Ratlarda Osteomyelit Modeli

Ratlarda Osteomyelit Modeli
Ömer Erşen, Serkan Bilgiç
Modern travma ve ortopedik cerrahide en ciddi problemlerden biri de osteomyelittir.
Osteomyelitin tedavisi kompleks ve zor bir süreçtir ve multidisipliner çalışmayı gerektirir [1]. Staphylococcus aureus en sık hastane enfeksiyonu oluşturan patojendir
ve osteomyelitin en sık sebebidir. Bununla birlikte implantla ilişkili enfeksiyonlarda
ve protez eklemlerde S. aureus, Staphylococcus epidermidis ile birlikte en sık görülen etkendir. Bu bakteriler bakteriyel tutunmayı ve biyofilm oluşmasına mediatörlük
eden ekzopolisakkaritler sentezler [2,3].
Osteomyelit modeli için kullanılan rat modeli birkaç basamak başarısızlığın sonucunda tam olarak sağlanabilmiştir. S. aureus enfeksiyon modeli [4] geliştirildikten sonra
model önce tavşanlarda ve daha sonra ratlarda oluşturuldu [5,6]. Bu modellerde enfeksiyon sistemik inokülasyon yoluyla veya bakterinin solüsyon içinde ve/veya biyofilm içinde direk sahaya inkülasyonu ile sağlanmaya çalışılıyordu [7, 8, 9, 10]. Bu modellerdeki genel problem osteomyelit oluşturma başarısının beklenenden daha az olması ve bunun sonucunda karşılaştırmalı çalışmalar için modelin yetersiz kalmasıydı. Bazı modellerde enfeksiyonu tetiklemek için sklerozan ajan kullanılması gündeme
gelmesine rağmen bu model de doğal osteomyelit sürecinin bir benzeri olmamaktaydı [11]. En sonunda bütün bu modellerin karışımı olan bir enfeksiyon modeli yüksek
enfeksiyon oranı ile ortaya konuldu [9].
Osteomyelit modeli için kullanılan mikroorganizma yüksek tutunma sağlayan yapışkan üreten S. aureus kolonisidir. Bu koloniler yapışkan oluşturmayan kolonilerden laboratuar ortamında oluşturulmaktadır. Yapışkan oluşturan ve oluşturmayan koloniler
Kongo kırmızısı agarda oluşturdukları kolonilerin şekillerine göre birbirinden ayrılır.
yapışkan S.aureus kolonileri pürüzlü olurken diğerleri pürüzsüzdür. Yapışkan olan koloniler doğal olmayan yüzeylere daha iyi tutunurlar.
Ribotipleme, süspansiyondaki bakterinin antibiyotik duyarlılığı ve Kongo kırmızısı
agarda koloni morfolojisi belirlenerek çalışma sonunda dokulardan ve kullanılan implanttan elde edilecek enfeksiyon ajanıyla karşılaştırılması yapılmalıdır.
Biyofilmler 1,5cm uzunluğundaki paslanmaz çelik parçalar üzerinde oluşturulur. İmp1
DERMAN MEDICAL PUBLISHING 339
Ratlarda Osteomyelit Modeli
Ratlarda Osteomyelit Modeli
lantlar otoklav ile sterilize edildikten sonra içinde 2 ml büyüme solüsyonu ve 50 µL
bakteriyel kültür ilave edilmiş tüplere konulur. Metal parçalar 37° de 12 saat tutularak üzerlerinde biyofilm oluşması sağlanır. Biyofilmler steril cımbız kullanılarak metal üzerinden ayrılır. tutunmamış bakterileri elimine etmek için parçalar fosfat tamponlu salin (FTS) ile 3 kez yıkanır ve cerrahi öncesi bakteri sayısının artmaması için
4°’de 1 saatten fazla tutulmaz. İn vivo enfeksiyondan önce implantasyon için kullanılmayan 6 kontrol parçasında biyofilm oluşturan bakteri sayısı belirlenmelidir. Bunun
için implantlar 2ml fosfat tamponlu salinde bekletilir. Bakteri kümelerini ve implanta
bağlı bakterileri ayırmak için 40 Hz’de 30 dakika sonikasyondan sonra tripton soya
agarda bakterilerin sayımı yapılabilir.
