protein çipleri

PROTEİN ÇİPLERİ
MUSTAFA UZUN
NİSAN 2007
İnsanlık tarihinin en
büyük ve sonuçları
açısından en önemli
projelerinden olan
İnsan Genom Projesi
(human genom project)
ile elde edilen
veriler,insan oğluna
yeni ufuklar sunarken
birçok farklı projeninde
başlamasına neden
olmuştur.
Diğer taraftan insan genom projesi ile elde
edilen bilgilerin çoğu ham bilgilerdir.Bu
bilgilerin uygulanabilmesi için, yeni bazı
bilgilere ihtiyaç vardır.Halen hücrede
birçok molekülün nereden,hangi koşullar
altında sentezlendiği bilinmemekte ve
protein moleküllerinin rolleri
açıklanamamaktadır.
¾Birçok hastalık; gen kontrolü ile ilgili
problemler,
transkripsiyon,posttranskripsiyonal
modifikasyon
ve
translasyon sırasında oluşan değişiklikler
ile oluşmaktadır.Bu nedenle, nükleik asit
bazlı labaratuvar tetkikleri yanında protein
bazlı labaratuvar tetkiklerinin de önemi
artarak sürmektedir.
Sıklıkla kullanılan geleneksel laboratuvar
yöntemleri, genellikle tek bir gen
veya proteinin araştırılmasına yöneliktir.
Hastalıkların çoğunda birçok gen
etkilenmekte
(multigenik) ve birçok faktöre bağlı
olarak hastalıklar oluşmaktadır
(multifaktöriyel)
. Bu da, birçok farklı genin ve
proteinin bir arada, kolay ve efektif olarak
incelenebilmesini gündeme getirmiştir.
Günümüzde gelişen
bilgisayar teknolojisinin
biyolojiye uyarlanması ile
karşımıza çıkan DNA çipleri,
bize bu olanağı
sağlamaktadır.
Mikroarrayler ile etkilenen genlerin
ekspresyonları, kanserli bir dokuda aynı anda
çalışılmakta, hücre siklusunu etkileyen yüzlerce genin
ekspresyonu takip edilebilmektedir.
Mikroarray, ileri derecede genotip ve gen
ekspresyon analizleri için geliştirilmiş bir
tekniktir.
Küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde
mikroarrayler, SNP’lerin,hastalıklı ve normal
fizyolojik koşullardaki modifiye gen
ekspresyonunun (mRNA’daki artış ve azalışlar)
hızlı bir şekilde çalışılmasını sağlar.
Gen ekspresyon arrayleri, mRNA
seviyelerindeki
değişiklikleri,kodlanan protein
seviyelerindeki değişikliklerle
karşılaştırmak için kullanılırlar.
Ancak bu çok doğru sonuç vermez.
Gen ekspresyon arrayleri, hücre
fonksiyonunu etkileyen protein post
translasyonal modifikasyonları
(fosforilasyon, glikolizasyon v.b.)
hakkında bilgi sağlamaz.Protein
seviyesinde ekspresyonu
değerlendirmek, ilgilenilen
proteinlerle ilgili kalitatif ve kantitatif
bilgi gerektirir. Bu nedenle, protein
mikroarrayleri geliştirilmiştir.
Bir protein mikroarrayi;
¾
antikorlar, proteinler, protein fragmentleri, peptidler,
aptamerler veya küçük yüzeylerde immobilize olmuş
veya kaplanmış karbonhidrat monomerlerini içerir.
¾Çip yüzeyinde yüzlerce spotlar vardır.Her
spot üzerinde de binlerce aynı tür problar
vardır.Prob türü sadece spottan spota
değişir.
Protein Array Tipleri
¾ Antikor-Protein Array
¾ Tek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein Array
¾ Hücresel Lizat Protein Array
Antikor-Protein Array
Antikor mikroarraylerinde, sandviç tip assayler için
eşleşen antikor çifti,işaretli tek antikor ve işaretsiz antikor
ligant olarak kullanılarak yapılır ve basit işaretleme
metodu vardır.
