ÖZEL EGE LİSESİ MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE AURORA

ÖZEL EGE LİSESİ
MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE AURORA KİNAZ
BASKILANMASININ HÜCRE DÖNGÜSÜ ÜZERİNE ETKİLERİ
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Müge DEMİRSOY
Selin TUNABOYLU
DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Hande KALECİ
İZMİR
2016
0
İÇİNDEKİLER
Sayfa
1. GİRİŞ
1
Projenin Amacı
3
2. YÖNTEM
3
Hücre Hatlarının Çözülmesi
3
Hücrelerin Kültür Edilmesi
4
Hücrelerin Hücre Kültürü Ortamında Çoğalması Ve Pasajlanması
4
Hücre Canlılık Testi
5
Sitotoksisite Testi İle Ic50 Dozunun Belirlenmesi
5
Deneylerin Kurulması, Aurora Kinaz İnhibitörü Cct137690’ın Uygulanması
8
Apoptoz Analizleri
9
Hücre Döngüsü Analizleri
10
3. BULGULAR
12
4. SONUÇ VE TARTIŞMA
15
5. ÖNERİLER
15
KAYNAKLAR
15
1
1. GİRİŞ
Dünyadaki ölümlerin en büyük sebeplerinden biri kanserdir. Yaklaşık olarak 2012
yılında 14 milyon yeni vaka ve kansere bağlı olarak gerçekleşen 8.2 milyon ölüm meydana
gelmiştir, gelecek yirmi yılda da kanser vakalarının %70 oranında artması bekleniyor. Kanser
sebebiyle gerçekleşen ölümlerin üçte biri 5 davranışsal ve beslenme bozukluğundan
kaynaklanır: obezite, az meyve ve sebze tüketimi, hareket eksikliği, alkol ve sigara kullanımı.
Orta ve az gelişmiş ülkelerde kanserden kaynaklanan ölümlerin %20’si kanserin sebep
olduğu HBV/HCV ve HPV gibi viral enfeksiyonlardandır. Akciğer, prostat, kalın bağırsak,
mide ve karaciğer kanserleri erkeklerde en çok tespit edilen beş kanser türüdür. Kadınlarda
ise göğüs, kalın bağırsak, akciğer, rahim ağzı ve mide kanserleri en çok görülür. Biz ise
kendi projemizde dünya genelinde birçok ölüme sebep olan meme kanseri hücreleriyle
çalıştık.
Göğüs kanseri dünyada en çok görülen ikinci kanser türüdür. 2012’de teşhis edilen
1.67 milyon vakayla (Tüm kanser vakalarının %25’i) kadınlarda en sık görülen kanser
çeşididir. Göğüs kanserini tüm kanser çeşitleri içinde en yüksek ölüm oranına sahip olan
beşinci kanser çeşididir (Şekil 1).
Şekil-1: Ülkelere göre meme kanseri sonucu gerçekleşen ölümlerin istatistikleri.
Meme kanseri tüm dünyada kadınlarda en yaygın gözlenen malignant tümördür.
Normal gelişim sürecinde her hücre belli bir döngü içinde bölünür, çoğalır ve farklılaşır. Bir
hücrenin bir hücre bölünmesinden diğer hücre bölünmesine kadar geçirmiş olduğu
evrelerden oluşan bu döngüye hücre döngüsü denir. Bu süreçte farklı protein kinazlar,
siklinler, siklin bağımlı kinazlar, siklin bağımlı kinaz inhibitörleri rol oynamaktadır.
Kanserleşen hücrelerde, hücre döngüsü kontrol noktalarında gerçekleşen bozukluklar ve
hücrelerin aşırı çoğalması gözlenmektedir. Hücre döngüsü G1, S, G2, ve M fazı olmak üzere
1
4 evreye bölünmüş haldedir. G1, S ve G2 interfaz olarak adlandırılmakta, M fazı ise iki
hücrenin oluşturulduğu mitoz ya da sitokinez olarak adlandırılmaktadır. G1 ve G2 bir sonraki
faz için gerekli olan hazırlıkların yapıldığı, S ise DNA replikasyonunun gerçekleştiği süreçtir.
