AZİZ COMET Grubu - Proje Danışmanlığı

BİDEB-2229
Biyoloji Öğretmenlerine
Proje Danışmanlığı Eğitimi
Çalıştayı
AZİZ COMET
Grubu
PROJENİN ADI
SİLİSYUM DİOKSİT
NANOPARTİKÜLLERİNİN
İNSAN LENFOSİT
HÜCRELERİNDEKİ
GENOTOKSİK ETKİSİ
PROJE EKİBİ
Selim AYDAŞ – Pursaklar Fen Lisesi /
ANKARA
Abdullah Baki BAKAR – Şırnak Lisesi/
ŞIRNAK
Emel HALLAÇ – Adıyaman Anadolu
Lisesi / ADIYAMAN
PROJE DANIŞMANI
Doç. Dr. Aziz ASLAN
PROJENİN AMACI
Yiyecek ve içeceklerde gıda katkısı
olarak, elektronik cihazlarda, cam
eşyalarda ve farmasötik olarak ilaç
tabletlerinde yaygın olarak kullanılan
Silisyum dioksit (SiO2)’in, insan
periferal lenfosit kan hücrelerinde
DNA hasarına neden olup olmadığını
belirlemektir.
HİPOTEZ

SİLİSYUM DİOKSİT
NANOPARTİKÜLLERİNİN İNSAN
LENFOSİT HÜCRELERİNDE
GENOTOKSİK ETKİSİ VARDIR.
NANOPARTİKÜLLER

Nanopartiküller (NP) 100 nm den küçük
boyutlarda, elektron tutucu özellikteki
bileşikler olarak tanımlanmaktadır
(Oberdörster ve ark., 2005). Bu
partiküllerin farklı büyüklüklerdeki eşşiz
özelliklerinden dolayı gerçekleşen
teknolojik hızlı ilerlemeler nanoteknoloji
alanlarının oluşmasını sağlamıştır.
NANOTEKNOLOJİ;

Günümüzde güneş kremleri, kozmetik,
kompozitler, killer, tekstil, yüzey
kaplamaları gibi endüstriyel alanlarda
yaygın olarak kullanılmaktadır.
http://www.zaman.com.tr/ekonomi_leke-tutmayan-gomlek-urettik-deterjancilarbiraz-uzulecek_837844.html

Boyalar, doğada düzenleyici olarak, yakıt
hücrelerinde, ekranlar, bataryalar,
katalizörler, yağlayıcılar, manyetik
malzemeler vb. alanlarda araştırmalar
devam etmektedir (Kayır ve Baççıl, 2010).
http://nanoteknolojinedir.com/?p=1693

Her yeni buluşun kendi içinde barındırdığı
olumsuz etkilerde olabilmektedir.
NP’lerin insanın yaşam kalitesini
artırmasının yanında olumsuz bazı etkilere
neden olduğu yapılan bazı araştırmalarla
ortaya konulmuştur (Dreher, 2004).

Bu araştırmalar bu tip maddelerin özellikle
kalıtsal madde üzerinde hasarlara neden
olduğunu göstermektedir.

Bu nedenle NP’lerin genetik materyal
üzerinde nasıl bir etkiye sahip olduğu
önemli bir araştırma konusudur.
Silisyum dioksit Nanopartikülü
yiyecek ve içeceklerde gıda katkısı olarak,
 elektronik cihazlarda,
 cam eşyalarda ve
 farmasötik olarak ilaç tabletlerinde yaygın
olarak kullanılmaktadır.


SiO2 NP’lerinin akciğer toksisitesine
neden olduğu belirtilmiş olmasına rağmen
mekanizması henüz anlaşılmamıştır.

Bazı son araştırmalarda da yine benzer
şekilde NP’lerin hücresel birikim
gösterdiği ve/veya sitotoksik olduğu
söylenmektedir (Hauck ve ark., 2008;
Milena ve ark., 2009).

