Mısırdan

Mısırdan
DNA
İzolasyon Kiti
Öğretmen Kılavuzu
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.
j.
k.
l.
Konu
Kullanıcı Kitlesi
Deney Süresi
Materyaller
Güvenlik
Genel Bilgi
Deney Öncesi Hazırlık
Ön Bilgi
Deneyin Yapılışı
Deney Sonuçları
Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları
Kaynaklar
Öğrenci Kılavuzu
a.
b.
c.
d.
Genel Bilgi
Deney Süresince Uyulması Gereken Kurallar
Deneyin Yapılış
Sorular
Öğretmen Kılavuzu
DNA, bazı virüsler hariç canlılarda kalıtsal bilgiyi taşıyan ve gelecek nesillere aktaran moleküldür. Tek
hücreli ve çok hücreli organizmalarda yer alan DNA molekülü canlının hücresel faaliyetlerini sürdürmesi
için gereken tüm bilgiyi içerir. Kit kullanılarak, kitin içinde hazır olarak verilen mısır bitkisinin DNA’ sı
elde edilecektir. Kit 10 öğrencinin deney yapabileceği şekilde dizayn edilmiştir.
a) Konu
Öğrenciler;
 Deneyde bitki hücresinden (mısır) DNA izolasyonunu gerçekleştirecektir.
b) Kullanıcı Kitlesi
DNA izolasyon kiti, 9 yaş ve üstü çocukların kullanımına uygundur.
c) Deney Süresi
Deney: 45 dakika
d) Materyaller

Falkon tüpü içerisine
konulmuş 5 gr mısır örneği: 10
tane

Liziz 1 çözeltisi: 50 ml

Liziz 2 çözeltisi: 50 ml

Etanol: 70 ml

Sargı bezi

Deney tüpü: 20 tane

Eppendorf;:15 tane

Pastör pipeti: 50 tane

Küçük plastik kap: 10 tane

Eldiven: 20 tane

Distile su
e) Güvenlik
Laboratuvarda uyulması gereken genel kurallara dikkat edilmelidir. Deney süresince öğrenciler
eldiven kullanmalıdır. Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir temas olması
durumunda bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır.
Kullanılan kimyasalların
solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar havalandırılmalıdır. Laboratuvar
sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır.
f)
Genel Bilgi
1.
DNA’ nın Yapısı
Genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını
sağlayan
kalıtsal
molekül
olan
DNA
(deoksiribonükleasit) -bazı virüsler hariç-;
prokaryotlarda hücre içinde dağınık olarak,
ökaryotlarda
ise
çekirdek
içerisinde
paketlenmiş olarak (kromotin iplik; bölünme
sırasında kısalıp kalınlaşarak kromozom adını
alır) bulunmaktadır. 1953’te James Watson ve
Francis Crick’ in önermiş olduğu, günümüzde
de hala kabul gören DNA’nın 3 boyutlu
modeline göre, DNA çift sarmal yapıdadır ve
her bir zincir nükleotitlerden meydana gelen uzun polinükleotit zinciri şeklindedir (Şekil 1).