Aurora kinazlar (A, B ve C) kromozom segregasyonu ve M fazı kontrol noktası dahil
olmak üzere hücre bölünmesinin farklı aşamalarında rol oynayan proteinlerdir. Hedefledikleri
proteinlerin serin ve treonin aminoasitlerine fosfat grubu ekleyen serin/treonin kinazlardır. Bu
şekilde hedef proteinlerinin aktivitelerini düzenlerler. Aurora kinaz A, interfaz boyunca
sentromerde bulunur ve M fazı başlangıcında miktarını arttırarak iğ iplikçiklerinin kutuplarına
ve mikrotübül iplikçiklerine lokalize olur. Böylece sentromer olgunlaşır. Aurora kinaz B
aktivitesi ise mitozun sonlarına doğru artar. Başlarda sentromerde bulunan aurora kinaz B
ilerleyen aşamalarda iğ iplikçiklerinin ortalarına yerleşerek, M fazı kontrol noktasını sağlamak
amacıyla aktif kalır. Aurora kinaz C ise geç mitoz evresinde aktive olur ve iğ iplikçiği
kutuplarında bulunur.
Apoptoz kısaca programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanmaktadır. Apoptoz her
hücrenin sahip olduğu bir özellik olup, genetik olarak programlanmış, son derece düzenli ve
başarılı bir şekilde kontrol edilen bir olaydır. Büyüme faktörlerinin eksikliği, hormonal etkiler,
hafif toksik etkiler, kematerapötik ajanların kullanımı gibi nedenlerle oluşur. Nekroz ise
kazara hücre ölümü olarak bilinmektedir. Anoksi, fiziksel hasar, kimyasal hasar gibi
nedenlerle oluşur.
Apoptoz sürecinde hücreler büzülür ve sonunda makrofajlar tarafından fagositoz
yoluyla sindirilirken, nekroza uğrayan hücreler şişerek patlar. Apoptotik hücrelerin DNA’ ları
belli bölgelerinden kesime uğrar, farklı gen ifadesi gözlenir ve mitokondrilerinin zar
potansiyeli değişir. Ayrıca hücre zarının iç yüzeyinde bulunan fosfatidilserin molekülü
apoptoza uğrayan hücrelerde hücre zarının dış yüzeyine transloke olur. Çoğalmayı ve
hayatta kalmayı kontrol eden genlerin mutasyonları sonucu kanser gelişebilir. Tamir
edilemeyen mutasyonları taşıyan hücreler normalde intihar ederler yani apoptoza uğrarlar.
Eğer bu hücreler apoptozdan kaçarlarsa kanserleşmeye neden olurlar.
CCT137690 molekülü aurora kinaz inhibitörü olarak tasarlanan bir moleküldür. Üç tip
aurora kinaz (A,B,C) inhibisyonunu da sağlayabilmektedir (Şekil 2).
Şekil-2: Deneylerimizde kullandığımız toz halindeki CCT137690
Çalışmamızda kullandığımız CCT137690 aurora kinazların normal fonksiyonuna
engel olan ilaçtır. Aurora kinazların inhibisyonunun malign hastalıkların tedavisinde kullanımı
yeni bir yaklaşımdır. Aurora kinazların aktivitelerinin durdurarak, kanser hücrelenin hücre
döngüsünde ilerlemesini engeller ve ve tümör büyümesinin inhibisyonuna neden olabilir. Ek
olarak kanser hücrelerinin ölmesine neden olmaktadır. Kanser hücrelerinin bu etkilere normal
hücrelerden daha fazla duyarlı olduğu gözlenmektedir. Dolayısıyla kanser hücreleri ölürken
normal hücreler zarar görmemektedir.
2
Bu çalışmada aurora kinaz inhibitörü CCT137690’ ın insan meme kanseri hücreleri
üzerinde apoptoz, hücre döngüsü ve sitotoksisite üzerine etkisi araştırılmıştır.
Projenin Amacı:
İnsan meme kanseri hücrelerine aurora kinaz inhibitörü olan CCT137690
uygulanmasıyla oluşan apoptotoz ve hücre döngüsü ile ilişkili değişikliklerin belirlenmesi
amaçlanmıştır.
2. YÖNTEM
Çalışmamızda, laboratuvar çalışmalarında ve in vitro kanser araştırmalarında sıklıkla
kullanılmakta olan ve ticari olarak elde edilen MCF-7 meme kanseri hücre hattı ve kontrol
olarak WI-38 sağlıklı fibroblast hücre hattı kullanılmıştır.
