Eğitim Belgesi

TÜBİTAK TÜRKHAYGEN-1 Projesi
Tür ve Irkların DNA İşaretleri ile Moleküler Tanımlanması Çalışma Paketi
I. Çalıştay
2-3 Nisan 2007, ODTÜ
Eğitim materyalini hazırlayan: Dr. Evren Koban
I. GİRİŞ
Bu çalıştayın amacı, proje çerçevesinde yer alan tür ve ırkların moleküler tanımlanması
kısmından sorumlu araştırma gruplarının moleküler çalışmaları yürütecek elemanlarının
toplanması, tanışması ve kullanılacak metodlar ve dikkat edilecek önemli noktalar
yönlerinden bir ön bilgi sunulmasıdır. Ek 1’de tüm katılımcıların listesi verilmiştir.
Projenin en temel noktası, proje kapsamında incelenecek türlerden ve ırklardan oluşturulacak
populasyonlar için bireylerin seçimidir. Proje sonuçlarını doğrudan etkileyecek bu aşamadan
sonra genetik tanımlamanın en temel basamağı da seçilen bireylerden temiz, kaliteli ve
yüksek konsantrasyonda DNA elde edilmesidir. DNA’ların uzun bir dönem saklanması
planlandığından, DNA’nın kitten ziyade fenol-kloroform yöntemi ile izolasyonu tercih
edilmektedir. Bunun için şu referanstan yararlanılabilir: “Sambrook J., Fritsch EF., Maniatis
T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3Volume Set)”. Ayrıca, ekte (EK 2)
laboratuvarımızda kullandığımız bu protokol verilmiştir.
Çalıştay sırasında, önceden elde edilmiş DNA’ların miktar ve kalite tayinleri yapılmış, daha
sonra bu DNA’lar yeterli miktarlar hesaplanarak mikrosatellit ve mtDNA kontrol bölgeleri
için PZR işlemleri yapılmış (dizi analizi için ayrıca PZR ürünleri temizlenip dizileme PZR
işlemine tabi tutulmuştur), sonuçlar jelde kontrol edilmiş ve sonrasında otomatik DNA analizi
cihazında analiz edilmiştir. İki gün boyunca yapılan işlemlerin detayları aşağıda verilmiştir.
II. DNA’ların Kontrol Edilmesi:
DNA izolasyonundan sonra DNAların kalitesinin ve miktarının kontrol edilmesi, çalışmada
işlemlerin optimizasyonu ve standartlaştırılması için gereklidir. Bunun için hem agaroz jel,
hem de uv- spektroskopi ölçümleri kullanılmıştır.
a) Agaroz jel elektroforezi ile:
Agaroz jelde DNA kontrol ederken %0.6’lık ya da %0.8’lik jel hazırlanabilir. Agarozu
çözdürmek için tampon solusyon olarak 0.5X TBE (Tris-Borik asit-EDTA) kullanıyoruz.
DNA’nın jelde görüntülenmesi için de EtBr kullanıyoruz. Bunu iki şekilde yapabiliriz:
Agarozu tampon solusyonunda erittikten sonra bunun içine 2-3 µl kadar EtBr (10mg/ml)
koyabiliriz ya da DNA’ları jelde yürüttükten sonra görüntülemeden önce EtBr’lı solüsyonun
içinde 15-30 dk kadar bekletebiliriz.
EtBr kanserojen bir kimyasaldır. Bu kimyasala karşı eldivenlerden ziyade nitrile eldivenler
koruyucudur. Yüksek konsantrasyondaki EtBr’lı atıklar (özellikle pembe renkli jeller, EtBr
1
bulaşmış eldiven, kağıt havlu vs) tibbi atık olarak işlem görmelidir. EtBr içeren solusyonlar
deaktive edilmelidir (ekte -EK 3- bu işlem için önerilen 3 metod bulunmaktadır).
EtBr yerine daha az kanserojen olduğu düşünülen “SYBR Green” ya da “SYBR Safe” de
kullanılabilir.
7 adet koyun DNA örneğimizin agaroz jel elektroforezi ile kontrolü için elektroforez
tankımızın kasetinin hacmine uygun olarak 30 ml %0.8 konsantrasyonunda agaroz jel
hazırlayıp içine EtBr ekledik ve donmasını bekledik. Bu sırada 3 µl su, 1 µl 6X yükleme
tamponu (loading buffer) ve 2 µl DNA karıştırarak 7 örneği jele yüklemek üzere hazırladık.
Kullandığımız 6X yükleme tamponu bromofenol mavisi (bromophenol blue; önde giden koyu
mavi renk) ve ksilen sayanol (xylene cyanol; arkadan giden açık mavi renk) içermektedir.
DNA gibi negatif yüklü olan ve jelde DNA ile aynı yönde hareket eden bu iki madde hem
örneklerimizin jele yüklenebilmesini kolaylaştırabilmek için onları gözle görünür kılmakta
hem de jelde yürürken yerlerini tayin edebilmemize yardım etmektedir. Böylece örneklerin
fazla yürüyüp jelden çıkmaları önlenmiş olmaktadır.
Jel donduktan sonra, jele örnekleri yükleyip (örnek numaraları sırasıyla: 3, 14, 46, 47, 48, 57,
65 ve DNA merdiveni), tanka uygulanabilecek max voltajı aşmamak kaydıyla (cihazınızın
kullanma kılavuzunu mutlaka kontrol edin) 120 voltta 20 dakika yürüttük. Daha sonra jel uv
ışığına tabii tutularak görüntülendi. Şekil 1’de jel görüntüleme cihazında UV altında çekilen
jel fotoğrafı verilmiştir.
Şekil 1. DNA kontrol için %0.8’lik agaroz jel. Soldan sağa sırasıyla örnekler: 3, 14, 46, 47,
48, 57 ve 65 ile en sağda DNA merdiveni (size ladder) yer almaktadır.
