TEZ SON YENİ ASIL2 - Gazi Üniversitesi Açık Arşiv
advertisement
T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMASÖTİK TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI ÇOCUKLARDA KROİK BÖBREK HASTALIĞI VE BÖBREK AKLİ SORASI GEOTOKSİK HASARI BİYOİZLEMESİ DOKTORA TEZİ Dt. Banu AYKAAT Tez Danışmanı Prof. Dr. Sema BURGAZ Tez Danışman Yardımcısı Yrd. Doç. Dr. Gonca ÇAKMAK DEMİRCİGİL ANKARA Haziran 2010 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARMASÖTİK TOKSİKOLOJİ ANABİLİM DALI ÇOCUKLARDA KROİK BÖBREK HASTALIĞI VE BÖBREK AKLİ SORASI GEOTOKSİK HASARI BİYOİZLEMESİ DOKTORA TEZİ Dt. Banu AYKAAT Tez Danışmanı Prof. Dr. Sema BURGAZ Tez Danışman Yardımcısı Yrd. Doç. Dr. Gonca ÇAKMAK DEMİRCİGİL Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından SBE- 02/2007-22 proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Haziran 2010 Çok Sevgili Anneme ve Babama........ TEEKKÜR Önümde yepyeni ufukların açılmasını sağlayan, desteğini ve yakınlığını hiç esirgemeyen, değerli bilgi ve katkılarıyla çalışmalarıma yön veren değerli danışmanlarım Prof.Dr. Sema BURGAZ’a ve Yrd. Doç.Dr. Gonca ÇAKMAK DEMİRCİGİL’e, Değerli bilgileri ve bakış açısı ile yönlendirici olan, ayrıca tez izleme toplantılarındaki önerileri için Prof. Dr. Ali Esat KARAKAYA’ya, Projenin oluşturulmasında, deneylerimin yürütülmesi sırasında, tez izleme toplantılarında değerli bilgileri ve destekleri için Prof. Dr. Necla BUYAN’a, Projenin oluşturulmasında, deneylerimin yürütülmesi sırasında yardım ve destekleri için Prof. Dr. Esra BASKIN’a Tez çalışmalarımın yürütülmesi sırasındaki ilgileri için Prof. Dr. Bensu KARAHALİL’e ve Prof. Dr. İsmet ÇOK’a, FISH protokolün geliştirilmesinde değerli katkıları için Prof. Dr. Hasan ACAR’a, Hasta gruplarının oluşturulması sırasındaki özverili çalışmaları, ilgi ve destekleri için Doç. Dr. Aylin SEPİCİ’ye, Yrd. Doç. Dr. Kibriya FİDAN’a, Dr. Kaan GÜLLEROĞLU’na, istatistik konusunda emeği geçen Salih ERGÖÇEN’e, Yardımları ve sevgileriyle her zaman yanımda olan değerli bölüm arkadaşlarım Dr. Emre DURMAZ’a, Dr. Ela KADIOĞLU’na, Dr. A. Başak ENGİN’e, Uzm. Ecz. Erdem CO<KUN’a, Uzm. Ecz. Esra EMERCE’ye, Uzm. Ecz. Onur Kenan ULUTA<’a ve bölüm sekreterimiz Meral DOĞANAY’a, Huzurlu ve sevgi dolu bir çalışma ortamı sağlayıp, destek olan annem Ayten TÜZÜN’e, eşim Dr. Y. Müh. Mimar Atilla AYKANAT’a ve oğlum Murat AYKANAT’a En İçten Duygularımla Teşekkür Ederim II İÇİNDEKİLER 1.GİRİ< VE AMAÇ Sayfa no .............................................................................. 1 2.GENEL BİLGİLER ............................................................................. 5 2.1. Böbreklerin Temel Fonksiyonları ve Düzenlenmesi ...................... 5 2.2. Glomerüler Filtrasyon ve Glomerüler Filtrat .................................. 8 2.3. Böbrek Hastalıklarında Tanı Yöntemleri ....................................... 11 2.3.1. GFR’nın Ölçülmesi ................................................................ 11 2.3.2. İdrar Analizleri ....................................................................... 15 2.3.3. Plazma Böbrek Akımının Ölçülmesi ..................................... 15 2.3.4. Kan Analizleri ....................................................................... 16 2.3.5. Görüntüleme Yöntemleri ...................................................... 17 2.3.6. Böbrek Biyopsisi ................................................................... 17 2.4. Kronik Böbrek Hastalığı (KBH) ..................................................... 18 2.4.1. KBH Nedenleri ..................................................................... 19 2.4.2. Klinik Bulgular ...................................................................... 20 2.4.3. Üremik Semptomların Patogenezisi .................................... 20 2.4.4. Kronik Böbrek Hastalığında Evrelendirme .......................... 23 2.5.Son Dönem Böbrek Hastalığı (SDBH) ......................................... 24 2.5.1. Son Dönem Böbrek Hastalığı Gelişimi İçin Risk Faktörleri ............................................................................. 26 2.5.2. Yaygınlık ve Sıklık ................................................................ 28 2.6.Çocuklarda KBH ........................................................................... ..31 2.6.1. Çocuklarda KBH’nın Etiyolojisi ............................................. 32 2.7. Kronik Böbrek Hastalığında Tedavi .............................................. 35 2.7.1. Renal Replasman Tedavisi .................................................. 36 2.7.1.1. Diyaliz ....................................................................... 37 2.7.1.2. Diyalizde Oluşabilecek Komplikasyonlar ................... 42 2.7.1.3. Hemodiyaliz ve Glutatyon S-transferaz Polimorfizmi ............................................................ 43 III 2.7.1.4. Transplantasyon ....................................................... 45 2.7.2. İmmün Baskılayıcı İlaçlar ..................................................... 49 2.7.3. İmmün Baskılayıcı İlaçlar ve Polimorfizm ............................ 58 2.7.4. İmmün Baskılayıcı İlaçlar ve Genotoksik Etkileri ................. 60 2.8. Renal Replasman Tedavisi Alan Hastalarda Kanser ................... 62 2.8.1. Üremi ve Kanser ................................................................. 63 2.8.1.1. SDBH’da Malign Dönüşümün Potansiyel Mekanizması ............................................................ 67 2.8.1.2. KBH’da Oksidatif Stres, Karbonil Stres ve Tiyol Stres .......................................................................... 75 2.8.2. Böbrek Nakli ve Kanser Gelişimi ........................................... 80 2.8.2.1.Böbrek Nakli Yapılan Hastalarda Kanser Etyolojisi..... 86 2.8.2.2.Böbrek Nakli Sonrası Gelişen Kanser Türleri ............. 90 2.9.Genotoksisite Testleri ..................................................................... 97 2.9.1. Comet Yöntemi (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) ..... 98 2.9.2. Modifiye Comet Yöntemi ......................................................100 2.9.3. Mikroçekirdek Yöntemi .........................................................101 2.9.4. FISH Yöntemi (Fluoresan İn Situ Hibridizasyon) ..................108 2.9.4.1. FISH Kombine MÇ Yöntemi ....................................110 2.9.5. Eksfoliye Bukkal Epitede MÇ Yöntemi .................................122 2.9.6. Kronik Böbrek Hastalığında Lenfositlerde Comet, MÇ ve Eksfoliye Bukkal Epitelde MÇ Yöntemi İle Kromozomal Hasarın Saptanması ............................................................ 128 2.9.7.Çocuklarda Lenfositlerde Comet, MÇ ve Eksfoliye Bukkal Epitelde MÇ Yöntemi İle Kromozomal Hasarın Saptanması..132 3. GEREÇ VE YÖNTEM ....................................................................... 136 3.1.Materyal ve Çalışma Grubunun Seçimi ........................................ 136 3.2.Çalışma Ve Kontrol Grubundan Biyolojik Analiz Materyalinin Alınması ....................................................................................... 137 IV 3.3.Comet ve Modifiye Comet Yöntemi ............................................. 138 3.3.1 Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler ............................. 138 3.3.2. Test İçin Kullanılan Aletler ................................................. 139 3.3.3. Deneyin Yapılışı ................................................................. 139 3.4.Sitokinezisin Durdurulduğu Mikroçekirdek Yöntemi ..................... 142 3.4.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler ............................. 142 3.4.2. Test İçin Kullanılan Aletler .................................................. 143 3.4.3. Deneyin Yapılışı ................................................................. 143 3.5.FISH Kombine Mikroçekirdek Yöntemi ........................................ 147 3.5.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler ............................ 147 3.5.2. Test İçin Kullanılan Aletler ................................................. 148 3.5.3. Deneyin Yapılışı ................................................................ 148 3.6.Bukkal Epitelde Mikroçekirdek Yöntemi ....................................... 150 3.6.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler ............................ 150 3.6.2. Test İçin Kullanılan Aletler .................................................150 3.6.3. Deneyin Yapılışı ................................................................ 151 3.7.İstatistiksel Analiz ......................................................................... 152 4. BULGULAR ...................................................................................... 154 4.1. Hasta ve Kontrol Gruplarının Anket Bilgileri ................................ 154 4.2.Hasta ve Kontrol Gruplarının Genel Özellikleri ............................. 167 4.3.Biyokimyasal Parametrelerin İncelenmesi .................................... 170 4.4.Lenfositlerde Comet ve Modifiye Comet Değerlerinin İncelenmesi .................................................................................. 185 4.5.Lenfositlerde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi .....................192 4.6.Lenfositlerde FISH Kombine Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi .................................................................................. 198 4.7.Bukkal Epitel Hücrelerinde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi ...................................................................................205 4.8.Korelasyon Analizleri .................................................................... 208 4.9.Regresyon Analizi .........................................................................215 V 5.TARTI<MA .....................................................................................219 5.1. Biyokimyasal Parametrelerin İncelenmesi ..............................222 5.2. Lenfositlerde Comet ve Modifiye Comet Değerlerinin İncelenmesi .......................................................................... 226 5.3. Lenfositlerde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi ............. 233 5.4. Lenfositlerde FISH ile Kombine Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi .............................................................................241 5.5. Bukkal Epitelde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi.......... 247 6. SONUÇ ........................................................................................252 7. ÖZET .......................................................................................... 255 8. SUMMARY ................................................................................. 257 9. KAYNAKLAR .............................................................................. 259 10. EKLER ......................................................................................279 11. ÖZGEÇMİ< ...............................................................................284 VI EKİLLER Sayfa no ekil 1: Sağ böbreğin boyuna kesiti ...................................................... 5 ekil 2: Nefronun yapısı ......................................................................... 6 ekil 3: Nefronun işlevleri ....................................................................... 7 ekil 4: USRDS 2008 verilerine göre 2006 SDBH prevalansı ............... 29 ekil 5: USRDS 2008 verilerine göre 2006 SDBH insidansı ................. 30 ekil 6: Türkiye’de 2007 yılında ilk defa RRT’ne başlanan pediyatrik hastalarda etyoloji .................................................................................. 34 ekil 7: Türkiye’de mevcut pediyatrik HD ve PD hastalarında yaş dağılımı .................................................................................................. 39 ekil 8: Türkiye’de mevcut HD hastalarında yaş ve cinsiyet dağılımı ... 40 ekil 9: Türkiye’de mevcut HD ve PD hastalarında diyalizde yaşam süresi ..................................................................................................... 40 ekil 10: HD hastalarında ölüm nedenleri ............................................. 41 ekil 11: Dünyada HD hastalarında ham ölüm oranları ...................... 41 ekil 12: Ülkemizde böbrek nakli yapılan hastalarının yıllara göre dağılımı ................................................................................................. 47 ekil 13: USRDS 2008 verilerine göre 2006 transplantasyon oranları... 48 ekil 14: Türkiye’de HD ve PD hastalarında malignitelere bağlı ölümlerin yıllara göre dağılımı ............................................................... 66 ekil 15: DNA’ da oksidatif hasar ve olası sonuçları .............................. 79 ekil 16: Böbrek nakli sonrası ölüm nedenleri ...................................... 80 ekil 17: MÇ formasyonu ......................................................................102 ekil 18: Cyt-B ilavesiyle MÇ formasyonun süreci ................................104 ekil 19: MÇ oluşumu ............................................................................105 ekil 20: Sitotoksik/genotoksik bir ajana maruziyet sonrasında hücrelerde MÇ yöntemiyle belirlenebilen oluşumlar ........................... 106 ekil 21: Köprü-kırılma-füzyon ve gen amplifikasyonu döngüsü .......... 107 ekil 22: MÇ tekniği ile sentromerik problu FISH’in kombine edilmesi . 111 VII ekil 23: a) Hibridizasyon bölgesindeki kırık, b) Hibridizasyon bölgesi dışındaki kırık, c) Kromozom kaybı veya ayrılamaması .........................112 ekil 24 : İn situ hibridizasyonun mekanizması .....................................113 ekil 25: Doğrudan fluorescein işaretli probla hedef DNA’nın hibridizasyonu ........................................................................................ 114 ekil 26: Bukkal mukozanın yapısı ve oluşan hücreler .........................124 ekil 27: Bukkal mukozanın farklılaşması .............................................125 ekil 28: Bukkal mukozada mikroçekirdekli hücre ................................ 127 ekil 29: Bukkal mukozada değerlendirmeye alınan hücre tipleri ........ 127 ekil 30: Hastaların binükleer lenfositlerindeki MÇ frekansı ................ 131 ekil31: Kontrol, KBH ve HD hastalarında DNA hasarının Comet yöntemiyle karşılaştırılması ....................................................................131 ekil 32: Mikroskopta MÇ, NPB ve Nbud görünümü .............................145 ekil 33: MÇ ve NPB formasyonu .........................................................147 ekil 34: k1 nolu kontrol grubu çocuğun n-1 kodlu lamından fotoğraflar189 ekil 35: (a, b, c, d) 14 nolu prediyaliz grubu çocuğun n-1 kodlu lamından fotoğraflar ...............................................................................190 ekil 36: (a) k1 nolu çocuğun, (b,c) 14 nolu çocuğun lenfositlerinde Comet Assay III görüntü analiz programı ile yapılan ölçümün fotoğrafları ........191 ekil 37: DAPI filtresi ile lenfositlerin çekirdek ve MÇ fotoğrafları (a) 6 nolu çocuk hastada trinükleer hücrede MÇ, (b) 9 nolu çocuk hastada mononükleer hücrede MÇ, (c ) 27 nolu çocuk hastada binükleer hücre 204 ekil38:FITC filtresi ile lenfositlerin (a)binükleer hücrede, (b) mononükleer hücrede sentromerlerinden alınan sinyallerin fotoğrafları ......................205 VIII TABLOLAR Sayfa no Tablo 1: Çocuk ve ergenlerde normal GFR değerleri ............................. 10 Tablo 2: Kronik böbrek hastalığının evrelendirmesi .............................. 24 Tablo 3: ABD’de SDBH nedenleri ve hasta dağılımı (1999-2003) ........ 25 Tablo 4: Türkiye’de hemodiyaliz tedavisine yeni başlayan hastalarda KBH nedenleri ........................................................................................ 26 Tablo 5: Primer böbrek hastalıklarının yaş dağılımı ............................. 33 Tablo 6: Çocuklarda 1991 yılında ABD’de SDBH insidansı ................. 34 Tablo 7: Böbrek naklinde kullanılan immün baskılayıcı ilaçlar ............ 50 Tablo 8: Cyclosporin ve tacrolimusun karşılaştırması .......................... 53 Tablo 9: Cyclosporine ve tacrolimusun özellikleri ................................ 53 Tablo 10: Azathioprine (Aza), mycophenolate mofetil (MMF), sirolimus’un özellikleri ............................................................................ 56 Tablo 11: İmmün baskılayıcı ilaçlar ve genotoksik etkileri ..................... 61 Tablo 12: Avustralya ve Yeni Zelanda’da SDBH olan çocuklarda uyumlama yapılmamış uzun dönem sağ kalım yüzdeleri ....................... 63 Tablo 13: SDBH’da malign dönüşümün potansiyel mekanizması ........ 67 Tablo 14: Hemodiyaliz hastalarında artmış oksidan stres ve azalmış antioksidan savunma nedenleri .............................................................. 69 Tablo 15: En sık karşılaşılan radikaller ve kimlikleri .............................. 75 Tablo 16: Böbrek nakli sonrası malignite insidansını arttıran nedenler .. 83 Tablo 17: Böbrek nakli ve başarılı bir kanser tedavisi arasındaki bekleme periyodu ................................................................................... 88 Tablo 18: CTTR’ye göre böbrek ve diğer organ alıcılarında “de novo” malignansil .......................................................................................... 89 Tablo 19: Alıcılarda kanser insidansının, coğrafi bölgelere göre dağılımı ................................................................................................... 90 Tablo 20: Dünyada transplantasyon sonrası kanser vakaları ............... 94 Tablo 21: Transplantasyon sonrası malignansi insidansı ...................... 95 IX Tablo 22: KBH olan yetişkinlerde genomik hasarın incelenmesi............130 Tablo 23: Çocuklarda 1999-2010 yılları arasında yapılan çalışmalar (Lenfositlerde Comet, MÇ, FISH ve bukkal epitelde MÇ) .......................133 Tablo 24: Hasta grubu çocukların KBH’nın nedenleri ............................154 Tablo 25: Tx grubunda kullanılan immün baskılayıcı rejimleri ...............155 Tablo 26: Hasta grubunun anket bilgileri ...............................................157 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri .........................160 Tablo 28: Kontrol grubunun anket bilgileri .............................................166 Tablo 29 : Hasta ve kontrol grubunun genel özellikleri ..........................167 Tablo 30: Tx hastalarının Tx, Tx öncesi HD ve ilk tanıdan itibaren; HD hastalarının HD ve ilk tanıdan itibaren; PreD hastalarının ilk tanıdan itibaren geçen süreleri ............................................................................169 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri ................................171 Tablo 32: Kontrol grubunun biyokimyasal değerleri ..............................177 Tablo 33: Tx, HD, PreD, TH ve kontrol gruplarında biyokimyasal parametrelerin ortalama (±SS) ve ortanca (IQR) değerleri .....................178 Tablo 34: Tx, HD ve PreD gruplarında biyokimyasal parametrelerin ortalama (±SS) ve ortanca (IQR) değerleri .............................................179 Tablo 35: Hasta ve kontrol grubu çocukların lenfositlerde TINT, TINTSENDO, TINTSFPG değerleri ........................................................186 Tablo 36: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında lenfositlerde TINT, TINTSENDO, TINTSFPG parametrelerinin ortalama (±SS) ve ortanca (IQR) değerleri ........................................................................................187 Tablo 37: Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde NDI, MÇ’li bnh, MÇ/bnh, MÇ/mnh, Nköprü/bnh, Nbud/bnh değerleri ..............................193 Tablo 38: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında lenfositlerde NDI, MÇ’li bnh, MÇ/bnh, MÇ/mnh, Nköprü/bnh, Nbud/bnh değerlerinin ortalama (±SS) ve ortanca (IQR) değerleri ............................................................195 Tablo 39: Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde MÇ, S(-)MÇ, S(+)MÇ değerleri ..................................................................................................199 Tablo 40: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında lenfositlerde MÇ/bnh, X S(-)MÇ, S(+)MÇ sıklığının ortalama (±SS) ve ortanca (IQR) değerleri...201 Tablo 41: Hasta ve kontrol gruplarında lenfositlerde S(- )MÇ ve S(+)MÇ dağılımı ................................................................................... 202 Tablo 42: Hasta ve kontrol grubunun bukkal epitel hücrelerinde MÇ sıklığı .....................................................................................................206 Tablo 43: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında bukkal MÇ, MÇ’li hücre sıklıklarının ortalama (±SS) ve ortanca (IQR) değerler ...............207 Tablo 44: Hasta grubunda birbiriyle ilişkisi olan genotoksisite parametreleri .........................................................................................209 Tablo 45: Kontrol grubunda birbiriyle ilişkisi olan genotoksisite parametreleri ........................................................................................ 210 Tablo 46: Hasta grubunda biyokimyasal parametreler ile genotoksisite parametreleri arasındaki ilişki ...............................................................212 Tablo 47: Kontrol grubunda biyokimyasal parametreler ile genotoksisite parametreleri arasındaki ilişki ...............................................................213 Tablo 48: Tx, HD ve PreD süreleriyle genotoksisite parametrelerinin İlişkisi ....................................................................................................215 Tablo 49: Regresyon analizi ile belirlenen parametrelerin genotoksisite parametreleri üzerine etkisi ...................................................................216 XI GRAFİKLER Sayfa no Grafik 1: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında BUN, total kolestrol, trigliserit değerleri [ortalama (±SS)] ...............................182 Grafik 2: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında ürik asit, kreatinin, albumin değerleri [ortalama (±SS)] ........................................182 Grafik 3: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında parathormon, alkalen fosfataz, ferritin değerleri [ortalama (±SS)] ........183 Grafik 4: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında homosistein, CRP, değerleri [ortalama (±SS)] ......................................183 Grafik 5: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında TAS, IL-6 değerleri [ortalama (±SS)] .....................................................................184 Grafik 6: Tx, HD ve PreD gruplarında potasyum ve sedimantasyon değerleri [ortalama (±SS)] .................................................................... 184 Grafik 7: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında TINT, TINTSENDO, TINTSFPG değerleri [ortalama (±SS)] ...........................188 Grafik 8: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında NDI, MÇ’li hücre sayısı, MÇ sayısı [ortalama (±SS)] ..............................................197 Grafik 9: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında MÇ sayısı/mnh, Nköprü sayısı/bnh [ortalama (±SS)] .................................. 197 Grafik 10: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında MÇ, S(-)MÇ, S(+)MÇ sayısı [ortalama (±SS)] ...............................................203 Grafik 11: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında MÇ ve MÇ’li hücre sayısı [ortalama (±SS)] .......................................................208 XII KISALTMALAR ACE Anjiotensin çevirici enzim AGE İleri glikozilasyon son ürünleri ALE İleri lipoksidasyon ürünleri ALG Antilenfosit globulin ALS Antilenfosit Serum ANTR Australian and New Zealand Transplant Registry ANZDATA Australia and New Zealand Dialysis and Transplant Registry AOPP Protein ileri oksidasyon ürünleri ATG Antitimosit Globulin Aza Azathioprine BUN Kan üre azotu CAT Katalaz CBMN Sitokinezisin bloke edildiği MÇ yöntemi CMV Sitomegalo Virus CRP C reaktif protein CTTR Cincinnati Transplant Tumor Registry CyA Cyclosporin A CYP Sitokrom P450 Cyt-B Sitokalazin-B DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole DOQI Dialysis Outcome Quality Index EBV Epstein Barr Virus EDTA European Dialysis and Transplant Association EtBr Etidium bromür EPO Eritropoetin FMF Familial Mediterranean Fever FK506 Tacrolimus GFR Glomerüler filtrasyon hızı GİS Gastrointestinal sistem GPx Glutatyon peroksidaz GST Glutatyon S transferaz GSTM1(-) GST M1 null aleli HAT Humanize ANTI-TAC HBV Hepatit B Virus HCV Hepatit C Virus HD Hemodiyaliz HDF Hemodiafiltrasyon HHV-8 Human Herpes Virus-8 HMA High melting agar hOGG1 Human OGG1 HPV Human Papilloma Virus HSV Herpes Simpleks Virus IFN Interferon-gamma XIII LMA KBH Maygn MÇ MDA MDR1 MMF Mtn NDI NRTR OGG1 OSI PBH PCC PD PMNL PreD PTLD PUFA RCC ROS RRT S(+)MN S(-)MN SCE SCGE SDBH SLE SOD SSC TAS TND TNFα TOR TOS TPMT Tx UGT USRDS VUR 8-OHdG Low melting agar Kronik böbrek hastalığı Milyon aynı yaş grubu nüfus Mikroçekirdek Malondialdehit Multidrug resistance gen1 Mycophenolate mofetil Milyon toplam nüfus Nükleer bölünme indeksi Nordic Renal Transplant Registry Okzoguanin-DNA glikozilaz 1 Oksidatif stres indeksi Polikistik böbrek hastalığı Protein karbonil bileşikleri Periton diyaliz Polimorfonükleer lökosit Prediyaliz Post transplant lenfoproliferatif hastalık Doymamış yağ asitleri Renal hücreli karsinoma Serbest oksijen radikalleri Renal replasman tadavisi Sentromer pozitif MÇ Sentromer negatif MÇ Sister chromatid exchange Comet Yöntemi (The single cell gel electrophoresis) Son dönem böbrek hastalığı Sistemik lupus eritematozus Süperoksit dismutaz Saline sodium citrate buffer Total antioksidan kapasite Türk Nefroloji Derneği Tümör nekrozis faktör-α Target of rapamycin Total oksidatif seviye Tiyopurin metiltransferaz Böbrek nakli yapılmış UDP glukoroniltransferaz ABD’de Renal Data Sistemi Vezikoüretral reflü 8-hidroksideoksiguanozin XIV 1.GİRİ ve AMAÇ Kronik böbrek hastalığı, glomerüler filtrasyon değerinde azalmanın sonucu, böbreğin sıvı-solüt dengesini ayarlamada ve metabolik endokrin fonksiyonlarında kronik ve ilerleyici bozulma hali olarak tanımlanabilir1. Böbreğin süzme ve hormonal fonksiyonlarındaki kaybının sebebine, gelişimine ve sonuçlarına yönelik tedavinin ömür boyu sürdürülmesi gereklidir. Hasta sonunda tüm böbrek fonksiyonlarını yitirdiğinde, yaşamı uzatmaya yönelik renal replasman tadavisine (RRT) başlanır2. Üremik semptomların patogenezisinde hormonal değişiklikler, kan üre nitrojeni, kreatinin, homosistein ve ileri glikozilasyon son ürününleri gibi organik bileşikler ve inorganik maddeler rol oynamaktadır3. Normal şartlarda hücrelerde oksidanlar ve antioksidanlar arasında korunan denge, kronik böbrek hastalığının bir sonucu olarak bozulmuştur4. Bu nedenle RRT alan/almayan tüm son dönem böbrek hastaları, artmış bir oksidatif stresle karşı karşıyadır5. Kronik böbrek hastalığı olanlarda aynı yaştaki genel nüfusa göre malignite riskinde artış vardır6. Ancak artışın belirli bir kanser türüne mi, ya da kronik böbrek hastalığının belli kategorilerine mi özgü olduğu ile ilgili, genel bir değerlendirme yoktur ve mekanizma tam olarak bilinmemektedir7. Ayrıca, immün baskılayıcı ilaçlarla uzun süreli tedavi gören böbrek nakli yapılmış hastaların kanser gelişimine daha duyarlı oldukları bazı çalışmalarla gösterilmiştir8. Türk Nefroloji Derneği’nin 2001 yılı istatistiklerine göre, ilk kez nefroloji polikliniğine yatan hastaların %15.5’i ve hemodiyalize başlayan hastaların %1.6’sı 15 yaş altındaki çocuklardır9. Hemodiyaliz hastalarının 1 yaş dağılımına bakıldığında ise, %51.4’ünü 15 yaş altı çocuklar oluşturmaktadır10. 2008 sonu itibariyle hemodiyaliz programına alınan 39208 hastanın %1.0’ini, periton diyaliz programına alınan 4417 hastanın %2.9’unu ve böbrek nakli yapılan 6979 hastanın %9,4’ünü 0-19 yaş grubu çocuklar oluşturmaktadır11. Çocuk hastalar, yetişkin olana kadar üremiye daha uzun süre maruz kalmaktadırlar12. Üremide artan oksidatif stresin kardiyovasküler hastalık ve kanser riskinin artışı ile de ilişkili olduğuna inanılmaktadır13. Kronik böbrek hastalığı (KBH) olan çocuklarda hayatta kalım süresinin uzatılması konusunda son 20 yılda elde edilen önemli başarılara rağmen, mortalite oranı hala yüksektir14. Bütün mortalite oranları beklenenden 30 kere fazladır. RRT’nin başlangıcında yaşın genç olmasının bütün çalışmalarda önemli bir mortalite risk faktörü olduğu tespit edilmiştir. Çocuklarda tüm ölümlerin %40-50’si kardiyovasküler, %20’si enfeksiyon hastalıklar nedeniyledir8. Genel popülasyon ile karşılaştırıldığında ise kansere yakalanma sıklığının 10 kez arttığı belirtilmiştir12. 1963-2002 yılları arasında Avustralya ve Yeni Zelanda’da son dönem böbrek hastalığı (SDBH) olan 1634 çocuk ve adolesanın incelenen kayıtlarına göre; böbrek nakli yapılan çocuklar arasındaki ölümlerin %14’ünü, hemodiyalizdeki çocuklar arasındaki ölümlerin %1’ini ve periton diyalizdeki çocuklar arasındaki ölümlerin %2’sini malign hastalıkların oluşturduğu tespit edilmiştir14. Pediatrik hastalarda son dönem böbrek hastalığının nedeni, yetişkin hastalardan belirgin bir şekilde farklıdır. Pediatrik SDBH olan hastalarda tedavi şekli de yetişkinlerden oldukça farklıdır. Büyüme, gelişme ve okula devam gibi sonuçlar, pediatrik SDBH olan hastalara özgüdür. SDBH olan çocukların bakımının, yetişkinlerdekinden daha kompleks olduğu kabul edilir. Bu nedenle çocuklarda böbrek hastalığı 2 tedavisi, multidisipliner bir takım çalışması ve daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir15. Oksidatif stresin, genotoksik hasar ile ilişkisi ve genotoksisitenin de kansere giden yolakta ara bir basamak olarak öngörülmesi7, etkinin biyogöstergeleri olarak genotoksisite testlerinin kullanımını yaygınlaştırmıştır. Comet Yöntemi oksidatif hasarın tespitinde16, lenfositlerdeki MÇ Yöntemi de kanser riskini öngörmede17 kullanılan önemli göstergelerdir. Karsinojen ve mutajenlerin oluşturduğu bazal DNA hasarının tespitinde ise bukkal epitel hücreleri yaygın biçimde kullanılmaktadır18. KBH olan yetişkin hastalarda genomik hasarın varlığı periferal kan lenfositlerinde Mikroçekirdek (MÇ), Comet, lökositlerde 8OHdG, bukkal mukoza epitelinde MÇ ölçümü gibi çeşitli yöntemlerle gösterilmiştir19. Henüz hemodiyaliz (HD) programına girmemiş veya uzun süredir HD’de olan yada böbrek nakli yapılmış immün baskılayıcı kullanan hastaların, DNA onarımında azalma olduğu gösterilmiştir20. Aynı hasta gruplarında, lenfositlerdeki MÇ sıklıklarında anlamlı artışlar olduğu gözlenmiştir 21,20. Diyaliz tedavisi gören ya da böbrek nakli nedeniyle immün baskılayıcı ilaçlarla tedavi gören çocuk hastalarda kanser oluşma riskini öngörecek, genotoksik hasara yönelik biyogöstergelerin kullanıldığı çalışmalar; gerekli önlemlerin alınabilmesi, tedavi yaklaşımlarının geliştirilebilmesi ve en önemlisi sağlıklı, uzun bir yaşam sürdürülebilmesi açısından önemlidir. Ayrıca genotoksik hasarı saptamaya yönelik invaziv 3 olmayan yöntemlerin etkinliğinin saptanması çocuk hastaları daha kolay biyoizleme olanaklarını ortaya koyması açısından önem taşımaktadır. Elimizdeki son verilere göre, prediyalizde olan veya diyaliz tedavisi gören ya da böbrek nakli nedeniyle immün baskılayıcı ilaçlarla tedavi gören çocuk hastalarda genotoksik hasar düzeylerinin incelendiği herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle düzenlenen çalışmamızın amacı; • Prediyalizde olan, hemodiyaliz tedavisi gören ve böbrek nakli yapılmış kronik böbrek hastalığı olan çocukların lenfositlerinde oksidatif/DNA hasarı düzeylerini Comet ve MÇ Yöntemleri ile saptamak, • Olası genotoksik hasarın klastojenik ya da anojenik bir mekanizma ile oluşup oluşmadığını “fluorescence in situ hybridization” (FISH) tekniği ile kombine MÇ Yöntemi ile belirlemek, • Bukkal mukozanın eksfoliye epitel hücrelerinde bazal DNA hasarını MÇ Yöntemi ile belirlemek ve hasta grubunun biyoizlenmesinde bukkal mukoza eksfoliye epitel hücrelerinin alternatif bir doku olma potansiyelini incelemek, • Bu hasta gruplarındaki biyokimyasal parametrelerin ve immün baskılayıcı ilaçların DNA hasar düzeylerine etkisini incelemektir. 4 2.GENEL BİLGİLER 2.1. Böbreklerin Temel Fonksiyonları ve Düzenlenmesi Böbrekler retroperitoneal bölgede bulunan, her biri yaklaşık 120-150g ağırlığında olan organlardır1. Iekil 1’deki boyuna kesitte böbreğin dışta korteks, en içte medulla ve internal pelvis ve kalislerden oluştuğu görülür22. 23 ekil 1: Sağ böbreğin boyuna kesiti Böbreğin temel fonksiyonları24: 1) Vücut sıvı ve elektrolit dengesinin korunması (Su, Na, K, H, Ca, P, Mg, bikarbonatL) 2) Metabolik artık ürünlerin atılımı (Üre, ürik ast, kreatininL) 3) İlaçlar, toksinler ve metabolitlerinin detoksifikasyonu ve atılımı 4) Ekstrasellüler sıvı hacmi ve kan basıncının hormonal düzenlenmesi • Renin-anjiotensin sistemi • Renal prostoglandinler • Renal kallikrein-kinin sistemi 5) Hormon üretimi ve metabolizmasına katkı 5 (Eritropetin, D vitaminiL) 6) Peptit hormonların yıkımı (İnsülin, glukagon, parathormon, kalsitonin, büyüme hormonuL) 7) Küçük molekül ağırlıklı proteinlerin yıkımı (Hafif zincirler, beta-2-mikroglobülinL) 8) Metabolik etki (Glukoneogenez, lipid metabolizmasıL) Böbreğin fonksiyonel birimi nefrondur. Nefron hem salgılama hem de boşaltım fonksiyonları olan bir tübülden ibarettir22. Her iki böbrekte yaklaşık 2000000 nefron vardır ve her nefron tek başına idrar yapma yeteneğine sahiptir. Bir nefron temel olarak iki kısımdan oluşur1 (Iekil 2). 1) Sıvının kandan filtre olduğu glomerül 2) Filtre edilmiş sıvının idrara dönüştüğü tübül 25 ekil 2: Nefronun yapısı 6 Kortekste glomerüller, proksimal ve distal tübülüsler ve de korteksteki nefronların Henle kulpları bulunur. Medullada ise toplayıcı kanallar, Henle kulpları ve vasa rektalar bulunur1. Nefronların temel işlevleri1 (Iekil 3): 1) Glomerüler filtrasyon: Glomerüldeki kanın yaklaşık 1/5’ini glomerüler membrandan tübüler sistem içine filtre eder. 2) Tübüler reabsorbsiyon: Filtre edilen sıvı tübüllerde seyrederken başta su olmak üzere gereken maddeler peritübüler kapiller ağdaki plazma içine reabsorbe edilirken, istenmeyen maddeler geri emilmez ve idrar oluşumuna katkıda bulunur. 3) Tübüler sekresyon: İstenmeyen maddelerin atılmasını sağlayan önemli bir mekanizmadır. Plazmadaki bazı maddeler tübülleri döşeyen epitel hücrelerince doğrudan tübüler sıvı içine sekrete edilir. ekil 3: Nefronun işlevleri 26 7 Glomerüler filtrat, tübüllerden geçerken su içeriğinin %99’u ve solüt içeriğinin değişen miktarları vasküler sisteme emilirken, az sayıdaki bazı maddeler de tübüllerin içine sekrete edilir. Bu işlemler sonucunda, geri kalan tübüler su ve solütler idrarı oluşturur1. Renal kan akımı ve basıncı: 70kg ağırlığında erişkin bir insanda her iki böbrekten geçen kan akımı 1200ml/dk’dır. Afferent arteriyolün başında ~100mmHg olan kan basıncı, glomerül içindeki kapillerlerde 60mmHg’ya düşer. İnsan vücudunda glomerül dışında bulunan kapillerlerde ise basınç ortalama 15-35mmHg’dır. Bu değerlerden de anlaşılabileceği gibi glomerül içindeki kapiller yapı, özelleşmiş bir yapıdır ve ~60mmHg’lık basınç, sıvının kolayca filtre olmasını sağlar. Kan efferent arteriyol içinde ilerledikçe basınç 20mmHg’ya düşer. Bu azalmış basınç plazmanın onkotik basıncından düşük olduğu için, tübül lümeninden geri emilim sağlanır1. 2.2. Glomerüler Filtrasyon ve Glomerüler Filtrat Glomerülden Bowman kapsülü içine filtre olan sıvıya filtrat adı verilir. Glomerüler membran, çok katmanlı olmasına rağmen olağan bir kapillere göre 100 ila 500 kat daha fazla geçirgenliğe sahiptir. Fakat glomerüler membranın geçirgenliğinin fazla olmasına rağmen seçiciliği molekül büyüklüğüne göre değişir. Bu seçiciliği, porların büyüklüğü ve elektriksel yük etkiler. Glomerül porları, kuvvetli negatif yüklü kompleks proteoglikanlar içerdiğinden negatif yüklü molekülleri uzaklaştırır1. Glomerüler filtratın kompozisyonu: Glomerüler filtratın yapısı, pratik açıdan plazma ile benzer olmasına karşın, içinde eritrosit yoktur ve protein miktarı çok daha azdır (plazmadakinin 1/240’ı kadar)1. 8 Glomerüler filtrasyon hızı (GFR)1: Her iki böbreğin tüm nefronlarında birim zamanda üretilen glomerüler filtrat miktarına, glomerüler filtrasyon hızı denilir. Normal bireyde bu değer yaklaşık 125 ml/dk’dır. Çocuk ve ergenlerde normal GFR’ı değişiklik gösterir (Tablo 1). Günde üretilen glomerüler filtrat miktarı yaklaşık 150-180litredir. Tübüllere ulaşan glomerüler filtrat sırasıyla proksimal tübül, Henle kulpu, distal tübül, kortikal toplayıcı kanallar ve pelvise ulaşan toplayıcı kanallar içinde ilerler. Ama %99’undan fazlası reabsorbe edilir ve geri kalanı idrar olarak atılır. İdrarın oluşumunda geri emilim, sekresyondan çok daha önemli bir rol oynar. Ancak sekresyon, özellikle potasyum ve hidrojen iyonlarının atılımı açısından çok önemlidir. Plazmanın glomerüler filtrat haline dönüşen kısmı filtrasyon fraksiyonudur. Böbreklerden normal plazma akımı 650 ml/dk ve normal glomerül filtrasyon hızı 125ml/dk olduğunda, ortalama filtrasyon fraksiyonu %18-20’dir1. Glomerül içinde filtrasyonu sağlayan dinamiği oluşturan 1 etkenler : 1) Glomerüler kapiller içindeki filtrasyon lehindeki hidrostatik basınç 2) Bowman kapsülünün filtrasyona karşı koyan hidrostatik basıncı 3) Filtrasyona engel oluşturan plazma proteinlerinin onkotik basıncı 4) Filtrasyona yardımcı olan Bowman kapsülü içindeki proteinlerin onkotik basıncı (Fizyolojik koşullarda bu basınç sıfıra yakındır). 9 27 Tablo 1: Çocuk ve ergenlerde normal GFR değerleri YA ve CİNSİYET GFR ± SD (ml/dk/1.73 m2) 1 hafta 40.6±14.8 2-8 hafta 65.8 ±24.8 >8 hafta 95.7 ±21.7 2-12 yaş 133.0 ±27.0 13-21 yaş – erkek 140.0 ±30.0 13-21 yaş – kız 126.0 ±22.0 GFR’nı böbrekler değişen fizyolojik durumlara göre yeniden düzenleyebilir. GFR, 80-180mmHg değerler arasında kan basıncı değişikliklerinden etkilenmez (otoregülasyon). Bu otoregülasyonda rol oynayan mekanizmalar1; 1) Miyojenik mekanizma: Kan basıncı düşünce afferent arteriyolde vazodilatasyon olur. 2) Tübüloglomerüler mekanizma: Kan basıncının düşmesi geçici olarak glomerüler kapiller basınç ve GFR’nı azaltır. Bunun sonunda makula densaya daha az sodyum gelir. Buna bağlı olarak afferent arteriyolün direnci azalır ve vazodilatasyon olur. 3) Renin-anjiyotensin sisteminin aktivasyonu: Kan basıncında azalma ve makula densaya gelen sodyumun azalması lokal reninanjiyotensin sistemini aktive eder. Anjiyotensin II’nin artması ise efferent arteriyolde vazokonstrüksiyona yol açar. 10 2.3. Böbrek Hastalıklarında Tanı Yöntemleri Böbrek hastalıklarında başlangıçta hastayı doktora yönlendirecek yakınma fazla değildir. Hastalık ilerleyince belirti ve bulgular ortaya çıkar ve çoğu kez tanı hastalık ilerledikten sonra konur28. Tanıda kullanılan yöntemler: 1) GFR’nın ölçülmesi 2) İdrar analizleri 3) Plazma böbrek akımının ölçülmesi 4) Kan analizleri 5) Görüntüleme yöntemleri 6) Böbrek biyopsisi 2.3.1. GFR’nın Ölçülmesi GFR’nın ölçülmesi aşağıdaki durumlarda yararlıdır1: • Böbrek yetmezliğinin derecesinin saptanması • İlaç dozunun ayarlanması • Kronik diyaliz tedavisine başlama zamanının belirlenmesi • Tedaviye yanıtın değerlendirilmesi Böbrek plazma akımının yaklaşık %20’si glomerülden filtre olur. GFR’nın ölçülmesi tüm böbrek fonksiyonları içinde en önemlisidir. GFR’nın normal değeri 70-145ml/dk’dır. 40 yaşından sonra GFR her yıl 1 ml/dk azalır. Klinikte GFR hesaplanırken klerens formülleri kullanılır24. Klerens ölçümü için kullanılacak olan ideal bir madde; dolaşımda serbestçe bulunmalı, glomerüler bazal mambrandan serbestçe filtre olmalı, nefron boyunca sekrete edilmemeli ve geri emilmemeli, sabit hızda endojen üretilmeli ve kolaylıkla ölçülebilir olmalıdır. GFR’nın ölçülmesinde 11 en sık kullanılan yöntem, kreatinin klerensidir. Ayrıca inülin, Tc 99m (Teknesyum-99m) ile işaretlenmiş DTPA (dietilen triamin pentaasetik asit) ve üre gibi maddeler de kullanılabilir1. Kreatinin, kas hücrelerinin yıkımı sonucunda oluşur. Yaklaşık 20mg kasın günlük metabolizması sonucunda 1mg kreatinin üretilmektedir. Ayrıca idrar kreatininin yaklaşık %20’si et alımı ile olmaktadır3. Erkeklerde 20-26mg/kg/gün ve kadınlarda 14-22mg/kg/gün idrarla atılır1. Kreatinin üretimi stabil olduğundan ve kreatinin glomerüllerden filtre edildiğinden, böbrek klerensi hemen hemen glomerül filtrasyon hızına eşit kabul edilir22. Ama kreatinin klerensi ile bulunan değer, gerçek GFR’dan %15 daha fazladır24. Bunun nedeni tübüler sekresyondur24. Kronik böbrek yetmezliği ve şiddetli proteinüri varlığında kreatininin tübüler sekresyonunun oranı artar ve ilerlemiş kronik böbrek yetmezliğinde “kreatinin klerensi / gerçek GFR” oranı 2-2,5’a yükselir. Bu durumda kreatinin klerensi GFR’nı daha az yansıtır hale gelir1. GFR’nın daha düzgün hesaplanması için, kreatinin salgılanmasının engelleyicisi olarak simetidin verilmektedir3. Serum kreatinin değerleri böbrek fonksiyonlarının yaklaşık %50’si kaybolana kadar normal düzeylerde kalır. Diğer atık ürünlerinin çoğunun aksine serum kreatinin düzeyi genellikle besinlerden ve hidrasyon durumundan etkilenmez. Böbrek fonksiyonunun ölçümü açısından, kreatinin yüksek derecede güvenilir olmasına karşın, idrar özellikle belirtilen süreden (sıklıkla 24 saat) daha kısa bir zamanda toplanmış veya aynı anda serum örneği alınmamışsa kreatinin klerensi yanıltıcı olabilir22. Kreatinin klerensi 2 formülle hesaplanabilir1. i) 24 saat idrar toplanarak1: İdrar kreatinin (mg/dl) X Günlük idrar hacmı (ml) Kreatinin klerensi (ml/dk) = -----------------------------------------------------------------Serum kreatinin (mg/dl) X 1440 12 ii) Sadece serum kreatinine bakılarak (Schwartz formülü, CockcroftGault formülü ve MDRD formülü) 1: • Schwartz formülü Boy (cm) x 0.55 GFR= ------------------------------------Serum kreatinin • Cockcroft-Gault formülü: (140-yaş) (İdeal kilo) Kreatinin klerensi (ml/dk) = --------------------------------------Serum kreatinin (mg/dl) X 72 Boy (cm) – 152,4 İdeal kilo (erkek için) = 50 + 2,3 X --------------------------2,54 Boy (cm) – 152,4 İdeal kilo (kadın için) = 45,5 + 2,3 X --------------------------2,54 • MDRD (Böbrek Yetmezliğinde Diyet Değişiklikleri) formülü: GFR = 186 X ([Scr] -1,154 ) X ([Yaş] – 0,203 ) X (0,742 kadın ise) Scr= Serum kreatinin düzeyi (mg/dl) MDRD formülü ile hesaplanan GFR, Cockcroft-Gault formülünden biraz daha düşüktür. Her üç formül de böbrek yetmezliğinin belirli bir dengede olduğu hastalar için geçerli olup, serum kreatinin düzeyini değiştiren faktörlerin yanıltıcı etkilerine açıktır1. 13 Serum kreatinin düzeyine dayalı klerens formülerinin kullanılamayacağı durumlar1: • Uç yaşlar • Uç beden boyutları • Iiddetli malnütrisyon veya obesite • İskelet kas hastalıkları • Parapleji veya kuadripleji • Vejeteryan diyet • Hızlı değişen böbrek fonksiyonları • Böbrekten atılan nefrotoksik ilaç doz hesaplanması • Serum kreatininini etkileyen diğer durumlar Üre klerensi de kısmen GFR’nı yansıtır, ama kabaca bir göstergedir1. Üre, protein katabolizmasının primer metaboliti olup tamamen böbreklerden atılır. Bu nedenle kan azotu, glomerül filtrasyon hızıyla yakın ilişki içindedir22. Üre klerensinin normal değerleri 60-80 ml/dk’dır. Kreatinin klerensinden düşük olma nedeni, ürenin tübüler geri emilimidir1. Üre klerens formülü1: İdrar üre azotu (mg/dl) X Günlük idrar hacmı (ml) BUN klerensi (ml/dk) = ----------------------------------------------------------------BUN (mg/dl) X 1440 Kreatininin hidrasyon durumundan aksine ve BUN diyetteki gastrointestinal protein sistem miktarından, kanamalarından etkilenir. Böbrek fonksiyonlarının yaklaşık üçte ikisi kaybolduğunda BUN düzeyinde önemli yükselmeler belirir. Bu nedenle yüksek BUN düzeyi yükselmiş kreatinin düzeyine göre böbrek yetersizliğinin daha az spesifik bir göstergesidir. Buna karşın BUN / Kreatinin oranı spesifik tanısal bilgi 14 sağlayabilir. Normalde bu orantı 10/1’dir. Dehidrate hastalarda ve her iki tarafta obstrüksiyon veya idrar ekstravazasyonu olanlarda orantı 20/1 – 40/1 arasında değişebilir. Aşırı hidrate hastalarda normal BUN düzeyinden daha düşük değerler görülebilir22. 2.3.2. İdrar Analizleri Böbrek hastalığının tipi ve şiddetine göre idrar hacmı değişir. Genellikle GFR, normalin %5’inden aşağı düşerse çıkartılan idrar miktarı oldukça azalır. Sodyum kayıpları düşük düzeyde ise kısa süre sonra sodyum retansiyonu oluşur. Proteinüri değişkenlik gösterebilir. İdrar tahlillerinde lökositler ve ara sıra mumsu silindirler görülebilmesine karşın, idrar tahlilleri genellikle nonspesifik olup, aktif enfeksiyon bulguları vermez22. • İdrarda protein: Normalde günde 100-150mg protein idrarla kaybedilir1. • İdrarla günlük albümin kaybı ise 30 mg altındadır1. • İdrar pH: Normalde 4-8 arasındadır1. • İdrarın özgül ağırlığı: 1003-1035 arasındadır1. • İdrarın ozmolaritesi: 50-1200 mOsm/kg arasındadır1. • İdrarda glikoz: İdrarla günde 50-150mg glikoz atılır. Glikozun nerdeyse tamamı glomerüler filtrata geçer1. 2.3.3.Plazma Böbrek Akımının Ölçülmesi Kalp atım hacmının %20-25’i böbreğe gelir. Böbrek kan akımı yaklaşık dakikada 1,1litredir1. (100—hematokrit) x (böbrek kan akımı) Böbrek plazma akımı = ---------------------------------------------------------100 15 2.3.4. Kan Analizleri Kronik böbrek hastalığında sıklıkla normokromik, normositik anemi görülür. Aneminin nedeni, genellikle mikroskobik hematürinin yol açtığı kronik kan kaybı değildir22. Üremideki anemi; azalmış eritropoetin aktivitesi, kemik iliğinin eritropoetine cevabını azaltan dolaşan faktörler ve dolaşan eritrositlerin ömürlerinin kısalmış olması gibi birçok faktörün kombinasyonu sonucu oluşmaktadır. KBH’ı olanlarda eritrositlerin ömrü 120 günden 80 güne inmiştir. Tanımlanmamış olmasına rağmen muhtemelen üremik toksinler de rol oynamaktadır. Rekombinant EPO’nun bulunmasıyla beraber böbrek hastalığındaki aneminin ana nedeninin EPO üretimindeki azlık olduğu görülmüştür. Çünkü üremik hastalara dışarıdan verilen EPO’ya iyi yanıt alınmaktadır3. Yüksek hematokrit ve hemoglobin düzeylerinin gösterdiği gibi eritrositlerde spesifik bir artış, renal hücreli kansere eşlik eden bir preneoplastik sendromun göstergesi olabilir. Eritrosit sayısındaki belirgin yükselmeler ürolojik semptomların altta yatan nedeni olan lösemiyi gösterebilmesine karşın, genellikle nonspesifik bir bulgudur22. GFR 30 ml/dk altına düştüğünde serum elektrolit ve mineral metabolizmasında birkaç anormallik görülebilir. Genellikle GFR 5ml/dk altına düşmedikçe hiperkalemiye rastlanmaz. Pek çok faktör serum fosfatında artma ve serum kalsiyumunda azalmaya yol açar. Böbrek fosfat klerensinin düşmesi nedeniyle hiperfosfatemi gelişir22. Plazma magnezyum ve fosforu GFR 25ml/dk altına inene kadar artmaz. Ondan sonra bile GFR 5ml/dk’nın altına inene kadar sadece 1-2mg/dl artış gösterir3. Böbrek yetmezliğinde kalsiyumun fraksiyone klerensinin artmış olmasına rağmen, atılım esasen azalmıştır. Üremik hastaların iştahı da azalmıştır, bu nedenle daha az kalsiyum alırlar. Diğer elemental bozuklukların tersine üremik durum ile bozulmuş kalsiyum metabolizması önemli olaylara yol açabilir. İlerlemiş böbrek yetmezliği olanlarda 16 hipokalsemi yaygındır3. Ayrıca vitD2’nin aktif vitD3’e renal dönüşümü azaldığından vitD aktivitesi düşmüştür. Bu bozukluklar sekonder hiperparatiroidizme bağlı hem osteomalasi, hem de osteitis fibroza sistikayla karakterize iskelet anomalilerine yol açar. Böbreklerden atılımın azalması nedeniyle ürik asit düzeyleri sıklıkla yükselmiş olmasına rağmen bu durum nadiren taş ve guta yol açar22. 2.3.5. Görüntüleme Yöntemleri Ultrasonografi, sintigrafi, voiding sistoüretrografi (VSUG), BT, retrograd pyelografi tanı amacıyla kullanılır. Düşük böbrek fonksiyonlu hastalar rutin olarak kontras madde kullanılan incelemelere alınmamalıdır. Böbrek ultrasonografisiyle önemli tanısal bilgiler elde edilebilir. Böbrek büyüklüğünü ve korteks kalınlığını belirleme ve perkütan böbrek biyopsisi için dokunun lokalizasyonu açısından böbrek sonografileri yararlı olur. Kemik filmleri büyüme geriliği, osteomalasi veya osteitis fibrosayı gösterebilir. Yumuşak doku kalsifikasyonları görülebilir22. 2.3.6. Böbrek Biyopsisi KBH’da orijinal böbrek hastalığı ne olursa olsun histolojik incelemede glomerüler skleroz, ekstrasellüler matriks artışı, tübüler atrofi, periglomerüler ve interstisiyel fibrozis gözlenir. Bu durum primer hastalıktan bağımsız olarak ilerleyici böbrek hasarında ortak mekanizmaların rol oynadığını düşündürmektedir1. Böbrek biyopsileri nonspesifik interstisyel fibroz ve glomerülonefrit dışında çok fazla bilgi vermez. Terminal dönemdeki büzülmüş böbreklerin açık veya perkütan biyopsileri özellikle kanama gibi yüksek morbidite oranları taşır22. 17 2.4. Kronik Böbrek Hastalığı (KBH) Kronik böbrek hastalığı, glomerüler filtrasyon değerinde azalmanın sonucu böbreğin sıvı-solüt dengesini ayarlamada ve metabolik–endokrin fonksiyonlarında kronik ve ilerleyici bozulma hali olarak tanımlanabilir1. Kısaca sağlıklı bir fizyolojik denge sağlamak için gerekli uyum mekanizmalarının kalıcı böbrek fonksiyonu bozulmasına bağlı olarak kaybıdır denilebilir2. KBH’dan etkilenmeyen organ veya sistem yok kabul edilir1. Hastaların klinik semptomları ve bulguları böbrek yetmezliğinin derecesi ve gelişme hızı ile yakından ilişkilidir1. Klinik gidiş, tipik olarak sürekli ve belirti vermeyen nefron fonksiyon kaybıdır. Sonuçta son dönem böbrek yetmezliğine yol açar. Hastalığın başlangıcı ile kronik böbrek yetmezliği ve son dönem böbrek yetmezliği arasındaki süre sadece farklı hastalıklarda değil, aynı hastalık sürecinde olan farklı kişiler de bile değişebilmektedir3. BUN ve kreatinin düzeylerindeki yükselme veya kreatinin klerensindeki azalma ile böbrek yetmezliği tanısı koyulabilir29. Sorun, akutkronik böbrek hastalığı ayırıcı tanısıdır1. Böbrek yetersizliği oluşum hızına ve ardından sınıflandırılabilir. azotemi Böbrek süresine göre yetersizliğinin akut süresini veya kronik saptamak olarak güçtür22. Öncel hipertansiyon veya küçük, büzülmüş böbrekler gibi radyolojik bulgular kronik bir süreci gösterir30. Bazı akut böbrek yetersizlikleri de geri dönüşümsüz olarak kronik böbrek yetersizliğine doğru ilerler22. Amiloidoz, diyabetik nefropati, hidronefroz, polikistik böbrek hastalığı, böbreğin infiltratif hastalıklarında ise kronik böbrek yetmezliği olmasına rağmen, böbrekler küçülmemiş olabilir. Böbrekler küçükse, histolojik inceleme amiloidoz dışında yeterli bilgi sağlamaz1. Böbrek hasarı belirteçleri olsun veya olmasın; 3 aydan uzun bir süre GFR<60ml/dk/1.73m2 ise kronik böbrek hastalığından bahsedilir28. 18 2.4.1. KBH Nedenleri 1) Konjenital ve herediter hastalıklar • Polikistik böbrek hastalığı • Alport sendromu • Konjenital hipoplazi/displazi • Amiloidozis 2) Glomeruler hastalıklar • Primer Glomerulonefritler Fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS) • Sekonder Diabetik glomerulosklerozis (çocuklarda nadir) Amiloidozis 3) Piyelonefritler 4) Vasküler hastalıklar • SLE (Sistemik lupus eritematozus) • HSN (Henoch Schönlein nefriti) • PAN (Poliarteritisnodosa) • HÜS (Hemolitik üremik sendrom ) 5) Tubulointerstisiyel hastalıklar • Tubulointerstisiyiel nefrit (idiyopatik, ilaçlara bağlı, immün orijinli) • Reflux nefropatisi • Nefrokalsinozis 6) İdrar yolu obstrüksiyonu • Üriner sistem taşları/ nefrokalsinozis • PUV (Posterior üretral valv) • UV-Darlık (Üreterovezikal darlık) • UP-Darlık (Üreteropelvik darlık) 19 2.4.2. Klinik Bulgular Genel bitkinlik, yorgunluk, unutkanlık, libido kaybı, bulantı ve kaşıntı bu kronik hastalığın sık görülen genel yakınmalarıdır. Sıklıkla güçlü bir ailevi böbrek hastalığı kanıtı vardır. Ergenlik öncesinde primer yakınma, büyüme yetersizliğidir. Birlikte birden fazla sistemi ilgilendiren semptomlar görülebilir. Böbrek yetmezlikli pek çok hastada aşırı volüm yüklenmesine ve aşırı hidrasyona bağlı olarak kan basıncı yükselmiştir. Ancak çok düşük sodyum diyetinde veya başka bir seçenek olarak göze çarpan tuz kaybetme eğiliminde olan hastalarda kan basıncı normal veya düşük olabilir. Anemi ve metabolik asidozun belirtisi olarak nabız ve solunum hızlanmıştır. Sıklıkla üremik faktör, trombosit bozuklukları, ödem, perikardit, nörolojik bulgular, mental bozukluklar, periferik nöropati, konvulsiyon ve puberte problemleri mevcuttur. Oftalmoskopik muayene hipertansif veya diyabetik retinopatiyi gösterebilir22. 2.4.3. Üremik Semptomların Patogenezisi Üremik semptomların patogenezisinde organik bileşikler, hormonal değişiklikler ve inorganik maddeler rol oynamaktadır3. 