Sırasıyla;
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Hücre hatlarının çözülmesi
Hücrelerin kültüre edilmesi
Hücrelerin hücre kültürü ortamında çoğaltılması ve pasajlanması
Hücre canlılık testi
Sitotoksisite testi ile IC50 dozunun belirlenmesi
Deneyin kurulması, aurora kinaz inhibitörü CCT137690’ ın uygulanması
Apoptoz analizleri
Hücre döngüsü analizleri
Hücre Hatlarının Çözülmesi:
1) Hücreler -86ºC’ den alınarak serumsuz ortamda pipetaj ile eritildi.
2) 2000 rpm’de 10 dakika santrifüj yapıldı.
3) Çöken hücreler ikinci kez serumsuz ortamda süspanse edilip 2000 rpm’de 10
dakika santrifüj yapıldı.
4) Daha sonra çöken hücreler kendi ortamları konularak flaska ekildi ve inkübatöre
kaldırıldı (Şekil 3).
Şekil-3: Hücrelerin flasklara ekilmesi.
3
Hücrelerin Kültüre Edilmesi:
In vitro koşullarda gerçekleştirilen hücre kültürü çalışmalarında kullanılan besi ortamı,
hücrelerin in vitro koşullar altında yaşayabilmeleri, büyüyebilmeleri ve çoğalabilmeleri için
uygun olmalı ve gerekli maddeleri içermelidir (Şekil 4).
MCF-7 ve WI-38 hücreleri uygulanacak işlemlere hazırlamak için 75 cm2’lik flasklar
içerisine ekildi. Kültür ortamı olarak%10 fötal sığır serum (FBS), % 1 L-glutamin, 10000 U/ ml
penisilin, 10mg/ml streptomisin içerenEMEM besiyeri kullanıldı. Hücrelerden yeterli büyüme
elde edilen kadarı 37oC, %95 nem, % 5 CO2‘ li inkübatörde inkübe edildi. Hücrelerin
proliferasyonu, pasajları ve takip işlemleri inverted mikroskop kullanılarak takip edildi.
Şekil-4: Hücrelerin kültüre edilmesi ve pipetlenmesi.
Hücrelerin Hücre Kültürü Ortamında Çoğaltılması ve Pasajlanması:
MCF-7 ve WI-38 hücreleri monolayer hücreler oldukları ilk olarak hücrelerin
pasajlanması için yapıştıkları yüzeyden ayrılmaları gerekir. Bu nedenle, tripsin-EDTA
solüsyonu kullanılarak hücreler yüzeyden kaldırıldı. Hücreler mikroskopla incelendi ve tüm
hücrelerin kalkıp kalkmadığı kontrol edildi. Tripsin-EDTA aktivitesini durdurma için flasklara 2
katı hacimde %10 FBS içeren EMEM eklendi. Hücre-ortam karışımı tüplere aktarılarak 2000
rpm’ de 5 dakika santrifüj edildi. Çöken hücreler taze ortamla süspanse edilerek iki flaska
bölündü.
Hücrelerin üremeye devam etmeleri için flasklar inkübatöre kaldırılarak
inkübasyona bırakıldı ve çoğalmaları sağlandı (Şekil 5).
4
Şekil-5: Hücrelerin üzerindeki ortamların değiştirilmesi
Hücre Canlılık Testi:
Kültüre edilen hücrelerin canlılıklarını ve sayılarını takip etmek amacıyla, tripan mavisi
boyası testi uygulandı. Buna göre, 50 µl süspanse hücreler 50 µl boya karıştırılarak, ışık
mikroskobu altında hücrelerin canlılığı ve sayısı “Neubauer” lam kullanılarak değerlendirildi.
Bu amaçla Neubauer lamda bulunan 4×4 lük karelerden oluşmuş 4 alan sayıldı. Tripan
mavisi boyası memran bütünlüğünü bozduğundan dolayı boyayı içine alıp metabolize
edemeyenler maviye boyandılar. Mavi renkte görünen hücreler ölü, boyayı içine alamayanlar
ise canlı olarak değerlendirildi. Bu nedenle, canlı hücreler beyaz renkte görüldü. Ölü hücreler
ise, tripan mavisini metabolize edemedikleri için maviye boyandı. Canlı hücre toplamının
ortalaması alınarak dilüsyon faktörü ve 2×104 ile çarpılmasıyla, ml başına düşen canlı hücre
sayısı saptandı. Aynı işlem ölü hücreler içinde gerçekleştiğinde, ml başına düşen ölü hücre
sayısı belirlendi. Hücre canlılığı ise, toplam hücre sayısının canlı hücrelere % olarak
oranlanmasıyla belirlendi.