En sonda yüklediğimiz DNA merdiveni konsantrayonu tayin edebilmek için referans olması
amacıyla kullanılmıştır. Eğer λ DNA’nız var ise farklı konsantrasyonlarda hazırlayıp (mesela
20 ng/µl, 50 ng/µl, 100 ng/µl ve 200 ng/µl gibi) örneklerinizin yanı sıra bunları da jele
yükleyip örneklerinizle beraber yürütebilir ve örneklerinizin konsantrasyonunu belirlemek
için bunlarla karşılaştırabilirsiniz.
Biz MBI Fermentas’ın GeneRuler 50 bp DNA merdivenini kullandık. Bunun konsantrasyonu
0.5 µg/µl. Jele bu DNA merdiveninden 1 µl yüklendiğinde 500 bandında (yukarıdan itibaren
okla gösterilmiş olan 6. bant) 75 ng DNA bulunuyor. DNA merdivenini hazırlamak için 1 µl
2
GeneRuler 50’yi 1 µl yükleme boyası (loading dye) ve 4 µl su ile karıştırıyoruz; yani her 1 µl
merdivenden 6 µl elde ediyoruz. Jele bu karışımdan 2 µl yükledik (hazırladığımız 6 µl
karışımın üçte biri). Yani merdivenin de üçte birini (0.33 µl) yüklemiş olduk. Bu durumda da
500 bandında da üçte biri kadar DNA var; yani yaklaşık 25 ng. Bu bant ile DNA’larımızın
bantlarını karşılaştırıp konsantrasyonlarını tahmin edebiliriz.
b) Spektrofotometre ile:
Aynı koyun DNA’sı örnekleri, 5 µl DNA + 595 µl su şeklinde 120 kat sulandırılmıştır ve uv
spektrofotometre cihazında 260 nm (DNA için) ve 280 nm (protein için) dalga boylarında
absorbans değerleri ölçülmüştür.
UV Spektroskopi cihazında 260 nm dalga boyunda alınan 1 OD (optical density) değeri 50
µg/ml DNA konsantrasyonuna eşittir. Bu değer RNA için 40 µg/ml ve primer için ise 33
µg/ml’dir. Bu denklikten yola çıkarak ve sulandırma faktörü de göz önüne alınarak DNAların
konsantrasyonları hesaplanabilir. Her bir örnek için kontrol amaçlı 2 defa okuma yapılmıştır.
Örneklerimiz için yaptığımız okumaların sonuçları Tablo 1’de verilmiştir.
Tablo 1. Spektrofotometre DNA okuma değerleri.
Konsantrasyon
(sulandırılmış) Konsantrasyon x120
DNA
Nükleik Asit
Örnek #
Oran A260/A280 (µg/ml)
Nükleik Asit (µg/ml)
1.7707
1.2681
152.17
3
1.8364
1.2677
152.12
1.8067
0.9346
112.15
14
1.7958
0.9134
109.61
1.7422
1.0331
123.97
46
1.7647
1.8092
217.10
1.5730
0.4665
55.98
47
1.6689
0.4866
58.39
1.7835
0.5593
67.12
48
1.7074
0.5911
70.93
1.8228
2.5881
310.57
57
1.8230
2.5783
309.40
1.8212
0.7590
91.08
65
1.8930
0.7823
93.88
Hem agaroz jel sonuçları hem de uv spektroskopi sonuçları birbirleri ile karışılaştırılarak
sonuçlardan emin olunduğunda bu DNA’lar stok olarak saklanır ve bunlardan çalışmalarda
kullanmak üzere 50 ya da 100 ng/µl konsantrasyonunda örnekler hazırlanır. Stok DNA’lar
böylece kontaminsayon riskinden korunmuş olur. Her bir örneğin konsantrasyonu yaklaşık
olarak eşit olduğu için de optimize edilen koşullar açısından kullanılacak DNA miktarını µl
bazında sabitlenmiş olur.
DNA’nın konsantrasyonu yüksek ise ve ondan daha az yoğun konsantrasyonda bir çalışma
tüpü hazırlayacaksak önce DNA örneğini etüvde 55°C’de yarım saat bekletiriz. Daha sonra bu
3
tüpten belli bir miktar DNA alıp (bu miktara DNA’nın ne kadar yoğun olduğuna, çalışmalar
için uygun konsantrasyonda toplamda ne kadar DNA çözeltisi hazırlamamız gerektiğine göre
değişir) bunu hazırladığımız yeni tüpteki steril dH2O ya da TE solüsyonuna ekleriz.
Hazırladığımız bu sulanmış DNA çözeltisini 37°C’de gece boyu bekletip ertesi gün
karıştırdıktan sonra tekrar agaroz jelde ve uv-spektrofotometre cihazında kontrol ederiz.
İstediğimizden daha yoğun ise bir miktar daha steril dH2O ya da TE solüsyonu ekleriz,
karıştırıp birkaç saat etüvde 37°C’de bekletip tekrar aynı şekilde kontrol ederiz. İstediğimiz
konsantrasyona ulaşıncaya kadar aynı işlemi tekrarlarız. Eğer istediğimizden daha az yoğun
olmuş ise stok DNA’mızdan (stok DNA’yı etüvde 55°C’de yarım saat beklettikten sonra)
uygun bir miktar DNA ekleriz.
Aşağıdaki şekilde stok DNA ve bu DNA’lardan hazırlanmış daha az yoğun konsantrasyonda
DNA’ların agaroz jelde görüntülenmiş resmi vardır (Şekil 2).
Şekil 2. DNA kontrol için %0.8’lik agaroz jel. Soldan sağa sırasıyla örnekler: (4 tane
sulandırılmış DNA) 65, 14, 3, 66 ve 4 tane stok DNA 14, 3, 65, 66).
260 nm OD ölçümünün 280 nm OD ölçümüne oranı bize DNA’mızda protein ya da RNA
kontaminasyonu olup olmadığı hakkında bilgi verir. A260/A280 oranının 1.8 ile 2.0 arasında
olması beklenir. OD’nin 2.0’nin üzerinde olması protein kontaminasyonuna, 1.8’in altında
olması da RNA kontaminasyonuna işaret eder. Bu durumda PZR sonuçlarının sağlıklı çıkması
için DNA’ların temizlenmesi gerekmektedir.