1) Organik bileşikler: Üremik semptomların patogenezisinden çeşitli toksinler sorumlu tutulmuştur3. Üremide biriken solütler molekül ağırlıklarına göre düşük (<300dalton), orta (300-12000dalton), yüksek (>12000dalton) olmak üzere üç gruba ayrılır. Küçük-orta molekül ağırlıklı solütlerin üremik semptomlardan sorumlu olduğu düşünülmektedir. Böbrek yetmezliğinde bu solütlerin birikmesinin nedeni, bu maddelerin böbrek aracılığıyla ve/veya böbrekte yıkılmasıdır1. • Homosistein: Üremik toksinler arasında homosisteinin eliminasyonu tam olarak bilinmeyen bir mekanizmayla yavaşladığından dolayı, bu hastaların 20 çoğunda homosistein artar30. Azalan böbrek rezervi ile homosistein düzeyleri arasında yakın bir ilişki vardır31. Böbrek yetmezliği gelişen hastalarda homosistein düzeyleri normal kişilere oranla en az 3-4 kere artmakta, normal popülasyonda %5-7 olan hiperhomosisteinemi prevalansı bu hastalarda %85-90’a ulaşmaktadır. Diyalizle tedavi edilen hastaların da %83’ünde hiperhomosisteinemi saptanmıştır. KBH olan çocuklarda hiperhomosisteinemi ile ilgili çalışmalar sınırlıdır. Sağlıklı ve üremik çocuklarda homosistein düzeylerinin yaşla arttığı bilinmektedir. Erişkinlerdekine benzer şekilde üremik çocuk hastalarda da hiperhomosisteinemi geliştiği, bunun SDBH’lığı gelişmeden önce ortaya çıktığı ve renal transplantasyon yapıldıktan sonraki dönemlerde de sebat ettiği saptanmıştır. Ayrıca plazma homsistein düzeyi ile glomerül filtrasyon hızı arasında ters ilişki olduğu da gösterilmiştir. Homosisteinin, kültüre edilmiş endoteliyal hücrelerde reaktif oksijen radikalleri oluşumunu arttırdığı ve peroksitleri detoksifiye edecek antioksidan enzimleri inhibe ettiği gösterilmiştir. Bunun sonucunda üremik hastalarda homosisteinin özellikle okside formlarının birikimi nedeniyle serbest oksijen radikalleri aşırı miktarda üretilmekte, antioksidan savunma mekanizmaları bozulmakta, nitrik oksitin biyoyararlanımı azalmakta ve endotel bağımlı vazodilatasyon negatif yönde etkilenmektedir31. Homosistein, DNA sitozin metilasyonu için metil vericisi bir amino asit olan metioninin metabolizmasının normal bir ürünüdür. Homosistenin DNA metiltransferaz üzerinde inhibe edici etkisi vardır32. Bu yüzden hiperhomosisteinemisi olan diyaliz hastalarının DNA’sının hipometillenmiş olduğu tespit edilmiştir. Hipometillenen DNA, daha kararsız olmaya meyillidir. Bu durum diyaliz hastalarında görülen artan genomik hasar için mekanistik bir açıklama olabilir. Sağlıklı kişilerde plazma homosisteini, periferik kan lenfositlerinde gözlenen genomik hasarın derecesiyle korelasyon gösterir. Homosistein birikimi, folik asit ve vitB12 desteğiyle azaltılabilir33. 21 • İleri glikozilasyon son ürününleri (AGE): Üremik toksinlerden muhtemel bir aday da, böbrek yetmezliği hastalarında yoğun bir şekilde artan ileri glikozilasyon son ürününleridir. Ieker ketonu veya aldehit grubuyla proteinlerin, lipitlerin ve amino asitlerin serbest bir amino grubunun arasındaki enzimatik olmayan bir reaksiyonundan AGE formasyonu ortaya çıkar. Bir dizi dehidrasyon, kondansasyon, fragmantasyon, oksidasyon ve dönüşüm reaksiyonlarından sonra AGE ile ifade edilen birçok tanımlanmamış bileşikler oluşur. AGE’lerin çok azı kimyasal olarak karakterize edilmiş ve dokularda tespit edilmiştir (örneğin karboksimetillizin)7. Böbrek hastalığında AGE birikiminin AGE’lerin eliminasyonunun bozulmasından ve oksidatif stres nedeniyle artan AGE formasyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir34. Glikozilasyon ürünlerinin DNA modifikasyonlarını doğrudan kullanabildiği ve böylece DNA hasarını veya mutajenik etkileri indüklediği düşünülmektedir7. 2) Hormonal değişiklikler: Üremide hormonal değişiklikler 4 mekanizma sonucu olmaktadır3. • Birinci olarak; zarar görmüş böbrek EPO ve 1,25(OH)2D3 (1,25dihidroksikolekalsiferol) gibi hormonların üretimini sağlayamamaktadır3. • İkinci olarak böbrek; büyüme hormonu, prolaktin, luteinizan hormon, gastrin, insülin, glukagon ve paratiroid hormon gibi bazı hormonları normal olarak atmakta ve azaltmaktadır. KBH olan hastalarda bu maddelerin atılımının azalmasına bağlı olarak bu hormon düzeyleri artabilir3. • Üçüncü olarak; hasar görmüş böbrek iskemi nedeniyle renin üretimini artırıp, anjiotensin aldesteron üretimi artmaktadır3. 22 • Dördüncü olarak son mekanizma; trade-off hipoteziyle açıklanır. Nefronların ilerleyici yıkımı sonucu geri kalan nefronların vücut hemeostazını sağlayabilmek için sodyum dengesinin korunmasındaki adaptasyon mekanizmasını açıklamak için tradeoff hipotezi kullanılmaktadır. Bu hipoteze göre; GFR 2ml/dk altına düştüğünde filtre edilen sodyumun yaklaşık %30’u vücut sodyum dengesini korumak için atılmalıdır. Sodyum reabsorbsiyonunu engelleyen muhtemel natriüretik bir hormon olduğu kabul 3 edilmektedir . 3) İnorganik maddeler: Üremik semptomların ortaya çıkışında inorganik maddelerin rolü ilgi çekmektedir. Üremik hastalarda beyin ve periferik sinirlerde kalsiyum düzeyleri artmış olarak bulunmuştur. Fosfor, bir diğer inorganik toksindir. Fosfor retansiyonu üremik hastalarda hiperparatiroidizm ve metastatik kalsifikasyonun patogenezisinde rol oynamaktadır. Üremik hastalarda alüminyum toksikasyonu nörolojik ve iskelet toksisitesinden sorumlu tutulmaktadır. Çinko eksikliği üremik hastalarda impotans ve iştahsızlığa neden olmasına rağmen çinko tedavisi çelişkili sonuçlar vermektedir3. 2.4.4. Kronik Böbrek Hastalığında Evrelendirme 2002 yılında ABD’de Ulusal Böbrek Vakfı (National Kidney Foundation) kronik böbrek hastalığı ile ilgili bir kılavuz hazırlamıştır. Bu kılavuzda DOQI (Dialysis Outcome Quality Index) sınıflamasına göre kronik böbrek hastalığı tanımlanmış ve evrelere ayrılmıştır. Tablo 2‘de evrelendirme sistemi gösterilmiştir27. Tablo 3 ve 4’de ABD’de ve Türkiye’de KBH nedenleri ve hasta dağılımları gösterilmiştir. 23 27 Tablo 2: Kronik böbrek hastalığının evrelendirmesi GFR* ml/dk/1,73m2 Evre Tanımlama 1 Böbrek hasarı var ama GFR normal veya artmış, ≥90 çoğunlukla asemptomatik 2 Hafif böbrek hasarı var, GFR hafif azalmış 60-89 3 Orta derecede azalmış GFR 30-59 4 Iiddetli derecede azalmış GFR 15-29 5 Böbrek yetmezliği * <15 * Bazı yazarlara göre GFR 15ml/dk’nın altında ise son dönem böbrek yetmezliği daha uygundur. 2.5. Son Dönem Böbrek Hastalığı (SDBH) SDBH deyimi, hayatı tehdit eden üremiyi engellemek için renal replasman tedavisi alan hastalar için kullanılmaktadır. KBH olan hastalarda böbrek fonksiyonlarındaki azalma başlangıçta asemptomatiktir. KBH’nın erken evrelerinde kalan nefronların böbrek fonksiyonlarını korumaları söz konusudur. GFR, normal veya hiperfiltrasyon nedeniyle artmış bile olabilir3. Yüksek proteinli yemek ve stres sonrası GFR’nin ölçümü, normal böbrek rezervinin yokluğunu gösterebilir. Böbrek rezervinin bitmesi GFR’nin normalin %25’ine düşmesi ile olur. Hastada genelde semptomlar yoktur, azotemi ve serum kreatininde artış vardır. GFR normal değerin %25’inin altına inince artan sayıda ve ciddiyette üremik klinik bulgular ve biyokimyasal bozukluklar ortaya çıkar. Anormal kreatinin düzeyine sahip olan kişilerin hangi oranda SDBH’na ilerleyeceği açık değildir3. Serum kreatinin konsantrasyonu, GFR’nin her %50 düşüşünde 2 kat artmaktadır. Fonksiyonlar daha düşer ve GFR %25 olursa serum kreatinin tekrar ikiye katlanır. Serum kreatinindeki değişiklikler, böbrekte hasar olduğu zaman renal fonksiyonların beklenen 24 yetmezliği saptanmakta daha hassas bir duruma gelmektedir3. Bu hasar düzeyi GFR’nin 25ml/dk nın altında semptomlar ortaya çıkmaya başlar1. glomerüler filtrasyonda azalma olmasıdır3. Hastada üremik Serum kreatininde doğrusal artış, ile orantılıdır. Altta yatan böbrek hastalığından bağımsız olarak son dönem böbrek yetmezliğine ilerleyiş serum kreatinin 1,5 – 2,0mg/dl yi aştığı zaman görülmektedir3. GFR 15 ml/dk’ya inince SDBH’dan bahsedilir ve hastalar diyaliz, renal transplantasyon gibi renal replasman tedavilerine ihtiyaç duyarlar1. Tek başına GFR’nin normal sınırlar altına inmesi teşhis için yeterli değildir. GFR’ndeki azalmanın spesifik olumsuz etkilerinin de ortaya çıkması gerekmektedir2. İlk bozulan fonksiyonlardan biri idrarı konsantre etme yeteneğinin azalmasıdır. SDBH’na kadar su, sodyum ve potasyum dengesi normal koşullarda korunur, ancak alt ve üst sınır limitleri azalmıştır. GFR 30-35ml/dk’nın altına inince hematokritte düşme başlar. Hastaların çoğunda normokrom normositer anemi gözlenir. Temel neden eritropoetin sentezindeki yetersizliktir1. Tablo 3: ABD’de KBH nedenleri ve hasta dağılımı (1999-2003) 1 HASTA SAYISI % Diyabetik nefropati 215733 44,8 Hipertansiyon / büyük damar hastalığı 130704 27,1 Glomerülonefrit 41097 8,5 İnterstisyel nefrit / piyelonefrit 17582 3,6 Kistik / herediter / konjenital hastalıklar 15206 3,2 Sekonder glomerülonefrit / vaskülit 10412 2,2 Kanser 10094 2,1 Diğer nedenler 21301 4,4 Nedeni bilinmeyen 19646 4,1 484998 100 TOPLAM 25 Tablo 4: Türkiye’de hemodiyaliz tedavisine yeni başlayan hastalarda KBH 1 nedenleri % Diyabetes mellitus 27,2 Hipertansiyon 25,0 Kronik glomerülonefrit 7,5 Ürolojik hastalıklar 6,0 Polikistik böbrek hastalıkları 4,3 Piyelonefrit 3,6 Renal vasküler hastalık 1,8 Diğer nedenler 4,8 Belirsiz 17,7 Bilgi yok 2,1 2.5.1. Son Dönem Böbrek Hastalığı Gelişimi İçin Risk Faktörleri SDBH gelişimi için 4 ana risk faktörü tanımlanmıştır3: 1) Irk ve etnik köken: Böbrek yetmezliği insidansı, AfrikaAmerikalılar ile beyazlar cinsiyet uyumlu olarak karşılaştırıldığında AfrikaAmerikalı nüfusta milyonda 500, beyazlarda ise milyonda 140 olup, AfrikaAmerikalı nüfusta 3 kat daha fazladır3. 2) Yaş: SDBH insidansı; 20-44 yaşları arasında milyonda 95, 65-74 yaşlarında milyonda 760 olarak bulunmuştur. Diyabet ve hipertansiyon dışarıda bırakıldığında yaklaşık tüm SDBH nedenlerinin %13’ü büyük oranda yaş bağımlıdır. 40 yaşından önce fokal segmental glomeruloskleroz (FSGS), lupus eritamatozus, Henöch Schönlein purpurası, AIDS bağımlı nefropati ve kalıtsal hastalıklar en sık olarak gözlenmektedir. 40-55 yaş grubunda otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı (PBH), memranöz glomerülonefrit, membranoproliferatif 26 glomerülonefrit ve hemolitik üremik sendrom artan oranda görülmektedir. Goodpasture sendromu, interstisyel nefrit, analjezik nefropatisi, amilodoz, multiple myelom ve Wegener granülomatozis 55 yaş üzerindeki grupta en sık olarak görülmektedir3. 3) Cinsiyet: Cinsiyet, bazı böbrek hastalıklarının gelişimi ve ilerleyişi açısından ek bir risk faktörüdür. Genel olarak SDBH insidansı erkeklerde kadınlardan daha sıktır (%56,3’e karşı %43,7). Fakat TipII diyabet, interstisyel nefrit, lupus eritamatozus, skleroderma ve hemolitik üremik sendrom nedeniyle oluşmuş SDBH kadınlarda daha sık 3 görülmektedir . 4) Aile öyküsü: Genetik faktörler SDBH gelişimi için önemlidir3. Ailesinde hipertansiyon öyküsü bulunan diyabetik hastalar ve lityum-sodyum transport anomalisi bulunan hastalar böbrek yetmezliği gelişimi açısından daha büyük riske sahiptir. Ayrıca kalıtsal Alport sendromu, otozomal dominant PBH, Fabry hastalığı gibi pek çok hastalık mevcuttur. SDBH‘de ilerleyişteki bireysel farklılık edinsel veya kalıtsal renal hastalıklara sahip hastaların karakteristik özelliğidir. KBH’nın ilerlemesinde birçok genetik faktör tanımlanmıştır. En çok üzerinde çalışma yapılmış olan ise anjiotensin çevirici enzim (ACE) geninde insersiyon veya delesyon polimorfizmidir. Birçok hastalıkta bu lokusun renal fonksiyonların bozulmasında önemli yeri olduğunu açığa çıkarmıştır3. 27 2.5.2. Yaygınlık ve Sıklık Sıklık ve yaygınlık açısından kesin bilgi SDBH hastaları için söz konusudur. SDBH’nın sıklığı, yani diyaliz veya yaşamı destekleyen böbrek nakline ihtiyaç gösteren hasta sayısı, renal replasman programının elverişliliği ve kapasitesine göre değişir. Japonya, Amerika Birleşik Devletleri, Avusturya ve Almanya gibi ülkelerde hastaya tedavi uygulamak için belirli bir sınırlama yoktur ve sıklık diğer ülkelerden daha fazladır. Bu istatistiklerden önemli bir sonuç çıkarılmalıdır. Renal replasman tedavisinin başarılı olduğu öyle ispatlanmıştır ki, şimdi birçok gelişmiş ülkede bir hak olarak kabul edilmektedir2. SDBH insidansı nüfusun yaş, ırk ve cinsiyet özelliklerine göre coğrafik farklılıklar göstermektedir. 1999’da ABD’de SDBH insidansı milyonda 317 idi. 2000 yılında ABD’de 90000 üzerinde hastada SDBH gelişmiş olup, yıllık yapılan transplantasyon sayısı 13000’dir. Bu da demek oluyor ki, hastaların büyük çoğunluğu diyalizle tedavi edilmektedir. Artışlar bu şekilde devam ederse 2010 yılında insidans 170000, prevalans ise %77 artarak 660000’e ulaşacaktır3. Ülkemizde KBH sıklığı ve nedenlerini araştıran en sağlıklı veriler Türk Nefroloji Derneğinin çalışmalarından elde edilmektedir24. 2007 yılında Türkiye’de renal replasman tedavisi gerektiren son dönem kronik böbrek yetmezliği nokta prevalansı milyon nüfus başına 709 olarak saptanırken, 2006 yılında ise nokta prevalansı milyon nüfus başına 578 ve insidans ise milyon nüfus başına 189 olarak saptanmıştır (Iekil 4; 5). Önceki yıla göre prevalansta artma dikkati çekmiştir35. 28 35 ekil 4: USRDS 2008 verilerine göre 2006 SDBH prevalansı 29 35 ekil 5: USRDS 2008 verilerine göre 2006 SDBH insidansı Ülkemizde böbrek hastalığı sıklığı konusunda sağlıklı veri elde etmek amacıyla Türkiye’de Kronik Böbrek Hastalığı Prevalansı Araştırması (Chronic Renal Disease In Turkey-CREDIT) çalışması başlatılmıştır1. 30 2.6. Çocuklarda KBH Yeni yüzyılın son çeyreğinde, kronik böbrek hastalığına ilgi arttırmıştır. Çocuklar için 1970’li yıllarda insidans Kuzey Amerika’da 1 çocuk/mtn ve Avrupa’da ise 3-5çocuk/mtn olarak bildirilmiştir. Bu farklılık 1 yaş altındaki çocukların analize alınıp alınmaması ve SDBH olan çocukların hangi kronolojik yaşta erişkin grubuna dahil edilmesi gerektiğindeki çelişkili görüşlerden kaynaklanmaktadır. Daha sonra yayınlanan KBH ile ilgili prospektif ve retrospektif çalışmalarda insidans sırasıyla 1-5 ile 4-5çocuk/mtn oranında değişmektedir2. Yeni doğan yoğun bakım ünitelerinde bebeklerde böbrek yetmezliği, nadir rastlanan bir durum değildir. Bu çocuklar ya ölürler, ya da düzelirler ve önemli bir kısmında SDBH gelişmediği ve dolayısıyla insidans çalışmalarını etkilemediği düşünülür2. 19 yaştan daha genç olan çocuklar pediatrik hasta olarak ifade edilir. 19-20 yaşındaki adolesanlar da, bazı organizasyonlarda ve veri tabanlarında pediatrik yaş grubuna dahil edilmiştir15. Avrupa Diyaliz ve Transplantasyon Birliği’nin (EDTA) raporunda 1984’de Avrupa’da ülkeler arasında, renal replasman tedavisi gören çocuk sayısının değişkenlik gösterdiği bildirilmiştir. ABD’de de Avrupa ülkelerine benzer şekilde eyaletler arasında farklılık gözlenmiştir2. ABD’de Renal Data Sisteminin (USRDS) kurulmasıyla bu ülkede 0-19 yaş arası SDBH insidansını güvenilir şekilde belirlemek mümkün olmuştur. USRDS’in 2009 yıllık raporunda 0-19 yaş arası çocuklarda 2005-2007 yılları için insidans 15.1 hasta/milyon çocuk/yıl olarak bildirilmiştir. (0-4 yaş için 10,8; 5-9 yaş için 6,0; 10-14 yaş için 14,6; 15-19 yaş için 28,3 hasta/milyon çocuk/yıl)36. 31 Türkiye’de çocukluk yaş grubunda KBH için 2007 Türk Nefroloji Derneği verilerine göre35: • 2007 yıl sonu itibariyle toplam pediyatrik hemodiyaliz (HD) hasta sayısı 1042, pediyatrik periton diyaliz (PD) hasta sayısı 1063 ve transplantasyon uygulanmış (Tx) pediyatrik hasta sayısı 326 ‘dır. • Tüm HD hastalarının %1.1’i 0-19 yaş grubudur. • 2007 yılında PD’e alınan hastaların %2.9’u 0-19 yaş grubudur. • 2007 yılında böbrek nakli yapılan hastaların %7.9’u 0-19 yaş grubudur. • 2007 yılında kronik HD tedavisine yeni başlayan pediyatrik hasta sayısı 55’dir. • 2007 yılı içinde kronik PD tedavisine yeni başlayan pediyatrik hasta sayısı 83’tür. • 2007 yılında transplantasyon uygulanmış pediyatrik hasta sayısı 42’dir. 2.6.1. Çocuklarda KBH’nın Etiyolojisi Yapılan epidemiyolojik çalışmalar; KBH’nın bir buz dağı, SDBH’nın da bu buz dağının görünen kısmı olduğunu göstermiştir. Günümüzde dünya genelinde kronik böbrek hastası sayısı, özellikle adolesanlarda kayda değer bir şekilde artış göstermekte ve büyük bir halk sağlığı problemi olarak tanımlanmaktadır37. Çocukta geriye dönüşü olmayan böbrek fonksiyon bozukluğu oluşturan patolojik olayların kesin nedenini araştırmak birçok açıdan gereklidir. Çocuklarda KBH ile sonlanan birçok hastalık kalıtsaldır. Spesifik etiyolojinin belirlenmesi, diğer aile bireylerinde gizli kalmış hastalıkların da ortaya çıkmasını sağlayabilir2. 32 Yapılan çalışmalar çocuklarda KBH’na yol açan primer böbrek hastalıklarının etiyolojilerinin erişkin hastalarda bildirilenlerden farklı olduğunu göstermektedir2 (Tablo: 3; 5; 6). Erişkinlerde ilk sırada yer alan diyabetik nefropati ve hipertansif nefrosklerozis, çocuklukta SDBH’nın nadir sebeplerinden biri olarak karşımıza çıkar15. Aksine, renal displaziyle ilişkili obstrüktif üropati, çocuklukta SDBH’nın en yaygın sebeplerinden birisidir15. Amiloidozis Batı Avrupa ve Kuzey Avrupa ülkeleriyle kıyasla Türkiye’de daha sıklıkla görülmektedir38 (Iekil: 6). Çocuklukta SDBH’nın sebebi çocuğun yaşına göre değişir. Ek olarak cinsiyet ve ırksal grup da böbrek yetmezliğinin sebebini etkiler. Sağ kalım oranları yaş ve tedavi şekli ile farklılık gösterir. Diyaliz tedavisi gören 0-4 yaş grubu çocukların SDBH tanısı koyulduktan 5 yıl sonrasında sağ kalımı %69 iken, diğer yaş gruplarındaki çocukların sağ kalımı ise %82’dir. Böbrek nakli yapılan çocuklar daha uzun süreli sağ kalıma sahiptir ve transplantasyon, çocuklarda renal replasman tedavisinin tercih edilen bir tedavi şeklidir. Her ne kadar diyalizde olan çocuklarda mortalite oranları, genel pediyatrik popülasyondan daha yüksekse de, diyalizdeki yetişkin hastalardan dikkat çekici bir şekilde daha düşüktür15. Tablo 5: Primer böbrek hastalıklarının yaş dağılımı 2 YA TANI 0-1 2–5 6-12 13-17 (n=127) (n=344) (n=763) (n=795) % % % % Aplastik hipoplastik displastik böbrek 28 22 18 12 Obstrüktif üropati 20 23 17 13 Fokal segmental glomeruloskleroz 0 8 15 12 52 47 50 63 Diğer 33 2 Tablo 6: Çocuklarda 1991 yılında ABD’de SDBH insidansı Primer Hastalık Grupları Toplam % İnsidans Yaş ort. (yıl) SDBH olan hasta sayısı 3431 100.0 15 Glomerulonefritler 1087 37.7 16 Kistik böbrek hastalıkları 723 25.1 16 Konjenital diğer kalıtsal hast. 560 19.4 11 Kollajen vasküler hastalıklar 283 9.8 16 Obstüktif nefropati 170 5.9 13 İnterstisyel nefrit 121 4.2 12 Hipertansiyon 105 3.6 17 Diyabet 45 1.5 19 Metabolik hastalıklar 32 1.1 10 Orak hücreli anemi 13 0.4 18 Habis hastalıklar 11 0.3 3 1 <0.1 13 16 0.5 7 Bilinmeyen 303 10.5 15 Yeterli bilgi verilmeyen 551 - 14 AİDS’e bağlı Diğer VUR ve tekrarlayan İYE 25 Prim er glom erülonefritler 20 Nörojenik/nonnörojenik m esane Doğumsal ürolojik anom aliler 15 Renal hipoplazi/displazi Yüzde 10 Taş hastalığı Sekonder glom erülonefritler 5 Am iloidoz 0 Etyoloji Bilinen diğer nedenler Bilinm eyen ekil 6 : Türkiye’de 2007 yılında ilk defa RRT’ne başlanan pediyatrik hastalarda 35 etyoloji 34 2.7. Kronik Böbrek Hastalığında Tedavi Hafif derecede böbrek yetmezliği olan hastalara koruyucu yaklaşım, son dönem böbrek yetmezliğine ilerlemeyi geciktirecek ve komplikasyonları azaltacaktır. Geç başvuru, diyalize başlanan ilk yılda daha yüksek ölüm oranına eşdeğerdir. Bütün kronik böbrek yetmezliği olgularının kesin sıklığını belirlemek güç olduğu gibi, bu tanımlamaya göre de değişir. Bununla beraber kronik böbrek hastalığı olan birçok hastaya, son dönem böbrek yetmezliği ve üremik acil olarak karşımıza çıkana dek tanı konmamış olur. Kronik böbrek hastalığı, hastaların hayatını her yönüyle etkiler. Böbreğin süzme ve hormonal fonksiyonlarındaki kaybın sebebi, gelişimi ve sonuçlarına yönelik tedavi ömür boyu sürdürülmelidir. Hastanın alışageldiği yaşam tarzını sürdürmesi imkansız hale gelene kadar tedavi konservatif olmalıdır. Konservatif tedavi diyette protein (0,5g/kg/gün), potasyum ve fosfor kısıtlaması, hastalarda diyetteki sodyum dengesinin dikkatle idamesinden ibarettir. Bu yaklaşım hastanın vücut ağırlığının sık sık ve doğru olarak ölçümüyle gerçekleştirilebilir. Orta derecede asidemide bikarbonat kullanımı yararlı olabilir. Anemi rekombinant eritropoetinle tedavi edilebilir. Olası üremik osteodistrofiden korunma kalsiyum ve fosfor dengesini dikkatle izlemeyi gerektirir. Dengeyi sağlamak için fosfat tutucu antasitler, kalsiyum ve vitD gerekebilir22. Hasta sonunda tüm böbrek fonksiyonlarını yitirdiğinde yaşamı uzatmaya yönelik renal replasman tadavisine (RRT) başlanır. Amaç; hastaya mümkün olan en uzun ve elverişli hayatı sunmak olmalıdır2. Diğer hastalıkların aksine SDBH tedavi masrafları, hastaların yaşam süreleri uzadıkça artar. Artan yaşla SDBH oranında ki artış da bunun üzerine eklenir2. 35 2.7.1. Renal Replasman Tedavisi Kronik böbrek hastalarının kalan yaşamı boyunca, tedavide yapılan birçok değişiklikle beraber hastalığı zamanla hızlanarak ilerler2. Bu hastalarının yaşam süresi, her birinin kendine özgü komplikasyon ve yetersizlikleri olan renal replasman tedavisi denilen, değişik tedavi tipleri ile uzatılmasına rağmen, hiçbir tedavi şekli tam tatminkar değildir. Aynı zamanda ileri derecede bir planlamaya da ihtiyaç gösterir. Erken başlayan tedavinin hastanın uzun dönem yaşam süresini anlamlı oranda arttırdığına dair kanıtlar bulunmaktadır3. Böbrek fonksiyonlarını yerine koyma tedavisi olarak bilinen RRT, ilk kez 1960 yılında diyaliz uygulamalarıyla ortaya çıkmış bir kavramdır39. Ekip, donanım ve deneyim eksikliği nedeniyle RRT çocuklara ancak 1970’li yıllarda uygulanmaya başlanmıştır40. Türkiye’de ilk pediatrik prosedürleri 1975’de Mehmet Haberal ve ekibi gerçekleştirmiştir41. 1980’in ilk yıllarına kadar çocukluk yaşlarında kullanılan tedavi yöntemlerinin başında hemodiyaliz geliyordu. 1985 yılından sonra ise çocuklarda periton diyalizi uygulanmaya başlandı. Günümüzde ise çocuk RRT’de hedeflenen tedavi yöntemi böbrek naklidir39. 1970’li yıllarda RRT uygulanabilmesi için hastaların 10 yaşından ve 10kg’dan büyük olması istenirdi. Günümüzde ise RRT’ne hasta seçiminde yaş ve ağırlık gibi hiçbir engelleyici kriterin bulunmadığı kabul edilmektedir. EDTA kayıtlarına göre, 6 aydan ve 5 kg’dan küçük çocukların da tedaviye alındığı bildirilmektedir. RRT’den yararlanan hasta sayısı çocuklarda yaşla artış göstermektedir. 0-5 yaş grubundaki hastaların %32’si, 5-10 yaş grubundaki hastaların %72’si, 10-16 yaş grubundaki hastaların ise %87’si RRT’den yararlanmaktadır39. 36 Hastalara kronik diyaliz veya böbrek transplantasyonu veya her ikisi gerekebilir. Diyaliz ve transplantasyon dünya çapında hızla genişlemektedir. A.B.D.’de 233000’den fazla sayıda hasta halen diyalizle tedavi edilmektedir ve halen nakil yapılan 94000 hastanın böbrekleri çalışmaktadır22. Diyaliz hastalarında yıllık mortalite oranı %20’nin üzerindedir. Böbrek nakli sonuçları ise immün baskılayıcı tedavilerin geliştirilmesi ile gelişmektedir. Ortalama bir yıllık greft sağ kalımı, canlı donörden ise %90, kadavra donörden ise %85’dir. SDBH tedavi programına alınan hastaların ancak %20’sinde böbrek transplantasyonu yapılabilmektedir3. 2006 yılı sonu itibariyle Türkiye’de mevcut SDBH hastalarında RRT tipleri ve yüzdeleri35 : Hemodiyaliz (HD) hastaları % 80.5 Periton diyaliz (PD) hastaları % 9.7 Transplant % 9.8 (Tx) hastaları 2.7.1.1. Diyaliz Diyaliz, yarı geçirgen bir membran aracılığı ile hastanın kanı ve uygun diyaliz solüsyonu arasında sıvı-solüt değişimini temel alan bir tedavi şeklidir. Sıvı ve solüt hareketi, genellikle hastanın kanından diyalizata doğrudur. Bu diyalizatın uzaklaştırılması ile hastada mevcut olan sıvı-solüt dengesizliği normal değere yaklaştırılır. Deneysel olarak ilk hemodiyaliz uygulaması, 1913 yılında nefrektomize köpekler üzerinde yapılmıştır. İnsanda ilk hemodiyaliz uygulaması ise, 1944 yılında Hollandalı bir hekim olan Kolff tarafından yapılmıştır. İlk periton diyalizi ise, 1923 yılında Ganter tarafından gerçekleştirilmiştir1. 37 Sıvı ve solüt değişiminin difüzyon ve ultrafiltrasyon olmak üzere iki temel prensibi vardır. Difüzyon, membranın iki yanındaki konsantrasyon farkı nedeni ile, solütün konsantrasyonu yüksek olan taraftan düşük olan tarafa hareketidir. Ultrafiltrasyon ise, uygulanan basınç nedeni ile membranın bir yanından diğer yanına sıvı transferidir. Sıvı transferine solüt transferi de eşlik eder1. Diyaliz, normal iki böbreğin klerens kapasitesinin %5’inden fazlasını temizleme yeteneğine sahip değildir, ama üreminin akciğer ödemi ve hiperkalemi gibi yaşamı tehdit eden etkilerini kontrol eder. Diyalize başlama zamanı genelde GFR’nin 5ml olduğu zamandır. Fakat bazı hastalar bu semptomlara düzeyin sahip üzerindeki olabilirler. renal Sıvı fonksiyonlarda dengesini da üremik sağlamada güçlük, hipertansiyon veya entelektüel performansta kötüye gidiş renal fonksiyon ne olursa olsun diyalize başlama endikasyonudur. Klinik olarak izlenen perikardit, pulmoner ödem, 2 geciktirildiğini düşündürür . periferal Diyaliz nöropati tedavisinde ise diyalizin hedef, çok hastanın yaşamasının sağlanması ve yaşam kalitesinin arttırılması olmalıdır1. Diyaliz iki membran aracılığıyla uygulanabilir1: a. Sentetik bir membran aracılığıyla hemodiyaliz b. Periton aracılığıyla periton diyalizi a) Hemodiyaliz Hemodiyaliz, hastadan alınan kanın bir membran aracılığı ve bir makine yardımı ile sıvı ve solüt içeriğinin yeniden düzenlenmesidir2. Suda eriyebilen, plazma proteinlerine bağlı olmayan düşük molekül ağırlıklı maddeler hemodiyaliz ile vücuttan uzaklaştırılırlar1. Genellikle haftada 3 kez 3-5 saat uygulanır22. Günümüzde en etkili hemodiyaliz 38 uygulamaları bile, iyi işlev gören, normal iki böbreğin başardığı küçük molekül ağırlıklı solüt atılımının sadece %10-12’sini sağlayabilir42. 2007 yılı sonu itibariyle ülkemizde düzenli HD programında olan hastaların HD seans sayı ve yüzdeleri35: Haftada bir kez HD % 0.9 Haftada iki kez HD % 7.8 Haftada üç kez HD % 89.9 Haftada üç kezden fazla HD %1.4 Günümüzde daha yaygın olarak uygulanan uzun süreli diyaliz yöntemi, hemodiyaliz tedavisidir. Türk Nefroloji Derneği 2007 yılı verilerine göre ülkemizde yaklaşık 40309 (1042’si çocuk) hemodiyaliz ve 6370 (1063’ü çocuk) düzenli periton diyaliz hastası mevcuttur35. Iekil 7’de Türkiye’de mevcut pediyatrik HD ve PD hastalarında yaş dağılımı verilmiştir. 45,0 40,0 35,0 30,0 25,0 Yüzde HD 20,0 PD 15,0 10,0 5,0 0,0 0-2 >2-6 >6-10 >10-15 >15-18 >18 Yaş ekil 7: Türkiye’de mevcut pediyatrik HD ve PD hastalarında yaş dağılımı (TND 35 2007) 39 TND 2007 verilerine göre Türkiye’de mevcut HD hastalarında yaş ve cinsiyet dağılımı, HD ve PD hastalarında diyalizde yaşam süreleri Iekil 8 ve 9’da gösterilmiştir. 25 20 15 Yüzde Erkek Kız 10 5 0 0-19 20-44 45-64 65-74 75+ Yaş ekil 8: Türkiye’de mevcut HD hastalarında yaş ve cinsiyet dağılımı (TND 2007) 90 80 70 60 50 Yüzde 40 30 20 10 0 35 HD PD 0-5 6-10 11-15 16-20 >20 Yıl ekil 9: Türkiye’de mevcut HD ve PD hastalarında diyalizde yaşam süresi (TND 2007) 35 40 Hemodiyaliz hastalarındaki en sık rastlanan ölüm nedeni kardiyovasküler hastalıklardır (%52.8). Bunu serebrovasküler hastalık, malignite ve infeksiyonlar izlemektedir (Iekil 10) (TND 2007)35. 60 50 Kardiovasküler SVO 40 Malignite İnfeksiyon Yüzde 30 GİS kanaması 20 Karaciğer yetmezliği Akciğer embolisi 10 Diyalizi red 0 Diğer Ölüm nedeni ekil 10: HD hastalarında ölüm nedenleri (TND 2007) 300 35 Norveç 2002 İsveç 2002 250 ABD 2000 Avusturya 2002 Danimarka 2002 200 İngiltere 2002 Ölüm oranı (1000 kişide) Finlandiya 2002 150 Yunanistan 2002 Almanya 2000 100 İtalya 2002 İspanya 2002 Avustralya 2002 50 Fransa 2000 Kanada 2001 0 Türkiye 2002 Ülkeler Japonya 2003 ekil 11: Dünyada HD hastalarında ham ölüm oranları (TND 2007) 35 41 b) Periton diyaliz Peritonun kan akımının 70-110ml/dk olması ve kan basıncı düşünce kan akımının korunması, peritonun diyaliz için uygun bir membran olmasını sağlar1. Hemodiyalizle karşılaştırıldığında kreatinin ve üre gibi küçük moleküllerin, B12 gibi büyük moleküllere göre daha az etkinlikle temizlenebilmesine karşın mükemmel bir tedavi sağlanabilir. Aralıklı haftada 3 kez (IPPD), sürekli yardımlı periton diyaliz (CCPD) veya kronik ayaktan periton diyaliz (CAPD) olasıdır. Teknolojik gelişmeler sayesinde, daha az sıklıkta bakteriyel kontaminasyon ve peritonit görülmektedir42. 2.7.1.2. Diyalizde Oluşabilecek Komplikasyonlar Her iki tip sürekli diyalizde ortak sorunlar; enfeksiyon, ilerleyici kardiyovasküler hastalık, kemiklere ilişkin semptomlar, teknik kazalar, inatçı anemi ve psikolojik bozukluklardır. Uzun süreli tedavide sıklıkla ateroskleroza ilişkin morbidite oluşur. Kronik üremi hastalarında diyalize rağmen tükenme sendromu, kardiyomiyopati, polinöropati ve diyalize sekonder amiloidoz gelişebildiğinden acilen böbrek nakli gerekebilir. Diyaliz hastalarında bazen edinsel kistik böbrek hastalığı oluşabilir. Bu hastaların in situ renal hücreli karsinom gelişimi açısından yakından izlemi gereklidir22. Hastada başka sistemik sorunlar (ör; diyabet) yoksa idame diyaliz tedavisi başlananlarda yıllık mortalite oranları %8-10 düzeyindedir22. 42 2.7.1.3. Hemodiyaliz ve Glutatyon S-transferaz Polimorfizmi Oksidatif DNA hasarları içinde hücresel DNA’yı en çok etkileyen 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) hasarıdır. HD hastalarının lökositlerinde 8-OHdG seviyesinin çok yüksek olduğu, bunu PreD ve sağlıklı bireylerin izlediği tespit edilmiştir. 8-OHdG seviyesi, selüloz membran kullanılan diyaliz hastalarında sentetik membran veya vitE bağlı membranlar kullanılan hastalarınkinden daha yüksektir. Bu nedenlerden dolayı lökositlerde 8-OHdG seviyesi, HD hastalarında oksidanların indüklediği DNA hasarının bir göstergesi olarak kabul edilebilir43. Çeşitli organizmalarda çok sayıda mekanizma, 8-OHdG birikimini azaltmaya çalışır. 8-OHdG lezyonları öncelikle baz eksizyon tamir yolağı sürecindeki DNA tamirine bağlılıdır. OGG1 geni tarafından kodlanan okzoguanin-DNA glikozilaz 1 (OGG1), 8-OHdG lezyonları üzerinde etki gösteren bir DNA tamir enzimidir. HD hastalarında DNA tamirinin etkinliğini değiştiren genetik faktörlerin, hOGG1 gen polimorfizmi ile (özellikle nükleotid 1245’de C3G değişimiyle) ilişkili olduğu gösterilmiştir43. Glutatyon, majör hücre içi bir antioksidandır ve hasarlı hücresel durumlarda glutatyonun kan seviyelerinde bir azalma olur. Çok sayıda genotoksik epoksidin metabolizmasına katılan, özellikle DNA’nın oksidatif hasardan korunmasında rol oynayan glutatyon S-transferaz M1, çok sayıda kimyasal karsinojenin detoksifikasyonunda gerekli bir protein olan GST ailesinin bir üyesidir. Okside DNA lezyonları için, baz eksizyon tamir yolağına ek olarak, ROS’nin indüklediği hasara karşı hücresel DNA’yı korumak için GST yolağıyla toksinlerin eliminasyonu önem taşımaktadır. Okside lipitler GST substratlarıdır ve ateroskleroz ve tümör oluşumunda rol oynadığı düşünülmektedir43. Farklı etnik gruplardaki 43 insanların yaklaşık yarısı polimorfiktir ve GST enzim aktivitesi eksiktir. Eksiklik GST M1 geninin 15 kb’lık bir alelinin homozigot delesyonu nedeniyledir. GST M1 null aleli [GST M1(-)] epidemiyolojik çalışmalarda, akciğer ve mesane kanseriyle ilişkisinin ve sigara kullananlarda kalp hastalığı artışıyla ilişkisinin bir sonucu olarak daha fazla dikkat çekmektedir. HD hastalarında diyaliz esnasında askorbat kaybı ve üremiyle ilişkili metabolik bozukluklar nedeniyle plazma askorbat seviyesinde kısmen bir azalma görülür. HD hastalarında, plazma askorbat seviyesinde ve kanda glutatyon seviyesinde azalmaya bağlı olarak, GST enzim aktivitesindeki kaybın oksidatif stresin artmasına katkıda bulunduğu gösterilmiştir43. Lin YS ve ark.nın çalışmasında HD hastalarında lökositlerdeki 8-OHdG seviyesi ile GST M1(-) gen polimorfizminin ilişkisi gösterilmiştir. HD hastalarında ve kontrol grubunda GST M1(-) genotipinin ve hOGG1 genotiplerinin (CC, CG, GG) dağılımında istatistiksel olarak anlamlı farklılık olmadığı tespit edilmiştir (p>0,05). Ayrıca, HD hastalarında kullanılan membran tipine ve böbrek yetmezliğinin sebebine göre GST M1 ve hOGG1 polimorfizmlerinin dağılımında da bir farklılık tespit edilmemiştir (p>0,05). Lökositlerdeki 8-OHdG seviyesi; kontrol grubunun GST M1(-) ve GST M1(+) genotipleri arasında anlamlı farklılık göstermezken (p>0,05), GST M1(-), 1245GG ve CG genotipleri olan HD hastalarında, GST M1(+) ve 1245CC genotipleri olan HD hastalarından anlamlı olarak daha yüksek olarak bulunmuştur (p<0,001). En yüksek 8-OHdG seviyesi ise hem GST M1(-), hem de1245GG olan HD hastalarında tespit edilmiştir43 (p<0,001). HD hastalarında genel popülasyona göre iskemik kalp hastalığı ve kanserden ölüm oranları daha yüksektir. HD hastalarında lökosit 8-OHdG seviyesindeki her 10/106 dG’lik artışın tüm mortalite nedenlerinde %88’lik bir artışa neden olacağı tahmin edilmektedir. GST M1 polimorfizmi ve belirli kanser türleri arasındaki ilişkiyi gösteren deliller 44 vardır ve GST M1(-) aleli riskteki artışı gösterir. GST M1(-) olan HD hastaları oksidatif stres açısından daha savunmasızdır ve lökositlerinde 8OHdG seviyesi daha yüksektir. Akciğer kanseri olan hastalarda da GST M1(-) genotipi, sağ kalımdaki azalmayla ilişkilendirilmektedir. GST M1(-) genotipi HD hastalarında diyalizle ilişkili ölüm riskinde güçlü bir etkiye sahiptir. GST M1(-) aleli homozigot olan HD hastaları, GST M1 aktivitesi olan hastalara göre 2 kat daha fazla ölüm riskine sahiptirler43. Biyouyumlu membranların yerine diyalizde selüloz membranların kullanımıyla ROS’nin üretiminin arttığı bilinmektedir. Azalan GST aktivitesi ile birlikte ROS’lerinin artışı, lökositlerde daha yoğun oksidatif DNA hasarına neden olabilir. Lin YS ve ark.nın çalışmasında bu artışın selüloz membranlı diyalize giren GST M1(-) hastalarında en fazla olduğu tespit edilmiştir43. 2.7.1.4. Transplantasyon Organ nakli dünyasındaki değişim, baş döndürücü bir hızla gelişmektedir. Kadavra organ sunumu sabit kalırken, gereksinim önlenemez şekilde artmaktadır. Kadavra organı için bekleme süresi aylardan yıllara uzamakta ve böbrek bulununcaya kadar geçen sıkıntılı bekleme süresi içinde diyaliz hastalarının çoğunun genel durumları bozulmaktadır42. Türkiye’de ilk başarılı böbrek nakli 1975 yılında 44 gerçekleştirildi . Ülkemizde 2007 yılında yapılan 1316 (%7,9’u 0-19 yaş arası) böbrek nakli sayısı geçen yıllara göre artmış olmakla birlikte, olması gerekenin çok altındadır. Iekil 12’de ülkemizde böbrek nakilleri sayısının yıllara göre dağılımı, Iekil 13’da ise USRDS 2008 verilerine göre dünyada 2006 transplantasyon oranları verilmiştir. Ülkemizde 2007 yılı sonuna 45 kadar çocuklarda toplam 326 böbrek nakli gerçekleştirilmiş olup, bu nakillerin 78’i 2007’de yapılmıştır. Bu hastaların %81’i 10 yaş üzerindedir ve %84’ünde böbrek fonksiyonları iyi seyretmektedir 35. Böbrek nakli, SDBH olan hastalara sağlıklı ve üretken bir yaşam fırsatı vermektedir. Ama tüm böbrek alıcıları, en azından bir dereceye kadar SDBH’nın zararlı etkilerine maruz kalmışlardır. SDBH’nın olası uzun süreli etkilerinin, başarılı organ naklinden yıllar sonra bile klinik izlemde gözlenebileceği bilinmelidir42. Organ naklinde immün baskılayıcı ajanların uygulanması ile, daha da karmaşık bir durum ortaya çıkmıştır. Yeni, etkin ve kuvvetli ajanlar uzun dönem yararları ve en uygun kullanım şekilleri kesinleşmeden, kısa dönem uygulama sonuçları temel alınarak kullanıma sunulmuştur. Değişik protokol seçenekleri ile karşı karşıya kalan organ nakli uygulayıcıları, tedaviyi hastaya özgünleştirmede zorlanabilmektedir. Diğer taraftan kardiyovasküler hastalıklar, kanser ve enfeksiyon uzun dönem sağ kalımı sürekli tehdit etmektedir42. Türk Nefroloji Derneği’nin 2007 yılı böbrek nakli sonrası mortalite analizinde; enfeksiyonlar, kardiyovasküler hastalıklar, serebrovasküler hastalıklar, pulmoner emboli ve malignitenin en önemli ölüm nedenleri arasında olduğu saptanmıştır35. 46 1400 1200 1000 800 Sayı Tx hastaları 600 400 200 0 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007 ekil 12: Ülkemizde böbrek nakli yapılan hastalarının yıllara göre dağılımı (TND 2007) 35 Nakledilen böbrek, anaerobik metabolizma sonucu ortaya çıkan yüksek yoğunluktaki serbest oksijen radikalleri ve yeniden dokuya giren oksijenle birlikte oluşan iskemi-reperfüzyon hasarına maruz kalmaktadır. Ortaya çıkan süperoksid anyonu ve hidrojen peroksid hücre zarının lipid peroksidasyonuna yol açmaktadır. Nitrik oksid sentez enzimleri tarafından üretilen nitrik oksid, hasar ve immün aktivite arasında bağlantı sağlayabilir. Sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin aktivasyonu, düşük düzeyde yangı oluşumunu kolaylaştırarak, akut ve kronik immün hasarı kolaylaştırabilir. Olaylar zincirinin sırası böylece hasar, yangı, immün yanıt, daha fazla hasar şeklinde olmaktadır42. 47 35 ekil 13: USRDS 2008 verilerine göre 2006 transplantasyon oranları 48 2.7.2. İmmün Baskılayıcı İlaçlar Bağışıklık sistemi yabancı doku antijenlerini kolayca tanıyabilir ancak, tümör dokusunu organizmadan kolayca atamaz. İnsanda bir saniyede bir milyara yakın hücre çoğalması olmakta ve somatik olarak bunların birkaçı, günde yüzlercesi mutasyonla farklı hücreler oluşturmaktadır. Bu farklı hücrelerin temizlenmesinde hücresel immün cevap mekanizması rol oynamaktadır. Buna, immün sistemin kansere karşı “immün denetimi” denilmektedir. İmmün sistem, kanser oluşumunu denetlemekte, aynı zamanda kanser hücresi ve antijenlerine karşı immün cevap oluşturmaktadır45. Hücresel immün cevap baskılandığı zaman, kanser oluşumu artmaktadır46. Bu nedenle immün sistemi baskılayıcı ilaç kullananlarda malignite riski artmaktadır45. İmmün baskılayıcı ilaçlar tarafından tetiklenen çok sayıda yan etkiden birisi olan kanser, morbidite ve mortalitenin en büyük nedenlerinden birisidir47. Kullanılan ilaçların mutajenik özelliklerinin olup olmadığı ve bunun kanser riskinin artışına katkıda bulunup bulunmadığı en önemli sorudur21. İmmün baskılamanın malignansi gelişimine yol açabileceği konusunda ilk kanıt, kanserden muzdarip vericilere ait böbreğin nakledildiği alıcılarda yapılan gözlemlerden elde edildi. Kanserden muzdarip vericilerin, makroskobik olarak normal allogreftlerinin transplant alıcılarına kanseri naklettiği tespit edildi48. İmmün baskılama için kullanılan ilaçların tipi, uygulama süresi ve dozunun kanserin tipi ve insidansını etkilediği bilinmektedir. Ama immün baskılayıcı ajanlar ve kanser arasındaki nedensel ilişkiyi immün baskılama tamamen açıklayamamaktadır49. Malign tümörler, organ naklini takiben immün baskılayıcı kullanan hastalarda, nakil yapılmayan hastalardakinden daha sık meydana gelir. Risk 2-10 kattır ve bazı vakalarda bu 100 kata bile ulaşabilir. Bu durum, transplant hastalarının %4-18’inde tümör gelişmesi beklenebilir demektir50. İmmün baskılayıcı ilaçlar, greft rejeksiyonunun 49 tedavisinde ve profilaksisinde ömür boyu kullanılmaktadır1. Erken dönemde rejeksiyon riski daha yüksek olduğundan ilaç dozları başlangıçta daha yüksek tutulur1. İmmün baskılayıcı ilaçlar Tablo 7‘de gösterilmiştir. 52 Tablo 7: Böbrek naklinde kullanılan immün baskılayıcı ilaçlar 1) Kalsinörin inhibitörleri Cyclosporin A Tacrolimus Azathioprine 2) Antiproliferatif ajanlar Mycophenolate mofetil Sirolimus 3) Kortikosteroidler Prednizolon Metilprednizolon OKT3 Basiliksimab 4) Antikor preparatları Daklizumab Rituksimab Alemtuzumab Antitimosit globulin Hastanın ve vericinin özelliklerine göre ikili, üçlü veya dörtlü tedavi protokolleri uygulanır. Sıklıkla kullanılan iki protokol vardır1: 1. Tacrolimus (veya Cyclosporin A) + Mikofenolat Mofetil + Steroid 2. Tacrolimus (veya Cyclosporin A) + Sirolimus + Steroid 1) Kalsinörin inhibitörleri • Cyclosporin A (CsA): Cyclosporin, doku ve klinik organ nakli ile ilgili pek çok deneysel modelde etkisi kanıtlanmış, güçlü bir immün baskılayıcı ajandır. 50 Cyclosporinin molekül ağırlığı 1200 kD olup, 11 aminoasit içerir. Sitokrom P-450 sisteminin izoenzimleri tarafından metabolize edilirler52. Cyclosporin aslında prodrug’dur ve tek başına immün baskılayıcı değildir2. Siklofilin bağlayıcı proteinle oluşturduğu kompleksle, kalsinörine bağlanıp fosfataz aktivitesi göstermesini engeller1. Başlıca etkisi yardımcı T-lenfositleri üzerinedir. Yardımcı T-lenfositlerinin lenfokin üretimini önler. Özellikle IL2’nin (T-hücresi büyüme faktörü) üretimini baskılar. Bu şekilde, sitotoksik T-hücresi oluşumu önlenir53. Buna karşılık, hem nonspesifik hem de spesifik baskılayıcı T-hücrelerinin oluşumu inhibe edilmemektedir. Baskılayıcı T-hücreleri, cyclosporine göreceli olarak dirençlidir. Genel olarak cyclosporinin B-lenfositi işlevlerini fazla etkilemediği düşünülürse de aksi yönde deliller de bulunmaktadır2. Yan etkileri: nefrotoksisite, hepatotoksisite, jinjival hiperplazi, hipertansiyon, hirsutismus, tremor, nörotoksisite, fungal ve viral enfeksiyonlara yatkınlık ve artmış kanser riski sayılabilir1. Cyclosporin dar bir terapötik indekse sahiptir ve farmakokinetik karakteristikleri bireyler arasında değişkenlik gösterir54. Çocuklarda cyclosporinin emilimi daha az, metabolizması ise erişkinlerden daha hızlıdır (CsA’nın yarı ömrü; çocuklarda 9,3 saat, yetişkinlerde 16-27 saat). Bu nedenle infantlarda adolesanlardan %50-80 daha yüksek doz gereklidir. Doz artışı yaş ilerledikçe azaltılır. Bu durum ilaç metabolizma oranlarının daha yüksek olmasıyla, özellikle sitokrom enzimleriyle açıklanabilir. Klerensdeki farklılıkların diğer potansiyel kaynağı p- glikoprotein ve P190’dır. CYP3A ve p-glikoproteinin kombine çalışması azalan absorbsiyonu açıklayabilir55. Az sayıda çalışmada tedavi rejimine cycosporinin katılmasından sonra kanser riskinde artış olmadığı bildirilirken, çok sayıda çalışmada ise, cyclosporinin malignansi riskinde artış ile ilişkili olduğu gösterilmiştir56. 1987’de Penn, cyclosporinin kullanımıyla Kaposi sarkomu ve non-Hodgkin lenfomanın arttığını bildirmesine rağmen, 1990’da Vagt ve arkadaşları 518 böbrek nakli yapılan hastanın 18’inde (%3) heterojen maligniteler saptamışlardır2. Cincinnati Transplant Tumor Registry’ye göre CsA ile tedavi edilen 51 transplant hastalarında en yaygın malignansilerin sırasıyla lenfoma, deri maligniteleri, Kaposi sarkoma ve renal malignansiler olduğu bildirilmiştir57. Ayrıca cyclosporin ile tedavi edilen hastalardaki malignansi tipi ve gelişme sıklığı, azathioprine ile tedavi edilenlerden farklı bulunmamıştır2. CsA tedavisi gören organ alıcılarının lenfositlerinde kromozomal aberasyon indüksiyonunda ve SCE frekansında artış bildirilmiştir21. • Tacrolimus (FK506): Tacrolimus, bağlayıcı proteinle oluşturduğu kompleks ile kalsinörine bağlanıp fosfataz aktivitesi göstermesini engeller. Toprak mantarından elde edilen bir makrolid antibiyotiktir. Hasta ve greft yaşam süresi cyclosporine benzerdir. Yan etkileri: nefrotoksisite, hemolitik üremik sendrom, “hipertansiyon, hiperlipidemi ve kozmetik etkileri cyclosporinden daha az”, “diyabet ve nörotoksisite cyclosporinden daha fazla” şeklinde sayılabilir1. Tacrolimusun, pretransplant dönemde Epstein Barr Virus (EBV) seronegative olan hastalarda post transplant lenfoproliferatif hastalık (PTLD) geliştirme riskinin yüksek olduğunun unutulmaması önerilmektedir. Bu yüksek olarak değerlendirilen riskin, tacrolimus kullanımına başlanıldığı yıllarda yüksek doz verilmesinin sonuçlarının günümüze yansıması olabileceği de düşünülmektedir58. Tablo 8 ve Tablo 9’da cyclosporin ve tacrolimusun karşılaştırmalı özellikleri görülmektedir. 52 Tablo 8: Cyclosporin ve tacrolimusun karşılaştırması 58 Cyclosporin Tacrolimus İlaç etkileşimleri Benzer Benzer Rejeksiyonu önleme yetisi + ++ Mevcut rejeksiyonu tedavi etme yetisi + ++ MMF ile birlikte kullanım + + Sirolimus ile birlikte kullanım + +(!) Nefrotoksisite + + Steroide daha az gereksinim + ++? Hipertansiyon ve sodyum retansiyonu ++ + Pankreas adacık toksisitesi + ++ Nörotoksisite + ++ Kozmetik yan etki ++ + GİS yan etki – + Gastrik motilite – + Hiperpotasemi + + Hipomagnezemi + + Hiperkolesterolemi + – (+) bilinen etki, (++) daha belirgin etki, (–) etkisiz veya az etkili, (+?) olası büyük etki, (!) eşleşme resmen kabul edilmemiş 58 Tablo 9: Cyclosporine ve tacrolimusun özellikleri Elde edilişi Ticari adı Dağılımı Metabolitleri Substratı olduğu enzim Atılım Hayvan, bakteri çalışmaları Genotoksisite Karsinojenesite Teratojenisite Fertilite Hamilelikte kategori İnsan sütüne geçiş İnsanda Malignansi riski En yaygın görülen maligniteler Cyclosporine Tacrolimus Mantar kaynaklı Streptomyces siklik polipepdit tsukabaensis kaynaklı makrolid antibiyotik Sandimmune, Neoral Prograf Plazmada Plazmada lipoproteinlere lipoproteinlere bağlanır bağlanır 15 adet 8 adet CYP3A, P-gp CYP3A, P-gp Safra %92,6 feçes, %2,3 idrar Yeterli delil yok Negatif Var Var Yeterli delil yok Embrio/fötotoksik Negatif Negatif C C Var Var Artış var Artış var Non-Hodgkin Non-Hodgkin Lenfoma ve deri Lenfoma ve deri kanserleri kanserleri, PTLD 53 2) Antiproliferatif ajanlar58: • Azathioprine (Aza): Pürin antimetabolitidir. Karaciğerde 6-merkaptopürine dönüşerek immün baskılayıcı etkisini gösterir. Hücre içine geçen 6merkaptopürin, inozitol ile yarışarak pürin nükleotidleri olan adenozin ve guanin sentezini engeller. Böylece DNA ve RNA sentezini inhibe ederek antiproliferatif etkiye ve lenfositlerde immün yanıtsızlığa neden olur2. Genel miyelosit baskılayıcısıdır. Bu sebeple primer immün yanıtın kuvvetli bir inhibitörüdür ve akut rejeksiyon başlamasının önlenmesinde 51 önemlidir . Rejeksiyon ataklarının tedavisinde etkili değildir51. Çocuklar tarafından iyi tolere edilir. Yan etkileri: trombositopeni, lökopeni, hepatit ve kolestaz, enfeksiyon, malignite (lenfoma, PTLD, hepatosplenik T-hücreli lenfoma)58. Azatiyoprinin direkt veya indirekt onkojenik etkisi tartışmalıdır47. • Mycophenolate mofetil (MMF): İnosin monofosfat dehidrogenaz enziminin geri dönüşlü inhibitörüdür. DNA sentezi üzerinden T ve B lenfositlerinin proliferasyonunu baskılar. B lenfositlerinden antikor oluşumunu, lenfosit ve monositlerde glikoproteinlerin glikolizasyonunu baskılar51. Çocuklarda yan etkiler daha çoktur ve tacrolimus ile kombine kullanılıyorsa doz %50 azaltılmalıdır. Abdominal kramplar, diyare, lökopeni gibi yan etkileri doza bağlıdır. Diğer yan etkiler: enfeksiyon, kemik iliği toksisitesi, lenfoma, PTLD ve deri kanserleridir58. Bazı çalışmalar MMF’in mutajenik etkiye sahip olduğunu ve malignansi yayılımını arttırabildiğini gösterirken, bazı çalışmalarda ise MMF’in malignansi riskinde herhangi bir artış ile ilişkili olmadığı gösterildi56. 54 • Sirolimus: Toprak mantarından elde edilen bir makrolid antibiyotiktir. Hücre bölünmesinde düzenleyici bir rol oynayan “target of rapamycin"’i (TOR) (sitokin reseptörleri ile hücre siklusu arasında iletişimi kuran protein) inhibe ederek etki ederler1. TOR inhibisyonu hücre bölünme siklusunun G1-S fazındaki sitokin bağımlı hücresel çoğalmayı inhibe eder. Etkisini hem kan, hem de diğer hücrelerde gösterir. Önceleri cyclosporine ile birlikte kullanılmış, ancak sonradan yapılan çalışmalar takrolimus ile kullanıldığında da etkin ve güvenilir olduğunu göstermiştir. Yan etkileri: hiperlipidemi, trombositopeni, lökopeni, anemi, yara iyileşmesinde gecikme, akut tübüler nekrozun iyileşmesinde gecikme, proteinüri, ağız ülserleri, deri lezyonları ve pnömonitis sayılabilir1. Sirolimus kullanan hastalar, kalsinörin inhibitörleri kullananlar ile kıyaslanırsa nakil sonrası malignansi insidansında bir azalma bildirilmiştir56. Azathioprine, mycophenolate mofetil ve sirolimus’un özellikleri karşılaştırmalı olarak Tablo 10’da gösterilmiştir. 55 Tablo 10:Azathioprine(Aza), mycophenolate mofetil(MMF), sirolimus’un özellikleri Aza Pürin antimetaboliti MMF 2-morpholinoethyl ester İmuran Plazma proteinlerine bağlanır 6-MeMP, 6-TU, 6-MeMPN,6TGN Thiopurine Smethyltransfera se ve Xanthine oxidase İdrar CellCept Plazma proteinlerine bağlanır Mikofenolik asit Eldesi Ticari adı Dağılımı Metabolitleri Substratı olduğu enzim Atılım Genotoksisite Karsinojenesite Hayvan, bakteri çalışmaları Teratojenisite Fertilite Hamilelikte kategori İnsan sütüne geçiş Malignansi riski İnsanda En yaygın görülen malignansiler ↑↑↑: Artış var ???: Bilinmiyor Var Var Var Sirolimus Streptomyces hygroscopicus kaynaklı makrolid antibiyotik Rapamune Plazma proteinlerine bağlanır 7 adet Glucuronyl transferase CYP3A, P-gp %87 idrarla, %6 feçesle Kesin delil yok Kesin delil yok Var %91 feçes, %2,2 idrar Negatif Var Embrio/fötotoksik etki Dişilerde etki yok, erkekte sperm sayısı azalıyor C ??? ↑↑↑ Lenfoma ve deri kanserleri Sperm sayısı ve Etkisi yok canlılığında azalma D Var ↑↑↑ Lenfoma ve deri kanserleri 58 C ??? ↑↑↑ Lenfoma, PTLD 3) Kortikosteroidler: • Prednisolone ve prednisone: Prednisone kareciğerde aktif bileşiği olan prednisolona metabolize edilir. Her ikisinin de glukokortikoid etkileri vardır. T lenfositlerinin sitokin salgılamasını ve hücresel immünolojik reaksiyonun başlamasını önlerler. B lenfositlerinin antikor oluşturmasını inhibe ederler. Makrofaj, monosit, PMNL’leri inhibe ederler (Böylece TNFα ,IL-1 yapımını 56 azaltır, IL-6 transkripsiyonunu inhibe eder)58. Aktif hale gelmiş lenfosit gruplarının lizisinde de görev alabilirler51. Yan etkileri: enfeksiyon sıklığı ve şiddetinde artış, iştah artışı, su ve tuz retansiyonuna bağlı kilo artışı, hipertansiyon, osteoproz artışı, kompresyon kırıkları, femur başında aseptik nekroz, miyopati, gastrointestinal hassasiyet, katarakt, çocuklarda büyüme gecikmesi sayılabilir1. 4) Antikor preparatları: • Polyclonal antibodies: Bunlar “Antitimosit Globulin (ATG)”, “Antilenfosit Serum (ALS)”, “Antilenfosit globulin (ALG)“ dir51. Atgam atların, timoglobulin ise tavşanların insan lenfoid materyali ile immünizasyonu sonucunda üretilen antitimosit globulinledendir. Etki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. T-hücre yanıtlarını bloke ederler. Uygulanmasından sonra periferal kan lenfositleri azalmaktadır. Yan etkileri: üşüme, titreme, ateş, eklem ağrıları, trombositopeni, lökopeni, enfeksiyon, nadiren anaflaksi58. • Monoclonal antibodies: Bunlar “OKT3”, “Humanize ANTİ-TAC (HAT)” dır. OKT3 bir immünglobulin G’dir. Tümüyle sıçanlardan elde edildiği için tür aşırı yaban etkiye sahiptir. T-hücre reseptörünün bir parçası olan CD3 molekülüne bağlanarak CD3’ü bloke eder. T-hücrelerini etkisiz hale getirir ve bir saat içinde retiküloendoteliyal sistem tarafından dolaşımdan temizlenir. OKT3, rejeksiyon yanıtının oluşmasında önemli rolü olan doğal öldürücü T-hücrelerinin işlevini de kilitlemektedir. Yan etkileri; üşüme, titreme, ateş, akciğer ödemi, nefrotoksisite, nörolojik 57 komplikasyonlar, enfeksiyon, hematolojik komplikasyonlar ve nadiren lenfoma58. OKT3 kullanımının, özellikle virüslerle tetiklenen transplantasyon sonrası, malignansi riskini arttırdığı gösterilmiştir. Ayrıca OKT3, PTLD gelişimi için iyi bilinen bir risk faktörüdür56. Basiliximab, Daclizumab’ın içinde olduğu HAT, IL-2 reseptörünün alfa zincirini hedef almaktadır ve akut rejeksiyon ataklarını tedavi etmek için değil, önlemek için tasarlanmışlardır. Monoklonal sıçan antikoru olarak üretilmekte ve daha sonra genetik mühendisliği yöntemleri ile insan IgG molekülüyle değiştirilmektedir. Önemli yan etkileri yoktur58. 5) Testleri süren immün baskılayıcılar: • FTY720 • FK778 • LEA29Y • Alemtuzumab 2.7.3. İmmün Baskılayıcı İlaçlar ve Polimorfizm Bireyler arasındaki değişikliklerden dolayı immün baskılayıcı ilaçların kullanımı zor olabilir. Düşük doz, rejeksiyonla sonuçlanırken, yüksek dozlar ise malignansi, enfeksiyon ve bir çok organda toksik reaksiyonlarla ilişkilendirilir. Başlangıç dozunun belirlenmesi de ilaçların farmakokinetiğindeki heterojenite açısından zordur. Doz ve kan konsantrasyonu arasında zayıf bir ilişki vardır. İlaçların terapötik indeksi dardır54. Ayrıca genetik polimorfizmden dolayı ilaç seçim ve doz miktarı değişmektedir. Her hasta için doğru ilaç ve doğru doz seçimi önem kazanmaktadır. Bu nedenle kullanılan ilaçları metabolize eden genlerin polimorfizm sonuçları da incelenmelidir. Bunlar: 58 • CYP3A4, CYP3A5 polimorfizmi: CYP3A5*3 polimorfizmi, sirolimus ve tacrolimus’un 59 farmakokinetiği ile ilişkilendirilmektedir . Cyclosporine ile arasındaki ilişki ise daha şüphelidir54. CYP3A5*3 ve CYP3A4*1B homozigot bireylerde tacrolimus atılımı fazla olduğu için daha yüksek tacrolimus dozu önerilmektedir. En az bir fonksiyonel CYP3A5 aleli olması istenir, aksi halde doz azaltılması önerilir. Uygun tacrolimus dozunun ayarlanması için CYP3A5 genotipinin kullanılması ümit vermektedir. CYP3A5’i eksprese edemeyenlerde ve CYP3A4*1B aleli taşıyanlarda daha düşük sirolimus dozu önerilmektedir. CYP3AP1 psödogeni polimorfizminde CYP3AP1*1 aleli taşıyanlarda tacrolimus kan konsantrasyonu daha düşük olduğu için CYP3AP1*3 aleli taşıyanlardan daha önce akut rejeksiyon görülür59. • MDR1 gen polimorfizmi: “Multidrug resistance gen1” (MDR1 geni), P-glikoproteini kodlayan gendir. MDR1’i güçlü eksprese edilen homozigot bireylerde, tacrolimus dozu %40 daha yükseltilmesi önerilmektedir. MDR1 gen polimorfizmi ile cyclosporine ve sirolimus arasında bir ilişki bulunamamıştır60. • TPMT polimorfizmi: Yüksek “tiyopurin metiltransferaz” (TPMT) aktivitesi, azathioprine etkisini azaltır ve yüksek hepatotoksisite riski oluşturur. TPMT*2, TPMT*3A ve TPMT*3C non-fonksiyonel alellerdir. Heterozigot alellerde orta seviyede aktivite, homozigot alellerde ise miyelotoksisite riskinde artışla sonuçlanan düşük aktivite veya aktivite yokluğu görülür. Beyaz ırk ve Afrika-Amerikalıların %10’unda non-fonksiyonel heterozigot alel, %0,3’ünde non-fonksiyonel homozigot alel görülürken, Asyalılarda ise 59 non-fonksiyonel alel çok daha nadirdir61. Türk popülasyonunda TPMT*3A ve TPMT*3C alel frekansı birlikte %0,9’dur. Türkiye’de TPMT*3C alel frekansı Caucasianlar’a benzerken TPMT*3A frekansı ise 62 Caucasianlar’dan daha düşüktür . • UGT1 polimorfizmi: “UDP enzimatik aktiviteyi glukoroniltransferaz”ın azaltırken, UGT1A9*3 UGT1A8 ve polimorfizmi UGT1A9 genleri glukronidasyon aktivitesini arttırdığı biliniyor60. 