
Antikor tarama , CRM 1980, Winn: Genişletilmiş bir antikor tarama,
CRM’nin yerini alabilir (ABO tiplendirme ve antikor
tarama doğrulanmış ve dokümante edilmiş
olmalı).
1984, AABB Standarts (11. baskı):
Antikor tarama (37°C inkübasyon + AHG)
CRM (37°C inkübasyon + AHG): Antikor tarama (−)
ise sadece ABO uygunluğu test edilebilir.
Tarihçe
Antikor tarama , CRM 1985, Shulman: Kan grubu alloantikorları
bulunmayan hastalarda klasik CRM (37°C
inkübasyon + AHG) yerine daha basit bir CRM
testi (immediate spin) uygulanabilir:
8.5 aylık bir sürede CRM tasarrufu (test sayısı):
46.959
Mali tasarruf: 49.300$/yıl
Tarihçe
Antikor tarama , CRM 1992, Judd: “ABO uyumsuzluğunu göstermede
CRM’den daha iyi bir yol var mı?”
1994, Butch ve Judd:
Elektronik Çapraz Karşılaştırma: Bağışçı-hasta
uyumunun elektronik olarak gösterilmesi.
1992-1993 yılları arasında 14.021 hasta
Ayrıntılı bir standart işletim prosedürü gerekli
1993, AABB Standarts (15. baskı): Elektronik
CRM
Serolojik CRM’ye alternatif (gerekli şartlar
sağlandığında)
Yasal Gereklilikler
ABD ve İngiltere
Uygunluk testleri
Eski kayıtların gözden geçirilmesi
ABO, RhD gruplama
Antikor tarama (37°C + AHG)
En az iki hücre (mümkünse homozigot)
Antikor (+) ise
antikor tanımlama
antijen (−) kan temini sonrasında CRM (37°C + AHG)
Antikor (−) ise
IS CRM
Elektronik CRM
Yasal Gereklilikler
Almanya ve Avusturya
Uygunluk testleri
Eski kayıtların gözden geçirilmesi
ABO RhD gruplama
Antikor tarama (37°C + AHG)
CRM (37°C + AHG)
Yasal Gereklilikler
Ulusal Kan ve Kan Ürünleri Rehberi
İndirekt Antiglobulin Test (IAT)
1.
2.
3.
4.
5.
Antikor tarama
Antikor tanımlama
Antikor titrasyonu
Bazı kan grubu
antijenlerinin
saptanması
Çapraz
karşılaştırma
(cross-match)
İmmünohematolojide Antikorlar
Otoantikor (bireyin kendi eritrositlerindeki
antijene karşı)
Alloantikor (bireyde bulunmayan antijene
yanıt olarak oluşan)
Doğal
İmmün
Beklenmedik alloantikorlar (irregüler antikorlar,
atipik antikorlar): Doğal olarak bulunan anti-A
ve anti-B dışındaki antikorlar.
Antikor Tarama
Kan grup antijenlerine karşı gelişmiş antikorlar
çapraz karşılaştırma
karşıt gruplama
antikor tarama
Antikor tarama
transfüzyon öncesi uygunluk testleri
antenatal testler
Antikor Tarama
Tarama en az iki test hücresi (havuzlanmamış)
kullanılarak yapılmalıdır.
Bu hücreler tüm önemli antijenleri taşımalı, ayrıca
yerel ve/veya ulusal rehberlerin önerdiği belirli kritik
antijenleri çift-doz olarak bulundurmalıdır (ör. Dia,
Mur).
Bir antikorun homozigot hücrelerle heterozigot
hücrelere göre daha kuvvetli aglutinasyon
oluşturmasına dozaj etkisi denilir.
Homozigot hücrelerin (EE, ee, cc, CC) kullanılması
duyarlılığı artırır.
Anti-c, anti-Jka ve anti-M antikorları homozigot hücrelerle
heterozigot hücrelere göre daha iyi reaksiyon verir. (Hatta
bazı kişilerde sadece homozigot hücreler kullanılarak
gösterilebilir)
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor tarama negatif, uygunsuz acil çapraz
karşılaştırma (Immediate-spin)
ABO uyumsuz bağışçı eritrositleri: Bağışçı, hasta
örneklerinden veya etiketlemeden kaynaklanan
hatalar.
ABO uyumsuz bağışçı eritrositleri: Saptanamayan
zayıf antijenler.
Bağışçı hücrelerinde poliaglütinasyon.
A2 ve A2B bireylerin serumlarında bulunan anti-A1.
Oda sıcaklığında reaktivite gösteren diğer antikorlar
(ör. anti-M).
Rulo formasyonu.
Soğuk antikorlar (anti-I).
