Survivin geni - Journal of Cell and Molecular Biology

Journal of Cell and Molecular Biology 10(1):27-32, 2012
Haliç University, Printed in Turkey.
http://jcmb.halic.edu.tr
Research Article 27
Survivin geni -625G/C polimorfizminin Küçük Hücreli Dışı Akciğer
Kanseri ile ilişkisinin araştırılması
Engin AYNACI1, Ender COŞKUNPINAR2, Ayşe EREN2, Onur KUM1, Yasemin
MÜŞTERİ OLTULU2, Nergiz AKKAYA2, Akif TURNA3, İlhan YAYLIM2, Pınar
YILDIZ*1.
1
Yedikule Chest Diseases and Thoracic Surgery Training Hospital, Istanbul, Turkey
Department of Molecular Medicine, Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, Istanbul,
Turkey
3
Cerrahpaşa Medicine Faculty, Department of Thoracic Surgery, Istanbul University, Istanbul, Turkey
(*author for correspondence; [email protected])
2
Received: 14 February 2012; Accepted: 21 May 2012
Özet
Akciğer kanseri tüm kanser türleri arasında görülme sıklığı olarak ikinci sırada, kanser sebepli ölümler
arasında ise ilk sırada gelmektedir. Survivin geni 17q25 kromozomal bölgesinde lokalizedir ve 142 amino
asitten oluşan bir protein kodlar. Survivin (BIRC5) apoptozu düzenleyen önemli bir protein ailesi olan
apoptoz proteinlerinin inhibitörü (IAPs) olarak ilk bulunan inhibitörlerden biridir ve özellikle kanser
hücrelerinde ifadesi gerçekleşir. Survivin genindeki polimorfizm survivin üretimi ve aktivitesine etki
edebilir, bu nedenle akciğer kanserine hassasiyet sağlar. Survivin genindeki aşırı ifadenin çok çeşitli
maligniteleri içeren kanser türlerinde hastalık gelişimi, nüksü ve prognozu ile ilişkili olduğu bilinmektedir.
Bu çalışmada bir Türk popülasyonunda survivin geni promotör bölgesi üzerinde bulunan -625G/C gen
polimorfizmi ile küçük hücreli dışı akciğer kanseri arasında, hastalığın gelişimi ile ilgili olası ilişkilerin
araştırılması amaçlandı. Çalışmaya 146 hasta, 98 kontrol olgu dahil edildi. Yöntem olarak PCR-RFLP tekniği
kullanıldı. Sonuç olarak survivin -625G/C genotip dağılımları incelendiğinde hasta ve kontrol grupları
arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı tespit edilmiştir.
Anahtar kelimeler: Küçük hücreli dışı akciğer kanseri, survivin, gen polimorfizmi, PCR-RFLP, biyobelirteç.
Investigation of the association of survivin gene -625G/C polymorphism in non-small cell
lung cancer
Abstract
Lung cancer is the second most common cancer type diagnosed and first in cancer related deaths among all
cancers worldwide. The survivin gene is located on human chromosome 17q25, encoding a protein consisting
of 142 amino acids. Survivin is one of the first reported inhibitors of apoptosis proteins, which is an
important family of proteins that regulate apoptosis. Survivin gene polymorphism may affect the survivin
production and activity, thus providing sensitivity for the development of lung cancer. The overexpression of
survivin gene was found to be associated with disease development, recurrence and prognosis in various
malignancies, including cancers. In this study the demonstration of the prognosis related associations
between the -625G/C gene polymorphism located on the survivin promoter region and non small cell lung
cancer in a Turkish population was aimed. 146 patients and 98 control subjects included to the study. PCRRFLP technique was used as the method. According to survivin -625G/C genotype distribution analysis, no
statistically significant difference between patients and controls were found.
Keywords: Non small cell lung cancer, survivin, gene polymorphism, PCR-RFLP, biomarker.
28 Engin AYNACI et al.
Giriş
Akciğer kanseri tüm dünyada kansere bağlı
ölümlerin önde gelen sebebi olarak bilinmektedir.