Bir nükleik asit olan DNA; azotlu baz, pentoz şeker (5 karbonlu şeker) ve fosfat grubundan oluşmuştur.
Azotlu bazlar 2 çeşittir: dokuz atomlu, 2 halkalı pürinler ve 6 atomlu tek halka içeren pirimidinler.
Nükleik asitlerde yaygın olarak iki tip pürin ve üç tip pirimidin bulunur. Pürinler adenin (A) ve guanin
(G); pirimidinler ise sitozin (C),timin (T) ve urasil (U) olarak adlandırılmaktadırlar. DNA ve RNA’da (bir
diğer nükleik asit) ortak olarak A, C, G bulunur; T bazı sadece DNA’ da U bazı ise sadece RNA’ da vardır.
Nükleik asite adını veren taşıdığı pentoz (5 karbonlu) şekerdir. Ribonükleik asitlerde (RNA) riboz,
deoksiribonükleikasitlerde (DNA) deoksiriboz bulunur. Riboz ve deoksiriboz arasındaki fark;
deoksiribozun (şekerin) 2. karbonunda ribozda olduğu gibi hidroksil grubu (OH) yerine hidrojen (H)
atomunun bulunmasıdır.
Nükleotit yapısınıdaki fosfat grupları ise;
polinükleotit yapısının oluşumu sırasında yapıya
katılmaktadır. Baz ve şekerin bir araya gelmesiyle
nükleozit; baz, şeker ve fosfat grubundan oluşan
yapıya ise nükleotit adı verilmektedir (Şekil 2). İki
mononükleotit arasında kurulan bağ yapısında iki
şekere bağlı fosfat grubu yer alır ve oluşan bağ
fosfodiester bağıdır. İki nükleotit birleştiğinde
dinükleotit, üç nükleotit birleştiğinde trinükleotit, yaklaşık yirmi nükleotit birleştiğinde oligonükleotit
ve çok sayıda nükleotitin birleşmesiyle de polinükleotit adı verilen yapılar oluşur. Çift sarmal yapının
oluşmasında ise bazlar arasındaki hidrojen (H) bağları görev almaktadır. Bir DNA zincirindeki adenin (A)
nükleotiti (bazı) diğer zincirdeki timin (T) bazı ile, guanin (G) bazı ise, diğer zincirdeki sitozin (C) bazı ile
baz çifti oluşturur. A ile T bazları arasında iki H bağı oluşurken G ile C arasında üç H bağı oluşmaktadır.
2. DNA’ nın Görevleri
DNA‘ nın iki temel görevi bulunmaktadır.
a) DNA, hücre bölünmesi sırasında kendini eşleyerek (replikasyon), atasal özelliklerin yeni nesle
aktarımını (kalıtımı) sağlar.
b) DNA molekülü hücrede protein sentezini (transkripsiyon ve translasyon) kontrol ederek
hücredeki metabolik olayları yönetir.
3. DNA Replikasyonu (Eşleme)
Hücre bölündüğü zaman kalıtsal özelliklerin hiç bir değişikliğe uğramadan yavru hücrelere aktarılması
gerekmektedir. Nesiller boyunca kalıtım materyalinin bu şekilde korunması replikasyon (eşleme) ile
sağlanmaktadır.
Replikasyon sırasında :