Birçok yayınlanan çalışmada,sandviç immunoassay
mikroarray’lerin
kullanılabilirliği
ve
etkinliği
gösterilmiştir.Bu yöntemde antikor çifti aynı proteine
bağlandığı için yüksek hassasiyetli analiz gerçekleşir.
Saptayıcı antikor, direkt tanımlayıcı
işaretle (enzim, floresan molekül, izotop,
vb) modifiye edilir veya işaretli
streptavidin ile prob uygulamasından
sonra saptama için biotinlenir.
Tek Antikor/İşaretlenmiş Örnek Protein
Array
Eşleşmiş antikor çiftleri yoksa, işaretli örnekler
içeren tek antikor protein mikroarray
protokolleri kullanılır. Sandviç antikor çift
arraylerde olduğu gibi, array platformu arrayi
yapılan antikoru (veya antikorları) içerir.. Bu
yöntemde, protein örneklerinin daha önceden
işaretlenmesi (floresan molekülle, isotop veya
biotinle) gerekir. İşaret, örnekteki bir proteinin mikroarray yapılan
bir antikorla ve ilişkili elamanlarla etkileşimi tanımlamayı
.
kolaylaştırır
Bu teknik, zayıf karakterli hücre sinyal proteinleri
gibi protein hedeflerin
değerlendirilmesinde kullanılır. Ana dezavantajı,
spesifik antijen tanımasından
emin olunmasını sağlayan antikor fazlalığının
olmamasıdır. Ek olarak, tüm örnek bileşenleri
işaretlendiği için, spesifik olmayan arka plan sinyali
artacaktır. Yöntem daha çok primer olarak
karşılaştırma ve kalitatif çalışmalarda kulanılır.
Hücresel Lizat Protein Array
Hücresel proteinlerin mikroarrayleri, kompleks
protein karışımları veya saflaştırılmış
fazla miktarda eksprese olmuş proteinlerin
arraylerinde kullanılır. Kompleks protein karışım
arrayleri, hücresel lizatları dot blotlar. Saflaştırılmış
veya fazla miktarda eksprese olmuş
proteinlerin kitaplıklarından oluşan mikroarraylerin
oluşturulması, protein:protein
etkileşimlerinin ve kinaz aktivitelerinin
görüntülenmesine olanak verir.
Özelliklerine Karar Verme
Protein arrayler, cam,
membran, kütle
spektroskopi plateleri,
boncuklar ve diğer
partiküller
gibi yüzeylere immobilize
proteinler kullanılarak
katı-faz ligand bağlama
deneme
sistemleridir. Denemeler,
paraleldir ve minyatüre
edilebilirler (mikroarray ve
protin çipleri).
Hızlı ve otomatik olmaları, yüksek
hassasiyette olmaları, çözeltilerin
ekonomik olması ve tek
denemeyle çok veri elde edilebilmesi bu
yöntemin avantajlarıdır. Elde edilen
verilerin
değerlendirilmesi biyoinformatik sayesinde
yapılabilmektedir.
Uygulama Alanları
Diyagnostikte, hapsedilen arrayler, paralel olarak
birçok denemenin gerçekleşmesine olanak verir.
Proteomikte, bu array, farklı örneklerdeki
proteinlerin miktarlarını hesaplamada ve
karşılaştırmada kullanılır..
Arrayde, ligandlardan daha spesifik olan
proteinler, protein-protein,
protein-DNA, protein-ilaç, reseptör-ligand,
enzim-substrat gibi in vitro fonksiyonel
etkileşimlerin görüntülenmesinde kullanlır.
Ayrıca, SNP’lerden doğan polimorfik
değişikliklerle protein fonksiyonu korele
edilebilir.
Protein arraylerin kullanıldığı 4 ana
alan vardır.
1. Diagnostik: Kan örneklerindeki antijen ve
antikorların saptanması.
2. Proteomik: Protein ekspresyon profili
oluşturulması, organ ve hastalık spesifik
arrayler.