2.7.4. İmmün Baskılayıcı İlaçlar ve Genotoksik Etkileri KBH’da kullanılan immün baskılayıcı ilaçların genotoksik potansiyeliyle ilgili olarak daha çok in vitro çalışmalar yapılmıştır. İn vivo çalışma sayısı ise az ve çelişkilidir. Örneğin CsA’nin bazı çalışmalarda genotoksik olmadığı gösterilirken bazı çalışmalarda ise tedavi dozunda genotoksik etkileri olduğu gösterilmiştir63. Bu çalışmalarda genotoksik etkiler için kardeş kromatid değişimi (SCE) ve MÇ Yöntemleri kullanılmıştır. IARC, CsA’ni insanlar için Grup1 karsinojen olarak kabul etmiştir64. Bu konuda yapılan bazı çalışmalar tablo11‘de özetlenmiştir. 60 Tablo 11: İmmün baskılayıcı ilaçlar ve genotoksik etkileri N:30 Maruziyetin kaynağı CsA SCE ↑↑(SCE sıklığı)Tx öncesi/Tx sonrası 3.ay (8,8±1,5/10,7±1,8) N:14 Tx N:20 kontrol CsA+MMF+ Pred. Lenfositlerde MÇ ↑↑(MÇ) Hasta /kontrol (10,5-25)/(2-11,5) N:20 CsA N:17 Tacrolimus N:37 kontrol N:68 Tx CsA+Tacroli mus SCE ↑↑(SCE sıklığı) CsA kullananlar/kontrol ↔(SCE sıklığı) Tacrolimus kullananlar/kontrol CsA+MMF+ Pred Lenfositlerde MÇ Çalışma grubu ↑↑ (p< 0.05); ↔ (p> 0.05) Sonuç Yöntem Yorum p Referans Tedavi dozunda genotoksik potansiyel gösterildi. İmmünbaskılayıcı ilaçlar DNA hasarı oluşturuyor. p< 0.005 63 (1999) p< 0.01 21 (2004) CsA ile genotoksik etki artarken, tacrolimus ile etki değişmiyor. ↑↑(MÇ)9yıldan fazla RRT/3 yıldan az RRT(13,4±4,1/10,7±1,9) İmmünbaskılayıcı ilaçlar DNA hasarı oluşturuyor. ↑↑(MÇ)Tx öncesi/Tx 3 hafta sonrası (12,3±3,4/16,1±4,8) ↔ Yaş ve cinsiyet İle MÇ p< 0.001 p> 0.05 65 (2008) p< 0.05 p< 0.001 p> 0.05 66 (2009) SCE: Kardeş kromatid değişimi 61 2.8. Renal Replasman Tedavisi Alan Hastalarda Kanser Kanserin, normalde immün sistem tarafından elimine edilen hatalı hücrelerden kaynaklandığı fikri, ilk kez 1959’da Thomas tarafından otaya atıldı. Hayvanlardaki deneylerin pozitif sonuçları bu fikri desteklemiştir. Ancak insanlar üzerindeki bilgiler, immün baskılayıcı ajanların nakil ve diğer amaçlar için kullanımlarına kadar, yetersiz kalmıştır. İmmün baskılayıcı ilaç kullanan transplant alıcılarının kansere duyarlı olduğunun ilk belirtisi, kanserden ölen vericilerin tamamen normal olan böbreklerinin nakli ile ortaya çıktı. Bu tip organların malign hücreleri tuttuğu ve çoğalmaları sonucunda “de novo” olarak ortaya çıkan kanserlerin, alıcının ölümüne neden olduğu anlaşıldı (Martin ve ark 1965, McPhaul ve ark. 1965). Daha sonra çoğu transplantasyon için bekleyen diyaliz hastalarının da kanser gelişimi için yüksek risk taşıdığı öne sürüldü2 (Matas ve ark. 1975). SDBH olan hastalarda kanser frekansının genel popülasyondan daha yüksek olduğu bilinmektedir. Fakat bu artışın belli kanserlere mi yoksa SDBH hastalarının belli kategorilerine mi özgü olduğu kesinlik kazanmamıştır9. Transplantasyondan sonra gelişen malignansiler hızlı ilerleme, kötü prognoz ve tedaviye zayıf cevapla karakterizedir50. 1963-2002 yılları arasında Avustralya ve Yeni Zelanda’da SDBH olan 1634 çocuk ve adolesanın incelenen kayıtlarına göre; böbrek nakli yapılan çocuklar arasındaki ölümlerin %14’ünü, hemodiyalizdeki çocuklar arasındaki ölümlerin %1’ini ve periton diyalizdeki çocuklar arasındaki ölümlerin %2’sini malign hastalıkların oluşturduğu tespit edilmiştir. Malign hastalıktan ölümlerin genellikle geç dönemde gerçekleştiği gözlenmiştir. Malign hastalıklardan ölümler; RRT’nin ilk 4 yılında ölümlerin %1’ini, RRT’nin başlangıcından 5-9 yıl sonra %2’sini, 1014 yıl sonra %13’ünü, 15 yıl ve daha sonrasında ise %17’sini oluşturmaktadır. Ölüm riski açısından; diyaliz tedavisinin, böbrek nakline göre 4 kere daha riskli olduğu bildirilmiştir. SDBH olan çocukların yaş 62 açısından uzun dönemde sağ kalımları kıyaslandığında; RRT başlandığında yaşı daha büyük olan çocukların çok küçük yaştaki çocuklara göre uzun dönemde sağ kalım için daha fazla şanslı olduğu görüldü (Tablo: 12)14. Tablo 12: Avustralya ve Yeni Zelanda’da SDBH olan çocuklarda uyumlama 14 yapılmamış uzun dönem sağ kalım yüzdeleri (RRT’nin başlama yaşına göre) RRT BALAMA YAI SAĞ KALIM (%) 5 yıl 10 yıl 15 yıl 20 yıl <1 73 67 67 - 1-4 79 78 74 74 5-9 87 79 73 72 10-14 88 79 70 68 15-19 86 79 72 65 0-19 86 78 71 66 2.8.1. Üremi ve Kanser SDBH’larında artan insidansta kanser gözlenmiştir. Özellikle de böbrek, prostat, karaciğer, uterus karsinomaları ve lenfoma görülmüştür. Böbrek hastalığıyla doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili olan faktörler ve tedavi rejimleri bu hastalarda artan malignite formasyonuna katkıda bulunabilir. İmmün sistemin ve DNA tamir mekanizmasının bozulması, antioksidan savunmanın azalması, böbrek eliminasyonunda azalma nedeniyle karsinojenik bileşiklerin birikimi ve kronik enfeksiyonlar genel popülasyona kıyasla SDBH’da daha sık gözlenmektedir. Bu durum malign dönüşümü ve formasyonu hızlandırabilir67. Üremik hastalarda malignansiler için en yaygın faktörler; tümör gözetiminin engellenmesi ve onkojenik virüslerin aktivasyonuyla sonuçlanan hücresel immünitenin baskılanması ve granülosit disfonksiyonu ile karakterize olan üremik immün baskılamadır68. Karsinojenik ve/veya mutajenik potansiyel için 63 hassas bir indikatör olan kardeş kromatid değişim hızının üremik hastalarda daha yüksek bulunması, üremi ile kanser ilişkisini gündeme getirmiştir. Üremi ile malignite arasındaki olası ilişkinin ilk sistematik çalışması 1975 yılında Matas tarafından yapılmış ve bu çalışmada, üremik hastalarda malignite görülme olasılığının aynı yaş ve cinsiyetteki normal kişilerden 7 kat daha fazla olduğu belirtilmiştir1. Üremisi olan ve diyaliz tedavisi gören hastalarda immün baskılama önemli bir komplikasyondur. Üremik birikim, vitB6 eksikliği, diyaliz ekipmanlarının biyolojik uyuşmazlığı da immün baskılamaya katkıda bulunabilir. Diyaliz işlemi de, malignansiye katkıda bulunabilir. Diyalizattaki su kaynaklı toksinler ve diyaliz borularından gelen silikon partiküller malignansi riskini arttırabilir. Karsinojenlerin birikimi, serumda serbest oksijen radikallerinin artışı ve süperoksid dismutaz eksikliğinin malignansi hastaların gelişimini sitümüle serumunun kistik ettiği düşünülmektedir. hastalığı, adenoma ve SDBH olan karsinomaları tetikleyen artan miktarda büyüme faktörü içerdiği hipotezi de mevcuttur68. Böbrek fonksiyonlarını etkileyen kanserlerin diyalize giren hastalarda, genel popülasyonda beklenenden daha sık olması sürpriz değildir. Bazı hastalarda, multiple myelom gibi kanserler direkt olarak böbrek yetmezliğinin sebebi iken, diğerlerinde böbrek yetersizliğinin sebebi, renal ve uteral malignitelerin tedavisi sırasında tüm fonksiyonel dokuların çıkarılmasıdır. Bazı hastalar ise, analjezik nefropatisi gibi hem yüksek kanser riski içeren hem de böbrek yetersizliği yapan tablolarla karşı karşıyadırlar69. Uzun süre diyalize giren hastalarda oluşabilen böbrek kistleri de yüksek malignite riski taşırlar2, 69. Tedavi süresine bağlı olarak hemodiyalizdeki yada periton diyalizdeki hastaların %90’ında ve diyaliz öncesindeki hastaların %8’inde 64 görülen akiz kistik böbrek hastalığı sıklıkla renal hücre karsinomalarıyla ilişkilendirilir67. Akiz kistik böbrek hastalığı prevalansının diyaliz hastalarına kıyasla transplant alıcılarında daha düşük olduğu bilinmektedir ve diyaliz hastalarında premalign bir durum olarak görülmektedir57. Proksimal hücrelerin proliferasyonu, üremik ortam ve renal iskemi kist formasyonuna ve malign dönüşüme katkıda bulunabilir67. Bununla beraber, diyalize giren hastaların renal sistem dışındaki kanserlere daha duyarlı olup olmadığı konusunda tartışma vardır2. Matas, Miach, Sutherlan, Herr ve Lider gibi birçok otorite kronik böbrek yetersizliğinde malignite riskinin arttığı konusunda birleşmişlerdir. Slifkin ve Kinlen gibi araştırmacılar ise böyle bir artışın olmadığını, sadece non-Hodgkin lenfoma riskinin arttığını bildirmişlerdir2. Diyaliz hastalarında oluşan kanserin ayrıntıları, Avustralya ve Yeni Zelanda‘daki diyaliz ve transplantasyon kayıtlarında (ANZDATA) bildirilmiştir. 1991’de yayınlanan bu rapor, ortalama 18 ay diyalize giren 13524 hastayı kapsamaktaydı. Bu hastaların 380’inde (%3) deriyi ilgilendiren maligniteler, 337’sinde (%2) diğer organ maligniteleri ortaya çıkmıştır. Tüm bu maligniteler ilk kez, hasta diyalizde iken tespit edilmişti ve hiçbirinde diyalizin uygulanma nedeni malignite değildi. Deri dışındaki kanserlerin yaklaşık 1/3’i böbreği, mesaneyi ve üreteri tutan malignitelerdi. Aynı yaştaki genel nüfusa göre kanser oluşma riski iki misliydi2. Son yıllarda yapılan çalışmalarda böbrek, mesane, oral kavite kanserlerinin gelişim riski için insidans genel popülasyona kıyasla 9 kere daha yüksek olarak bildirilmiştir34. Son yıllarda üremik hastaların tedavilerindeki ilerlemeler, bir yandan hastaların daha uzun süre yaşamalarını sağlarken, bir yandan da hastalığın klinik ve patofizyolojik olarak daha ayrıntılı bir biçimde gözlenme 65 ve incelenmesine olanak vermiştir. İmmünolojideki gelişmeler, üremide immün sistemin yeni bir yaklaşım ile incelenmesine yol açmıştır. İmmün yetersizlikle kanser gelişimi arasındaki ilişkiler, üremideki 1 komplikasyonların daha iyi bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır . Avrupa ve Amerika’nın büyük diyaliz merkezlerinin geniş kapsamlı vaka serilerini içeren raporlarında, ev diyalizi uygulanan hastaların %6’sının, hastane diyalizi uygulanan hastaların %2’sinin kanserden öldükleri bildirilmiştir. Daha sonra Miach ve arkadaşları üremili hastalarda %13’e varan oranlarda kanser görüldüğünü bildirmişlerdir. Bunu takiben üremik hastalarda değişik oranlarda kanser insidansını gösterir çok fazla rapor yayınlanmıştır. Avrupa ve Amerika’nın büyük diyaliz merkezlerinden bildirilen büyük vaka serilerinde, üremik hastaların sadece kanserden ölenlerin bildirilmiş olması, kansere rağmen yaşayan üremik hastaların bildirilmemesi üremide kanser oranının umulan ve bulunandan daha yüksek olabileceğini düşündürmektedir1. Ülkemizde TND’nin verilerine göre 2006 yılında hemodiyaliz hastalarında malignitelere bağlı ölümlerin oranı %10.9, periton diyaliz hastalarında ise %3.8 olarak bildirilmiştir (Iekil 14). 12 10 8 Yüzde HD 6 PD 4 2 0 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 ekil 14: Türkiye’de HD ve PD hastalarında malignitelere bağlı ölümlerin yıllara göre dağılımı (TND 2005 10 36 ve 2007 ) 66 Son yıllarda üremik hastalarda malignite oranının yüksek bildirilmesinin nedeni, bu hastaların malignansi gelişebilecek kadar uzun yaşatılabilmesi olabilir. Diğer böbrek hastalıkları ile karşılaştırıldığında kanser oranı, kistik böbrek hastalığında en yüksektir. Yine bu hastalarda renal hücreli karsinom görülme sıklığının normal popülasyona oranla 50 misli daha fazla bulunmasının nedeni, hastalık seyrinin yavaş olmasından olabilir. Kronik böbrek yetmezliği olan hastalarda hipernefroma, uterus kanseri, multipl myeloma ve kanser riski artmıştır. Üremik hastalarda çoğunlukla mezanşimal kökenli kanserler gelişirken, transplantasyon sonrası hastalarda çoğunlukla epitelyal kökenli kanserlerin gelişiyor olması, kanser oluşumunda değişik tipte mekanizmaların varlığını düşündürmektedir1. 2.8.1.1. SDBH’da Malign Dönüşümün Potansiyel Mekanizması SDBH’da malign dönüşümün potansiyel mekanizması Tablo 13’de özetlenmiştir. Buna göre70: 67 Tablo 13: SDBH’da malign dönüşümün potansiyel mekanizması İmmün sistemin bozulan fonksiyonu Reaktif oksijen türlerinin artan formasyonuna eşlik eden azalan antioksidan kapasite Paratiroid hormon aşırılığı ve 1,25-dihidroksikolekalsiferol eksikliği Kronik enfeksiyonlar İlaçlar: immün baskılayıcılar,analjezikler, diüretikler Karsinojenik bileşeklerin birikimi (heterosiklik aminler ve nitrosodimetilamin) Hipometilasyon Tütün Diyalizle ilişkili faktörler DNA tamirinde bozukluk 67 1) İmmün sistemin bozulan fonksiyonu: SDBH’da hücresel ve hümoral immün cevap sıklıkla bozulmuştur70. Üremik hastalarda immün cevapta bir azalma, sirkülasyondaki B ve T lenfositlerinde azalma, yardımcı ve süpressör T hücre oranında azalma, kütanöz hipersensitivitede gecikme gözlenir67. Diyaliz hastalarında onkojenik virüslere karşı hassaslığın, üremik immün bozuklukdan kaynaklandığı düşünülmektedir. immün sistemin fonksiyonunu Ayrıca RRT’nin tipi de değiştirebilir71. Sürekli hemodiyaliz hastalarında IL-2 gen indüksiyonu kaybolur, Interferon-gamma (IFN) gen indüksiyonu da azalır. Periton diyaliz hastalarında ise IL-2 mRNA ekspresyonu normalken, IFN mRNA ekspresyonu artmıştır67. 2) Reaktif oksijen türlerinin artan formasyonu ve bozulmuş antioksidan savunma: Hemodiyaliz hastalarında, normal sağlıklı gruplara göre oksidan stres artmış ve antioksidan savunma ise azalmıştır72. Bunun sonucunda, vücutta birçok oksidatif reaksiyonda eşleşmemiş bir elektrona sahip atom veya moleküllerden oluşan serbest radikal oluşumu artmıştır. Bu serbest radikaller karbonhidratlar, proteinler, nükleik asitler ve özellikle de membran lipitleri ile reaksiyona girer. Bu durum iyon transport mekanizmalarını bozarak hücre ölümüne yol açar. SOD, CAT, GPx gibi antioksidan enzimler serbest radikallerin toksik seviyeye ulaşmasını engellerler. Ancak enzim düzeylerinde azalma olduğu taktirde, denge serbest radikaller lehinde bozularak organizma zarar görür73. Vanella ve arkadaşları HD tedavisi uygulanmayan üremik hastaların eritrositlerinde süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesinin düşük olduğunu ve bunun hemodiyaliz sonrasında anlamlı şekilde arttığını göstermişlerdir. Böylece üremik toksinlerin antioksidan enzimleri inhibe ettiği, diyaliz ile toksinlerin düzeyinin azaltılması ve bunun sonucunda antioksidan enzimlerin arttığı düşünülebilir. HD öncesi düşük konsantrasyonda olan glutatyon 68 peroksidaz (GPx) enzimi de HD sonrasında yükselmektedir72. Aksine, sürekli hemodiyalize giren hastalarda sıklıkla SOD aktivitesinin azaldığı da gözlenmiştir67. Tablo 14’de hemodiyalize giren hastalarda oksidan streste artışın ve antioksidan savunmada azalmanın nedenleri özetlenmiştir72. Tablo 14: Hemodiyaliz hastalarında artmış oksidan stres ve azalmış antioksidan 72 savunma nedenleri Oksidan stresin artış nedenleri Antioksidan savunmanın azalma nedenleri Üremiye bağlı toksik metabolitler Üremik hastalarda beslenme bozukluğu sonucu eksik alım, HD sonucu vitE, Cu, Zn, Se kaybı Hemodiyalizin etkisi: Eritrosit Na-K ATP-az ve asetil kolin esteraz aktivitesinde azalma • HD membranlarında lökosit ve kompleman sisteminin Eritropoetin eksikliği veya etkisine direnç aktivasyonu • Heparinin etkisiyle serbest yağ Üremiye bağlı toksik metabolitlerin asidi artımı antioksidan savunma enzimlerini inhibe etmesi Diyaliz sıvısı • • Diyaliz sırasında hastalardan eser element ve vitamin kaybı • Termal hasar Renal antioksidan enzim fonksiyonlarında azalma Oksidatif strese karşı savunma mekanizmaları; intrasellüler, membransal ve ekstrasellüler olarak sınıflandırılabilir. İntrasellüler antioksidanlar içinde SOD, GPx, CAT, Na-K ATPaz, asetil kolin esteraz, sitokrom oksidaz gibi enzimler bulunmaktadır67. VitE, koenzim-Q, βkaroten membransal antioksidanlara, askorbik asit, transferrin, laktoferrin, haptoglobulin, hemopeksin, albumin, serüloplazmin, bilirubin, mukus, ürik asit, glikoz ise ekstrasellüler antioksidanlara örnek olarak sayılabilir74. Antioksidanları görevlerine göre üç grup altında toplamak mümkündür75: 69 • Birincil antioksidanlar: Yeni serbest radikal oluşumunu önlerler. (SOD, GPx, transferrin seruloplazmin..) • İkincil antioksidanlar: Yeni oluşan serbest radikalleri ortamdan uzaklaştırırlar. (Vit C, Vit E, β-karoten, ürik asit, bilirubin, albumin, tiyoller..) • Üçüncül antioksidanlar: Serbest radikaller tarafından oluşturulan hücre hasarını onarırlar. (metionin sülfoksit redüktaz, DNA onarım enzimleri...) SDBH’da plazma GPx’ın ana kaynağı olan proksimal tübül hücrelerindeki hasara bağlı olarak sentezdeki yetersizlik nedeniyle plazma GPx aktivitesi azalmıştır. Sıklıkla azalan serum selenyum seviyesi de, plazma GPx aktivitesinin bozulmasına katkıda bulunabilir. Çünkü selenyum, enzimin aktif merkezinin önemli bir parçasını oluşturmaktadır. Araştırıcılar sürekli hemodiyaliz hastalarında serum selenyum seviyesinin normal değerinden daha aşağıya düştüğünü ve plazma GPx aktivitesinin azaldığını gösterdiler. Birçok epidemiyolojik çalışmada, düşük serum selenyum seviyesi kanser gelişiminde bir risk faktörü olarak gösterildi. Kanser gelişimine karşı selenyumun koruyucu etkisi; radikal bir temizleyici olarak ve nihai karsinojen oluşumunda prokarsinojenlerin aktivasyonunun bir inhibitörü olarak gösterilebilir. Hiperkalemi riski ve genel malnütrisyon nedeniyle diyetle alınan antioksidanlar (askorbat, tokoferol, karotenoidler ve koenzim-Q10) sürekli hemodiyaliz hastalarında azaltılabilir. Meyve ve sebzeden zengin diyetin kanser önleyici etkisi, birçok epidemiyolojik çalışmada gösterilmiştir. Sürekli hemodiyaliz hastalarında diyetteki bu bileşiklerin düşük tüketimi bu hastalarda kanser riski için bir faktör olabilir. Kararlı okside edici bileşiklerin birikimi de, sürekli hemodiyaliz hastalarının plazmasında gösterilmiştir. VitC, vitE’nin fizyolojik plazma konsantrasyonları veya azalmış glutatyon üremik plazmanın oksidasyon kapasitesini inhibe edemez67. Giray B ve ark. nın HD hastalarında 14 70 haftalık vit E desteği ile eritrositlerde SOD ve GPx aktivitelerinde anlamlı bir artış tespit etmişlerdir76. 3) Paratiroid hormon fazlalığı ve 1,25-dihidroksikolekalsiferol eksikliği: Primer hiperparatiroidizmin artan malignansi insidansıyla ilişkisi gösterilmiştir. Özellikle tiroid, meme ve GİS kanserleri primer hiperparatiroidizm ile ilişkilidir. İkincil hiperparatiroidizm sıklıkla SDBH’da tespit edilmiş olup, bu hastalarda karsinojenezisin artışında paratiroid hormonun aşırılığının etkisi tartışmalıdır. VitD’nin aktif formu olan 1,25dihidroksikolekalsiferol ise hücre çoğalmasını baskılar, paratirod hormon sentezini inhibe eder. Bu yüzden SDBH’da 1,25-dihidroksikolekalsiferolün eksikliği nedeniyle artan paratiroid hormonun prokanserojen etkisi, kronik böbrek yetmezliğinde artan malignite formasyonuna katkıda bulunacak şekilde davranabilir67. 4) Kronik enfeksiyonlar: Kronik inflamasyonda nötrofil ve makrofajlarda respiratuar patlama sırasında, çok miktarda oksijen ve nitrojen radikalleri oluşmakta ve bunlar DNA ile etkileşerek kansere yol açabilen zincir kırıkları, nokta mutasyonları ve kromozom anomalileri gibi genetik değişikliklere neden olabilmektedir77. Kronik enflamasyon, KBH olanlarda ve özellikle diyaliz tedavisi alanlarda yaygın görülen bir durumdur. SDBH ve HD hastalarında dolaşımdaki nötrofillerde oksidatif metabolizmanın arttığı gösterilmiştir5. Üreminin tetiklediği immün baskılama ve bozulmuş antioksidan savunma virüs ve bakteri enfeksiyonlarına zemin hazırlar. Nitrik oksit, süper oksit, hidrojen peroksit ve hidroksil radikallerinin artışı ile çoğalan fagositik aktivite DNA hasarına, mutasyonların ve kanserin teşvikine katkıda bulunabilir. Çünkü DNA sentezi hatasız bir süreç değildir ve DNA hasarının onarım süresi hızlı DNA sentezi ile kısaltılabilir. Sürekli hemodiyaliz hastalarında kronik hepatit, karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomaya yol açan hepatit B ve C enfeksiyonlarının prevalansında bir 71 artış olduğu gösterilmiştir. Japonya’da onkojenik (insan) T-hücreli lösemi virüsünün aktivasyonu nedeniyle sürekli hemodiyaliz hastalarında yetişkin T-hücreli lösemisinde artış bildirilmiştir. Genel popülasyonda sık görülen diğer bir enfeksiyon da mide kanserinde artışla ilişkili olan Helicobacter pylori bakterisinin sebep olduğu kronik gastirittir. Fakat böbrek hastalığı olmayan kontrol grubuna kıyasla sürekli hemodiyaliz hastalarında, gastrik metaplazi insidansı artsa da, Helicobacter pylori enfeksiyonu prevalansı daha düşüktür. Kronik üremide, kronik enflamasyon artan kanser prevalansının tek sebebi değildir67. 5) İlaçlar: Sürekli hemodiyaliz hastalarının çoğu glomerulonfrit yada başarısız böbrek kullanmışlardır. naklinden Azathioprin, dolayı metotreksat, immün baskılayıcı siklofosfamid ve ilaçları özellikle cyclosporin gibi immün baskılayıcı ilaçlar lenfoma ve sarkoma kadar deri, dudak, uterus, mesane ve karaciğer karsinomalarının prevalansının artışına da yol açabilir67. Diüretiklerin kronik kullanımı renal hücreli kanser gelişimimde risk faktörü olabilir. Kalsiyum kanal blokerlerinin de kanser defans mekanizmalarından apopitozu inhibe ettikleri deneysel olarak gösterildiğinden, kronik kullanımları kanser görülme riskinde rölatif artış yapabilir70. 6) Karsinojenik bileşiklerin birikimi: SDBH’da triptofan, glutamik asit ve imidazokinolon bileşikleri gibi karsinojenik heterosiklik aminler birikir. Üremik hastaların plazmasında diyaliz uygulaması başlamadan hemen önce yapılan ölçümlerde karsinojenik heterosiklik aminlerin yüksek olduğu gösterilmiştir67. 72 7) Hipometilasyon: SDBH’da malignite formasyonunun frekansında artışa neden olan diğer bir faktör hipometilasyondur. Homosistenin DNA metiltransferaz üzerinde inhibe edici etkisi olduğu bilinmektedir. Hiperhomosisteinemisi olan diyaliz hastalarında homosistein ve homosistein prekürsorü olan Sadenosilhomosisteinin biriktiği ve buna bağlı olarak DNA metiltransferazın inhibisyonu sonucunda DNA’nın hipometillenmiş olduğu tespit edilmiştir33. DNA’nın hipometilasyonu hücresel farklılaşmaya ve malign dönüşüme meyillidir. Yüksek miktarda toksik adenozilhomosistein SDBH’da artan homosisteinin kan konsantrasyonu ile doğrudan ilişkilidir. Homosistein seviyesi, toksik adenozilhomosistein konsantrasyonunu da azaltan folik asit tedavisi ile düşürülebilir67. 8) Tütün: Sigara içmek de artan kanser riski ile ilişkilidir. Fakat SDBH olanlarda artmış kanser riski ile sigara arasındaki ilişkinin, genel popülasyona göre farklılık gösterdiğine dair veri yoktur70. Böbrek nakli yapılan hastalarda kanser insidansının analizi sonucunda, 45 yaş üzerinde olmakla ve sigara içmekle artan kanser riski arasında anlamlı bir ilişki gösterildi56. Transplant süresinde 25 paket-yıl sigara içenler, sigara içmeyen veya çok az içenlere göre 2,56 kere daha yüksek kanser riskine sahipti78. 9) Diyaliz tedavisiyle ilişkilendirilen faktörler: Diyaliz süreciyle doğrudan ilişkilendirilen faktörler artan malignansi riskine de katkıda bulunabilir. Kompleman aktivasyonu olan diyaliz memranından dolayı oluşan biyouyuşmazlık, proteaz ve sitokin salınımı gibi serbest oksijen radikallerinin formasyonunu arttıran granülosit ve platelet aktivasyonunu tetikleyebilir. Fakat yapılan çalışmalarda kompleman aktivasyonu olan veya olmayan membran tipleri arasında kanser insidansı açısından anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Fakat kanser 73 mortalitesi, sürekli hemodiyaliz hastalarında periton diyaliz hastalarından daha yüksekti67. 10) Uzun süreli hemodiyaliz tedavisinden sonra DNA tamirinde bozukluk: DNA hasarının onarımı gerçekleştiren hücresel yetenek, kansere karşı majör bir savunma mekanizmasıdır. Diyalize başlanmadan önce ve uzun süreli RRT’den sonra lenfositlerindeki mikro çekirdek sayısının değerlendirilmesiyle DNA onarımında anlamlı değişiklikler olduğu gösterilmiştir71. Uzun süreli diyaliz tedavisi sırasında karsinoma gelişen hasta grubunda, DNA onarımının baskılandığı gözlenirken, kısa süreli hemodiyaliz grubunda, kontrol grubuna kıyasla DNA onarımında artış görülmüştür. Aksine, diyalize girmeyen kronik böbrek hastalarında, DNA onarımında azalma tespit edilmiştir. Bozulan DNA onarımı; artan hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ve DNA hipometilasyonunu içeren çeşitli faktörlerin sonucunda olabilir. Üremik hastalarda aşırı paratiroid hormonun etkisiyle hücre içine kalsiyum girişinin arttığı ve in vitro olarak kalsiyum iyonoforu ile lenfositlerde kalsiyum içeriğinin ani yükselişinin DNA onarımını inhibe ettiği gösterilmiştir. “Geleneksel olarak tedavi edilen üremik hastalarda ve üremik toksinleri muhtemelen elimine eden hemodiyaliz tedavisinin ilk yılındaki iniş çıkışlarda bile, DNA onarımı baskılanmış görünmektedir” denilebilir. Sonuç olarak, uzun süreli hemodiyaliz tedavisi, hemodiyalizin advers etkilerine ilave olarak kısmen kalıcı olan üreminin DNA onarımını baskılamasıyla sonuçlanır67. DNA onarım yeteneğinin bozulması, üremik hastalarda kanser insidansının artışına katkıda bulunur79. 74 2.8.1.2. KBH’da Oksidatif Stres, Karbonil Stres ve Tiyol Stres Enzimatik mitokondriyal elektron reaksiyonlar, taşıma zinciri, mikrozomal hidroksilasyon, otooksidasyon reaksiyonları, fagositoz gibi endojen reaksiyonlar ve ağır egzersiz, aşırı alkol kullanımı, aşırı beslenme, hava kirliliği, radyasyon, pestisidler, sigara dumanı, UV ışını, radyoaktif ışın gibi eksojen reaksiyonlar sonucunda organizmada çok miktarda serbest radikaller oluşmaktadır77. Serbest radikaller yaşam için gereklidir ama çeşitli makromoleküllere de saldırıda bulunabilirler4 (Tablo 15). Yapısal proteinler, hücre membranları, enzimler, lipidler ve DNA okside edilebilir yapılardır. Oksidatif streste in vivo üretilen serbest oksijen radikalleri, DNA’da farklı mekanizmalarla nükleik asitlerin, proteinlerin ve lipitlerin oksidatif hasarına neden olur. Bu hasarın sonucunda oksidasyon, köprüleşme, protein sarmalında kesilme, kromozom kırılmaları, mutasyonlar, malign değişiklikler ve hatta hücre ölümü gerçekleşebilir74. Tablo 15: En sık karşılaşılan radikaller ve kimlikleri 74 Hidrojen Bilinen en basit radikal Süper oksit Oksijen metabolizmasının ilk ara ürünü Hidroksil En toksik (reaktif) oksijen metaboliti Hidrojen peroksit Reaktivitesi çok düşük, moleküler hasar yeteneği zayıf Singlet oksijen Yarılanma ömrü hızlı, güçlü oksidatif oksijen formu Perhidroksi radikal Lipidlerde hızlı çözünerek lipid peroksidasyonunu artırır Peroksil radikal Perhidroksile oranla daha zayıf etkili, lipidlere lokalize olur Triklorometil CCl4 metabolizması ürünü Tiyol radikali Sülfürlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerin genel adı Alkoksil Organik peroksitlerin yıkımı ile üretilen oksijen metaboliti Nitrojen oksit L- arjinin amino asitinden in vivo üretilir Nitrojen dioksit NO'in oksijen de reaksiyonundan üretilir 75 Hidroksil radikali biyolojik sistemlerde bulunan en güçlü radikaldir4. DNA ile hidroksil radikallerinin etkileşimi durumunda, radikallerin %80’i bazlara eklenir ve %20’den daha az bir kısmı da şeker grubundan bir hidrojen atomu alır4. Albumin, üremik hastalarda oksidatif strese uğrayan başlıca proteindir4. Protein oksidasyon ürünleri arasında protein karbonil bileşikleri (PCC); 3-nitrotirozin, klorotirozin gibi yan zincir oksidasyon ürünleri; ditirozin ve protein ileri oksidasyon ürünleri (AOPP) gibi çapraz bağlanma ürünleri sayılabilir. Karbonil stres varlığında proteinlerin reaktif karbonil bileşikleriyle etkileşimi, AGE’lerin ve ileri lipoksidasyon ürünlerinin (ALE) oluşumuyla sonuçlanır. Üremik hastalarda AGE/ALE birikimi sadece okside proteinlerin renal atılımındaki azalmaya değil, karbonil strese de bağlanabilir5. Proteinlerin yanı sıra sistein, glutatyon gibi serbest tiyol grubu içeren bileşikler de üreminin başlıca hedefleri arasındadır. SDBH hastalarında plazma tiyol seviyelerinin azaldığı belirlenerek, bu durum tiyol stres olarak değerlendirilmiştir. Tiyol düzeyindeki azalma üremide üretilen serbest oksijen radikalleri tarafından tiyolün tüketilmesine ve diyalizden önce de protein oksidasyonunun oluşumuna bağlanabilir5. Antioksidanlar ise bu serbest radikallerin etkilerini nötralize eden, kanser, kalp hastalıkları ve erken yaşlanmaya neden olabilecek zincir reaksiyonlarını engelleyen moleküllerdir. Aynı zamanda serbest radikaller için kolay bir elektron hedefi oluştururlar4. Antioksidan savunma; radikal metabolit üretiminin önlenmesi, üretilmiş radikallerin temizlenmesi, oluşan hücre hasarının onarılması, sekonder radikal üreten zincir reaksiyonlarının durdurulması ve endojen antioksidan kapasitenin 74 artırılması olarak beş grup altında toplanabilir . 76 Normal şartlarda hücrelerde oksidanlar ve antioksidanlar arasında korunan bir denge vardır4. Organizmada serbest oksijen radikallerinin aşırı miktarda üretildiği, ya da antioksidan mekanizmaların yetersiz kaldığı durumlarda oksidan-antioksidan sistemler arasındaki denge bozulur ve bu durum oksidatif stres olarak adlandırılır5. Serbest radikaller klinik olarak direkt ölçüm için oldukça kısa ömürlüdür, bu yüzden reaktif oksijen ürünlerinin ölçümünde indirekt göstergeler kullanılır74. Oksidan-antioksidan homeostazının ölçümünde kullanılan bazı parametreler aşağıda gösterilmiştir75: • TOS (Total oksidatif seviye) • TAS (Total antioksidan kapasite) • OSI (Oksidatif stres indeksi) OSI=TOS/TAS Plazmada bulunan antioksidanlar ayrı ayrı ölçülebilse de çok sayıda antioksidan olması ve birbiriyle in vivo etkileşimleri nedeniyle, oksidatif stresin ortaya konulmasında TAS’ı gösteren analizlerin daha değerli olduğu düşünülmektedir75. RRT alan/almayan tüm SDBH hastaları, artmış bir oksidatif stresle karşı karşıyadır. Ancak oksidatif stresin neden HD hastalarında daha belirgin olduğu halen tartışılmaktadır. Üremik toksinlerin yanı sıra, diyalizin dolaşımdaki nötrofil ve monositleri ROS oluşturmak üzere tetiklediği, vitamin kaybıyla antioksidan gücün de zayıfladığı ve böylece diyaliz hastalarında oksidatif stresin oluşabileceği varsayılmaktadır5. Bu durumun üremik toksinlere maruziyet ve bilinmeyen diğer bazı faktörlerden dolayı serbest radikal üretimi sırasında antioksidan tüketiminden de gerçekleşebileceği ileri sürülmektedir13. Hiperhomosisteinemi, enflamasyon gibi üremi ile ilişkili metabolik anormallikler, kan-membran uyumsuzluğu ve/veya endotoksinle kontamine diyalizat kullanımı gibi diyalize bağlı faktörler ve hatta tedavide kullanılan eritropoietin gibi ilaçların da oksidatif strese katkıda bulunabilecekleri düşünülmektedir. Her 77 seansta artan oksidatif stres; hem karbonil stresi artıran başlıca faktörlerden biri, hem de hastalardaki kronik komplikasyonların sorumlusu olarak düşünülmektedir. Diğer bir görüş ise, oksidatif stresle ilişkili en önemli faktörün HD işleminden çok, enflamasyonun derecesi ve tedavinin süresi olduğunu öne sürmektedir. HD işleminin askorbik asit gibi antioksidanların kaybına yol açarak total antioksidan kapasiteyi azaltacağı öne sürülmektedir. HD’in TAS’ı etkilemediği ya da HD sonunda TAS’ın düşük bulunduğu çalışmalar da vardır. Bu durum diyalizle azalan ürik asit seviyelerine bağlanabilir. Plazmada tiyol ve TAS’ın yükselmesi çok kısa süre olmakta ve diyaliz seansları arasında prooksidan şartlar nedeniyle tiyol seviyeleri yeniden düşerken TAS’da azalmaktadır5. Böbrek naklinde, öncelikle böbreğin çıkarılması sırasında total bir iskemi durumunu oluşur. Bunu uzun bir soğuk iskemi periyodu izler. Daha sonra cerrahi vasküler anastomoz sırasındaki iskemireperfüzyon periyodu bunu takip eder. İskemi-reperfüzyon esnasında ROS nedeniyle doku zedelenmesi oluşur80. Böbrek nakli sonrasında greft fonksiyonu hemen gerçekleşse bile, tübüllerde ve nefronun glomerüler yapısında morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler görülür. Reperfüzyon sırasında, artan oksijen konsantrasyonu, ROS artışına neden olur81. Bunun sonucunda DNA bazlarında karakteristik değişiklikler ve zincir kırıkları oluşur. Özellikle hidroksil radikalleri tarafından timidinin oksidasyonuyla timidin glikol oluşur ve idrarla değişmeden atılır. Böbrek nakli sonrası timidin glikolün atılımında artış gözlenir. Atılım oranındaki bu artış, böbrekte iskemi-reperfüzyonun tetiklediği oksidatif DNA hasarı ile açıklanabilir ve oksidatif DNA hasarının bir biyogöstergesi olarak kullanılabilir81. SDBH olanlarda en az 2 tip oksidatif DNA hasarının meydana gelebileceğini beklenir82. Birinci tip oksidatif DNA hasarı, kendiliğinden veya üremik sendromla ilişkili faktörlerle oluşan üremiyle 78 ilişkilidir. Diğer tip oksidatif DNA hasarı ise, kan antioksidan yetersizliği ve belirgin ROS üretim artışıyla karakterizedir82. DNA’da oluşan oksidatif hasar, mutagenezisin, karsinogenezisin ve yaşlanmanın göstergesidir83 (şekil 15). Oksidatif DNA hasarını artıran ajanlar, genellikle kanser gelişimi riskini de artırır. Yapılan çalışmalardaki kanıtlar, malign hücrelerin yüksek miktarda okside Oksidasyonla olmuş değişikliğe DNA lezyonları uğratılmış DNA içerdiğini miktarının göstermiştir4. artışı, insan dokularında özellikle tümörlerde ortaya çıkarılmıştır. DNA hasarının mutlaka kansere yol açması da beklenmemelidir4. Düşük düzeylerde hasar, etkin bir şekilde onarıldığından ve yüksek düzeylerde oksidatif hasar ise hücre ölümü ile sonuçlandığından, orta düzeydeki hasarın maligniteye yol açma olasılığı çok yüksektir4. ekil 15: DNA’ da oksidatif hasar ve olası sonuçları 4 79 2.8.2. Böbrek Nakli ve Kanser Gelişimi Böbrek nakli, SDBH tedavisinde hastaya en iyi yaşam kalitesini sunan bir tedavi şeklidir. Ama böbrek naklinin uzun süreli fonksiyonel olması için uygulanan immün baskılama tedavisinin erken ve uzun dönemde gelişebilen yaşamı tehdit edici yan etkileri vardır69. Böbrek nakli sonrası ölüm nedenleri arasında kardiyak nedenler, enfeksiyonlar, malignite ve inme sayılabilir42 (Iekil 16). Diğer 30% İnme 7% Akut MI 11% Malignite 12% Diğer kardiyak nedenler 22% İnme Akut MI Malignite Enfeksiyon Diğer kardiyak nedenler Diğer Enfeksiyon 18% ekil 16: Böbrek nakli sonrası ölüm nedenleri (1998 USRDS yıllık raporu) 42 Böbrek nakli sonrası oluşan geç komplikasyonlar2: 1. Kardiyovasküler komplikasyonlar 2. Malignite 3. Kemik ve mineral metabolizması komplikasyonları 4. Hiperürisemi-gut 5. Kronik transplant nefropatisi şeklinde sayılabilir. 80 Hastalarda kanser riskini belirlemek için iki yaklaşım vardır47 : • Kümülatif kanser riski: Çeşitli çalışmalardan elde edilen verilerde, böbrek nakli hastalarında kümülatif kanser riskinin, 10 yılda %1318’den 20 yılda %35-40’a ve 25 yılda %60-70’e arttığı belirlenmiştir47. • Kanser insidansı: Kanser insidansı daha kullanışlı bir yaklaşım olup, böbrek nakli yapılan hastalarda düzenli diyalizde olan hastalarla kıyaslandığında anlamlı şekilde daha yüksek bulunmuştur47. 1973-2007 yılları arasında böbrek nakli yapılan 2535 hastanın malignite insidansının incelenmesi sonucunda 188 (%7,6) hastada 193 malign hastalık tespit edildi50. Üremili hastalarda hücresel ve hümoral immün cevabın baskılandığı bilinmektedir1. Bu etkinin renal transplantasyondan sonra yüksek doz immün baskılayıcı tedavi alan hastalarda, daha fazla olduğu bildirilmiştir1. Maligniteler organ naklinden sonra herhangi bir zamanda ortaya çıkabilir. Kronik diyaliz hastalarında, eşdeğer normal nüfusa kıyasla daha sık olan maligniteler, organ naklinden sonra da, sık görülmektedir48. Malignite-organ nakli ilişkisi ile ilgili bilgilerin çoğu Dr Israel Penn başkanlığındaki “Cincinnati Transplant Tumour Registry (CTTR)” ile “Australia-New Zealand Dialysis and Transplantation Registry (ANZDATA)” gibi geniş kayıt sistemlerinden elde edilmektedir. Bu verilere göre deri dışı malignitelerin insidansı yaş uyumlu kontrollere kıyasla 3,5 kat daha fazladır. Bu artış birçok kanser insidansındaki artışa atfedilebilir42. Ancak birçok kanser tipinde gözlenen/beklenen kanser insidansı tekdüze değildir. Kadınlarda meme, erkeklerde prostat kanseri gibi bazı kanserlerin böbrek alıcılarındaki görülme sıklığı, genel nüfusa göre daha azdır69. Aksine deri kanserleri ise transplant popülasyonu arasında daha yüksek insidansa sahiptir. Kanser kayıtlarının verilerine göre lenfoma, dudak kanserleri, Kaposi sarkoma, böbrek kanserleri ve 81 vulval veya perineal kanserler gibi genel popülasyonda nadir görülen malignansiler ise transplant popülasyonunda daha yüksek bir insidansta görülür46. Böbrek alıcılarında değişik malignitelerde gözlenen/beklenen arasındaki insidans farkı, böbrek naklinden sonra birden fazla mekanizmanın malignite gelişmesine katkıda bulunuyor olması ile açıklanabilir42. Bazı hastaların kronik rejeksiyon nedeniyle tedavilerinin kesilip diyalize dönmesinden gözlenmektedir84. Transplant sonra bile, hastalarında malignansi geliştiği malignansiler, normal popülasyona göre daha agressif davranmaktadır85. Örneğin Kaposi sarkoma, genel popülasyonun aksine transplant hastalarında daha sık ortaya çıkmakta ve daha ciddi bir seyir göstermektedir86. Böbrek hastalıklarına bazen premalign veya malign patolojiler eşlik etmektedir. Böbrek alıcıları arasında üriner maligniteler daha sık görülebilir. Benzer şekilde nadir görülen paratiroid kanseri riskindeki artış, uzun süreli böbrek hastalığına ve organ nakli öncesi olaylara atfedilebilir. Bunda başka mekanizmaların da rolü olduğuna inanılmaktadır. Böbrek nakli sonrası malignite insidansını artıran nedenler Tablo 16’da verilmiştir. Organ naklinden sonra erken dönemde bazı malignitelerin ortaya çıkma olasılığı diğerlerine göre daha yüksektir. Bunlar arasında Kaposi sarkomunu saymak mümkündür. Diğer malignitelerin büyük çoğunluğu geç dönemde ortaya çıkmaktadır. ANZDATA verilerinde non-Hodgkin lenfomaların ortaya çıkışı ile organ naklinin yapıldığı zaman arasında geçen ortalama süre 8-10 yıldır. Malignitelerin insidansı organ nakli sonrası geç dönemde giderek artmaktadır. Organ naklinden 30 yıl sonra deri dışı malignitelerin toplam görülme sıklığı %33’tür42. Deri kanserleri de dahil olmak üzere kanser insidansı transplantasyondan 25 yıl sonra %40’dır87. 82 2 Tablo 16: Böbrek nakli sonrası malignite insidansını arttıran nedenler Kronik immun defekt Kronik antijenik uyarı Onkojenik viruslar İmmün baskılayıcı ilaçların direkt etkisi Uzun süreli üremi Genetik eğilim • Kronik immun defekt: Normal insanlarda anormal hücrelerin sıklıkla ortaya çıktığı gerçeği, yaygın olarak benimsenmiştir. Bu gibi hücreler, somatik mutasyon veya viral enfeksiyonla açığa çıkar ve zamanla otonom hale gelip malignansi oluşturabilirler. Bu gibi potansiyel malignansilerin ortadan kaldırılmasında immün sistemin önem taşıdığı da ortaya konmuştur (Thomas 1959). Neoplastik mutasyon geçirmiş hücrelere yönelik denetim mekanizmasının yok olması ya da azalmasının, bir kanser sebebi olarak görülebileceği de öne sürülmüştür (Keast 1970). Cyclosporin-A, antilenfosit globulin ve OKT3 gibi güçlü antilenfosit aktiviteye sahip immün baskılayıcı ajanların, T lenfositlerin eliminasyonu ve fonksiyonlarında oluşturdukları değişiklikten ötürü, viral onkojenezi arttırdıkları öne 2 sürülmüştür . • Kronik antijenik uyarı: Hastalarda yabancı allogreft antijenlerinin devamlı olarak uzun süreli taşınması, kanser sebebi olarak önem taşıyabilir. Waldorf ve Smithers’in çalışmalarıyla kronik olarak lenfoid uyarımın da yüksek insidansta malign lenfomalara sebebiyet verdiği gösterilmiştir. Lenfoid dokunun devamlı olarak uyarılması hiperplaziye ve sonuç olarak 83 malignansiye yol açar. Bunun yanı sıra, viral proliferasyon yapabilen latent bir virojenin aktivasyonuyla, malign bir transformasyon gelişebilir. Transplantasyon dışında diğer hastalıklar nedeniyle immün baskılayıcı ajan kullananlarda, transplant vakalarına oranla çok daha düşük kanser insidansı bildirilmiştir (Mc Ewan ve Petty 1972, Kinler ve ark 1979). Bu durum, insan allogreft alıcılarında canlı antijen bulunmasının malignansi oluşumundaki önemini ortaya koymuştur2. • Onkojenik virüslar (EBV, HBV, HCV, HPV): Bazı malignitelerin viral enfeksiyonlarla oluştuğu konusunda kuşku bulunmamaktadır. Normal koşullarda konakta sessiz kalacak olan virüs, immün baskı altındaki böbrek alıcılarında potansiyel olarak ölümcül malign değişime yol açabilir42. Onkojenik virüsler, deneysel tümör modelleri sayesinde iyi bilinmektedir. Organ nakli alıcıları Epstein Barr virüsü (EBV), herpes simplex virüsü (HSV), herpes zoster virüsü, sitomegalo virüs (CMV) ve human papilloma virüsü (HPV) gibi virüsler tarafından oluşturulan viral enfeksiyonlara duyarlıdır. Bu virüsler insanlarda potansiyel onkojenlerdir. Örneğin EBV’nun nakil yapılmamış insanlarda Burkitt Lenfoma ile ilişkisi bilinmektedir. Organ nakli alıcılarında benzer tipte malignitelerin (lenfomalar, deri, dudak, serviks kanserleri gibi) etiyolojisinde de muhtemelen onkojenik virüslerin rol oynadığı düşünülmektedir46. Kinlen ve arkadaşları non-Hodgkin lenfoma, Kaposi sarkomu ve hepatoma oluşumunda viral enfeksiyonun rol oynadığını göstermişlerdir. Transplantasyon ve bazı malignitelerin oluşumu arasındaki kısa indüksiyon periyodu da, viral onkojenez lehinedir Çünkü viral değişim immün baskılamanın başlamasıyla birlikte başlar. Organ nakli alıcılarında, EBV ve lenforetiküler malignitelerin ilişkisi, cyclopsporin tedavisinin ortaya çıkışından hemen sonra, hem bu ajanla tedavi edilen, hem de diğer immün baskılayıcı ajanların kullanıldığı hastalarda gösterilmiştir. Öne sürülen hipotez: cyclosporin ve anti lenfositik ajanlar 84 gibi immün baskılayıcıların, bazı T hücresi fonksiyonlarını inhibe ederek, primer viral enfeksiyon ya da latent virüsün reaktivasyonuna yanıt olarak kontrol edilemeyen B hücre proliferasyonuna neden oldukları şeklindedir. Onkojenezde viral düşünülmüştür. rol Viral ihtimali, olarak bazı gelişen siğil bu taşıyan tümörler, hastalarda nerdeyse da nakil hastalarının yarısında bulunur (Koranda ve ark 1974). Az sayıdaki hastada da bu siğillerin malign tümörlere döndüğü açıkça belirtilmiştir. Bu değişim, güneş gören bölgelerde olur ve bu da malign değişimde bir çok karsinojenik uyarı gerektiğini gösterir2. Nakil hastalarında diğer viral enfeksiyonlara bağlı kanserler arasında uterusun servikal karsinoması (HPV ve HSV ile), hepatoma (HBV ile) ve Kaposi sarkomu (CMV ile) sayılabilir46. Organ nakli alıcılarında premalign keratoz ve skuamoz hücreli karsinoma oluşumları içinde onkojenik ve benign HPV tespit edildi. Bu durum HPV’ün kütanöz malignansilerin gelişiminde bir rol oynayabileceğini göstermektedir88. • İmmün baskılayıcı ilaçların direkt etkisi: Yeni ve daha etkin immün baskılayıcı ajanların kullanımı, transplant alıcıları için uzun süreli sağ kalımı sağladı. Buna bağlı olarak kronik immün malignansilerin baskılamanın riskinde artış uygulandığı olduğu alıcılarda “de 89 düşünülmektedir . novo” İmmün baskılamaya bağlı onkojenetik katkıların yanı sıra, immün baskılayıcı ajanlar direkt olarak da neoplastik olabilirler2. İmmün baskılayıcı ajanlar DNA’yı hasara uğratabilir, hücrelerde malign dönüşüme yol açabilir, normal immün kontrolü baskılayabilir ve malign değişimi gerçekleşen hücrelerin kontrolsüz sağlayabilirler. olarak Hayvan bölünme modelinde ve çoğalmasına cyclosporinin, konağın olanak immün hücrelerinden bağımsız olarak doğrudan “transforming growth factorbeta”nın hücrelere etkisiyle kanserin büyümesini hızlandırdığı gösterilmiştir42. Kombine tedavilerin kullanımı, kanserde bireysel immün baskılayıcı ajanların etkisini değerlendirmek için zorluk oluşturmaktadır56. 85 Araştırıcıların çoğu, böbrek naklinden sonra deri dışı malignitelerde artmış insidansın herhangi bir özel etken veya etkenlerden çok, doğrudan immün baskının kümülatif etkisi ile ortaya çıktığına inanmaktadır. Yaşın organ nakli sonrası malignite gelişme riskini arttırdığı gösterilmiştir. Bu nedenle 60 veya 65 yaşın üzerindeki organ alıcılarında immün baskı dozunun mümkün olan en düşük düzeyde tutulması akılcı bir uygulamadır42. • Uzun süreli üremi: Üremik hastalarda ve diyaliz hastalarında, hümoral ve hücresel immünitede bozukluklar vardır. Bu bozukluk, diyaliz hastalarındaki yüksek kanser riskini açıklayabilir2. Ayrıca, transplantasyon sonrası devam eden kanser riskine de katkıda bulunabilir2. • Genetik eğilim: Birçok transplant alıcısında kanserin oluşmasında, genetik etkinin kişisel eğilimi denetlediği gösterilmiştir2. Von Hippel-Lindau sendromu, Wiskott-Aldrich sendromu ve Drash sendromu gibi nadir bazı genetik durumlarda görülen herediter papiller renal hücreli karsinoma oluşumunda ailesel ve genetik faktörlerin etkisi gösterilmiştir56. Bazı hastalardaki renal malformasyonların da, renal hücreli karsinoma 71 gelişiminde risk artışına neden olduğu düşünülmektedir . 2.8.2.1. Böbrek Nakli Yapılan Hastalarda Kanser Etiyolojisi Böbrek nakli yapılan hastalarda kanser etiyolojisinde rol oynayan faktörleri 3 grupta toplamak mümkündür: • Kanserli böbrek nakli adayları • Nakledilen kanser • De novo (sonradan gelişen) kanser 86 1) Kanserli böbrek nakli adayları: Transplantasyon öncesi kanser hikayesi olmayan alıcılarla karşılaştırıldığında, invazif kanser hikayesi olan alıcılarda transplantasyon sonrası kanser riskinin 2 kattan daha fazla olduğu gösterilmiştir56. Penn’in retrospektif çalışmasında, hastalarda önceden var olan ve tedavi edilen neoplazmların böbrek nakli sonrası tekrarı %22 olarak bildirildi. Tekrarlayan vakaların %53’ü transplant öncesinde 2 yılda tedavi edilen, %34’ü önceden 2-5 yıl tedavi gören ve %13’ü önceden 5 yıldan fazla tedavi edilen hastalardaki kanserlerdi. Bu bulguların ışığında Dr Penn, malignansi tipindeki farklılıklara göre hastalar için transplantasyon öncesi 2 yıl, 2-5 yıl ve 5 yıldan daha fazla bekleme periyodu önerdi90. “The European Best Practice Guidelines for Renal Transplantation” ve “The American Society of Transplant Physician Guidelines”ın böbrek nakli ve başarılı bir kanser tedavisi arasındaki bekleme periyodu için önerileri Tablo 17’de gösterilmiştir. Bazı araştırıcılar Kaposi sarkomu gibi bazı malignitelerin, nakil için kesinlikle kontrendike olduğunu bildirdiler. Kanser küçük bir odaksa, uygun histolojisi varsa ve kanser tedavisi ile transplant zamanı arasında uzun süre varsa kanser tekrarının düşük olması beklenebilir. 1963-1999 yılları arasında Australian and New Zealand Transplant Registry (ANTR) tarafından belirlenen 11894 böbrek nakli alıcısının 210’unda nakilden önce malignite tanısı koyuldu. 210 malignitenin 11’i (%5) tekrarladı69. Bu çalışmada diyalizden önceki kanser tanısının prognozu, genel popülasyona benziyordu. Bu delillere dayanarak diyalizdeyken malignite gelişen hastalar için nakilden önce 5 yıllık bir bekleme süresi öneriliyor. Malignite tanısı hasta diyalize girmeden önce koyulmuşsa bekleme süresinin 2 yıla kadar kısaltılabileceği bildiriliyor69. 87 Tablo 17: Böbrek nakli ve başarılı bir kanser tedavisi arasındaki bekleme periyodu 69 <2 YIL 2 YIL 2-5 YIL Tesadüfen tespit edilen renal karsinoma In situ karsinomalar Tek odaklı, küçük neoplazmlar Düşük dereceli mesane kanseri Bazal hücreli deri kanseri 2 yıldan daha az olanlar ve 2’den 5 yıla kadarkiler hariç Melanomalar Meme karsinomalar Kolorektal karsinoma Uterusun non-in situ karsinoması Lenfomalar Prostat karsinoması >5cm veya semptomatik renal karsinoma 2) Nakledilen kanser: Kanserli vericilerden organ grefti alan hastaların büyük çoğunluğunda hem organda, hem de sistemik olarak malignite geliştiği gösterilmiştir2. Hastaların çoğu da malignite nedeniyle kaybedilmiştir. Bu nedenle kansere yakalanmış potansiyel organ vericilerinin, donör olarak daha ileri tetkikleri yapılmalıdır. Donör organlarının çok az olması nedeniyle, opere edilemeyen primer intraserebral malignitesi veya düşük dereceli deri malignitesi olan donörlerin bağışları, seyrek metastaz yapmaları nedeniyle kabul edilebilir. Yine de trajik olarak tüm dikkatlere rağmen sonuçta metastatik lezyonlara sahip böbrek nakli gerçekleştirilebilir2. Bu sonuç vericilerde malign bir hastalığın çok kapsamlı bir şekilde araştırılmasını ve kanser hastalarının da transplant vericisi olarak kabul edilmemesine büyük dikkat sarf edilmesini gerektirmiştir48. 88 3) De novo kanser: Pratikte, bütün “de novo” neoplazmlar, böbrek nakli hastalarında daha büyük bir insidansa sahiptir69. Cincinnati Transplant Tumor Registry (CTTR)’ye göre organ alıcılarında en yaygın “de novo” neoplazmlar; deri maligniteleri ve PTLD’dır69 (Tablo 17). Böbrek dışındaki organ alıcılarının aksine böbrek alıcılarında en fazla kütanöz maligniteler görülür ve nakil süresi ile insidans artar91. Böbrek dışı organ alıcılarında ise en fazla PTLD görülür (Tablo 18). “De novo” neoplazmların bu farklı dağılımı böbrek alıcılarının daha fazla takip süresi ve daha düşük immün baskılama düzeyi ile açıklanabilir. Daha uzun süreli sağ kalım sonucunda, alıcılar kütanöz maligniteleri hızlandıran fiziksel faktörlere daha fazla maruz kalmaktadırlar. Iiddetli akut rejeksiyonları engellemek için kullanılan güçlü immün baskı tedavisi, böbrek alıcılarında yaşamlarını sürdürebilmeleri diyalizle sağlanabileceğinden dolayı diğer organ alıcılarına göre daha sık terk edilir69. Tablo 18: CTTR’ye göre böbrek ve diğer organ alıcılarında “de novo” malignansiler 69 Malignansi tipleri Böbrek alıcıları (8868 hastada 9508 malignansi) Diğer organ alıcıları (2087 hastada 2155 malignansi) N % N % Deri kanserleri 3819 40 587 27 PTLD 1080 11 873 41 Akciğer karsinoma 505 5 147 7 Kaposi sarkoma 416 4 51 2 Serviks karsinoma 337 4 19 1 Böbrek maligniteleri 385 3 30 1 Vulva/perineum karsinoma 265 3 20 1 89 Böbrek alıcılarda kanser insidansı, coğrafi bölgelere göre değişiklik göstermektedir. “De novo” kanserlerin oranı tablo 19’da görüldüğü gibi Avrupa’da %1.6, İskandinavya’da %3.3, ABD’de %5.6, Avustralya’da %24 olarak bildirilmiştir. Avustralya’daki bu değişikliğin sebebi, deri kanseri oluşması yönünden yüksek riskli bölgeleri olmasındandır. Eğer deri kanserleri göz ardı edilirse, nakil yapılan hastalarda %4-7 kanser oranı olağandır. Penn 1975’de bu oranın, aynı yaştaki genel nüfusa oranla 100 kat daha fazla olduğunu hesaplamıştır2. Tablo 19: Alıcılarda kanser insidansının, coğrafi bölgelere göre dağılımı Avrupa % 1.6 Jacobs ve ark İskandinavya % 3.3 Birkeland ve ark ABD % 5.6 Penn ve ark Avustralya % 24.0* Sheil ve ark 2 2.8.2.2. Böbrek Nakli Sonrası Gelişen Kanser Türleri • Deri kanserleri: Deri kanserlerinin böbrek nakli yapılan hastalarda en yaygın malignansiler olduğu ve böbrek nakli sonrası geçen süre ile arttığı konusunda görüş birliği vardır. CTTR’e göre deri kanserleri, böbrek alıcılarında bütün malignansilerin %40’ını oluştıurmaktadır69. İmmün baskılamaya uzun süreli maruziyet, nakil sonrası deri kanseri gelişimi için bağımsız bir risk faktörüdür92. Nordic Renal Transplant Registry (NRTR)’ye göre böbrek nakli hastalarında insidans, genel popülasyonda beklenenin 30 katıdır. İnsidans, immün baskılamanın ilk yılında %7 iken, 20 yıl sonra %82’lere ulaşabilmektedir69. Deri kanseri gelişmesi açısından immün baskılamaya 5-10 yıl maruz kalanlar, 5 yıldan daha az maruz kalanlara göre 4 kere daha yüksek riske sahiptir93. Etiyolojisinde güneşin ultraviyole ışınları önem taşır56. Transplantasyondan sonra deri kanserinin 90 patogenezisinde deri tipi, immün baskılama ve güneş ışığı arasında karşılıklı etkileşim söz konusudur. Deri kanserlerinin Batı Avrupa, İskandinavya, ABD gibi ılıman ülkelerde çok yaygın olmadığı düşünülür. Fakat bu ülkelerde de çok daha az güneş ışığına maruz kalmalarına rağmen, böbrek nakli hastalarda deri kanseri gelişme riskinin gittikçe arttığı gözlenmektedir94. Viral etiyolojisinde HPV rol oynadığı düşünülmektedir56. Deri kanserinin geliştiği böbrek nakli alıcıları, genel popülasyonda etkilenenlerden daha gençtir ve alıcılarda genel popülasyonda görülenin aksine çok sayıda odak şeklinde ortaya çıkar95. Genel popülasyonda bazal hücreli karsinoma, skuamoz hücreli karsinoma oranı 5:1 iken, böbrek nakli hastalarında bu oran 1,8:1 şeklinde skuamoz hücreli karsinoma lehinedir69. Transplantasyonun gerçekleşmesi ve ilk karsinomanın ortaya çıkışı arasındaki ortalama latent periyodun 39,5 ay gibi çok kısa bir süre olduğu bildirilmiştir96. • Posttransplant lenfoproliferatif hastalık (PTLD): PTLD, nakil sonrası immün baskılama koşullarında ortaya çıkan lenfoid hücre çoğalması ile karakterize bir hastalık kombinasyonudur. Benign polimorfik hiperplazi ve poliklonal hiperplaziden maligniteye dönüşüm oldukça yüksektir69. En yüksek insidansı nakil sonrası ilk aylar veya yıllarda görülür ve görülüm sıklığı zaman ilerledikçe azalır47. Opelz ve Hendreson böbrek nakli yapılan hastalarda PTLD insidansını ilk yıl için %0.2 (genel popülasyondan 20 kere daha fazla) olarak bildirmişlerdir. PTLD gelişiminde ana risk faktörü EBV enfeksiyonudur. EBV sero-pozitif organ alan sero-negatif hastalarda PTLD insidansı, sero-pozitif alıcılardan birkaç kere daha fazladır. Böbrek nakli alıcılarında ATG/ALG veya OKT3 kullanımının PTLD riskini 1.8 kat arttırdığı bildirilmiştir. Böbrek nakli hastalarında PTLD için rölatif risk, genel popülasyondan NRTR’e göre 10 kere, diğer kayıtlara göre ise 4.8 kere daha fazladır. CTTR’de böbrek nakli yapılan hastaların kaydedilen kanserlerinin %11’i PTLD’tır. Genel popülasyonda ise lenfoproliferatif 91 durum neolazmların %6’sıdır. Çocuklarda mortalite %48’lere kadar çıkabilmektedir69. • Kaposi sarkoma: Kaposi sarkoma, böbrek nakli yapılan popülasyonda yüksek bir insidansa sahiptir. Nakil sonrası ilk yıllarda en fazla olarak görülür. Görünüm sıklığı zamanla azalır. Transplant alıcılarında ortalama görülme zamanı 13-72 ay arasıdır87. Etyopatolojisi Human Herpes Virüs-8 (HHV-8) enfeksiyonu ile ilişkilidir. Böbrek alıcısının nakil öncesi sero-pozitif olması, nakil sonrasında bu malignansinin gelişmesi için bir risk faktörüdür69. Dağılımı belli bölgeler ve ırklara göre değişiklik göstermektedir97. Bu malignansi Yunan, İtalyan, Türk, Yahudi ve zenci transplant alıcılarında daha sık görülür. Genel popülasyonda çok nadir görülürken böbrek nakli hastalarında belirlenen malignansilerin %4’ünü oluşturur. CTTR’e göre transplant alıcılarında genel popülasyondan 400-500 kez daha fazladır69. Mortalite %50’lere ulaşabilir69. Türkiye’de 10 yıllık bir periyotta incelenen böbrek nakli yapılmış 772 hastanın %3,2’sinde Kaposi sarkoma vakası tespit edilmiştir85. Haberal ve ekibinin 1975-2004 yılları arasında 86 pediyatrik hastada gerçekleştirdiği böbrek nakilleri sonrasında geç dönem komplikasyonu olarak 2 hastada Kaposi sarkoma geliştiği bildirilmiştir44. • Melanoma: Görülme zamanı nakil sonrası ortalama 5 yıldır. Açık renkli göz ve saça sahip olan bireylerde daha fazla görülür. Böbrek nakli popülasyonunda genel popülasyondan NRTR’e göre1.6 ve ANTR’e göre 3.3 kere daha fazladır. Yetişkinlerde transplantasyon sonrası “de novo” deri kanserlerinin %6.2 ‘ni, çocuklarda ise %15’ini oluşturur69. 