Tablo 1 ve Şekil 1 sonuçlarına bakılarak, DNA miktarlarını sulandırıp eşit hale getirmeden
polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) için bir tane çok yoğun DNA (3 numaralı), 2 tane de
yaklaşık olarak gerekli yoğunlukta DNA (46 & 47 numaralı) seçtik. Buradaki amaç DNA
miktarının PZR sonuçlarına olası etkisini görebilmektir.
11
Mayıs
2007’de
ODTÜ’de
gerçekletirilen
toplantıda
DNA’ların
çözdürülmesi/sulandırılması işleminde 10 mM’lık Tris HCl buffer (pH 8.0) kullanmanın uzun
vadede DNA’lar ve primerlerin bozulmaması için daha iyi olacağı konuşuldu. Ancak buffer’ı
hazırlamak için kullanılan suyun kalitesi önemli. Gerekirse suyun satın alınabileceği
konuşuldu.
III. DNA Bankası:
DNA bankası için Hacettepe Hastanesi’ne bulunan DNA bankasının müdürü Prof. Dr. Meral
Özgüç ile görüşülmüş ve tavsiyeler alınmıştır.
DNA’lar kit ile değil, fenol – kloroform metodu ile izole edilmelidir. Bu yolla izole edilen
DNA’ların moleküler ağırlığı kitle izole edilene kıyasla daha büyüktür. DNA’nın saflığı,
kalitesi ve miktarı da banka için uygundur.
4
DNA örnekleri -20°C ve -80°C’de saklanmalıdır. Örnek toplama sırasında bazı hayvanlardan
daha fazla örnekleme yapılmalı ve bunların DNA’ları bankanın zamana bağlı “kalite
kontrolü”nü yapmak için kullanılmalıdır.
Periyodik olarak (6 ayda bir) kalite kontrol DNA’ları çözdürülerek agaroz jelde kontrol edilir
ve kontrol amaçlı seçilmiş DNA lokusları açısından PZR çoğaltma işlemleri gerçekleştirilir.
Böylece DNA bankasındaki örneklerde fragmentasyon olup olmadığı ve PZR işlemi için
sonuç verip vermedikleri kontrol edilir.
VI. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ve Agaroz Jel Elektroforezi:
Seçilen 3 DNA ile mikrosatellit DNA lokusları için PZR işlemi yapılmıştır ve sonuç agaroz
jelde kontrol edilmiştir. Ayrıca DNA konsantrasyonları kontrol edilen 7 örneğin hepsi
mtDNA kontrol bölgesi için PZR işlemine tabi tutuldu ve yine agaroz jelde kontrol edildi.
İşlemlerin detayları aşağıda verilmiştir.
a) Mikrosatellit Lokusu Analizi İçin:
Mikrosatellit lokusu analizi için, proje kapsamında seçilen koyun ırklarında incelenecek olan
20 mikrosatellit lokusundan 7 tanesi (OarFCB20, OarFCB48, OarFCB304, OarJMP29,
OarJMP58, MAF65, MAF209) kullanılmıştır. Bu 7 lokus, primerlerinin TM dereceleri (erime
sıcaklıkları) nedeniyle seçilmiştir. Primerler ile birlikte gelen kağıtlarda primerlerin
konsantrasyonları ve TM dereceleri ile ilgili bilgi de bulunmaktadır. Bu kağıtlar yardımıyla
primerlerinizi istediğiniz konsantrasyona nasıl sulandıracağınızı hesaplayabilirsiniz. 50 ya da
100 mM’lık stok primer hazırlayıp, bundan daha da seyrelterek PZR işlemlerinizde kullanmak
için 100-200 µl hacimlerde 5 ya da 10 mM’lık primerler hazırlayabilirsiniz. Böylece
stoğunuzun kontaminasyon ihtimalini minimuma düşürürsünüz. Bu 5-10 mM’lık
hazırladığınız primerleri, dNTP karışımını hazırladığınız gibi, Forward ve Reverse primer
birlikte tek bir tüpün içine “primer mix” olarak da hazırlayabilirsiniz.
PZR işlemi temel olarak 3 safhadan oluşmaktadır. Ön denaturasyon adımı (94°C’de 2-5 dk),
25-35 döngüden oluşan çoğaltma adımı (1 döngü 3 sıcaklıktan oluşuyor: 94°C - denaturation,
anneal – primer bağlanma sıcaklığı ve 72°C – uzatma sıcaklığı) ve son adım olarak da
çoğaltma işlemi sırasında eksik kalan işlemlerin tamamlanması için son “uzatma” (final
extension) adımı. Primerlerin TM dereceleri, PZR ile çoğaltma işlemi sırasında anneal
sıcaklığına karar vermemiz açısından referans bir sıcaklık değeridir. Eğer gradient fonksiyonu
olan bir PZR cihazınız var ise (yani aynı anda PZR kuyularına farklı sıcaklıklar verebiliyorsa)
TM den 5°C aşağısı ve ve 5°C yukarısını kapsayan aralığı tarayacak şekilde farklı PZR mixleri
tek bir seferde denenebilir. Gradient PZR cihazınız yok ise olası annealing sıcaklıklarını tek
tek kontrol edebilirsiniz.
PZR reaksiyon karışımı için 10X PZR buffer kullanılabileceği gibi, 10X NH4 buffer da test
edilebilir (Fermentas Taq DNA polymerase ile birlikte geliyor – ayrıca hazırlanabilir de).
Ayrıca MgCl2 konsantrasyonu da optimizasyon işlemleri sırasında 1.5 mM’dan 4 mM’a kadar
test edilebilir. PZR çoğaltma işleminin sonucunu etkileyen başka 2 faktör de DNA miktarı ve
primer miktarıdır. Bunlar da farklı konsantrasyonlar açısından test edilebilir. PZR
çoğaltmasında alınan sonuçları iyileştirme amaçlı, BSA veya Triton-X100 kullanılabilir. BSA
için PZR reaksiyon karışımının hacmine göre 0.04 – 0.1 µg/µl miktarlarının ilavesi test
edilebilir.