Bu çalışmada Silika olarak da bilinen
Silisyum dioksit (SiO2) NP’ünün insan
periferal lenfosit kan hücrelerine etkisi
araştırılmıştır.
MATERYAL ve METOT

Bu çalışma Akdeniz Üniversitesi Fen
Fakültesi Biyoloji Bölümü Genetik
Laboratuarında yapılmıştır.

Etik Kurul raporu alınarak

İnsan kan örneği temin edilmiştir.

SiO2 gibi bileşiklerin neden olduğu DNA
hasarının tespit edilmesinde güvenilir ve
hassas bir teknik olan COMET testi
kullanılmıştır.

Comet yönteminin temel prensibi
kimyasal ve fiziksel nedenlerle oluşan
genotoksik ve sitotoksik ajanların canlı
hücreleri üzerindeki etkilerini, hücrelerin
DNA’larını tek tek inceleyerek tespit
etmektir (Dikilitaş ve Koçyiğit, 2010).

İnsan periferal lenfositlerinde meydana
gelen DNA hasarı kuyruklu yıldız
görünümünde olduğu için bu yönteme
“COMET” adı verilmiştir.
Konsantrasyon
KONTROL
(µg/mL)
GRUBU
Saf Su
Negatif
(5 mM EMS)
Pozitif
DENEY GRUBU
SiO2 Nanopartikülü - 6 nm
1
Deney 1
10
Deney 2
100
Deney 3
SiO2 Nanopartikülü - 30 nm
1
Deney 4
10
Deney 5
100
Deney 6
Deney loş ışıkta gerçekleştirildi.

Kan ve PBS’nin buzun içerisinde bekletilmesi.
Lenfositlerin Kandan Ayrılması İçin
Ayıraç İlavesi
Santrifüj Aşaması

Lenfositlerin Santrifüj Sonrası Üste
Çıkması (pembe katman)
Alınan lenfositlerin Kimyasallar ile
karıştırılması ve İnkübasyon Aşaması
Santrifüj Aşaması
2 tabakalı NMA’ lı Lam Üzerine LMA lenfosit Tabakası Oluşturulması ve Son
Katman (sandvich)
Lising Solüsyonu ve Şale Aşaması
Elektroforez Tankı Alışma Aşaması
Elektroforez Tankı Yürüme Aşaması
Nötralizasyon solüsyonu ve şale
3 Kez
Etidyum bromür ile boyanıp
Floresans mikroskopta sayım (100
Hücre DNA’ sı)
Bilgisayar Comet programı ile
lenfosit hücrelerinin DNA
yapılarının bilgileri tespiti

Lenfositlerin DNA bilgilerinden kuyruk
yoğunluğu ve kuyruk momenti verileri
alınarak student’s t testi ile
karşılaştırılarak p<0.05 anlamlılık
düzeyinde karşılaştırıldı.
Sonuçlar ve Tartışma

Silisyum dioksit konsantrasyonları (6 ve 30
nm) uygulanan insan periferal lenfosit
hücrelerinin DNA’larında meydana gelen
kuyruk yoğunluğu ve momenti Tablo I’de
verilmiştir.
Tablo 1. KOMET Testinde İki Farklı Nanoboyuttaki (6 ve
30 nm) Silisyum Dioksit (SiO2) Nanopartikülünün İnsan
Periferal Lenfosit Hücrelerindeki Genotoksik Etkileri.
Konsantrasyon
Kuyruk Yoğunluğu
Kuyruk Momenti
(µg/mL)
(%) a
(µm) a
3.54 ± 1.03
1.37 ± 0.67
12.20 ± 2.17
3.91 ± 1.02
1
5.23 ± 1.24
1.82 ± 0.69
10
5.31 ± 0.84
1.47 ± 0.24
100
2.27 ± 0.67
0.57 ± 0.18
1
6.57 ± 1.21
2.28 ± 0.57
10
4.59 ± 0.68
1.08 ± 0.17
100
3.67 ± 0.57
0.94 ± 0.15
Negatif Kontrol
Saf Su
Pozitif Kontrol
(5 mM EMS)
SiO2 Nanopartikülü - 6 nm
SiO2 Nanopartikülü - 30 nm