Bakterilerin inokülasyonu için bakteri kolonileri büyümeye bırakılır. Solüsyon içindeki konsantrasyon spektofotometri ile tespit edilir ve kullanılacak modele göre inoküle edilecek bakteri miktarı ayarlanır.
Cerrahi işlem. Diz kapağı çevresi traş edildikten ve dezenfekte edildikten sonra artiküler fasianın arka tarafına doğru insizyon yapılır. Eklem kapsülü açılarak distal femur ve proksimal tibia yüzeylerine ulaşılır. 18 G iğne ile femur distalden proksimale doğru oyulur. Üzerinde biyofilm oluşturulmuş metalik implant oluşturulan boşluğa
yerleştirilir. Gerekli olursa bakteriyel süspansiyonla da inokülasyon yapılabilir. Daha
sonra yara kapatıldıktan sonra cilt dezenfektanla temizlenir. Aynı işlem için tibia da
kullanılabilir.
Çalışmanın sonunda enfeksiyon radyolojik olarak, bakteriyel analizlerde ve histolojik
olarak (doku kesitlerinde 4 µm kalınlığında) tespit edilmelidir. Histolojik incelemeden
önce örnekler 26 gün EDTA-PVP içerisinde tutularak dekalsifiye olması sağlanır. Örnekler yıkandıktan sonra dehidrate olması için değişik konsantrasyonlardaki alkol ve
ksilol ile muamele edildir (%70- %80- %96- %100- %100). Daha sonra örnekler parafine yerleştirilir. Bakteriyel analizler çalışmanın sonunda cerrahiden 9 hafta sonra yapılır. İmplant olan kemik ve karşı ekstremitedeki aynı kemik incelenerek enfeksiyonun sistemik olarak karşı ekstremiteye de yayılıp yayılmadığı kontrol edilir. Ayrıca deneklerden karaciğer ve dalak örnekleri ve tam kan alınır. Yaşayan bakteri sayımı için canlı bakteri sayısını etkilemeyen bir yöntem olarak 22-24° de 40Hz ile 230
dakika sonikasyon işlemi uygulanır.
Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile bakteriyel büyümenin çeşitli aşamalarında implant üzerinde oluşan biyofilmin homojenitesi değerlendirilebilir. Aseptik
Resim 1. Femoral kondillerin ortaya konulması, implant yerleştirilmesi ve radyolojik değerlendirme
340 DERMAN MEDICAL PUBLISHING
2
Ratlarda Osteomyelit Modeli
şartlarda biyofilm oluşmadan önce bakteriyel kültürün durağan büyüme aşamasındaki yapışkan oluşturan izolattan 500 ml ve 4,5 ml büyüme solüsyonu paslanmaz çelik yüzeye konulur. Biyofilmler 12 ila 48 saat içerisinde oluşur. TEM analizi için FTS
ile 3 kez yıkandıktan sonra %0,05 rutenyum kırmızısı içeren 0,1M sodyum kakodilat tamponu içinde (pH 7) %5’lik gluteraldehitin 2,5 ml si ilave edilir. 22- 24 ° de 2
saat bekletildikten sonra örnekler birkaç kez daha FTS ile yıkanır ve dehidrate olmaları için birbirini takip eden %50, %70, %80 ve %100’lük etanolle her biri en az 10
dakika olacak şekilde muamele edilir. Biyofilmi ayırmak için %100 etanol eklenir ve
3X3 mm² parçalara ayrılır. Etanol uzaklaştırılıp propilen oksit eklenir ve hafifçe çalkalanır. Kare şeklindeki örnekler hacim olarak 1: 1 oranındaki propilen oksit ve reçine karışımında 22- 24° de 12 saat bekletilir. Daha sonra örnekler %100 reçineye alınır. 22-24° de 2-3 gün kaldıktan sonra örnekler 16 saat boyunca 70 ° de yeni yapılmış reçinede bekletilir ve son olarak TEM için hazır hale gelir.