Sitotoksisite Testi ile IC50 Dozunun Belirlenmesi:
CCT137690’ ın MCF-7 ve WI-38 hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisini belirlemek
amacıyla, her bir kuyucukta 100 μl EMEM bulunan 96-kuyucuklu E-platelere, 1 ml’de 2x105
hücre olacak şekilde ayarlanıp her kuyucuğa 100 µl hücre dağıtıldı. Yirmi dördüncü saatte
hücreler,CCT137690’ ın 50 μM’ dan başlayan dozlarıyla 1/2 dilüsyon olacak şekilde
muamele edildi ve xCELLigence ile gerçek zamanlı olarak ölçüldü ve IC50 dozları hesaplandı
(Şekil 6, 7, 8 ve 9) (Çizelge 1 ve 2).
Şekil-6: Deneyler sırasında kullandığımız 96 kuyucuklu e-plate
5
Şekil-7: Etken maade ve hücreler
Şekil-8: Hücrelerin e-plate’e aktarılması
Şekil-9: Ölçümler sırasında kullandığımız xCEllignece cihazı.
6
Çizelge 1: E-plate kuyucuklarına ekilen hücre hatları ve kontrol besiyerleri.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
B
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
C
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
D
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
E
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
F
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
G
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
MC7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
H
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
Çizelge 2: E-plate üzerindeki 96 kuyucukta bulunan CCT137690 uygulanan MCF-7 ve WıI38 hücre hatları, CCT137690 dozları, kontrol grupları ve EMEM ortamı
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
781,
25n
m
781,
25n
m
781,
25n
m
50µ
m
50µ
m
50µ
m
781,
25n
m
781,
25n
m
781,
25n
m
50µ
m
50µ
m
50µ
m
B
390
nm
390
nm
390
nm
25µ
m
25µ
m
25µ
m
390
nm
390
nm
390
nm
25µ
m
25µ
m
25µ
m
C 195
nm
195
nm
195
nm
12,5
µm
12,5
µm
12,5
µm
195
nm
195
nm
195
nm
12,5
µm
12,5
µm
12,5
µm
D 97n
m
97n
m
97n
m
6,25
µm
6,25
µm
6,25
µm
97n
m
97n
m
97n
m
6,25
µm
6,25
µm
6,25
µm
E
48n
m
48n
m
48n
m
3,12
5µm
3,12
5µm
3,12
5µm
48n
m
48n
m
48n
m
3,12
5µm
3,12
5µm
3,12
5µm
F
24n
m
24n
m
24n
m
1,56
25µ
m
1,56
25µ
m
1,56
25µ
m
24n
m
24n
m
24n
m
1,56
25µ
m
1,56
25µ
m
1,56
25µ
m
G MC
F-7
MC
F-7
MC
F-7
MC
F-7
MC
F-7
MC
F-7
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
WI38
H EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
7
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
EM
Deneylerin Kurulması, Aurora Kinaz İnhibitörü CCT137690’ ın Uygulanması:
Apoptoz ve hücre döngüsü analizleri için 6 kuyucuklu platelere 1ml’ de 5X105 hücre
olacak şekilde MCF-7 ve WI-38 hücrelerinin ekimi yapıldı. Hücrelerin tutunması için 24 saat
inkübe edildi. Süre sonunda CCT137690’ ın IC50 dozu hücre hattıyla muamele edildi ve 48
saat inkübe edildi. Etken madde ile muamele edilmeyen grup kontrol grubu olarak alındı.
Analizler 3 tekrar olarak çalışıldı. Kırk sekiz saat boyunca CCT137690’ ın IC50 dozuna maruz
kalan hücreler tripsin ile yüzeyden kaldırılıp %10 FBS içeren EMEM ile muamele edilip
tüplere toplandı. Hücreler 2000 rpm’ de 5 dakika santrifüj edildi. Üstteki sıvı uzaklaştırılarak
altta kalan pellet 1 ml PBS içinde süspanse edildi ve tekrar 2000 rpm’ de 5 dakika santrifüj
edildi. Aynı işlem 2 kere tekrarlanarak hücrelerin yıkanması sağlandı. Bu işlemlerden sonra
gerekli kitler kullanılarak ayrı ayrı apoptoz ve hücre döngüsü analizlerine devam edildi (Şekil
11, 12 ve 13).