5
Çalışmamızda 3 DNA ve bir negatif kontrol (su) olmak üzere 4 örnek 7 lokus için PZR
çoğaltmasına tabi tutulmuştur. Çoğaltma işlemine tabi tutulan mikrosatellit lokuslarının
isimleri, primerlerinin hangi florasan renkler ile işaretlenmiş olduğu ve beklenen alel uzunluk
aralıkları şöyledir:
i)
OarFCB20: Hex (sarı); 90-130 bp
ii)
OarFCB48: Hex (sarı); 136-172 bp
iii)
OarFCB304: Hex (sarı); 145-158 bp
iv)
OarJMP29: Fam (mavi); 117-157 bp
v)
OarJMP58: Tet (yeşil); 142-174 bp
vi)
MAF65: Fam (mavi); 120-140 bp
vii)
MAF209: Hex (sarı); 109-135 bp
PZR reaksiyonu için hazırlanan karışımın içeriği aşağıda Tablo 2’de verilmiştir.
Tablo 2. Mikrostelit DNA yükseltgeme reaksiyon içeriği.
PZR mix içindeki Tek örnek için
konsantrasyonlar
(µl)
8.6
dH2O
1X
1.5
10X PZR Buffer
2mM
1.2
25 mM MgCl2
200µM
0.3
dNTP mix (10 mM)
3 pmol
0.3
Primer (10 mM F & R mix)
~100 - 150 ng
3.0
DNA
0.5 units
0.1
Taq
Toplam
-
PZR master
mix (x32)
265.6
48
38.4
9.6
3.2
15
-
7 lokus ve 4 örnek olmak üzere toplamda 28 reaksiyon tüpü vardır. Pipetleme hatası
düşünülerek 32x’lik karışım hazırlanmıştır. 7 farklı çift primer olduğundan yedi PZR master
mix hazırlamak yerine içine primer koymadan bir adet PZR master mix hazırlanmıştır.
Primerler ise DNA’lar gibi tüplere tek tek konulmuştur. Karışımdan 11.7 µl üzeri uygun
şekilde etiketlenmiş/yazılmış tüplere (total hacim – DNA – primer = 15-3-0.3 = 11.7 µl)
dağıtılmıştır. Bunun üzerine 3 µl DNA ve 0.3 µl ilgili primer mixden (F+R) eklenmiş ve PZR
cihazına yerleştirilmiştir. Bu noktaya kadar işlemler buzun üzerinde yapılmıştır. PZR
çoğaltma işleminde uygulanan sıcaklıklar ve süreleri aşağıdaki Tablo 3’te verilmiştir.
Tablo 3. Mikrostelit DNA yükseltgeme koşulları.
Aşamalar
Sıcaklık
Süre
Denaturasyon
94ºC
2,5 dakika
Denaturasyon
94ºC
20 saniye
30 döngü
Yapışma (Annealing)
57ºC
20 saniye
Uzatma (Extension)
72ºC
40 saniye
Son Uzatma (Final Extension) 72ºC
10 dakika
Eğer PZR cihazınız ısıtmalı kapak değil ise mutlaka PZR karışımlarının üzerine 1 damla
mineral yağ damlatmalısınız. Isı yalıtımı sağlar ve karışımın buharlaşmasını engeller.
Otomatik DNA analiz cihazınıza yüklerken bu yağın mutlaka iyice temizlenmesi
gerekmektedir. Eğer cihazınız ısıtmalı kapak ise, yani yağ koymayacaksanız, tüplerinizin
6
kapaklarını iyice kapattığınızdan emin olun. Hafif aralık kaldığında yine buharlaşma olacak
ve PZR çoğaltma işleminiz gerçekleşmeyecektir.
PZR sıcaklıkları ve süreleri de optimizasyon sırasında değişebilir. Eğer HotStart Taq enzimi
kullanıyorsanız sıcaklık ve süresi kullandığınız taq enzimine göre olmalıdır. PZR çoğaltılması
yapılacak DNA bölgesinin uzunluğuna göre uzatma (extension) zamanı da değişecektir.
Ayrıca cihazın istenilen sıcaklıklara çıkma/inme hızı da bazen PZR çoğaltma işleminde etkili
olabilmektedir ve cihazın fabrika ayarlarından farklı hızlar ayarlamanız gerekebilir. Son
uzatma bazen hiç gerekli olmadığı gibi bazen de son uzatmadaki süre çoğaltılan bölgenin PZR
ürünü kalitesini etkilemektedir. Bütün bunlar optimizasyon sırasında göz önünde
bulundurmanız gereken noktalardır. Ayrıca, literatürleri takip edip neyi neden test etmeniz
gerektiğini bilip, ona göre optimizasyon için deneyeceğiniz başka adımlar da olabilir.
Eğitim çalışması sırasında PZR çoğaltması işlemi uyguladığımız mikrosatellit lokusların PZR
sonuçları için %2’lik agaroz jel hazırlanmıştır. Jelin konsantrasyonunun önceki jele göre daha
yoğun olmasının sebebi yürüteceğimiz PZR ürünlerinin uzunluklarının küçük olmasıdır.
Artan konsantrasyon jelin çözünürlüğünü (resolution) arttırmaktadır. Hem büyüklük açısından
birbirine yakın olan DNA bantları daha iyi ayırt edilir, hem de küçük bantlar seyrek jele göre
daha yavaş yürüyeceklerinden jelden kaçırma ihtimali azalır. Bu hazırladığımız jele EtBr
konulmamıştır. Jel donarken örnekler jele yüklemek için hazırlanmıştır: 3 µl PZR ürünü+1 µl
loading buffer+2 µl dH2O. Sonra örnekler jelin kuyularına yüklenmiştir. En solda 50 bp DNA
mikrosatellit, en sağda da yine 2 adet 50 bp DNA merdiveni ile bir adet pBR322 HaeIII enzim
kesimi ile elde edilen DNA merdiveni (sağda en dıştaki) yüklenmiştir. 120 V ve 80 dk/saat
yürüttükten sonra yarım saat EtBr’lı suda bekletilen jel uv’de görüntülenmiştir. Şekil 3’de
mikrosatellit DNA lokuslarının PZR çoğaltması işleminin ardından agaroz jel elektroforezi ile
görüntülendiği sonuçlar sunulmuştur.