3.İleri ekspresyon ve maniplasyonlar için
display kitaplıklarından bireysel üyelerin
izolasyonu protein ve antikorların seçilimi
4.Protein fonksiyonel analizi: protein-protein
etkileşimleri, reseptörün ligand bağlama
özellikleri, enzim aktiviteleri, antikor çapraz
aktivitesi ve spesifitesi, epitop haritalaması.
Formatlar ve Yüzeyler
Protein arrayler, ELISA ve dot blot gibi
metodların minyatürize edilmiş şekli
olarak
tasarlanmıştır. Genelde kullanılan fiziksel
destek, cam slaydlar, silikon,
mikrokuyular,
nitroselüloz membranlar, manyetik veya
diğer boncuklardır.Süspansiyondaki
partiküller, array’lerin temeli olarak kullanılır.
Protein İmmobilizasyonu
Proteinlerin imobilizasyonlarındaki çeşitlilikler
çözeltiler ve yüzeyin özellikleridir. İyi bir
protein array yüzeyi, kimyasal olarak eşleşme
prosesinden önce ve sonra stabil olmalıdır, iyi
spot morfolojisine izin vermelidir, saptama
sistemleri arka planla girişim yapmamalıdır.
Kullanılan immobilizasyon metodu
tekrarlanabilir, farklı özellikteki proteinlere
uygulanabilir, otomasyona yatkın olmalı ve
tüm fonksiyonel protein aktivitesini geri
kazanabilme yeteneğinde olmalıdır.
Protein immobilizasyonu için hem kovalent
hem de non-kovalent metodlar
kullanılmaktadır.
Yüzeye pasif adsorbsiyon metodolojik olarak
basittir ancak az kantitatif ve
tekrarlanabilirlikleri azdır.
Kovalent bağlanma metodları, stabil bağlanma
sağlarlar ve çok geniş özellikte proteinlere
uygulanabilirler ve tekrarlanabilirlikleri iyidir.
Kovalent bağlanma substratları amino- veya
aldehit içeren silan
çözeltisiyle kaplanmış cam slaytları içerir.
Versalinx™ sistemde [Prolinx], fenildiboronik asit
ve salisilhidroksamik asit ile türevlenmiş
proteinler arasındaki etkileşimler yüzeye geri
dönüşümlü olarak immobilize edilmeyi
başarılmıştır.
Ayrıca, bu yöntemde daha az arka plan
bağlanması görülmüştür ve immobilize
proteinlerin fonksiyonlarını kazanmaları
sağlanmıştır.
En yaygın kullanımı olan biyolojik eşleme
metodu, biotin/streptavidin veya
heksahistidin/Ni etkileşimleridir. Biotin,
titanyum dioksit gibi bir yüzeyde poli lizin
iskeletine konjuge olabilir.
Saptama
Saptamada en yaygın olarak floresan
işaretleme kullanılmaktadır. DNA
mikroarraylerini okumak için kullanılan
metodlar, protein arraylere de
uygulanabilmektedir.
.
Planar
waveguide technology
[Zeptosens] ultrahassas
floresans saptaması
sağlar ve yıkama
prosedürünün olmaması
da ayrı bir avantajıdır.
Ayrıca, yüksek hassasiyet
süspansiyon boncukları
ve partikülleri ile işaret
olarak fitoeritrin
kullanılmasıyla sağlanır.
Diğer alternatif metodlar , yüzey plazmon
rezonansı , dönen halkasal DNA
amplifikasyonu [Molecular Staging], kütle
spektroskopisi ve atomik kuvvet
mikroskopisidir.
Large-Scale Protein Arrayleri
¾Large-scale fonksiyonel çipler, çok sayıda
saflaştırılan proteinin immobilizasyonu ile
geniş miktarda biyokimyasal fonksiyonun
(protein-protein etkileşimi, ilaç-hedef
etkileşimi, enzim-substrat etkileşimi vs.)
denemesinde kullanılırlar.
•
•
•
•
•
•
www.functionalgenomics.org
www.microarray.swmed.edu
www.arrayit.com/.../protein_chips.html
www1.qiagen.com/products/protein
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi
www.gulhanemedicaljournal.org/pdf.php3?id=243