Microsoft PowerPoint - Lab Hafta X Bask\375.ppt

21.04.2008
GÜVENLİ VE ETKİN
LABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
BAKTERİ KÜLTÜRÜ
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
RİSK GRUPLARI
• Sınıf 1 (risksiz): Patojen olmayan (E. coli, B. subtilis)
• Sınıf 2 (düşük risk): Shigella, Salmonella
• Sınıf 3 (soluma durumunda yüksek risk):
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis…
• Sınıf 4 (birey ve toplum için yüksek risk): arbovirüs,
arenavirüs, filovirus.
1
21.04.2008
RİSK GRUPLARI
• Sınıf 1 (risksiz): Bençte çalışılabilir.
• Sınıf 2 (düşük risk): Sınıf 2 biyogüvenlik kabini.
• Sınıf 3 (soluma durumunda yüksek risk): Ayrı bir oda gerektirir.
Diğer odalarla kapı veya havalandırma yolu ile hava değişimi
olmamalıdır. Giriş çıkış kontrollü olmalı, özel kıyafet giyilmeli ve
bütün çalışmalar biyogüvenlik kabinlerinde yürütülmelidir.
• Sınıf 4 (birey ve toplum için yüksek risk): Hükümet nezninde izni
olan az sayıda laboratuvarda yürütülebilen çalışmalardır.
ALTYAPI
• Lab tezgahında:
–
–
–
–
–
Mutant seçimi
Organizmaların büyütülmesi
Bakteri konsantrasyonunun belirlenmesi
Transformasyon
Plazmid izolasyonu yapılabilir.
2
21.04.2008
ALTYAPI
İnkübatör: Genellikle 37oC
Çalkalamalı inkübatör (aerobik büyüme için)
Santrifüjler
Vorteks
Bek (bunsen burner)
Biyogüvenlik kabini (petri dökmek, besiyeri bileşenlerinin filtre
sterilizasyonlarını gerçekleştirmek için)
• Elektroporatör (transformasyon için)
• Spektrofotometre (büyümeyi gözlemek için)
•
•
•
•
•
•
Çalışma Kuralları
• Yemek, içmek, ağızla pipetleme yapmak, açık ayakkabı giymek
veya lab önlüğünü lab dışında giymek yasaktır.
• Çalışma alanınızı günde en az bir kez ve her bakteri
döküldüğünde bir dezenfektan ile silin.
• Bulaşıcı (enfeksiyöz) atıkları atmadan önce dekontamine edin.
• Eldiven giyiyorsanız dahi laboratuvardan çıkmadan önce
muhakkak ellerinizi yıkayın.
• Sıvı atığı son konsantrasyonu %10 olacak şekilde çamaşır
suyunda 30 dakika bekletip lavabodan akar suyun altında dökün.
• Katı atığı tıbbi atık çöpüne atın.
3
21.04.2008
Çalışma Kuralları
• Aerosol oluşumunu minimalize edecek şekilde
Pipetleme, dökme, kapak açma aşamalarına itina edin.
çalışın.
• Petri kaplarını ve tüpleri gereksiz yere biriktirmeyin.
Buzdolabındaki gereksiz kültürler tam bir kontaminasyon
kaynağıdırlar.
Bakterileri Nereden Elde Edeceğiz?
•
•
•
•
Lab üyeleri
Diğer araştırıcılar
ATCC
Firmalar
4
21.04.2008
BAKIM VE BÜYÜTME
•
•
•
•
Aerobik/Anaerobik
Durağan/Çalkalamalı
Sıvı/Yarı-katı
Bir bakteriyi üretmeden önce fizyolojisini bilmelisiniz.
SIVI KÜLTÜRLER
• Mümkünse besiyerini laminar kabinde hazırlayın.
• Eğer besiyerinin kontamine olduğunu düşünüyorsanız gece boyu
37oC’de inkübe edin, üreme olup olmadığını görün.
5
21.04.2008
KATI KÜLTÜRLER
• 100 mm hücre kültürü kaplarını bakteri kültürü için kullanmayın.
Gereksiz ve pahalı bir harcama yapmış olursunuz.
• Katı kültürleri birbirinden ayırmak için kod veya renk uygulaması
yapılmasında fayda vardır.
• 50oC veya üstündeki sıcaklıktaki besiyerini eldivenle tutup
dökebiliyorsanız da dökmeyin zira çok sıcak dökülen besiyerleri
aşırı kondensasyona neden olur.
KATI KÜLTÜRLER
• Besiyerinin şişenin kenarından taşıp akmasına fırsat vermeyin.
Petri kabına damlayıp kontaminasyona neden olabilir. Böyle
sızıntıları hemen temizleyin.
• Petri kabının yüzeyi pürüzsüz olmalı. Petri yüzeyinde kabarcık
oluşursa hızlıca alevden geçirip kabarcığı yok edin. Plastik
petrilerde bu aşamaya dikkat edin.