Bununla birlikte özellikle Amerika’da kansere bağlı
ölüm oranları arasında akciğer kanseri sıklığı
gitgide azalmakta, fakat Çin gibi sigara tüketiminin
özellikle son 20 yılda arttığı bazı ülkelerde akciğer
kanseri
sebepli
ölüm
oranının
arttığı
gözlenmektedir. Amerika’da 2008 yılında 215.020
yeni vaka belirlenirken, 161.840 kişinin bu hastalık
sebebiyle öldüğü, kayıtlarda yer almaktadır.
Akciğer kanserinin küçük hücreli (KHAK) ve
küçük hücreli dışı (KHDAK) olmak üzere iki tipi
vardır. Son 60 yıldır akciğer kanserinde hastalık
gelişiminin
kalıtsal
bir
temele
oturduğu
belirtilmektedir.
(Julian
et
al.,
2008).
Programlanmış hücre ölümü olarak bilinen apoptoz,
önemli bir hücre büyüme kontrol mekanizmasıdır
(Yuan-Hung et al., 2009; Thompson, 1995).
Survivin (BIRC5 olarak da bilinir) apoptozu
düzenleyen önemli bir protein ailesi olan apoptoz
proteinlerinin inhibitörü (IAP) olarak ilk bulunan
inhibitörlerden biridir ve özellikle kanser
hücrelerinde ifadesi gerçekleşir (Reed,1997).
Survivin terminal tetikleyici kaspaz-3 ve kaspaz-9
aktivitesini inhibe ederek her iki apoptoz yolunun
baskılanmasını bloke eder (Nicholson and
Thornberry, 1997). Ayrıca survivin apoptotik
uyarıcıyla indüklenen interlökin (IL-3), Fas
(CD95), Bax, tümör nekroz faktörü α, kaspazlar ve
antikanser ilaçlarınının etkisini yok eder (Chan et
al., 2009; Yun-Hong et al., 2004). Mitozda
düzenleyici rol oynadığı da çeşitli yayınlarda (Chan
et al., 2009) bildirilmiş olan survivin geni 17q25
kromozomal bölgesinde lokalizedir ve 142 amino
asitten oluşan bir protein kodlar (Chiou et al., 2003;
Deveraux et al., 1997; Uren et al., 1998).
Survivin ayrıca mikrotübül dinamiklerinin
düzenlenmesinde de önemli rol oynar (Li et al.,
1998; Li and Altieri, 1999; Altieri, 2006; Giodini et
al., 2002). Survivin geni promotör bölgesindeki
polimorfizmler genin transkripsiyonuna etki ettiği
için gen aktivitesini ve ekspresyonunu değiştirerek
akciğer kanserine yatkınlık sağlayabilir (Jin Sung et
al., 2008).
Survivin hücre döngüsünde G2/M fazında bol
miktarda eksprese olur ve G1 fazında hızlı
regülasyon sergiler (Li et al., 1998). Bu durum
transkripsiyonel basamakta kontrol edilir ve hücre
döngüsüne bağlı elementler (CDE) ve hücre
döngüsü homoloji bölgeleri (CHR) survivin
promotörünün proksimal bölgesinde lokalize olur
(Masayuki et al., 2000; Li and Altieri, 1999).
Survivin geni ekspresyon düzeylerindeki artışın
bazı hastalıklar için prognostik belirteç olabileceği
düşünülmektedir (Chun-Hua et al., 2010). Survivin
genellikle embriyonik dokularda ifade olur ve
görülen
homozigot
mutasyonların
erken
embriyonik dönemde ölümle sonuçlanması bu gen
ailesinin hücre gelişimi, farklılaşması ve homeostaz
sürecinde çok önemli rol oynadığını göstermektedir
(Chan et al., 2009).
Çeşitli tek-nükleotit polimorfizmleri survivin
gen bölgesi promotöründe tespit edilmiştir.