92 • Renal hücreli karsinoma (RCC): İlk kez, 1977’de Dunhill ve arkadaşları edinsel kistik böbrek hastalığı ve hemodiyaliz arasında bir ilişkinin varlığını bildirmişlerdir98. Edinsel renal kistik hastalık, yaş ve primer böbrek hastalığından bağımsız olarak hemodiyalizde veya periton diyalizde olan hastalarda ortaya çıkar ve prevalans diyalizin süresiyle artar99. 3 yıldan daha az diyalizde olan hastalarda %10-20, 3 yıl diyalizde olan hastalarda %40-60, 5 yıldan daha fazla diyalizde olan hastalarda ise %90’dan daha fazla edinsel renal kistik hastalık tespit edilmiştir100. Edinsel kistlerden sonra sekonder gelişen RCC, diyaliz süresiyle ilişkili bulunmuştur99.Transplant alıcılarında ortalama ortaya çıkma süresi 84 aydır, ama bu maligniteler diyalizdeki hastalarda da sıklıkla oluştuğu için bu süre değişkenlik göstermektedir69. RCC alıcının kendi böbreğinde ve daha az sıklıkla da nakledilen böbrekte görülebilir101. Analjezik nefropatisi ve hastanın fonksiyonsuz kendi böbreğini etkileyen edinsel kistik hastalık, böbrek kanseri gelişimi için bir risk faktörüdür71. Böbrek nakli yapılan hastalarda yaş uyumlu genel popülasyona oranla böbrek kanseri gelişme riski 7 kere daha fazladır. Bütün böbrek nakli malignansilerinin de %4.6‘sını oluşturmaktadır. Genel popülasyonda görülme sıklığı ise %3’dür. Böbrek nakli alıcılarında “de novo” RCC’ların %25’i tesadüfen fark edilir. Mortalite %40’dır69. Malignansinin kümülatif prevalansı takip edilen süreyle artış gösterir. İmmün baskılamanın yoğunluğu ve süresi transplantasyon sonrası malignansi gelişimi için önemli bir risk faktörüdür71. • Anogenital karsinoma: Genel popülasyonda %0.7, böbrek nakli alıcılarında ise %3 olarak görülür. Ortalama görülme süresi 7 yıldır69. HPV enfeksiyonu bir risk faktörüdür102. ANTR’e göre ATG/ALG veya OKT3 tedavisi uterus, serviks, vajina ve vulva kanserlerini artırmıştır69. 93 Tablo 20’de dünyada transplantasyon sonrası kanser vakaları ve Tablo 21’de 1990-2004 yılları arasında yapılmış çalışmalardaki verilere dayanarak transplantasyon sonrası malignansi insidansları verilmiştir69. 94 Tablo 20: Dünyada transplantasyon sonrası kanser vakaları Ülke Yıl Hasta Malignansi sayısı sayısı İnsidans Tedavi Deri Lenfoma Kaposi (%) (%) S (%) Avustralya 1996 6993 1915 27,38 CsA-Aza 75,10 3 0,73 Kanada 2002 760 93 12,20 CsA-Aza 42,30 2,70 1,80 Danimarka 2000 1821 109 11,40 NS 56,40 9,30 0 Finlandiya 1994 2090 94 4,50 CsA-Aza 10,20 7,40 2,10 Fransa 1997 1710 133 7,78 CsA-Aza 39 15 6,80 Almanya 1997 2372 1476 6,20 CsA-Aza 50 5,70 0,40 İtalya 1996 854 76 8,90 CsA-Aza 46 4 17 Rusya 2000 718 33 4,60 CsA-Aza 12,10 6,00 45,40 İspanya 2003 2121 84 4,24 CsA-Aza 33,30 12,20 5,50 İngiltere 1995 918 70 7,63 CsA-Aza 53 9 0 USA (IL) 1996 305 28 9,18 CsA 71 7,10 3,60 USA (AL) 1995 3359 137 4,08 CsA-Aza 41 8,80 0 Güney 2001 542 41 7,56 CsA-Aza 31,70 4,90 53,60 Mısır 1997 950 22 2,32 CsA-Aza 4,50 13,60 50 İran 2000 1216 21 1,73 CsA 14,20 33,30 23,80 Japonya 1997 1744 46 2,64 CsA-Aza 0 10,90 0 Kore 1998 1600 32 2,00 CsA NS NS 15,60 Meksika 1992 318 16 5,03 CsA-Aza 37,50 18,80 6,20 Pakistan 1999 630 12 1,90 CsA 0 50 33,30 Türkiye 1999 1167 33 2,83 CsA-Aza NS NS 25,80 Türkiye 2001 954 36 3,80 CsA-Aza 25 22,50 25 Afrika NS: spesifik değil 94 69 Tablo 21: Transplantasyon sonrası malignansi insidansı (1990-2004) Araştırıcı Böb. Nakli sayısı Kasiske ve ark (2004) Stewart ve ark (1995) 35765 a Malignansi sayısı Rapor edilmemiş Malignansi insidansı % 14,9 25914 762 2,9 Sheil ve ark (2001) 9796 3061 31,0 Adami ve ark (2003) 5931 692 11,6 Birkeland ve ark (1995) 5692 471 8,3 Lampreabe ve ark (1993) 5635 165 3,2 Kyllonen ve ark (2000) 3440 230 6,7 Vilardell (1992) 2222 66 3,0 Birkeland ve ark (2000) 1821 175 9,6 Hoshida ve ark (1997) 1744 46 2,6 Hiesse ve ark (1997) 1710 133 7,7 Mankin ve ark (1989) 1605 59 3,7 Anaya ve ark (1995) 1528 46 3,0 Danpanich ve Kasiske (1999) 1500 88 5,8 Behrend ve ark (1997) 1497 147 9,8 Ishikawa ve ark (2000) 1312 40 3,0 Fahlenkamp ve ark ( 1996) 1243 39 3,1 Villacampa ve ark (1998) 1231 28 2,3 Tremblay ve ark (2002) 924 London ve ark ( 1995) 918 70 7,6 Pecqueux ve ark (1990) 709 19 2,7 Schmidt ve ark (1996) 633 38 6,0 Ondrus ve ark (1999) 620 18 2,9 Vogt ve ark (1990) 598 18 3,0 Gaya ve ark (1995) 274 54 19,7 Dantal ve ark (1998) 231 60 25,0 a Rapor edilmemiş 12,2 23729 böbrek ve 2185 kalp nakli 95 Pediatrik alıcılarda gelişen malignansi tipleri ise genel pediatrik popülasyondan ve yetişkin alıcılardan çok farklıdır103. Pediyatrik alıcılardaki lenfomalar bütün malignansilerin %52’sini kapsar. Pediatrik alıcılardaki lenfomaların %85’i çocukluk döneminde meydana gelir104. 25 yaş altındaki hastalar transplantasyon sonrası ilk 2 yıl sonrası özellikle artan bir riske sahiptir105. İkinci en yaygın malignansi deri kanserleridir104. Fakat bunlar yetişkin alıcılardakinden daha az sıklıkta oluşur. Malign melanomlar ve dudak kanserleri ise pediatrik alıcılarda yetişkinlerden daha yaygındır103. Genel popülasyonla kıyaslandığında yetişkin böbrek nakli popülasyonunda iki kat sıklıkla oluşan RCC, pediyatrik böbrek nakli alıcılarında nadirdir104. Lenf düğümlerine yayılma, pediatrik alıcılarda yetişkinlerden daha fazladır. Bunları vulva ve perineumun sarkoma ve karsinomaları izler. Bu malignansiler çocukluktan sonra ortaya çıkar. Pediatrik alıcılarda gelişen diğer malignansiler: tiroid karsinoma, Kaposi sarkoma, baş boyun kanserleri, serviks karsinoma, lösemi, ovaryum karsinoma, renal karsinomadır103. 96 2.9 . Genotoksisite Testleri Moleküler epidemiyoloji ve toksisite alanındaki gelişmeler hastalık ve toksik bir durumun erken teşhisi için değerli yöntemlerin ortaya çıkmasını sağlamıştır. Çevresel ve mesleksel maruziyetlerde bu yöntemler büyük önem taşımaktadır. Kanser etiyolojisiyle ilgili çalışmalarda, biyogöstergelerinin kullanılması ile daha az bireyle daha hızlı çalışabilme ve daha doğru maruziyet değerlendirmesi yapabilme olanağı vardır. Hücre düzeyinde biyolojik izleme, genotoksik maddelere maruziyet sonucu ortaya çıkan kromozomal hasarı saptamada geleneksel olarak kullanılmaktadır. Genotoksisite terimi, genellikle DNA’ya ya da kromozoma zarar verebilen kimyasalları tanımlamak için kullanılmaktadır. Genotoksisite, mutasyonların ya da kromozom hasarının ölçümü ile doğrudan saptanabilmektedir106. Genotoksik kimyasallara maruz kalmış popülasyonlardaki kromozomal hasarın tespiti için en fazla kullanılan genotoksisite yöntemleri: Mikroçekirdek Yöntemi (MÇ), Comet Yöntemi, Kromozomal Aberasyon (CA), Kardeş Kromatid Değişimleri (SCE), Floresan In Situ Hibridizasyon Yöntemi (FISH), protein katım ürünleri, DNA katım ürünleri, hipoksantin guanin-fosforiboziltransferaz (HPRT) mutasyonlarıdır. Yöntemlerin birçoğu in vivo ve in vitro olarak çeşitli hücrelerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Periferal kan hücreleri (lenfositler), eksfoliye hücreler (yanak, burun, serviks epiteli gibi) ve in vitro hücre kültürü için kullanılan hücre dizileri genotoksisite yöntemlerinde kullanılan hücre tipleri arasındadır106. 97 Çalışmamızda kullanılan yöntemler: • Comet Yöntemi /The single cell gel electrophoresis (SCGE) • Modifiye Comet Yöntemi • Mikroçekirdek Yöntemi • FISH kombine Mikroçekirdek Yöntemi • Eksfoliye bukkal epitelde Mikroçekirdek Yöntemi’dir. 2.9.1. Comet Yöntemi (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) DNA hasarını ölçmek için sıklıkla kullanılan etkinin biyogöstergelerinden birisi Alkali Comet Yöntemi’dir108. Comet Yöntemi, denatüre olan DNA’nın elektroforetik bir alan boyunca göçüne dayanan, tek tek hücrelerin DNA hasarını ölçmek için kullanışlı, hızlı, kolay ve duyarlı bir yoldur107. İlk olarak 1984 yılında Östling ve Johanson tarafından tek tek hücrelerde DNA hasarının direkt olarak gösterilmesinde bir teknik olarak sunulmuştur83. 1989 yılında Singh ve ark. tarafından geliştirilen yöntem, daha sonra çeşitli modifikasyonlarla genotoksisite ve apoptoz araştırmalarında sıklıkla kullanılır hale gelmiştir108. Bu testte hücreler agar içine yerleştirilir ve DNA’ları lizis edilir. DNA’yı gevşetmek ve denatüre etmek için alkali ile muamele edilir ve elektriksel alana maruz bırakılır109. Tek veya çift zincir kırıklarının, alkali labil bölgelerin ve gevşek kromatinlerin varlığı, bozulmamış çekirdeksel DNA’nın ilerisine, anoda doğru hareket eden DNA fragmanlarına yol açar110. Elektriksel alanda DNA hasarı olan hücrelerde, DNA’sı bozulmamış olan hücrelere göre daha fazla DNA göçü olmaktadır107. Küçük fagmanlar ve gevşek luplar, bozulmamış DNA’dan ve daha büyük yapılardan daha uzağa hareket edebildikleri için mikroskop altında kuyruklu yıldız benzeri bir yapı oluşur111. Bu nedenle yönteme Comet Yöntemi adı verilmiştir112. DNA’nın sağlam kısmı yıldızın başını, kırık zincirler ise kuyruğunu oluşturur77. Bu yapılar uygun DNA boyamasıyla (EtBr, silver stain veya floresan boyalarla) 98 mikroskopta değerlendirilebilir. Basitliği ve duyarlılığı nedeniyle Comet Yöntemi, genotoksisite testleri arasında kendine önemli bir yer bulmuştur112. Comet Yöntemine ilgi duyulmasının diğer nedenleri: hücre örneklerinin sayısındaki azlık ve farklı dokulardan yeterli hücre örneğinin invaziv olmayan işlemlerle elde edilebilmesi nedeniyledir113. Comet Yöntemi ile, çalışılan bireydeki bazal DNA hasarı değerlendirilir. Oluşan DNA görüntüleri, DNA hasarının miktarı tahmin edilerek veya kuyruk boyu ölçülerek analiz edilir. İmaj analiz cihazları çeşitli parametreleri analiz edebilir: Cometlerin momentleri, göç eden DNA yüzdeleri, kuyruk uzunluğu, kuyruk yoğunluğu gibi114. Kuyruk uzunluğun tek başına comet görüntüsünü bir çizgi olarak yansıtamayacağı düşünülmektedir110. Kuyruk yoğunluğu gevşeyen ya da kırılan parçaların sayısını yansıtırken, kuyruk momenti ise kuyruk uzunluğunun ve yoğunluğunun bir arada ifadesidir83. Bu yöntem çok duyarlıdır ve sonuçları yorumlamak için bilgili bir araştırmacıya ihtiyaç duyulur114. Gözle yapılan değerlendirme ile %DNA arasında ise düzgün lineer bir ilişki vardır115. Comet ile yapılan DNA hasarı değerlendirmelerinde yaş, cinsiyet, çevresel faktörlerin (egzersiz, güneş ışığı, hava kirleticiler gibi) etkisi olduğu bilinmektedir. Bazı çalışmalar mevsimsel değişikliklerin rolünü de göstermektedir115. DNA hasarının doğru ölçümü bazı faktörlere bağlıdır83: • Lizis durumu ( tuz konsantrasyonları, pH, lizis süresi) • Elektroforez öncesi yıkama basamağı (arta kalan tuzlar DNA göçünü inhibe edebilir) • Agaroz konsantrasyonundaki artış • Lamların elektroforez öncesi kullanılan tamponla dengelenip dengelenmemesi 99 • Elekroforez süresinin kısalması DNA göçünü etkileyebilir83. Enfeksiyon, beslenme bozukluğu, kan örnekleme zamanı veya ağır fiziksel aktivite gibi faktörlerin comet formasyonuna neden olduğu bildirilmiştir. Bu durum kontrol edilmelidir. Genomik hasar için en az bir diğer gösterge ile kombinasyon önerilmektedir112. 2.9.2. Modifiye Comet Yöntemi Alkali şartlar hazırlandığında Comet Yöntemi; tek ve çift zincir kırıklarını (fakat ikisini birbirinden ayırt edemez), alkali labil olan bölgeleri (tek zincir kırıklarında), tamamlanmamış eksizyon tamirlerini (tek zincir kırıklarında), DNA-DNA ve DNA-protein etkileşimlerini tespit eder. DNA modifiye edici enzimleri eklenerek, Comet Yönteminin spesifikliği arttırılabilir116. Comet Yönteminde başarıyla kullanılan enzimler; alkilasyon hasarı için Alk A, okside edici pürinler için formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG/ Mut M), okside edici primidinler için endonuclease III (Endo III), DNA-protein etkileşimleri için proteinkinaz K’dır114. Radikallerin DNA ile etkileşimi sonucu DNA’da yaklaşık 20 tane oksidatif hasar ürünü oluşmaktadır4. Bunların arasında en fazla miktarda oluşan ve en mutajenik DNA hasarı, 8-hidroksideoksiguanozindir (8-OHdG)77. DNA’da tüm pürin ve pirimidin bazları arasında guanin, oksidasyona daha çok yatkındır118, 119 . 8-OHdG, hidroksil radikalinin DNA bazlarından guaninin 8. karbonunu oksitlemesi ile oluşur4. Böylece 8-OHdG, DNA replikasyonu sırasında sitozin yerine adeninle eşleşerek G:C →T:A mutasyonuna neden olur. 8OHdG, DNA onarım enzimleri tarafından kesilerek uzaklaştırılır, periferik dolaşıma geçer ve idrarla atılır74. Bu nedenle 8-OHdG, hem hücre içi oksidatif DNA hasarının, hem de onarım seviyesinin göstergesidir117. Onarımın yetersiz olduğu koşullarda hasar kalıcı hale gelir77. Bu baz 100 değişimi mutasyona uğramış protoonkogenler ve tümör baskılayıcı genlerde sıklıkla görülmektedir. 8-OHdG’ne spesifik bir endonükleaz olan FPG kullanılarak, bu hasarın bulunduğu bölgelerde ilave kırıklar oluşturmak yoluyla DNA üzerindeki 8-OHdG kalıntılarının sıklığı Comet Yöntemi ile belirlenebilmekte ve oksidatif DNA hasarının bir göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Burada amaç, DNA zincir kırıkları ve FPGduyarlı bölgelerin sıklığının belirlenmesidir116. DNA üzerinde zincir kırıkları oluşumu sadece oksidatif strese bağlı olmayıp UV, radyasyon ve DNA hasarlarının onarımı sırasında da geçici olarak ortaya çıkabilmektedir. Oysa 8-OHdG kalıntıları sadece oksijen ve nitrojen radikalleri tarafından oluşturulmaktadır77. ENDOIII ile tayin edilen DNA lezyonları110: • 5,6-dihidroksi-5,6-dihidro-2’-deoksitimidin (timidin glikol, dTg) • 5,6-dihidroksi-5,6-dihidro-2’-deoksiüridin (urasil glikol, dUg) • 5 hidroksi-2’-deoksisitidin (5-OHdC) • 5 hidroksi-2’-deoksiüridin (5-OHdU) FPG ile tayin edilen DNA lezyonları110: • 7-hidro-8-okso-2’-deoksiguanozin (8-oxodG) • 2,6-diamino-4 hidroksi-5-formamidoprimidin (FapyGua) • 4,6-diamino-5-formamidoprimidin (FapyAde) 2.9.3. Mikroçekirdek (MÇ) Yöntemi Literatürde mikroçekirdek (MÇ), küçük çekirdek anlamındadır120 ve Howell-Jolly cisimcikleri olarak da bilinir121. MÇ, hücre bölünmesinde mitozun metafaz-anafaz geçişi esnasında, iki kardeş hücrenin içine kromozomlardan katılamayan oluşur. asentrik İlerleyen fragmanlardan aşamalarda interfaz veya tam hücresinin sitoplazmasında bir membranla çevrili kromatin materyali içeren küçük bir 101 çekirdek olarak ortaya çıkar122. Bu olaylar oksidatif stresle, klastojen veya anojenlere maruziyetle, hücre siklusunu kontrol eden ve/veya DNA onarım genlerindeki genetik defektlerle tetiklenebilir123. Anöploidiyi uyaran ajanlar, sentromer bölünme hatalarına ve iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol açarak; klastojenler ise kromozom kırıkları oluşturarak MÇ oluşumuna katkıda bulunmaktadırlar121 (Iekil 17). MÇ görülmesindeki sıklık, kromozom kırılmalarına veya kayıplarına ve hücre bölünme oranına bağlıdır120. ekil 17: MÇ formasyonu 124 MÇ Yöntemi mitoz geçiren tüm bitki, hayvan ve insan hücrelerinde, fiziksel ve kimyasal ajanların oluşturduğu genotoksik etkinin belirlenmesinde kullanılabilir125. Bu yöntem, 1950’lerde bitki hücrelerinde kromozom hasarının ölçülmesinde, 1970’lerde hayvan hücrelerinde ve daha sonra Haddle ve arkadaşları tarafından kültüre edilmiş insan lenfositlerinde kimyasal karsinojenleri belirlemeye yönelik bir test olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bazı araştırmacılar geliştirdikleri modifiye metotlarla anöploidiye yol açan ajanlar ile klastojenleri birbirinden ayırmak için MÇ büyüklük farkından yararlanmışlar; klastojenlerce uyarılan MÇ’lerin asentrik kromozomal fragmanlar içeren küçük ebatlı, anojenlerce uyarılan MÇ’lerin tam kromozom içeren daha büyük ebatlı olduğunu göstermişlerdir126. Daha sonra 1985’de Fenech ve Morley tarafından geliştirilen sitokinezisin bloke edildiği MÇ Yöntemi (SBMÇ), bazı kinetik 102 problemlerin ortadan kalkmasını ve tekniğin uygulanmasındaki güvenirliğin artmasını sağlamıştır127. Bu metot, küf mantarlarının metabolitlerinden biri olan Sitokalazin-B (Cyt-B) ile bir çekirdek bölünmesi geçiren hücrelerde, sitokinezi durdurma esasına dayanmaktadır (Iekil 18). Cyt-B, sitokinezis esnasında kardeş çekirdekler arasında sitoplazmanın daralmasını sağlayan mikrofilament halkasının oluşumu için ihtiyaç duyulan bir aktin polimeraz inhibitörüdür128. Standart lenfosit kültürlerine uygun konsantrasyonda Cyt-B ilavesiyle, çekirdek bölünmesini tamamlamış, ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş çift çekirdekli hücreler kolaylıkla tanınarak Heddle ve Countryman’in kriterlerine göre sayılabilmekte ve MÇ bulunduran hücrelerin oranı saptanabilmektedir. Bu yöntem ilk başta, insan lenfosit kültürlerinde kullanım için geliştirilmişti. Ama daha sonra, solid tümör ve kemik iliği hücreleri gibi çeşitli hücre tiplerine de adapte edilidi121. MÇ Yöntemi kromozom kaybı ve kromozom kırıklarını güvenilir bir şekilde belirlemeye olanak verir121. MÇ genetik hasara yol açan iç ve dış indikatörlere duyarlıdır ve in vivo ve in vitro genotoksisite testleri içinde en önemli son noktalardan birisidir20. Genotoksik ajanlara maruz kalan insan popülasyonlarında kromozomal hasarın varlığını veya yokluğunu değerlendirmek için periferal kan lenfositlerindeki MÇ frekansının ölçülmesi moleküler epidemiyoloji ve sitogenetikte geniş bir şekilde kullanılır. MÇ tekniğinin basitliği, çok sayıda hücrenin incelenebilmesi, yüksek güvenilirlik ve düşük maliyeti in vitro ve in vivo genomik hasar çalışmalarında bu biyogöstergenin benimsenmesine ve başarısına katkıda bulunmuştur127. 103 128 ekil 18: Cyt-B ilavesiyle MÇ formasyonun süreci MÇ Yönteminde sadece iki çekirdekli hücrelerde MÇ sayımı yapılır121. İncelenen alanda, kültür süresi içinde ikinci bölünmesini tamamlamış 3, 4 ve daha fazla çekirdekli hücrelere de rastlanmaktadır; ancak MÇ sayımında Heddle ve Countryman’in kriterlerine göre bu hücrelerde görülen MÇ’ler değerlendirme dışı bırakılmaktadır126. MÇ Yönteminde diğer önemli bir nokta, tek çekirdekli hücrelerde sayılan MÇ’in de alternatif bir kavram olmasıdır. Bunun dayanağı; lenfositlerin zaten in vivo hücre bölünmesinin bir sonucu olarak ifade edilen mikroçekirdeği içinde bulundurmasıdır132. Tek çekirdekli hücrelerdeki MÇ, Cyt-B ile kültüre koymadan önce hücrelerde var olan DNA hasarını göstermektedir. Binükleer hücrelerdeki MÇ sayılmasına ilave olarak, tek çekirdekli hücrelerde de MÇ sayımının yapılması, daha kapsamlı bir işlem olup, MÇ olarak kaydedilen bütün DNA hasarını ifade edebilmektedir129. Lenfosit proliferasyon oranını değerlendirmek için nükleer bölünme indeksi (NDI) aşağıdaki formüle göre hesaplanır130. NDI = 1 mono + 2 bi + 3 tri +4 tetra ---------------------------------------------Toplam sayılan hücre sayısı MÇ tetiklenmesi ve kanser gelişimi arasında bir ilişkinin varlığı çok sayıda çalışmayla desteklenmektedir. Kanıtların bazılarının kapsamı aşağıdaki şekildedir125, 131: 104 i) Tedavi edilmeyen kanser hastalarında ve kansere yatkın olduğu bilinen konjenital hastalıklı kişilerde bu biyogöstergenin yüksek frekansta olması. Ör: Bloom sendromu, ataxia telengiectasia gibi. ii) Klinikte kimyasallarla yapılan çalışmalarda oral mukozada bir yardımcı biyogösterge olarak kullanılan MÇ frekansında artışın olması. iii) MÇ tetikleyen ajanlar ve karsinojenesite arasındaki korelasyonun varlığı. Ör: iyonize radyasyon ve ultraviyole. iv) Folat, kalsiyum, vitE, nikotinik asit gibi kanser riskinin azaltılmasıyla ilgili belirli vitamin ve minerallerin diyetle alınımı ve/veya kan konsantrasyonları ile MÇ frekansı arasındaki ters korelasyonun varlığı. Sitokinezisin bloke edildiği kültüre edilen lenfositlerde gözlenen MÇ, muhtemelen daha önceden var olan MÇ’den de türeyebilir132 (şekil 19). Kandan toplanan bazı lenfositler, toplanmadan önce son hücre bölünmesi sırasında in vivo olarak belirlenen bir MÇ içerebilir. Lenfositler, son bölünme ve kanın toplandığı zaman arasındaki sürede kültürde bölünme için stimüle edildikten sonrasına kadar eksprese edilmeyen Go’da hücrelerdeki ilave DNA lezyonlarını biriktirebilir131. ekil 19: MÇ oluşumu 132 105 Kültürdeki insan lenfositlerinde spontan MÇ frekansı, sirküle şekilde uzun süre yaşayan (yaklaşık 3-4 yıl) lenfositlerin yaşam süresinde genetik hasarın birikiminin bir kaydını verir. Gözlenen genetik kararsızlık, olgun lenfositlerin orijin aldığı kök hücre soyunda biriken mutasyonları da yansıtabilir124. Endojen DNA hasarının büyük bölümü, organizmanın detoksifikasyon mekanizmasından kaçan reaktif oksijen türleri tarafından tetiklenir. Reaktif oksijen türlerinin yüksek miktarda olduğu durumlarda yakın çevredeki tek zincir kırıkları, çift zincir kırığı formasyonuna neden olabilir ve sonuçta MÇ oluşumu artar. MÇ insidansı DNA tamir sürecinden etkilenir görünmektedir. Bir hücre siklusunda kesip çıkarma ile onarılabilen lezyonların mikroçekirdeğe dönüşümü, insan lenfositlerine DNA onarım inhibitörlerinin artabilir20. eklenmesiyle MÇ Yöntemiyle kültürdeki lenfositlerinde şekil 20’de görüldüğü gibi kromozom kırıklarının ve kaybının, disentrik kromozomların, nükleoplazmik köprülerin (NPB), gen amplifikasyonlarının (Nbud), nekrozis ve apoptozisin değerlendirmesi yapılabilir133. ekil 20: Sitotoksik/genotoksik bir ajana maruziyet sonrasında hücrelerde MÇ 133 Yöntemiyle belirlenebilen oluşumlar 106 Disentrik kromozom, bölünebilen hücrelerde bir sorun olarak karşımıza çıkar. Çünkü anafazda iki sentromer zıt kutuplara çekilirken NPB oluşumuna neden olur. Daha sonra bu köprünün eşit olmayan bir şekilde kırılmasıyla gen amplifikasyonu ve daha fazla sayıda köprükırılma-füzyon olayları birbiri ardına gerçekleşir (Iekil 21). Bunun sonucunda mutasyonda aşırı bir artış görülür. Gen amplifikasyonları onkogen miktarında değişime neden olabilir ve bu durum kanser riskinde artışı yol açabilir134. ekil 21: Köprü-kırılma-füzyon ve gen amplifikasyonu döngüsü 134 Sağlıklı bireylerin lenfositlerinde tek bir binükleer hücredeki MÇ sayısı 0-3 arasındadır. Ama genotoksinlere ve yaşa bağlı olarak 3’den fazla olabilir121. Yaş ve cinsiyet MÇ indeksini etkileyen en önemli demografik değişikliklerdir. İlerleyen yaşla MÇ frekansında artış olduğu gösterilmiş ve bu durum DNA onarım kapasitesindeki bozulmayla ilişkilendirilmiştir. MÇ, kadınlarda yaş gruplarına bağlı olarak erkeklerden daha fazladır ve yaşla daha artmaktadır. MÇ frekansı; folat eksikliği, vitB12 ve homosisteinin plazma seviyeleri gibi diyet faktörlerinden de etkilenir. Çeşitli biyolojik faktörler ve deneysel değişiklikler MÇ frekansının 107 değerlendirmesini etkileyebilir. Örneğin; laboratuar şartları, farklı teknisyenlerin MÇ sayımları en önemli faktörler arasındadır131. Yapılan çalışmaların sonucunda periferal kan lenfositlerindeki MÇ formasyonu, kanser riskini önceden bildiren bir biyogösterge olarak kabul görmektedir134. Bu veriler deneysel, mekanistik ve ilgili çalışmalardan toplanan delilleri destekler ve güçlendirir. Lenfositlerde ölçülen genetik hasarın büyüklüğü, hedef dokulardaki erken karsinojenik olayların oluşumunu yansıtır125. 2.9.4. FISH Yöntemi (Fluoresan İn Situ Hibridizasyon) FISH, hücrelerdeki kromozomal değişiklikleri tayin etmek için floresanla işaretlenmiş DNA problarının kullanıldığı bir tekniktir136. Bir hücredeki makro ve mikro çekirdeklerde FISH sinyallerinin tayin edilebilmesi, 1995’den beri yapılan anöploidi çalışmalarındaki büyük ilerlemeyi göstermektedir127. Marmur ve Lane 1960’da DNA çift sarmalını oluşturan komplementer iplikçiklerin kontrol altında tutulan tepkimelerle birbirlerinden ayrılıp tekrar eşleşebileceğini göstererek In Situ Hybridization (ISH) Yöntemine ilk adımı atmışlardır17. 1969’da Pardue ve Gall, ISH tekniğini geliştirdi. ISH, morfolojik olarak iyi korunan metafaz veya interfaz hücrelerinde radyoizotop kullanarak nükleik asitle ilişkili reaksiyonların sonuçlarını görüntülemeye izin veren bir tekniktir137. O yıllarda nükleik asitleri tek işaretleme yolunun radyoizotoplar ve hibritleri görüntüleme yolunun da otoradyografi olması nedeniyle Gall ve Pardue tek zincirli RNA probunu moleküler tritium radyoizotopuyla yöntemlerle işaretlemişlerdir. klonlanması ve Nükleik radyoaktif asitlerin yöntemlerin iyileştirilmesiyle ISH’in kullanım alanı genişlemiştir. Duyarlı bir yöntem 108 olmasına karşın radyoaktivitenin tehlikeli, raf ömrünün kısa olması ve otoradyografinin zaman alıcı olması nedeniyle ISH sadece araştırma laboratuarlarında uygulanmıştır. 1981’de Langer’in ilk rayoaktif olmayan DNA işaretleme yöntemi ile, non-izotopik in situ hibridizasyon (FISH) geliştirilmeye başlandı17. Diğer enzimatik veya floresan yöntemleri kullanarak işaretleme yapılması, radyoaktif olmayan tespit metotlarının geliştirilmesi, teçhizatlı mikroskopların, filitrelerin, kameraların ve imaj analizlerinin kullanılması sonucunda FISH, mevcut sistemlerle yer değiştirdi ve geniş olarak kullanılmaya başlandı138. Floresan in situ hibridizasyona dayanan teknikler moleküler genetik ve konvansiyonel sitogenetik arasında köprü vazifesi görmektedir. FISH temeline dayanan metodlar hematolojik malignitelerin ve solid tümörlerin sitogenetik analizini büyük ölçüde artırmıştır. Gerek FISH teknolojisine olan ilgi, gerekse konvansiyonel sitogenetikteki zorluklar, renkli karyotipleme (multipleks FISH), fiber FISH, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, polipeptid nükleik asit problar ve padlock problar gibi FISH'e dayanan yeni teknolojilerin gelişmesini sağlamıştır139. FISH analizi metafaz indeksi yüksek olduğu için lenfositlerde ve fibroblastlarda kolayca uygulanabilir. Metafaz indeksi düşük olan lenfoblastoid ve tümör “cell line” larında ise kullanımı daha zordur140. FISH tekniğininin uygulanabildiği hücreler141: • Periferal kan • Kemik iliği aspirasyonu • Lenf nodları ve doku biyopsisi • Serebrospinal sıvı • Plevral sıvı • Formalin ile fikse edilmiş parafine gömülmüş doku 109 ISH Yöntemi diğer genotoksik yöntemlerle kombine olarak kullanılabilmektedir. Comet-FISH Yöntemi hücrelerde bölgeye özgü DNA hasar ve tamirini tayin etmekte kullanışlı bir yöntemdir. Comet Yöntemiyle sadece DNA hasarının düzeyi tespit edilirken, FISH kombinasyonuyla hasarlı ve hasarsız comet bölgelerinde prob uygulanan dizilerinin gözlenmesine imkan sağlanır142. Bukkal ve ürotelial epitel gibi eksfoliye epitelde yada lenfositlerde MÇ ile kobine FISH Yöntemi kullanılarak oluşan MÇ’in tam kromozomdan mı, yoksa kromozom kırığından mı orijin aldığı tespit edilebilir143, 144. 2.9.4.1. FISH Kombine MÇ Yöntemi MÇ analizi, klastojen ve anöploidojenlere maruziyeti belirleyebilir145. Fakat MÇ formasyonunun ayırımını yapamaz. Mikro çekirdek tetikleme mekanizması, ancak MÇ içinde kinetokor proteininin varlığı veya yokluğunun tayini ile klastojenik ve/veya anojenik olarak nitelenebilir127. Gözlenen mikroçekirdeğin orijinini belirlemek için, MÇ tekniği ile sentromerik problu FISH’in kombine edilmesi klastojenik ve anojenik ajanları ayırt etmekte kullanışlı bir görüntüleme tekniği olduğunu düşündürmektedir146 (Iekil 22). MÇ’in oluşumunun tam kromozomdan mı yoksa asentrik kromozomdan mı kaynaklandığıyla ilgili ilk çalışmalar, tam kromozom içeren MÇ’in daha büyük olacağı farz edilerek büyüklük temeline göre yapıldı122. Anojenler çok miktarda MÇ indükleseler bile klastojenler de, birden fazla asentrik fragman içeren çok miktarda MÇ indükleyebilir olduğundan dolayı, MÇ çapının ölçümü bugünlerde sadece tarihsel bir değere sahiptir. Kromozom spesifik probların kullanımı interfaz lenfositlerinde kromozom kayıp veya kazancınının indüklenmesini tayin edebilir. Ama pansentromerik prob gibi kromozoma spesifik olmayan 110 probların kullanımı, sadece kromozom kırıklarını tayin etme kısıtlamalarına karşın, görüntüleme için daha güvenilir olmaktadır147. FISH-MÇ tekniğinde gözlenen mikroçekirdeğin orijinini S+MÇ ve SMÇ şeklinde açıklanır130: • S-MÇ (Sentromer negatif MÇ): MÇ’de floresan sinyalin yokluğu olup, kromozom kırığından orijin alır (klastojenik etkinin bir sonucu olarak)130 (Iekil 23). • S+MÇ (Sentromer pozitif MÇ): MÇ’deki sentromerik sinyal tam bir kromozomu içerir (anojenik etkinin bir sonucu olarak)130. MÇ’de probun hedeflediği bölgedeki kırıktan orijin alan bir kromozom fragmanı içeriyorsa MÇ’de sinyal vardır ve bu durum yanlış tespittir122 (Iekil 23). 128 ekil 22: MÇ tekniği ile sentromerik problu FISH’in kombine edilmesi 111 ekil: 23: a) Hibridizasyon bölgesindeki kırık, b) Hibridizasyon bölgesi dışındaki kırık, c) Kromozom kaybı veya ayrılamaması 122 “İn situ” mikroskop lamına fikse edilen hücrelerin çekirdeği içinde hibridizasyonun meydana geldiği yer demektir148. FISH, spesifik DNA dizisinde çekirdekte floresan moleküllerinin birikmesini gerektirir138. Kısaca FISH; hücre veya doku fiksasyonu, hedef DNA’nın denatürasyonu, floresanla işaretlenmiş probun hibridizasyonu, yıkama ve prob tayininden oluşan çok basamaklı bir prosedürdür149. Yöntemin 6 temel aşaması vardır17 (Iekil 24): 1) Probun işaretlenmesi 2) Dokunun fikse edilerek hibridizasyona hazırlanması 3) Prob ile hedef dokunun denature edilmesi 4) Denatüre edilen tek iplikli DNA prob ile hedef DNA’nın hibridizasyona sokulması 5) Hibridizasyon sonrası yıkamalar 6) Prob DNA ile hedef DNA’dan oluşan hibrid molekülün görüntülenmesi 112 ekil 24 : İn situ hibridizasyonun mekanizması 150 Problar, non-izotopik yöntemlerle direkt ve indirekt şekilde görüntülenebilir. Direkt yöntemde görüntülenen aracı molekül, doğrudan DNA probuna bağlandığı için hibridler hibridizasyondan hemen sonra mikroskopta görülebilir (Iekil 25). Bu yöntemde en önemli noktalardan biri, prob ile aracı molekül arasında oluşan bağın ağır hibridizasyon ve hibridizasyon sonrası yıkama aşamalarına dayanmasıdır. Ancak yöntemin duyarlılığı indirekt yönteme göre 5-10 kat daha azdır. Bu nedenle daha çok alfa satellit DNA’ları gibi kozmitlere oranla daha büyük hedeflerin görüntülemesinde kullanılır. Anti-floresein antikorlarından yaralanılarak sinyali çoğaltmakla duyarlılık artırılabilir. Çok renkli FISH uygulamaları için elverişli olması ve hibridizasyon yöntemini hızlandırması nedeniyle direkt yöntem prenatal tanıda ve preimplantasyon tanısında da tercih edilmektedir17. 113 ekil 25: Doğrudan fluorescein işaretli probla hedef DNA’nın hibridizasyonu 17 İndirekt yöntemde aracı molekül, DNA probunun kimyasal ya da enzimatik olarak modifiye edilmesiyle proba integre edilir. Aracı molekül ancak sitokimyasal afinite tepkimeleriyle probun görüntülenmesini sağladığı için görüntüleme dolaylı yoldan gerçekleşir17. Görüntülemede 3 çeşit aracı molekül kullanılır. Bunlar: enzimler, florokromlar ve kolloidal altındır17. En sık kullanılan enzimlerden alkalin fosfataz sitokimyasal yöntemlerle ışık yada ile peroksidaz, refleksiyon kontras mikroskobuyla görülebilen renk tepkimeleri oluşturur17. En sık kullanılan florokromlar ise, uygun filtreler yardımıyla floresan mikroskopta görülebilen ve yeşil floresan veren FITC, kırmızı floresan veren Rhodamin ve Teksas kırmızısıdır. Ayrıca amino metil kumarin asetik asit ve Cy3 gibi spektrumu maviden kırmızı ötesine dek uzanan florokromlar sayesinde çok renkli FISH Yöntemi uygulanabilmektedir17. Kolloidal altının oluşturduğu sinyaller ise, istenirse gümüşle çoğaltılarak ışık mikroskobuyla görüntülenir17. 114 Genellikle FISH için kullanılan probların hepsi haptenler veya florokromlar ile işaretlenir. işaretlemedir149. Günümüzde bulunabilmeleri nedeniyle Alternatif pratik direkt bir yaklaşım olmaları florokromla ve da PCR ticari işaretli ile olarak problar kullanılmaktadır137. Analiz edilmek istenen hedef hücreler ya da metafaz kromozomları, klasik sitogenetik yöntemlerle elde edilen dokulardan hazırlanarak lam üzerine yayılır. Prob DNA’sının hedef DNA ile hibridize olması için ilk şart, her iki DNA’nın da tek zincirli hale getirilmesi yani denatüre edilmesidir. Nükleik asitler, komplementer dizilerine bazlar arasındaki zayıf hidrojen bağlarıyla bağlıdır. Hibridizasyondan önce alkalin ortamda ya da yüksek pH ve ısı yardımıyla bu bağlar kırılarak DNA molekülü tek zincirli hale getirilebilir. Ancak yüksek pH ve ısı, hücre morfolojisini bozduğu için, hidrojen bağlarının kırılmasını sağlayan formamid kullanılarak denatürasyon ısısı düşürülmektedir. Prob ve hedef DNA’nın birlikte denatürasyonuna olanak veren bu yöntem kolay olduğu ve iyi sonuç verdiği için daha sık kullanılmaktadır. Ancak uygun denatürasyon ısısı ve süresi her prob ve hedef DNA için deneysel olarak saptanmalıdır. Uzun DNA parçaları, kısa olanlara göre daha zor denatüre olur. Denatürasyon ısısı, başka bir deyişle DNA’nın stabilitesi içeriğindeki GC miktarı ile doğrudan ilişkilidir. Bir DNA’daki GC çiftinin molar oranı arttıkça erime ısısı da artar. Erime ısısı ortamdaki çift zincirli DNA’ların yarısının tek zincirli hale geldiği yani denatüre olduğu ısıdır17. Hibridizasyon, denatüre edilmiş DNA’nın erime ısısından daha düşük bir ısıda komplementer iplikçiği ile eşleşmesine bağlıdır. Erime değerini ve renatürasyonu etkileyen parametreler; ısı, pH, hibridizasyon solüsyonundaki bir değerlikli katyonların konsantrasyonu ve organik eriyiklerdir17. 115 Isı: Denatüre edildikten sonra iki DNA molekülü en hızlı 25°C’de hibridize olur17. pH: Hibridizasyon hızı 5-9 arasındaki pH değerlerden etkilenmez. Bu nedenle hibridizasyon solüsyonu olarak daha çok pH’ı 6,5-7,5 arasında olan 25-50mM fosfat içeren tampon çözeltiler kullanılır17. Bir değerlikli katyonlar: Sodyum iyonu gibi bir değerlikli katyonlar nükleik asitlerle, özellikle de fosfat gruplarıyla elektrostatik etkileşime girer. Bu nedenle SSC gibi yüksek oranda tuz içeren solüsyonlar, çift sarmalın iki iplikçiği arasındaki elektrostatik itme gücünü azaltarak hibrit molekülün stabilitesini artırır17. Organik eriyikler: Formamid gibi organik eriyikler çift sarmallı polinükleotidlerin termal stabilitesini azaltarak hibridizasyonun 6575°C’den daha düşük derecede yapılmasını sağlar. %50 oranında formamid içeren hibridizasyon solüsyonu kullanıldığında, hibridizasyon 30-45°C’de gerçekleştirilebilir. Bu da morfolojinin korunmasını sağlar. Işık formamidi hızla iyonlaştırdığı için hibridizasyon işlemi karanlıkta yapılmalıdır17. Hibridizasyon için en uygun ortam koşullarının belirlenmesinde; probların boyu, konsantrasyonu ve dekstran sülfat solüsyonunun kullanımı da önemlidir17. Probun boyu hibridizasyon süresini ve termal kararlılığı etkiler. Çözeltideki DNA’nın renatürasyon hızı, tek zincirli DNA parçasının uzunluğunun kare köküyle orantılıdır. Bu nedenle uzun problar daha hızlı hibridize olur. Ancak kısa probların yoğun hücre matriksinin içine girmesi ya da kromozomlarla hibridizasyonu daha kolay olduğu için FISH Yönteminde yaklaşık 200-500 baz çiftinden oluşan kısa problar tercih edilir17. Probun konsantrasyonu ilk birkaç bazın eşleşme sayısını etkiler. Nükleasyon tepkimesi adı verilen bu tepkime hibridizasyon hızını 116 belirler. Prob ne kadar konsantre ise hibridizasyon hızı o kadar artar17. Dekstran sülfat hibridizasyon solüsyonunun bileşiminde yer alır. Sulu çözeltilerde hidrate olduğu için makromoleküllerin suyla birleşmesini önleyerek prob konsantrasyonunu, dolayısıyla da hibridizasyon hızını artırır17. Hibridizasyon genellikle çok sert olmayan ortam şartlarında yapıldığı için, prob komplementer dizilerinden başka dizilerle de eşleşebilir. Ancak spesifik olmayan ve sinyal gürültüsü yaratan bu eşleşme nedenleriyle oluşan stabilitesi zayıf hibrid molekülleri hibridizasyon sonrası yıkamalar ile ortamdan uzaklaştırılır. Spesifik olmayan hibrid molekülleri ile hibridize olmamış probları ortamdan uzaklaştırmak amacıyla yıkamalar dilüe tuz çözeltisi (formamid/SSC) kullanılarak hibridizasyon ısısından biraz daha yüksek ısıda gerçekleştirilir17. Kromozomların sentromerleriyle ilişkili kinetokor proteininin varlığı veya asentrik kromozom fragmanlarından dolayı yokluğunu tanımlama amacıyla, floresanla işaretlenmiş DNA’yı görüntülemek için kullanılan karşı boyalar (antifade) genellikle kırmızı floresan veren PI ya da mavi floresan veren DAPI’dir127. FISH Yöntemi ile hibrid moleküllerin görüntülenmesinde uygun filtre setleri bulunan standart floresan mikroskoplar kullanılır. İkili ya da üçlü filtre setlerinin geliştirilmesi iki ya da üç farklı florokromla işaretlenmiş probların aynı anda görülebilmesini sağlamıştır. Floresan mikroskobu ile elde edilen görüntüler dijital görüntüleme ve görüntü işleme sistemleri yardımıyla güçlendirilebilmekte, saklanabilmekte ve sinyal yoğunlukları ile sinyaller arası uzaklıklar ölçülebilmektedir17. Problar, sıklıkla izole edilen DNA fragmanlarından türetilir. Prob, hedefine uygun hiridizasyon için yeterince uzun olmalıdır fakat 117 hibridizasyon işlemini engellemek için çok da büyük olmamalıdır151. Floresan boyanın çok sayıda rengini birini bağlayarak bu problar işaretlenir. Sinyal, prob hibrizidasyonu ile görünür hale getirilir138. Problar tek zincirden oluştuğu için onlar DNA’nın tamamlayıcı zincirine bağlanabilir. Prob bir kromozoma bağlandığı zaman onun floresan işaretlenmesi, onun lokasyonunu görmek için araştırıcılara bir yol sağlar152. Çekirdekteki hedef DNA’ya probların ulaşması, hücrelerin geçirgenleştirilmesi ile sağlanabilir. İnterfaz sitogenetiğindeki protokoller temel olarak incelenilen materyale ve uygulanan probun çeşidine bağlıdır149. Tüm genomdan, klonlanmış DNA parçacıklarından (maya yapay kromozomları, kozmit, faj ve plazmitler), polimeraz zincir tepkimesiyle çoğaltılan DNA’dan ya da sentetik oligonükleotitlerden hazırlanabilen üç çeşit FISH probu vardır152: 1) Tam kromozom probları: Kromozom boyunca değişik bölgelere özgü floresan işaretli birçok DNA dizisi içermesi nedeniyle tüm kromozomu p terminalinden q terminaline kadar boyayan problardır. Özellikle kaynağı belirlenemeyen marker kromozomların, karmaşık translokasyonların ve “de novo” yapısal anomalilerin tanımlanmasında kullanılır. Tam kromozom probları 17 kromozom anomalilerinin tespiti için de özellikle kullanışlıdır . 2) Lokusa özgü işaretleme probları: Bu problar 15 ila 500 kilobaz uzunluğundadır17. Bir kromozomun özel bir bölgesine bağlanır. Bir genin küçük bir kısmını izole edildiği zaman ve genin yerleştiği kromozom tespit edilmek istediğinde bu tip problar kullanışlıdır152. Metafaz kromozomlarında ya da interfaz nükleuslarındaki hedef lokusta parlak bir floresan sinyal verir. 118 Kromozomların belli bir bölgesindeki delesyon, duplikasyon ya da inversiyonlar ile özellikle tümör hücrelerinde karmaşık translokasyonların kırık noktaların belirlenmesinde ve birçok mikrodelesyon sendromunun belirlenmesinde kullanılır17. 3) Alfoid ve sentromerik problar (Tekrarlayan dizi probları): Her bir kromozomun ortasında bulunan tekrarlayıcı dizilerinden yaratılır. Araştırıcılar bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup olmadığını tayin etmek için bu probları kullanır152. Tüm insan DNA’sının yaklaşık %10-20’si satellit DNA adı verilen tekrarlayan dizilerden oluşur. Satellit DNA özellikle kromozomların sentromer ve sentromeri çevreleyen bölgelerinde bulunur ve 105-106 baz çifti uzunluğunda kısa tandem tekrarlar yapar. Bu alfa satellit, beta satellit ya da diğer satellit DNA dizilerini oluşturan monomerik birimler birbirinden öyle farklıdır ki, birçoğu kromozoma özgü birer gösterge olarak kullanılabilir. Tekrarlayan dizilerin bu özelliğinden yararlanılarak birçok kromozoma özgü tekrarlayan dizi probu izole edilip ticari klonlanarak ticari kullanıma sunulmuştur17. Bu problar aynı zamanda bir bireyin belli bir kromozomdan genetik materyalin kaybolup kaybolmadığını tayin etmek için “lokusa spesifik problar” ile kombinasyonla da kullanılabilir152. Tandem tekrarlar yapan dizilerden en iyi incelenmiş olanı alfa satellit DNA’sıdır153. Bir monomeri 171 baz çifti içeren alfa tekrarları herbir kromozomun lineer uzunluğunun %2-5’ini kaplar ve tüm insan kromozomların sentromerinde birkaç bin kopya olarak bulunur. Bu nedenle alfoid problar da denilen alfa satellit dizileri işaretlenip hücrelerle hibridizasyona sokulduğunda sentromerde ya da bazı kromozomların heterokromatik bölgelerinde ve interfaz nükleusunda oldukça parlak kuvvetli bir sinyal alınır. Bu özelliklerinden dolayı alfoidler, sentromerlerin incelenmesinde, ring kromozomların varlığının belirlenmesinde ve anöploidilerin prenatal tanısında kullanılmaktadır. İnsan alfoid DNA’sının kromozoma özgü alfa tekrar alt ailelerini içerdiğini göstermişti. Nükleotidlerindeki bazı 119 değişiklikler ile belirgin olan alfa tekrar alt aileleri arasında bu değişiklikler yaklaşık %30 oranında sekans varyasyonuna yol açar17. FISH Yönteminin avantajları122: • Kullanımının kolay olması122, • Duyarlı olan floresan işaretli probların daha kararlı ve rezolüsyon düzeyinin daha yüksek olması17, • Farklı renklerle işaretli problar kullanılarak aynı hücrede iki ya da daha çok dizinin aynı anda görüntülenebilmesi17, • DNA’nın üç boyutlu yapısı bozulmadan DNA dizilerinin yerinin hem interfaz nükleusunda hem de metafaz kromozomlarında 17 saptanabilmesi , • İşaretleme molekülleriyle floresan maddelerin birlikte satışa sunulmuş olması nedeniyle yöntemin kolay ve güvenilir olarak uygulanabilmesi17, • Kullanılan probun uzunluğuna ve yapısına bağlı olarak belli bir türün tüm genomunu, p terminalinden q terminaline kadar kromozomlarını, kromozomlardaki tekrarlayan bölgelerini ya da tek kopya dizilerini görüntülemenin mümkün olması17, • Kısa süreli kullanımda gerekli olan özel bir saklama olmaması122, • Prob ve antikor penetrasyon problemlerinin proteinaz ve/veya deterjanların kullanımı ile giderilebilmesi122, • DNA problarının nicelik elde edilebilmesi ve değişkenlikte minimal sınırlamalarla 122 , • Lamların standart sitogenetik tekniklerle hazırlanabilmesi122, • Sinyallerin genellikle çok güçlü olması122, 120 FISH Yönteminin dezavantajları122: • Eğer ajan, prob ile hedeflenen bölgede kırığa neden olmuş ise sonuçlar hatalı yorumlanabilir. • DNA probları genellikle türe özgüdür. • Bazı problar bir türün tüm kromozomlarını aynı etkinlikle işaretlemez. • Sinyaller farklı kromozomlarda farklı niteliklere sahiptir. • Pahalı ve zaman alıcıdır. • Denatürasyon süreci hücre morfolojisine ve zayıf kromatine zarar verebilir. • FISH sinyalinin sayısal değerlendirmesi için yaklaşımların gelişimindeki artan ilgiye rağmen, henüz standardize edilmiş ve yaygın kullanılan bir protokol yoktur154. FISH ile yapılan analizlerin doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği; kullanılan probların duyarlılığına, özgünlüğüne ve hibridizasyonun verimlilik derecesine bağlıdır. Örneklerin hazırlanma biçimi, hücre geçirgenliği, probların yapısı ve uzunluğu ise verimliliği etkiler17. Hibridize edilen dizilerin incelenmesi epifloresan mikroskop kullanarak yapılır. Esas lambadan beyaz ışık filtre edilir. Floresan moleküllerin sitümülasyonu için sadece uygun dalga boyları numuneye ulaşır. Florokromla yayılan ışık genellikle ikinci optik filtre yardımıyla sitümülasyon ve yayılma ışığı arasındaki farka izin veren daha uzun dalga boylarıdır. Bu nedenle karanlık bir zeminde parlak renkli sinyalleri görmeyi mümkün kılar. Aynı hedefteki birçok farklı probu incelemeye olanak veren 121 şiddetli sitümülasyonu ve yayılma bantları arasındaki farkı da ayırt etmek mümkündür155. Klinik uygulamalar göz önüne alındığında FISH yeni yeni bir araştırma yöntemi olarak kabul edilmektedir. Klinik sitogenetikte bir çığır açan FISH Yönteminin kromozomların tekrar bölgelerine özgü alfoid problar kullanılarak, interfaz nükleuslarında da uygulanmasıyla “interfaz sitogenetiği” adı verilen yeni bir alan doğmuştur17. 2.9.5. Eksfoliye Bukkal Epitelde MÇ Yöntemi Bu yöntem, insan bukkal mukoza hücrelerinde DNA hasarının, kromozomal instabilitenin, hücre ölümü ve rejeneratif potansiyelin incelenmesine imkan veren minimal invaziv bir metottur18. Vücuttaki organ ve dokuların yenilenme kapasitesi sağlıklı yaşlanmanın temel ilkesidir. Yenilenme; çoğalmakta olan bazal hücrelerin sayısına ve bölünme oranına, genomik stabilitesine, hücre ölümü eğilimine bağlıdır. Bukkal mukoza hücreleri, insanlarda ektodermden menşey alan epitel dokusunun yenilenme kapasitesini incelemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Bukkal epiteldeki bazal hücrelerin ölü hücrelere oranı bu dokunun yenilenme kapasitesinin bir göstergesidir. Bukkal mukoza potansiyel karsinojenlere karşı bir bariyer oluşturur18. Kanserlerin %90’dan fazlası epitel dokuda ortaya çıkar. Bu dokular karsinojenlerin çoğunun hedef dokusudur131. Lenfosit kültürlerindeki çalışmalara paralel olarak MÇ tekniği, eksfolyatif hücrelere 1982 yılında ilk defa Stich ve arkadaşları tarafından uygulanmıştır. İnvaziv olmayan bu teknik sayesinde toplanan ağız, burun, bronş ve ürotelyal eksfolyatif hücrelerde kimyasalların ve enfeksiyonların etkilerini değerlendirmek mümkün olmuştur. Hızla çoğalan bu epitelyal dokular çevreleriyle sürekli temas halindedir ve epitelin 122 yüzeyel tabakasını oluşturan eksfolyatif hücreler kolaylıkla elde edilebilmekte, dolayısıyla uğradıkları genotoksik hasar da kolaylıkla gösterilebilmektedir. Böylece bu hücreler ait oldukları dokularda meydana gelen morfoloji bozukluğunu, kromozom kırıklarını, premalign değişiklikleri ve kanseri gösterebildiklerinden bir biyogösterge olarak değerlendirilebilmekte ve karsinojenlere maruz kalmış bireylerde artmış kanser riskini göstermek amacıyla kullanılabilmektedir126. Sigara içmek, tütün çiğnemek gibi faktörlerin, tıbbi tedaviler, potansiyel mutajenik veya karsinojenik kimyasallara mesleki maruziyet gibi genotoksik etkilerin gösterilmesinde, Bloom sendromu gibi herediter genomik bozuklukların belirlenmesinde ve normal yaşlanma ile Down sendromu, Alzheimer gibi hastalıklarda görülen erken yaşlanma arasındaki farklılıkları değerlendirmekte eksfoliye bukkal hücreler başarıyla kullanılmıştır18. Bukkal epitel, çevresel ve mesleki olarak inhalasyonla maruz kalınan genotoksikanların maruziyetini incelemek için alternatif bir dokudur. İnsan hücrelerinde klastojenik ve anojenik olayları çalışmaya izin veren yeni moleküler sitogenetik tetkikler ihtiyaç duyulan duyarlılığı sağlayabilir156. DNA hasarının (örneğin: MÇ ve/veya nükleer bud), sitokinetik defektlerin (örneğin: binükleer hücreler), çoğalma potansiyelinin (bazal hücre frekansının), hücre öümlerinin (örneğin: çekirdeğin hücre içine dağılması, piknotik ve karyolitik hücreler) biyogöstergesi olarak Bukkal MÇ Yöntemi kullanıldı. Yöntem DNA adduct ölçümü için moleküler probların kullanımını da mümkün kılmaktadır18. Bukkal mukoza 4 katmandan oluşur (Iekil 26). En dıştaki stratum korneum, keratinize hücre tabakasıdır. Yüzeyel dokunun yıpranıp, dökülen hücrelerini oluşturur. Bu tabakanın altında stratum granülozum ve stratum spinozum vardır. Bu tabakalarda farklılaşmış, apoptotik ve nekrotik hücreler bulunur. Bu tabakaların altında stratum germinativum tabakası yer alır. Bu tabaka aktif olarak bölünebilen bazal hücreler ve 123 bazal kök hücrelerden oluşur. Bu hücreler bukkal mukozanın profilinin, yapısının ve bütünlüğünün devamlılığını ve değişimini sağlarlar18. 18 ekil 26:Bukkal mukozanın yapısı ve oluşan hücreler Yüzeyel epitel hücreleri sürekli olarak dökülür ve skuamoz epitel katmanlarının bazal hücre suşlarındaki hücre bölünmesi ile yer değiştirir18. Bu hücreler bölündüğü zaman, kromozom fragmanları veya tam kromozomlar mitotik anafaz esnasında geri kalabilir ve kardeş hücrelerin sitoplazmasında mikroçekirdek denilen küçük nükleer partiküller şeklinde görülebilir. Kromozomlar anafazda hatalı da ayrılabilir. Hücrelerin olgunlaşması ve yüzeye göç etmesinden sonra sitogenetik değişiklikler dökülen hücrelerden analiz edilebilir156 (Iekil 27). Standart prosedürlerle dökülen hücreler toplanır. Örnekleme yapılırken her iki yanaktan bukkal mukozada tek bir bölgeden değil geniş bir alandan örnek alınmalıdır. Hücre dağılımını sabitlemek için örnekleme metodunu aynen korumak önemlidir. Aynı alanda tekrarlayan sert sürüntü yapılması daha az 124 farklılaşmış bazal tabakadan hücrelerin toplanmasına neden olacağından dikkatli olunmalıdır18. 18 ekil 27: Bukkal mukozanın farklılaşması Hücreler lamlara sürülerek yayılır, fikse edilir ve Giemsa veya Feulgen gibi kromatin spesifik boya veya Hoechst 33258 veya propidium iodid gibi floresan boyalarla boyanır131. Yapılan çalışmalarda Giemsa, May-Grunwald Giemsa ve/veya Leishmann’s gibi Romanowsky tip boyalarla MÇ frekansında hatalı pozitif sonuçlar elde edilebildiği gösterildi18. Bu boyalar keratin cisimciklerini de boyar. Bu da DNA hasarının hatalı değerlendirilmesine yol açar. Bu yüzden bu tip analizler için uygun değildir. Feulgen’inin önerilme nedeni: Floresan ışığı altında sürekli gözlenebilen lamlar elde edilebilmesindendir. MÇ sonuçlarını yorumlamada en önemli unsur, hücre kinetikleridir. Dökülen epitel hücrelerinde gözlenen MÇ’i eğer hücreler yüzeyde ise teşvik etmez, ama bazal tabakada ise teşvik eder. Genellikle, hücrelerin yüzeye çıkması ve dökülmesi 7-21 gün kadar sürer (Iekil 27). Bu nedenle akut maruziyetin 125 genotoksik etkilerini 7-21 gün sonra gözlemlemek mümkündür. İdeal olanı örneklemenin akut maruziyetten en az 7 gün sonra, 28 gün veya daha sonra tekrarıyla biyogöstergelerin incelenmesidir. Kronik maruziyette ise en az 3 ayda bir, çoklu örnekler alınmalıdır. Farklı hücre tipleri ve çekirdek anomalilerini skorlama kriterleri Tolbert ve arkadaşlarının tanımladığı şekilde yapılır. Bu kriterler bukkal hücreleri sınıflamak için tasarlanmıştır. Bukkal mukozada mikroçekirdekli hücreler için temel alınacak frekans genellikle 1000 hücrede 0,5-2,5 MÇ ‘dir. Çok sayıda MÇ’i olan hücreler sağlıklı kişilerde nadirdir olup, radyasyon veya genotoksik ajanlara maruz kalan bireylerde daha yaygındır. Bu hücrelerde bir ana çekirdek ve bir yada daha fazla MÇ denilen daha küçük çekirdeksel yapılar bulunur. MÇ, yuvarlak veya oval olup, ana çekirdeğin çapının 1/3 ve 1/16’sı kadardır, ana çekirdekle aynı densitede ve aynı boyanma özelliğindedir. MÇ’li hücrelerdeki çekirdekler normal hücrelerdeki çekirdek morfolojisine sahiptir. MÇ, hücre sitoplazması içinde yerleşmiştir (şekil 28). MÇ’in varlığı, hücre bölünmesinin erken dönemlerindeki kromozom kaybı veya kromozom parçalanmasının bir göstergesidir. MÇ sadece aynı şekilde boyanmış farklılaşmış hücrelerde sayılır. Bazal hücrelerde de saymak mümkündür, ama bu hücre tipinin frekansının düşük olması nedeniyle pratik değildir. Piknotik hücreler, kondanse kromatinli veya karyorhektik çekirdeği olan hücreler MÇ için sayılmaz18 (şekil 29). Bukkal epitelde yapılan çalışmalarda MÇ genellikle 1000 hücrede değerlendirilirken, etkinliği arttırmak için 3000 hücrede MÇ’in değerlendirildiği çalışmalar da vardır157. 126 18 ekil 28: Bukkal mukozada mikroçekirdekli hücre 18 ekil 29: Bukkal mukozada değerlendirmeye alınan hücre tipleri 127 2.9.6. Kronik Böbrek Hastalığında Lenfositlerde Comet, MÇ ve Eksfoliye Bukkal Epitelde MÇ Yöntemi İle Kromozomal Hasarın Saptanması Kanser, spesifik hücresel genlerdeki mutasyonların ilerleyici bir şekilde birikmesiyle karakterize kompleks bir süreçtir. Bu duruma onkogenlerin aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu sebep olur. Kanser hücrelerinin sonuçlardan biri nokta kromozomal değişikliklerin oluşum mutasyonlarını, oluşumunu ve gelişmesinde mikrosatellit içeren genetik kesin dengesizliğini, dengesizliğin kazanılmasıdır. Kromozomal değişiklikler; translokasyonlar, delesyonlar, amplifikasyonlar ve anöploidiyle sonuçlanır158. Kronik böbrek hastalığının bir sonucu da, artan kanser riskidir159. Bu fenomenin altında yatan mekanizmalar arasında üremi, mikroenflamasyon, oksidatif ve karbonil stres en önemlileridir19. Artan malignite formasyonu, DNA tamirinin bozulmasıyla ilişkili olabilir. Çünkü DNA hasarını onaran hücresel yetenek, kansere karşı en büyük savunma mekanizmasıdır112. Diyalizin ilk yıllarında malignansi insidansı yüksektir. Çoğu malignansiler için 10 yıllık bir latent dönem vardır. Bu nedenle malign formasyonun RRT’ne başlamadan önce geliştiği söylenebilir. Çünkü genomik hasar, yüksek kreatinin seviyesine sahip olan prediyaliz hastalarında en yüksektir. Bu nedenle kanser riskini azaltmak için, bu hastalarda daha erken diyalizle müdahale avantajlı olabilir. Aksine erken RRT, daha uzun bir diyaliz süreci demektir ki, bu durum da muhtemel kanser riski demektir112. 