Negatif Kontrol grupları ile diğer grupların
DNA’larında meydana gelen kuyruk
yoğunlukları ile momentleri arasında
uygulana paired samples t-testi sonuçları
Tablo II’ de verilmiştir.
Paired-samples t-testi sonuçları
Kuyruk Yoğunluğu
Kuyruk Momenti
Anlamlılık Düzeyi
Anlamlılık Düzeyi
(p< 0.05)
(p< 0.05)
Saf Su- EMS
0.001
0.044
Saf Su- Deney 1
0.211
0.615
Saf Su- Deney 2
0.196
0.897
Saf Su- Deney 3
0.310
0.255
Saf Su- Deney 4
0.060
0.303
Saf Su- Deney 5
0.408
0.681
Saf Su- Deney 6
0.917
0.532
Karşılaştırılan Gruplar

Çıkan sonuçların saf suya göre anlamlılık
düzeyleri, 0.05’in altında çıkmıştır.

Comet yöntemi sonucunda oluşan hasarlı
ve hasarsız DNA fotoğrafları
Tek hücre jel elektroforez yöntemi ile farklı
seviyelerde hasara uğramış DNA’ların görüntüleri.
a-b: Hasarsız, c-d-e: Hasarlı DNA
e
c
d
b

a
b
c
d
e

Yapılan bilimsel çalışmalar farklı
boyutlardaki Nanopartiküllerin farklı
sonuçların ortaya çıkmasına sebep
olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada
kullanılan 6 ve 30 nm boyutundaki SiO2
nanopartiküllerinin insan lenfosit
hücrelerinde hasara neden olmamıştır.

benzer bir çalışmada normal boyuttaki
alüminyum oksit (Al2O3)
nanopartiküllerinin tek başına sıçanların
periferal kan hücrelerinde in vivo
koşullarda COMET ve mikronükleus
(MN) testlerinde herhangi bir genotoksik
etkiye neden olmadığı halde alüminyum
oksit NP’lerin iki farklı partikül boyutunun
(Al2O3-30 nm ve Al2O3-40 nm), DNA’daki
tek iplik kırıklıklarını ve MN oluşum
frekansını indükleyebildikleri gösterilmiştir
(Balasubramanyam ve ark., 2009).

Son yıllarda COMET testi ile yapılan
çalışmalarda SiO2 NP’nün 20-400 nm
arasındaki partikül boyutlarında herhangi
bir genotoksik aktiviteye rastlanmamıştır
(Jin ve ark., 2007; Wang ve ark., 2007a, b;
Barnes ve ark., 2008; Lee ve ark., 2009).
Son Söz

Malzemelerinde 6 ve 30 nm boyutundakji
SiO2 Nanopartükülü bulunduran firmaların
ürünleri insan sağlığını olumsuz
etkilememektedir..

KAYNAKLAR

BALASUBRAMANYAM A., Sailaja N., Mahboob M., Rahman M.F., Hussain S.M., Grover P., In vivo
genotoxicity assessment of aluminium oxide nanomaterials in rat peripheral blood cells using
the comet assay and micronucleus test, Mutagenesis, 24, 245-51, (2009).


BARNES C.A., Elsaesser A., Arkusz J., Smok A., Palus J., Lesniak A., Salvati A, Hanrahan JP, Jong
WH, Dziubałtowska E, Stepnik M, Rydzyński K, McKerr G, Lynch I, Dawson KA, Howard CV.,
Reproducible comet assay of amorphous silica nanoparticles detects no genotoxicity, Nano Lett.,
8, 3069-74, (2008).