Şekil 3. 7 farklı mikrosatellit lokusunun PZR ürünlerinin kontrol edildiği %2’lik agaroz jel.
Lokusların isimleri ve DNA örnek numaraları kuyuların üzeinde yazmaktadır (M: marker).
7 lokusun hepsinde PZR çoğaltma işlemi başarılı olmuştur. PZR bantları DNA ladder ile
karşılaştırıldığında görüntülenen DNA bantları, beklenen allel uzunlukları ile uyuşmaktadır.
Yoğun olan 3 numaralı DNA hiçbir mikrosatelit lokusu için PZR çoğaltması sonucu
vermemiştir. Aynı şekilde DNA yerine su koyduğumuz negatif kontrolde de bant yoktur, yani
işlemimiz sırasında kontaminasyon olmamıştır. Bu yedi lokusumuzun florasan renkleri ve
beklenen alel uzunlukları şöyleydi:
7
viii)
ix)
x)
xi)
xii)
xiii)
xiv)
OarFCB20: Hex (sarı); 90-130 bp
OarFCB48: Hex (sarı); 136-172 bp
OarFCB304: Hex (sarı); 145-158 bp
OarJMP29: Fam (mavi); 117-157 bp
OarJMP58: Tet (yeşil); 142-174 bp
MAF65: Fam (mavi); 120-140 bp
MAF209: Hex (sarı); 109-135 bp
Bu durumda: renkleri ve alel uzunlukları nedeniyle FCB20, FCB304, JMP29 ve JMP58
lokuslarının PZR ürünlerini karıştırıp otomatik DNA analiz cihazında birlikte gözlemlememiz
mümkün olduğundan, PZR ürünlerinin hepsini karıştırdık. Bu karışımdan 2 µl alıp 1.5 µl
Tamra DNA merdiveni (kırmızı renkte) ve 6.5 µl HiDi formamide ile karıştırıp 95°C’de 3 dk
denature edip hemen buza koyduk.
Primerler – dolayısıyla PZR çoğaltma işlemi ürünleri – ya sarı ya mavi ya da yeşil renk ile
işaretlidir. Bu durumda kırmızı renkli DNA merdiveni her seferinde PZR sonuçlarının
karışımından analiz için aldığımız küçük miktar ile karıştırılabilir. Her seferinde hem PZR
ürünleri hem de DNA merdiveni birlikte yürüyeceği için, PZR çoğaltma işlemi ile elde edilen
DNA bantlarının uzunlukları bu “iç büyüklük standardı” nedeniyle en doğru şekilde tayin
edilmektedir. Agaroz veya poliakrilamit jellerde DNA siz mikrosatellit başka kuyuda
yürüdüğünden jelin polimerleşmesinde oluşabilen farklılıklar nedeniyle bazen hızlı ya da daha
yavaş gidebilmekte ve diğer kuyularda yürüyen PZR bantlarının uzunlukları hatalı
hesaplanabilmektedir.
ABI 310 cihazının 47 cm kapilerini ve mikrosatellit lokusu analizi için kullanılan POP4
polimerini cihaza yerleştirip 46 ve 47 numaralı DNA için 4 çift primer ile gerçekleştirilen
PZR çoğaltma işleminin sonuçlarını içeren karışımı cihaza yükledik. Örnek başına cihazın
okuma işlemi 30-35 dk sürmektedir. Her iki örneğin de cihaz tarafından okuma işlemi
bittikten sonra sonuçlar GeneMapper (ABI) ile kontrol edilmiştir. Öncelikle her iki örneğin de
iç DNA büyüklük standartları kontrol edilmiş ve gerekli bilgiler cihaza girilmiştir. Daha sonra
her iki DNA örneği için elde edilen alellerin uzunlukları, kendileri ile birlikte aynı anda
kolondan geçen iç DNA büyüklük standardının bantları için yapılan kalibrasyon ile otomatik
olarak belirlenmiştir. Sonuçlar Şekil 4 ve Şekil 5’te verilmiştir:
8
Şekil 4: 46 numaralı DNA örneğinin FCB20, FCB304, JMP29 ve JMP58 mikrosatellit
lokusları için gerçekleştirilen PZR çoğaltma işleminin sonucunun ABI 310 cihazı ile
görüntülenmesi.
46 numaralı örneğin ilgili mikrosatellit lokuslar açısından PZR çoğaltma işlemi ile elde edilen
alel uzunlukları (iç DNA büyüklük standardına göre belirlenmiştir) şöyledir:
FCB20
FCB304
JMP 29
JMP58
: 90 bp (homozigot)
: 165 bp/177 bp
: 137 bp (homozigot)
: 140 bp/158 bp
Şekil 5: 47 numaralı DNA örneğinin FCB20, FCB304, JMP29 ve JMP58 mikrosatellit
lokusları için gerçekleştirilen PZR çoğaltma işleminin sonucunun ABI 310 cihazı ile
görüntülenmesi.
47 numaralı örneğin ilgili mikrosatellit lokuslar açısından PZR çoğaltma işlemi ile elde edilen
alel uzunlukları (iç DNA büyüklük standardına göre belirlenmiştir) şöyledir:
FCB20
FCB304
JMP 29
JMP58
: 88 bp/90 bp
: 161 bp/189 bp
: 114 bp/126 bp
: 158 bp/168 bp
9
b) mtDNA Dizi Analizi İçin:
Mitokondriyal DNA analizinde, mikrosatellit lokusları için PZR çoğaltması yapmak üzere
konsantrasyonları kontrol edilen 7 DNA örneği (3, 14, 46, 47, 48, 57 ve 65) ile beraber negatif
kontrol amaçlı (kontaminasyon olup olmadığını görmek için) su kullanılmıştır. Tablo 4 ve
Tablo 5’te yükseltgenme reaksiyon içeriği ve koşulları verilmiştir.