128 Sağlıklı kişilerle kıyaslanırsa, böbrek nakli yapılmış immün baskılayıcı kullananlarda MÇ frekansında anlamlı bir artış ve nükleer çoğalma indeksinde önemli bir azalma görülmüştür. Transplant alıcılarında malignansi riskine neden olan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Muhtemelen çok sayıda faktör bu konuda rol oynamaktadır: İmmün sistemin kronik stimülasyonu, genetik duyarlılık, çevresel faktörler, onkojenik virüslerin aktivasyonu, immün baskılamanın seviyesi, kullanılan immün baskılayıcı sayısı, cinsiyet, transplantasyon süresi, ek olarak immün baskılayıcıların onkojenik etkileri ve bu bileşiklerin muhtemel koonkojenik özellikleri21. İster prediyaliz ister diyalizde olsun KBH olanlarda ve transplant yapılan yetişkin hastalarda genomik hasar, periferal kan lenfositlerinde MÇ, Comet ve bukkal MÇ ölçümü gibi çeşitli yöntemlerle gösterilmiştir (Tablo 22). 129 Tablo 22: KBH olan yetişkinlerde genomik hasarın incelenmesi Çalışma grubu N:19 PreD N:16 HD N:23 kontrol Maruziyetin kaynağı KBH Yöntem Sonuç Yorum p Referans Lenfositlerde MÇ ↑↑MÇ (HD/kontrol)(44,3±13,7/15,3±4,7) ↑↑ PreD ve HD’de oluşan DNA hasarı bu hastalarda kanser insidansını artırıyor. p< 0.01 p< 0.01 20 (1999) (şekil 30) N:23 PreD N:26 HD N:15 HDF N:21 kontrol KBH KBH ve uzun süreli HD tedavisi DNA hasarını arttırıyor. p< 0.01 p< 0.01 p< 0.01 112 (2001) (şekil 31) N:36 HD N:36 kontrol KBH-HD Lenfositlerde Comet HD DNA hasarı oluşturuyor. Tedavi süresi ile hasar artıyor. p< 0.001 p< 0.001 160 (2002) N:14 Tx N:20 kontrol İmmün baskılayıcı ilaçlar KBH-HD Lenfositlerde MÇ ↑↑Hasta MÇ/ kontrol MÇ (10,5-25)/(2-11,5) ↑↑ İmmünbaskılayıcı ilaçlar DNA hasarı oluşturuyor. p< 0.01 21 (2004) Lenfositlerde MÇ ↑↑MÇ (SHD/DHD)(29,1±5,9/14,8±4,0) ↑↑ DNA hasarı DHD hastalarında SHD hastalarından daha düşük. p< 0.01 19 (2005) ↑↑MÇ (PreD/kontrol)(28,2±9,4/15,3±4,7) ↑↑ Lenfositlerde Comet ↑↑%DNA (PreD/kontrol)(14,7±3,5/10,5±0,8) ↑↑ ↑↑%DNA (HD/kontrol)(16,7±4,2/10,5±0,8) ↑↑ ↑↑%DNA (HDF/kontrol)(15,6±2,1/10,5±0,8) ↑↑ ↑↑DNA hasarı-tedavi süresiyle ↑↑ N:13 DHD N:12 SHD N:12 kontrol N:20 HD N:20 PD N:40 kontrol ↑↑HD de DNA hasarı (x :321,16) 2 ↑↑DNA hasarı-tedavi süresiyle ↑↑ ↑↑MÇ (SHD/kontrol)(29,1±5,9/13,2±3,0) ↑↑ ↔ MÇ (DHD/kontrol)(14,8±4,0/13,2±3,0) KBH Bukkal MÇ ↑↑MÇH (HD/kontrol)(5,6±5,3/1,5±2,0) ↑↑ ↑↑MÇ (HD/kontrol)(5,6±5,3/1,8±2,2) ↑↑ p>0.01 PD, HD’e göre daha emniyetli . Tedavi süresiyle DNA hasarı artıyor. ↔(MÇH;MÇ)(PD/kontrol p< 0.01 p< 0.01 p>0.01 p< 0.01 159 (2008) ↑↑MÇH-tedavi süresiyle ↑↑ HD: Hemodiyaliz, PreD: Prediyaliz, PD: Periton diyaliz, HDF: Hemodiyafiltrasyon, DHD: Günlük HD, SHD: Standart HD ↑↑ (p< 0.01); ↔ (p> 0.01) 130 MN/1000BN 44,3 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 28,2 3-B Sütun 1 15,3 Kontrol SDBH MHD (SDBH: Sondönem böbrek hastalığı, MHD: Sürekli HD) 20 ekil 30: Hastaların binükleer lenfositlerindeki MÇ frekansı 25 20 15 Kuyruktaki DNA(%) 10 5 0 Kontrol KBY Kreatinin >6mg/dL HD HD>10yıl ekil 31: Kontrol, KBH ve HD hastalarında DNA hasarının karşılaştırılması Comet Yöntemiyle 112 131 2.9.7. Çocuklarda Lenfositlerde Comet, MÇ ve Eksfoliye Bukkal Epitelde MÇ Yöntemi İle Kromozomal Hasarın Saptanması KBH olan çocuklarda genotoksik hasar düzeylerinin incelendiği herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Tablo 23‘de çeşitli etkilere maruz kalan çocuklarda kromozomal hasarın saptanmasına yönelik lenfositlerde Comet, MÇ ve eksfoliye bukkal epitelde MÇ Yöntemi ile yapılmış çalışmalar gösterilmiştir. 132 Tablo 23: Çocuklarda 1999-2010 yılları arasında yapılan çalışmalar (Lenfositlerde Comet, MÇ, FISH ve bukkal epitelde MÇ) Çalışma grubu Maruziyet kaynağı Muhtemel Yöntem genotoksik faktör N=30 kontrol N=26 tümörsüz Gomel ç N=16 tiroid CA Gomel ç Yaş (kontrol 14,96±2,17; tümörsüz Gomel ç 10,58±2,09; tiroid CA Gomel ç11,56±2,60) Çernobil kazası 137 N=20 kontrol N=21 hasta yaş ( hasta 6,8±5,0; kontrol 8,8±5,5) N=28 Yaş:3-12 Malign tümör Tarım ilacı Lenfositlerde MÇ DNA hasarının parametresi MÇ Lenfositlerde MÇ MÇ ↑↑ MÇ li h (kontrol 2,4±2,3; hasta (p<0,05) 5,1±3,9) Comet Tail moment Tail length ↔ TMOM Spreyleme öncesi 9,1±3,2 ve sonrası 9,1±3,0 ↔ TL Spreyleme öncesi 43,2±12,7 ve sonrası 39,2±9,6 MÇ ↑↑(hasta MÇ/ kontrol MÇ ↑↑ 5.29±1.67/1.58±0.33) (p< 0.001) MÇ ↑↑ MÇ daha genç grup için (kontrol 4,9± 2,0; maruz 7,0± 2.3) ↔ Yaş ve cinsiyet (p< 0.05) ↑↑DDE, DDT ve bazal DNA hasarı ↔ DDE, DDT ve oksidatif DNA hasarı (p< 0.05) ↑↑Folat tedavisi öncesi lenfositlerde(CD MÇ 10,1±12,1; UC MÇ 5,3±6,1; kontrol MÇ 8,3±11,5) ↑↑Folat tedavisi sonrası lenfositlerde (CD MÇ 6,6±8,3; UC MÇ 18,1±16,7; kontrol MÇ 8,7±10,7) (p< 0.05) Cs Deltametrin ve Bukkal MÇ N=20 hasta N=20kontrol E/K, 3/2 Yaş ort=7,5 Kronik tonsillit Enfeksiyon antibiyotikler N=24 kontrol N=23 maruz yaş (6,6±0,6; 9,0±1,2 şeklinde 2 şerli 2 grup) Hava kirliliği N=118 Yaş:6-13 Sağlıklı çocuk DDE, DDT N=41 hasta N=28 kontrol E (kontrol %54; hasta%59) Yaş ort (kontrol 12,8±3,4; hasta11.8±3,9) Crohn’s Enfeksiyon, ROS, Lenfositlerde MÇ hastalığı (CD) ilaçlar ve ülseratif kolit (UC) PAH’lar Lenfositlerde MÇ Comet ve Modifiye Comet (FPG) N (denek sayısı); E(erkek); K(kız); MÇ (mikronükleus); TL(kuyruk boyu); ↑↑ (p< 0.05); MÇ Sonuç p Diğer test sonuçları ↑↑ MÇ’li bnh (kontrol* 2,0±2,1; tümörsüz Gomel ç 3,61±2,65; tiroid CA Gomel ç* 7,4±4,95) ↔ Yaş ve cinsiyet (p< 0.05) 161 (1999) 162 (2000) İdrarda 3-PBA and Br2CA ve toprakta Deltametrin ölçümleri Referans 163 (2005) ↑↑Hasta (BNh: 3.13±1.2) 164 (2005) Kontrol (BNh:1.43±0.47) (p< 0.001) ↑↑Havada partikül 165 (2006) madde konsantrasyonu (2 bölge arasında) (p< 0.05) 166 (2006) 167 (2007) ↔ (p> 0.05) 133 Tablo 23: Çocuklarda 1999-2010 yılları arasında yapılan çalışmalar (Lenfositlerde Comet, MÇ, FISH ve bukkal epitelde MÇ) (devam) Çalışma grubu Maruziyet kaynağı Muhtemel Yöntem genotoksik faktör Enfeksiyon, Bukkal MÇ, N=41 hasta N=28 kontrol E (kontrol %54; hasta%59) Yaş ort (kontrol 12,8±3,4; hasta11.8±3,9) Crohn’s hastalığı (CD) ROS, ilaçlar ve ülseratif kolit (UC) N=49 kontrol N=92 maruz yaş 9 Hava kirliliği Kurşun N=49 kontrol N=92 maruz yaş 9 Hava kirliliği Kurşun N=21 kontrol N=20 hasta yaş ( hasta 9.8±5.6; kontrol 6.3±5.4) Malign tümör ve kemoterapi Lenfositlerde MÇ N=21 kontrol N=20 hasta yaş ( hasta 9.8±5.6; kontrol 6.3±5.4) Malign tümör ve kemoterapi Bukkal MÇ, N=12 kontrol N=21 pasif içici Yaş (7-10) Pasif sigara maruziyeti Sigara dumanı DNA hasarının Sonuç parametresi p Diğer test sonuçları Referans MÇ ↑↑Folat tedavisi öncesi bukkal epitelde(CD MÇ 1,3±1,0; UC MÇ 1,1±0,8; kontrol MÇ 1,3±1,2) ↑↑Folat tedavisi sonrası bukkal epitelde (CD MÇ 0,9±1,0; UC MÇ 3,3±2,3; kontrol MÇ 1,1±1,1) Lenfosit MÇ, bukkal MÇ’nin 10 katı (p< 0.05) 167 (2007) Lenfositlerde MÇ ve FISH MÇ, S+MÇ, S-MÇ ↑↑ MÇ (kontrol 1,16±1,28; maruz 2,96± 2.36) ↑↑ S+MÇ%/S-MÇ% (kontrol* 31/69; maruz* 52/48) (p< 0.05) ↑↑ Kan kurşun düzeyi maruz grupta (p<0,05) yüksek (p< 0.05) 168 (2007) Lenfositlerde MÇ ve FISH MÇ, S+MÇ, S-MÇ ↑↑ S+MÇ (kontrol 0,53±1,02; maruz 1,64±1,27) ↑↑ S-MÇ (kontrol 0,90±1,19; maruz 1,93±2,78) ↔ Yaş ve cinsiyet Lenfositlerde MÇ li h (kontrol 0,38±0,59) ↑↑ Tedavi öncesi lenfositlerde MÇ li h 2,90±2,51 ↑↑Tedavi sonrası lenfositlerde MÇ li h 7,95±6,77 Bukkal MÇ li h kontrol 0,10±0,20 ↔ Tedavi öncesi bukkal MÇ li h 0,45± 0,81 ↔Tedavi sonrası bukkal MÇ li h 0,81± 1,00 ↔ Yaş ve cinsiyet (p<0,05) (p<0,05) ↑↑ Kan kurşun düzeyi maruz grupta yüksek (p< 0.05) 168 (2007) Comet TL N (denek sayısı); E(erkek); K(kız); MÇ (mikronükleus); TL(kuyruk boyu); ↑↑ (p< 0.05); ↑↑ %DNA TL (kontrol 7,00±0,66; maruz 9,11±0,39) ↔ Yaş ve cinsiyet (p<0,05) 169 (2008) (p>0,05) 169 (2008) (p< 0.05) 170 (2008) ↔ (p> 0.05) 134 Tablo 23: Çocuklarda 1999-2010 yılları arasında yapılan çalışmalar (Lenfositlerde Comet, MÇ, FISH ve bukkal epitelde MÇ) (devam) Çalışma grubu Maruziyet kaynağı Muhtemel genotoksik faktör Partikül madde Yöntem N=24 kontrol (kirlilik az) N=23 maruz (kirlilik yoğun) yaş (7.8) Hava kirliliği N=15 kontrol N=5 grup Yaş (6-15) Petrol endüstrisi PAH’lar Comet N=60 5-10 yaş çocuk N=60 40-50 yaş yetişkin N=60 70-80 yaş yaşlı E/K (20/60) Sağlıklı çocuk γ-irradiation, H202 Comet N=30hasta N=30 kontrol E/K, 15/15 Yaş ort (kontrol 16,80±11,90; hasta 17.07±12.28) Down sendromu Bukkal MÇ N=30 maruz N=30 kontrol E (kontrol %33; maruz %47) Yaş ort (kontrol 7,67±0,95; maruz 8,33±1,24) Pasif sigara maruziyeti Genetik Sigara dumanı DNA hasarının parametresi Lenfositlerde bnh MÇ % MÇ Comet Sonuç p Diğer test sonuçları ↑↑ bnh MÇ [kontrol 5.8 (1–17); maruz 8.0 (4–5)] (p<0,05) ↑↑Havada partikül 171 (2008) madde konsantrasyonu (2 bölge arasında) (p<0,05) TL ve TL (kontrol 12,25; maruz 14,21-42,14) Tail/Head Tail/Head (kontrol 0,63; maruz 0,97-2,83 ↑↑DNA hasarı ve maruziyet arasında Kuyruktaki (↑↑gruplar arasında) DNA % % DNA (çocuk 3,2±0,12; yetişkin 10,2±0,13, yaşlı 22,5±0,18) MÇ Kuyruktaki DNA % N (denek sayısı); E(erkek); K(kız); MÇ (mikronükleus); TL(kuyruk boyu); ↑↑ (p< 0.05); Referans US/EPA TO-13-A 172 methodu ile PAH analizi (2008) ↑↑H202 ve γ-ışınlaması sonrası (en yüksek hasar yaşlılarda, en düşük hasar gençlerde) ↑↑H202, γ-ışınlaması sonrası (en yüksek onarım gençlerde, en düşük onarım yaşlılarda) 173 (2009) ↑↑(hasta MÇ/ kontrol MÇ 14.30±9.35/4.03±1.71 ↔ Cinsiyet Yaş-MÇ frekansı (p< 0.001) ↑↑Hasta (BNh:0.97±1.3) 174 (2009) ↑↑% DNA (maruz 10,73±1,38; kontrol 8,16±1,29) (p< 0.05) (p< 0.05) Kontrol(BNh:0.33±0.66) (r = 0.437; (p< 0.05) p<0.001) 175 (2010) ↔ (p> 0.05) 135 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Materyal ve Çalışma Grubunun Seçimi Çalışmanın deney grubu, Gazi Üniversitesi ve Başkent ÜniversitesiTıp Fakültelerinin Pediyatrik Nefroloji Bölümünde tedavi edilen 2-19 yaş arası toplam 49 çocuktan oluşmaktadır. Bu çocukların 17’si prediyaliz, 15’i hemodiyaliz ve 17’si transplant hastasıdır. Kontrol grubu ise, yaş ve cinsiyet uyumlu sağlıklı 20 çocuktan oluşmaktadır. Çalışma için 07.03.2007 tarih ve 07/39 sayı ile Başkent Üniversitesi’nden Etik Kurul onayı alındı (Ek:1). Çalışma ve kontrol grubunundaki çocukların ebeveynlerinden, çocuklarının çalışmada gönüllü olarak yer aldığına, kan ve bukkal epitel örneklerinin bu projedeki çalışmalarda kullanılmasını kabul ettiklerine dair gönüllü beyan formu ile onayları alındı. Her çocuğa yaş, kilo, boy, öğrenim durumu, sigara ve çay alışkanlığı, son 3 ayda X-ışını maruziyeti, son 1 yılda olduğu aşılar, kullandığı ilaç ve vitaminler, yaptığı spor aktiviteleri gibi bilgileri içeren anket formu uygulandı. Anket formunun hastanın hekimi tarafından doldurulacak bölümünde ise, böbrek yetmezliği ve tipini belirleyen parametreleri, hastalığın şiddetini, tedavi tipini, kullandığı ilaçlarını ve geçirdiği viral enfeksiyonları sorgulayan sorular yer almıştır. Uygulanan anket formu ve gönüllü beyan formu örneği Ek:2 ve 3’de yer almaktadır. 136 3.2. Çalışma Ve Kontrol Grubundan Biyolojik Analiz Materyalinin Alınması Çalışma ve kontrol grubunun kan ve bukkal epitel örnekleri 16.07.2008–29.07.2009 tarihleri arasında toplanmıştır. Kan ve bukkal epitel örnekleri Gazi ve Başkent Tıp Fakültelerinin Pediyatrik Nefroloji Bölümünde çalışan hemşireler tarafından alınmıştır. Kanda Comet, MÇ, FISH kombine MÇ Yöntemleri ve bukkal epitelde MÇ Yönteminin uygulanması Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalında gerçekleştirilmiştir. Diğer biyokimyasal analizler ise ilgili fakültelerin laboratuarlarında yapılmıştır. Kan örneklerinin alınması: Venöz kan örnekleri Comet, MÇ ve FISH ile kombine MÇ analizleri için heparin içeren steril tüplere (5ml), biyokimyasal analizler için ise teste özgü tüplere alınmıştır. Hasta ve kontrol grubunda BUN, kreatinin, ürik asit, total kolestrol, trigliserit, total protein, albumin, CRP, kalsiyum, fosfor, demir, ferritin, homosistein, parathormon, alkalen fosfataz, TAS, IL-6 analizleri için kan örnekleri alınmıştır. Açlık kan şekeri, AST, ALT, HSCRP, potasyum, sodyum, hematokrit, hemoglobin, eritrosit, lökosit, trombosit, sedimantasyon, HDL-K ve LDL-K analizleri ise sadece hasta grubunda yapılmıştır. Toplanan kan örnekleri alındığı gün en geç 4 saat içinde Comet, MÇ ve FISH kombine MÇ analizleri için kültür ortamlarına eklenmiştir (+4°C’de muhafaza edilerek). Bukkal epitel örneklerinin alınması: Çalışma ve kontrol grubundan, kan alımıyla eş zamanlı olarak yanaktan bukkal epitel örneği alındı. Bu işlem için lamlar etanolde yıkanarak oda ısısında kurutuldu. Her birey için 2 lam kodlandı. Deneklerin ağızı suyla iyice çalkalatıldı. Sonra distile su içinde bekletilen abeslangın bir tarafı ile 137 sol yanaktan, diğer tarafıyla sağ yanaktan bukkal epitel kazındı. Bu sürüntü atıldı. Distile su içinde bekletilen diğer abeslangın bir tarafı ile sol yanak kazınarak distile suda bekleyen lam üzerine yayıldı. Abeslangın diğer tarafıyla da sağ yanaktan bukkal epitel kazınarak diğer lam üzerine yayıldı. Lamlar oda ısısında kurumaya bırakıldı. Kuruyan lamlar %80’lik metanol içinde 10 dakika bekletilerek fiksasyonları gerçekleştirildi ve oda ısısında kurutularak daha sonra boyanmak üzere saklandı. 3.3. Comet ve Modifiye Comet Yöntemi 3.3.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler NaOH (Merck-B929862710): 1kg KOH (Merck-B0075321747): 1kg EDTA (Amresco-6381926): 500g Tris (Amresco -77861): 500g NaCl (Amresco -7647145): 1kg Agarose (Serva-11404): 100g Agarose II (Amresco-9012366): 25g RPMI 1640 (Biological Industries- 011061B): 100ml PBS (Biological Industries-020231B): 100ml Lymphocyte LSM 1077 (PAA-J11-004): 100ml Triton x-100 (Amresco-0694): 1lt Dimetil sülfoksit (DMSO) (Amresco -67685): 500ml Hepes (Amresco-0511): 250g KCl (Merck-1049361000): 1kg BSA (Albumine bovine) (Amresco-0332): 25g Endonükleaz III (Collins Lab) FPG (Collins Lab) Ethidium bromide (Sigma-E8751): 1g Distile su 138 3.3.2. Test İçin Kullanılan Aletler Isı ayarlı santrifüj (Nüve NF 800R) Elektroforez cihazı (Thermo EC250-90) Etüv (PπMed Termal) Isıtıcı tabla (PπMed Major Science) Vorteks (FIRLABO-sa) Hassas terazi (Shimadzu AW320) Pipetler (Acura) Fotoğraf makineli floresan mikroskop (Zeiss) Traşlı lam ve lamel (Menzel-Glaser) 3.3.3. Deneyin Yapılışı 10M NaOH çözeltisi: Distile su ile 400g NaOH 1lt’ye tamamlanacak şekilde hazırlandı ve +4°C’de saklandı. 0.2M EDTA çözeltisi: Distile su ile 74.4g EDTA 1lt’ye tamamlanacak şekilde hazırlandı ve +4°C’de saklandı. 10M KOH çözeltisi : Distile su ile 561.1g KOH 1lt’ye tamamlanacak şekilde hazırlandı ve oda sıcaklığında saklandı. Stok lizis çözeltisi :146.1g (2.5M) NaCl + 37.2g (100mM) EDTA + 1.2g (10mM) tris, distile suyla 900ml’ye tamamlandı ve oda sıcaklığında saklandı. (pH 10) Lizis çözeltisi : 89ml stok lizis çözeltisi+10ml DMSO+1ml tritonX karışımı taze olarak hazırlandı ve +4°C’de saklandı. Nötralizasyon tamponu: Distile su ile 48.5g tris 1lt’ye tamamlanacak şekilde hazırlandı ve +4°C’de saklandı. (pH 7.5) Elektroforez tamponu: Distile suyla 37.5ml (10M) NaOH + 6.75ml (0.2M) EDTA 1250ml’ye tamamlandı. Taze olarak hazırlandı ve +4°C’de muhafaza edildi. 139 Stok enzim çözeltisi : Distile suyla 95.32g (10mM) hepes + 74.55g (0.1M) KCl + 1.86g (0.5mM) EDTA + 40.2g BSA, 1lt’ye tamamlandı ve 25ml’lik falkon tüplerine dağıtılarak –20°C’de saklandı. (pH 8) Enzim çözeltisi : Stok enzim çözeltisinin +4°C’de çözülmesi sağlandı, sonra 1/10 oranında distile suyla seyreltildi. (pH 8) %65’lik LMA : 0.65g LMA PBS içinde mikrodalgada çözüldü, kullanıma kadar +37 °C’de bekletildi. HMA çözeltisi : 0.65g agarose 100ml distile su içinde mikrodalgada çözüldü. Ethidium bromide stok çözeltisi: Distile suyla 5mg ethidium bromide 50ml’ye tamamlandı ve +4°C’de saklandı. Ethidium bromide (20µg/ml) çözeltisi: Ethidium bromide stok çözeltisi 1/5 oranında distile suyla seyreltildi. Lamlar, HMA ile kaplanmaları için +90°C’ye ayarlanmış ısıtıcı tabla üzerinde duran HMA çözeltisine batırıldı, alt yüzleri silinerek, oda ısısında kurumaya bırakıldı. Kuruyan lamlar daha sonra kullanılmak üzere kutularına yerleştirildi. Ortam karanlık yapıldı. Her birey için 6 adet ependorf kodlandı. Kodlama 1 adet n (enzimsiz için), 1 adet b (buffer için), 2 adet e1, e2 (Endo III için), 2 adet f1, f2 (FPG için) olacak şekildeydi. Ependorfların her birine 1ml PBS ve 100µl heparinize kan koyuldu. Ters yüz edilen ependorflar buz üzerine dizildi. 10 dakika beklendikten sonra lenfositleri izole etmek için, ependorfların en dip kısmına 100µl lenfoprep yavaşça, pipet yardımıyla bırakıldı. Bu ependorflar, daha önceden sıcaklığı +4°C’ye getirilmiş olan santrifüjde 1500 rpm’de 3 dakika santrifüj edildi ve tekrar buz üzerine alındı. Dipte kalan çökeltinin hemen üzerindeki 140 lenfosit yoğun şeffaf kısımdan, 100µl lenfosit alınarak aynı şekilde kodlanmış yeni ependorfların içine bırakıldı. Daha önceden +37°C’ye getirilmiş olan LMA çözeltisinden 100µl, ependorf içindeki lenfosit üzerine bırakıldı. Pipetaj yapılarak, aynı şekilde kodlanmış olan HMA kaplı lam üzerine 100µl damlatıldı. Üzeri lamelle kapatılarak +4°C’ye kaldırıldı. 30 dakika sonunda lameller çıkarılarak, önceden aluminyum folyo ile kaplanmış şale içine lamlar dizildi. Lenfositlerin çekirdek materyali dışında tüm sitoplazmasını parçalamak amacıyla, yüksek konsantrasyonda tuz içeren lizis çözeltisi şaleye döküldü. Kapağı kapatılarak +4°C’ye kaldırıldı. Ertesi gün ortam karanlıklaştırıldı. Stok enzim çözeltisi seyreltildi. Yeni bir şale aluminyum folyo ile kaplanarak buz aküsü üzerine yerleştirildi. Enzimsiz (n olarak kodlanan) lamlar dışındaki lamlar lizis çözeltisinden çıkarılarak yeni şaleye yerleştirildi ve üzerine seyreltilmiş enzim buffer döküldü. 5 dakika sonra enzim buffer şaleden dışarı döküldü. Iale içine yeniden enzim buffer koyularak işlem 3 kere tekrarlandı. Oksidatif DNA hasarını gösteren FPG ve Endo III-duyarlı bölgelerin sıklığını ölçmek için şaleden çıkarılan lamlardan (b) kodlu olanlara 50µl “enzim buffer”, (e) kodlu olanlara 50µl “10µl Endo III + 290µl enzim buffer” çözeltisi, (f) kodlu olanlara 50µl “10µl FPG + 290µl enzim buffer” çözeltisi damlatıldı. Üzerlerine lamelleri kapatılarak nemli ve karanlık bir kutu içerisinde +37°C’deki etüve yerleştirildi. (f) kodlu lamlar 30 dakika sonra, (b) ve (e) kodlu lamlar ise 45 dakika sonra etüvden alınarak lamelleri çıkarıldı. (n), (b), (e) ve (f) kodlu tüm lamlar önceden (25V, 300A şeklinde) hazırlanan soğutulmuş elektroforez tankı içerisine yerleştirilerek 20 dakika elektroforez tamponuyla süpersarmal yapının gevşeyerek açılması için muamele edildi. Sonra cihaz 20 dakika çalıştırıldı. Sürenin sonunda lamlar buz aküsü üzerinde duran şale içine alınarak, nötralizasyonu sağlamak amacıyla nötralizasyon tamponu ile 3 kere 5’er dakika yıkandı. Lamlara 50µl ethidium bromide çözeltisi damlatıldı ve lamelleri kapatılarak +4°C’ye 141 kaldırıldı. 10 dakika sonra karanlık ortamda Comet Assay III görüntü analiz programının kullanıldığı floresan mikroskobunda, herbir lamda 50 hücrenin değerlendirmesi yapıldı. Çalışmamızda DNA hasarını ölçmede “tail intensity” değerleri kullanıldı. Jel tabakasının kenarları civarındaki cometler lamın gerisindekilere benzememektedir. Bu testteki “kenar etkisi”dir107. Bu nedenle jel tabakasının kenarı boyunca cometler skorlanmadı. FPG ve Endo III ile inkübe edilmiş lamda bulunan zincir kırıkları sıklığından buffer uygulanan lamda bulunan zincir kırıkları sıklığı çıkartılarak, oksidatif baz hasarının net miktarı bulundu. 3.4. Sitokinezisin Durdurulduğu Mikroçekirdek Yöntemi 3.4.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler RPMI 1640 (Biological Industries- 011061B): 100ml Fötal Buzağı Serumu (Biological Industries-040071B): 100ml Fitohemaglutinin (PHA-M) (Biological Industries-120061H) L-Glutamin (Biological Industries-030201C): 100ml Sitokalazin B (Sıgma-C6762-SMG): 5mg Dimetil sülfoksit (DMSO) (Amresco -67685): 500ml KCl (Merck-1049361000): 1kg Asetik asit %100 (Merck-1000562500): 2.5lt Metanol (Merck-1060072500): 2.5lt Formaldehit (Merck-1040022500): 2.5lt %4 Giemsa (Merck-1092040500): 500ml %4 May Grünwald (Merck-1014240500): 500ml 142 3.4.2. Test İçin Kullanılan Aletler 37 °C’lik inkübatör (PπMed Termal) 1000 rpm’lık santrifüj (Nüve CN180) Vorteks (FIRLABO-sa) Hassas Terazi (Shimadzu AW320) Pipetler (Acura) Işık mikroskobu (Zeiss) Sayaç (Marienfeld Superior Counter 2001) Traşlı lam ve lamel (Menzel-Glaser) Su trompu Özel boyama kabı 3.4.3. Deneyin Yapılışı Vasat hazırlanması: Steril koşullarda 100ml RPMI içine kültür ortamını zenginleştirmek amacıyla 2.5ml fitohemaglütinin, 25ml fötal buzağı serumu ve 500µl L-glutamin eklenerek hepsi iyice karıştırıldı. Sonra karışım, steril koşullarda her birinde 4.5ml olacak şekilde, özel steril kültür tüplerine dağıtıldı. Sonra kullanılmak üzere tüpler -20 °C’ye kaldırıldı. Sitokalazin B çözeltisinin hazırlanması: Steril koşullarda 2.5ml DMSO, 5mg sitokalazin B’ye eklendi, iyice vortekslendi, steril küçük ependorflara 30µl olacak şekilde dağıtılarak -80 °C’ye kaldırıldı. Hazırlanan vasatlar her bireyin numarasına göre 2’şer adet kodlandı. Steril koşullarda vasatlara 500µl venöz kan eklendi. Tüpler 72 saat kalmak üzere +37°C’deki inkübatöre kaldırıldı. 44. saatte son konsantrasyonu 6µg/ml olacak şekilde hazırlanmış olan 100µl sitokalazin B çözeltisi (15µl sitokalazin B + 85µl RPMI içeren) steril koşullarda 143 vasatlara ilave edildi ve inkübatöre kaldırıldı. Vasatlar 72 saat sonunda inkübatörden alınarak 1000 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi. Üstte kalan sıvı, su trompuyla çekildi. Vasatlar vorteks üzerindeyken çökelti üzerine pastör pipetiyle 5ml (taze hazırlanmış ve buzdolabında +4°C’ye soğutulmuş) potasyum klorür damla damla ilave edildi ve sonra buzdolabına koyularak 3 dakika beklendi. Daha sonra 1000 rpm’de 10 dakika santrifüj yapılarak üst kısım atıldı ve kalan çökelti üzerine (taze hazırlanmış ve buzdolabında +4°C’de soğutulmuş) metanol:asetik asit (3:1) fiksatifi, vasat vorteks üzerindeyken damla damla 5ml olacak şekilde eklendi. 10 dakika 1000 rpm’de sanrtifüj edildi. Bu işlem dipteki çökelti şeffaflaşana kadar 4 kere tekrarlandı. Vorteks üzerinde son fiksatifin ilavesi sırasında 2 damla formaldehit eklenerek, santrüfüj edildi. En üstteki sıvı atıldı, altdaki çökeltiye cam pipetle pipetaj yapıldı ve soğuk metanolde bekletilen aynı şekilde kodlanmış 2 lam üzerine damlatılarak uygulandı. Lamlar oda ısısında kurumaya bırakıldı. 100’lük mezüre 4ml Giemsa, 4ml May Grünwald boyalarından koyularak distile suyla 100ml’e tamamlandı. Lamlar bir cam şaleye yerleştirildi ve üzerine hazırlanan boya çözeltisi ilave edilerek 17 dakika beklendi. Süre sonunda lamlar distile suyla 2 kere çalkalandı ve oda ısısında kurutuldu. Boyanmış preparatlarda her birey için 1000 binükleer hücre ışık mikroskobunda X40 objektif kullanılarak değerlendirildi. 250 binükleer hücre sayılana kadar belirlenen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 çekirdekli hücrelerin yüzdesi hesaplandı. 250 binükleer hücre sayılana kadar 1, 2, 3, 4 çekirdek içeren hücre sayıları tespit edilerek nükleer bölünme indeksi hesaplandı. 1000 binükleer hücre sayılana kadar MÇ’li binükleer hücre sayısı; binükleer hücrelerdeki MÇ, nükleer bud (Nbud) ve nükleer köprü sayısı (NPB); mononükleer hücrelerdeki MÇ ve nükleer bud sayısı, belirlendi (şekil 32). 144 ekil 32: Mikroskopta MÇ, NPB ve Nbud görünümü 133 Binükleer sitokineziste durdurulmuş hücrelerin teşhisi için kriterler121,129: • Hücreler iki çekirdekli olmalı. • Hücreler 6 mikroçekirdekten fazla mikroçekirdek içermemeli. • Ayrılan ana hücreler yaklaşık aynı hacımda, aynı boyama özelliklerinde ve aynı yoğunlukta olmalı. • İki çekirdekli bir hücrede, ana iki çekirdek temas edebilir ama biri diğeriyle üstüste gelmemeli, örtüşmemeli. Örtüşen 2 çekirdeği olan bir hücre, sadece eğer her bir çekirdeğin çekirdek sınırları ayırt edilebiliyorsa sayılabilir. • İki çekirdekli bir hücre, çekirdek çapının ¼’inden daha geniş olmayan nükleoplazmik bir köprü ile bağlı olabilir. • İki çekirdekli bir hücrede iki çekirdeğin çekirdek zarları tam olmalı ve aynı sitoplazmik sınır içinde yerleşmiş olmalı. • İki çekirdekli bir hücrenin sitoplazmik sınırı veya membranı bozulmamış olmalı ve bitişik hücrelerin sitoplazmik sınırlarından açıkça ayırdedilebilmeli. 145 Sayılamayan hücreler128,129 : • Tek çekirdekli, 3 çekirdekli, 4 çekirdekli veya çok çekirdekli hücreler. • Ana çekirdekleri apoptozise uğramış hücreler Mikroçekirdeğin tanınması için kriterler129,130: • Mikroçekirdek düzgün konturlu, yuvarlak veya oval olmalı ve hücre sitoplazması içinde kalmalı. • Ana çekirdeğe kıyasla koyuluğu aynı veya daha az olmalı, morfolojik yapısı ve ışığı kırması benzer olmalı. Mikroçekirdek ışığı kırmaz ve bu nedenle onlar boyama partikülleri gibi artifaktlardan kolayca ayırt edilebilir. • Ana çekirdeğin çapının 1/16 ve 1/3’ü arasında olmalı. • Ana çekirdekle aynı düzlemde olmalı. • Ana çekirdekten açık bir şekilde ayırt edilebilmeli. • Ana çekirdeğe nükleoplazmik köprüyle bağlı olmamalıdır. • Ana çekirdekle temasta olmamalı ve ana çekirdekle üst üste çakışmamalı. • Iüphe duyulan mikroçekirdek değerlendirme dışında bırakılmalı. NPB’lerin özellikleri129,176 (şekil 33) • NPB, binükleer bir hücrede çekirdekler arasında devamlı nükleoplazmik bir bağlantıdır. • NPB, çekirdekleri açıkça ayırt edilen binükleer hücrelerde değerlendirilir. Çünkü çekirdekleri temas eden veya üst üste binen hücrelerde bir NPB görmek zordur. • Bir NPB’nün genişliği değişebilir ama genellikle hücredeki çekirdeklerin çapının 1/4’ünden fazla olmaz. • NPB, ana çekirdeklerle aynı boyanma özellikleri gösterir. • Bir binükleer hücrede birden fazla NPB olabilir. 146 • NPB olan bir binükleer hücrede bir yada daha fazla MÇ olabilir veya olmayabilir. • NPB, anafazda disentrik kromozomların sentromerlerinin hücrenin zıt kutuplarına çekilmesinden kaynaklanır. ekil 33: MÇ ve NPB formasyonu 3.5. 133 FISH Kombine Mikroçekirdek Yöntemi 3.5.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler RPMI 1640 (with L-glutamine, HEPES) (Biological Industries011061B): 100ml Fötal Buzağı Serumu (Biological Industries-040071B): 100ml Fitohemaglutinin (PHA-M) (Biological Industries-120061H) L-Glutamin (Biological Industries-030201C): 100ml Sitokalazin B (Sıgma-C6762-SMG): 5mg Dimetil sülfoksit (DMSO) (Amresco -67685): 500ml KCl (Merck-1049361000): 1kg Asetik asit %100 (Merck-1000562500): 2.5lt Metanol (Merck-1060072500): 2.5lt Etanol (Merck-1009862500): 2.5lt Formaldehit (Merck-1040022500): 2.5lt Sodyum sitrat (Amresco -6132043): 1kg 147 NaCl (Amresco -7647145): 1kg Pepsin (Merck-1071850100): 100g HCl %37 (Merck-1003142500): 2.5lt FITC (Cambio-1695 F) 150µl DAPI (Cambio-1124MD) 150µl Bidistile su 3.5.2. Test İçin Kullanılan Aletler 37 °C’lik inkübatör (PπMed Termal) 1000 rpm’lık santrifüj (Nüve CN180) Vorteks (FIRLABO-sa) Su banyosu (Nüve BM402) Hassas terazi (Shimadzu AW320) Pipetler (Acura) Floresan mikroskobu (Zeiss) Traşlı lam ve lamel (Menzel-Glaser) Su trompu Özel boyama kabı 3.5.3. Deneyin Yapılışı %10’luk pepsin stok çözeltisinin hazırlanması: 0.1g pepsin, 1ml (+37°C’de) bidistile su ile vortekslenerek hazırlandı. Kullanılmayan çözelti 44µl şeklinde ependorflara bölünerek -20°C’de saklandı. 0.005’lik pepsin çözeltisinin hazırlanması: +37°C’deki 69.3ml bidistile su, 0.7ml 1N HCl ve 44µl pepsin stok çözeltisi iyice karıştırıldı. Hemen ve sadece 3 lam için kullanıldı. 148 20XSSC (saline sodium citrate buffer) solüsyonunun hazırlanması: 87.6g NaCl ve 44,1g sodyum sitrat bidistile suyla 500ml’ye tamamlandı. Otoklavlanarak +4°C’de saklandı. (pH 7.4) 2XSSC solüsyonunun hazırlanması: 25ml “20XSSC”, +37°C’deki 225ml bidistile suyla karıştırılarak taze olarak hazırlandı. 4XSSC solüsyonunun hazırlanması: 50ml “20XSSC”, +37°C’deki 200ml bidistile suyla karıştırılarak olarak hazırlandı. Hazırlanan vasatlar her bireyin numarasına göre kodlandı. Steril koşullarda vasatlara 500µl venöz kan eklendi. Bu andan itibaren Mikroçekirdek Yönteminin boyama aşamasına kadar olan işlemler aynen uygulandı. Kuruyan lamlar, içinde 2XSSC bulunan şalede 5 dakika bekletildikten sonra, oda ısısında kurumaya bırakıldı. Lamlar taze hazırlanan +37°C’deki pepsin çözeltisi içinde 7 dakika inkübe edildikten sonra, +37°C’deki 2XSSC solüsyonunda 1 dakika, +37°C’deki distile su içinde 2 kere 1’er dakika yıkandı. Lamlar 3 dakika %70’lik etanolde, 5 dakika %90’lık etanolde dehidrate edildikten sonra oda ısısında kurumaya bırakıldı. Karanlık ortamda (-20°C’de bekletilen) FITC probu vortekslendikten sonra 15µl lama uygulandı, üzerine lamel kapatıldı ve kenarları yapıştırıldı. Kullanılan FITC probu içinde formamid içeren hibridizasyon bufferı mevcuttu. Önceden +70°C’ye getirilmiş olan su banyosundaki kap içine lamlar yerleştirilerek 7 dakika denatüre edildi. Daha sonra lamlar ışık geçirmeyen, kapalı bir kutuya yerleştirilerek +37°C’de 1 gece hibridizasyona bırakıldı. Ertesi gün karanlık ortamda, lamlar +37°C’de 2XSSC solüsyonu içinde yıkandı ve lamelleri çıkarıldı. Daha sonra lamlar +37°C’deki 2XSSC solüsyonunda 2 kere 5’er dakika ve +37°C’deki 4XSSC solüsyonunda 2 kere 5’er dakika yıkandı. Oda ısısında karanlıkta kurutularak hemen görüntülemek üzere (-20°C’de 149 bekletilen) 15µl DAPI vortekslenerek lama uygulandı ve lameli kapatıldı. Lamlar, bekletilmeden floresan mikroskopta DAPI filtresi kullanılarak X40 objektifle değerlendirildi. 1000 binükleer hücre sayılarak, MÇ sayısı belirlendi. Ayrıca belirlenen MÇ’li hücrelerde FITC filtresi kullanılarak sentromerden sinyal alınıp alınmadığına bakıldı. Sinyal alınan mikroçekirdekler “sentromer pozitif MÇ” [S(+)MÇ], sinyal alınmayan mikroçekirdekler “sentromer negatif MÇ" [S(-)MÇ] olarak değerlendirildi. Binükleer sitokineziste durdurulmuş hücrelerin teşhisi ve mikroçekirdeğin tanınması için geçerli olan kriterler FISH Yöntemi için de aynen uygulandı. 3.6. Bukkal Epitelde Mikroçekirdek Yöntemi 3.6.1. Test İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler Fast green FCF (Merck-K20676480507):10g HCl %37 (Merck-1003142500): 2.5lt Xylen (Merck-86852500): 2.5lt Pararosanilin (Merck-K18926509404): 100g Sodyum bisülfit (Merck-K22464657-547)1000g Aktif kömür Metanol (Merck-1060072500): 2.5lt Etanol (Merck-1009862500): 2.5lt 3.6.2. Test İçin Kullanılan Aletler Su banyosu (Nüve BM402) Işık mikroskobu (Zeiss) Sayaç (Marienfeld Superior Counter 2001) Pipetler (Acura) Abeslang Traşlı lam (Menzel-Glaser) 150 3.6.3. Deneyin Yapılışı Feulgen reaktifinin hazırlanması: Erlen içinde 1g pararosanilin 100ml kaynamış distile suyla çözüldü. Erlen aluminyum folyo ile kaplanarak, +60°C’ye soğuması beklendi. Yeterince soğuyan çözelti filtre kağıdından süzülerek içine 20ml 1N HCl ve 2g sodyum bisülfit eklendi. Çözelti aluminyum folyo ile kaplı bir şişeye alınarak ağzı kapatıldı ve oda ısısında karanlıkta bekletildi. 24 saat sonra, içine 300mg aktif kömür ilave edilerek, 1 dakika iyice çalkalandı. Çözelti aluminyum folyo ile kaplı bir şişeye filtre kağıdından süzülerek aktarıldı. Kapağı sıkıca kapatılan çözelti gerektiğinde kullanılmak üzere +4°C’ye kaldırıldı. Fast green çözeltisinin hazırlanması: 0.5g fast green 100ml %95’lik etanolde çözüldü. Çözelti aluminyum folyo ile kaplı bir şişede oda ısısında saklandı. 1N HCl hazırlanması: 83ml %37’lik HCl distile suyla 1lt’ye tamamlandı. Fiksasyonu yapılmış olan lamlar, içinde 1N HCl bulunan şalede 2 dakika bekletildi. Lamlar, su banyosunda içinde +60°C’ye getirilmiş 1N HCl bulunan şaleye geçirilerek 10 dakika beklendi. Ialeden çıkarılan lamlar 10 dakika kurutulduktan sonra, oda ısısında içinde 1N HCL bulunan şaleye yerleştirildi. 2 dakika sonra lamlar distile suyla yıkandıktan sonra kurutuldu. Ertesi gün karanlık ortamda, lamlar içinde Feulgen reaktifi olan (aluminyum folyo ile kaplanmış) şaleye dizilerek 2 saat beklendi. Lamlar içinde distile su bulunan şaleye geçirilerek 15 dakika daha beklendi. Daha sonra distile suyla yıkanarak kurumaya bırakıldı. Lamlar, içinde Fast Green çözeltisi bulunan beherde 10 saniye bekletildikten sonra etil alkolde yıkanıp, kurumaya bırakıldı. Kuruyan lamlar çeker ocak altında, içinde xylen olan şalede 10 dakika bekletildi. 151 Sonra oda ısısında kurutulan her iki lamda ışık mikroskobunda X40 objektifle sayılan 1000 farklılaşmış hücrenin MÇ değerlendirmesi yapıldı. Ayrıca MÇ’li hücre sayısı belirlendi. Uygulanan Fuelgen-Fast Green boyama yöntemi ile hücrenin çekirdeği parlak pembe, sitoplazması ise açık yeşil boyanmaktadır. Mikroçekirdeğin tanınması için kriterler18: • MÇ, sadece aynı şekilde boyanmış farklılaşmış hücrelerde skorlanır, • Bazal hücrelerde de skorlamak mümkündür, ama bu hücre tipinin frekansının düşük olması nedeniyle pratik değildir, • Piknotik hücreler, kondanse kromatinli veya karyorhektik çekirdeği olan hücreler MÇ için skorlanmaz, • MÇ, yuvarlak veya oval olup, ana çekirdeğin çapının 1/3 ve 1/16’sı kadardır, • MÇ, ana çekirdekle aynı yoğunlukta ve aynı boyanma özelliğindedir • MÇ’li hücrelerdeki çekirdekler normal hücrelerdeki çekirdek morfolojisine sahiptir, 3.7. İstatistiksel Analiz Verilerin analizi “SPSS for Windows 11.5” paket programında yapıldı. Sürekli değişkenlerin dağılımının normale yakın olup olmadığı Shapiro Wilk testi ile araştırıldı. Tanımlayıcı istatistikler sürekli değişkenler için ortalama (± standart sapma) veya ortanca (IQR: interquartile range) olarak, kategorik değişkenler ise olgu sayısı ve (%) olarak gösterildi. Gruplar arasında ortalamalar yönünden farkın önemliliği bağımsız grup sayısı iki olduğunda Student’s t testi ile ikiden fazla grup arasındaki farkın önemliliği ise Tek Yönlü Varyans Analizi (One-Way ANOVA) ile değerlendirildi. Tek yönlü varyans analizi sonucunun önemli bulunması halinde post hoc Tukey testi kullanılarak farka neden olan 152 durumlar belirlendi. Gruplar arasında ortanca değerler yönünden farkın önemliliği bağımsız grup sayısı iki olduğunda Mann Whitney U testi ile ikiden fazla grup arasındaki farkın önemliliği ise Kruskal Wallis testi ile değerlendirildi. Kruskal Wallis test istatistiği sonucunun önemli bulunması halinde parametrik olmayan çoklu karşılaştırma testi kullanılarak farka neden olan durumlar belirlendi. Kategorik değişkenler Pearson’un Ki-Kare veya Fisher’in Kesin Sonuçlu Ki-Kare testi ile değerlendirildi. Gruplar içerisinde S(+)MÇ ve S(-)MÇ oranları arasındaki farkın önemliliği Wilcoxon İşaret testiyle incelendi. Sürekli değişkenler arasında istatistiksel olarak anlamlı korelasyon olup olmadığı Spearman’ın Korelasyon testiyle araştırıldı. Tek değişkenli istatistiksel analizler sonucunda genotoksisite göstergeleri üzerinde istatistiksel olarak anlamlı birliktelik gösteren faktörlerle klinik olarak etkili olabileceği düşünülen faktörler bir araya getirilip Çoklu Adımsal Doğrusal Regresyon Analizi kullanılarak genotoksisite göstergeleri üzerinde en fazla belirleyiciliğe sahip olan etkenler tespit edildi. Daha sonra, yaş, cinsiyet, beden kitle indeksi (BMI), sigara maruziyeti ve günlük spor yapma süresine göre düzeltme yapıldığında genotoksisite göstergeleri üzerinde daha önce anlamlı belirleyiciliği olan faktörlerin hem de araştırma gruplarının anlamlı etkilerinin devam edip etmediği Çoklu Doğrusal Regresyon Analiziyle araştırıldı. Her bir değişkene ait regresyon katsayısı ve %95 güven aralıkları hesaplandı. Genotoksisite göstergeleri normal dağılmadığından regresyon analizlerinde logaritmik dönüşüm yapıldı. p<0,05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi 153 4. BULGULAR 4.1. Hasta ve Kontrol Gruplarının Anket Bilgileri Hasta grubu çocuklarının kronik böbrek hastalıklarının nedenleri tablo 24’de, Tx grubunda kullanılan immün baskılayıcı rejimleri tablo 25’de gösterilmiştir. Tablo 24: Hasta grubu çocukların KBH’nın nedenleri KBH NEDENİ VUR (Vezikoüroteral reflü) Nörojenik mesane Konjenital ürogenital sistem anomalisi Nefrolitiazis Fokal segmental glomeruloskleroz Nefrotik sendrom Bardet-Biedl Sistinozis VUR+Nörojenik mesane FMF+VUR FMF+SLE Down send+Nörojenik mesane Polikistik böbrek hastalığı Obstrüktif üropati Atrofik böbrek Alport Sendromu Oxalozis Hemolitik üremik sendrom Post üretral valv Bilinmeyen TOPLAM N 12 5 3 3 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 49 154 Tablo 25: Tx grubunda kullanılan immün baskılayıcı rejimleri İMMÜN BASKILAYICI TİPİ TX Grup n % 4 8 23,5 47,1 1 1 5,9 5,9 Rapamisin+ MMF+Steroid 1 1 5,9 5,9 Rapamisin 1 5,9 TOPLAM 17 100,0 Siklosporin + MMF+Steroid Takrolimus+ MMF+Steroid Siklosporin + MMF Takrolimus+ Steroid Takrolimus Hasta grubunun, doktorunun ve kontrol grubunun anket bilgileri tablo 26, 27 ve 28’de gösterilmiştir. 155 Tablo 26: Hasta grubunun anket bilgileri Hasta Ad Kilo Yaş Cinsiyet No Soyad (kg) 2 3 4 5 6 HA ONB TG MK RNG 7 IOD 9 10 11 12 13 14 15 AB EY EG VTA FNC MA MKK 16 16 16 15 13 Erkek Erkek Kız Erkek Kız 16 Erkek 16 16 17 19 6 12 18 Erkek Erkek Kız Erkek Kız Erkek Erkek Boy (cm) Son 1 yılda yapılan aşı 62 46,5 65 42 49 160 147 159 142 147 53 165 Grip 42 60 47,5 60 16 45 109 150 162 150 160 102 135 157 Hepatit Son 3 ayda çekilen rontgen Yaşadığı BMI ortamda 2 (kg/m ) sigara içiliyor mu DÜSG MAG-3 sintigrafi 24,22 21,52 Pelvis 25,71 20,83 22,68 Pelvis Böbrek Hepatit Akciğer Akciğer KranialCT, akciğer 19,47 18,67 22,86 21,11 23,44 15,38 24,69 44,22 İçilen çay (bardak/gün) Yaptığı Spor spor aktivitesinin aktivitesi süresi Hayır Evet Hayır Hayır Hayır --2 --3 veya daha fazla 1 Orta Fazla Az 1 saat 1saat Yarım saat Evet 1 Fazla 1 saat Hayır Hayır Hayır Hayır Evet Hayır Hayır ------3 ve daha fazla 3 ve daha fazla 2 1 Fazla Fazla Az Orta Orta Fazla Az 4 saat 2 saat 7 saat 2 saat 1 saat 2 saat Yarım saat 157 Tablo 26: Hasta grubunun anket bilgileri (devam) Hasta Ad Kilo Yaş Cinsiyet No Soyad (kg) 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 İK AOA Eİ SA DY HA EG ET AÇ GG AK SD DA CK YÖ FY 6 10 14 14 17 17 16 2 18 14 18 18 18 9 12 17 Erkek Erkek Erkek Kız Erkek Kız Kız Erkek Erkek Erkek Kız Erkek Kız Kız Erkek Kız 36 22 35 37 82 51 43 8 41,5 26 24 69 40 24 35 32 Boy Son 1 yılda (cm) yapılan aşı 113 118 135 149 Hepatit 172 154 147 71 DBT, HİB 141 HİB 123 140 104 156 122 132 135 Son 3 ayda çekilen rontgen Akciğer Akciğer Akciğer Yaşadığı BMI ortamda 2 (kg/m ) sigara içiliyor mu 28,19 15,80 19,20 16,67 27,72 21,50 19,90 15,87 Sistogram 20,87 17,19 12,24 63,79 Akciğer 16,44 16,12 20,09 Direkt karın g 17,56 Hayır Evet Hayır Hayır Evet Hayır Evet Hayır Hayır Evet Evet Hayır Hayır Hayır Hayır Evet İçilen çay (bardak/gün) --2 2 2 3 ve daha fazla 2 2 --1 --2 2 3 ve daha fazla 3 ve daha fazla --2 bardak Yaptığı spor aktivitesi Spor aktivitesinin süresi Fazla Az 1 saat 5 saat Fazla Az Az Az Az 2 saat 1 saat Yarım saat 1 saat Az (bebek) Az Az Az Az Orta Orta Orta 1 saat 1 saat 1 saat 1 saat 1 saat 1 saat Yarım saat 158 Tablo 26: Hasta grubunun anket bilgileri (devam) Hasta Ad Kilo Yaş Cinsiyet No Soyad (kg) MB BF GK ES RB IB YG SA 41 CB 15 19 18 16 14 12 15 18 42 ID 43 AÇ 44 EM 45 HNM 46 IÖ 47 KA 48 SG 49 AC 50 BD 51 MAA 52 MK 33 34 35 36 37 38 39 40 Boy (cm) Kız Kız Kız Kız Kız Kız Erkek Kız 44 34 63,5 34 40 32 20 60 122 130 160 136 152 142 125 170 18 Erkek 33,5 140 8 12 10 9 5 13 15 15 15 18 17 17 33 43 19,5 13 27 27 27 74 65 39 98 145 133 120 100 120 135 131 169 183 143 Kız Kız Erkek Kız Kız Kız Erkek Erkek Erkek Erkek Erkek Son 1 yılda yapılan aşı Yaşadığı Son 3 ayda BMI ortamda çekilen 2 (kg/m ) sigara içiliyor rontgen mu VCUG Hepatit B Grip VCUG Akciğer Akciğer Bacak Okulda 3 kere Okulda VCUG Okulda Akciğer Tetanoz, hepatit İçilen çay (bardak/gün) Spor Yaptığı spor aktivitesinin aktivitesi süresi 29,56 20,12 24,80 18,38 17,31 15,87 12,80 20,76 Evet Hayır Evet Hayır Hayır Evet Evet Evet 1 2 2 --3 ve daha fazla 2 2 2 Az Az Az Az Fazla 1 saat Yarım saat 1 saat Yarım saat 1 saat Az Az 1 saat Yarım saat 17,09 Evet 3 ve daha fazla Az 1 saat 17,70 15,74 24,31 13,54 13,00 18,75 14,81 15,73 25,91 19,41 19,07 Evet Evet Evet Evet Evet Hayır Hayır Evet Evet Evet Evet 1 3 ve daha fazla 2 1 --2 bardak 2 bardak 1 bardak 3 bardak 1 bardak 2 bardak Az Fazla Orta Fazla Orta Yarım saat 6 saat 3 saat 2 saat 1 saat Fazla Az Az Fazla Az 1 saat 1 saat 2 saat 2 saat 2 saat 159 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri Hasta Yetmezliğin grubu şiddeti No Başka bir hastalığı Hastalığın süresi Diyaliz süresi Diyaliz öncesi Ne kadar İmmün İmmün Gün/ immün süre önce baskılayıcı baskılayıcı hafta baskılayıcı ilaç böbrek nakli ilacın adı ilacın süresi kullanımı yapıldı? Kullanılan immün baskılayıcı ilaç 2 Tx Tx 3 Tx Tx 7 ay Takrolimus 4 Tx Tx FMF 2 ay 4 yıl Takrolimus, MMF, Steroid 5 Tx Tx Epilepsi 2 ay 1 ay Takrolimus, MMF, Steroid 6 Tx Tx 9 ay Siklosporin MMF 2,5 yıl Takrolimus, MMF,Steroid 1,5 yıl Takrolimus, MMF, Steroid 3 ay Siklosporin, MMF, Steroid 7 Tx Tx 9 HD Son 10 Tx Tx 11 Tx Tx 12 PreD Orta 13 PreD Orta 14 PreD Son 15 PreD Orta 6 yıl Lesch Nyhan send Doğuştan Down S+ Mesane disfonksiyonu Hepatik fibrozis Takrolimus, MMF, Steroid 3 Doğuştan 1,5 yıl 5 yıl 20 gün Lawrence Moon Biedle Doğuştan 160 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri (devam) No Hasta Yetmezliğin grubu şiddeti Başka bir hastalığı Hastalığın Diyaliz Gün/ süresi süresi hafta Diyaliz öncesi İmmün İmmün Ne kadar süre immün baskılayıcı baskılayıcı önce böbrek baskılayıcı ilacın adı ilacın süresi nakli yapıldı? ilaç kullanımı Kullanılan immün baskılayıcı ilaç 16 Tx Tx 19 ay Takrolimus, MMF, Steroid 17 Tx Tx 1 ay Siklosporin, MMF, Steroid 18 Tx Tx 3 yıl Takrolimus,MMF,steroid 20 Tx Tx 2 yıl Rapamisin 21 Tx Tx 4 yıl Siklosporin, MMF,Steroid 22 Tx Tx 1 yıl Takrolimus,MMF,Steroid 23 Tx Tx 2 yıl Rapamisin,MMF, Steroid Üretrovezikal darlığa ikincil üretrakotenostomi 24 PreD Orta 25 HD Son 4 yıl 3 26 HD Son 3 yıl 3 27 HD Son 6 yıl 3 28 Tx Tx 1,5 yıl Takrolimus, Steroid 29 Tx Tx 10 ay Siklosporin, MMF, Steroid 30 PreD Orta Epilepsi Polikistik böbrek hastalığı 1,5 yıl 2 yıl Doğuştan 161 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri (devam) No Hasta Yetmezliğin grubu şiddeti 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 PreD HD PreD HD PreD HD PreD HD HD HD HD PreD Orta Son Son Son Orta Son Orta Son Orta Son Son Son 43 HD Orta 44 45 HD HD Orta Son Başka bir hastalığı Diyaliz öncesi Hastalığın Diyaliz immün Gün/hafta süresi süresi baskılayıcı ilaç kullanımı 3 5 yıl 3 Hidrosefali Bardet Biedl Doğuştan doğuştan 1 ay 3 ay 6 yıl 5 yıl 3 3 3 3 Oksalozis Doğuştan Hipertansiyon 1 ay 1 hafta 2 1 yıl 5 ay 2 3 14 ay 3 Başlangıç Orta Orta Meningomiyosel Doğuştan 49 PreD Orta Konjenital kalp h Doğuştan 50 PreD 51 PreD Başlangıç Orta Son 4 yıl Doğuştan 47 PreD 48 PreD HD 4 Kas distrofisi 46 PreD 52 1 yıl C.albicans enf 1 yıl İmmün baskılayıcı ilacın adı İmmün baskılayıcı ilacın süresi Evet Prednizolon, siklofosfamid 15 gün Evet Siklosporin, MMF, prednizolon 6 ay Ne kadar Kullanılan süre önce immün böbrek nakli baskılayıcı yapıldı? ilaç 162 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri (devam) No Antihipertansif ilaç Eritropoetin Osteoporoz ilacı kullanıyor mu? 2 Vasocard,Hyzaar Diğer ilaçlar Vitamin mineral takviyesi Sıklığı Son 2 yılda geçirilen viral enfeksiyon? Antiasidoz, Phosex, Cipro Multivitamin Her gün Polyomavirus Multivitamin Her gün Multivitamin Her gün Ca-Sandoz 3 Rocaltrol 4 Kolşisin, 5 6 Norvasc, Enapril Aspirin, Bactrim, Supradyn, Omeprol 7 Cozaar, Enapril Zocor 9 Ürikoliz, Scholl sol 10 Bactrim, Aspirin 11 Bactrim, Zocor, Supradyn, Aspirin Multivitamin Her gün Antiasidoz,Aminoglikozid,Bactrim, Ca karbonat, Multivitamin Her gün 12 Amlodipen Evet Rocaltrol Antifosfat,Scholl, Ferrosanol,Allopürinol,Ca karbonat 13 Kaptopril,Dideral, Suçiçeği 14 15 Enapril Rocaltrol 163 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri (devam) Diğer ilaçlar Vitamin mineral takviyesi Sıklığı Omeprol, Bactrim Multivitamin Her gün 17 Bactrim, Omeprol, Triflucan Multivitamin Her gün 18 Symbicort No 16 Antihipertansif ilaç kullanıyor mu? Eritropoetin Osteoporoz ilacı Enapril, Norvasc 20 Evet 21 Ca-Sandoz,Aktif Dvit Antifosfat, Antiasidoz,Scholl, Son 2 yılda geçirilen viral enfeksiyon? BK virüs Rocaltrol,Ca-Sandoz 22 Enapril 23 Norvasc Aktif Dvit Ator,Bactrim 24 25 Evet 26 Evet 27 Uropan,Lansor,Oral fosfor,Scholl sol Evet Scholl solüsyonu, Phosex Multivitamin Kalsiyum laktat, Phosex Folat Rocaltrol Phosex Multivitamin Rocaltrol Phosex, Ferrasanol, Luminaletten Folat 28 Her gün Her gün Aspirin 29 Enapril, Norvasc,Alfamet, 30 Enapril Rocaltrol Multivitamin Hergün 164 Tablo 27: Hasta grubunun doktoruna ait anket bilgileri (devam) No Antihipertansif ilaç kullanıyor mu? Eritropoetin Osteoporoz ilacı Diğer ilaçlar Vitamin mineral takviyesi Sıklığı Renegel,Calcijex, Bemiks,Folbiol Her gün Son 2 yılda geçirilen viral enfeksiyon? 31 32 Evet 33 34 Enapril,Norvasc Evet Rocaltrol, Phosex, EAS,Ferrasanol Folat Enapril,Norvasc Evet Rocaltrol Phosex,Renegel,Ferrasanol, Multivitamin Her gün Bemiks,Folbiol Her gün,3 günde 1 35 36 37 Adalat Vasocard,Enapril,Dideral 38 Losartan, 39 Vasocard 40 41 42 43 Enapril Prednol Evet Rocaltrol Evet Evet Adalat, Norvasc 48 49 50 51 52 Multivitamin Phosex Phosex Folat Folat Vasocard, Enapril Multivitamin 44 45 46 47 Scholl sol,Bactrim Evet Scholl sol,Antifosfat Multivitamin Ferrasanol Pyeloseptil Folat Grip Her gün Multivitamin Her gün Rocaltrol Scholl sol,Bactrim,Pyloseptil Cvit Her gün Rocatrol Phosex, Eprex Folat Her gün Norvasc 165 Tablo 28: Kontrol grubunun anket bilgileri Son 1 Ad yılda No Yaş Cinsiyet Kilo (kg) Boy (cm) Soyad olunan aşı 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 AY TY CK CK TK DK PB KEZ KEK GK TK OK YA LÖ AO CY BY EA OE DF 14 17 10 9 18 12 16 4 10 16 18 15 15 18 11 9 13 9 9 13 Kız Kız Erkek Erkek Erkek Kız Erkek Erkek Kız Kız Erkek Erkek Erkek Kız Kız Kız Kız Erkek Erkek Erkek 34 49 29 22 50 40 74 20 25 35 67 43 47 52 31 33 48 38 26 48 143 152 129 127 160 148 168 109 138 162 175 153 166 165 148 144 158 134 131 165 Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Yok Son 3 ayda çekilen rontgen Kol Yaşadığı BMI ortamda sigara 2 (kg/m ) içiliyor mu 16,63 21,21 17,43 13,64 19,53 18,26 26,22 16,83 13,13 13,34 21,88 18,37 17,06 19,10 14,15 15,91 19,23 21,16 15,15 17,63 Evet Evet Evet Evet Evet Evet Hayır Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet Evet İçilen çay (bardak/gün) 1 bardak 2 bardak 2 bardak 1 bardak 2 bardak 2 bardak 2 bardak --1 bardak 2 bardak 2 bardak 1 bardak 2 bardak 2 bardak 1 bardak 1 bardak 2 bardak 1 bardak --2 bardak Yaptığı spor aktivitesi Orta Orta Fazla Orta Fazla Orta Orta Orta Az Az Orta Fazla Fazla Az Az Az Az Orta Orta Az Spor aktivitesi süresi 4 saat 2 saat 3 saat 3 saat 5 saat 2 saat 2saat 2 saat 1 saat 1 saat 2 saat 3 saat 3 saat 1 saat 1 saat 2 saat 1 saat 2 saat 2 saat 2 saat 166 4.2. Hasta ve Kontrol Gruplarının Genel Özellikleri Hasta ve kontrol grubunun genel özellikleri Tablo 29’da gösterilmiştir. Tablo 29 : Hasta ve kontrol grubunun genel özellikleri Hasta Grubu Tx HD PreD Toplam 17 15 17 49 20 15,06(±3,05) 15,20(±3,17) 12,71(±5,15) 14,29(±4,03) 12,80(±3,87) Erkek N(%) 10(%58,8) 7(%46,7) 9(%52,9) 26(%53,1) 11(%55,0) Kız 7(%41,2) 8(%53,3) 8(%47,1) 23(%46,9) 9(%45,0) N a Yaş Ortalama (± ±SS) yıl Cinsiyet b N(%) Tx süresi Ortalama (± ±SS) ay HD süresi Ortalama (± ±SS) ay PreD süresi Ortalama (± ±SS) ay BMI Ortalama (± ±SS) Çevresel sigara etkisi Kontrol Grubu 22,35(±19,43) 29,75(±27,68) 41,35(±38,83) 23,98(±10,87) c 17,61(±3,29) 20,99(±7,56) 20,99(±8,27) 11 (%73,3) 9 (%52,9) 26 (%53,1) 17,79(±3,27) c Var N(%) 6(%35,3) Yok N(%) 11(%64,7) Alıyor N(%) 6(%35,3) Almıyor N(%) 11(%64,7) 0 (%0,0) 12(%70,6) 23 (%46,9) 19 (%95,0) Viral enf (son 2 yılda) Geçiren N(%) 2(%11,8) 1 (%6,7) 1 (%5,9) 4 (%8,2) 0 (%0,0) Geçirmeyen N(%) 15(%88,2) 14 (%93,3) 16 (%94,1) 45 (%91,8) 20 (%100,0) Aşı (son 1 yılda) Olan N(%) 4(%23,5) f 12 (%24,5) Olmayan N(%) 13(%76,5) 13 (%76,5) 37 (%75,5) Çekilen N(%) 7(%42,1) Çekilmeyen N(%) 10(%58,8) 8 (%53,3) 11 (%64,7) 29 (%59,2) 19 (%95,0) 2 bardak 2 bardak 2 bardak 2 bardak 2 bardak Az Az Orta d e 4 (%26,7) d 15 (%100,0) d 8 (%47,1) e 5(%29,4) e 23 (%46,9) 26 (%53,1) d e 19 (%95,0) 1 (%5,0) 1 (%5,0) d e Vitamin Rontgen (son 3 ayda) Çay içme alışkanlığı Spor yapma alışkanlığı Spor süresi (Ortanca) a 1 saat b h f g 4 (%26,7) f 4 (%23,5) 11 (%73,3) 7 (%46,7) 1 saat g 6 (%35,3) h 1 saat c g 20 (%40,8) f g 0 (%0,0) f 20 (%100,0) 1 (%5,0) g Orta h 1 saat h 2 saat h d, e, f, g [ (Anova test p>0,05 ), (Ki Kare test p>0,05), (kontrol-Tx p<0,05, Tukey test), h (kontrol-Tx, HD, PreD p<0,05, Ki Kare test), (kontrol-Tx, HD, PreD p<0,001, MannWhitney test)] 167 Tablo 29’da da görüldüğü gibi hasta grupları ve kontrol grubunda yer alan çocuklar yaş ve cinsiyet açısından uyumludur (p>0,05). Hasta ve kontrol grubu çocuklar sigara içmiyordu. Fakat, kontrol grubu çocuklarda çevresel sigara etkisine maruziyet Tx, HD, PreD ve toplam hasta (TH) gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksekti (p<0,05). BMI; kontrol ve hasta grubu arasında anlamlı bir farklılık bulunmamasına karşın (p>0,05), TX grubunda kontrol grubundan anlamlı bir şekilde yüksek bulunmuştur (p<0,05). Son iki yıl içinde viral enfeksiyon geçirme açısından kontrol ve hasta grubu ve her bir hasta grubu benzerlik göstermektedir (p>0,05). Hasta grubunun vitamin kullanma, son bir yılda aşı olma ve son 3 ayda röntgen çektirme yönünden kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı farklılığı vardı (p<0,05). TX ve HD gruplarında az enerji gerektiren spor aktiviteleri yapılırken, PreD ve kontrol gruplarında ise orta derecede enerji gerektiren spor aktiviteleri yapılıyordu. Kontrol grubunda spor yapma süresinin ortanca değeri 2 saat iken, hasta grubunda ise bu değer 1 saat idi. 168 Tablo 30: Tx hastalarının Tx, Tx öncesi HD ve ilk tanıdan itibaren; HD hastalarının HD ve ilk tanıdan itibaren; PreD hastalarının ilk tanıdan itibaren geçen süreleri TX TX öncesi İlk tanıdan HD İlk tanıdan Hasta Hasta Grup Süresi HD itibaren geçen Grup Süresi itibaren geçen No No (ay) süresi süre (ay) (ay) süre (ay) (ay) Tx 2 9 72 36 108 HD 3 6 Tx 3 25 7 60 72 HD 48 156 Tx 4 26 48 8 57 HD 36 44 Tx 5 27 1 48 54 HD 72 216 Tx 6 32 9 42 120 HD 12 132 Tx 7 34 30 48 144 HD 48 96 Tx 10 36 18 36 180 HD 60 60 Tx 11 38 3 6 9 HD 1 101 Tx 16 39 19 23 42 HD 3 60 Tx 17 40 1 47 48 HD 72 85 Tx 18 41 36 6 144 HD 60 132 Tx 20 43 24 6 120 HD 1/4 4 Tx 21 44 48 3 51 HD 12 72 Tx 22 45 12 12 36 HD 5 89 Tx 23 52 24 5 36 HD 14 72 Tx 28 18 40 60 Tx 29 10 72 88 PreD 12 24 13 PreD 60 14 PreD 2 15 PreD 18 24 PreD 10 30 PreD 10 PreD 31 4 33 PreD 7 35 PreD 8 37 PreD 14 42 PreD 28 46 PreD 1 PreD 47 120 48 PreD 156 49 PreD 168 50 PreD 37 51 PreD 36 169 4.3. Biyokimyasal Parametrelerin İncelenmesi Hasta ve kontrol grubunun biyokimyasal analizlerinin sonuçları tablo 31 ve 32’de, ortalama (±SS) ve ortanca değerleri (IQR) ise tablo 33 ve 34‘de gösterilmiştir. 