Bunlardan en çok bilineni ve literatürde en fazla
çalışması yapılmış olan CDE/CHR reseptör
bağlayıcı bölgede lokalize olan -31G/C gen
polimorfizmidir. Survivin geninin promotör
bölgesindeki bu mutasyon sonucu hücre
döngüsünden
bağımsız
olarak
genin
transkripsiyonu ve bunun sonucunda da aşırı ifadesi
görülür (Xu et al., 2004).
Bu çalışmada KHDAK hastalarında PCR-RFLP
tekniği kullanılarak survivin geni promotör
bölgesindekiki
-625G/C
(rs8073069)
polimorfizminin bir Türk popülasyonunda KHDAK
hastalığına yatkınlığı araştırılmıştır.
Akciğer kanseri ile ilgili olarak eldeki verilerin
doğru olarak kullanılması ve buna ek olarak
hastalık oluşumu ya da gelişiminin anlaşılmasına
yönelik belirteçlerin ve genetik mekanizmaların
anlaşılması özellikle hastalığın erken tanısı ve
tedavi sürecinde bu hastalar için anlamlı olacaktır.
Materyal ve metod
Örneklerin tanımı
Çalışma ile ilgili olarak öncelikle İstanbul
Üniversitesi
İstanbul
Tıp
Fakültesi
Etik
Değerlendirme Komisyonu’ndan 09.06.2010 tarih
ve 2010/228-36 dosya numarası ile etik kurul onayı
alındı. Çalışmaya Yedikule Göğüs Hastalıkları ve
Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi 3.
Klinikte ve İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp
Fakültesi Göğüs Cerrahisi Kliniğinde tanı konulan
toplam 146 KHDAK olgusu ile yine aynı
kliniklerde tetkik edilen ve kronik hastalık veya
malignite bulgusu saptanmayan 98 sağlıklı kontrol
olgusu alındı. Çalışmaya girmeyi kabul edenlere
gönüllü olur imzaladıktan sonra 1 adet EDTA’lı
tüpe 10 ml kanları alınarak soğuk zincirle
laboratuvara ulaştırıldı.
DNA izolasyonu
Gönüllülerden alınan kanlardan High Pure PCR
Template Preparation Kit (Roche, Manheim)
protokolüne uygun olarak genomik DNA
KHDAK’de survivin polimorfizmi 29
izolasyonu yapıldı ve daha sonra Nano Drop
Spektrofotometre
kullanılarak,
elde
edilen
DNA’ların konsantrasyonları ölçüldü. DNA’lar
konsantrasyonları 100 ng/μl olacak şekilde
seyreltildi.
PCR
Survivin geni promotör bölgesindeki -625G/C
polimorfizmine özgü primerler (Tablo 1) dizayn
edildi. PCR, total hacim 25 µl ve 10X PCR Buffer
(MBI Fermentas), 1mM MgCl2, 0.2 mM dNTP,
0.375 mM her bir primer, 100 ng genomik DNA ve
1 U Taq DNA polimeraz (MBI Fermentas) olacak
şekilde dizayn edildi. Amplifikasyon şartları,
95°C’de 10 dakika ilk denatürasyondan sonra
95°C’de 45 saniye, 72°C’de 60 saniye 5 döngü,
takiben 94°C’de 45 saniye, 60°C’de 45 saniye ve
72°C’de 60 saniye 30 döngü, uzama aşamasında da
10 dakika 72°C’de olacak şekilde düzenlendi.
Optimum amplifikasyon şartları sağlanarak PCR
ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezinde
yürütüldü.
Tablo 1. Survivin geni promotör -625 G/C bölgesi primerleri (FP: İleri Primer, RP: Geri Primer)
Polimorfizm
Primer Dizileri
PCR Ürün boyu
BstUI kesimi sonrası
ürün boyları
CC: 125
-625C/G
(rs8073069)
FP: 5’-TGTTCATTTGTCCTTCATGCGC-3’
RP: 5’-CCAGCCTAGGCAACAAGAGCAA-3’
125 bç
CG: 125/104/21
GG: 104/21
Restriksiyon analizi
Sonuçlar
Amplifiye olan PCR ürünleri BstUI restriksiyon
enzimi ile uygun tamponu içeren karışım
hazırlandıktan sonra 37°C de 4 saat inkübe edildi.