Tablo 4. mtDNA yükseltgeme reaksiyonu karışımının içeriği.
PZR mix içindeki
Tek örnek için
konsantrasyon
(µl)
14.15
dH2O
1X
2.5
10X PZR Buffer
3mM
3.0
25 mM MgCl2
0.05 µg/µl
0.25
BSA (50 mg/ml)
200µM
1.0
5 mM dNTP mix
10 pmol
1.0
10 mM Primer mix
~150 ng
3.0
DNA
0.5 units
0.1
Taq polimeraz
Toplam
-
25
PZR master mix
(x9)
127.35
22.5
27.0
2.25
9.0
9.0
0.9
-
mtDNA PZR çoğaltma işlemimizde mikrosatellit lokuslarımızın aksine, 7 çift değil bir çift
primerimiz olduğu için master mixin içine primerimizi de koyduk.
Her bir DNA’nın konsantrasyonunu aşağı yukarı bildiğimiz için hepsinden 3 µl koymadık
(vaktimiz olsaydı DNA’ların konsantrasyonları yukarıda anlatıldığı gibi eşitlenir, hepsinden
aynı hacimde konurdu, ancak vakit olmadığından pipetle farklı hacimlerde DNA çekilerek
yaklaşık olarak aynı DNA miktarı konmaya çalışıldı), mesela 3 nolu örnekten 0.8 µl; 4
numaralı örnekten 1.2 µl; 46 ve 47 numaralı örneklerden 3er µl; 48, 57 ve 65 numaralı
örneklerden de 2şer µl koyup eksik olanları su ile 3 µl’ye (toplam DNA hacmini tablodaki
hesaplamalarda 3 µl olarak belirlediğimiz için) tamamladık. Böylece PZR çoğaltması için her
örnekten aşağı yukarı benzer miktarda DNA alınmış oldu. Master mixten de 22 µl bunun
üzerine ekleyip (yani toplam PZR reaksiyonu hacmi 25 µl oldu) tüpleri PZR cihazına
yerleştirdik. İşlemler buzun üzerinde gerçekleştirildi. Mikrosatellit DNA PZRişleminden
farklı olarak reaksiyon karışımına BSA koyduk; çünkü daha önce denediğimizde BSA’lı PZR
sonuçlarının BSA’sızlara göre daha iyi olduğunu tespit etmiştik
Tablo 5. mtDNA yükseltgeme koşulları.
Aşamalar
Sıcaklık
Süre
Denaturasyon
94 ºC
3 dakika
Denaturasyon
94 ºC
20 saniye
Yapışma (Annealing)
60 ºC
20 saniye
Uzatma (Extension)
72 ºC
1 dakika 15 saniye
Son Uzatma (Final Extension) 72 ºC
15 dakika
30 döngü
PZR işlemi bittikten sonra örnekler önce 2% agaroz jelde kontrol edildi (Şekil 6). PZR
çoğaltma ürünlerinden 4 µl örnek 2 µl loading buffer ve 6 µl su ile karıştırılarak jel yüklendi.
100 voltta 90 dk yürütüldü.
10
Şekil 6. mt DNA için %2’lik agaroz jel. Soldan sağa sırasıyla:50 bp DNA mikrosatellit, 3, 14,
46, 47, negatif kontrol, 48, 57, 65.
Eğitim çalıştayından sonra laboratuvarımızda mtDNA kontrol bölgesi için gerçekleştirdiğimiz
PZR işleminde iki DNA örneği kullanılmış (3 ve 14 numaralı) ve optimizasyon amaçlı farklı
parametreler test edilmiştir: (i) 2 farklı bağlanma sıcaklığı (annealing temperature), (ii) 3
farklı primer konsantrayonu ve (iii) PZR karışımını BSA’lı ve BSA’sız hazırlamak. 1%
agaroz jelde kontrol edilen sonuçlar Şekil 7’de verilmiştir.
Şekil 7. 3ve 14 numaralı DNA örnekleri ile yapılan optimizasyon çalışması sonucu. Üst sırada
60°C bağlanma sıcaklığının test edildiği sonuçlar verilmiştir. Soldan sağa: ilk 4 örnek için
(3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 3 pmol primer kullanılmıştır; ikinci 4 örnek için
(3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 5 pmol ve üçüncü 4 örnek için de (3BSAsız, 3BSAlı,
14BSAsız, 14BSAlı) 10 pmol primer kullanılmıştır. Alt sırada 57°C bağlanma sıcaklığının
test edildiği sonuçlar verilmiştir. Soldan sağa: ilk 4 örnek için (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız,
14BSAlı) 3 pmol primer kullanılmıştır; ikinci 4 örnek için (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız,
14BSAlı) 5 pmol ve üçüncü 4 örnek için de yine (3BSAsız, 3BSAlı, 14BSAsız, 14BSAlı) 10
pmol primer kullanılmıştır.
Elde edilen bu sonuçlara göre 10 pmol primer miktarı PZR işleminin sonucunu olumsuz
etkilemiştir. Her iki bağlanma sıcaklığında da (annealing temperature) 3 pmol ve 5 pmol
primer miktarı aynı yoğunlukta PZR ürünü vermiştir. PZR karışımında BSA olması özellikle
60°C bağlanma sıcaklığında belirgin bir fark yaratmıştır; BSA ile elde edilen PZR bantlarının
kalınlığı (yani PZR ürünlerinin konsantrasyonu) BSAsız elde edilen ürünün bant kalınlığının
11
iki katı kadardır. 57°C bağlanma sıcaklığında da BSA ile elde edilen PZR ürünleri BSAsız
elde edilenlere kıyasla biraz daha yoğundur, ancak bu sıcaklıkta BSAsız elde edilen PZR
ürünlerinin konsantrasyonu da şekilde de görüldüğü gibi oldukça iyidir. Elde edilen bu
sonuçlara göre bağlanma sıcaklığı 57°C ve primer miktarı ise 3 pmol olmalıdır. BSA
kullanmak sonucu olumlu etkilediği için kullanılabilir. 3 pmol ve 5 pmol primer miktarı
kullanımı benzer sonuçlar verdiği için istenilirse (minimum miktarlar kullanmak adına) 1
pmol ve 2 pmol primer miktarı da test edilebilir. Elde edilen PZR ürünü miktarı değişmiyorsa,
PZR karışımında daha az primer kullanılabilir.