170 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri BUN Kod Grup (mg/dl) Kreati nin (mg/dl) GFR* T. Triglise T. Albumin CRP Ca P Kolestrol rit protein (g/dl) (mg/L) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) Fe (ug/dl) 2 1 22 1,25 232,73 149 139 7,40 5,30 1,00 10,40 3,80 125,00 3 1 51 7,28 36,71 250 247 7,30 4,50 0,10 9,60 5,40 73,00 4 1 15 0,91 317,68 172 282 7,40 4,70 9,80 9,70 3,30 35,00 5 1 17 0,89 290,09 148 98 7,30 5,50 0,00 10,30 5,20 98,00 6 1 18 1,00 267,27 155 137 6,90 4,90 0,20 10,00 3,70 55,00 7 1 25 1,62 185,19 134 109 6,00 4,15 0,60 8,60 5,70 71,00 10 1 23 1,30 226,57 108 136 7,37 4,16 9,60 10,40 5,82 35,00 11 1 18 0,91 299,70 185 492 6,90 5,00 3,80 9,70 4,70 49,00 16 1 16 0,55 373,55 169 69 7,30 5,20 1,20 9,90 4,50 198,00 17 1 11 0,54 397,31 172 296 5,70 3,70 11,50 9,60 5,40 68,00 18 1 13 0,71 345,71 162 56 6,60 4,90 2,13 9,80 3,90 42,00 20 1 32 3,53 76,74 110 73 6,80 4,70 1,00 8,70 3,40 52,00 21 1 24 1,44 217,17 157 132 8,10 5,40 9,39 9,90 3,80 62,00 22 1 13 0,77 363,64 179 68 7,40 5,40 1,24 10,40 3,40 34,00 23 1 29 3,12 85,66 173 67 6,40 4,70 5,02 8,20 2,80 31,00 28 1 24 1,86 101,66 162 125 7,30 5,20 3,40 9,60 3,10 136,00 29 1 79 3,75 75,64 256 211 4,60 3,36 11,80 8,20 5,51 169,00 9 2 41 6,41 42,55 163 103 7,75 4,70 11,80 10,50 6,09 41,00 25 2 131 14,23 18,02 188 128 6,69 3,74 5,10 7,40 2,88 36,00 (*GFR, Schwartz formülü ile hesaplanmıştır) (Grup 1: Tx; Grup 2: HD; Grup 3: PreD) Ferritin (ng/ml) Homo Paratiroid sistein h (pg/ml) 56,03 618,00 84,00 404,00 19,00 11,00 44,00 134,00 107,00 124,00 16,56 115,62 54,38 31,17 11,94 118,00 148,00 55,00 302,00 22,30 19,83 18,48 13,31 10,92 8,60 13,30 10,10 9,66 5,87 9,40 35,00 17,50 23,20 31,80 14,20 9,60 14,21 30,20 22,20 663,50 51,84 162,50 57,16 129,00 84,43 37,29 46,95 86,00 40,80 546,20 121,90 111,60 1177,00 72,00 54,00 358,90 1100,00 Ürik Alkalen TAS IL-6 asit fosfataz (mmol/l) (pg/ml) (mg/dl) (U/L) 4,40 7,00 6,50 8,40 3,00 5,80 8,80 3,40 3,60 5,20 2,80 3,10 9,00 5,90 5,30 9,20 6,10 3,00 9,30 199 398 210 464 284 246 669 253 567 212 212 889 213 174 184 113 178 718 903 0,98 1,83 1,18 1,89 0,89 1,78 1,85 0,96 0,99 1,11 0,97 0,91 1,76 0,76 1,23 1,25 1,65 1,30 1,82 3,80 9,15 6,59 3,69 3,10 15,43 5,43 5,08 3,45 14,97 6,94 6,13 15,20 7,17 4,15 2,41 7,29 2,29 17,52 171 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri (devam) BUN Kod Grup (mg/dl) Kreati nin (mg/dl) GFR* T. Triglise T. Albumin CRP Ca P kolestrol rit protein (g/dl) (mg/L) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) 26 2 80 7,95 28,13 132 147 6,10 4,10 4,30 8,10 10,20 27 2 82 7,28 34,97 158 60 5,70 3,60 12,10 9,00 5,70 32 2 46 6,18 39,72 140 216 7,90 5,40 10,90 3,80 34 2 60 9,43 25,07 114 122 6,70 4,10 4,80 9,40 7,70 36 2 67 5,57 44,39 126 203 7,10 4,60 5,80 9,60 6,60 38 2 40 5,80 44,51 159 211 6,10 4,20 12,00 10,50 4,50 39 2 66 4,50 50,51 146 140 5,30 3,40 24,00 8,90 6,20 40 2 55 10,87 28,44 156 166 7,20 4,90 4,60 9,30 5,90 41 2 44 5,91 43,07 189 124 6,80 10,00 5,20 10,00 2,40 43 2 66 2,46 107,17 275 189 5,20 2,90 4,00 8,50 6,90 44 2 39 1,89 127,95 212 201 7,10 4,40 1,02 4,60 45 2 10 1,30 167,83 206 222 7,50 4,60 6,20 11,80 1,80 52 2 79 12,14 21,42 152 162 7,36 4,45 0,70 7,50 6,33 12 3 51 3,48 83,59 117 87 6,70 4,50 9,30 3,00 13 3 64 2,07 89,59 132 84 6,10 4,30 0,22 7,60 6,30 14 3 25 4,87 50,40 5,00 3,50 24,00 8,70 5,20 15 3 51 4,05 70,48 174 300 7,82 4,78 2,60 9,90 4,75 24 3 53 1,47 87,82 124 108 7,10 4,90 2,30 10,40 5,40 (*GFR, Schwartz formülü ile hesaplanmıştır) (Tx; Grup 2: HD; Grup 3: PreD) Fe (ug/dl) Ferritin (ng/ml) Homo Paratiroid sistein h (pg/ml) 45,00 186,00 15,10 61,00 226,00 11,06 576,35 51,00 123,00 10,12 49,00 211,00 14,29 2000,00 8,10 57,00 298,98 11,10 56,00 124,00 26,30 19,00 536,00 14,37 47,43 28,70 74,00 23,15 9,00 54,00 128,00 9,63 66,00 46,00 14,03 96,00 185,36 18,00 17,00 28,37 31,00 39,00 46,00 118,00 43,17 56,00 220,00 10,20 210,00 146,00 388,30 246,00 108,00 218,00 117,30 296,70 79,20 1743,00 107,10 174,00 108,90 1258,00 Ürik Alkalen TAS IL-6 asit fosfataz (mmol/l) (pg/ml) (mg/dl) (U/L) 4,30 6,30 3,80 6,80 4,30 4,10 6,70 7,10 6,40 4,60 4,40 1,40 6,70 5,80 9,60 6,40 7,80 7,80 500 148 269 216 311 89 290 189 136 132 252 432 652 155 111 108 288 1828 1,00 13,57 1,08 10,55 1,83 6,36 1,52 61,71 0,88 2,17 1,29 13,22 1,68 15,66 1,29 1,83 1,53 36,59 1,03 226,36 1,06 5,31 1,81 11,36 1,61 1,71 1,39 4,73 0,89 6,94 1,78 17,87 1,75 11,71 1,41 3,57 172 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri (devam) BUN Kod Grup (mg/dl) Kreati nin (mg/dl) GFR* T. Triglise T. Albumin CRP Ca P kolestrol rit protein (g/dl) (mg/L) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) 30 3 85 5,32 41,70 184 235 8,07 5,02 31 3 42 2,61 91,95 6,10 4,10 33 3 137 15,98 13,88 146 74 7,30 3,55 35 3 58 6,17 47,15 188 205 7,00 4,70 37 3 52 2,04 135,47 345 132 5,60 3,70 42 3 126 8,29 21,49 113 110 6,70 3,98 46 3 34 1,60 113,64 138 279 7,10 4,70 47 3 46 3,88 56,23 132 132 7,30 4,50 48 3 47 2,81 87,35 150 161 7,50 5,00 49 3 56 2,82 84,46 147 94 7,10 4,70 50 3 18 1,14 269,54 192 8,10 5,40 51 3 31 1,76 189,05 185 168 6,30 4,00 (*GFR, Schwartz formülü ile hesaplanmıştır) (Grup 3: PreD) 6,10 10,00 9,00 4,80 5,40 4,10 9,50 6,10 8,50 1,00 5,90 9,40 9,00 9,70 9,50 10,10 8,90 6,32 3,50 5,01 4,60 4,60 9,85 4,80 2,70 4,10 5,00 Fe (ug/dl) Ferritin (ng/ml) 71,00 215,00 478,19 120,00 140,00 42,00 15,00 67,00 124,00 77,00 115,00 26,00 117,00 46,16 64,00 44,95 185,00 11,14 67,00 21,65 4,10 123,00 81,61 Homo Paratiroid sistein h (pg/ml) 25,11 42,78 18,70 16,00 24,33 8,80 26,40 15,30 9,40 19,80 68,00 973,30 646,10 160,70 108,10 659,00 0,00 130,30 287,70 Ürik Alkalen TAS IL-6 asit fosfataz (mmol/l) (pg/ml) (mg/dl) (U/L) 8,40 3,80 7,40 6,50 8,10 6,80 6,30 1,60 5,30 6,10 442 131 274 167 142 571 213 168 696 280 5,90 75 1,91 1,36 1,40 23,69 1,78 2,29 1,83 3,10 1,88 4,38 1,62 5,90 1,55 2,87 1,83 6,36 1,27 4,50 1,11 3,10 0,80 2,41 1,37 3,34 173 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri (devam) AKI (mg/dl) No AST (U/L) ALT (U/L) HS CRP K Na Hematokrit Hb (mg/L) (mmol/L) (mmol/L) (%) (g/dl) 2 90 19 19 3 88 35 4 96 27 5 99 6 70 7 9 10 11 Eritrosit Lökosit (M/uL) (bin/uL) Trombosit (bin/uL) Sedim (mm/h) HDL-K (mg/dl) LDL-K (mg/dl) 0,06 4,1 137 42,3 14,4 5,08 8,28 239 7 37 84,2 18 89 3,4 139 31,6 10,3 3,68 5,15 161 60 41 159 15 14,9 3,6 138 38,8 12,7 4,91 4,51 245 23 39 87 21 17 0,7 3,6 139 42,7 14,3 4,77 10,8 229 2 46 71 22 15 1,5 4,3 136 31,3 10,3 3,84 7,79 322 22 38 90 68 13 11 0,1 4,3 140 30,7 10,1 3,8 7,31 282 3 30 83 101 16 11 2,1 5,2 144 33,9 11,3 3,47 6,3 257 23 61 101 87 21 12 2,9 4,8 144 30,9 10,2 3,92 13 352 0 36 63 82 30 24 0,8 3,8 144 37 12,4 3,98 6,45 346 16 32 80 12 103 23 25 0,74 4,4 134 34,5 11,5 3,86 6,26 226 21 35 65 13 100 15 0,22 141 141 14 4,61 1,89 3,05 91,4 42 73 14 101 13 6 15 100 9 11 16 85 34 17 91 28 18 87 20 91 21 22 3,2 142 19,8 9,14 3,61 12,6 242 0 11,5 6 144 30 10 3,39 6,87 210 55 35 114 25 1,9 3,8 139 39,3 13,6 4,58 9,12 429 7 56 101 25 13,8 4,8 138 32,2 10,7 3,69 9,61 255 6 28 89 20 26 0,17 3,3 145 35,5 12 4,21 7,6 312 11 58 93 18 10 0,06 4,1 141 30,4 9,97 3,62 6,47 170 27 42 53 86 8 20 0,93 5 140 44,8 15,1 5,3 6,73 241 16 32 98,6 98 13 12 0,12 4,1 142 38,2 13,7 4,85 7,64 298 5 43 122 174 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri (devam) No AKI (mg/dl) AST (U/L) ALT (U/L) HS CRP K Na Hematokrit Hb Eritrosit Lökosit Trombosit (mg/L) (mmol/L) (mmol/L) (%) (g/dl) (M/uL) (bin/uL) (bin/uL) 23 90 14 19 0,43 24 92 44 11 25 88 16 12 26 82 12 27 75 18 28 83 12 29 81 30 152 31 32 3,7 145 31,1 9,69 3,63 0,1 4 0,3 5,1 133 33 11,4 139 30,8 30,8 6 1,8 6 24 5,4 140 26,7 6 136 26,3 10 1,1 4,2 139 13 25 8 4,3 4,9 14 0,8 5,3 86 172 87 16 143 0 13 0 33 89 34 18 16 2 35 50 16 16 80 14 10 36 87 24 37 83 12 38 110 16 13 39 84 16 9 1,63 40 123 24 6 41 76 10 6 Sedim (mm/h) HDL-K (mg/dl) LDL-K (mg/dl) 6,14 259 27 67 92,6 4,12 10 259 14 46 58 3,82 4,72 197 54 28 68 8,6 3,22 5,97 149 22 25 89 8,8 3,08 5,38 137 21 47 87 31,9 10,7 3,95 4,74 245 13 53 90 141 21,3 7,14 2,69 4,87 148 50 44 172 138 31 10,2 3,71 8,83 436 30 40 110 3,5 139 16,6 5,5 2,6 15,4 257 0 5,6 146 28 9,89 3,17 12,7 393 44 28 68,8 4,9 138 15,6 5,22 1,8 4,47 131 77 29 105 258 6 138 34 11,1 3,6 12 121 30 45 30 1,1 4,2 138 33,3 11 4,05 6,37 176 16 61 96 12 0,8 6,3 139 35,4 11,5 4,53 6,37 208 3 28 63 15 0,9 5,4 142 36,6 12,1 4,42 7,63 187 45 137 161 3,8 139 21,6 7,4 3,11 10,2 254 19 32 84 4,1 137 21,6 7,18 2,42 7,9 312 54 45 73 0,4 3,9 143 32,7 10,6 4,04 5,96 177 12 31 93 2,2 5 138 29 9,36 3,71 4,68 184 21 49 96 175 Tablo 31: Hasta grubunun biyokimyasal değerleri (devam) No AKI (mg/dl) AST (U/L) ALT (U/L) HS CRP K Na Hematokrit Hb (mg/L) (mmol/L) (mmol/L) (%) (g/dl) 42 76 25 11 9,2 43 76 28 14 1,45 44 85 26 16 45 63 18 22 46 109 22 9 47 104 13 48 93 33 49 85 27 34 4,8 137 75 99 19 Trombosit (bin/uL) Sedim HDL-K LDL(mm/h) (mg/dl) K(mg/dl) 18,9 6,65 2,46 6,15 202 45 27 93 52 185 43 128,8 5 131 24 8,58 3,56 9,64 310 4,7 139 36,3 12 4,65 7,47 310 61 3,1 137 21,6 7,18 2,48 8,02 313 65 34 115 4,4 138 31,4 10,9 3,89 6,86 323 9 34 57,4 8 965 3,4 139 38,6 13 4,15 6,85 173 37 68,6 27 0,49 4,5 138 38,1 13,4 4,49 13,1 264 42 75,8 0,05 5,7 140 29,3 9,79 3,62 6,14 226 39 89,2 45,6 16,6 5,25 5,06 253 44 122,6 0 53 98,4 30,4 10 3,81 5,63 206 27 33 81 0,21 52 Lökosit (bin/uL) 0,69 50 51 Eritrosit (M/uL) 10 9 0,02 4,9 137 5,7 139 176 Tablo 32: Kontrol grubunun biyokimyasal değerleri Kreati T. Triglise T. Ürik Alkalen Fe Albumin CRP Ca P Fe Ferritin Homo Paratiroid TAS IL-6 nin GFD* kolestrol rit protein asit fosfataz bağlama (g/dl) (mg/L) (mg/dl) (mg/dl) (ug/dl) (ng/ml) sistein h (pg/ml) (mmol/l) (pg/ml) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) (mg/dl) (U/L) kap (ug/dl) No BUN (mg/dl) 1 14 0,56 140 153 80 7,8 5,2 1 10 5,5 53 25,59 7 76 3,3 2 13 0,72 116 139 56 7,5 5,2 3,17 9,5 5 48 13,11 7,9 118 2,5 3 18 0,56 127 127 38 6,7 4,7 1 9,3 5,2 34 17,35 7,5 35,8 2,3 4 16 0,55 127 140 44 7,1 5,1 1 9,3 5,3 50 8,69 8,6 33,9 2,2 5 14 0,64 138 101 28 6,8 5 1,51 9,4 4,7 74 18,08 10,2 41,5 4,1 6 16 0,63 129 101 67 6,8 4,7 1,81 9,6 5,7 75 11,21 11,9 29,6 4,5 7 15 0,86 107 91 33 7,2 5,1 1,7 9,5 3,3 100 33,53 11,5 44,1 8 13 0,5 120 151 32 6,5 4,5 1 9,5 5,2 84 25,9 6,8 9 10 0,55 138 135 66 7,4 5,1 1,38 10 4,4 75 17,61 9,2 10 13 0,65 137 130 53 7,5 5,2 1 9,9 3,5 73 13,38 11 12 0,85 113 126 81 6,9 5,1 1,63 9,6 4,9 147 46,21 12 13 0,66 128 148 73 7,5 5,2 2,32 9,6 5,7 104 13 12 0,72 127 121 47 7,4 4,9 1 9,6 5,6 14 10 0,5 182 150 82 6,7 4,6 1 9,5 5,1 1,8079 4,733 400 1,6867 2,988 368 180 1,5251 3,105 324 204 1,3231 2,523 376 228 1,5453 2,058 318 223 1,6665 6,477 350 5,8 108 0,8686 5,314 328 34,1 3 253 1,9089 30,43 363 41,8 3,2 226 1,8079 24,62 344 11,6 52,5 3,5 75 1,2625 22,52 333 1,63 37,8 5,7 95 1,8584 20,9 361 22,21 12,8 32,3 3,9 215 1,5958 14,5 448 36 6,84 16,4 94,6 4,1 1,9392 10,9 436 42 21,81 10,6 43,7 2,5 1,9291 7,291 397 66 15 8 0,85 96 131 69 6,6 4,7 1 9,2 3,9 44 20,35 11 21,1 3 1,1615 3,453 325 16 10 0,47 169 133 48 6,6 4,9 1 9,5 5,2 115 23,51 7,9 43,8 3,2 1,4847 4,965 367 17 7 0,54 161 161 149 7,6 5,1 1 9,9 4,5 161 25,6 10 25,7 4,3 1,5857 26,13 419 58 18 9 0,57 129 160 177 7,4 5 2,65 9,7 4,9 55 33,47 11,8 30,4 3,4 231 1,7069 14,03 371 19 15 0,55 131 171 53 7,6 5,2 6 9,7 5 35 66 8 8 4,6 250 1,6968 4,849 319 20 9 0,65 140 144 53 6,7 4,6 1,86 9,5 5,8 30 14,2 7,8 36,7 4,7 1,7675 8,802 377 (*GFD, Schwartz formülü ile hesaplanmıştır) 177 Tablo 33: Tx, HD, PreD, TH ve kontrol gruplarında biyokimyasal parametrelerin ortalama (± ±SS) ve ortanca (IQR) değerleri BİYOKİMYASAL PARAMETRELER N BUN * (5-18mg/dl) Kreatinin * (0,3-0,7mg/dl) Ürik asit * (2-5,5mg/dl) Total kolestrol* (121-205mg/dl) Trigliserit * (50-200mg/dl) Total protein (6-8g/dl) Albumin * (3,8-5,4g/dl) Kalsiyum (8,8-10,8mg/dl) Fosfor (4,5-5,5mg/dl) Demir (25-156ug/dl) Ferritin * (21,8-274,6ng/ml) Homosistein * (5-14 umol/L) Parathormon * (14-72pg/ml) Alk.fosfataz * (15-250U/L) TAS * (mmol/l) IL-6 (pg/ml) CRP * (0-6mg/L) Ortalama (±SS) b,c,e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) b,c,e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) b,c Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) b,e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) b,c,e Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) b Tx (a) 17 26,29 (±16,77) 22,00 (11,50) 1,85 (± 1,73) 1,25 (1,66) 5,74 (± 2,19) 5,80 (4,20) 167,12 (±38,86) 162,00 (27,50) 161,00 (±113,89) 132,00 (158,00) 6,87 (± 0,83) 7,30 (0,89) 4,75 (± 0,61) 4,90 (0,92) 9,59 (± 0,73) 9,70 (1,00) 4,32 (± 1,02) 3,90 (2,00) 78,41 (± 50,17) 62,00 (73,00) 123,34 (±157,61) 84,00 (103,92) 16,06 (± 8,24) 13,31 (11,44) 203,79 (±308,48) 84,43 (96,36) 321,47 (±210,50) 213,00 (239,50) 1,29 (± 0,40) 1,18 (0,80) 7,06 (± 4,27) 6,13 (4,48) 4,22 (± 4,37) 2,13 (8,70) a,e a,e e e e a,e a,e e a,e a,e Hasta Grubu HD (b) 15 60,40 (± 27,49) a,e 60,00 (38,00) 6,79 (± 3,69) a,e 6,18 (4,93) 5,28 (± 1,98) e 4,60 (2,60) 167,73 (± 40,99) e 158,00 (49,00) 159,60 (± 47,49) e 162,00 (79,00) 6,70 (± 0,85) 6,80 (1,26) 4,61(± 1,62) a,e 4,40 (0,96) 8,83 (± 2,49) 9,30 (2,40) 5,44 (± 2,18) 5,90 (2,80) 50,75 (± 14,50) 52,50 (18,00) 325,53 (±492,48) e 186,00 (247,00) 15,44 (± 7,41) e 14,12 (7,90) 417,62 (±497,99) a,e 232,00 (256,48) 349,13 (±243,35) 269,00 (352,00) 1,38 (± 0,33) 1,30 (0,61) 28,41 (± 57,02) 11,36 (15,23) 7,74 (± 6,00) e 5,20 (7,45) PreD (c ) 17 57,41 (± 31,92) 51,00 (23,00) 4,14 (± 3,59) 2,82 (3,20) 6,48 (± 1,89) 6,45 (1,98) 164,47 (± 56,70) 147,00 (53,00) 154,93 (± 73,77) 132,00 (120,25) 6,88 (± 0,85) 7,10 (1,20) 4,43 (± 0,55) 4,50 (0,85) 8,87 (± 1,39) 9,30 (1,20) 4,95 (± 1,65) 4,78 (1,25) 75,31 (± 43,89) 67,00 (68,75) 122,96 (±121,13) 115,00 (156,99) 22,64 (± 11,71) 19,25 (15,53) 390,10 (±398,97) 167,35 (547,48) 353,06 (±430,64) 190,50 (269,75) 1,50 (± 0,34) 1,55 (0,52) 6,36 (± 6,02) 4,38 (3,66) 5,69 (± 7,18) 4,10 (4,45) e e e e e e e e e e e e Toplam Hasta (d) 49 47,18 (± 30,25) 44,00 (38,50) 4,16 (± 3,65) 2,82 (4,67) 5,84 (± 2,05) 6,10 (2,78) 166,47 (±44,91) 158,00 (47,00) 158,70 (±83,02) 136,50 (104,75) 6,82 (± 0,83) 7,10 (1,17) 4,60 (± 1,00) 4,60 (0,85) 9,11 (± 1,66) 9,50 (1,35) 4,88 (± 1,69) 4,73 (2,07) 69,93 (± 41,99) 57,00 (33,50) 187,75 (±309,86) 118,00 (166,05) 17,92 (± 9,58) 14,37 (13,66) 320,90 (±400,14) 130,30 (291,79) 340,65 (±303,51) 231,00 (272,25) 1,39 (± 0,36) 1,37 (0,73) 13,35 (± 32,69) 5,90 (9,24) 5,73 (± 5,71) 4,60 (8,19) Kontrol Grubu (e) a,b,c,d a,b,c,d a,b,c,d a,b,c,d a,b,c,d b,c,d a,b,c,d a,b,c,d a,b,c,d d d b,c,d 20 12,35 (± 2,96) 13,00 (4,75) 0,63 (± 1,12) 0,60 (0,16) 3,69 (± 1,04) 3,45 (1,45) 135,65 (±20,92) 137,00 (24,50) 66,45 (± 37,13) 54,50 (33,50) 7,12 (± 0,42) 7,15 (0,80) 4,96 (± 0,24) 5,05 (0,48) 9,59 (± 0,22) 9,55 (0,20) 4,92 (± 0,70) 5,05 (0,90) 71,75 (± 37,44 64,00 (53,50) 23,23 (±13,76) 21,08 (12,24) 9,51 (± 3,02) 9,60 (3,75) 44,07 (±25,33) 37,25 (13,15) 172,29 (±74,10) 209,50 (138,75) 1,60 (± 0,28) 1,68 (0,31) 11,03 (± 9,07) 6,88 (15,52) 1,70 (± 1,19) 1,19 (0,85) [*p<0.05 ; a,b,c, e ile karşılaştırıldığında (Kruskal Wallis testi); d, e ile karşılaştırıldığında (Mann Whitney testi) 178 Tablo 34: Tx, HD ve PreD gruplarında biyokimyasal parametrelerin ortalama (± ±SS) ve ortanca (IQR) değerleri BİYOKİMYASAL PARAMETRELER N HDL kolestrol (30-80mg/dl) LDL kolestrol (60-130mg/dl) Açlık kan şekeri (60-100mg/dl) AST (0-40U/L) ALT (0-40U/L) HS CRP (0-0,3mg/L) Potasyum * (3,4-4,7mmol/L) Sodyum (138-145mmol/L) Hematokrit (35-45 %) Hemoglobin (11-15,5g/dl) Eritrosit (3,7-5,3M/uL) Lökosit (4,5-13,5bin/uL) Trombosit (130-400bin/uL) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) b,c Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) Ortanca(IQR) Ortalama (±SS) b,c Sedimantasyon * Ortanca(IQR) (0,15mm/h) [*(P<0,05 ) Kruskal Wallis test] Tx (a) 17 42,47 (± 10,73) 41,00 (15,50) 95,80 (± 30,44) 90,00 (18,30) 86,59 (± 8,39) 87,00 (8,50) 20,47(± 8,03) 20,00 (14,50) 16,82 (± 5,85) 17,00 (10,50) 7,81 (± 21,41) 0,93 (3,46) 4,11 (± 0,53) a 4,10 (0,90) 140,41 (± 2,76) 140,00 (4,50) 34,71 (± 5,90) 32,20 (8,05) 11,61 (± 2,14) 10,70 (3,50) 4,15 (± 0,67) 3,95 (1,13) 7,42 (± 2,27) 7,31 (3,05) 266,65 (± 72,81) 255,00 (83,00) 18,44 (± 16,54) a 14,50 (19,75) Hasta Grubu HD (b) 15 38,73 (± 10,81) 34,00 (19,00) 90,84 (± 34,84) 87,00 (32,20) 85,73 (± 17,95) 85,00 (23,00) 18,29 (± 5,25) 16,00 (8,00) 11,40 (± 4,60) 12,00 (8,00) 29,27 (± 80,69) 1,72 (6,95) 4,99 (± 0,92) a 5,10 (1,60) 139,00 (± 3,53) 139,00 (3,00) 28,82 (± 5,10) 29,00 (9,90) 10,95 (± 5,71) 9,89 (2,72) 3,51(± 0,65) 3,56 (0,71) 7,53 (± 2,55) 6,37 (4,01) 235,20 (± 79,30) 208,00 (133,00) 35,85 (± 24,99) a 27,00 (34,00) PreD (c ) 17 46,73 (± 26,44) 40,00 (11,00) 90,32 (± 29,19) 89,20 (45,40) 95,50 (± 18,32) 92,50 (19,00) 31,27 (± 39,98) 22,00 (14,00) 22,81 (± 32,94) 12,50 (12,75) 66,20 (± 248,67) 0,74 (1,79) 13,10 (± 34,11) 4,65 (1,33) 138,63 (± 2,83) 138,00 (3,50) 29,14 (± 9,41) 31,20 (16,95) 10,06 (± 3,25) 10,55 (4,68) 3,58 (± 0,95) 3,79 (1,35) 7,85 (± 3,35) 6,86 (3,57) 228,53 (± 78,61) 226,00 (79,75) 34,67 (± 22,53) 30,00 (35,00) 179 Tablo 33 ve 34’e görüldüğü gibi gruplar arasında [TX, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta (TH)] BUN, kreatinin, albumin, ferritin, total kolestrol, trigliserit, CRP, homosistein, parathormon, alkalen fosfataz, ürik asit, potasyum ve sedimantasyon değerlerinde anlamlı farklılık bulundu. Çoklu karşılaştırma sonuçlarına göre: • BUN değeri; TX grubunda HD ve PreD gruplarından anlamlı düşük (p<0,001) iken kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,05). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik 1). • Kreatinin değeri: TX grubunda HD ve PreD gruplarından anlamlı düşük (p<0,001) iken kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik 2). • Albumin değeri: TX grubunda HD ve PreD gruplarından anlamlı yüksekti (p<0,05). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı düşüktü (p<0,001) (Grafik 2). • Ferritin değeri: TX grubunda HD grubundan anlamlı düşükken (p<0,05), kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik 3). • Total kolestrol değeri: TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksekti (sırasıyla p<0,001; p<0,05; p<0,05; p<0,05) (Grafik 1). • Trigliserit değeri: TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik 1). • CRP değeri: TX grubunda HD grubundan anlamlı düşükken (p<0,05) HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksekti (sırasıyla p<0,001; p<0,05; p<0,05) (Grafik 4). 180 • Homosistein değeri: TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksekti (sırasıyla p<0,05; p<0,05; p<0,001; p<0,001) (Grafik 4). • Parathormon değeri: TX grubunda HD ve PreD gruplarından anlamlı düşük (p<0,05) iken kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik 3). • Alkalen fosfataz değeri: TH grubunda kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p>0,05). TX, HD ve PreD gruplarında da kontrol grubundan anlamlı yüksekti, fakat istatistiksel anlamlılığı yoktu (p>0,005) (Grafik 3). • Ürik asit: TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksekti (sırasıyla p<0,001; p<0,05; p<0,001; p<0,001) (Grafik 2). • TAS değeri: Kontrol grubunda TH grubundan anlamlı yüksekti (p<0,05). TAS, kontrol grubunda en yüksek, daha sonra sırasıyla PreD, HD ve TX grubu geliyordu. Fakat bu gruplar arasında istatistiksel anlamlılık yoktu (p>0,05) (Grafik 5). • IL-6 değeri: HD grubunda en yüksek, daha sonra sırasıyla kontrol, TX ve PreD grubu geliyordu. Fakat istatistiksel bir anlamlılık yoktu (p>0,05) (Grafik 5). • Potasyum değeri: TX grubunda HD ve PreD gruplarından anlamlı düşüktü (sırasıyla p<0,001; p<0,05). Bu değere sadece hasta gruplarında bakılmıştı (Grafik 6). • Sedimantasyon değeri: TX grubunda, HD ve PreD gruplarından anlamlı düşüktü (p<0,05). Bu değere sadece hasta gruplarında bakılmıştı (Grafik 6). 181 Trigliserit mg/dl 300 T kolestrol mg/dl 250 BUN Tx-HD Tx-PreD Tx-K HD-K PreD-K TH-K P<0,001 P<0,001 P<0,05 P<0,001 P<0,001 P=0,000 200 T kolestrol Tx-K P<0,001 HD-K P<0,05 PreD-K P<0,05 TH-K P<0,05 150 BUN mg/dl 100 50 0 Tx HD PreD K TH Trigliserit Tx-K P<0,001 HD-K P<0,001 PreD-K P<0,001 TH-K P=0,000 Grafik 1: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında BUN, total kolestrol, trigliserit değerleri [ortalama (± ±SS)] 12 Ürik asit Tx-K P<0,001 HD-K P<0,05 PreD-K P<0,001 TH-K P=0,000 Kreatinin mg/dl Ürik a mg/dl 10 Albumin g/dl 8 6 4 2 0 Tx HD PreD K TH Kreatinin Tx-HD P<0,001 Tx-PreD P<0,001 Tx-K P<0,001 HD-K P<0,001 PreD-K P<0,001 TH-K P=0,000 Albumin Tx-HD Tx-PreD HD-K PreD-K TH-K p<0,05 p<0,05 p<0,001 p<0,001 p<0,05 Grafik 2: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında ürik asit, kreatinin, albumin değerleri [ortalama (± ±SS)] 182 Parathormon Tx-HD p<0,05 Tx-PreD p<0,05 Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K p=0,000 Parat h pg/ml Alkalen f U/L 1000 800 Ferritin ng/ml 600 Alkalen fosfataz TH-K p<0,05 400 200 Ferritin Tx-HD Tx-K HD-K PreD-K TH-K 0 Tx HD PreD K TH p<0,05 p<0,001 p<0,001 p<0,001 p=0,000 Grafik 3: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında parathormon, alkalen fosfataz, ferritin değerleri [ortalama (± ±SS)] 40 Homosistein umol/L Homosistein Tx-K p<0,05 HD-K p<0,05 PreD-K p<0,001 TH-K p=0,000 35 30 CRP mg/L 25 20 CRP 15 Tx-HD P<0,05 HD-K P<0,001 PreD-K P<0,05 TH-K P=0,05 10 5 0 Tx HD PreD K TH Grafik 4: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında homosistein, CRP, değerleri [ortalama (± ±SS)] 183 40 35 IL-6 pg/ml 30 TAS TH-K 25 p<0,05 20 15 TAS mmol/L IL-6 10 p>0,05 5 0 1 Tx HD PreD K TH Grafik 5: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında TAS, IL-6 değerleri [ortalama (± ±SS)] Sedim mm/h 70 60 Potasyum Tx-HD P<0,001 Tx-PreD P<0,05 50 40 30 Potasyum mmol/L Sedim Tx-HD P<0,05 Tx-PreD P<0,05 20 10 0 Tx HD PreD Grafik 6: Tx, HD ve PreD gruplarında potasyum ve sedimantasyon değerleri [ortalama (± ±SS)] 184 4.4. Lenfositlerde Comet ve Modifiye Comet Değerlerinin İncelenmesi Comet Yönteminde lenfositlerdeki bazal DNA hasarının miktarı kuyruk yoğunluğu (tail intensity, TINT) ölçülerek analiz edildi. Oksidatif DNA hasarının ölçümünde ise okside edici pürinler için “Formamidopyrimidine DNA Glycosylase (FPG)”, okside edici primidinler için “Endonuclease III (Endo III)” enzimleri kullanıldı, TINTSENDO ve TINTSFPG ölçümüyle analiz yapıldı. Hasta ve kontrol grubunun TINT, TINTSENDO ve TINTSFPG değerlerine ilişkin sonuçlar tablo 35 ve 36’da gösterilmiştir. 185 Tablo 35: Hasta ve kontrol grubu çocukların lenfositlerde TINT, TINTSENDO, TINTSFPG değerleri Comet KOD GRUP NTINT Comet TINTSEND TINTSFPG KOD GRUP NTINT TINTSEND TINTSFPG 2 1 1,54 3,08 9,28 15 3 6,07 1,13 7,28 3 1 3,16 4,41 10,64 24 3 5,08 -0,35 0,73 4 1 4,15 1,85 9,15 30 3 5,23 0,87 1,49 5 1 8,47 -0,59 2,57 31 3 4,62 -0,87 -0,16 6 1 6,73 2,22 0,89 33 3 4,52 -0,17 3,35 7 1 7,62 3,76 3,29 35 3 5,62 -1,75 0,59 10 1 6,67 3,87 5,32 37 3 4,80 3,50 1,26 11 1 5,34 2,02 7,39 42 3 5,79 0,94 0,11 16 1 4,78 -0,06 7,72 46 3 6,35 0,73 1,75 17 1 6,53 -0,01 5,76 47 3 2,46 15,01 10,19 18 1 4,33 2,79 5,43 48 3 4,32 -0,84 3,96 20 1 8,48 3,42 4,97 49 3 6,24 12,17 -0,13 21 1 7,06 3,05 1,42 50 3 3,49 18,09 15,55 22 1 7,62 0,61 4,55 51 3 2,34 3,73 4,77 23 1 6,70 7,32 2,47 k1 4 2,63 0,30 -0,55 28 1 4,03 -6,65 -3,06 k2 4 2,91 3,79 0,96 29 1 5,29 0,25 -1,44 k3 4 14,43 -0,57 -1,91 -0,16 9 2 3,88 5,42 4,12 k4 4 0,52 -0,44 25 2 6,69 2,63 3,66 k5 4 1,24 2,99 0,51 26 2 6,56 -0,26 1,44 k6 4 3,47 -1,21 -1,93 27 2 4,21 -0,11 1,34 k7 4 1,40 2,89 3,26 32 2 3,93 7,63 4,54 k8 4 1,40 2,64 1,74 34 2 5,24 3,73 3,38 k9 4 0,89 1,53 2,50 36 2 3,47 0,53 0,53 k10 4 1,95 3,10 1,16 38 2 5,62 0,10 0,21 k11 4 1,21 2,65 3,35 39 2 4,07 5,21 -0,18 k12 4 2,36 4,44 1,60 40 2 6,04 1,82 -0,68 k13 4 3,53 3,53 3,89 41 2 3,47 0,36 1,12 k14 4 2,58 1,55 1,41 43 2 4,67 -1,56 -0,80 k15 4 0,83 0,83 4,54 44 2 7,74 2,00 1,60 k16 4 2,21 4,86 4,31 45 2 4,68 0,07 0,27 k17 4 1,76 0,80 -0,36 52 2 3,39 47,30 3,03 k18 4 3,33 9,87 3,75 12 3 4,98 7,11 8,71 k19 4 3,23 1,42 3,80 13 3 6,45 1,67 12,87 k20 4 2,93 1,55 5,57 14 3 5,36 -3,62 15,71 [Tx grubu (1), HD grubu (2), PreD grubu (3), kontrol grubu (4)] 186 Tablo 36: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında lenfositlerde TINT, TINTSENDO, TINTSFPG parametrelerinin ortalama (± ±SS) ve ortanca (IQR) değerleri Hasta Grubu GENOTOKSİSİTE PARAMETRELERİ N Ortalama (±SS) e Tx (a) HD (b) PreD (c ) Toplam (d) 17 15 17 49 5,79 (±1,94) e 4,91 (±1,35) e 4,92 (±1,23) e Kontrol Grubu (e) 20 5,22 (±1,57) a,b,c,d 2,74 (±2,91) TINT * Ortanca (IQR) COMET TINTSENDO Ortalama (±SS) Ortanca (IQR) Ortalama (±SS) b,e 6,53 (3,10) 4,67 (2,16) 5,08 (1,51) 5,23 (2,38) 2,29 (1,88) 1,84 (±2,96) 4,99 (±11,98) 3,37 (±6,16) 3,34 (±7,69) 2,33 (±2,44) 2,22 (3,47) 1,82 (5,15) 0,94 (6,01) 1,82 (3,78) 2,10 (2,62) 5,18 (±5,53) 3,84 (±4,27) 3,35 (8,79) 3,03 (4,93) 4,49 (±3,78) a,c 1,57 (±1,77) b,e a,c 1,87 (±2,17) TINTSFPG * Ortanca (IQR) 4,97 (5,61) 1,34 (3,17) 1,67 (3,78) [* (P<0,05 ); a,b,c, e ile karşılaştırıldığında (Kruskal Wallis testi); d, e ile karşılaştırıldığında (Mann Whitney testi)] 187 Tablo 36’da görüldüğü gibi gruplar (TX, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta) arasında: • Kuyruk yoğunluğu (TINT) değeri: TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksekti (p<0,001) (Grafik 7). • Pürin baz hasarı (TINTSFPG) değeri : Hem TX hem de PreD grubunda, HD ve kontrol gruplarından anlamlı yüksekti (p<0,05) (Grafik 7). • Primidin baz hasarı (TINTSENDO) değeri: HD grubunda en yüksek, sonra sırasıyla PreD, kontrol, Tx gruplarında azalmaktadır. Fakat istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlılık yoktu (p>0,05) (Grafik 7). COMET 18 16 14 TINTSENDO TINTSFPG TINT Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K 12 10 TINT TINTSENDO p>0,05 8 6 TINTSFPG Tx-HD p<0,05 Tx-K p<0,05 HD-PreD p<0,05 PreD-K p<0,05 4 2 0 Tx HD PreD K TH Grafik 7: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında TINT, TINTSENDO, TINTSFPG değerleri [ortalama (± ±SS)] 188 Kontrol grubumuzdan ve hasta grubumuzdan birer hastanın farklı comet görüntülerinin fotoğrafları şekil 34 ve 35’de, Comet Assay III görüntü analiz programı ile yapılan ölçümlerinin fotoğrafları ise şekil 36’de verilmiştir. (a) (b) ekil 34: k1 nolu kontrol grubu çocuğun n-1 kodlu lamından fotoğraflar 189 (a) (b) (c) (d) ekil 35: (a, b, c, d) 14 nolu prediyaliz grubu çocuğun n-1 kodlu lamından fotoğraflar 190 (a) (b) (c) ekil 36: (a) k1 nolu çocuğun, (b,c) 14 nolu çocuğun lenfositlerinde Comet Assay III görüntü analiz programı ile yapılan ölçümün fotoğrafları 191 4.5. Lenfositlerde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde NDI, MÇ’li bnh, MÇ/bnh, MÇ/mnh, nükleer bud/bnh, nükleoplazmik köprü/bnh değerlerine ilişkin sonuçlar tablo 37 ve 38’de gösterilmiştir. 192 Tablo 37: Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde NDI, MÇ’li bnh, MÇ/bnh, MÇ/mnh, Nköprü/bnh, Nbud/bnh değerleri KOD GRUP NDI MÇ li bnh MÇ/bnh MÇ/mnh Nköprü/bnh Nbud/bnh 2 1 1,76 3 3 5 0 1 3 1 1,66 2 2 5 3 0 4 1 1,44 7 7 10 1 0 5 1 1,69 1 1 7 1 0 6 1 1,44 3 3 10 6 3 7 1 1,71 7 7 9 0 0 10 1 1,85 3 3 3 0 1 11 1 2,05 3 3 1 0 0 16 1 2,08 11 12 10 5 1 17 1 1,68 7 7 11 7 0 18 1 1,61 4 4 7 1 0 20 1 1,80 6 6 3 0 0 21 1 1,86 5 5 3 1 1 22 1 1,86 4 4 2 0 0 23 1 1,59 5 5 4 1 0 28 1 1,26 7 8 21 7 0 29 1 1,92 24 24 23 15 1 9 2 1,96 1 1 2 1 0 25 2 2,11 7 7 7 6 0 26 2 2,25 8 8 6 0 0 27 2 2,44 3 3 0 1 0 32 2 2,10 9 10 4 4 0 34 2 1,99 15 15 0 0 0 36 2 2,09 10 11 2 0 3 38 2 2,28 12 12 6 0 0 39 2 2,29 8 8 5 0 0 40 2 2,53 6 6 2 1 0 41 2 2,39 7 7 5 0 0 43 2 1,95 14 14 22 4 10 44 2 2,24 9 9 4 0 0 45 2 1,88 5 5 5 1 0 52 2 1,91 19 20 11 1 0 12 3 2,10 6 6 3 0 0 [Tx grubu (1), HD grubu (2), PreD grubu (3), kontrol grubu (4)] 193 Tablo 37: Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde NDI, MÇ’li bnh, MÇ/bnh, MÇ/mnh, Nköprü/bnh, Nbud/bnh değerleri (devam) GRU KOD P NDI MÇ li hücre MÇ/bnh MÇ/mnh Nköprü/bnh Nbud/bnh 13 3 2,08 10 10 5 1 1 14 3 1,86 13 13 6 0 0 15 3 2,14 10 10 4 0 1 24 3 1,74 7 7 9 0 3 30 3 1,97 4 4 3 1 0 31 3 1,96 7 7 13 6 1 33 3 1,56 11 12 9 7 4 35 3 2,04 9 9 3 0 0 37 3 1,95 6 6 5 0 0 *42 3 - - - - - - 46 3 2,30 10 10 4 0 2 47 3 2,09 11 11 8 1 0 48 3 2,29 12 12 3 1 0 49 3 2,15 10 10 2 0 1 50 3 2,15 8 8 3 0 1 51 3 2,00 12 12 3 0 1 k1 4 1,91 2 2 3 0 1 k2 4 1,71 3 3 0 0 1 k3 4 2,11 2 2 0 0 0 k4 4 2,03 2 2 1 0 0 k5 4 2,07 3 3 1 0 0 k6 4 2,05 3 3 2 0 0 k7 4 2,06 1 1 2 0 0 k8 4 2,00 0 0 2 0 0 k9 4 2,12 0 0 1 0 0 k10 4 2,03 1 1 1 1 0 k11 4 1,77 1 1 2 0 0 k12 4 1,90 2 2 1 0 1 k13 4 2,27 0 0 0 0 1 k14 4 1,92 1 1 0 0 0 k15 4 2,14 2 2 1 0 0 k16 4 2,15 3 3 1 0 1 k17 4 1,99 2 2 2 0 0 k18 4 2,04 2 2 0 0 0 k19 4 2,04 1 1 1 0 3 k20 4 1,89 1 1 1 0 0 [Tx grubu (1), HD grubu (2), PreD grubu (3), kontrol grubu (4)] (*Teknik nedenlerden dolayı analiz yapılamadı) 194 Tablo 38: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında lenfositlerde NDI, MÇ’li bnh, MÇ/bnh, MÇ/mnh, Nköprü/bnh, Nbud/bnh değerlerinin ortalama (± ±SS) ve ortanca (IQR) değerleri GENOTOKSİSİTE PARAMETRELERİ Tx (a) N 17 b,c,e 1,72 (±0,22) Ortalama(±SS) NDI * Ortanca(IQR) 1,71 (0,26) MÇ li hücre Ortalama(±SS) b,c,e 6,00 (±5,24) Ortanca(IQR) 5,00 (4,00 ) * Ortalama(±SS) b,c,e 6,12 (±5,33) MÇ MÇ/bnh * Ortanca(IQR) 5,00 (4,00 ) Lenfositlerde 7,88 (±6,18) Ortalama(±SS) e MÇ/mnh * Ortanca(IQR) 7,00 (7,00 ) Nköprü/bnh Ortalama(±SS) e 2,82 (±4,05) Ortanca(IQR) 1,00 (5,50 ) * 0,47 (±0,80) Ortalama(±SS) Nbud/bnh Ortanca(IQR) 0,00 (1,00 ) Hasta Grubu HD (b) PreD (c ) 15 17 a 2,16 (±0,20) a 2,02 (±0,19) 2,11 (0,33 ) 2,06 (0,19 ) a,e 8,87 (±4,67) a,e 9,13 (±2,55) 8,00 (6,00 ) 10,00 (4,00 ) a,e 9,07 (±4,86) a,e 9,19 (±2,61) 8,00 (6,00 ) 10,00 (4,75 ) e 5,40 (±5,40) e 5,19 (±3,06) 5,00 (4,00 ) 4,00 (4,50 ) e 1,27 (±1,87) 1,06 (±2,17) 1,00 (1,00 ) 0,00 (1,00 ) 0,87 (±2,64) 0,94 (±1,19) 0,00 (0,00 ) 1,00 (1,00 ) e e e e Toplam (d) 49 1,96 (±0,27) 1,96 (0,36) 7,94 (±4,48) 7,00 (5,00) 8,06 (±4,58) 7,00 (5,75) 6,21 (±5,12) 5,00 (5,75) 1,75 (±2,96) 1,00 (1,00) 0,75 (±1,67) 0,00 (1,00) Kontrol Grubu (e) 20 2,01(±0,13) 2,03 (0,19 ) a,b,c,d 1,60 (±0,99) 2,00 (1,00 ) a,b,c,d 1,60 (±0,99) 2,00 (1,00 ) a,b,c,d 1,10 (±0,85) 1,00 (1,75 ) a,b,d 0,05 (±0,22) 0,00 (0,00 ) 0,40 (±0,75) 0,00 (1,00 ) a [* (P<0,05 ); a,b,c, e ile karşılaştırıldığında (Kruskal Wallis testi); d, e ile karşılaştırıldığında (Mann Whitney testi)] 195 Tablo 38’de görüldüğü gibi gruplar (TX, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta) arasında: • NDI (Nükleer bölünme indeksi) değerleri: TX grubunda, HD, PreD ve kontrol gruplarından anlamlı olarak düşüktü (p<0,001) (Grafik 8). • MÇ’li hücre sayısı/1000 bnh ve ve MÇ sayısı/1000 bnh değerleri: TX grubunda, HD ve PreD gruplarından anlamlı düşük (p<0,05) iken kontrol grubundan anlamlı olarak yüksekti (p<0,001). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı olarak yüksekti (p<0,001) (Grafik 8). • MÇ sayısı/mnh: TX, HD ve PreD gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksekti (p<0,001) (Grafik 9). • Nükleer köprü sayısı/bnh: TX ve HD gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksekti (sırasıyla p<0,001; p<0,05) (Grafik 9). 196 NDI Tx-HD p<0,001 Tx- PreD p<0,001 Tx-K p<0,001 Lenfositlerde MÇ 16 MÇ sayısı MÇ’li hücre MÇ’li hücre Tx-HD p<0,05 Tx-PreD p<0,05 Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 14 12 10 TH-K 8 p<0,001 NDI 6 MÇ sayısı Tx-HD p<0,05 Tx-PreD p<0,05 Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K p<0,001 4 2 0 Tx HD PreD K TH Grafik 8: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında NDI, MÇ’li hücre sayısı, MÇ sayısı [ortalama (± ±SS)] Lenfositlerde MÇ 16 MÇ sayısı/mnh MÇ sayısı/mnh Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K p<0,001 14 12 10 8 Nköprü sayısı/bnh N köprü sayısı/bnh p<0,001 Tx- K HD-K p<0,05 TH-K p<0,001 6 4 2 0 Tx HD PreD K TH Grafik 9: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında MÇ sayısı/mnh, Nköprü sayısı/bnh [ortalama (± ±SS)] 197 4.6. Lenfositlerde FISH Kombine Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde MÇ, S(+)MÇ, S(-)MÇ değerlerine ilişkin sonuçlar tablo 39 ve 40’da gösterilmiştir. 198 Tablo 39: Hasta ve kontrol grubunun lenfositlerde MÇ, S(-)MÇ, S(+)MÇ değerleri KOD GRUP MÇ S-MÇ S+MÇ KOD GRUP MÇ S-MÇ S+MÇ 2 15 1 4 3 1 3 8 1 3 24 1 0 0 0 3 5 1 4 30 1 7 5 2 3 6 2 5 31 1 4 4 0 3 8 2 6 33 1 1 0 1 3 10 6 7 35 1 6 4 2 3 20 12 10 37 1 2 0 2 3 6 2 11 *42 1 2 1 1 3 16 46 1 10 2 8 3 7 3 17 47 1 10 2 8 3 9 5 18 48 1 5 2 3 3 10 6 20 49 1 7 1 6 3 12 7 21 50 1 5 1 4 3 7 2 22 51 1 10 7 3 3 14 6 23 k1 1 5 2 3 4 1 0 *28 k2 1 8 4 3 2 *29 k3 1 24 4 3 1 9 k4 2 2 1 1 4 2 0 25 k5 2 8 1 7 4 2 1 26 k6 2 10 3 7 4 4 2 27 k7 2 4 2 2 4 1 1 32 k8 2 9 3 6 4 0 0 34 k9 2 11 4 7 4 1 1 36 k10 2 13 8 5 4 0 0 38 k11 2 8 2 6 4 1 1 39 k12 2 6 1 5 4 2 0 40 k13 2 5 0 5 4 1 0 41 k14 2 8 3 5 4 1 0 43 k15 2 9 1 8 4 1 1 44 k16 2 6 3 3 4 3 1 45 k17 2 5 4 1 4 2 0 52 k18 2 15 6 9 4 3 0 12 k19 3 7 2 5 4 3 1 13 k20 3 9 5 4 4 1 1 14 3 9 4 5 [Tx grubu (1), HD grubu (2), PreD grubu (3), kontrol grubu (4)] 7 4 4 6 4 8 4 4 4 4 5 5 8 1 1 2 2 1 2 0 0 0 0 0 2 1 1 0 2 2 3 2 0 (*Teknik nedenlerden dolayı analiz yapılamadı) 199 Tablo 40: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında lenfositlerde MÇ/bnh, S(-)MÇ, S(+)MÇ sıklığının ortalama (± ±SS) ve ortanca (IQR) değerleri GENOTOKSİSİTE PARAMETRELERİ N MÇ/bnh * FISH S(-)MÇ * S(+)MÇ * Ortalama (±SS) Ortanca (IQR) Ortalama (±SS) Ortanca (IQR) Ortalama (±SS) Ortanca (IQR) b,c,e c,e b,c,e Tx (a) 17 5,20 (±3,21) a,e 5,00 (5,00) 2,27 (±2,02) e 2,00 (3,00) 2,93 (±2,58) a,e 2,00 (3,00) Hasta Grubu Kontrol Grubu(e) HD (b) PreD (c ) Toplam (d) 15 17 49 20 7,93 (±3,45) a,e 9,19 (±3,69) e 7,48 (±3,78) a,b,c,d 1,75 (±1,12) 8,00 (5,00) 8,50 (3,00) 7,00 (5,00) 1,50 (2,00) 2,80 (±2,11) a,e 4,13 (±2,90) e 3,09 (±2,47) a,b,c,d 0,65 (±0,67) 3,00 (3,00) 3,50 (4,00) 2,00 (3,25) 1,00 (1,00) 5,13 (±2,45) a,e 5,06 (±1,44) e 4,39 (±2,38) a,b,c,d 1,10 (±0,97) 5,00 (4,00) 4,50 (1,75) 4,00 (3,25) 1,00 (2,00) [* (P<0,05 ); a,b,c, e ile karşılaştırıldığında (Kruskal Wallis testi); d, e ile karşılaştırıldığında (Mann Whitney testi)] 201 Tablo 40’da görüldüğü üzere gruplar (TX, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta) arasında: • MÇ sayısı/1000bnh (FISH): HD, PreD, Tx ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001), öte yandan TX grubunda, HD ve PreD gruplarından anlamlı düşüktü (p<0,05) (Grafik 10). • Sentromer(-)MÇ/1000bnh: TX grubunda, PreD grubundan anlamlı düşük (p<0,05) iken kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,05). HD, PreD ve TH grupları ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik 10). • Sentromer(+)MÇ/1000bnh: TX grubunda, HD ve PreD gruplarından anlamlı düşük (p<0,05) iken kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,05). HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001) (Grafik10). • Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında S(+)MÇ yüzdeleri, S(-) MÇ yüzdelerinden daha yüksek olarak tespit edilirken (p>0,05), HD grubunda S(+)MÇ yüzdeleri, S(-)MÇ yüzdelerinden anlamlı düzeyde yüksekti (p<0,05) (Tablo 41). Tablo 41: Hasta ve kontrol gruplarında lenfositlerde S(- )MÇ ve S(+)MÇ dağılımı TX grup HD grup * PreD grup Kontrol S(+)MÇ S(-)MÇ S(+)MÇ S(-)MÇ S(+)MÇ S(-)MÇ S(+)MÇ S(-)MÇ N 14 14 15 15 16 16 18 18 Ortalama 58,04 41,96 64,40 35,60 58,69 41,31 57,41 42,59 SS ± 31,05 ± 31,05 ± 21,04 ± 21,04 ± 15,83 ± 15,83 ± 42,09 ± 42.09 % 60,00 40,00 63,64 36,36 57,14 42,86 66,70 33,30 p 0,277 0,023 0,078 0,478 [*(P<0,05 ) Wilcoxon Signed Ranks Test] 202 MÇ sayısı Tx-HD p<0,05 Tx-PreD p<0,05 Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K p<0,001 FISH-MÇ 14 MÇ sayısı 12 10 S(-)MÇ S(+)MÇ 8 S(-)MÇ Tx-PreD Tx-K HD-K PreD-K TH-K p<0,05 p<0,05 p<0,001 p<0,001 p<0,001 S(+)MÇ Tx-HD Tx-PreD Tx-K HD-K PreD-K TH-K p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,001 p<0,001 p<0,001 6 4 2 0 1 Tx HD PreD K TH Grafik 10: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında MÇ, S(-)MÇ, S(+)MÇ sayısı [ortalama (± ±SS)] Iekil 37’de DAPI filtresi ile lenfositlerin çekirdek ve MÇ fotoğrafları, şekil 38’de ise FITC filtresi ile alınan sinyallerin fotoğrafları gösterilmiştir. 203 (a) (b) (c) ekil 37: DAPI filtresi ile lenfositlerin çekirdek ve MÇ fotoğrafları (a) 6 nolu çocuk hastada trinükleer hücrede MÇ, (b) 9 nolu çocuk hastada mononükleer hücrede MÇ, (c ) 27 nolu çocuk hastada binükleer hücre 204 ekil 38: FITC filtresi ile lenfositlerin (a) binükleer hücrede, (b) mononükleer hücrede sentromerlerinden alınan sinyallerin fotoğrafları 4.7. Bukkal Epitel Hücrelerinde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi Hasta ve kontrol grubunun bukkal epitel hücrelerinde MÇ sıklığı, MÇ’li hücre sayısına ilişkin sonuçlar tablo 42 ve 43’de gösterilmiştir. 205 Tablo 42: Hasta ve kontrol grubunun bukkal epitel hücrelerinde MÇ sıklığı KOD GRUP MÇ/1000 MÇli hücre 2 3 4 5 6 7 10 11 16 17 18 20 21 22 23 28 29 9 25 26 27 32 34 36 38 39 40 41 43 *44 45 52 12 13 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 7 17 2 6 4 14 5 7 9 6 10 4 9 11 34 10 9 9 13 9 7 2 27 16 5 17 1 13 5 3 6 37 8 15 5 14 2 5 4 9 4 5 7 5 7 4 4 10 23 7 7 5 9 8 6 2 17 8 5 11 1 5 4 2 5 16 4 11 KOD GRUP MÇ/1000 MÇli hücre 15 24 30 31 33 35 37 42 46 47 48 49 50 51 k1 k2 k3 k4 k5 k6 k7 k8 k9 k10 k11 k12 k13 k14 k15 k16 k17 k18 k19 k20 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 6 4 1 9 15 3 7 6 13 2 3 1 3 7 0 4 0 0 0 0 0 0 0 1 0 3 1 0 4 0 1 0 1 3 5 4 1 8 11 3 5 4 6 2 3 1 2 3 0 2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 3 1 0 2 0 1 0 1 2 [Tx grubu (1), HD grubu (2), PreD grubu (3), kontrol grubu (4)] (*Teknik nedenlerden dolayı analiz yapılamadı) 206 Tablo 43: Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında bukkal MÇ, MÇ’li hücre sıklıklarının ortalama (± ±SS) ve ortanca (IQR) değerleri GENOTOKSİSİTE PARAMETRELERİ N MÇ Bukkal MÇ * MÇ li hücre * Ortalama (±SS) Ortanca (IQR) Ortalama (±SS) Ortanca (IQR) Hasta Grubu Tx (a) 17 e 9,65 (±7,31) e 9,00 (5,00) e 7,18 (±4,97) e 5,00 (4,00) HD (b) 15 9,50 (±7,12) e 8,00 (9,25) 6,29 (±4,18) e 5,00 (4,75) Kontrol Grubu (e) PreD (c ) Toplam (d) 17 49 20 8,24 (±8,66) e 9,10 (±7,62) a,b,c,d 0,90 (±1,41) 6,00 (8,00) 7,00 (8,50) 0,00 (1,00) 5,24 (±4,09) e 6,23 (±4,43) a,b,c,d 0,65 (±0,93) 4,00 (4,50) 5,00 (4,00) 0,00 (1,00) [* (P<0,05 ); a,b,c, e ile karşılaştırıldığında (Kruskal Wallis testi); d, e ile karşılaştırıldığında (Mann Whitney testi)] 207 Tablo 43’de görüldüğü üzere gruplar (TX, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta) arasında: • Bukkal epitelde MÇ sayısı/1000 hücre ve MÇ’li hücre sayısı: TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan yüksekti (p<0,001) (Grafik 11). Bukkal MÇ MÇ sayısı 18 16 MÇ’li hücre 14 12 MÇ sayısı Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K p<0,001 10 8 MÇ’li hücre Tx-K p<0,001 HD-K p<0,001 PreD-K p<0,001 TH-K p<0,001 6 4 2 0 Tx HD PreD K TH Grafik 11: Tx, HD, PreD, kontrol ve toplam hasta gruplarında MÇ ve MÇ’li hücre sayısı [ortalama (± ±SS)] 4.8. Korelasyon Analizleri Hasta ve kontrol gruplarında genotoksisite parametreleri arasındaki korelasyon analiz sonuçları tablo 44 ve 45 ‘de gösterilmiştir. 208 Tablo 44: Hasta grubunda birbiriyle ilişkisi olan genotoksisite parametreleri* COMET TINTSENDO HASTA GRUBU (r , p) N Lenfositlerde MÇ TINTSFPG (r , p) N r=0,347 p=0,015 49 FISH-MÇ MÇ/1000bn MÇli bnh/1000bn (r , p) (r , p) N r=0,997 p=0,000 48 N S(+)MÇ (r , p) Bukkal MÇ S(-)MÇ N (r , p) MÇ li hücre N (r , p) N MÇ/1000h (r , p) N r=0,927 p=0,000 48 TINT COMET TINTSENDO TINTSFPG MÇ/1000bn Lenfositler MÇ FISH-MÇ Bukkal MÇ MÇli bnh/1000bn S(+)MÇ r=0,717 p=0,000 r=0,712 p=0,000 46 46 r=0,477 p=0,001 r=0,477 p=0,001 46 46 S(-)MÇ MÇ li hücre [*Spearman’s rho korelasyon testi] 209 Tablo 45: Kontrol grubunda birbiriyle ilişkisi olan genotoksisite parametreleri* COMET KONTROL GRUBU TINTSENDO (r , p) N TINTSFPG (r , p) N Lenfositlerde MÇ MÇli MÇ/1000bn bnh/1000bn (r , p) N (r , p) N TINT COMET TINTSENDO r=0,481 p=0,032 FISH-MÇ S(+)MÇ (r , p) r=0,464 p=0,039 Bukkal MÇ S(-)MÇ N (r , p) MÇ li hücre N (r , p) N MÇ/1000h (r , p) N r=0,989 p=0,000 20 20 20 TINTSFPG MÇ/1000bn Lenfositler MÇ FISH-MÇ Bukkal MÇ MÇli bnh/1000bn S(+)MÇ r=1,000 p=0,000 20 r=0,561 p=0,010 r=0,561 p=0,010 20 20 S(-)MÇ MÇ li hücre [*Spearman’s rho korelasyon testi] 210 Tablo 44 ve 45’de görüldüğü gibi: • Hasta ve kontrol grubunda TINTSENDO ile TINTSFPG arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi. Bu ilişki hasta grubunda r=0,347 (p=0,015) iken kontrol grubunda r=0,481 (p=0,032) idi. • Hasta ve kontrol grubunda lenfositlerdeki MÇ ile MÇ’li hücre sayısı arasında aynı yönde güçlü bir ilişki tespit edildi. Bu ilişki hasta grubunda r=0,997 (p=0,000) iken kontrol grubunda r=1,000 (p=0,000) idi. • Kontrol grubunda TINT ile S(+)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi (r=0,464 p=0,039). • Hasta ve kontrol grubunda lenfositlerdeki MÇ ile S(+)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi. Bu ilişki hasta grubunda r=0,717 (p=0,000) iken kontrol grubunda r=0,561 (p=0,010) idi. • Hasta ve kontrol grubunda lenfositlerdeki MÇ’li hücre sayısı ile S(+)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi. Bu ilişki hasta grubunda r=0,712 (p=0,000) iken kontrol grubunda r=0,561 (p=0,010) idi. • Hasta grubunda lenfositlerdeki MÇ ile S(-)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi (r=0,477 p=0,001). • Hasta grubunda lenfositlerdeki MÇ’li hücre sayısı ile S(-)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi (r=0,477 p=0,001). • Hasta ve kontrol grubunda bukkal MÇ’li hücre sayısı ile bukkal MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi. Bu ilişki hasta grubunda r=0,927 (p=0,000) iken kontrol grubunda r=0,989 (p=0,000) idi. Hasta ve kontrol gruplarında genotoksisite parametreleri ile biyokimyasal parametreler arasındaki korelasyon analiz sonuçları tablo 46 ve 47‘de gösterilmiştir. 211 Tablo 46: Hasta grubunda biyokimyasal parametreler ile genotoksisite parametreleri arasındaki ilişki* HASTA GRUBU TINT (r , p) N COMET TINTSENDO TINTSFPG (r , p) (r , p) N r=0,359 p=0,011 r=-0,372 p=0,009 49 N Lenfositlerde MÇ MÇ/1000bn MÇli bnh/1000bn (r , p) N (r , p) N FISH-MÇ S(+)MÇ S(-)MÇ (r , p) N (r , p) Bukkal MÇ MÇli hücre MÇ/1000h N (r , p) N (r , p) N r=0,325 p=0,024 48 r=0,292 p=0,044 48 YA BMI BUN Kreatinin 49 r=0,379 p=0,008 r=0,298 p=0,040 48 48 r=0,382 p=0,007 r=0,294 p=0,043 48 48 r=0,374 p=0,010 r=0,337 p=0,022 46 46 CRP Fosfor Demir Ferritin Homosistein Parathormon Alk. fosfataz TAS IL-6 Ürik asit Spor süresi İlk tanıdan itibaren geçen süre r=0,305 p=0,033 49 [*Spearman’s rho korelasyon testi] 212 Tablo 47: Kontrol grubunda biyokimyasal parametreler ile genotoksisite parametreleri arasındaki ilişki* KONTROL GRUBU TINT (r , p) N COMET TINTSEND O (r , p) N TINTSFPG (r , p) N Lenfositlerde MÇ MÇ/1000bn MÇli bnh/1000bn (r , p) N (r , p) N FISH-MÇ S(+)MÇ (r , p) Bukkal MÇ MÇ li hücre MÇ/1000h S(-)MÇ N (r , p) N r=0,463 p=0,040 20 (r , p) N (r , p) N YA BMI BUN r=-0,559 p=0,010 20 Kreatinin CRP Fosfor Demir r=0,511 p=0,021 r=-0,473 p=0,035 20 20 Ferritin Homosistein Parathormon Alk. Fosfataz TAS IL-6 r=-0,487 p=0,029 r=-0,600 p=0,005 20 20 r=-0,487 p=0,029 r=-0,600 p=0,005 20 20 Ürik asit Spor süresi [*Spearman’s rho korelasyon testi] 213 Tablo 46 ve 47’de görüldüğü gibi: • Kontrol grubunda fosfor ile TINT arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi (r=0,511 p=0,021). • Kontrol grubunda demir ile TINT arasında ters yönde bir ilişki tespit edildi (r=-0,473 p=0,035). • Kontrol grubunda CRP ile S(-)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi (r=0,463 p=0,040). • Kontrol grubunda TAS ile; lenfositlerdeki MÇ ve MÇ’li hücre sayısı arasında ters yönde bir ilişki (r=-0,487 p=0,029) tespit edildi. • Kontrol grubunda IL-6 ile; lenfositlerdeki MÇ ve MÇ’li hücre sayısı arasında ters yönde bir ilişki (r=-0,600 p=0,005) tespit edildi. • Kontrol grubunda BUN ile TINTSFPG arasında ters yönde bir ilişki tespit edildi (r=-0,559 p=0,010). • Hasta grubunda BMI ile TINTSFPG arasında aynı yönde bir ilişki tespit edildi (r=0,359 p=0,011). • Hasta grubunda BUN ile; TINTSFPG arasında ters yönde bir ilişki (r=-0,372 p=0,009), lenfositlerdeki MÇ arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,379 p=0,008), lenfositlerdeki MÇ’li hücre sayısı arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,382 p=0,007) ve S(+)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,374 p=0,010) tespit edildi. • Hasta grubunda kreatinin ile; lenfositlerdeki MÇ arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,298 p=0,040), lenfositlerdeki MÇ’li hücre sayısı arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,294 p=0,043), S(+)MÇ arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,337 p=0,022) tespit edildi. • Hasta grubunda IL-6 ile; bukkal MÇ arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,292 p=0,044), bukkal MÇ’li hücre sayısı arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,325 p=0,024) tespit edildi. • Hasta grubunda ilk tanıdan itibaren geçen süre ile; TINTSENDO arasında aynı yönde bir ilişki (r=0,305 p=0,033) tespit edildi. 214 Hasta grubunda Tx,HD ve Prediyaliz süreleri ile incelenen genotoksisite parametreleri arasındaki korelasyon analiz sonuçları tablo 48’de gösterilmiştir. Tablo 48: Tx, HD ve PreD süreleriyle genotoksisite parametrelerinin ilişkisi* TINT Lenfositlerde MÇ/1000bnh Bukkal MÇ/1000h Tx süresi HD süresi PreD süresi -0,171 0,512 17 0,256 0,321 17 0,072 0,785 17 -0,018 0,949 15 -0,249 0,371 15 0,167 0,585 15 -0,183 0,483 17 0,106 0,695 17 -0,535 0,027 17 r p N r p N r p N [*Spearman’s rho korelasyon testi] Tablo 48’de de görüleceği gibi; Tx ve HD süreleriyle TINT, lenfositlerde MÇ/1000bnh ve bukkal MÇ/1000h ile arasında bir ilişki gözlenmezken, sadece PreD süresiyle bukkal MÇ/1000h arasında ters yönde anlamlı bir ilişki görüldü (r= -0.535; p=0.027). 4.9. Regresyon Analizi Değişkenler arasındaki ilişkinin yapısı ve derecesini incelemek amacıyla Çoklu Adımsal Doğrusal Regresyon Analizi yapıldı. Regresyon analizinde genotoksisite parametreleri üzerinde etkili olabilecek çok sayıda faktör bulunduğundan regresyon analizi iki adımda gerçekleştirildi. ilk aşamada klinik ve istatistiksel olarak genotoksisite parametrelerindeki değişimi en fazla belirleyecek faktörleri tespit etmek amacıyla eleminasyon yapıldı. Bu işlemin önemi işe yaramayacak olan faktörleri belirleyerek işe yarayacak diğer faktörlerle yola devam etmekti. Birinci adımda BUN, ürik asit, kreatinin, ferritin, TAS, spor süresi ve vitamin kullanımı genotoksik parametreleri etkileyen değerler olarak 215 belirlendi (p<0,05). İkinci aşamada Tx, HD ve PreD grubunda olmak, yaş, cinsiyet, BMI, pasif sigara içiciliğinin de içinde bulunduğu gruba birinci aşamada belirlenen parametreler ilave edilerek regresyon analizi gerçekleştirildi (Tablo 49). Tablo 49: Regresyon analizi parametreleri üzerine etkisi TINT Comet TINT SENDO TINT SFPG ile belirlenen Lenfositlerde MÇ MÇ MÇli bnh 0,973 0,909 B 0,000 0,000 p 0,886 1,321 B HD grubu 0,003 0,000 p 0,792 0,651 1,335 B PreD grubu 0,001 0,032 0,000 p 0,060 B Yaş 0,011 p B Cinsiyet p - 0,096 - 0,084 B BMI 0,000 0,000 p B Pasif sigara p B Spor saati p X B BUN X p B Kreatinin p X B TAS X p X B Ürik asit X p B Ferritin p X B Vitamin kullanımı p X X: Birinci adımda genotoksik parametreleri etkileyen değerler TX grubu parametrelerin genotoksisite FISH-MÇ S(+)MÇ S(-)MÇ 0,914 0,684 Bukkal MÇ MÇli MÇ hücre 0,690 1,445 1,566 0,000 1,322 0,002 1,327 0,003 1,080 0,000 1,151 0,000 1,318 0,000 1,349 0,000 0,000 1,155 0,000 0,002 1,254 0,000 0,003 1,094 0,000 0,007 1,156 0,000 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 216 Tablo 49’de görüldüğü gibi: • TINT’yi etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “Tx grubunda olmak” (B=0,973; p=0,000), “HD grubunda olmak” (B=0,886; p=0,000) ve “PreD grubunda olmak” (B=0,792; p=0,001) olarak güçlü bir etki tespit edildi. • TINTSENDO’yu etkileyen değerler; “Yaş” aynı yönde zayıf bir etki (B=0,060; p=0,011), “BMI” ise ters yönde zayıf bir etki (B=-0,096; p=0,000) olarak tespit edildi. • TINTSFPG’yi etkileyen değerler; “PreD grubunda olmak” aynı yönde orta derecede bir etki (B=0,651; p=0,032) ve “BMI” ise ters yönde zayıf bir etki (B=-0,084; p=0,000) olarak tespit edildi. • Lenfositlerdeki MÇ’i etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “PreD grubunda olmak” (B=1,349; p=0,000), “HD grubunda olmak” (B=1,321; p=0,000) ve “Tx grubunda olmak” (B=0,909; p=0,000) olarak güçlü bir etki tespit edildi. • Lenfositlerdeki MÇ’li hücre sayısını etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “PreD grubunda olmak” (B=1,349; p=0,000), “HD grubunda olmak” (B=1,322; p=0,000) ve “Tx grubunda olmak” (B=0,914; p=0,000) olarak güçlü bir etki tespit edildi. • Lenfositlerdeki S(+)MÇ’yi etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “HD grubunda olmak” (B=1,327; p=0,000), “PreD grubunda olmak” (B=1,155; p=0,000) ve “Tx grubunda olmak” (B=0,684; p=0,002) olarak güçlü bir etki tespit edildi. • Lenfositlerdeki S(-)MÇ’yi etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “PreD grubunda olmak” (B=1,254; p=0,000), “HD grubunda olmak” (B=1,080; p=0,002) ve “Tx grubunda olmak” (B=0,690; p=0,003) olarak güçlü bir etki tespit edildi. • Bukkal MÇ’yi etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “Tx grubunda olmak” (B=1,566; p=0,000), “HD grubunda olmak” (B=1,318; p=0,007) ve “PreD grubunda olmak” (B=1,156; p=0,000) olarak güçlü bir etki tespit edildi. 217 • Bukkal MÇ’li hücre sayısını etkileyen değerler; Yüksekten düşüğe doğru sırasıyla “Tx grubunda olmak” (B=1,445; p=0,000), “HD grubunda olmak” (B=1,151; p=0,003) ve “PreD grubunda olmak” (B=1,094; p=0,000) olarak güçlü bir etki tespit edildi. • Cinsiyet ve çevresel sigara etkisi, incelenen genotoksisite parametrelerini etkilememiştir (p>0.05). 218 5. TARTIMA Kronik böbrek hastalığı böbrek fonksiyonlarında şiddetli ve geri dönüşümsüz bir azalma ile karakterize olup, artan insidansı, yüksek maliyeti ve kötü prognozu ile dünya genelinde bir halk sağlığı problemi oluşturmaktadır. Diyaliz ve transplantasyon kronik böbrek hastalarında yaşamı uzatan ve uzun süreli yarar sağlayan etkin tedavi şekilleridir. Türk Nefroloji Derneğinin 2008 verilerine göre HD’ye giren hastalarının %1’ini, transplantasyon yapılan hastaların ise %9,4’ünü 0-19 yaş grubu çocuklar oluşturmaktadır177. Her ne kadar SDBH popülasyonunun küçük bir yüzdesini kapsamakta ise de çocukların kendilerine özgü karakteristikleri ve problemleri vardır. Bu nedenle çocuklarda böbrek hastalığının tedavisi için multidisipliner bir takım çalışmasına ihtiyaç vardır15. Kronik böbrek hastalığı olan çocuklar, yetişkinlere göre üremiye daha uzun süre maruz kalmaktadırlar12. Üremide artan oksidatif stresin, kardiyovasküler hastalık ve malignite riskinin artışı ile de ilişkili olduğuna inanılmaktadır13. Üremik hastalarda malignite görülme olasılığının, aynı yaş ve cinsiyetteki normal kişilerden 7 kat daha fazla olduğu bildirilmiştir. Üremik hastalarda çoğunlukla mezanşimal kökenli malignansiler gelişirken, transplantasyon sonrası hastalarda çoğunlukla epitelyal kökenli malignansilerin gelişiyor olması, malign oluşumda değişik mekanizmaların varlığını düşündürür1. Çocukluğundan beri kronik böbrek hastalığı olan gençlerde uzun dönem malignansi riski yeterince değerlendirilmemiştir. 1963-2002 yılları arasında Avustralya ve Yeni Zelanda’da SDBH olan 1634 çocuk ve adolesanın incelenen kayıtlarına göre; böbrek nakli yapılan çocuklar arasındaki ölümlerin %14’ünü, hemodiyalizdeki çocuklar arasındaki 219 ölümlerin %1’ini ve periton diyalizdeki çocuklar arasındaki ölümlerin %2’sini malign hastalıkların oluşturduğu tespit edilmiştir. Malign hastalıktan ölümlerin genellikle geç dönemde gerçekleştiği gözlenmiştir. RRT başlandığında yaşı daha büyük olan çocukların, çok küçük yaştaki çocuklara göre, uzun dönemde sağ kalım için daha fazla şanslı olduğu görülmüştür14. Pediatrik Tx hastalarında yapılan çalışmalarda lenfomaların bütün malignitelerin %52’sini oluşturduğu, bunu sırasıyla deri maligniteleri104, vulva ve perineumun sarkoma ve karsinomaları, tiroid karsinoma, Kaposi sarkoma, baş boyun kanserleri, serviks karsinoma, lösemi ve renal karsinomanın izlediği görülmüştür103. Bu nedenle özellikle çocuk hastalar, daha ayrıntılı incelenmeli ve malignite yönünden takip edilmeye devam edilmelidir. 2003 yılında WHO’nun Bangkok bildirgesinde, çocukların çok sayıda kimyasal, fiziksel ve biyolojik ajanın etkilerine karşı çok savunmasız olduğu açıklanmıştır. Yetişkinlere göre çocukların savunmasızlığının artması üç ana faktöre bağlıdır. Birincisi; çocuklar, yaşam biçimi ve fizyolojileri nedeniyle çevresel toksinlere daha yüksek dozda maruz kalırlar. İkincisi; çevresel toksinlerin çocuklardaki metabolizmasıyla ilgilidir. Yetişkin ve çocukta maruziyet benzer olabilir ama, hedef organa ulaşma miktarında farklılık olabilir. Üçüncüsü; maruziyet çocuklukta başlarsa, bedeninde maruziyetin kronikleşmesi ve advers sağlık etkilerinin ortaya çıkması için yeterince zamanın olmasıdır. Çocuklukta bazı maruziyetler daha sonraki yıllarda malignansi riskini artırabilir. Örneğin, hayatın erken dönemindeki enfeksiyonların çocukluk dönemi lösemilerinin etyolojisinde, hepatit B virüs enfeksiyonlarının da hepatosellüler karsinoma gelişiminde rol oynadığı düşünülmektedir178. Çocuklarda metabolizması da, ilaçların fizyolojik absorbsiyonu, özelliklerinden dolayı dağılımı ve yetişkinlerden farklıdır178. Çocuklarda verilen ilaçların plazma proteinlere bağlanma 220 miktarı yaşla değişim göstermekte ve yetişkinlere göre proteinlere daha az bağlanma nedeniyle, artmaktadır178. bağlanmamış Örneğin çocuklarda toksinlerin CsA’nın plazma emilimi seviyeleri daha az, metabolizması ise erişkinlerden daha hızlıdır. Bu nedenle doz ayarlamaları önem taşımaktadır55. Oksidatif stresin, genotoksik hasar ile ilişkisi ve genotoksisitenin de kansere giden yolakta ara bir basamak olarak öngörülmesi7, etkinin biyogöstergeleri olarak genotoksisite testlerinin kullanımını yaygınlaştırmıştır. Genomik hasar göstergesi olarak en fazla kullanılan genotoksisite yöntemleri: Mikroçekirdek Yöntemi (MÇ), Comet Yöntemi, Kromozomal Aberasyon (CA), Kardeş Kromatid Değişimleri (SCE), Floresan In Situ Hibridizasyon Yöntemi (FISH), protein katım ürünleri, DNA katım ürünleri, hipoksantin guanin-fosforiboziltransferaz (HPRT) mutasyonlarıdır106. Bu göstergelerden Comet Yöntemi oksidatif hasarın tespitinde152, lenfositlerdeki MÇ Yöntemi ise kanser riskini öngörmede17 kullanılan önemli göstergelerdir. Karsinojen ve mutajenlerin oluşturduğu bazal DNA hasarının, bazal DNA hasarı olan hücre sıklığının ve hücre ölümünün tespitinde ise bukkal epitel hücreleri yaygın biçimde kullanılmaktadır18. KBH olan yetişkin hastalarda genomik hasarın varlığı periferal kan lenfositlerinde mikroçekirdek (MÇ), Comet, lökositlerde 8OHdG, bukkal mukoza epitelinde MÇ ölçümü gibi çeşitli yöntemlerle gösterilmiştir19,179. Fakat KBH olan çocuklarda, genotoksik hasar düzeylerinin incelendiği herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle yapılan çalışmamızda prediyalizde olan, hemodiyaliz tedavisi gören ve böbrek nakli yapılmış çocukların lenfositlerindeki oksidatif/DNA hasarı düzeyleri Comet ve MÇ Yöntemleri ile, genotoksik hasarın klastojenik mi yoksa anojenik bir mekanizmayla mı oluştuğu FISH kombine MÇ Yöntemi ile, bukkal mukozanın eksfoliye epitel hücrelerindeki bazal 221 DNA hasarı ise MÇ Yöntemi ile ölçüldü. Ayrıca biyokimyasal parametrelerin DNA hasar düzeylerine etkisi incelendi. Çalışmamız tablo 29’da görüldüğü gibi 0-19 yaş arasında 17 prediyaliz (PreD), 15 hemodiyaliz (HD), 17 böbrek nakli yapılmış çocuk hastada (Tx) ve kontrol grubu olarak yaş-cinsiyet uyumlu (p>0,05) 20 sağlıklı çocukta gerçekleştirildi. 