DİKİLİTAŞ, M., Koçyiğit, A., Canlılarda “Tek Hücre Jel Elektroforez” Yöntemi İle

Dna Hasar Analizi (Teknik Not): Comet Analiz Yöntemi, HR.Ü.Z.F. Dergsi, 14(2), 77-89 (2010)


DREHER, K.L., Health and Environmental Impact of Nanotechnology: Toxicological Assessment
of Manufactured Nanoparticles, Toxicology Sciences, 77, 3-5 (2004).


GAZZANO E., Turci F., Foresti E., Putzu M.G., Aldieri E., Silvagno F., Lesci I.G., Tomatis M., Riganti
C., Romano C., Fubini B., Roveri N., Ghigo D., Iron-Loaded Synthetic Chrysotile: A New Model
Solid for Studying the Role of Iron in Asbestos Toxicity, Chem. Res. Toxicol., 20, 380-7, (2007).

HAUCK T.S., Ghazani A.A., Chan W.C., Assessing the effect of surface chemistry on gold
nanorod uptake, toxicity, and gene expression in mammalian cells, Small, 4, 153-9, (2008).

JIN Y., Kannan S., Wu M., Zhao J.X., Toxicity of luminescent silica nanoparticles to living cells,
Chem. Res. Toxicol., 20, 1126-33, (2007).

KAYIR Y.Z., Baççıl, E.G., 15. “Nanoteknoloji Nedir?”, Uluslar arası Metalurji ve
Malzeme Kongresi, http://www.metalurjist.gen.tr/docs/makale4.pdf, 03.02.2013.


LEE S.W., Kim S.M., Choi J., Genotoxicity and ecotoxicity assays using the freshwater
crustacean Daphnia magna and the larva of the aquatic midge Chironomus riparius to
screen the ecological risks of nanoparticle exposure, Environ. Toxicol. Pharmacol., 28, 8691, (2009).

MILENA R.V., Luisa D.C., Han Z., Efficient Energy Transfer between Silicon Nanoparticles
and a Ru-Polypyridine Complex, J. Phys. Chem. C., 113, 2235-3340, (2009).

OBERDORSTER G., Oberdoerster E., Oberdoerster J., Nanotoxicology: an emerging
discipline evolving from studies of ultrafine particles, Environ. Health Perspect., 113, 82339, (2005).

SINGH N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L., A simple technique for quantitation of
low levels of DNA damage in individual cells, Exp. Cell Res., 175, 184-91, (1988).

WANG J.J., Sanderson B.J.S., Wang H., Cytotoxicity and genotoxicity of ultrafine
crystalline SiO2 particulate in cultured human lymphoblastoid cells, Environ. Mol.
Mutagen., 48, 151-7, (2007a).

WANG J.J., Wang H., Sanderson B.J.S., Ultrafine quartz-induced damage in human
lymphoblastoid cells in vitro using three genetic damage end-points, Toxicol. Mech.
Methods., 17, 223-32, (2007b).

TEŞEKKÜR
Bize bu projede destek olan Akdeniz Üniversitesine,
fon sağlayan TÜBİTAK’a,
 projeyi yürüten Prof. Dr. Semra MİRİCİ ve ekibine,
 çalışmalarımızda bize danışmanlık yapan
Doç. Dr. Aziz ASLAN’a,
 Akdeniz Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Genetik Laboratuarını bizim kullanımımıza açan
Prof. Dr. Bülent KAYA’ya,
 Laboratuarda bizden yardımlarını esirgemeyen
Araş.Gör. Dr. Eşref DEMİR’ e ve Araş.Gör. Fatma
TURNA’ ya,

Bu stresli proje yolunda bizi
çocukluğumuza döndürerek dinlendiren
Tülin TÜMTÜRK YILMAZ hocamıza
 Bizi otel ve üniversite arasında taşıyan
Gülnaz ALKAN’ a

Bizi Dinlediğiniz İçin Tüm
Değerli Öğretmen Arkadaşlarımıza da

TEŞEKKÜR EDERİZ….