DNA dizileme işlemi için kullanılacak DNA örneğinin temiz olması önemli olduğu için PZR
çoğaltma işlemi ürünlerinin dizileme PZR işlemine tabi tutulmadan önce temizlenmesi
gerekmektedir. Bunun için örnek olarak seçilen 46 ve 47 numaralı örnekler Q Biogene marka
GeneClean Turbo for PZR kiti ile, kitin kullanım önerilerine göre temizlendi. Her kitin kendi
solusyonları ve kendi kullanım önerisi vardır. Seçilen kitin kullanım klavuzu okunmalıdır.
Qiagen ve Hybaid kitleri de kullanılabilir.
Dizileme PZR işlemi tek yönlüdür; Her bir reaksiyon ya forward ya da reverse primer içerir.
Dizileme işlemi için kullanılan yöntem Sanger’in dizi sonlandırma (chain termination)
yöntemidir. ABI firması tarafından cihazın özelliklerine uygun olarak üretilen “Big Dye
Terminator DNA sequencing v3.1” kiti kullanılmıştır. Her ne kadar kitin kullanım önerileri
başlangıçta dikkate alınsa da buradan yola çıkılarak optimizasyon yapılabilir ve enzim daha
az kullanılarak da sonuç elde edilebilir.
Temizlenmiş mtDNA bölgesine Tablo 6 ve Tablo 7’de gösterilmiş olan PZR reaksiyon
içerikleri ve yükseltgenme koşulları uygulanmıştır.
Tablo 6. Dizi PZR’si reaksiyon içeriği.
Big Dye v3.1
5X Sequencing Buffer
Primer (F ya da R)
Temizlenmiş mtDNA PZR ürünü
dH2O
Tek Örnek
İçin (µl)
1.0
3.0
2.5
3.0
2.5
PZR Mix (4x)
12
-
Toplam
Tablo 7. Dizi PZR’si yükseltgeme koşulları.
Aşamalar
Denaturasyon
Denaturasyon
96ºC
Yapışma (Annealing)
50ºC
Uzatma (Extension)
60ºC
Bekletme (Hold)
4.0
12.0
10
Sıcaklık
Süre
96ºC
1 dakika
10 saniye
25 döngü
5 saniye
4 dakika
4ºC
∞
Dizileme PZR işlemi bittikten sonra ürünlerin, oluşan DNA dizilerine bağlanmamış, florasan
işaretle işaretlenmiş fazlalık ddNTPlerden ve PZR karışımı içinde yer alan diğer
kimyasallardan temizlenmesi gerekmektedir. Aksi takdirde DNA analiz cihazının okuma
12
sonuçları sağlıklı olmayabilir. Bunun için EtOH çöktürmesi yapılabilir veya kit kullanılabilir.
Literatürde bir çok protokol mevcuttur.
Uyguladığımız EtOH çöktürmesi protokolü:
•
PZR ürünlerine 2µl 3 M NaAc ve 50 µl %96’lık EtOH eklendi ve soğukta yarım saat
bekletildi.
• 30 dakika, 5000 rpm ve 12 ºC’de santrifuj yapıldı.
• Santrifuj sonunda tüpler ters çevrilip sallanarak içindekiler boşaltıldı ve havlu kağıt
üzerinde ters olarak bir süre bekletildi. Pelet tüpe yapıştığı için tüpü ters
çevirdiğimizde PZR ürünleri kaybolmamaktadır.
• Daha sonra tüplere 75 µl %70’lik EtOH eklendi.
• Yine 5000 rpm’de ve 12 ºC’de 10 dakika santrifuj edildi.
• Santrifuj sonunda tüpler ters çevrilip sallanarak içindekiler boşaltıldı ve havlu kağıt
üzerinde ters olarak kuruyana kadar bekletildi.
(Eğer 4000-5000 rpm’e çıkan “mikroplate” rotoru olan bir santrifuj cihazımız varsa
mikroplate’ler ile bu işlemi gerçekleştirebiliriz. Özellikle çok sayıda örnek ile uğraşıyorsak
büyük kolaylık olacaktır. Bu durumda ters çevirip kurumasını beklemek yerine havlu kağıt
koyduğumuz rotorun üzerine mikroplate’i ters çevirip 700 rpm’de 3-5 sn çevirirsek
kuruyacaktır).
Tüpler kurutulduktan sonra 10 µl HiDi formamide eklenip, hafifçe vortexlenip ABI otomatik
sekans cihazına yüklendi. Her bir reaksiyon sonucu 61 cm kapilerde POP6 polimeriyle 3 saat
yürütülerek sonuçlar cihaz tarafından otomatik olarak bilgisayara kaydedildi. Sequence
Analyis (ABI) programi ile kromatogramlar görüntülendi. Dizileme işlemi başarılı olmamıştı.
Bunun farklı sebepleri olabilir ama elimizdeki kitteki mevcut enzim oldukça eski olduğundan
sebebinin bu olması kuvvetle muhtemel.
Dizileme işleminin gerçekleşmemesinin sebepleri için iç kontroller kullanılabilir: (i) Standart
DNA ve buna ait standart primer her dizileme PZR işlemi sırasında mutlaka konulmalıdır. (ii)
Ayrıca bir de dizileme PZR işlemi gerçekleştirilmiş, temizlenmiş ve yüklemeye hazır standart
da satılmaktadır. Bunun da her defasında örneklerle beraber yürütülmesinde fayda vardır.
•
Eğer bu standart DNA’nın dizileme PZR işlemi gerçekleşir ama sizin DNAlarınızın
dizileme işlemi gerçekleşmezse, o zaman ya DNA’nız ya da primeriniz problemlidir.