5.1. Biyokimyasal Parametrelerin İncelenmesi Çalışmamızda kronik böbrek hastalığı olan çocuk hastaların (PreD, HD, Tx) ve sağlıklı kontrol grubu çocukların biyokimyasal parametrelerinin analizi yapıldı. Tablo 33’de de görüldüğü gibi BUN, kreatinin, ürik asit, total kolestrol, trigliserit, parathormon, ferritin, homosistein değerleri tüm hasta gruplarında kontrol grubundan, CRP değeri ise sadece HD ve PreD gruplarında kontrol grubundan anlamlı şekilde yüksektir (p<0,05). Albumin değeri Tx grubunda ve kontrol grubunda HD ve PreD gruplarından anlamlı şekilde yüksektir (p<0,05). Bu değerler KBH’nın bir sonucu olarak beklenen değerlerdi. Çünkü üremik semptomların patogenezisinde hormonal değişiklikler, BUN, kreatinin, homosistein ve ileri glikozilasyon son ürününleri gibi organik bileşikler ve inorganik maddeler rol oynamaktadır3. Çalışmamıza benzer şekilde Ece A ve ark.nın13 çalışmasında da PreD ve periton diyalizde (PD) olan çocuklarda üre, ürik asit, kreatinin, total kolestrol ve CRP değerleri kontrol grubundan yüksek olarak tespit edilmiştir (p<0,001). Albumin seviyesi ise çalışmamızdakinin aksine hasta ve kontrolde benzerlik gösterirken (p>0,001), PreD grubunda PD grubundan yüksektir (p<0,001). Stoyanova ve ark.nın yetişkinlerdeki çalışmasında16 albumin seviyesi PreD hastalarında HD hastalarından yüksektir (p<0,001). Aynı çalışmada16 parathormon, CRP, ferritin ve 222 homosistein değerleri ise HD grubunda PreD grubundan yüksektir (p<0,001). Parathormon Fivush BA ve ark.nın 180 değeri çalışmamızdakine benzer şekilde, çocuklarda yapılan çalışmasında da, PreD grubunda kontrol grubuna göre yüksektir (p<0,05). Parathormonun aşırılığının kronik böbrek hastalarında karsinojenezisin artışındaki etkisi halen tartışmalıdır67. Serum ferritin değeri, Tarng DC ve ark.nın yetişkinlerdeki çalışmasında en yüksek PD grubundaydı (p<0,05) ve çalışmamızdakine benzer şekilde bunu PreD ve kontrol grupları takip ediyordu. Enflamasyonun veya karaciğer hastalığının yokluğunda, demir birikiminde artış olması, çok miktarda intravenöz demir ilaçlarının kullanıldığını veya daha önce çoklu kan nakillerinden yapılmış olduğunu düşündürür. Çalışmamızda 1 PreD, 1 Tx, 10 HD hastası eritropoetin kullanırken 1 PreD, 4 HD hastası ise oral demir tedavisi görüyordu. Demir, hücresel bir değişim elementidir ve onun iyonik formları tek elektron transfer reaksiyonlarına katılmaya eğilimlidir. Bu kapasite, demirin serbest radikal oluşumuna katkıda bulunmasına olanak sağlar. Oluşan çok reaktif hidroksil radikalleri lipit peroksidasyonunu veya DNA hasarını başlatır. Demir metabolizması ve hidroksil radikallerinin üretimi oksidatif DNA hasarının seviyesiyle yakından ilişkilidir82. Aksu BY’nin çalışmasında demir eksikliği anemili çocuklarda, tedavi dozunda verilen oral demir tedavisi sonrasında, tedavi öncesine göre DNA hasarında artmanın olduğu gösterilmiştir. Bu durumun oral demir takviyesinin oksidan-antioksidan dengeyi oksidanların lehine bozmasıyla oluşturduğu düşünülmektedir74. Kronik böbrek yetmezliği olan yetişkinlerde artan kardiyovasküler mortalite ve morbidite iyi tanımlanmıştır. Kronik böbrek 223 yetmezliğinde endotel hasarı için muhtemel bir mekanizma, yüksek homosistein seviyesinin varlığıdır ve aterosklerozun patogenezisinde rol oynamaktadır. Gençlerde kardiyovasküler mortalite ve morbiditede kronik böbrek yetmezliğinin advers etkisi, kontrol grubundan 500 kat daha yüksek orandadır. Homosistein seviyesi, kronik böbrek yetmezliği olan yetişkinlerde artmakta ve böylece aterosklerozun patogenezisinde rol oynamaktadır12. Üremik hastalarda homosisteinin özellikle okside formlarının birikimi nedeniyle, serbest oksijen radikalleri aşırı miktarda üretilmekte ve antioksidan savunma mekanizmaları bozulmaktadır31. Homosistenin DNA metiltransferaz üzerinde, inhibe edici etkisi yüzünden hiperhomosisteinemisi olan diyaliz hastalarının DNA’sının hipometillenmiş olduğu tespit edilmiştir. Hipometillenen DNA, daha kararsız olmaya meyillidir. Bu durum diyaliz hastalarında görülen artan genomik hasar için mekanistik bir açıklama olabilir. Sağlıklı kişilerde plazma homosisteini, periferik kan lenfositlerinde gözlenen genomik hasarın derecesiyle korelasyon gösterir33. Tablo 33’de de görüldüğü gibi çalışmamızda homosistein değeri, en yüksek PreD grubunda sonra sırasıyla Tx ve HD grubunda tespit edilidi, fakat farklılık anlamlı değildi (p>0,05). Homosistein değeri, tüm hasta gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,05). Çocuklarda homosisteinle ilgili veriler sınırlı olup, çalışmamıza benzer şekilde homosistein değeri Richards KB ve ark.nın çalışmasında12, PreD grubundaki çocuklarda kontrol grubundakilerden yüksek olarak tespit edilmiştir (p<0,05). Benzer şekilde Fragedaki E ve ark.nın19, Kouloridis ve ark.nın181 yetişkinlerdeki çalışmalarında homosistein değeri HD grubunda kontrol grubundakilerden yüksek olarak tespit edilmiştir (p<0,05). Çalışmamızda 5 PreD, 6 Tx, 15 HD hastası multivitamin tedavisi görüyordu. Stopper H ve ark.larının33 HD hastalarında yapılan çalışmasında, folik asit ve daha etkin olan folik asit-vitB12 kombinasyonu ile MÇ sıklığında ve homosistein seviyesinde bir azalma olduğu bildirildi (p<0,05). 224 KBH’da artan oksidatif stres, böbrek hasarının sebep ve sonucu olarak gösterilmektedir182. Oksidatif stres, üremik hastaların dokularındaki protein ve diğer moleküllerin biyokimyasını önemli ölçüde etkiler183. Üremi, oksidatif stresle ve protein modifikasyonlarıyla karakterize patolojik bir durumdur. Bu değişiklikleri üreten mekanizmaları sadece biyokimyasal parametrelerin analizi ile tahmin etmek yetersizdir. Fakat üremiye eşlik eden oksidatif stresin amino asitler, lipitler, karbonhidratlar, proteinler gibi küçük molekülleri ve enflamatuar durumu arttırdığı bilinmektedir183. AGE’ler, karboniller ve ilerlemiş oksidasyon protein ürünleri, böbrek yetmezliği ve hemodiyaliz tedavisi esnasında meydana gelen oksidatif işlemlerle tetiklenen bazı değişikliklerdir184. Üremik hastalarda oksidan/antioksidan artan oksidatif dengesizliği stres, nedeniyle üremik serbest serumdaki radikallerin çok miktarda üretilmesine de neden olur. Antioksidan korumanın azalması doğrudan total antioksidan kapasitenin ölçümüyle izlenebilir183. Bu amaç doğrultusunda çalışmamızda ölçümü gerçekleştirilen TAS değeri, en yüksek PreD grubunda sonra sırasıyla HD ve Tx grubunda tespit edildi, fakat farklılık anlamlı değildi (p>0,05) (Tablo 33). TAS değeri toplam hasta grubunda ise kontrol grubundan anlamlı şekilde düşüktü (p<0,05). Tarng DC ve ark.nın çalışmasında PD hastalarında vitC ve vitE gibi antioksidan desteği ile ROS’nin indüklediği DNA hasarında azalma tespit edilmiştir82. Benzer şekilde Domenici ve ark. HD hastalarında vitE desteği ile Comet ve 8-OHdG analizi ile DNA hasarında azalma tespit etmiştir185. Ayrıca Stopper H ve ark.nın çalışmasında HD hastalarında folik asit ve daha etkin olan folik asit-vitB12 kombinasyonun MÇ frekansında ve homosistein seviyesinde bir azalmaya neden olduğu görüldü33. Bizim çalışmamızda her 3 hasta grubunda da multivitamin tedavisi alan hastalar vardı (6 PreD, 6 Tx, 15 HD hastası). Fakat az sayıda hastanın vitamin kullanımı nedeniyle vitaminlerin antioksidan düzeyini etkileyip etkilemediği konusunda yorum getirmek olanaksızdı. Çalışmamıza benzer şekilde Ece A ve ark.nın13 KBY olan çocuklarda, oksidatif stres göstergelerinin incelendiği çalışmasında 225 TPX (total peroksit) ve OSI (oksidatif stres indeksi) kontrol grubuna göre daha yüksek, antioksidan göstergeler PON (paraoksanaz) ve TAS ise daha düşüktür (p<0,05). Karamouzisa I ve ark.nın182 çalışmasında ise, TAS değeri sağlıklı kontroller ve PreD hastalarında benzerlik gösterirken, HD grubunda küçük miktarlarda azalma göstermiştir (p>0,05). Benzer şekilde Kaya ve ark.nın çalışmasında da PON aktivitesi, HD grubunda kontrol grubuna göre düşüktür186( p<0,05). Kronik böbrek hastalığında TAS azalması, üremik toksinlere maruziyet ve bilinmeyen diğer bazı faktörlerden dolayı serbest radikal üretimi sırasında, antioksidan tüketimi gibi nedenlerden kaynaklanabilir. ROS’nin aşırı üretimi IL-6 gibi proenflamatuar sitokinlerin ve CRP gibi proteinlerin üretimini düzenleyebilir. IL-6 ve CRP’nin artan plazma seviyeleri, üremik hastalarda bunu izleyen kardiyovasküler morbidite ve mortalitenin güçlü bir habercisi olarak ortaya çıkar13. Çalışmamızda IL-6 değeri, HD grubunda en yüksek, daha sonra sırasıyla kontrol, TX ve PreD grubunda geliyordu. Fakat istatistiksel bir anlamlılık yoktu (p>0,05) (Tablo 33). CRP değeri ise sadece HD ve PreD gruplarında kontrol grubundan anlamlı şekilde yüksekti (p<0,05). Çalışmamıza benzer şekilde Ece A ve ark.nın13 çalışmasında da IL-6 ve CRP gibi enflamasyon göstergeleri hastalarda kontrol grubundan daha yüksektir. Fragedaki E ve ark.nın19 yetişkinlerdeki çalışmasında ise, CRP değeri HD ve kontrol gruplarında benzerken (p>0,05), IL-6 ise HD grubunda kontrol grubundan yüksektir (p<0,05). 5.2. Lenfositlerde Comet ve Modifiye Comet Değerlerinin İncelenmesi DNA hasarını ölçmek için sıklıkla kullanılan etkinin 108 biyogöstergelerinden birisi Alkali Comet Yöntemi’dir . Comet Yöntemi, 226 elektroforetik bir alan boyunca denatüre olan DNA’nın göçüne dayanır. Bu yolla hücrelerin tek tek DNA hasarı ölçülmektedir107. Bu yapılar uygun DNA boyamasıyla mikroskopta ölçülebilir. İlk olarak 1989 yılında Singh ve ark. tarafından geliştirilen yöntem, daha sonra çeşitli modifikasyonlarla genotoksisite ve apoptoz araştırmalarında sıklıkla kullanılır hale gelmiştir77. Günümüzde Comet Yöntemi, oksidatif hasarın tespitinde kullanılan önemli bir gösterge olarak kabul edilmektedir16. Bu yönteme ilgi duyulmasının nedeni: basitliği, duyarlılığı, hücre örnek sayısının az oluşu ve farklı dokulardan yeterli hücre örneğinin invaziv olmayan işlemlerle elde edilebilmesindendir113. Standart Comet Yöntemi ile sadece zincir kırıkları ve alkali labil bölgeler tespit edilebilirken, Modifiye Comet Yöntemi ile ENDOIII ve FPG gibi enzimler kullanılarak, pürin ve primidin baz hasarlarının bulunduğu bölgelerde ilave kırıklar oluşturmak yoluyla, DNA üzerindeki okside olmuş bazlar kolayca tespit edilebilmekte16,110 ve oksidatif DNA hasarının bir göstergesi olarak değerlendirilmektedir77. Comet Yöntemi kullanılarak oksidatif DNA hasarını inceleyen çalışmalarda, etkilemesi olası faktörlere göz atıldığında, aşağıdaki bilgilere erişilmektedir: • Sigara kullanımının, yaşın ve cinsiyetin oksidatif DNA hasarı üzerindeki etkileri üzerinde çelişkili sonuçlar vardır187,115. Zalata A ve ark çocuklarda çevresel sigara maruziyetinin (pasif sigara içiciliği) DNA hasarını arttırdığını tespit etmiştir188. • VitC ve vitE kullanımı ile oksidatif DNA hasarı arasında bir ilişki gözlenmemiştir115. VitB12 ve folat kullanımı ile ilgili veriler ise yetersizdir187. • Uzun süreli fiziksel egzersizlerin oksidatif DNA hasarını arttırdığı gösterilmiştir187, 115. 227 • Demirbağ ve ark. BMI ile oksidatif DNA hasarı arasında aynı yönde anlamlı bir ilişki tespit etmişlerdir187. Heilborn ve ark. 6 ayda vücut ağırlığının %15 kaybında oksidatif DNA hasarında azalma tespit etmişlerdir187. • Yaz aylarında oksidatif DNA hasarında artış belirlenmesiyle, mevsimsel değişikliklerin (ör: güneş ışığı) oksidatif DNA hasarını etkilediği gösterilmiştir115,189. Bir çok çalışmada onarımdaki azalmaya bağlı olarak yaş artışıyla, DNA hasarı arasında anlamlı bir ilişkinin olduğu gösterilmiştir. Memelilerde yaşam süresi, DNA onarımının etkinliğiyle korelasyon gösterir. DNA onarım enzimlerinin etkinliğinin yaşla azalması beklenebilir, fakat bu durumun gerçekleşip gerçekleşmediği konusu halen tartışmalıdır. Bireysel değişiklikler olsa da, 20 ve 70 yaşları arasında insan lökosit DNA’sında, 8-OHdG seviyesinde lineer bir artış gözlenmiştir. İnsan fibroblastlarında yapılan çok sayıda çalışmada nükleotid eksizyon onarımının yaşla azaldığı gösterilmiştir. Yaşlıların fibroblast ve lökositlerinde glikozilaz aktivitesi gençlere göre düşüktür. Yaşla, baz eksizyon onarımlarında görülen azalmanın nedenin de, glikozilaz aktivitesindeki bu düşüş nedeniyle olduğu düşünülmektedir190. Çalışmamızda lenfositlerde yapılan Comet analizi sonucunda bazal DNA hasarı TINT değerinin ölçümüyle, oksidatif DNA hasarı ise TINTSENDO (primidin baz hasarı için) ve TINTSFPG (pürin baz hasarı için) değerlerinin ölçümüyle belirlendi (Tablo 36). Çalışmamızda Tx grubunda bazal DNA hasarı en yüksektir. Bunu PreD ve HD grubu takip etmektedir. Ama hasta grupları arasında istatistiksel olarak anlamlılık yoktur. Buna karşılık bazal DNA hasarı TX, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek 228 oluşu, hasta grubunun bazal DNA hasarında bir artış olduğunu göstermektedir. Bu durum, regresyon analizi esnasında bazal DNA hasarını, ürik asitin etkilediğinin gösterilmesiyle de desteklenmiştir. Çünkü ürik asit değeri, toplam hasta grubunda, kontrol grubundan anlamlı şekilde yüksektir. Regresyon analizi sonucunda bazal DNA hasarını, hasta gruplarından herhangi birinde olmanın güçlü bir şekilde etkilediği tespit edildi (Tablo 49). Bazal DNA hasarı üzerindeki etki TX grubunda en yüksek bulunmuştur (B=0,973; p=0,000) ve bunu sırasıyla HD (B=0,886; p=0,003), PreD (B=0,792; p=0,000) grupları izlemektedir. Tx grubundaki etkiden kullanılan immün baskılayıcı ilaçlar, HD ve PreD grubundaki etkiden ise üremik toksinler, reaktif AGE’ler ve karbonil bileşiklerin birikimi gibi etkenlerin sorumlu olabileceği önerilebilir. Kobras ve ark.nın191 HD ve HDF grubu hastalarda yapılan çalışmalarında, reaktif AGE’ler ile genetik hasar arasında (Comet ve MÇ yöntemiyle belirlenen) bir ilişki bulmaları bu öneriyi doğrular niteliktedir. Ayrıca HD grubunda, ilave olarak diyalizattaki su kaynaklı toksinler, diyaliz borularından gelen silikon partiküller, vitB6 eksikliği, diyaliz ekipmanlarının biyolojik uyuşmazlığı68 ve uzun süreli hemodiyaliz tedavisinin kısmen kalıcı olan üreminin DNA onarımını baskılamasıyla67,79 genomik hasarın arttığı bilinmektedir. Çalışmamıza benzer şekilde Stoyanova E16 ve Stopper H ve ark.nın112 yetişkin kronik böbrek hastalarında yaptıkları çalışmalarda DNA hasarı HD ve PreD hastalarında, Kan E160, Horoz M192, Bagatini PB193, Buemi M179 ve ark.nın çalışmalarında ise HD hastalarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek tespit edilmiştir. Buemi M ve ark.nın çalışmasında179 DNA hasarının HD grubunda kontrol grubundan anlamlı yüksek oluşu, SCE analizi ile de desteklenmiştir. Kronik böbrek hastalarında oksidatif stres, sağlıklı kişilere göre daha yüksektir. Bu durum üremi, azalan antioksidan kapasite, hemodiyaliz membranlarının okside edici etkileri ve intravenöz demir 229 infüzyonlarına bağlanmaktadır16. Ayrıca SDBH’da önemli şekilde artan AGE’ler ve reaktif karbonil ürünlerin de oksidatif stresi tetiklediği bilinmektedir184. Antioksidan koruma mekanizması oksidan ajanların çoğunu uzaklaştırabilir. ROS’ların aşırı üretimi veya antioksidan koruma mekanizmasındaki yetersizlikler gibi özel durumlarda da oksidatif stresin oluştuğu görülür16. DNA’da oluşan oksidatif hasar, aynı zamanda mutajenezisin, karsinojenezisin ve yaşlanmanın da göstergesidir194. Radikallerin DNA ile etkileşimi sonucu DNA’da yaklaşık 20 tane oksidatif hasar ürünü oluşmaktadır4. Bunların arasında en fazla miktarda oluşan ve en mutajenik DNA hasarı 8-hidroksideoksiguanozindir (8-OHdG)77. 8OHdG, DNA onarım enzimleri tarafından kesilerek uzaklaştırılır, periferik dolaşıma geçer ve idrarla atılır75. Bu nedenle 8-OHdG, hem hücre içi oksidatif DNA hasarının, hem de onarım seviyesinin göstergesidir118. Çalışmamızda primidin baz hasarının göstergesi olan TINTSENDO değeri açısından, hasta grupları ile kontrol grubu arasında ve hasta grupları arasında istatistiksel farklılık gözlenmemiştir (Tablo 36). Yaş ile primidin baz hasarı arasında aynı yönde zayıf bir etki vardır (Tablo 49). Bu durum yaşın oksidatif hasarı arttırıcı özelliğini de destekler bir durumdur. Çalışmamızda pürin baz hasarının göstergesi olan TINTSFPG değeri açısından; hem TX hem de PreD gruplarında, HD ve kontrol gruplarından anlamlı yüksek sonuç, bu gruplarda oksidatif DNA hasarında bir artış olduğunu göstermektedir (Tablo 36). Biyokimyasal parametreler ile genotoksisite parametreleri arasındaki ilişkinin incelendiği korelasyon analizinde, pürin baz hasarı ile BMI arasında aynı yönde anlamlı bir ilişki tespit edilmiştir (Tablo 46). Boya nazaran kiloda artış olduğunda, BMI artar. BMI’ndeki artış, prednisolon kullanan Tx hastalarında görülebilir195 ve pürin baz hasarı ile BMI arasındaki aynı yöndeki ilişkinin sonucunda, Tx grubundaki oksidatif DNA hasarındaki 230 artışı açıklayabilir. Pürin baz hasarı PreD grubunda en yüksektir. Aynı durum regresyon analizi sonucunda PreD grubu olmak ile pürin baz hasarı arasında da gözlenerek (B=0,651; p=0,032) desteklenmiştir (Tablo 49). Biyokimyasal parametrelerden BUN değeri ile pürin baz hasarının ters ilişki göstermesi beklenenden farklı bir durumdur (Tablo 46). BUN göstergesi hastalık durumunun özelliklerindendir ve oksidatif hasarla artması beklenir. Bu sonuç bize, pürin baz hasarının BUN parametresi ile açıklanamadığını göstermektedir. DNA üzerinde zincir kırıkları oluşumu sadece oksidatif strese bağlı olmayıp UV, radyasyon ve DNA hasarlarının onarımı sırasında da geçici olarak ortaya çıkabilmektedir. 8-OHdG kalıntıları ise sadece oksijen ve nitrojen radikalleri tarafından oluşturulmaktadır77. Yani PreD ve Tx gruplarında, DNA üzerindeki 8OHdG kalıntılarının sıklığını gösteren pürin baz hasarına duyarlı bölgelerin fazla oluşu, bu gruplarda ROS’ların aşırı üretimi veya antioksidan koruma mekanizmasındaki yetersizliklerin varlığıyla açıklanabilir. Oksidatif DNA hasarını artıran ajanların, malignite gelişimi riskini de arttırabileceği göz ardı edilmemelidir4. Çalışmamızda hasta ve kontrol grubunun genotoksisite parametreleri arasındaki korelasyon analizi sonucunda, TINTSENDO ile TINTSFPG arasında aynı yönde anlamlı bir ilişki tespit edildi (p<0,05) (Tablo 44). Çalışmamıza benzer olarak KBH’da pürin ve primidin baz hasarına ilişkin yapılmış tek araştırma Stoyanova E ve ark.nınkidir16 . Çalışmamızdan farklı olarak yetişkin hastalar ele alınmıştır. Primidin baz hasarı Stoyanova E ve ark.nın araştırmasında çalışmamızdaki gibi HD grubunda kontrol grubundan yüksektir16. Çalışmamızda anlamlı artış yokken, primidin baz hasarı adı geçen araştırmada HD grubunda PreD grubundan ve HD ve PreD gruplarında kontrol grubundan anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0,001). Pürin baz hasarı ise her iki çalışmada, PreD grubu için kontrol grubundan anlamlı olarak yüksektir. Tek fark HD grubunun Stoyanova E ve ark.nın çalışmasında PreD grubundan yüksek olmasıdır 231 (p<0,001). Genel olarak değerlendirildiğinde, her iki çalışmada da hastalık durumunun baz hasarını, dolayısıyla oksidatif hasarını arttırmış olmasıdır. Kronik böbrek hastası olan çocukların lenfositlerinde, Comet Yöntemiyle oksidatif DNA hasarın incelendiği bir çalışma bulunmamaktadır. Bulgularımızı çocuklarda Comet Yöntemi ile yapılan diğer çalışmalarla karşılaştıracak olursak (Tablo 23): Çalışmamızdaki tüm hasta gruplarına benzer şekilde, PAH’lara172, DDE ve DDT’ye166, sigara dumanına maruz kalan çocuklarda170,175 bazal DNA hasarı kontrol grubundaki çocukların hasarından yüksektir. Tarım ilacı Deltametrin’e maruz kalan çocuklarda163 ise bazal DNA hasarı kontrol grubuna benzerdir. Pürin baz hasarı ise çalışmamızdakine benzer şekilde DDE ve DDT’ye maruz kalan çocuklarda166 kontrol grubundaki çocukların hasarından yüksektir. Çalışmamızda Tx, HD ve PreD süreleri ile TINT arasında korelasyon olmadığı (p>0,05) (Tablo 48), ilk tanıdan itibaren geçen süre ile TINTSENDO arasında ise aynı yönde bir korelasyon olduğu görüldü (p<0,05) (Tablo 46). Stopper H ve ark.nın 9-23 yıl arası HD’de olan 20 kronik böbrek hastasının Comet Yöntemiyle yapılan çalışmasında, 10 yıl ve daha fazla HD süresi ile DNA hasarı arasında bir ilişki bulundu112 (p<0,05). Bu farklılık bizim hasta grubumuzun Tx (22,35±19,43 ay), HD (29,75±27,68 ay) ve PreD (41,35±38,83 ay) sürelerinin daha az oluşundan kaynaklanıyor olabilir. Ayrıca çalışmamızda çocukların ele alınmış olması, sözü edilen sürelerin kısa olmasındaki etkenlerden biri ve en önemlisidir. Benzer şekilde Kan E ve ark. DNA hasarı ve diyaliz tedavisinin süresi arasında anlamlı bir ilişki bulmamışlardır160 (p>0,05). Bu çalışmada da ortalama diyaliz tedavisi süresi 3.5 yıl gibi kısa süreydi160. Uzun süreli HD tedavisi ile DNA hasarı arasındaki ilişki aşağıdaki şekilde açıklanabilir: Uzun süreli ve sürekli HD’e giren hastaların kanı biyouyumlu diyaliz membranlarıyla etkileşebilir ve bu süreçte çok sayıda reaktif oksijen türü 232 üretilebilir. Substratları ve esansiyel faktörleri ortamdan uzaklaştırdığı için diyaliz süreci, glutatyonla ilişkili enzimleri de etkileyebilir ve bu enzimlere gereksinimi olan antioksidan mekanizmalar hasar görebilir160. 5.3. Lenfositlerde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi Mikroçekirdek, spontan olarak ya da genotoksik maruziyete yanıt olarak, hücre bölünmesi sırasında iki kardeş hücrenin içine katılamayan asentrik fragmanlardan veya tam kromozomlardan oluşur122. Uzun ömürlü T lenfositlerin yarı ömrünün ortalama 3-4 yıl olduğu tahmin edilmektedir. Bu nedenle insan lenfositlerindeki spontan MÇ frekansı, sirkülasyondaki lenfositlerin yaşam süresi boyunca oluşan genetik hasarın birikiminin bir indeksini sağlar124. Mikroçekirdek, kromozom kaybı (anojenik etki) ve kromozom kırıklarınının (klastojenik etki) sonucunda oluşabilmektedir121. Kromozomlardaki bu sayısal ve yapısal hasarlar, maruziyetin göstergesidir ve genotoksik kimyasallara biyolojik yanıtın indikatörleridir123. MÇ Yöntemi genetik hasara yol açan iç ve dış indikatörlere duyarlıdır ve in vivo ve in vitro genotoksisite testleri içinde en önemli son noktalardan birisidir20. Cyt-B kullanımıyla sitokinezis durdurularak, hücre çekirdeği bölünürken binükleer hücrelerin açığa çıkmasıyla MÇ Yöntemi daha duyarlı hale getirilmiştir128. Periferal kan lenfositlerindeki MÇ frekansının, kanser riskini öngörmede duyarlı bir biyogösterge olduğu ortaya konmuştur135. Bu veriler, deneysel ve mekanistik çalışmalardan toplanan delilleri destekler ve güçlendirir niteliktedir125. MÇ tetiklenmesi ve kanser gelişimi arasındaki ilişkinin varlığını gösteren kanıtları aşağıdaki şekilde sayabiliriz125: • Tedavi edilmeyen kanser hastalarında ve kansere yatkınlığı olan konjenital hastalıklı bireylerde MÇ sıklığının yüksek olması (Ör: Bloom sendromu, Ataxia telengiectasia gibi). 233 • Klinik kemoterapi uygulamalarında yardımcı biyogösterge olarak kullanılan oral mukozada artan MÇ frekansının varlığı. • Genotoksik olarak karsinojenesite mikroçekirdeği arasındaki tetikleyen korelasyonun varlığı ajanlar (Ör: ve İyonize radyasyon ve ultraviyole). • Folat, kalsiyum, vitE, nikotinik asit gibi kanser riskinin azaltılmasıyla ilgili belirli vitamin ve minerallerin diyetle alınımı ve/veya kan konsantrasyonları ve MÇ sıklığı arasındaki ters korelasyonun varlığı. Yaş ve cinsiyet, MÇ indeksini etkileyen en önemli demografik değişikliklerdir. Kadınlarda MÇ sıklığı daha yüksektir ve yaş ilerledikçe erkeklerden daha fazla artış gösterdiği bilinmektedir. Çocuklarda yaşla MÇ sıklığının hem arttığına, hem de azaldığına dair veriler vardır. Ayrıca MÇ sıklığının, folat196, vitB12 ile ters yönde korelasyon gösterdiğine, homosisteinin plazma seviyesiyle ise aynı yönde korelasyon gösterdiğine dair bilgiler mevcuttur187. Günde 30 sigaranın üzerinde sigara kullanımıyla MÇ sıkığının arttığı bildirilirken, daha az sigara kullanımıyla ilgili yeterli delil yoktur. Alkoliklerde MÇ sıklığı artmaktadır, fakat kullanım süresiyle korelasyon bulunmamıştır. VitE ve vitC için çelişkili sonuçlar vardır. MÇ sıklığının; BMI yüksekliğinde, yoğun egzersizlerde ve kronik hastalıklarda (Alzheimer hastalığı, Behçet hastalığı, Parkinson hastalığı, romotoid artirit, kanser, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, polikistik over sendromu ve kronik obstrüktif pulmoner hastalık gibi) arttığı bildirilmiştir187. Kronik böbrek hastalığının genomik hasarda artış oluşturup oluşturmadığı MÇ sıklığı ile değerlendirilirken, in vitro mitotik stimülasyondan sonra kültürde periferal lenfositlerin çoğalma yeteneğini etkileyip etkilemediği ise, MÇ’li hücrelerin değerlendirilmesiyle mümkün olur. Bu nedenle çalışmamızda hem MÇ, hem de MÇ’li hücre sayısı analiz edildi. 234 Çalışmamızda MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı PreD grubunda en yüksekti, bunu HD ve Tx grupları takip ediyordu. Tx, HD, PreD ve TH gruplarında MÇ ve MÇ’li hücre sıklığının kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek (p<0,001) oluşu, hasta grubunun genomik hasarında bir artış olduğunu gösteriyordu (Tablo 38). Bu durum, regresyon analizi sonucunda MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı ile TAS arasındaki ters yönde bir etkileşimin varlığıyla da desteklendi (Tablo 49). Çünkü TAS değeri, toplam hasta grubunda kontrol grubundan anlamlı şekilde düşüktü (p<0,05) (Tablo 33). Regresyon analizi sonucunda hasta gruplarından herhangi birinde olmak ile lenfositlerdeki MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı arasında aynı yönde güçlü bir etki tespit edildi (p=0,000) (Tablo 49). MÇ sıklığı üzerindeki etki PreD grubunda en yüksekti (B=1,335; p=0,000) ve bunu sırasıyla HD (B=1,321; p=0,000), Tx (B=0,909; p=0,000) grupları izliyordu. MÇ’li hücre sıklığındaki etki de sırasıyla PreD (B=1,349; p=0,000), HD (B=1,322; p=0,000) ve Tx (B=0,914; p=0,000) grupları şeklindeydi. Üremik toksinler, reaktif AGE’ler ve karbonil bileşiklerin birikimi nedeniyle PreD grubunda genomik hasar daha yüksek bulunmuş olabilir. Fragedaki E ve ark.nın19 HD grubu hastalarda yapılan çalışmalarında da reaktif AGE’ler ve karbonil bileşikleri ile genetik hasar arasında bir ilişki bulmaları da bu sonucumuzu doğrular niteliktedir. TX grubunda ise MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı, HD ve PreD gruplarından anlamlı olarak düşüktü (p<0,05) (Tablo 38). Çalışmamızın korelasyon analizinde MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı ile BUN ve kreatinin arasında aynı yönde bir ilişki saptandı (Tablo 46). BUN ve kreatinin değerinin HD ve PreD gruplarında Tx grubundan anlamlı yüksek (p<0,05) oluşu, TX grubundaki MÇ ve MÇ’li hücre sıklığındaki azalmayı da açıklayabilir. Ayrıca Tx grubunda kullanılan immün baskılayıcı ilaçlar nedeniyle de, genomik hasarda artış olması beklenebilir. Tablo 11’de de görüldüğü gibi Cyclosporin63,65 ve Tacrolimus’un65 SCE sıklığını arttırdığı, Cyclosporin+Mycophenolate mofetil+Prednizolon kombinasyonunun21,66 235 da lenfositlerde MÇ sıklığını arttırdığı yapılan in vivo çalışmalarla gösterilmiştir. Fakat PreD ve HD gruplarına göre Tx grubunda MÇ sıklığının az oluşuna, Tx grubunun immün baskılayıcı ilaçlara maruziyet süresinin (22,35±19,43 ay) kısa oluşu nedeniyle, ilaçların geç dönem komplikasyonlarından daha az etkilendiği şeklinde açıklık getirilebilir. Çalışmamızdaki çocukların kullandığı immün baskılayıcı ilaçların çeşitliliğinin fazla oluşu, kısa süredir kullanılıyor olmaları ve hasta sayısının az olması nedeniyle TX grubundaki hastaların lenfositlerinde gözlenen DNA hasar düzeylerine (MÇ sıklığı olarak) immün baskılayıcı ilaçların katkısı tam olarak anlaşılamamıştır. Çalışmamızda Tx, HD, PreD ve TH gruplarında MÇ’li hücre sıklığının kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek (p<0,001) oluşu (Tablo 38), kronik böbrek hastalığının, lenfositlerin çoğalma yeteneğini de etkilediğini gösterdi. Hasta grupları içinde MÇ’li hücre sıklığının Tx grubunda en az olması kullanılan immün baskılayıcı ilaçların etkisiyle açıklanabilir. Çalışmamızdakine benzer şekilde Fragedaki E ve ark.nın yetişkinlerdeki çalışmasında MÇ sıklığı, HD grubunda kontrol grubuna göre19 (p<0,01), Oliveira VD ve ark.nın çalışmasında ise Tx grubunda (CsA, MMF ve prednizolon kullanan) kontrol grubuna göre daha yüksek miktarda tespit edilmiştir21 (p<0,001). Benzer şekilde Stopper ve ark.nın çalışmasında da, MÇ sıklığı PreD ve HD gruplarında kontrol grubundan yüksek iken20 (p<0,05), çalışmamızdakinin aksine MÇ’li hücre sıklığı ise PreD, HD ve kontrol gruplarında benzerlik gösteriyordu, yani KBH lenfositlerin çoğalma yeteneğini etkilememişti20 (p>0,05). Kronik böbrek hastası olan çocukların lenfositlerinde MÇ değerlendirilmesinin incelendiği bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızdaki hasta gruplarının MÇ sıklığı, kronik böbrek hastası olan 236 yetişkinlerle karşılaştırıldığında daha düşük olduğu görüldü19,20,21 (Tablo 22). Çocuk ve yetişkinlerde DNA hasar ve tamir etkinliğinin incelendiği çalışmalara aşağıdaki örnekleri vermek mümkündür: Reddy TPK ve ark. nın çalışmasında yaşlılarda antioksidan potansiyelde azalmayla birlikte lenfositlerdeki DNA hasarının, gençlere göre iki kat attığı gösterilmiştir197. Norppa H ve ark. 65 yaş üzerindeki bireylerin lenfositlerinde 20-25 yaşlarındaki gençlere göre daha fazla tam kromozom içeren MÇ oluşumunun varlığını gösterdiler145. Fenech M ve ark. lenfositlerde MÇ sıklığının kadınlarda yaşla arttığını bildirdiler131,133. Sirota NB ve ark. ise spontan DNA hasarının derecesi ve yaş arasında anlamlı bir ilişki bulamadılar198. Richards KB ve ark.nın çalışmasında KBH olan çocuklarda 8 haftalık folik asit desteği ile homosisteinde azalma, oksidasyona duyarlı LDL’de düşüş ve endotel fonksiyonlarında düzelme saptarken, yetişkinlerde benzer bir etkinin görülmediğini bildirdiler12. Bulgularımızı çocuklarda MÇ Yöntemi ile yapılan diğer çalışmalarla karşılaştıracak olursak, tablo 23’de görüldüğü gibi belirlenen DNA hasar düzeyleri: • Çalışmamızdaki topam hasta gruplarındaki çocuklarda MÇ sıklığı (8,06±4,58); çeşitli hastalıkları olan çocukların (ülseratif kolit, Crohn hastalığı ve malignansiler gibi) ve hava kirliliği nedeniyle kurşuna, PAH’lara maruz çocukların kan örneklerindeki MÇ sıklıkları aralığındaydı (minimum: 2,96 - maksimum: 10,1) 161,162, 165, 167,169. • Çalışmamızdaki kontrol grubundaki çocukların lenfositlerindeki MÇ sıklıkları (1,60±0,99), çocuklarda yapılan diğer çalışmalardaki sağlıklı kontrol grubu bireylerin MÇ sıklıkları aralığındaydı (minimum: 0,38maksimum: 8,3). 237 Prediyaliz ve hemodiyaliz durumundaki genomik instabilitenin, yukarıda sayılan etken ya da durumlarla karşılaştırıldığında oldukça önemli olduğu görülmektedir. Çeşitli kimyasal ajanlar ve farklı tipteki radyasyonlar moleküler, hücresel ve kromozomal seviyede çoklu etkiler gösterir. Bu etkiler eş zamanlı ve doza bağımlı olarak ortaya çıkabilir. Nükleer bölünme indeksi (NDI), apoptoz veya nekroz üzerinde etkileri olan genotoksik olayların izahı komplekstir. Çünkü genom hasarında gözlenen artış apoptozisin inhibisyonu, daha kısa hücre döngüsüne yol açan hatalı hücre döngüsü noktaları ve yüksek oranda hatalı kromozom ayrılmaları gibi indirekt faktörler nedeniyle de oluşabilmektedir. Bu nedenle NDI’nin ve nekroz veya apoptoza uğrayan hücrelerin oranının bilinmesi toksisite değerlendirmeleri yönünden önemli bilgi sağlar. Lenfositlerde NDI, immün cevabın bir biyogöstergesi olarak mitojenlere cevabın bir ölçümünü verir131. Kısaca NDI, genotoksik bir maruziyete maruz kalan hücre kültürünün canlılığının bir göstergesidir. Çalışmamızda NDI değerleri TX grubunda, HD, PreD ve kontrol gruplarından anlamlı olarak düşüktü (p<0,001) (Tablo 38). Tx grubundaki NDI’deki bu azalmanın immün baskılamanın bir sonucu olduğu düşünülmektedir. Benzer şekilde Oliveira VD ve ark.nın çalışmasında da Tx grubunda (CsA, MMF ve Pred. kullanan) kontrol grubuna göre NDI’de önemli bir azalma gözlenmiştir21 (p<0,001). Rath ve ark.nın çalışmasında Tx grubunda (CsA, MMF ve pred. kullanan) transplantasyon sonrasında NDI, trasnplantasyon öncesine göre azalma göstermiştir199. Çalışmamızda kronik böbrek hastalarının lenfositlerinde gerçekleştirilen MÇ analizinde, binükleer hücrelerdeki MÇ frekansının yanı sıra NPB ve Nbud ve mononükleer hücrelerdeki MÇ frekansları da tespit edilmiştir. Fenech ve Morley tarafından geliştirilen MÇ Yönteminde, mononükleer ve binükleer hücrelerdeki MÇ’in yanı sıra, nekroz, apoptozis, disentrik kromozomların biyogöstergesi olarak NPB’lerin, gen 238 amplifikasyonlarının biyogöstergesi olarak Nbud’ların ölçümünün de yapılabileceği ortaya konmuştur131. Kronik böbrek hastalarında binükleer hücrelerdeki MÇ’in yanı sıra NPB, Nbud ve mononükleer hücrelerde MÇ gibi diğer biyogöstergelerin de incelendiği herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Nükleoplazmik köprü, anafazda disentrik kromozomların hücrenin zıt kutuplara çekilmesi sırasında oluşur. Hücreler sitokinezisi tamamlamayı anafaz ve telofazda hızlı bir şekilde sürdürürler ve kardeş hücreler ayrıldığında en son nükleoplazmik köprünün kırılması gerçekleşir. Bu nedenle, nadir de olsa çekirdek zarı şekillenmesinden önce disentrik anafaz köprülerini gözlemlemek mümkündür. Cyt-B kullanılan MÇ Yönteminde sitokinezis inhibe edildiği için, NPB’li binükleer hücreler birikime uğrar ve çekirdek membranı bu yapının etrafında şekillenir. DNA’daki zincir kırıklarının hatalı onarımını takiben, çeşitli mekanizmalar NPB oluşumuna yol açabilir133: • Genellikle, asentrik kromozom fragmanları MÇ oluşumu ile, disentrik kromozom fragmanları ise NPB oluşumu ile sonuçlanırlar. DNA’daki zincir kırıklarının hatalı onarımı, NPB ile sonuçlanan disentrik ring kromozom ve bitiştirilmiş ring kromozom oluşumuna neden olabilir133. • Disentrik kromozom ve NPB oluşumunda diğer bir mekanizma; telomerde protein kaybı, kohezyon kaybı nedenleriyle telomerin kısalması sonucunda telomerin ucunda kaynaşma olmasıdır. Fakat bu durumda NPB’ye bir asentrik fragmanın veya MÇ’in eşlik etmesi şart değildir133. Gerçek zamanlı in vitro çalışmalarda anafaz köprülerinin geç anafaz esnasında bir veya daha fazla bölgeden kırılabildiği ve MÇ formasyonuyla sonuçlandığı gösterilmiştir. Bu nedenle bazı MÇ’ler anafazda kırılan NPB’lerden de orijin alabilirler. Bu nedenle NPB’lerin değerlendirilmesi küçümsenmemelidir. Çünkü NPB’ler; hatalı onarılmış 239 DNA kırıklarıyla veya telomerin kısalması, telomerin stabilizasyonundan sorumlu proteinlerin kaybı, telomer kohezyonundaki bozukluklarla sonuçlanan genom hasarı ile ilgili direkt delillerdir ve bu durumu sadece MÇ değerlendirmesiyle anlamak mümkün değildir133. Bu amaçla çalışmamızda binükleer hücrelerde NPB değerlendirmesi de yapıldı. Buna göre nükleer köprü sıklığı TX ve HD gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek olarak tespit edildi (sırasıyla p<0,001; p<0,05) (Tablo 38). Bu nedenle Tx ve HD hastalarında gözlenen genomik hasarın bir kısmının yukarıdaki oluşum mekanizmaları göz önüne alındığında hatalı onarılmış kromozomal kırıklardan ya da telomerde oluşan bozukluklar nedeniyle oluştuğu düşünülebilir. Gen amplifikasyonunun tümor ilerlemesinde ve kanser ilaçları ile tedavide, ilaca rezistans gelişiminde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir200. Gen amplifikasyonun göstergesi olarak nükleer bud (Nbud) ölçümü diğer bir MÇ formasyonu olup, son 10 yıl içinde önem kazanmaya başlanmıştır. Shimizu ve ark tarafından mitozun S fazı sırasında MÇ oluşturmak için nükleer budding yoluyla çekirdeğin periferinde spesifik bölgelere genişleyen DNA’nın yerleştiği gösterilmiştir. Nükleer budding süreci, S fazı sırasında ortaya çıkar. Oluşan Nbud’lar, budding sürecinin aşamasına bağlı olarak ince veya kalın bir nükleoplazmik materyal ile çekirdeğe bağlı olmasının dışında MÇ ile aynı morfolojiye sahiptir. Nükleer budding süreci sırasında MÇ formunun hücre dışına doğru itilmesinin nedeni bilinmemektedir. γ-radyasyonununa maruziyet sonrasında MÇ’in budding süreciyle de şekillenebildiği gösterilmiştir133. Ayrıca folik asid eksikliğinin de Nbud oluşumunu arttırdığı bilinmektedir201.Çalışmamızda binükleer hücrelerde Nbud değerlendirmemiz sonucunda TX, HD, PreD ve kontrol grupları arasında anlamlı bir farklılık bulunmadı (p>0,05) (Tablo 38). 240 MÇ Yönteminde diğer önemli bir gelişme, alternatif olarak mononükleer hücrelerde (mnh) de MÇ değerlendirmesinin yapılmasıdır. Bu değerlendirme, lenfositlerin in vivo hücresel bölünmenin bir sonucu olarak önceden bir MÇ içerebilmesine dayanmaktadır129. Mononükleer hücrelerdeki MÇ, Cyt-B ile kültüre koyulmadan önce hücrelerde var olan DNA hasarını gösterebilir. Binükleer hücreler, kültürde iken oluşan MÇ’e ek olarak in vivo G0 fazı esnasında biriken kromozom kırıklarının bir sonucu olarak önceden var olan MÇ de içerebilirler202. Binükleer hücrelerdeki MÇ değerlendirmesine ek olarak mononükleer hücrelerdeki MÇ’in de değerlendirilmesi ile, MÇ olarak ifade edilen tüm DNA hasarlarının daha emin ve kapsamlı şekilde belirlenmesi sağlanmış olur129. Bu amaçla çalışmamızda mononükleer hücrelerdeki MÇ’ler de değerlendirildi. Buna göre mononükleer hücrelerdeki MÇ sıklığı TX, HD ve PreD gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0,001) (Tablo 38). Çalışmamızda Tx, HD ve PreD süreleri ile binükleer hücrelerdeki MÇ sıklığı arasında korelasyon olmadığı görüldü (p>0,05) (Tablo 48). Bu durum bizim hasta grubumuzun Tx (22,35±19,43 ay), HD (29,75±27,68 ay) ve PreD (41,35±38,83 ay) sürelerinin daha az oluşundan kaynaklanıyor olabilir. 5.4. Lenfositlerde FISH ile Kombine Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi Kromozomlardaki yapısal ve sayısal değişiklikler onkojenezisin önemli bir yüzüdür203. Anöploidinin (kromozomlardaki sayısal değişiklikler), infertilitede ve kanserde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. İnsan kanser hücrelerinde anöploidiye sıklıkla rastlanır ve genelde solid tümörlerde bulunan kromozomal instabilitenin ağırlıklı bir 241 türüdür. Çok sayıda araştırma ile anöploidinin, insan prekanseröz lezyonlarında (serviks, gırtlak, kolon, akciğer, cilt, pankreas, gonatlar, özefagus gibi) ve akut lösemide erken bir basamak veya erken bir olay olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle mutajenlere ve karsinojenlere maruziyet sonucunda anöploidinin frekansındaki her artış belirlenmeli ve kontrol edilmelidir204. MÇ analizi, MÇ formasyonunu belirler, fakat klastojenik ve anojenik maruziyetin ayırımını yapamaz205. Mikroçekirdek tetikleme mekanizması, ancak MÇ içinde kinetokor proteininin varlığının veya yokluğunun tayini ile klastojenik (yapısal değişiklikler) ve/veya anojenik (sayısal değişiklikler) olarak nitelenebilir127. FISH Yöntemi ise, hücrelerdeki kromozomal değişiklikleri tayin etmek için floresanla işaretlenmiş DNA problarının kullanıldığı bir tekniktir136. Gözlenen mikroçekirdeğin orijinini belirlemek için, MÇ tekniği ile sentromerik problu FISH’in kombine edilmesi klastojenik ve anojenik ajanları ayırt etmekte kullanışlı bir görüntüleme yöntemi oluşturmuştur146. FISH sinyalinin sayısal değerlendirmesi için yaklaşımların gelişimindeki artan ilgiye rağmen, henüz standardize edilmiş ve yaygın kullanılan bir protokolü yoktur154. Tüm insan DNA’sının yaklaşık %10-20’si satellit DNA adı verilen tekrarlayan dizilerden oluşur. Satellit DNA özellikle kromozomların sentromer ve sentromeri çevreleyen bölgelerinde bulunur. Alfa satellit, beta satellit ya da diğer satellit DNA dizilerini oluşturan monomerik birimler birbirinden öyle farklıdır ki, bir çoğu kromozoma özgü birer gösterge olarak kullanılabilir. Tandem tekrarlar yapan dizilerden en iyi incelenmiş olanı alfa satellit DNA’sıdır. Bu nedenle alfoid problar da denilen alfa satellit dizileri, işaretlenip hücrelerle hibridizasyona sokulduğunda sentromerde ya da bazı kromozomların heterokromatik bölgelerinde ve interfaz nükleusunda oldukça parlak kuvvetli bir sinyal alınır. Bu özelliklerinden dolayı alfoidler; 242 sentromerlerin incelenmesinde, ring kromozomların varlığının belirlenmesinde ve anöploidilerin prenatal tanısında kullanılmaktadır17. Sentromere özgü prob kullanımını takiben, FITC filtresi kullanılarak MÇ’li hücrelerde sentromerden sinyal alınan mikroçekirdekler “sentromer pozitif MÇ” [S(+)MÇ], sinyal alınmayan mikroçekirdekler “sentromer negatif MÇ" [S(-)MÇ] olarak değerlendirilir. S(+) mikroçekirdeklerde kromozom kaybına bağlı sayısal bir hasar (anojenik etki), S(-) mikroçekirdeklerde ise kromozom kırıklarına bağlı yapısal bir hasar (klastojenik etki) mevcuttur205. Gerek yetişkin gerekse çocuk kronik böbrek hastalarında, genotoksik hasarın FISH Yöntemiyle değerlendirildiği bir çalışma yapılmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda ilk kez FISH ile kombine MÇ Yöntemini de kullanarak bulduğumuz MÇ değerlerinin anojenik mi yoksa klastojenik bir aktiviteyle mi oluştuğunu belirlemeyi amaçladık. MÇ Yönteminin uygulandığı çalışmamızda MÇ sıklığını Tx, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek, hasta grupları arasındaki karşılaştırmada ise, Tx grubunun MÇ sıklığının HD ve PreD gruplarından anlamlı olarak düşük olduğunu ortaya koymuştuk. Hasta ve kontrol grubunun genotoksisite parametreleri arasındaki korelasyon analizi sonucunda, MÇ sıklığı ile S(+)MÇ ve S(-)MÇ arasında aynı yönde anlamlı bir ilişki tespit edildi (p<0,05) (Tablo 40). • S(-)MÇ sıklığı; PreD grubunda en yüksek, sonra sırasıyla HD ve Tx grupları takip ediyordu. TX grubunda, PreD grubundan anlamlı düşük (p<0,05) iken Tx, HD, PreD ve TH grupları ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001). Bu durumda, tüm hasta gruplarında özellikle de PreD grubunda, daha fazla klastojenik maruziyet sonucunda kromozomal kırık oluşumunun arttığını belirledik. 243 • Sentromer(+)MÇ sıklığı; HD grubunda en yüksek, sonra sırasıyla PreD ve Tx grupları takip ediyordu. TX grubunda, HD ve PreD gruplarından anlamlı düşük iken (p<0,05), Tx, HD, PreD ve TH gruplarında ise kontrol grubundan anlamlı yüksekti (p<0,001). Bu durumda, tüm hasta gruplarında özellikle de PreD ve HD gruplarında, daha fazla anojenik maruziyet sonucunda kromozom kaybı oluşumunun arttığını belirledik. Tx, HD, PreD ve kontrol gruplarında S(+)MÇ yüzdeleri, S(-) MÇ yüzdelerinden daha yüksek olarak tespit edildi ama istatistiksel olarak anlamlılık yoktu (p>0,05), sadece HD grubunda S(+)MÇ yüzdeleri, S(-)MÇ yüzdelerinden anlamlı düzeyde yüksekti (p<0,05) (Tablo 41). HD hastalarında; reaktif AGE’lere ve karbonil bileşiklerine19 ilave olarak diyalizattaki su kaynaklı toksinler, diyaliz borularından gelen silikon partiküller, üremik birikim, vitB6 eksikliği, diyaliz ekipmanlarının biyolojik uyuşmazlığı doğrudan veya immün baskılamaya katkıda bulunarak68 ve uzun süreli hemodiyaliz tedavisiyle RRT’nin advers etkilerine ilave olarak kısmen kalıcı olan üreminin DNA onarımını baskılayarak67,79 malignansi riskini arttırdığı bilinmektedir. Yukarda bahsedilen etkenlerin HD grubunda gözlenen anöploidi frekansındaki artışın nedeni olabileceği düşünülmektedir. Regresyon analizi sonucunda hasta gruplarından herhangi birinde olmak ile lenfositlerdeki S(+)MÇ ve S(-)MÇ sıklığı arasında aynı yönde güçlü bir etki tespit edildi (p=0,000) (Tablo 49). S(+)MÇ ve S(-)MÇ sıklığı üzerindeki etki, PreD grubunda en yüksekti (sırasıyla B=1,155; p=0,000 ve B=1,254; p=0,000) ve bunu sırasıyla HD (sırasıyla B=1,327; p=0,000 ve B=1,080; p=0,002), Tx (sırasıyla B=0,684; p=0,002 ve B=0,690; p=0,003) grupları izliyordu. 244 Sonuç olarak tüm hasta grupları, kontrol grubuna göre hem klastojenik hem de anojenik etkiye daha fazla maruz kalmışlardı (p<0,05) (Tablo 40). Hasta gruplarında anojenik etki daha baskındı, ama sadece HD grubunda, anojenik etkinin baskın oluşu anlamlı şekilde belirlendi (Tablo 41). Ayrıca PreD grubunun Tx grubuna göre hem klastojenik hem de anojenik etkiye daha fazla maruz kaldığını, HD grubunun ise Tx grubuna göre daha fazla anojenik etkiye maruz kaldığını belirledik (Tablo 40). Bu durumda özellikle HD ve PreD grubunda gözlenen anöploidi frekansındaki artışının, insan prekanseröz lezyonlarının gelişimindeki önemi göz ardı edilmemelidir204. Rath T ve ark. nın Tx hastalarıda yapılan çalışmasında immün baskılama sonrasında, Tx öncesine göre MÇ sıklığında artış, NDI’de ise azalma gözlendi199. İmmün baskılama Tx için mutlaka gereklidir, fakat lenfositlerin proliferasyonunda azalmaya neden olur. Lenfosit proliferasyonu göz önüne alınmadığında hastaların greft fonksiyonu çok iyi olabilir. Bu durum, uygulanan immün baskılayıcının antiproliferatif etkisini yansıtıyor olabilir, ama belki de bu, uygulanan ilacın mutajenezisinde gizli olabilir. CsA için, bildirilen genotoksik etkileri ve mutajenezis üzerindeki sonuçları çelişkilidir. Ama yine de, kanserin başlamasına ve yayılmasına öncülük eden DNA onarımının inhibisyonu ve aktif T hücrelerinin apoptozisinin indüksiyonu için, CsA sorumlu tutulmaktadır. Steroidlerin DNA üzerindeki sitotoksik etkilerinin zayıf olduğu düşünülmektedir. MMF’in ise B ve T lenfositlerinde DNA sentezini inhibe ettiği bilinmektedir. Bunun sonucunda da hücre proliferasyonu güçlü bir şekilde inhibe edilir ve apoptozis artışı görülür. İn vitro çalışmalarda MMF’in düşük konsantrasyonlarında bile, lenfosit kültüründe hücre döngüsünde gecikmeye, MÇ artışına eşlik eden NDI’de azalmaya neden olduğu bildirilmiştir. Kısaca Tx hastalarında immün baskılayıcı tedavi, KBH’nın neden olduğu genotoksik hasarı arttırmaktadır. Bu durum KBH’larında artan kanser riskinin nedeni olabilir199. Çalışmamızdaki 245 çocukların kullandığı immün baskılayıcı ilaçların çeşitliliğinin fazla oluşu, kısa süredir kullanılıyor olmaları ve hasta sayısının az olması nedeniyle, TX grubundaki hastaların lenfositlerinde MÇ sıklığı olarak gözlenen DNA hasar düzeylerine, immün baskılayıcı ilaçların katkısı tam olarak anlaşılamamıştır. Çalışmamızın korelasyon analizinde S(-)MÇ sıklığı ile BUN arasında (Tablo 49), S(+)MÇ sıklığı ile BUN ve kreatinin arasında aynı yönde bir ilişki saptandı (Tablo 46,49). Kronik böbrek hastalarında, hastalığın şiddetini gösteren kreatinin seviyesi ile DNA hasarı (lenfositlerde Comet ve MÇ sıklığı) arasında bir ilişki olduğu gösterilmiştir. DNA onarımındaki bozukluk ve artan kromozom hasarı, kalıcı üremik durumla ile ilişkilendirilebilir20,112. Çalışmamıza benzer şekilde, Stopper ve ark.nın yetişkin PreD hastalarında kreatinin seviyesi >6mg/dL olduğunda lenfositlerde TINT değerinde anlamlı bir artış gözlenirken112 (p<0,01), MÇ sıklığında ise hafif bir artış görüldü20 (p>0,01). MÇ sıklığının değerlendirildiği ikinci çalışmada, örnekleme hacmının küçük oluşu nedeniyle incelenen farklılıkların anlamlı olmadığı vurgulandı. Tablo 33’de görüldüğü gibi BUN ve kreatinin değerlerinin HD ve PreD gruplarında Tx grubundan anlamlı yüksek (p<0,05) oluşu, TX grubundaki kromozom kırığı ve kaybının daha az oluşunu açıklayabilir. Ayrıca Tx grubunun immün baskılayıcı ilaçlara maruziyet süresinin (22,35±19,43 ay) kısa oluşu nedeniyle, ilaçların geç dönem komplikasyonlarından daha az etkilendiği de düşünülebilir. Kronik böbrek hastası olan çocukların lenfositlerinde FISH kombine MÇ değerlendirilmesinin incelendiği bir çalışma 246 bulunmamaktadır. Bu nedenle çalışmamızı çocuklarda FISH kombine MÇ Yöntemi ile yapılan diğer bir çalışmayla karşılaştıracak olursak (tablo 23): Çalışmamızdaki tüm hasta gruplarındaki çocuklarda belirlenen anojenik ve klastojenik maruziyet, hava kirliliği nedeniyle kurşuna maruz kalan çocuklardaki168 anojenik ve klastojenik maruziyetten daha yüksekti. Her iki çalışmadaki sağlıklı kontroller ise benzerlik gösteriyordu. 5.5. Bukkal Epitelde Mikroçekirdek Sıklığının İncelenmesi Vücuttaki organ ve dokuların yenilenme kapasitesi sağlıklı yaşlanmanın temel ilkesidir. Yenilenme; çoğalmakta olan bazal hücrelerin sayısına, bölünme oranına, genomik stabilitesine ve hücre ölümü eğilimine bağlıdır131. Tüm malignitelerin yaklaşık %90’ı epiteliyal orijinlidir. Bukkal mukoza, karsinojenlerin çoğunun hedef dokusudur ve potansiyel karsinojenlere karşı bir bariyer oluşturur131. Vücuda inhalasyonla veya sindirim yoluyla giren potansiyel karsinojenlerin bir sonucu olarak gelişebilen genotoksik olayların erken gözlemlenmesinde eksfoliye bukkal mukoza epiteli kullanılabilir. Bukkal mukoza epitelinde uygulanan MÇ Yöntemi, DNA hasarının (örneğin: MÇ ve/veya nükleer bud), sitokinetik defektlerin (örneğin: binükleer hücreler), çoğalma potansiyelinin (bazal hücre frekansının), hücre öümlerinin (örneğin: çekirdeğin hücre içine dağılması, piknotik ve karyolitik hücreler) ve rejeneratif potansiyelin biyogöstergesi olarak incelenmesine imkan veren minimal invaziv bir metottur. Yöntem, DNA adduct ölçümü için moleküler probların kullanımını da mümkün kılmaktadır. Bukkal hücrelerin döngüsü 7-21 gün kadardır. Teorik olarak akut maruziyetin genotoksik etkileri 7-21 gün sonra gözlemlemek mümkündür. Fakat daha sonra da örneklemeler yapılarak genotoksinle inhibe edilen hücre bölünmesinin miktarına bakılabilir. İdeal olanı örneklemenin akut maruziyetten en az 7 gün sonra, 28 gün veya daha sonra tekrarıyla biyogöstergelerin incelenmesidir18. 247 Çalışmamızda bukkal epitelde MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı Tx, HD, PreD ve TH gruplarında kontrol grubundan anlamlı olarak yüksekti (p<0,001). MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı Tx grubunda en yüksekti, sırasıyla HD ve PreD grupları onu takip ediyordu. Fakat 3 hasta grubu arasında anlamlı bir faklılık bulunmadı (p>0,05) (Tablo 43). Bu durum hasta grubunun genomik hasarında bir artış olduğunu gösteriyordu. Bu sonuç, regresyon analizi sonucunda MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı ile TAS arasındaki ters yönde bir etkileşimin varlığıyla da desteklendi (Tablo 49). Çünkü TAS değeri, toplam hasta grubunda kontrol grubundan anlamlı şekilde düşüktü (p<0,05) (Tablo 33). Ayrıca biyokimyasal parametreler ile genotoksisite parametreleri arasındaki ilişkinin incelendiği korelasyon analizinde hasta grubunda MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı ile IL-6 arasında aynı yönde anlamlı bir ilişki saptanırken, kontrol grubunda ise benzer bir ilişki görülmedi (Tablo 46). IL-6 değeri gruplar arasında anlamlı farklılık göstermiyordu (p>0,05). IL-6, tümör hücrelerinin büyümesini ve farklılaşmasını sağlayarak kanserin patogenezinde ve inflamatuar cevapta önemli rol oynadığı bilinen bir sitokindir18. Bazı kanser hastalarında IL-6 düzeylerinin arttığı da bildirilmiştir206. Regresyon analizi sonucunda bukkal MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı ile kreatinin arasında, bukkal MÇ sıklığı ile ferritin arasında ve bukkal MÇ’li hücre sıklığı ile ürik asit arasında aynı yönde etkileşim saptanmıştır (Tablo 49). Kreatinin ve ferritin değeri HD grubunda Tx grubuna göre anlamlı yüksek iken, ürik asit ise her üç hasta grubunda da benzer şekilde yüksekti (p<0,05) (Tablo 33). Üremik semptomların patogenezisinde kreatinin ve ürik asitin önemli rol oynadığı3, demir metabolizması ve hidroksil radikallerinin üretiminin de oksidatif DNA hasarının seviyesiyle yakından ilişkili olduğu bilinmektedir82. Hasta grubunun genomik hasarındaki artışta yukarıda sayılan nedenlerin katkıda bulunabileceğini söylemek mümkündür. 248 Çalışmamızdakine benzer şekilde Roth JM ve ark.nın HD grubu yetişkinlerdeki çalışmasında bukkal MÇ sıklığı HD grubunda kontrol grubundan yüksekti159 (p<0,01). Regresyon analizi sonucunda hasta gruplarından herhangi birinde olmak ile bukkal MÇ ve MÇ’li hücre sıklığı arasında aynı yönde güçlü bir etki tespit edildi (p=0,000) (Tablo 49). MÇ sıklığı üzerindeki etki Tx grubunda en yüksekti (B=1,566 p=0,000) ve bunu sırasıyla HD (B=1,318; p=0,007), PreD (B=1,156; p=0,000) grupları izliyordu. MÇ’li hücre sıklığındaki etki de sırasıyla Tx (B=1,445; p=0,000), HD (B=1,151; p=0,003) ve PreD (B=1,094; p=0,000) grupları şeklindeydi. Bukkal MÇ ve MÇ’li hücre sıklığının Tx grubuyla etkileşiminin daha fazla olması Tx grubunda kullanılan immün baskılayıcı ilaçlar nedeniyle olabilir. Çünkü bukkal hücrelerin döngüsü 7-21 gün arasında olduğu için, bukkal epiteldeki MÇ sıklığı yakın zamandaki genomik hasarın bir göstergesidir. Bu nedenle kullanılan ilaçların kısa dönemdeki etkilerini saptayabilmektedir. Kronik böbrek hastası olan çocukların bukkal epitelinde MÇ değerlendirilmesinin incelendiği bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle çalışmamızı çocuklarda bukkal MÇ Yöntemi ile yapılan diğer çalışmalarla karşılaştıracak olursak, tablo 23’de görüldüğü gibi belirlenen DNA hasar düzeyleri: • Çalışmamızdaki tüm hasta gruplarındaki çocukların bukkal MÇ sıklığı (9,10±7,62): kronik tonsilliti olup antibiyotik kullanan çocukların164, ülseratif kolitli çocukların167, Crohn hastalığı olan çocukların167, kemoterapi öncesi ve sonrası malign tümörü olan çocukların169, Down sendromu olan çocukların174 bukkal MÇ sıklıkları aralığındaydı (minimum: 1,1-maksimum: 14,30). 