Salmonella PCR`ın avantajları

SALMONELLA PCR TEST ÇEKİNCELERİNE YANIT
PCR genetik bir test olup, bir canlıya ait ve sadece ona özgü (spesifik) belli bir gen segmentini (DNA
parçacığını) arttırmaya (amplifiye etmeye) yönelik olarak uygulanır. Arttırmadaki amaç, bu spesifik DNA
parçacığını gözlenebilir düzeye getirmektir.
İnsan ve hayvan Salmonella taramalarında PCR kullanımına ilişkin bilgiler,literatürlerde rahatlıkla bulunabilir
yaygınlıktadır.
Uygulanan PCR’da iki yönden çekince duyulur:
* Bunlardan birincisi, ölü bakteriye ait geni attırmak ve dolayısıyla infeksiyonla ilgili olmayan ölü bakteriyi
tanımlamaktır. Bu yanlış tanı, genellikle aranan bakterinin, konumuz Salmonella olduğu için Salmonella’nın, ön
zenginleştirmesi yapıldıktan sonra PCR uygulanmasıyla önlenebilir.
*İkincisi ise, aranan gen segmentinin Salmonella’ya biyolojik olarak yakın ve onunla aynı florada bulunan diğer
bakterilerde de bulunma olasılığıdır. Bu durum ise sadece Salmonella’ya ait ve diğer bakterilerde bulunmayan
bir gen segmenti hedeflenerek engellenebilir. Bu bölgenin seçiminde, “gen analiz” programları kullanılır ve bu
bölgeyi amplifiye etmeye yönelik spesifik DNA parçacıkları (primerler) seçilir. Bu primerler sadece ve sadece
Salmonella’ya ait seçilen gen parçacığını arttırırken, aynı floradaki diğer bakterilerin DNA’ları ile hiçbir ilişki
kurmazlar. Bu bakterilere örnek olarak, Citrobacter , Proteus , Providencia , Shigella türlerini ve diğer bir çok
Enterobactericeae familyasındaki bakteri genuslarını verebiliriz.
Salmonella taramalarında,PCR’da aranan sipesifik bölgelerden birisi de Salmonellaların invazyonundan sorumlu
olan “invA” bölgesidir. Bu bölgenin özgün bir kısmını arttırmaya yönelik primerler Galan ve ark. tarafından
tanımlanmış ve Rahn ve ark. tarafından da test edilmiştir. Bu çalışmalar sonucunda, invA geninin 241bp
büyüklüğündeki taranan bölgesinin başka hiçbir bakteri ile (özellikle Citrobacter, Proteus, Providencia, E.coli
v.b)yanlış bir reaksiyon vermediği, dolayısıyla yanlış bir tanıya neden olmadığı ortaya çıkarılmıştır. Bizim
araştırmalarımızda da “invA”geni temel alınmış, gerek deneysel ve gerekse doğal örneklerle yapılan
çalışmalarımızda hiçbir kros-reaksiyona (Aynı flora yada değişik floralardaki bakterilerle) rastlanmamıştır.
Çalışmalarımız ve testlerin geliştirilmesi,TÜBİTAK-TOGTAG/TARP 2201 No.lu proje ile ve İONTEK
BİYOTEKNOLOJİ LTD.tarafından desteklenmiştir.Araştırmalarımızın ve yaptığımız teslerin bazıları ile verileri
dünyaca ünlü ve en saygın sayılan mikrobiyoloji dergisi (Journal of Clinical Microbiology, Letters in Applied
Microbiology) yayınlanmış ve bir kısım bölümleri ise Kanatlı Hayvan Hastalıkları dergilerinde (Avian Diseases)
2003 yılında basımı proğrama alınmıştır.
Yukarıdaki dergilerde yayınlanan makalelerimizde, Salmonella PCR testinin özgünlüğünün daha ileri
garantilenmesi için başka bir çok parametre ile de oynanmış ve test kafalarda hiçbir soru işaretine yer
vermeyecek yapıda optimize edilmiştir. Bu parametrelerin en önemli ikisi şunlardır:
1) PCR’da sıcaklık artış ve azalışlarının çok hızlı olması sağlanarak, primerlerin yanlış bir DNA parçacığı ile
rastgele birleşme olasılığı engellenmektedir.
2) PCR sonrası ürünün spesifikliğini teyit etmek için PCR testi prob-spesifik hale getirilmiş ve ayrıca
prob birleşme özgünlüğünü de test etmek için “Ürün erime analizi” (temparature of melting analysis)’nden
yararlanılan bir sistem geliştirilerek kullanılmaktadır.
Bu bilgiler ışığı altında, gelecekteki soruların yanıtı için haberleşebilmeyi umarım.
Prof. Dr. K. Tayfun Çarlı
Uludağ Üniversitesi
Veteriner Fakültesi
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Görükle kampusü
16059 Bursa
E-mail:[email protected]
Tel:0.224.4429200-137
0.224.4428502
Literatür
RAHN, K., De Grandis S. A., Clarke R. C., McEwen S. A., Galan J. E., Ginocchio C., Curtis R. III, and
Gyles C. L. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as
a specific method of detection of Salmonella, Molecular and Cellular Probes, 6, 271-9, (1992).
EYIGOR A., Carlı K. T., and Unal C. B. Implementation of Real-Time PCR to Tetrathionate Broth
Enrichment Step of Salmonella Detection in Poultry, Letters in Applied Microbiology, 34, 37-41 (2002).
CARLI K.T., Caner V., Eyigor A., Unal, C.B., Rapid identification of Salmonella colonies by the
Polymerase Chain Reaction. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 25, 717-20, (2001).
CARLI, K.T., Unal, C.B., Caner, V., Eyigor, A. Detection of Salmonella in chicken feces by a
combination of tetrathionate broth enrichment, capillary PCR and capillary gel electrophoresis, Journal of
Clinical Microbiology, 39, 1871-6, (2001).
EYIGOR A., CARLI K.T. Rapid Detection of Salmonella from Poultry by Real-Time PCR with
Fluorescent Hybridization Probes, Avian Diseases, (2003) Basıma kabul edildi.