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor tarama negatif, uygunsuz AHG çapraz
karşılaştırma
Bağışçı eritrositlerinde bulunan bir düşük insidans
antijene karşı antikor.
Bağışçı eritrositlerinde DAT pozitif.
Antijen ekspresyonundaki bireysel farklılıklar (ör.
P1).
Pasif antikor transferi: ABO-uyumsuz trombosit
süspansiyonu transfüzyonundan sonra dolaşımda
anti-A veya-B bulunabilir.
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor tarama pozitif, uygun çapraz
karşılaştırma
Dozaj etkisi gösteren antikorlar ve söz konusu
antijen için heterozigot olan bağışçı eritrositleri.
Oto-anti-IH (-H).
Anti-LebH.
Reajen eritrosit dilüentinden kaynaklanan antikor
reaksiyonu.
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor tarama pozitif, uygunsuz çapraz
karşılaştırma, negatif otokontrol
Alloantikor(lar).
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor tarama pozitif, uygunsuz çapraz
karşılaştırma, pozitif otokontrol, negatif DAT
Reaksiyon ortamındaki bileşenlerden
kaynaklanan antikor reaksiyonu.
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor tarama pozitif, uygunsuz çapraz
karşılaştırma, pozitif otokontrol
Alloantikor ile birlikte hastada geç tipte bir
serolojik veya hemolitik transfüzyon reaksiyonu
var.
Pasif alloantikor transferi: Örneğin, İVİG.
Soğuk reaktif otoantikor.
Sıcak reaktif otoantikor.
Rulo formasyonu.
Reajen kaynaklı sorunlar.
Antikor Taramada Karşılaşılan
Sorunlar
Antikor Tarama
Dozaj etkisi
(homozigot
antijenler)
Tasarruf
İş gücü
Zaman
Maliyet
CRM (37°C + AHG)
Düşük insidans
antijenler
Bölgesel etnik
farklılıklar
DAT+ eritrositlerin
transfüzyonu
Antikor Tanımlama
Transfüzyon reaksiyonlarına neden olduğu
bilinen bir antikor saptandığında çaprazkarşılaştırma için antijen negatif kan
seçilmelidir.
Antikor Tanımlama
Antikor tanımlama testi, antikor tarama testi ile
saptanan antikorun hangi eritrosit antijenine
karşı geliştiğini belirlemek amacıyla çalışılır.
Tarama testine göre daha çok sayıda ve farklı
fenotipik yapıda test hücreleri kullanılır.
Antikor Tanımlama
Gebelerde de IAT pozitif bulunan tüm
olgularda antikor tanımlanmalıdır.
YDHH izlemi
Rh immünglobülin profilaksi endikasyonu
değerlendirilir.
Antikor Tanımlama
“Ulusal Kan ve Kan Ürünleri Rehberi”ne göre
Kullanılan tanımlama paneli ile şu antijenlere
karşı antikorlar tanımlanabilmelidir:
C, c, D, E, e, M, N, S, s, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb.
Antikor, antijeni içeren miyar eritrosit
örneklerinden en az iki tanesiyle reaksiyona
girmeli ve içermeyen örneklerden en az iki
tanesiyle reaksiyon vermemelidir.
Antikor Tanımlama
Pre-analitik
Önceki antikor tarama/tanımlama bilgileri
Transfüzyon/transplantasyon, gebelik öyküsü
Enfeksiyon öyküsü
Tanı, kullanılan ilaçlar
Yaş, cinsiyet, ırk/etnik köken
Analitik
Post-analitik
Sonuçların klinik veriler ile uyumu
Elde edilen bilginin sorun çözümünde kullanılması
(transfüzyon/gebelik)
Antikor Tanımlama
Otokontrol
Pozitif
Negatif
Pozitif
Test Hücresi
Negatif
Pozitif
Pozitif
Antikor
Otoantikor
Alloantikor
Otoantikor veya Otoantikor+Alloantikor
Antikor Tanımlama
Negatif sonuç saptanan antijen ekarte edilir (elenen antijen çift-doz
eksprese edilmiş olmalıdır).
Elenmeden kalan antijenler değerlendirmeye alınır.
Antikor Tanımlama
Hastanın ayrıntılı bir fenotipi, kişinin hangi
antikorları üretebileceğini gösterecektir.
Reaksiyon yöntemi antikorun tanımlanmasını
kolaylaştırabilir.
Antikor tanımlama sürecinde birden fazla
antikor olması durumunda, özellikle bu
antikorların bir veya birden fazlası enzimduyarlı antijene karşı ise, enzimle işlem
görmüş hücrelerin kullanımı çok yararlı olabilir.