Kesim ürünleri % 3’lük agaroz jelde 100 volt
elektrik altında, 20 dakika yürütüldükten sonra UV
altında incelenerek genotipler tespit edildi.
Çalışmaya 146 KHDAK hastası ve 98 kontrol olgu
dahil edildi. Hastaları yaş ortalaması 60,41 yaş
(±9,71), kontrol olgularının yaş ortalaması 55,23
yaş (±8,8.) di. Çalışmaya dahil edilen hastalardan
132’si erkek (%90,4), 14’ü kadın (%9,6), kontrol
grubu olgularının ise 56’sı erkek (%57,1), 42’si
kadındı (%42,9). Hasta ve kontrol grubuna ait
genotip ve alel dağılımları Tablo 2’de verilmiştir.
PCR sonucu elde edilen bant boyu 125 baz çifti
büyüklüğünde (Şekil 1); BstUI restriksiyon enzimi
kesimi sonucu elde edilen bant büyüklükleri ise
125, 104 ve 21 baz çifti olarak görüntülendi (Şekil
2).
İstatistiksel
analiz
AJJC tarafından yayınlanmış olan evrelendirme
sistemine göre tümör evrelendirmesi yapılan hasta
olguları ve kontrollere ait veriler SPSS 15.0
programına yüklendi ve kategorik verilerin
karşılaştırılmasında ki-kare testi ve parametrik ttesti kullanıldı.
Şekil 1. Survivin geni -625 G/C bölgesi PCR
görüntüsü
Şekil
2.
BstUI
kesimi
%3’lük
jel elektroforezi görüntüsü. M: 50 bp DNA markörü
Ϯϵ
30 Engin AYNACI et al.
Tablo 2. Hasta ve kontrol grubuna ait genotip ve alel dağılımları
Genotipler ve Alel
dağılımları
Kontrol
Hasta
Grubu
Grubu
N=98
N=146
P değeri
χ2
0.484
1.45
-625G/C
N
%
N
%
GG
56
57.1
72
49.3
GC
32
32.7
57
39.1
CC
10
10.2
17
11.6
144
52
56.06
43.94
201
58.59
0.27
1.21
91
41.41
düzeyindeki artışın -31G/C polimorfizmi ile ilişkili
olduğunu ve bu artışın hem mRNA düzeyinde hem
de protein düzeyinde meydana geldiğini
bildirmişlerdir.
Klinik perspektiften bakıldığında kişisel
paternlerle klinik özelliklerin öngörülmesinde
hastaların genetik parmak izinde survivin geni
ifadesi düzeylerinde ve genetik varyantlarda oluşan
değişikliklerin olası tedaviye yanıtta erken bir
belirteç olabileceğini söylemek mümkündür.
Örneğin plevral efüzyondaki yüksek survivin
düzeylerinin kötü prognoz göstergesi olduğu Lan
ve ark. 2010 yılındaki yayınında gösterilmiştir.
Yang ve ark 2009 yılında özefagus kanserli
hastalarda yaptıkları bir çalışmada C alleline sahip
olmanın hastalık riskini 1.4 kat arttırdığını
söylemektedirler. Özefagus kanseri hastalarında
survivin -625G/C promotor polimorfizminin p53
düzeyine bağlı olan survivin yüksek ifadesi
olasılığını artırdığı düşünülmektedir.
Sonuç olarak bir Türk popülasyonu üzerinde
yapmış olduğumuz bu çalışmada survivin geni -625
G/C bölgesi (rs8073069) polimorfizminin küçük
hücreli dışı akciğer kanseri hastalığına yatkınlık
sağladığına dair herhangi bir bulgu elde edilemedi.
Ancak olgu sayısının artırılması ve polimorfik
bölgenin özellikle transkripsiyonun aktivitesine etki
eden promotör bölgesinde olmasından dolayı
yapılabilecek ekspresyon çalışmaları ile özellikle
tanı öncesi ve sonrası gen anlatım ifadesine bağlı
değişikliklerin öngörülmesine yardımcı olabilecek
daha
anlamlı
sonuçlara
ulaşılabileceği
kanaatindeyiz.