•
Eğer hem standart DNA’nın hem de sizin örneklerinizin dizileme PZR sonuçları
çıkmadıysa ama dizisi hazır yapılmış standart cihaz tarafından güzelce okunduysa o
zaman enzimde bir sorun vardır.
•
Eğer hem standart DNA’nın hem de sizin örneklerinizin dizileme PZR sonuçları
çıkmadıysa ve ayrıca dizisi hazır yapılmış standart cihaz tarafından okunmadıysa o
zaman cihazın lazerinde bir sorun vardır.
13
EK 1: Katılımcı Listesi
İsim
Kurumu
Aylin Özdemir
TÜBİTAK MAM
Bengi Çınar
ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., GENETİK A.B.D.
Burcu Cingöz
ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., GENETİK A.B.D.
Emel Özkan
NAMIK KEMAL UNİV., ZİRAAT FAK., ZOOTEKNİ A.B.D.
Eren Yüncü
ODTÜ, BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
Evren Koban
ODTÜ, MERKEZİ LABORATUVAR
Hande Acar
ODTÜ, BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
Havva Dinç
ODTÜ, BİYOLOJİ BÖLÜMÜ
Koray Balcıoğlu
TÜBİTAK MAM
Orhan Karaca
TAGEM, BALIKESİR
Özgecan Korkmaz
ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., GENETİK A.B.D.
Ali Reha Ağaoğlu
ANKARA UNİV., VETERİNER FAK., JİNEKOLOJİ ve
DOĞUM A.B.D.
Seda Doğanlar
SELÇUK ÜNİV., VETERİNER FAK., BİYOKİMYA A.B.D.
Yalçın Yaman
TAGEM, BALIKESİR
Yusuf Özşensoy
SELÇUK ÜNİV., VETERİNER FAK., BİYOKİMYA A.B.D.
14
EK 2: DNA İzolasyon İşlemi
Laboratuvarımızda kullanılan, bazı küçük değişikliklerle uyguladığımız
fenol:kloroform DNA izolasyonu metodu (Sambrook et al., 1989) şöyledir:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
standart
10 ml kan 0.5 ml EDTA (0.5 M; pH 8.0) içeren falkon tüpe konur ve 2X lysis buffer
(10X Lysis solusyonu: 770 mM NH4Cl, 46 mM KHCO3, 10mM EDTA) ile 50 ml’ye
tamamlanır.
10 dk boyunca tüpler alt üst edilerek iyice karıştırılır ve 30 dk buzun içinde bekletilir.
Daha sonra tüpler 10 dakika santrifüj edilir (3000 rpm, +4°C).
Supernatant fazı atılır ve pelete 3 ml salt/EDTA (75mM NaCl, 25 mM EDTA)
eklenerek vortexlenir.
0.3 ml %10 SDS solusyonu ve 150 µl proteinase K (10 mg/ml) eklenerek örnekler
55°C’de 3 saat etüvde bekletilir.
Bekleme süresi bittiğinde 3 ml of fenol (pH 8.0) eklenir. Tüpler 20 sn oldukça sert bir
şekilde çalkalanır, sonra yumuşak bir şekilde 5 dk boyunca ters yüz edilir.
Daha sonra tüpler 10 dakika santrifüj edilir (3000 rpm, +4°C).
Supernatant fazı temiz ve uygun şekilde etiketlenmiş yeni steril tüpe transfer edilir.
Üzerine 3 ml fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) eklenir. Tüpler 20 sn oldukça
sert bir şekilde çalkalanır, sonra yumuşak bir şekilde 5 dk boyunca ters yüz edilir.
Daha sonra tüpler 10 dakika santrifüj edilir (3000 rpm, +4°C).
Supernatant fazı steril ve uygun şekilde etiketlenmiş cam tüpe aktarılır. Üzerine 2 katı
kadar –20°C’de soğutulmuş etanol eklenir. Cam tüpler sert bir şekilde sallanır ve
yoğunlaşarak çöken DNA cam çubuk ile alınarak 0.5 ml TE buffer (10mM Tris, 1mM
EDTA PH 7.5) içeren 1.5 ml eppendorf tüpe aktarılır. Eğer DNA yeterince yoğunlaşıp
çökmedi ise santrifüj işlemi ile çöktürülebilir.
DNA hemen kullanılacaksa +4°C’de, saklanak ise -20°C’de muhafaza edilir.
15
EK 3: EtBr deaktivasyonu için önerilen metodlar:
1- Armour method
This is the simplest method, but is somewhat controversial. One study found traces of
mutagenic reaction mixtures using this method. (Lunn, G. and E. Sansone, Analytical
Biochemistry, vol. 162, pp. 453-458, 1987)
Combine equal amounts of ethidium bromide solution and household bleach.
Stir constantly for four hours or let sit for 2-3 days.
Adjust pH to 4-9 with sodium hydroxide.
Pour down drain with copious amounts of water.
Lunn and Sansone method
For each 100 ml of ethidium bromide solution:
Add 5% hypophosphorus acid.
Add 12 ml of 0.5 M sodium nitrate.
Stir briefly and let stand for 20 hours.
Adjust pH to 4-9 using sodium hydroxide.
Pour down drain with copious amounts of water.
2- Quillardet and Hoffnung method
This method uses 0.5 M potassium permanganate and 2.5 M hydrochloric acid. Since chlorine
gas may be released in significant concentration, EHS does not recommend using this method.
3- Charcoal filtration
Filtering the aqueous ethidium bromide waste solutions, free of other contaminants, through a
bed of activated charcoal is a relatively simple and effective method for removal of ethidium
bromide. Schleicher and Schuell (603-352-3810 or http://www.s-and-s.com) supply
commercial filter funnel kits that use packaged charcoal disks that are graduated for easily
tracking the amount of aqueous solution calculated for a fixed quantities of ethidium bromide
residue.
Filter the ethidium bromide solution through charcoal filter.
Pour filtrate down the drain.
Place charcoal filter in a sealed bag (e.g., Zip-loc) and place in biohazardous waste box for
incineration.
16