Antikor Tanımlama
Bazen daha kapsamlı ve/veya özel tekniklerin
uygulanması ya da antikorların tek tek
saptanması gerekebilir.
Birden fazla olasılık içeren durumlarda
antikoru belirleyebilmek için özel fenotipe
sahip hücrelerden yararlanılır.
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar
Anormal sonuçlar
düşük frekans veya yüksek frekans antijene karşı
antikor
antikor karışımı (birden fazla antikor)
‘non-spesifik’ antikor
otoantikor
profilaktik anti-D uygulanmasına bağlı testlerde
görülen karışıklık
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar
Çözüm
hasta eritrosit antijenlerinin ayrıntılı
fenotiplendirilmesi
inhibisyon testleri
kan grup antijenlerinin inaktivasyonu
adsorbsiyon, elüsyon, kombine adsorbsiyonelüsyon
sülfidril bileşiklerinin (DTT, 2-ME gibi) kullanılması
titrasyon
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Gözlenen durum
Yorumlar
Düşük frekans antijen
Negatif antikor tarama,
uygunsuz çapraz-karşılaştırma
Uygun kan kolaylıkla
bulunabilir
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Gözlenen durum
Yorumlar
Yüksek frekans Çoğu veya tüm tarama ve panel Uygun kan bulmak çok zor.
antijen
hücreleri ile pozitif reaksiyon.
Akrabaları test et
Otokontrol negatif
Otolog donasyon seçeneğini
değerlendir
Uluslar arası nadir bağışçı
programına danış
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Birden fazla
sayıda
antikor
Gözlenen durum
Yorumlar
Farklı reaksiyon şiddetleri, çoğu Her bir antikoru tanımla.
tarama ve panel hücreleri ile
Hasta fenotipini belirle.
pozitif reaksiyon
Antikor özgüllüklerine bağlı olarak
uygun kan bulmak çok zor olabilir.
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Post-profilaktik
anti-D
uygulaması
Gözlenen durum
Yorumlar
Antenatal veya postnatal
uygulamaya bağlı olarak
anti-D
Diğer antikorların taranması için
RhD negatif hücreleri kullan.
Pasif edinilmiş anti-D zamanla
azalır (yarı-ömrü 21 gün).
Genellikle 12 hafta sonra IAT ile
saptanamaz
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Gözlenen durum
Non-spesifik
Tanımlanamayan özellikte
veya eritrosit dışı pozitif reaksiyonlar
antijen
Yorumlar
Dozaj gösteren antikor.
Yüksek termal amplitüde sahip
soğuk antikor.
Eritrositlerde eksprese edilen
lökosit antijenlerine karşı antikor.
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Otoantikor
Gözlenen durum
Yorumlar
Tüm reajen hücreler ve
otokontrol pozitif.
Altta yatan alloantikorun
saptanması önemlidir (oto/alloadsorbsiyon).
Bazen kendi hücreleri ile
daha güçlü reaksiyon.
DAT pozitif
Güçlü soğuk otoantikor için testleri
37°C’de yap.
Hasta öyküsü/kullanılan ilaçlar
(tanı/ilaca bağlı durumlar)
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-SORUN
Antikor tipi
Diğer
Gözlenen durum
Yorumlar
Maskelenmiş antikorlar
•
Tüp tekniğinde, rulo
formasyonuna bağlı pozitif
reaksiyonlar
•
Belirgin özgüllükte tek bir
antikor varsa bile dikkat et
Miyelom hastaları.
•
Salin ile dağılır
•
Genellikle kolon aglütinasyon
tekniğinde görülmez
Tüp tekniğinde hatalı negatif
sonuca yol açabilir
Bazı antikorların özelliğidir (ör.
anti-Lua, -Sda)
Reajen hücrelerin hemolizi •
Çift popülasyon
reaksiyonlar
•
•
Havuzlanmış hücrelere bağlı
olabilir.