DNA’nın çift zincirli sarmal yapısının oluşumunu sağlayan bazlar arasındaki hidrojen bağları,
enzimler vasıtasıyla koparılmaktadır. Kopan hidrojen bağlarıyla birlikte iki zincir açılmaya
başlamakta ve karşılıklı konumlanmış olan nükleotit dizileri birbirinden ayrılmaktadır.

Ayrılan
zincirlerde iki yönde DNA polimeraz enzimleri yardımıyla yeni DNA zincirleri
sentezlenmektedir.

Yeni oluşturulan DNA moleküllerine ait zincirlerden biri atasal zincirden gelirken diğeri
ortamdaki nükleotitlerden sentezlenmektedir. Açılmış zincirlerdeki tüm nükleotitlerin
eşleşmesinin tamamlanmasıyla hücre içerisindeki DNA sayısı ikiye çıkmaktadır. Bu işlemde
atasal DNA’ nın açılmış olan her iki kolu da kalıp işlevi görmektedir. DNA’nın bu şekilde
eşlenmesine yarı korunumlu (semikonsevatif) replikasyon denir.
4. DNA’nın Denatürasyonu ve Renatürasyonu
DNA’nın çift sarmal yapısındaki hidrojen bağlarının ısı ve çeşitli kimyasallarla karşılaşma sonunda
açılması sonucunda ipliklerin ayrılmasına denatürasyon denir.
İki tamamlayıcı DNA ipliğinin tekrar çift zincir haline dönüşmesine renatürasyon denir. Renatürasyon
tamamlayıcı iplikler arasındaki kendine özgü baz eşleşmesine dayanmaktadır. Isı ile gerçekleştirilen
denatürasyon, soğutma işlemi ile geri döndürülebilmektedir. Hızlı bir şekilde soğutma tüm bölgelerin
renatürasyonuna olanak sağlamazken, yavaş yavaş soğutma ile komplementer (tamamlayıcı) zincirlerin
tamamıyla hibridizasyonu gerçekleşebilmektedir. Zincirlerin kimyasal ve ultraviyole ile muamele
sonucu ayrılması yani denatürasyonu, DNA zincirlerinde oluşan hasarlar ve konfigürasyon değişimleri
sebebiyle geri dönüşümsüzdür.
g) Deney Öncesi Hazırlık
1. Kit kitapçığı öğretmen ve öğrenci kılavuzu olmak üzere 2 kısımdan oluşmaktadır. Uygulama
öncesi öğrenci kılavuz bölümü öğrencilere çoğaltılıp verilecektir
2. Deneyde kullanılan ayırma yöntemlerinde gerçekleşen reaksiyonların bilgisi sadece öğretmen
kılavuzundadır. Öğrenci kılavuzunda deney sonunda reaksiyonlar ile ilgili sorular verilerek,
öğrencilerin akıl yürütmesi ve araştırma yapması hedeflenmiştir.
3. Deneyde kullanılan liziz 1 ve liziz 2 çözeltileri hücrelerin kimyasal parçalanmasına yönelik
hazırlanan kimyasallardır. Çözeltileri oluşturabilmek için liziz 1 ve liziz 2’ nin bulunduğu şişeler
50 ml’ ye distile su eklenerek tamamlanmalıdır. Liziz 1 ve liziz 2 çözeltilerinin bu şekilde
kullanıma sunulmasının sebebi raf ömrünü uzatmak ve çözeltilerden maksimum verim
alabilmektir.
4. Kit içerisinde verilmiş olan etanol -20° C’ de saklanmalıdır. Deney sırasında kullanılacak olan
etanolün soğukluk derecesi, deney sonucunun kalitesini etkilemektedir.
h) Ön Bilgi
Mısır örneği toz şeklinde kullanıma sunulmuştur. Bu sayede bitki hücrelerinde bulunan hücre duvarının,
fiziksel etki ile parçalanarak deneyde kimyasal parçalamada kullanılacak liziz solüsyonlarının daha etkin
bir parçalama yapması hedeflenmiştir.
i) Deneyin Yapılışı

Falkon tüpü içerisine konulmuş toz halindeki 5 g mısır örneği üzerine 3 ml liziz 1 çözeltisi ve 3
ml liziz 2 çözeltilerinden pastör pipeti yardımıyla eklenerek iyice karıştırılır (15 dakika)

Bu karışım sargı bezi kullanılarak küçük plastik kap içine süzülür.

Süzüntü deney tüpünün içerisine alınır.

Üzerine pastör pipeti yardımıyla çok yavaş bir şekilde tüpün iç kenarından 5 ml etanol (-20° C)
eklenir ve 10-15 dakika beklenir. (Bu sırada tüp kıpırdatılmamalıdır, bu sayede altta süzüntü
üstte etanol olacak şekilde 2 fazın oluşumu sağlanır.)