• Kullandığınız antibiyotik ışığa duyarlı ise petri kaplarını
alüminyum folyo ile kaplayın veya bir kutuya koyun (örn.
Tetrasiklin)
6
21.04.2008
DONDURULMUŞ KÜLTÜRLER
• Çözülüp yeniden ekilen kültürlerin lag fazları biraz uzayacaktır.
Bu nedenle bu tip kültürlere normalden iki kat fazla süre verin.
• Bakteri kültürlerini sürekli olarak dondurup çözmekten kaçının.
• Eğer kültürünüz antibiyotik direnç geni içeren plazmid taşıyorsa
besiyerine antibiyotik ilave etmelisiniz. Ancak Tetr, Ampr, Kanr
veya Camr taşıyan suşların antibiyotik direnç genleri ifade
bulana dek antibiyotiksiz olarak kültür edilmeleri gerekmektedir.
ANTİBİYOTİKLER
• Genetik olarak tasarlanmış plazmidlerin genellikle en azından bir
antibiyotik için direnç geni taşırlar. Bu ilgili bakterinin
araştırıcının istediği geni ifade etmesi durumunda seçilebilmesini
mümkün kılar.
• Plazmidlerin hemen tamamı bir veya daha fazla direnç geni taşır
(amp, tet, chl, kan).
• Antibiyotikler ısıya duyarlıdır bu nedenle besiyeri sterilize olup
soğuduktan sonra eklenir. Genellikle dondurulmuş ve tek
kullanımlık hacimlere bölünerek saklanır.
7
21.04.2008
TEK KOLONİ EKİMİ
• Öze ile
• Tek tip bakteri üretmek için muhakkak gerekli.
• Kontaminasyonu asgariye indirmek için:
–
–
–
–
Eğer sağ elinizi kullanıyorsanız alevi sağınıza yerleştirin.
Petri kaplarını solunuza.
Bakteri örnekleri ortada olmalı.
Tüp veya şişelerin ağızlarını gevşetmiş olun.
• Bütün petri kaplarını baş aşağı yerleştirin ki kondensasyon kolonilerin üzerine
damlamasın.
• Yayma yapmadan önce özenizi petrinin yayma yapmayacağınız bir köşesinde
soğutun.
SAKLAMA
•
•
Kısa dönemli: Petri kaplarındaki koloniler ve sıvı kültürler 4oC’de birkaç hafta
saklanabilir. Petri kaplarının ömrünü uzatmak için parafilm ile iyice
kaplanmalıdır.
Uzun dönemli: Her bakteri için tercih edilmesi gereken usul değişebilir.
– Altkültür: Sürekli büyütme ve saklama
•
•
Avantaj: Hemen ulaşılabilirlik. Düşük maliyet.
Dezavantaj: Hayatiyet kaybı, kontaminasyon riskinin yükselmesi, fenotip stabilitesinin kaybı.
– Kurutma: Su uzaklaştırılır. Mantar için sık kullanılır. Bazı bakteriler için de uygundur.
•
•
Avantaj: Ucuz, kontaminasyona açık değil.
Dezavantaj: Hangi suşa uygun olduğu bilgisi çok açık değil.
– Dondurma/Kurutma: Donmuş kültürden süblimasyon ile su uzaklaştırılır. Kurutulduktan
sonra örnekler vakum altında cam ampüllerde saklanır.
•
•
Avantaj: Uzun dönemli kültürler kolayca korunur.
Dezavantaj: Gerekli cihazlar bütün laboratuvarlarda mevcut değildir.
– Dondurma ve düşük ısıda saklama: Gliserol stokları -70 veya -196oC’de saklamak
mümkündür.
•
•
Avantaj: Birçok hücre için uygundur.
Dezavantaj: Dondurucular pahalıdır. Soğutmadan dondurmaya ve eritme aşamalarında hücrelere hasar verilmesi
mümkündür.
8
21.04.2008
BAKTERİLERİ DONDURMAK
•
Alt kültür hazırlamayı asgariye indirin.
•
Hücreleri ideal koşullarda kültüre edin.
•
Hücrelerinizin dondurma koşullarını öğrenin.
•
Dondurma besiyerini taze hazırlayın.
•
Bütün bu bilgileri lab defterinizin dışında ayrı bir kayıt defterine girin.
KONTAMİNASYON
•
Petri kapları: Koloni biçimlerine dikkat edin. Eğer farklı görünen koloni varsa
tek koloni ekimi ile test edin.
•
Maya: Ökaryotiktirler. Bakteri gibi üretilirler. Petri ve sıvı kültürde ürerler.
Besiyerleri bakterilerinkine benzerdir. Memeli hücrelerinden ziyade bakteri
hücrelerine benzer çiftlenme süreleri vardır. Genellikle 30oC’de ürerler.
•
Maya ve bakteri: Asla aynı inkübatörde üretilmemelidirler. Ayrı odada
çalışılmaları tercih nedenidir. Mayalar bakterilerden kontamine olurlar
genellikle.
•
EĞER ŞÜPHELENİYORSANIZ ATIN!!
9