249 • Çalışmamızdaki kontrol grubundaki çocukların bukkal MÇ sıklıkları (0,90±1,41), çocuklarda yapılan diğer çalışmalardaki sağlıklı kontrol grubu bireylerin MÇ sıklıkları aralığındaydı (minumum: 0,10 - maksimum: 4,03). Tx, PreD ve HD durumundaki genomik instabilitenin, yukarıda sayılan etken ya da durumlarla karşılaştırıldığında oldukça önemli olduğu görülmektedir. Çalışmamızda PreD süresi (1ay- 14yıl) ile bukkal MÇ sıklığı arasında ters yönde bir ilişki olduğu görüldü (r=-0,535; p<0,05) (Tablo 48). Çalışmamızdakinin aksine Roth JM ve ark.nın yetişkinlerdeki çalışmasında HD grubunda MÇ’li hücre sıklığı ve tedavi uzunluğu (2-22 yıl) arasında aynı yönde bir ilişki olduğu gösterildi159 (r=0.414; p< 0.01). Çalışmamızda hasta grubunun biyoizlenmesinde bukkal mukoza eksfoliye epitel hücrelerinin alternatif bir doku olma potansiyelini de inceledik. Bukkal hücrelerdeki ve lenfositlerdeki MÇ sıklığı arasında korelasyonun olmaması nedeniyle (Tablo 44), bukkal mukoza eksfoliye epitel hücrelerinin alternatif doku olma potansiyelinin zayıf olduğu öne sürülebilir. Bu durum başka çalışmalar ile de araştırılmıştır. Antiblastik kemoterapi ile indüklenen kromozomal aberasyonda MÇ’in etkinliğinin lenfositlerde bukkal hücrelerden daha yüksek olduğu bildirilmiştir156. Diğer bir çalışma, etilen oksidin kromozomal aberasyonu binükleer lenfositlerde indüklerken bukkal hücrelerde indüklemediğini gösterdi156. Bununla beraber, başka çalışmalarda ters sonuçlar da alındığından dolayı, lenfositlerle kıyaslandığında bukkal hücrelerde daha düşük cevap tüm maruziyetler için genellenemez156. Örneğin formaldehite maruz kalanlarda bukkal hücrelerde MÇ çekirdek frekansı artarken, lenfositlerde artmaz. Bukkal hücrelerde MÇ frekansının karsinojenik maruziyetle birkaç kat artabildiği bildirilmiştir156. Bu çalışma ile elde ettiğimiz veriler, farklı biyolojik hedeflerdeki genotoksik etkilerin tayininde bukkal MÇ ve lenfositlerdeki MÇ Yöntemlerinin birbirlerini tamamlayıcı nitelikte olduğunu düşündürmektedir. 250 Öte yandan çocuklarda yapılacak çalışmalarda, bukkal epitel örneklerin kolay alınması, tekrarlanabilir örnekleme açısından avantajlıdır. Bu nedenle örnek sayısı ve sayılan hücre sayısı arttırılarak ya da hassasiyeti artırıcı diğer tekniklerle kombine ederek, bukkal epitelin alternatif doku olma potansiyeli incelenmeye devam edilmelidir. Bukkal dokuda elde ettiğimiz sonuçların, şu anda devam etmekte olan bukkal hücrelerde yöntem validasyonu ve kanser riski göstergesi olarak kullanılıp kullanılmayacağına ilişkin HUMAN XL projesine207 önemli katkı sağlayacağını söylemek mümkündür. 251 6. SONUÇ Kronik böbrek hastalığı, çocuk ve gençlerin yaşamını derinden ilgilendirdiğinden önemi büyüktür. Üremik hastaların tedavilerindeki ilerlemeler, bir yandan hastaların daha uzun süre yaşamalarını sağlarken, bir yandan da hastalığın daha ayrıntılı bir biçimde gözlenme ve incelenmesine olanak vermiştir. Son yıllarda üremik hastalarda malignite oranının yüksek bildirilmesinin bir nedeni de, bu hastaların malignite gelişebilecek kadar uzun yaşatılabilmesi olabilir. Malignite riskini azaltmak için kronik böbrek hastalarında daha erken diyalizle veya böbrek nakliyle müdahale avantajlı olabilir. Aksine erken RRT, daha uzun bir diyaliz süreci yada uzun bir immün baskılama süreci demektir ki, bu durum da muhtemel kanser riski demektir. Konuyla ilgili moleküler epidemiyolojik çalışmalar özellikle çocuklarda oldukça azdır. Ayrıca çocuk hastalar, yetişkin olana kadar üremiye daha uzun süre maruz kalmaktadırlar. Gerekli önlemlerin alınabilmesi, tedavi yaklaşımlarının geliştirilebilmesi ve en önemlisi sağlıklı, uzun bir yaşam sürdürülebilmeleri açısından çocuk hastalar daha ayrıntılı incelenmeli ve malignite yönünden takip edilmeye devam edilmelidir. Bu çalışmada elde ettiğimiz sonuçlar; kronik böbrek hastalığı olan çocuk hastaların, genotoksik hasar riskinin arttığını ve kanser insidansında artışa katkıda bulunabileceğini ortaya koymaktadır. • Comet Yöntemiyle belirlenen bazal DNA hasarının Tx, HD ve PreD gruplarında arttığı, okside DNA hasarını yansıtan pürin baz hasarının PreD ve Tx gruplarında HD grubundan daha yüksek olduğu, primidin baz hasarının ise hasta gruplarında benzerlik gösterdiği saptandı. 252 • MÇ Yöntemiyle belirlenen DNA hasarının da benzer şekilde Tx, HD ve PreD gruplarında arttığı, fakat hasarın HD ve PreD gruplarında Tx grubuna göre daha yüksek olduğu saptandı. • 3 hasta grubunda da MÇ oluşumunda hem anojenik (sayısal hasar) hem de klastojenik (yapısal hasar) mekanizmaların rolünün arttığı belirlendi. HD grubundaki mikroçekirdek artışında anojenik etkilerin daha baskın olduğu belirlendi. • Bukkal epitelde MÇ Yöntemiyle belirlenen DNA hasarının da benzer şekilde Tx, HD ve PreD gruplarında arttığı belirlendi. Çalışma sonuçlarımız, farklı biyolojik hedeflerdeki genotoksik etkilerin tayininde, bukkal MÇ ve lenfositlerdeki MÇ Yöntemlerinin birbirlerini tamamlayıcı nitelikte olduğu göstermektedir. • BUN, kreatinin, TAS, ürik asit ve ferritin değerleri ile incelenen genotoksisite parametreleri arasında daha fazla etkileşim saptandı. • Tx grubunda gözlenen DNA hasarı artışında immün baskılayıcı ilaçların katkısını açık bir şekilde değerlendirmek mümkün olmamıştır. ÖNERİ • Çalışmamızdaki hasta grubu, klinisyenlerle birlikte ileriye yönelik kanser izleme çalışmaları içine alınmalıdır. • Tedavi yöntemlerinin ve kullanılan immün baskılayıcı ilaçların uzun dönemdeki etkilerini görebilmek için, en az 5 yıl sonra aynı hasta grubunda benzer bir çalışma gerçekleştirilmelidir. • Bukkal epitel hücreleri ile yapılacak çalışmalarda, örnek ve sayılan hücre sayısının arttırılmasının yanı sıra bukkal epiteldeki diğer çekirdek anomalilerini de (binükleer hücre sayısı, karyolitik, karyorhektik, piknotik ve Nbud içeren hücreler) içerecek biçimde daha kapsamlı olarak gerçekleştirilmelidir. 253 • Bukkal epitelde yapılan analizlerin hassasiyetini artırmak amacıyla FISH Yöntemiyle kombinasyon yapılabilir. • Genetik faktörlerin (OGG1, GSTM1, CYP3A4, CYP3A5, MDR1, TPMT ve UGT1 gibi genetik polimorfizmlerin) bu çalışmada incelenen genotoksik yanıtlar üzerine etkisinin araştırılması elde ettiğimiz sonuçların yetkinliğine katkıda bulunacaktır. 254 7. ÖZET Çocuklarda Kronik Böbrek Hastalığı Ve Böbrek Nakli Sonrası Genotoksik Hasarın Biyoizlenmesi Kronik böbrek hastalığı, böbrek fonksiyonlarında şiddetli ve geri dönüşümsüz bir azalma ile karakterize olan çok ciddi bir hastalıktır. Yapılan epidemiyolojik çalışmalar; KBH’nın bir buz dağı, SDBH’nın da bu buz dağının görünen kısmı olduğunu göstermiştir. Günümüzde dünya genelinde kronik böbrek hastası sayısı özellikle adolesanlarda kayda değer bir şekilde artış göstermekte ve büyük bir halk sağlığı problemi olarak tanımlanmaktadır. KBH’nın bir sonucu, artan kanser riskidir. Kanser riski, genomik hasarın artışıyla ilişkilendirilebilir. KBH olan çocuklarda genomik hasarın incelendiği herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu amaçla, 17 PreD, 15 HD ve 17 Tx hastası çocuğun lenfositlerinde Comet, Modifiye Comet, MÇ, FISH kombine MÇ ve bukkal epitelde MÇ Yöntemlerini kullanarak genomik hasarı ve ölçümü yapılan biyokimyasal parametrelerin genotoksisite parametreleriyle ilişkisini değerlendirdik. Kontrol grubumuz yaş ve cinsiyet uyumlu 20 sağlıklı çocuktan oluşturuldu. Comet Yöntemiyle belirlenen bazal DNA hasarının (TINT) Tx (5,79±1,94), HD (4,91±1,35) ve PreD (4,92±1,23) gruplarında arttığı, pürin baz hasarının (TINTSFPG) PreD (5,18±5,53) ve Tx (4,49 (±3,78) gruplarında HD (1,57±1,77) grubundan daha yüksek olduğu (p<0,05), primidin baz hasarının (TINTSENDO) ise hasta gruplarında benzerlik gösterdiği saptandı (p>0,05). MÇ Yöntemiyle belirlenen DNA hasarının Tx (6,12±5,33), HD (9,07±4,86) ve PreD (9,19±2,61) gruplarında arttığı, fakat hasarın HD ve PreD gruplarında Tx grubuna göre daha yüksek olduğu saptandı (p<0,05). 3 hasta grubunda da MÇ oluşumunda hem anojenik (sayısal hasar) hem de klastojenik (yapısal hasar) 255 mekanizmaların rolü olduğu belirlendi (p<0,05). HD grubundaki mikroçekirdek artışında anojenik etkilerin (%63,64) daha baskın olduğu belirlendi (p<0,05). Bukkal epitelde MÇ Yöntemiyle belirlenen DNA hasarının da benzer şekilde Tx (9,65±7,31), HD (9,50±7,12) ve PreD (8,24±8,66) gruplarında arttığı belirlendi (p<0,05). BUN, kreatinin, TAS, ürik asit ve ferritin değerleri ile incelenen genotoksisite parametreleri arasında etkileşim saptandı. Regresyon analizi sonuçları, hasta gruplarından birinde olmanın Comet, MÇ, S(+)MÇ, S(-)MÇ ve bukkal MÇ sıkılığını arttırdığını göstermektedir. Bu çalışma ile elde ettiğimiz veriler, farklı biyolojik hedeflerdeki genotoksik etkilerin tayininde bukkal MÇ ve lenfositlerdeki MÇ Yöntemlerinin birbirlerini tamamlayıcı nitelikte olduğu düşündürmektedir. Bukkal hücrelerdeki ve lenfositlerdeki MÇ sıklığı arasında korelasyonun olmaması nedeniyle, bukkal hücrelerin kanser riskini öngörmede kullanılıp kullanılmayacağını ve her iki hücre grubu arasındaki ilişkiyi göstermek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulduğunu söylemek mümkündür. Bu çalışmada elde ettiğimiz sonuçlar; kronik böbrek hastalığı olan çocuk hastaların genotoksik hasar riskinin arttığını ve bu durumun kanser insidansındaki artışa katkıda bulunabileceğini ortaya koymaktadır. Anahtar sözcükler: kronik böbrek hastalığı, çocuklar, genotoksisite 256 8. SUMMARY Biomonitoring Of Genotoxic Damage In Children With Chronic Renal Disease And İn Those After Kidney Transplantation Chronic renal disease is a serious illness that causes severe and irrevesible reduction in kidney function. Epidemiological studies showed that the CRD is an iceberg and ESRD is the tip of this iceberg. Worldwide, the number of patients with CKD is rising remarkably, especially in adolescence, and CKD is now being recognized as a major public health problem. One consequence of chronic renal disease is an elevated cancer risk. It has been suggested that cancer risk may be related to an elevated level of genomic damage. To the our knowledge, there has been no previous study examining genomic damage in children with chronic renal disease. For this purpose, we evaluated the genomic damage by using Comet, modified Comet, MN, FISH-MN Assay in lymphocytes and MN Assay in buccal epitelium. Lymphocytes and buccal epitelium were taken from 17 PreD, 15 HD, and 17 Tx pediatric patients. We evaluated the relation between genotoxicity parameters and the measured biochemical parameters. Our control group consist of 20 healthy children who were age and sex matched. The DNA base damage (TINT) determined by Comet Assay increased in Tx (5,79±1,94), HD (4,91±1,35) and PreD (4,92±1,23) groups (p<0,05). It was found that purine base damage (TINTSFPG) in PreD (5,18±5,53) and Tx (4,49 (±3,78) groups was higher than the HD (1,57±1,77) group (p<0,05) whereas primidine base damage (TINTSFPG) was the same in all patient groups (p>0,05). MN frequencies in lymphocytes were significantly higher in Tx (6,12±5,33), HD (9,07±4,86) and PreD (9,19±2,61) groups when compared with that of 257 control (p<0,05). However, the DNA damage as MN frequencies in HD and PreD groups were higher than the Tx group (p<0,05). It has been found that role of both aneugenic and clastogenic mechanisms were evident in increased MN frequencies of all patient groups. However, aneugenic effects (%63,64) were more predominant in HD group (p<0,05). In buccal epithelium, the DNA damage determined by MN Assay was also increased in Tx (9,65±7,31), HD (9,50±7,12) and PreD (8,24±8,66) groups (p<0,05). There was an interaction between BUN, creatinine, TAS, uric acid and ferritine and genotoxicity parameters analyzed. Regression analysis shows that being in any of the patient groups increases the Comet as DNA base damage , MN, C(+)MN, C(-)MN and buccal MN frequencies. Our results indicate that buccal cells and lymphocytes may complement each other in the detection of a wide range of genotoxic effects in completely different biological targets. There was no correlation between MN frequencies in lymphocytes and those in buccal cells, thus, further studies will be needed to prove such a relationship and whether buccal cells may be used to predict future cancer risk. In conclusion, our results reveal that pediatric PreD, HD and Tx patients with chronic renal disease have an increased genotoxic damage and thus contributing to the future cancer risk. . Key words: chronic renal disease, children, genotoxicity 258 9. KAYNAKLAR 1. Akpolat T, Utaş C, Süleymanlar G. Nefroloji el kitabı. 4. Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd; 2007. 2. Morris PJ. Böbrek transplantasyonu temel bilgiler ve uygulama. 4.Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd; 1997. 3. Schrier RW. Böbrek ve elektrolit hastalıkları. 6.Baskı. Ankara: Güneş Kitabevi Ltd; 2005. 4. Altuntaş İ. The importance of 8-Ohdg, the oxidative DNA damage indıcator in the diagnosis and treatment of autoimmune thyroidit. Yüksek Lisans. Ankara: Ankara Üniversitesi; 2007. 5. Yazıcı C ve Köse K. Kronik böbrek yetmezliğinde oksidatif stres ve biyomarkırları. TNDT Derg 2004; 13(3): 117-124. 6. Maisonneuve P, Agodoa L, Gellert R, Stewart JH, Buccianti G, Lowenfels AB, et al. Cancer in patients on dialysis for end-stage renal disease: an international collaborative study. The Lancet 1999; 354: 9398. 7. Stopper H, Schinzel R, Sebekova K, and Heidland A. Genotoxicity of advanced glycation end products in mammalian cells. Cancer Letters 2003; 190: 151-1156. 8. Groothoff JW. Long-term outcomes of children with end-stage renal disease. Pediatr Nephrol 2005; 20: 849-853. 9. Türk Nefroloji Derneği. Türkiye’de Nefroloji-Diyaliz ve Transplantasyon. İstanbul: Türk Nefroloji Derneği Yayınları; 2001. 10.Türk Nefroloji Derneği. Türkiye’de Nefroloji-Diyaliz ve Transplantasyon. İstanbul: Türk Nefroloji Derneği Yayınları; 2005. 11.Türk Nefroloji Derneği. Türkiye’de Nefroloji-Diyaliz ve Transplantasyon. İstanbul: Türk Nefroloji Derneği Yayınları; 2008. 12. Richards KB, Kattenhorn M, Donald A, Oakley G, Varghese Z, Rees L, et all. Does oral folic acid lower total homocysteine levels and improve 259 endothelial function in children with chronic renal failure. Circulation 2002; 105: 1810-1815. 13. Ece A, Atamer Y, Gürkan F, Davutoğlu M, Bilici M, Tutanç M, ve ark. Paraoxonase, anti-oxidant response and oxidative stress in children with chronic renal failure. Pediatr Nephrol 2006; 21: 239-245. 14. McDonald SP and Craig JC. Long-term survival of children with endstage renal disease. N Eng J Med 2004; 350: 2654-2662. 15. Andreoli SP , Brewer ED, Watkins S, Fivush B, Powe N, Shevchek J, et al. American society of pediatric nephrology position paper on linking reimbursement to quality of care. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2263-2269. 16. Stoyanova E, Sandoval SB, Zuniga LA, El-Yamani N, Coll E, Pastor S, et al. Oxidative DNA damage in chronic renal failure patients. Nephrol Dial Transplant 2010; 25: 879-885. 17. Kılıç GL. Fetal doku interfaz nükleuslarında 13, 18, 21, X, Y kromozom anöploidilerinin fluoresan in situ hibridizasyon yöntemi ile araştırılması. Doktora Tezi. İstanbul: İstanbul Üniversitesi; 1998. 18. Thomas P, Holland N, Bolognesi C, Kirsch-Volders M, Bonassi S, Zeiger E, et al. Buccal micronucleus cytome assay. Nat Protoc 2009; 4(6): 825-837. 19. Fragedaki E, Nebel M, Schupp N, Sebekova K, Vökel W, Klassen A, et al. Genomic damage and circulating AGE levels in patients undergoing daily versus standart haemodialysis. Nephrol Dial Transplant 2005; 20: 1936-1943. 20. Stopper H, Meysen T, Böckenförde A, Bahner U, Heidland A and Vamvakas S. Increased genomic damage in lymphocytes of patients before and after long-term maintenance hemodialysis therapy. Am J Kidney Dis 1999; 34(3): 433-437. 21. Oliveira VD, Zanki H, and Rath T. Mutagenic and cytotoxic effects of immunosuppressive drugs on human lymphocyte cultures. Exp Clin Transplant 2004; 2: 273-279. 260 22. Tanagho EA, and McAninch JW. Smith genel üroloji. 16.Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd; 2004. 23.http://images.google.com.tr/imgres?imgurl=http://academic.kellogg.cc. mi.us/herbrandsonc/bio201_McKinley/f276ab_renal_corpuscl_c.jpg&imgre furl=http://academic.kellogg.cc.mi.us/herbrandsonc/bio201_McKinley/Urin ary%2520System.htm&usg (Mart 2008) 24.http://www.tsn.org.tr/egchalhem/bobrek_yetmezligi.pdf (Iubat 2007) 25.http://images.google.com.tr/imgres?imgurl=http://www.engin.umich.edu /~cre/web_mod/viper/pics/kidney2.gif&imgrefurl=http://www.engin.umich.e du/~cre/web_mod/viper/kidney_function.htm&usg (Mart 2008) 26. www.chemcases.com/alcohol/alc-07.htm (Mart 2008) 27.http://www.kidney.org/Professionals/kdoqi/guidelines_ckd/p4_class_g1. htm (Mart 2008) 28. http://www.kidney.org/kidneydisease/ckd/index.cfm (Mart 2008) 29.http://www.tsn.org.tr/egchalhem/kronik_bobrek_yetmezligi.pdf (Iubat 2007) 30. Çetinkaya R, Odabaş AR, Aktaş E ve Selçuk Y. Kronik hemodiyaliz hastalarında hemodiyaliz yeterliliğinin homosistein düzeylerine etkisi. TNDT Derg 2001; 10(4): 219-222. 31. Bakkaloğlu SA. Homosistein ve kronik böbrek yetmezliği. TNDT Derg 2002; 11( 2): 68-73. 32. Crott J, and Fenech M. Preliminary study of the genotoxic potential of homocystein in human lymphocytes in vitro. Mutagenesis 2001; 16(3): 213-217. 33. Stopper H, Treutlein AT, Bahner U, Schupp N, Schmid U, Brink A, et al. Reduction of the genomic damage level in haemodialysis patients by folic acid and vitamin B12 supplementation. Nephrol Dial Transplant 2008; 23(10): 1-8. 34. Schupp N, Schmid U, Heidland A, and Stopper H. New approaches for the treatment of genomic damage in end-stage renal disease. J Ren Nutr 2008; 18 (1): 127-133. 261 35.Türk Nefroloji Derneği. Türkiye’de Nefroloji-Diyaliz ve Transplantasyon. İstanbul: Türk Nefroloji Derneği Yayınları; 2007. 36. http://www.usrds.org/atlas.htm 37. Warady BA, Chadha V. Chronic kidney disease in children: the global perspective. Pediatr Nephrol 2007; 22: 1999-2009. 38. Iirin A, Emre S, Alpay H, Nayır A, Bilge I, Tanman F. Etiology of chronic renal failure in Turkish children. Pediatr Nephrol 1995; 9(5): 549552. 39. Mir S. Çocuk yaş grubu renal replasman tedavisinde (RRT) yenilikler. TNDT Derg 1994; 3: 20-25. 40. Darbyshire P, Oster C, and Henning P. Children’s and young people’s experiences of chronic renal disease: a review of the literature, methodological commentary and an alternative proposal. J Clin Nurs 2006; 15(6): 751-760. 41. Haberal M, Bereket G, Karakayalı H, Arslan G, Moray G, Bilgin N. Pediatric renal transplantation in Turkey: A review of 56 cases from a single center. Pediatr Transplant 2000; 4: 293-299. 42. Danovitch GM. Böbrek nakli el kitabı. 3. Baskı. Ankara: Güneş Kitabevleri Ltd; 2003. 43. Lin YS, Hung SC, Wei YH, and Tarng DC. GST M1 polymorphism associates with DNA oxidative damage and mortality among hemodialysis patients. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 405–415. 44. Sözen H, Dalgic A, Karakayali H, Baskin E, Saatci Ü, Haberal M, ve ark. Renal transplantation in children. Transplant Proc 2006; 38: 426-429. 45. http://www.genetikbilimi.com/genbilim/kansernedir.htm (Mart 2007) 46. Langer RM, Jaray J, Toth A, Hidvegi M, Vegsö G, Perner F, et al. De novo tumors after kidney transplantation: the Budapest experience. Transplant Proc 2003; 35: 1396-1398. 47. Vial T, Descotes J. Immunosuppressive drugs and cancer. Toxicology 2003; 185: 229-240. 262 48. Winter P, Schoeneich G, Miersch WDE, Klehr HU. Tumour induction as a consequence of immunosuppression after renal transplantation. Int Urol Nephrol 1997; 29(6): 701-709 49. Dantal J, Soulillou JP. Immunosuppressive drugs and the risk of cancer after organ transplantation. N Eng J Med 2005; 352(13): 13711373. 50. Vegso G, Toth M, Hidvegi M, Toronyi E, Langer RM, Dinya E, et al. Malignancies after renal transplantation during 33 years at a single center. Pathol Oncol Res 2007; 13(1): 63-69. 51. Taylor Al, Watson CJE, and Bradley JA. Immunosuppressive agents in solid organ transplantation: Mechanisms of action and therapeutic efficacy. Crit Rev Oncol Hematol 2005; 56: 23-46. 52. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/dailys/04/apr04/042004/03p-0275- ref0001-063-Tab-18-vol4.pdf (Ocak 2009) 53. Ataman R, Önen K, Sarıyar M, Ayaz M, Dalmak S, Ülkü U, et al. Renal transplantasyonda üçlü tedavi (siklosporin, azathioprin, prednisolon) ve sonuçlarımız. TNDT Derg 1992; 1: 34-39. 54. Azarpira N, Aghdaie MH, and Behzad-Behbahanie A, Geramizadeh B, Behzadi S, Malekhoseinie SA, et all. Association between cyclosporine concentration and genetic polymorphisms of CYP3A5 and MDR1 during the early stage after renal transplantation. Exp ClinTransplant 2006; 4 (1): 416-419. 55. Schachter AD, Benfield MR, Wyatt RJ, Grimm PC, Fennell RS, Herrin JT, et al. Sirolimus pharmacokinetics in pediatric renal transplant recipients receiving calcineurin inhibitor co-therapy. Pediatr Transplant 2006; 10(8): 914-919. 56. Dantal J, and Pohanka E. Malignancies in renal transplantation: an unmet medical need. Nephrol Dial Transplant 2007; 22: i4-i10. 57. Lien YH, Hunt KR, Siskind MS, and Zukoski C. Association of cyclosporin A with acquired cystic kidney disease of the native kidneys in renal transplnt recipients. Kidney Int 1993; 44: 613-616. 263 58. http://www.fda.gov/medwatch/ (Ocak 2009) 59. Thervet E, Anglicheau D, Legendre C, Beaune P. Cytochrome P450 3A polymorphisms and immunosuppressive drugs: an update. Pharmacogenomics 2007 Jul; 8(7): 835-49. 60. Thervet E, Anglicheau D, Legendre C, Beaune P. Role of pharmacogenetics of immunosuppressive drugs in organ transplantation. therapeutic drug monitoring. Ther Drug Monit. 2008; 30 (2): 143-150. 61.http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2005/016324s03 0,017391s013lbl.pdf (Ocak 2009) 62. Tümer TB, Ulusoy G, Adalı O, Iahin G, Gözdaşoğlu S, Arınç E. The low frequency of defective TPMT alleles in Turkish population: a study on pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia. Am J Hematol. 2007; 82(10): 906-10. 63. Palanduz S, Sever MS, Öztürk I, Taşçıoğlu C, Karan MA, Sönmez G, ve ark. Genotoxic potential of cyclosporin A in patients with renal transplantation. Cell Biol and Toxicol1999; 15: 13-17. 64. IARC Monograph. 1990; 50; p.77 65. Öztürk S, Ayna TK, Cefle K, Palanduz S, Çiftçi HS, Kaya SA ve ark. Effect of cyclosporin A and tacrolimus on sister chromatid exchange frequency in renal transplant patients. Genet Test 2008; 12(3): 427-430. 66. Rath T, and Oliveira-Frick V. Mutagenicity of immunosuppressive medications among renal transplant recipients. Am J Nephrol 2009; 30: 514–520. 67. Vamvakas S, Bahner U, Heidland A. Cancer in end-stage renal disease: potential factors involved. Am J Nephrol 1998; 18: 89-95. 68. Ou JH, Pan CC, Lin JSN, Tzai TS, Yang WH, Chang CC, et all. Transitional cell carcinoma in dialysis patients . Eur Urol 2000; 37: 90-94. 264 69. Andres A. Cancer incidence after immunosuppressive treatment following kidney transplantation. Crit Rev Oncol Hematol 2005; 56: 71-85. 70. Er Ö. Son dönem böbrek yetmezliğinde kanser. TNDT Derg 2001; 10: 7-10. 71. Ramon P. Malignancy and chronic renal failure. Saudi J Kidney Dis Transpl 2003; 14 (1): 5-14. 72. Çavdar C, Sifil A, Çamsarı T. Hemodiyaliz hastalarında oksidan stres ve antioksidan savunma. TNDT Derg 1997; 3-4: 102-105. 73. Altaş E, Çetinkaya R, Kızıltunç A, Tonbul HZ, Üçüncü H, Çapoğlu İ. Kronik hemodiyaliz hastalarında işitme kaybı ve antioksidanlar. TNDT Derg 1998; 2: 97-101. 74. Aksu BY. Demir eksikliği anemili çocuklarda oral demir tedavisinin DNA hasarı ile ilişkisi. Uzmanlık Tezi. İstanbul: Sağlık Bakanlığı Bakırköy Dr. Sadi Konuk Eğitim ve Araştırma Hastanesi Çocuk Sağlığı Ve Hastalıkları Kliniği; 2008. 75.http://www.danoneenstitusu.org.tr/pdf/Birgul_Mutlu_en_iyi_bildiri_3.pdf (Ocak 2009) 76. Giray B, Kan E, Bali M, Hincal F, Başaran N. The effect of vitamin E supplementation on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels in hemodialysis patients. Clin Chim Acta 2003; 338: 91–98. 77. Dinçer Y, Akçay T, Saygılı Eİ, Ersoy EY, Tortum O. Helicobacter pylori ile enfekte vakalarda clarithromycin+amoxicillin tedavisinin oksidatif DNA hasarı üzerine etkisi. UHOD 2007; 4(17): 204-208. 78. Danpanich E, Kasiske BL. Risk factors for cancer in renal transplant recipients (The 18th annual meeting of the American society of transplantation, may 15-19, 1999, Chicago, Illinois clinical transplantation). Transplantation 1999pp; 68 (12): 1859-1864. 79. Zevin D, Malachi T, Gafter U, Friedman J, Levi J. Impaired DNA repair in patients with end-stage renal disease and its improvement with hemodialysis. Miner Electrolyte Metab 1991; 17(5): 303-306. 265 80. Cooke Ms, Evans MD, Dizdaroğlu M and Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J 2003; 17: 11951214. 81. Makropoulos W, Kocher K, Heintz B, Schwarz ER, Mertens PR, Stefanidis I. Urinary thymidine glycol as a biomarker for 1 oxidative stress after kidney transplantation. Ren Fail 2000; 22(4): 499-50. 82. Tarng DC, Chen TW, Huang TP, Chen CL,Liu TY, Wei YH. Increased oxidative damage to peripheral blood leukocyte DNA in chronic peritoneal diaysis patients. J Am Soc Nephrol 2002;13: 1321-1330. 83. Fairbairn DW, Olive PL, O’Neill KL. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Res 1995; 339: 37-59. 84. Aydın Ç, Turkmen F, Berber İ, Aydın M, Yaltı T, Yiğit B, et al. Renal Transplant alıcılarında posttransplant maligniteler. TNDT Derg 2000; 1: 41-43. 85. Berber I, Altaca G, Aydın C, Dural A, Kara VM,Yigit B, et all. Kaposi’s sarcoma in renal transplant patients: predisposing factors and prognosis. Transplant Proc 2005; 37: 967-968. 86. Moray G, Başaran Ö, Yağmurdur MC, Emiroğlu R, Bilgin N, Haberal M. Immunosuppressive therapy and Kaposi’s sarcoma after kidney transplantation. Transplant Proc 2004; 36: 168-170. 87. Agraharkar ML, Cinclair RD, Kou YF, Daller JA, Shahinian VB. Risk of malignancy with long-term immunosuppression in renal transplant recipients. Kidney Int 2004; 66: 383-389. 88. Euvrard S, Chardonnet Y, Pouteil-Noble C, Kanitakis J, Chignol MC, Thivolet J, et all. Association of skin malignancies with various and multiple carcinogenic and noncarcinogenic human papillomaviruses in renal transplant recipients. Cancer 1993; 72(7): 2198-2206. 89. Adani GL, Baccarani U, Lorenzin D, Gropuzzo M, Tulissi P, Montanaro D, et all . De novo gastrointestinal tumours after renal transplantation: role of CMV and EBV viruses. Clin Transplant 2006; 20: 457-460. 266 90. Hanaway MJ, Weber S, Buell JF, Trofe J, Alloway R, Beebe T, et all . Risk for recurrence and death from preexisting cancers after transplantation. Transplant Rev 2005; 19: 151-163. 91. Veroux M, Puliatti C, Fiamingo P, Cappello D, Puliatti D, Vizcarra D, et all . Early de novo malignancies after kidney transplantation. Transplant Proc 2004; 36: 718-720. 92. Moloney FJ, Comber H, O’Lorcain P, O’Kelly P, Conlon PJ, and Murphy GM. A population-based study of skin cancer incidence and prevalence in renal transplant recipients. Br J Dermatol 2006; 154: 498504. 93. Bordea C, Wojnarowska F, Millard PR, Doll H, Morris PJ. Skin cancers in renal transplant recipients ocur more frequently than previously recognized in a temperate climate. Transplantation 2004; 77(4): 574-579. 94. Moosa MR. Racial and ethnic variations in incidence and pattern of malignancies after kidney transplantation. Medicine 2005; 84: 12-22. 95. Ramsay HM, Fryer AA, Hawley CM, Smith AG, Nicol DL, and Harden PN. Non-melanoma skin cancer risk in the Queensland renal transplant population. Br J Dermatol 2002; 147: 950-956. 96. Fuente MJ, Sabat M, Roca J, Lauzurica R, Fernandez-Figueras MT, and Ferrandiz C. A prospective study of the incidence of skin cancer and its risk factors in a Spanish Mediterranean population of kidney transplant recipients. Br J Dermatol 2003; 149: 1221-1226. 97. Sabeel AI, Qunibi WY, Alfurayh OA, Meshari KA. Kaposi’s sarcoma in Sudanese renal transplant recipients: A report from a single center. J Nephrol 2003; 16: 412-416. 98. Savaj S, Liakopoulos V, Ghareeb S, Musso C, Sahu K, Bargman JM, et all. Renal cell carcinoma in peritoneal dialysis patients. Int Urol and Nephrol 2003; 35: 263-265. 99. Satoh S, Tsuchiya N, Habuchi T, Ishiyama T, Seimo K, Kato T. Renal cell and transitional cell carcinoma in a Japanese population undergoing maintenance dialysis. J Urol 2005; 174: 1749-1753. 267 100. Farivar-Mohseni H, Perlmutter AE, Wilson S, Shingleton WB, Bigler SA, Fowler JE. Renal cell carcinoma and end stage renal disease. J Urol 2006; 175: 2018-2021. 101. Barama A, St-Louis G, Nicolet V, Hadjeres R, Dalozi P. Renal cell carcinoma in kidney allografts: A case series a single center. Am J Transplant 2005; 5: 3015-3018. 102. Mir S, Özkayın N, Akalın T. Renal transplantasyon sonrası human papillom virüs olgusu. TNDT Derg 2003; 12(4): 236-238. 103. Penn I. De novo malignancy in pediatric organ transplant recipients. J of Pediatric Surgery 1994; 29(2): 221-228. 104. Tyden G, Wernersson A, Sandberg J, Berg U. Development of renal cell carcinoma in living donor kidney grafts. Transplantation 2000; 20(11): 1650-1656. 105. Smith JM, Rudser K, Gillen D, Kestenbaum B, Seliger S, Weiss N, et all . Risk of lymphoma after renal transplantation varies with time:an analysis of the United States Renal Data System. Transplant 2006; 81: 175-180. 106. Farmasötik toksikoloji uygulama ders notu. GÜ Eczacılık Fak F Toksikoloji ABD, 2007. 107.http://www.usbweb.com/tech_tips/Single%20Cell%20Gel%20Electrop horesis%20(Comet)%20Assay.pdf (Ekim 2008) 108. Speit G, Schütz P, Bonzheim I, Trenz K, Hoffmann H. Sensititivity of the FPG protein towards alkylation damage in the comet assay. Toxicol Lett 2004; 146: 151-158. 109. Speit G, and Hartmann A. The Comet Assay a sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage and repair. Methods Mol Biol 2006; 314: 275-286. 110. Moller P. The alkaline comet assay: towards validation in biomonitoring of DNA damaging exposures. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 2006; 98: 336-345. 268 111. Collins AR. The Comet Assay for DNA damage and repair. Mol Biotechnol 2004; 26: 249-261. 112. Stopper H, Boullay F, Heidland A, Vienken J, and Bahner U. Cometassay analysis ıdentifies genomics damage in lymphocytes of uremic patients. Am J Kidney Dis 2001;38: 296-301. 113. Valverde M, Wegman PO, Rojas E, Fortoul T, Meneses F, Ramirez M et all. The application of single cell gel electrophoresis or comet assay to human monitoring studies. Salud Publica Mex 1999; 41(2): s109-s113. 114. http://imbs.massey.ac.nz/images/al_micronucleus.jpg (Ekim 2008) 115. Moller P, Knudsen LE, Loft S, and Wallin H. The comet assay as a rapid test in biomonitoring occupational exposure to DNA-damaging agents and effect of confounding factors. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000; 9: 1005-1015. 116. Stoyanova E, Sandoval SB, Zuniga LA, El-Yamani N, Coll E, Pastor S, et all. Oxidative DNA damage in chronic renal failure patients. Nephrol Dial Transplant 2010; 25: 879-885. 117. Altuntaş İ. Otoimmün tiroid hastalığının tanı ve takibinde oksidatif dna hasar belirleyicisi 8-OHdG’nin önemi. Yüksek Lisans Tezi. Ankara: Ankara Üniversitesi; 2007. 118. Collins AR, Dusinska M, Gedik CM and Stetina R. Oxidative damage to DNA: do we have a reliable biomarker. Environ Health Perspect 1996; 104(3): 465-469. 119. Dinçer Y, Akçay T, Saygılı Eİ, Ersoy EY, Tortum O. Helicobacter pylori ile enfekte vakalarda clarithromycin+amoxicillin tedavisinin oksidatif DNA hasarı üzerine etkisi. UHOD 2007; 17(4): 204-208. 120.http://ntp.niehs.nih.gov/ntpweb/idex.cfm?objectid=16D65516-BA998D3E-BEFF712372F4B675 (Ekim 2008) 121. Fenech M. The in vitro micronucleus technique. Mutat Res 2000; 455:81-95. 269 122. Schuler M, Rupa DS, Easmond DA. A critical evaluation of centromeric labeling to distinguish micronuclei induced by chromosomal loss and breakage in vitro. Mutat Res 1997; 392: 81-95. 123. Fenech M, Baghurst P, Luderer W, Turner J, Record S, Ceppi M, et all. Low intake of calcium, folate, nicotinic acid, vitamin E, retinol, βcarotene and high intake of pantothenic acid, biotin and riboflavin are significantly associated with increased genome instability-results from a dietary intake and micronucleus index survey in South Australia. Carcinogenesis 2005; 26(5): 991-999. 124. Fenech M. The cytokinesis-block micronucleus teqnique and its application to genotoxicity studies in human populations. Environ Health Perspect 1993; 101(3): 101-107. 125. Bonassi S, Znaor A, Ceppi M, Lando C, Chang WP, Holland N et all. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis 2007; 28(3): 625631. 126. Demirel S, Zamani AG. Mikronükleus tekniği ve kullanım alanları. Genel Tıp Derg. 2002; 12(3): 123-127. 127. Parry EM, Parry JM, Corso C, Doherty A, Haddad F, Hermine TF, et all. Detection and characterization of mechanisms of action of aneugenic chemicals. Mutagenesis 2002; 17(6): 509-521. 128.htpp://cdfc00.rug.ac.be/HealthRisk/genotoxicitytests/micronucleus_tes t.htm (Ekim 2007). 129. Fenech M, Chang WP, Kirsch-Volders M, Holland N, Bonassi S, Zeiger E. HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutat Res 2003; 534: 65-75. 130. Lewinska D, Stepnik M, Krajewski W, Arkusz J, Stanczyk M, Wronska-Nofer T. Increased incidence of micronuclei assessed with the micronucleus assay and the fluorescence in situ hybridization (FISH) 270 technique in peripheral blood lymphocytes of nurses xposed to nitrous oxide. Mutat Res 2005; 581: 1-9. 131. Fenech M, Holland N, Chang WP, Zeiger E, Bonassi S. The human micronucleus project-an international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutat Res 1999; 428: 271-283. 132. www.istanbul.edu.tr/fen/notlar/1260050503.ppt (Ekim 2009) 133. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc 2007; 2(5): 1084-1104. 134. Fenech M. Biomarkers of genetic damage for cancer epidemiology. Toxicology 2002 ; 181-182: 411-/416. 135. Bolognesi C, Landini E, Perrone E, Roggieri P. Cytogenetic biomonitoring of floriculturist population in Italy: micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization (FISH) with an all-chromosome centromeric probe. Mutat Res 2004; 557: 109-117. 136. Halling KC, Kipp BR. Fluorescence in situ hybridization in diagnostic cytology. Hum Pathol 2007; 38: 1137-1144. 137. www.genbilim.com/content/view/3414/33 (Eylül 2008) 138. Gole LA, Bongso A. Fluorescent in-situ hybridization-some of its applications in clinical cytogenetics. Singapore Med J 1997; 38 (11): 497503. 139. Tuna M. Kanser sitogenetiğinde yeni moleküler teknikler. Türk onkoloji dergisi 2001; 16(3): 142-145. 140. http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHguide.html (Eylül 2008) 141. http://www.hmds.org.uk/fish.html (Eylül 2008) 142. Schlörmann W, and Glei M. Comet Fluorescence In Situ Hybridization (Comet-FISH): Detection of DNA Damage. CSH Protoc 2009: 5; 5220. 143. Holland NT, Moore LE, and Smith MT. Measurement and characterization of micronuclei in exfoliated human cells by fluorescence 271 in situ hybridization with a centromeric probe. Mutat Res 1994; 312(1): 3950. 144. Surralles J, Autio K, Nylund L, Jarventaus H, Norppa H, Veindebaum T, et al. Molecular cytogenetic analysis of buccal cells and lymphocytes from benzene-exposed workers. Carcinogenesis 1997; 18(4): 817-823. 145. Norppa H, Luomahaara S, Heikanen H, Roth S, Sorsa M, Renzi L, et all. Micronucleus assay in lymphocytes as a tool to biomonitor human exposure to aneuploidogens and clastogens. Environ Health Perspect 1993; 101(3): 139-143. 146. Cavallo D, Ursini CL, Sale EO and Iavicoli S. Micronucleus induction and FISH analysis in buccal cells and lymphocytes of nurses administering antineoplastic drugs. Mutat Res 2007; 628: 11-18. 147. Migliore L, Cocchi L, Scarpato R. Detection of the centromere in micronuclei by fluorescence in situ hybridization: its application to the human lymphocyte micronucleus assay after treatment with four suspected aneugens. Mutagenesis 1996; 11(3): 285-290. 148. htpp://vysis.com/WhatIsFISH 12954.asp (Eylül 2006) 149. Werner M, Wilkens L, Aubele M, Nolte M, Zitzelsberger H, Komminoth P. İnterphase cytogenetics in pathology: principles, methods, and applications of fluorescence in situ hybridization (FISH). Histochem Cell Biol 1997; 108: 381-390. 150. Passarge E. Renkli Genetik Atlası. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri; 2002. 151. http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent_in_situ_hybridization (Eylül 2006) 152. http://www.genome.gov/10000206#3 (Eylül 2006) 153. Norppa H, and Falek GCM. What do human micronuclei contain? Mutagenesis 2003; 18(3): 221-233. 154. Iourov IY, Soloviev IV, Vorsanova SG, Monakhov VV, Yurov YB. An approach for quantitative assessment of fluorescence in situ hybridization 272 (FISH) signals for applied human molecular cytogenetics. J Histochem Cytochem 2005; 53 (3): 401-408. 155.http://science.jrank.org/pages/2775/Fluorescence-in-SituHybridization-FISH.html (Eylül 2006) 156. Surralles J, Autio K, Nylund L, Jarventaus H, Norppa H, Veidebaum T, et all. Molecular cytogenetic analysis of buccal cells and lymphocytes from benzene-exposed workers. Carcinogenesis 1997; 18(4): 817-823. 157. Burgaz S, Erdem O, Çakmak G, Erdem N, Karakaya A, Karakaya AE. Cytogenetic analysis of buccal cells from shoeworkers and pathology and anatomy laboratory workers exposed to n-hexane, toluene, methyl ethyl ketone and formaldehyde. Biomarkers 2002; 7(2): 151-161. 158. Andreassi MG, Botto N. DNA damage as a new emerging risk factor in atherosclerosis. TCM 2003; 13(7): 270-275. 159. Roth JM, Restani RG, Gonçalves TTS, Sphor SLS, Ness AB, Martino-Roth MG et all. Genotoxicity evaluation in chronic renal patients undergoing hemodialysis and peritoneal dialysis, using the micronucleus test. Genet Mol Res 2008; 7 (2): 433-443. 160. Kan E, Ündeğer Ü, Bali M, Başaran N. Assessment of DNA strand breakage by the alkaline comet assay in dialysis patients and the role of vitamin E supplementation. Mutat Res 2002; 520: 151-159. 161. Zotti-Martelli L, Migliore L, Panasiuk G, and Barale R. Micronucleus frequency in Gomel-Belarus / children affected and not affected by thyroid cancer. Mutat Res 1999; 440: 35–43. 162. Fellay-Reynier I, Orsie`re T, Sari-Minodier I, Auquier P, ZattaraCannoni H, Capodano AM, et al. Evaluation of micronucleated lymphocytes, constitutional karyotypes and anti-p53 antibodies in 21 children with various malignancies. Mutat Res 2000; 467: 31-39. 163. Ortiz-Perez MD, Torres-Dosal A, Batres LE, Lopez-Guzman OD, Grimaldo M, and CarranzaC, et al. Environmental health assessment of deltamethrin in a malarious area of Mexico: environmental persistence, 273 toxicokinetics, and genotoxicity in exposed children. Environ Health Perspect 2005; 113(6): 782-786. 164. Ünal M, Çelik A, Ateş NA¸ Micozkadioğlu D, Derici E, Pata YS, et al. Cytogenetic biomonitoring in children with chronic tonsillitis: Micronucleus frequency in exfoliated buccal epithelium cells. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2005; 69: 1483-1491. 165. Pedersen M, Vinzents P, Petersen JH, Kleinjans JCS, Plas G, KirschVolders M et al. Cytogenetic effects in children and mothers exposed to air pollution assessed by the frequency of micronuclei and fluorescence in situ hybridization (FISH): A family pilot study in the Czech Republic. Mutat Res 2006; 608: 112-120. 166. Perez-Maldonado IN, Athanasiadou M, Yanez L, Gonzalez-Amaro R, Bergman A, and Diaz-Barriga F. DDE-induced apoptosis in children exposed to the DDT metabolite. Sci Total Environ 2006; 370: 343–351. 167. Holland N, Harmatz P, Golden D, Hubbard A, Wu YY, Bae J, et al. Cytogenetic damage in blood lymphocytes and exfoliated epithelial cells of children with ınflammatory bowel disease. Pediatr Res 2007; 61(2): 209214. 168. Kapka L, Baumgartner A, Siwin´ska E, Knudsen LE, Anderson D, and Mielzynska D. Environmental lead exposure increases micronuclei in children. Mutagenesis 2007; 22(3): 201-207. 169. Minicucci EM, Ribeiro DA, de Camargo B, Costa MC, Ribeiro LR, and Salvador DMF. DNA damage in lymphocytes and buccal mucosa cells of children with malignant tumours undergoing chemotherapy. Clin Exp Med 2008; 8: 79–85. 170. Akıcı N. Sigara dumanına maruz kalan pasif içici durumundaki çocuklarda DNA hasarının araştırılması. Uzmanlık Tezi. İstanbul: Haydarpaşa Numune Eğitim Ve Araştırma Hastanesi Çocuk Sağlığı Ve Hastalıkları Kliniği; 2008. 171. Van Leeuwen DM, Pedersen M, Hendriksen PJM, Boorsma A, van Herwijnen MHM, Gottschalk RWH, et al. Genomic analysis suggests 274 higher susceptibility of children to air pollution. Carcinogenesis 2008; 29(5): 977–983. 172. Gamboa RT, Gamboa AR, Bravo AH, and Ostrosky WP. Genotoxicity in child populations exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH’s) in the air from tabasco, Mexico. Int. J. Environ. Res. Public Health 2008; 5(5): 349-355. 173. Piperakis SM, Kontogianni K, Karanastasi G, Iakovidou-Kritsi Z, and Piperakis MM. The use of comet assay in measuring DNA damage and repair efficiency in child, adult, and old age populations. Cell Biol Toxicol 2009; 25: 65–71. 174. Ferreira FLS, Pra D, Martino-Roth MG, and Garcias GL. Buccal micronucleus frequency is associated with age in Down syndrome. Genet Mol Res 2009; 8 (4): 1231-1237 . 175. Beyoğlu D, Özkozaci T, Akıcı N, Omurtag GZ, Akıcı A, Ceran Ö, ve ark.. Assessment of DNA damage in children exposed to indoor tobacco smoke. Int. J. Hyg. Environ. Health 2010; 213: 40-43. 176. Fenech M. The Micronucleus Assay Determination of Chromosomal Level DNA Damage. Methods Mol Biol 2006; 410: 185-216. 177. Türk Nefroloji Derneği. Türkiye’de nefroloji-diyaliz ve transplantasyon2008. İstanbul: Dernek; 2009. 178. Wild CP, and Kleinjans J. Children and increased susceptibility to environmental carcinogens: evidence or empathy? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12: 1389-1394. 179. Buemi M, Floccari F, Costa C, Caccamo C, Belghity N, Campo S, et al. Dialysis-related genotoxicity: sister chromatid exchanges and DNA lesions in T and B lymphocytes of uremic patients. Blood Purif 2006; 24: 569–574. 180. Fivush BA, Jabs K, Neu AM, Sullivan EK, Feld L, Kohaut E, et al. Chronic renal insufficiency in children and adolescents: the 1996 annual report of NAPRTCS. Pediatr Nephrol 1998; 12: 328-337. 275 181. Koulouridis E, Tzilianos M, Katsarou A, Costimba I, Klonou E, Panagiotaki E, at al. Homocysteine and C-reactive protein levels in Haemodialysis patients. Int Urol and Nephrol 2001; 33: 207–215. 182. Karamouzisa I, Sarafidisb PA, Karamouzisa M, Iliadisa S, Haidichc AB, Sioulisb A, et al. Increase in oxidative stress but not in antioxidant capacity with advancing stages of chronic kidney disease. Am J Nephrol 2008; 28: 397-404. 183. Antolini F, Valente F, Ricciardi D, Baroni M, Fagugli RM. Principal component analysis of some oxidative stres parameters and their relationships in hemodialytic and transplanted patients. Clin Chim Acta 2005; 358: 87-94. 184. Schupp N, Dette EM, Schmid U, Bahner U, Winkler M, Stopper H. Benfotiamine reduces genomic damage in peripheral lymphocytes of hemodialysis patients. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2008; 378: 283-291. 185. Domenici FA, Vannucchi MTI, Jardao AA, Meirelles MSS, and Vannucchi H. DNA oxidative damage in patients with dialysis treatment. Ren Fail 2005; 27: 689-694. 186. Kaya H, Polat F, Çetinkaya R, Taysi S, Odabaş AR, Selçuk Y. Serum paraoxonase activity in chronic hemodialysis patients. Official Journal of the Turkish Nephrology Association 2000; 3: 176-179. 187. Battershill JM, Burnett K, and Bull S. Factors affecting the incidence of genotoxicity biomarkers in peripheral blood lymphocytes: impact on design of biomonitoring studies. Mutagenesis 2008; 23(6): 423-437. 188. Zalata A, Yahia S, El-Bakary, and Elsheikha HM. Mut Res/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 2007; 629(2): 140-147. 189. Kopjar N, Zeljezic D, and Garaj-Vrhovac V. Evaluation of DNA damage in white blood cells of healthy human volunteers using the alkaline comet assay and the chromosome aberration test. Acta Biochimia Polonica 2006; 53(2): 321-336. 276 190. Best BP. Nuclear DNA Damage as a Direct Cause of Aging. Rejuvenatıon Res 2009; 12(3): 1-22. 191. Kobras K, Schupp N, Nehrlich K, Adelhardt M, Bahner U, Vienken J, et al. Relation between Different Treatment Modalities and Genomic Damage of End-Stage Renal Failure Patients. Kidney Blood Press Res 2006; 29: 10–17. 192. Horoz M, Bölükbaş C, Bölükbaş FF, Koçyiğit A, Aslan M, and Koylu AO. Assessment of peripheral DNA damage by alkaline comet assay in maintenance hemodialysis subjects with hepatitis C infection. Mutat Res 2006; 596: 137–142. 193. Bagatini PB, Palazzo RP, Rodrigues MT, Costa CH, and Maluf SW. Induction and removal of DNA damage in blood leukocytes of patients with type 2 diabetes mellitus undergoing hemodialysis. Mutat Res 2008; 657: 111–115. 194. Forlenza MJ, and Miller GE. Increased Serum Levels of 8-Hydroxy-2Deoxyguanosine in Clinical Depression. Psychosom Med 2006; 68: 1-7. 195. Patel MG. The effect of dietary intervention on weight gains after renal transplantation. J Ren Nutr 1998; 8(3): 137-141. 196. Titenko-Holland N, Jacob RA, Shang N, Balaraman A, and Smith MT. Micronuclei in lymphocytes and exfoliated buccal cells of postmenopausal women with dietary changes in folate. Mutat Res 1998; 417: 101–114. 197. Reddy TPK, Kanala KR, De Dios AE, Cantu GJM. Age-related correlation between antioxidant enzymes and DNA damage with smoking and body mass index. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2008; 63(4): 360-364. 198. Sirota NP, Kuznetsova EA. Spontaneous DNA damage in peripheral blood leukocytes from donors of different age. Bull Exp Biol Med 2008; 145(2): 194-197 199. Rath T, and Oliveria-Frick V. Mutagenicity of immunosuppressive medications among renal transplant recipients. Am J Nephrol 2009; 30: 514–520. 277 200. Morales C, Garcia MJ, Ribas M, Miro R, Munoz M, Caldas C, et al. Dihydrofolate reductase amplification and sensitization to methotrexate of methotrexate-resistant colon cancer cells. Mol Cancer Ther 2009; 8(2): 424-432. 201. Fenech M, and Crott JW.Micronuclei, nucleoplasmic bridges and nuclear buds induced in folic acid deficient human lymphocytes-evidence for breakage-fusion-bridge cycles in the cytokinesis-block micronucleus assay. Mutat Res 2002; 504(1-2): 131-136. 202. El-Zein R, Fenech M, Lopez MS, Spitz MR, and Etzel CJ. Cytokinesis-blocked micronucleus cytome assay biomarkers identify lung cancer cases amongst smokers. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008; 17(5): 1111–1119. 203. Iarmarcovai G, Botta A and Orsi`ere T. Number of centromeric signals in micronuclei and mechanisms of aneuploidy. Toxicology Letters 2006; 166: 1–10. 204. Iarmarcovai G, Botta A, Orsiere T. Number of centromeric signals in micronuclei and mechanisms of aneuploidy. Toxicology Letters 2006; 166: 1-10. 205. Acar H, Çalışkan U, Demirel S and Largaespada DA. Micronucleus incidence and their chromosomal origin related to therapy in acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients: detection by micronucleus and FISH techniques. Teratog Carcinog Mutagen 2001; 21: 341–347. 206. Kemik Ö, Kemik AS, Dülger AC, Hasırcı İ, Daşdan E, Bartın MK, ve ark. Karaciğer metastazlı kolon kanserli hastalarda İnterlökin-6 düzeyleri. Van Tıp Der 2010; 17(2): 42-45. 207. Bonassi S, Biasotti B, Kirsch-Volders M, Knasmueller S, Zeiger E, Burgaz S, et al. State of the art survey of the buccal micronucleus assay a first stage in the HUMNXL project initiative. Mutagenesis 2009; 24(4): 295302. 278 10. EKLER EK 1: 279 EK:2 GÖNÜLLÜ BEYAN FORMU Kronik böbrek yetmezliği veya böbrek nakli sonrası çocuk hastalarımızın hücrelerinde oluşabilecek zedelenmelerin araştırılarak bunların önlenmesini amaçlayan çalışmada gönüllü olarak yer alıyorum. Kan, idrar ve yanak epiteli örneklerimin bu projedeki çalışmalarda kullanılmasını kabul ediyorum. Ad: Soyad : Telefon no: İmza: Tarih: 280 EK: 3 ANKET A) HASTA TARAFINDAN DOLDURULACAK BÖLÜM 1.Adı Soyadı: 2.Yaş: Kilo: Boy: 3.Öğrenim durumu; İlk Doğum yeri: Orta Lise Yüksekokul 4.Nerede yaşıyorsunuz? Köy İlçe İl 5.Son bir yılda herhangi bir aşı oldunuz mu? Evet Hayır Cevabınız evet ise ne aşısı oldunuz? 6.Son 3 ay içinde röntgen çektirdiniz mi ?(Diş ve diğer) Hangisi? 7.Doktorunuz tavsiyesi dışında herhangi bir ilaç alıyor musunuz? Evet Hayır Cevabınız evet ise adı nedir? Ne kadar süredir? 8. Doktorunuz tavsiyesi dışında vitamin ve mineral takviyesi alıyor musunuz? Evet Hayır Cevabınız evet ise adı nedir? Hangi sıklıkta? 9.Sigara içme alışkanlığınız: Hiç içmedim İçiyorum .L. Ay Yıl Günde L.. adet sigara içiyorum .L. Ay Yıldır Eskiden içerdim 10.Yaşadığım ortamda LLLLLLLL Sigara içiliyor 11.Çay içme alışkanlığınız var mı? Evet Hayır önce bıraktım içiyorum Sigara içilmiyor Cevabınız EVET ise aşağıdakilerden hangisi ? Günde 1 bardak 2 bardak 3 ve daha fazla bardak 281 12.Yaptığınız spor ve aktivitelere ilişkin olarak; Az enerji gerektiren spor ya da diğer aktivitelerde bulunuyorum. (yürüme, bahçe işleri, ev işleri gibi) _____ saat/gün Orta derecede enerji gerektiren spor ya da diğer aktivitelerde bulunuyorum. (ağır ev işleri ya da bahçe işleri, yüzme, bisiklet sürme gibi) _____ saat/gün Fazla güç ve enerji gerektiren spor ve aktivitelerde bulunuyorum. (koşu, hızlı yüzme ya da bisiklet sürme, futbol gibi) _____ saat/gün B) HEKİM TARAFINDAN DOLDURULACAK BÖLÜM 1.Hastanın renal yetmezliği hangi parametre ile belirlendi? Parametre Değeri :LL (Yapılan tüm klinik analiz sonuçlarının fotokopisi eklenmelidir) 2.Hastanın renal yetmezliğinin şiddetiLLBaşlangıç 3.Hastanın başka bir rahatsızlığı var mı? Evet Orta Hayır Son dönem ( Genetik, diyabet, hipertansiyon, akut, kronik, intercurrent enfeksiyon, malign tümör, vb) Cevabınız EVET ise nedir? Ne kadar süredir? 4.Hasta diyalize giriyor mu? Evet Hayır Cevabınız EVET ise hangi tip diyalize giriyor? Haftada kaç gün diyalize giriyor? Ne kadar süredir diyalize giriyor ? 5.Eğer hasta periton diyaliz yapıyorsa son 6 ay içinde peritonit geçirdi mi? Evet Hayır 282 6.Hasta diyalize girmeden önce immün süpressif ilaç aldı mı? Evet Hayır Cevabınız EVET ise LL.. Ne dozda immün süpressif ilaç aldı? Ne süredir immün süpressif ilaç aldı? Kullandığı immün süpressif ilacın adı? 7.Hastaya böbrek nakli yapıldı mı? Evet Hayır Cevabınız EVET ise ne kadar süre önce yapıldı? İmmünosüpressif bir ilaç kullanıyor mu? Evet Hayır Cevabınız EVET ise hangi ilacı kullanıyor? 8.Hasta başka ilaç kullanıyor mu? Evet Hayır Cevabınız EVET ise nedir? 9.Hasta vitamin ve mineral takviyesi alıyor mu? Evet Hayır Cevabınız EVET ise aşağıdakilerden hangisi? Multivitamin C vitamini E vitamini Beta karoten Çinko Hangi sıklıkta? 10.Hasta son iki yılda herhangi bir viral enfeksiyon geçirdi mi ? (sarılık, kızamık, kızamıkçık, suçiçeği, kabakulak, menenjit vb gibi) Cevabınız EVET ise hangi viral enfeksiyonu geçirdi ? Dr. LLLLLLLLLLL.. Tarih 283 11. ÖZGEÇMİ KİIİSEL BİLGİLER Adı ve Soyadı : Dt. Banu AYKANAT Doğum Yeri ve Tarihi : İstanbul – 04.08.1957 Yabanci Dili : İngilizce EĞİTİM BİLGİLERİ • 1982 : Hacettepe Üniversitesi, Diş Hekimliği Fakültesi (Yüksek Lisans) • 2003 : Anadolu Üniversitesi, Sağlık Kurumları İşletmeciliği Uzmanlığı • 2004 : Gazi Üniversitesi , Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmasötik Toksikoloji ABD (Yüksek Lisans) • 2005 : Anadolu Üniversitesi, İşletme Fakültesi (Lisans) PROFESYONEL DENEYİM • 1983- 1984 : Zonguldak Devlet Hastanesi, Diş Hekimi • 1984 : Ankara Çubuk Yenice Sağlık Ocağı, Diş Hekimi • 1983-1992 : Serbest Diş Hekimi olarak çalışma • 1993-1994 : Çankırı, Diş Hekimliği Iube Müdürü • 1994- : Ankara Numune Eğitim Araştırma Hastanesi Diş Polikliniği, Diş Hekimi BİLİMSEL YAYINLAR • Karahalil B, Aykanat B, Ertaş N. Dental lead levels in children from two different urban and suburban areas of Turkey. İnt j Hyg Environ Health 2007; 210: 107-112. • Çok İ, Aykanat B. Gıdaların Işınlanması. Journal of Health and Society 2006; 16(1): 12-19. 284 KONGRE KATILIMI • Coşkun E, Aykanat B, Ertaş N, Karahalil B. 3rd Euro-Asian Conference on Hazardous Waste & Human Health (2008). • Aykanat B, Coşkun E, Ertaş N, Karahalil B. “Türkiyenin İki Farklı Bölgesinde Yaşayan Çocuklardaki Kurşun Maruziyetinin Süt Dişlerinde Tayini” konulu poster ile 7. Uluslararası Katılımlı Türk Toksikoloji Derneği Kongresi (2009). • Aykanat B, Çakmak GD, Fidan K, Gülleroğlu K, Bayrakçı US, Buyan N, Baskın E, Karakayalı H, Haberal M, Burgaz S.“DNA Damage In Lymphocytes Of Children With Chronic Kidney Disease And After Transplantation By Comet Assay” konulu poster ile 10. International Conference on Environmental Mutagens (2009). • Çakmak GD, Aykanat B, Fidan K, Bayrakçı US, Buyan N, Baskın E, Karakayalı H, Haberal M, Burgaz S. “The Detection of Aneuploidy in Peripheral Blood Lymphocytes of Children With Chronic Kidney Disease” konulu poster ile 10. International Conference on Environmental Mutagens (2009). • Çakmak GD, Aykanat B, Fidan K, Bayrakçı US, Büyükkaragöz B, Karakayalı H, Haberal M, Baskın E, Buyan N, , Burgaz S. “Genotoxicity Assessment by Micronucleus Assay in Peripheral Blood Lymphocytes and Buccal Epithelial Cells of Children With Chronic Kidney Disease” konulu poster ile 12. International Conference of Toxicology (2010). • Aykanat B, Çakmak GD, Fidan K, Gülleroğlu K, Sepici A, Bayrakçı US, Buyan N, Baskın E, Karakayalı H, Haberal M, Burgaz S.“Detection of Genomic Damage in Lymphocytes of Children With Chronic Kidney Disease by Comet Assay” konulu poster ile 15. Congress of The International Pediatric Nephrology Association (2010). 285 ALINAN ÖDÜL “Detection of Genomic Damage in Lymphocytes of Children with Chronic Kidney Disease by Comet Assay” konulu poster ile “Trainee Travel Award”. ÜYE OLUNAN BİLİMSEL KURULUILAR • Türk Diş Hekimleri Birliği • Türk Toksikoloji Derneği 286