Etanol içinde topak halinde çıkan DNA molekülü, pastör pipeti yardımıyla eppendorf içerisine
alınır
j) Deney Sonuçları
Etanol içerisinde DNA topak halinde görünür hale gelmektedir.
k) Öğrenci Kılavuzundaki Soruların Cevapları
1. Genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını sağlayan kalıtsal moleküldür.
2. DNA prokaryotlarda sitoplazmada dağınık olarak, ökaryotlarda ise çekirdek içerisinde
paketlenmiş olarak bulunur.
l) Kaynaklar
 Concepts of Genetics; Eighth edition; William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A.
Spencer.
 Harper’ s Illustrated Biochemistry; Twenty-sixth edition; Robert K. Murray, Daryl K. Granner,
Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell.
 Lehninger Principles of Biochemistry; Fifth edition; David L. Nelson, Michael M. Cox.
Öğrenci Kılavuzu
AD- SOYAD :
TARİH
:
DNA, bazı virüsler hariç genetik bilginin nesiller boyunca aktarılmasını sağlayan kalıtsal
moleküldür. Bir hücreyi ya da organizmayı
oluşturmak için gerekli tüm bilgileri
içermektedir. Yapılacak olan deneyde bitki
hücresinden
DNA
izolasyonu
gerçekleştirilecektir.
a)
Genel Bilgi
1.
DNA’ nın Yapısı
Genetik
bilginin
nesiller
boyunca
aktarılmasını sağlayan kalıtsal molekül
olan
DNA
(deoksiribonükleasit)
-bazı
virüsler hariç-; prokaryotlarda hücre içinde dağınık olarak, ökaryotlarda ise çekirdek içerisinde
paketlenmiş olarak (kromotin iplik; bölünme sırasında kısalıp kalınlaşarak kromozom adını alır)
bulunmaktadır. 1953’te James Watson ve Francis Crick’ in önermiş olduğu, günümüzde de hala
kabul gören DNA’nın 3 boyutlu modeline göre, DNA çift sarmal yapıdadır ve her bir zincir
nükleotitlerden meydana gelen uzun polinükleotit zinciri şeklindedir (Şekil 1).
Bir nükleik asit olan DNA; azotlu baz, pentoz şeker (5 karbonlu şeker) ve fosfat grubundan
oluşmuştur. Azotlu bazlar 2 çeşittir: dokuz atomlu, 2 halkalı pürinler ve 6 atomlu tek halka
içeren pirimidinler. Nükleik asitlerde yaygın olarak iki tip pürin ve üç tip pirimidin bulunur.
Pürinler adenin (A) ve guanin (G); pirimidinler ise sitozin (C),timin (T) ve urasil (U) olarak
adlandırılmaktadırlar. DNA ve RNA’da (bir diğer nükleik asit) ortak olarak A, C, G bulunur; T
bazı sadece DNA’ da U bazı ise sadece RNA’ da vardır.
Nükleik asite adını veren taşıdığı pentoz (5 karbonlu) şekerdir. Ribonükleik asitlerde (RNA)
riboz, deoksiribonükleikasitlerde (DNA) deoksiriboz bulunur. Riboz ve deoksiriboz arasındaki
fark; deoksiribozun (şekerin) 2. karbonunda ribozda olduğu gibi hidroksil grubu (OH) yerine
hidrojen (H) atomunun bulunmasıdır.
Öğrenci Kılavuzu
Nükleotit
yapısınıdaki
fosfat
grupları
ise;
polinükleotit yapısının oluşumu sırasında yapıya
katılmaktadır. Baz ve şekerin bir araya gelmesiyle
nükleozit; baz, şeker ve fosfat grubundan oluşan
yapıya ise nükleotit adı verilmektedir (Şekil 2). İki
mononükleotit arasında kurulan bağ yapısında iki
şekere bağlı fosfat grubu yer alır ve oluşan bağ
fosfodiester bağıdır. İki nükleotit birleştiğinde
dinükleotit, üç nükleotit birleştiğinde trinükleotit, yaklaşık yirmi nükleotit birleştiğinde oligonükleotit
ve çok sayıda nükleotitin birleşmesiyle de polinükleotit adı verilen yapılar oluşur. Çift sarmal yapının
oluşmasında ise bazlar arasındaki hidrojen (H) bağları görev almaktadır. Bir DNA zincirindeki adenin (A)
nükleotiti (bazı) diğer zincirdeki timin (T) bazı ile, guanin (G) bazı ise, diğer zincirdeki sitozin (C) bazı ile
baz çifti oluşturur. A ile T bazları arasında iki H bağı oluşurken G ile C arasında üç H bağı oluşmaktadır.
2. DNA’ nın Görevleri
DNA‘ nın iki temel görevi bulunmaktadır.
c) DNA, hücre bölünmesi sırasında kendini eşleyerek (replikasyon), atasal özelliklerin yeni nesle
aktarımını (kalıtımı) sağlar.
d) DNA molekülü hücrede protein sentezini (transkripsiyon ve translasyon) kontrol ederek
hücredeki metabolik olayları yönetir.
3. DNA Replikasyonu (Eşleme)
Hücre bölündüğü zaman kalıtsal özelliklerin hiç bir değişikliğe uğramadan yavru hücrelere aktarılması
gerekmektedir. Nesiller boyunca kalıtım materyalinin bu şekilde korunması replikasyon (eşleme) ile
sağlanmaktadır.
Replikasyon sırasında :

DNA’nın çift zincirli sarmal yapısının oluşumunu sağlayan bazlar arasındaki hidrojen bağları,
enzimler vasıtasıyla koparılmaktadır. Kopan hidrojen bağlarıyla birlikte iki zincir açılmaya
başlamakta ve karşılıklı konumlanmış olan nükleotit dizileri birbirinden ayrılmaktadır.

