Expressed Sequence Tags (ESTs) ESTler , fonksiyonel genlerin

Expressed Sequence Tags (ESTs)
ESTler , fonksiyonel genlerin segmentleridir. ESTler yeni genlerin keşfi, genom
haritalanması, genomik sekanslardaki kodlayıcı bölgelerin tanımlanması, gen ekspresyonu ve
regülasyonu ile ilgili veri elde edilmesi için hızlı ve ucuz bir yol sunar. ESTler genellikle 100150 nükleotit uzunluğundadır ve proteinlerin kodlanmasında fonksiyonel değildir. Farklı
organizmaların belirli hücre, doku ve organlarında ifade edilen genleri temsil eden DNA
parçası sekanslanır, baz çifti eşleşmesi aracılığıyla kromozomal DNA’nın bir kısmının genini
çıkarmak için bu etiketler (tag) kullanılır.
İnsanlarda gen tanımlanması genomda intronların bulunması nedeni ile zordur. Bu
nedenle mRNA izolasyonu ifade edilen genlerin bulunması için anahtardır. Bununla birlikte
mRNA hücre dışında stabil değildir, bu nedenle mRNA’dan komplementer DNA (cDNA)
sentezlenir, cDNA daha stabildir, intronları uzaklaştırılmış mRNA’dan oluşmuştur ve cDNA
sadece ifade edilen DNA sekansını içerir. cDNA izole edildikten sonra iki farklı EST
oluşturabilmek için molekülün her iki ucundan birkaç yüz nükleotit sekanslanır. Sadece
cDNA’nın başlangıç kısmının sekanslanması ile 5’ EST oluşturulur. 5’ EST genellikle
proteini kodlayan transkript kısmından elde edilir. Bu bölgeler türler arasında korunma
eğilimindedir ve gen ailesi içinde değişmez. cDNA molekülünün son kısmının sekanslanması
ile 3’ EST oluşturulur, çünkü bu EST’ler transkriptin 3’ ucundan oluşturulur.
Şekil: EST’nin oluşturulması
Örneğin rat genlerinin dizisi ile insan ve fare genlerinin dizileri arasında korunmuş
bölgeler vardır. Ratlardan elde edilen genler ile insan ve farelerden elde edilen genler arasında
karşılaştırılması ile bu genlerin temelde aynı olup olmadığı anlaşılabilir. Öncelikle rat
EST’leri tanımlanırsa haritalanmış insan ve fare geninin türler arasındaki gen göçü
karşılaştırılabilir. Bunun yapılabilmesi için öncelikle rat genindeki EST’nin lokasyonunun
bulunması gerekir, bu da radyasyon hibrid analizi ile gerçekleştirilir. Farklı hücre hatları rat
genomuna spesifik DNA fragmentleri içerir. Hücre hatlarına ilişkin bilgi primer analizi
aracılığı ile elde edilebilir. Her bir primer rat genomunda özgül kromozomal lokasyona
sahiptir ve her bir hamster hücre soyu için pozitif sinyallerin özgül dizisini verir. Diğer bir
deyişle, bir hücre soyu test edilen primerin lokasyonuna benzerlik gösteren DNA ya da
kromozomal fragment içerirse bu soy için pozitif sinyal alınır. Fakat sinyalin negatif olması
bu soyun spesifik kromozomal fragment içermediği anlamına gelir. Yeterli primerler ile rat
genomunun tam olarak hangi kısmının hamster hücre hattına dahil edildiği anlaşılabilir. EST
primerleri kullanılarak elde edilen pozitif sinyaller kromozomal primerler ile elde edilen
sonuçlar ile karşılaştırılabilir. EST primeri gibi aynı pozitif sonucu veren primer bulunursa
EST’nin belirlediği genin lokasyonunun primerinki ile aynı olduğu sonucuna varılır.
EST’ler bilinen genlerin avlanması için de güçlü bir araçtır, çünkü genin
lokalizasyonunun belirlenmesi için gereken zamanı büyük ölçüde kısaltır. EST’ler ifade
edilen genomun sadece ilgilenilen parçasının bir kopyasıdır ve kalıtsal hastalıklarda yer alan
genlerin avlanmasında kullanışlı bir araç olduğu tekrar tekrar kanıtlanmıştır.
ESTler gen keşif aracı oldukları için kolaylıkla ulaşılabilir olması için veritabanı
olarak düzenlenmiştir. EST veritabanına (dbEST) www.ncbi.nlm.nih.gov adresinden
ulaşılabilir. dbEST’nin en yaygın uygulamalarından biri gen keşfidir. Yeni genler protein
yada DNA dizisi ile dbEST taraması ile bulunabilir. Böyle bir tarama ile insan Ly-6 ailesinin
yeni üyesi bulunmuştur. 66 insan ESTsi tanımlanmıştır ve 66 Drosophila genleri ile
benzerliğine dayanılarak haritalanmıştır. ESTlerin kullanılması ile Alzheimer hastalığı ve
kolon kanserinde rol oynayan genlerin bazıları izole edilebilmiştir.