Aleller
G
C
Tartışma
Kanser oluşumunda apoptoz mekanizmasındaki
bozukluklar önemli rol oynamaktadır. Apoptoz,
farklı inhibe ve aktive edici ajanlar tarafından
kontrol altında tutulan önemli bir olaydır. Kanserde
apoptozun
çeşitli
anti-apoptotik
proteinler
tarafından inhibisyonu söz konusudur.
Survivin, hücre döngüsünün düzenlenmesinde
temel rol oynayan başlıca anti-apoptotik faktördür.
Ayrıca survivinin Bcl-2 ve diğer IAPlerin aksine
farklılaşmasını tamamlamış normal dokularda
anlatımı olmayan ancak çeşitli kanser tiplerinde
ifade edilen bir protein olduğu bilinmektedir. Bu
durum survivin genindeki anormal ifadenin
transkripsiyonel regülasyon bozukluğuna sebep
olduğunun açık bir göstergesidir. Apoptozu inhibe
eden diğer proteinlerde de bulunan BIR
(“Baculovirus IAP Repeat”) bölgesi ile kaspazlara
bağlanarak etkisini göstermektedir. Dai ve ark.
2010 yılında yaptıkları çalışmada survivin geni
promotor
bölgesindeki
polimorfizmlerin
KHDAK’de
gen
modifikasyonuna
neden
olabileceğini ileri sürmüşlerdir.
Jang ve ark. tarafından yapılan çalışmada -31 G
alelinin -31 C aleline göre önemli derecede düşük
transkripsiyonel aktiveye sahip olduğu ve bu
durumun -31G/C polimorfizminden etkilenerek
ortaya çıktığı ve buna bağlı olarak -31G/C
polimorfizminin akciğer kanserine yatkınlıkta
önemli bir rolü olduğu belirtilmektedir. (Jang et al.,
2008). Xu ve ark. kanser hücre hatları ile yapmış
oldukları bir çalışmada survivin gen ifadesi
.
KHDAK’de survivin polimorfizmi 31
Kaynaklar
Altieri DC. Survivin apoptosis: an interloper
between cell death and proliferation in cancer.
Lab Invest. 79: 1327-1333, 1999.
Altieri DC. The case for survivin as a regulator of
microtubule dynamics and cell-death decisions.
Curr Opin Cell Biol. 18: 609-615, 2006.
Chan H. Han, Qingyi Wei, Karen K. Lu,
Zhensheng Liu, Gordon B. Mills, Li-E Wang.
Polymorphisms in the survivin promoter are
associated with age of onset of ovarian cancer.
Int J Clin Exp Med. 2: 289-299, 2009.
Chiou SK, Jones MK, Tarnawski AS. Survivin an
anti-apoptosis protein: its biological roles and
implications for cancer and beyond. Med Sci
Monit. 9:I25-I29, 2003.
Chun-Hua Dai, Jian Li, Shun- Bing Shi, Li- Chao
Yu, Li-Ping Ge, Ping Chen, Survivin and Smac
Gene Expressions but not Livin Are Predictors
of Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer
Patients Treated with Adjuvant Chemotherapy
Following Surgery. Jpn J Clin Oncol. 2-9,
2010.
Dai J, Jin G, Dong J, Chen Y, Xu L, Hu Z, Shen H.
Prognostic
significance
of
survivin
polymorphisms on non-small cell lung cancer
survival.
J
Thorac
Oncol.
2010
Nov;5(11):1748-54. PubMed PMID: 20881643.
Deveraux QL, Takahashi R, Salvesen GS and Reed
JC. X-linked IAP is a direct inhibitor of celldeath proteases. Nature. 388: 300-304, 1997.
Giodini A, Kallio MJ, Wall NR, Gorbsky GJ, Tognin S, Marchisio PC, Symons M and Altieri
DC. Regulation of microtubule stability and
mitotic progression by survivin. Cancer Res.
62: 2462-2467, 2002.