63. günde histolojik çalışmalarla birlikte Scaning elektron mikroskopisi (SEM) rat kemiğindeki ve çevre dokulardaki enfeksiyonun tespiti yapılır. %4 gluteraldehitle 17
gün boyunca tespit edilen örneğe daha sonra osmiyum tetroksitle çözülür ve liyofilizasyon altın uygulaması ile kurutulur.
İn vitro kolonize edilmiş implantların in vivo yerleştirilmesi ile konakta bakteri varlığının sağlanması ve fagositler tarafından elimine edilmemesi sağlanır. Böylece deneklerde enfeksiyonun başlangıcında hücre sayısı olarak ve biyofilm büyüklüğü olarak homojenite sağlanır. Bu homojenite TEM ile gösterilebilir. Bu homojenite antimikrobiyal ajanların karşılaştırılması gibi çalışmalarda biyofilmlerin tekrarlana uygulamalarında faydalı olmaktadır.
Deneysel bir osteomyelit modeli uzun süren bir enfeksiyon oluşturmanın yanı sıra deneklerde yüksek oranda enfeksiyon oluşturabilmelidir. Ayrıca mortalite oranı da düşük olmalıdır.
Kaynaklar
1. Tiemann AH, Hofmann GO. Principles of the therapy of bone infections in adult extremities: Are there any new
develop-ments? Strat Traum Limb Recon 2009;4:57.
2. Fritz JM, McDonald JR. Osteomyelitis: Approach to diagnosis and treatment. Phys Sportsmed 2008;36:116823.
3. Oğuz E, Ekinci Ş, Eroğlu M, Bilgic S, Koca K, et al. Evaluation and Comparison of the Effects of Hyperbaric Oxygen and
Ozonized Oxygen as Adjuvant Treatments in an Experimental Osteomyelitis Model. Journal of Surgical Research 2011:
171, e61–e68.
4. Rodet A. The classic. An experimental study on infectious osteomyelitis. Clin Orthop 1973; 96: 3-4.
5. Andriole V, Nagel D A, Southwick W O. Chronic staphylo-coccal osteomyelitis: an experimental model. Yale J Biol
Med 1974; 1: 33-9.
6. Power M E, Olson M E, Domingue P A G, Costerton J W. A rat model of Staphylococcus aureus chronic osteomyeli
-tis that provides a suitable system for studying the human infection. J Med Microbiol 1990; 33: 189-98.
7. Lasierra J M, Aznar J M, Albareda J, Palanca D, Remartínez J M, Marín J, Seral F. Modelo de osteomielitis experimental con tallo metálico intramedular. Rev Ortop Traum
1994; 38 IB: 437-45.
8. Lambe D W, Ferguson K P, Mayberry-Carson K J, Tober-Meyer B, Costerton J W. Foreign body-associated experimental osteomyelitis induced with Bacteroides fragilis
and Staphyloccus epidermidis in rabbits. Clin Orthop 1991; 266: 285-94
9. Gracia E, Laclériga A, Monzón M, Leiva J, Oteiza C, Amorena B. Application of a rat osteomyelitis model to
compare in vivo and in vitro antibiotic efcacy against
bacteria with high capacity to form bio lms. J Surg Res 1998; 79: 146-53.
10. Ward K H, Olson M E, Lam K, Costerton J W. Mechanism of persistent infection associated with peritoneal implants.
J Med Microbiol 1992; 36: 406-13.
11. Kaarsemaker S, Walenkamp G, Vanderbogaard A E J. New model for chronic osteomyelitis with Staphylococcus
aureus in sheep. Clin Orthop Rel Res 1997; 339: 246-52.
3
DERMAN MEDICAL PUBLISHING 341