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-ÇÖZÜM
İAT sonuçları
Hepsi pozitif
(aynı reaksiyon
şiddeti)
Otoaglütinasyon
negatif
Kuşkulanılan Yararlı testler
Durum
HFA
• ETC
•
Diğer
sıcaklıklar
İleri araştırmalar
•
HFA-negatif hücreler
•
Maskelenmiş antikorun gösterilmesi
güç
•
Anti-HI veya anti-LebH’yi dışlayabilmek
için A1 ve A2 hücreleri kullan
•
Hasta fenotipini belirle
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-ÇÖZÜM
İAT sonuçları
Hepsi/bir kısmı
pozitif (farklı
reaksiyon
şiddetleri)
Otoaglütinasyon
negatif
Kuşkulanılan Yararlı testler
Durum
Karışım
• ETC
•
•
İleri araştırmalar
•
Diğer sıcaklıklar
•
Dozaj etkisi ve
listelenmemiş
antijenler yönünden •
kontrol et
Seçilmiş hücreler kullanarak
her bir antikor için test yap
IgG ve IgM antikor ayrımını
yap (DTT/2ME)
Hasta fenotipini belirle
Dr. Raşit DURUSOY Kan M erkezi Personeli Kan Grupları Antijen Tablosu
Kan Grubu
Antijenleri
semin HEPER
. Haldun BAL
. Tufan KUMAŞ
luk MERGEN
vinç KAYA
ülay ÜZÇELĐK
lem KARAÇAR
lem ÖZVAROL
kan KILIÇ
hal KONUKÇU
ğdem CĐVA
ğdem GÖRAL
mile AYDIN
tin ÖNCÜ
ryem ĐLHAN
. C. Dereçiçek
A
B
O
A
A
B
O
A
A
A
A
B
A
B
Rh
Kell
Duffy
a
b
a
Kidd
b
a
Lewis
b
a
P
b
M NS
Lutheran
a
b
D
C
E
c
e
K
k
Kp
Kp
Fy
Fy
Jk
Jk
Le
Le
P1
M
N
S
s
Lu
Lu
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
B
A
O
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
O
+
-
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+
-
+
AB
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-ÇÖZÜM
İAT sonuçları
Bir kısmı pozitif
(aynı şiddette)
Otoaglütinasyon
negatif
Kuşkulanılan Yararlı testler
Durum
Tek antikor • ETC
•
Altta yatan
maskelenmiş
antikor yönünden
kontrol et
İleri araştırmalar
•
Belirli bir özgüllük
saptanamazsa dozaj
yönünden kontrol et
•
Hasta fenotipini belirle
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-ÇÖZÜM
İAT sonuçları
Kuşkulanılan Durum
Yararlı testler
İleri araştırmalar
Bir kısmı pozitif
(farklı reaksiyon
şiddetleri)
Farklı düzeylerde
eksprese edilen
antijenler
•
Reaksiyonları
dozaj/ekspresyon
yönünden kontrol et
•
Listelenmemiş
antijenler ve/veya LFA
yönünden kontrol et
Otoaglütinasyon
negatif
Dozaj gösteren antikor
•
•
Knops sistemi, Csa ve
diğer belirsiz veya nonspesifik antikorlar
Knops sistemi
antikorları yönünden
kontrol et
Özel testler ve
araştırmalar
•
Lökosit antikorları (ör.
anti-Bg) yönünden
kontrol et
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
M, N, S, s, Ge2,
Ge4, Xga, Fya, Fyb,
Ch/Rg
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Negatif
Pozitif
Anti-s, papain ile değişkenlik
gösterir
Ch/Rg, plazma/serum ile inhibe
olur. Kordon kanı hücreleri Ch/Rg
negatiftir
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
Indian, JMH
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Negatif
Negatif
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
Cromer, Knops
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Pozitif
Zayıflar
Cromer antijenleri DAF üzerinde
yer alırlar bu yüzden PNH
hücrelerinde bulunmazlar
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
Yta
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Değişken
Negatif
Kordon kanı hücrelerinde zayıf
ekspresyon
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
Lutheran,
Dombrock
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Pozitif
Zayıflar
Kordon kanı hücreleri Lua, Lub
antijenleri yönünden zayıftır
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
Kell, LW, Scianna,
MER2
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Pozitif
Negatif
Kordon kanı hücreleri LW’yi güçlü
eksprese ederler
Scianna, düşük DTT
konsantrasyonlarında daha
dirençli olabilir
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
A, B, H, P1, Lewis,
Kidd, Fy3, Diego,
Colton, AnWj, Ge3, Ii,
P, Csa, Vel, Sda
Papainuygulanmış
hücreler
Pozitif
DTT (200
mmol)
Açıklamalar
Pozitif
Kordon kanı hücreleri Lewis negatifken,
i’yi güçlü eksprese ederler
ABH ve Lewis, tükürük ve serum/plazma
ile inhibe olurlar
Sda, idrar ile inhibe olur
Antikor Tanımlamada Karşılaşılan
Sorunlar-İLERİ ÇÖZÜM
Antikor
Kx
Papain-uygulanmış DTT (200 mmol) Açıklamalar
hücreler
Pozitif
Güçlenir
Antikor, KGH hastalığı olan
McLeod fenotipe sahip
erkeklerde bulunur
Özel Testler (ne kadar
mümkün?)
Zaman
Mekan
Donanım
Personel
Bilgi, beceri
Deneyim
Gelişmeler
Birileri bizi bu dertlerden kurtarsa
Teşekkürler