Jang JS, Kim KM, Kang KH, Choi JE, Lee WK,
Kim CH, Kang YM, Kam S, Kim IS, Jun JE,
Jung TH, Park JY. Polymorphisms in the
survivin gene and the risk of lung cancer. Lung
Cancer. Apr;60(1):31-9, 2008.
Jin Sung Jang,,Kyung Mee Kim, Kyung Hee Kang,
Jin Eun Choi, Won Kee Lee, Chang Ho Kim,
Young Mo Kang, Sin Kam, In-San Kim, Jae
Eun Jun, Tae Hoon Jung, Jae Young Park.
Polimorphizms in the survivin gene and the risk
of lung cancer. Lung Cancer. 60:31-39, 2008.
Julian R. Molina, Ping Yang, Stephen D. Cassivi,
Steven E. Schild,, Alex A. Adjei, Non–Small
Cell Lung Cancer: Epidemiology, Risk Factors,
Treatment, and Survivorship. Mayo Clin
Proc.83(5): 584–594.,2008.
Lan CC, Wu YK, Lee CH, Huang YC, Huang CY,
Tsai YH, Huang SF, Tsao TC. Increased
survivin mRNA in malignant pleural effusion is
significantly correlated with survival. Jpn J Clin
Oncol. Mar;40(3):234-40, 2010.
Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S,
Marchisio PC and Altieri DC. Control of
apopto-sis and mitotic spindle checkpoint by
survivin. Nature. 396: 580-584, 1998.
Li F.,Altieri DC. The cancer antiapoptosis mouse
survivin gene: characterization of locus and
transcriptional requirements of basal and cell
cycle-dependent expression. Cancer Res.59:
3143-3151, 1999.
Masayuki Otaki, Masahiko Hatano, Koichi
Kobayashi, Takeshi Ogasawara, Takayuki
Kuriyama, Takeshi Tokuhisa Cell cyledependent regulation of TIAP/m-survivin
expression. Biochim Biophys Acta. 1493:188194, 2000.
Nicholson DW,Thornberry NA. Caspase:killer
proteases. Trends Biochem Sci. 22:299-306,
1997.
Reed JC. X-linked IAP is a direct inhibitor of celldeath proteases. Nature. 388: 300-304, 1997.
Thompson CB. Apoptosis is the pathogenesis and
treatment of disease. Science. 5267:1456-1462,
1991.
Uren AG, Coulson EJ and Vaux DL. Conserva-tion
of baculovirus inhibitor of apoptosis repeat
proteins (BIRPs) in viruses, nematodes, vertebrates and yeasts. Trends Biochem Sci. 23: 159162, 1998.
Xu Y, Fang F, Ludewig G, Jones G, Jones D. A
mutation found in promoter region of the human
survivin gene is correlated to overexpression of
survivin in cancer cells. DNA Cell Biol.
23:419-429, 2004.
Yang X, Xiong G, Chen X, Xu X, Wang K, Fu Y,
Yang K, Bai Y. Polymorphisms of survivin
promoter are associated with risk of esophageal
squamous cell arcinoma. J Cancer Res Clin
Oncol. Oct;135(10):1341-9, 2009.
32 Engin AYNACI et al.
Yang X, Xiong G, Chen X, Xu X, Wang K, Fu Y,
Yang K, Bai Y. Survivin expression in
esophageal cancer: correlation with p53
mutations and promoter polymorphism. Dis
Esophagus. 2009;22(3):223-30.
Yuan-Hung Wang, Hung-Yi Chiou, Chang-Te Lin,
Hsiao-Yen Hsieh, Chia-Chang Wu, Cheng-Da
Hsu, Cheng-Huang Shen. Association Between
Survivin Gene Promoter -31C/G Polymorphism
and Urothelial Carcinoma Risk in Taiwanese
Population. Urology. 73 (3):670-674, 2009.
Yun-Hong Li, Chen Wang, Kui Meng, Long-Bang
Chen, Xiao-Jun Zhou, İnfluence of survivin and
caspase-3 on cell apoptosis and prognosis in
gastric carcinoma. World J Gastroenterol.
10(13):1984-1988, 2004͘