Ayrılan
zincirlerde iki yönde DNA polimeraz enzimleri yardımıyla yeni DNA zincirleri
sentezlenmektedir.
Öğrenci Kılavuzu

biri atasal zincirden gelirken diğeri ortamdaki nükleotitlerden sentezlenmektedir. Açılmış
zincirlerdeki tüm nükleotitlerin eşleşmesinin tamamlanmasıyla hücre içerisindeki DNA sayısı
ikiye çıkmaktadır. Bu işlemde atasal DNA’ nın açılmış olan her iki kolu da kalıp işlevi
görmektedir. DNA’nın bu şekilde eşlenmesine yarı korunumlu (semikonsevatif) replikasyon
denir.
4. DNA’nın Denatürasyonu ve Renatürasyonu
DNA’nın çift sarmal yapısındaki hidrojen bağlarının ısı ve çeşitli kimyasallarla karşılaşma sonunda
açılması sonucunda ipliklerin ayrılmasına denatürasyon denir.
İki tamamlayıcı DNA ipliğinin tekrar çift zincir haline dönüşmesine renatürasyon denir. Renatürasyon
tamamlayıcı iplikler arasındaki kendine özgü baz eşleşmesine dayanmaktadır. Isı ile gerçekleştirilen
denatürasyon, soğutma işlemi ile geri döndürülebilmektedir. Hızlı bir şekilde soğutma tüm bölgelerin
renatürasyonuna olanak sağlamazken, yavaş yavaş soğutma ile komplementer (tamamlayıcı) zincirlerin
tamamıyla hibridizasyonu gerçekleşebilmektedir. Ancak nasıl ki kimyasal ve ultraviyole ile muamele
sonucu zincirlerin ayrılması yani denatürasyonu geri dönüşümsüzse (DNA zincirlerinde oluşan hasarlar
ve konfigürasyon değişimleri sebebiyle) çok yüksek sıcaklık sonucu oluşmuş olan denatürasyonda geri
dönüşümsüz olabilir.
b) Deney süresince uyulması gereken kurallar

Laboratuvar dersinde uyulması gereken genel kurallar dışında kit içerisinde bulunan kimyasal
malzemeler eldiven kullanılmaksızın kullanılmamalıdır.

Deney süresince kullanılan kimyasallar ile istenmeyen bir müdahale olması durumunda
bulaşan bölge bol sabun ve su ile yıkanmalıdır.

Kullanılan kimyasalların solunmamasına özen gösterilmeli, deneyin yapıldığı laboratuvar
havalandırılmalıdır.

Deneyler tamamlandıktan sonra sonuçlar yazılmalı ve üzerinde tartışılmalıdır.

Deney sonu verilen sorular işlenen konuyu ve yapılan deneyi pekiştirici niteliktedir. Deney
tamamlandıktan sonra soruların çözülmesi ve cevaplarının tartışılması önerilmektedir.

Laboratuvar sorumlusu olmadan kit kullanılmamalıdır.
Öğrenci Kılavuzu
c) Deneyin Yapılışı

Falkon içerisine konulmuş toz halindeki 5 g mısır örneği üzerine 3 ml liziz 1 çözeltisi ve 3 ml
liziz 2 çözeltilerinden pastör pipeti yardımıyla eklenerek iyice karıştırılır (15 dakika)

Bu karışım sargı bezi kullanılarak küçük plastik kap içine süzülür.

Süzüntü deney tüpünün içerisine alınır.

Üzerine pastör pipeti yardımıyla çok yavaş bir şekilde tüpün iç kenarından 5 ml etanol (-20° C)
eklenir ve 10-15 dakika beklenir. (Bu sırada tüp kıpırdatılmamalıdır, bu sayede altta süzüntü
üstte etanol olacak şekilde 2 fazın oluşumu sağlanır.)

Etanol içinde topak halinde çıkan DNA molekülü, pastör pipeti yardımıyla ependorf içerisine
alınır.
d) Sorular
1. DNA nedir?
2. DNA canlılarda nerede bulunur? Ökaryotik ve prokaryotik canlıları düşünerek bu soruyu
cevaplandırınız.