Şekil-10: Apoptoz ve hücre döngüsü analizleri için hücre ekimi yapılan 6 kuyucuklu
plate.
Şekil-11: Santrifüj sonrası dibe çöken EMEM’deki hücreler.
8
Şekil-12: Santrifüj sonrası dibe çöken PBS’deki hücreler.
Apoptoz Analizleri
Apoptoz indüksiyonu sırasında meydana gelen ilk olaylardan biri sitoplazma
membranının iç yüzeyinden dışına doğru fosfaditiliserin birikmesi ve stabilizasyonudur. Dış
yüzeyde, fosfaditilserin fagositoz için hedef hücrelerin belirlenmesinde görev yapmaktadır.
Annexin–V fosfaditilserine spesifik olarak bağlanan bir proteindir. Sağlam hücrelerin
fluokroma bağlı annexin–V ile boyanması apoptozun erken dönemlerindeki hücreleri belirler.
Membran bütünlüğünü ölçen canlı/ölü hücre diskriminatörü propidium iyodür (PI) ile birlikte
kullanıldığında, erken apoptotik hücreler, geç apoptotik ve nekrotik hücrelerden
ayrıştırılabilinecektir.
Boyanmamış hücreler canlıdır ve her iki açıdan da negatiflerdir. Sadece Annexin-V ile
boyanmış hücreler apoptotik hücrelerdir. Yüzeylerinde fosfatidilserin ekspresyonu başlamıştır
ancak, sitoplazmik membranlarının geçirgenliğine neden olan sürece henüz girmemişlerdir.
Geç apoptotik hücreler yüzeylerind fosfatidilserin ekprese ederler ve hasar görmüş
membranlarından PI’yı içeriye alırlar. Annexin-V EGFP Apoptosis Detection Kiti (Biovision),
apoptoz başlangıcından sonraki gözlemlere dayanmaktadır: Çoğu hücre tipi plazma
membranının iç yüzeyindeki fosfatidilserini hücre yüzeyine transloke eder. Hücre yüzeyine
geldiği zaman fosfatidilserin, fosfatidilserine yüksek affinite gösteren ve geliştirilmiş yeşil
floresan proteini (Enhanced Green Fluoresan Protein – EGFP) ile işaretli Annexin-V ile
boyanarak kolaylıkla belirlenebilir. EGFP, diğer floresan ajanlara göre daha parlak ve ışığa
karşı daha kararlıdır (Şekil 13).
1.
2.
3.
4.
5.
Santrifüj sonrasında PBS içindeki hücrelerin üzerindeki sıvı uzaklaştırıldı.
Hücreler 100 µl 1X Binding Buffer ile resüspanse edildi.
1 µl Annexin-V EGFP ve 1 µl propidiyum iyodür eklendi.
On beş dakika karanlıkta oda sıcaklığında bekletildi.
Flow sitometri ile okutmalar yapıldı.
9
Şekil-13: Apoptoz analizleri sırasında kullandığımız Annexin-V EGFP Apoptosis Detection
Kiti (Biovision)
Hücre Döngüsü Analizleri
Hücre döngüsü analizi “BD Cycletest Plus kit” kullanılarak gerçekleştirildi. Bu kit hücre
membranının bir non-iyonik deterjan ile lizisine, hücre sitoiskeletinin ve nükleer proteinlerin
tripsin ile elimine edilmesine, RNA’ nın Ribonükleaz A ile sindirilmesine dayanmaktadır. İzole
edilen nukleustaki DNA’ yı boyamak için Propidium iodide (PI) kullanılmaktadır. DNA’ ya
bağlanmış PI, 488-nm ve 586/42 bandpass emisyon filtreleri ile flow sitometri ile saptandı.
“FACSuite software” ile sub G0/G1, G0/G1, S, G2/M ve 2n, 2n-4n, >4n evrelerindeki hücre
sayısı ve yüzdeleri ile belirlendi (Şekil 14, 15 ve 16).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Santrifüj sonrasında PBS içindeki hücrelerin üzerindeki sıvı uzaklaştırıldı.
Hücreler 500 µl 1X Buffer solüsyon ile süspanse edildi.
Hücreler 2000 rpm’ de 5 dakika santrifüj edildi.
İkinci ve üçüncü basamaklar 2. kez tekrarlandı.
Üstteki sıvı tamamen uzaklaştırıldı.
A solüsyonunda 125 µl eklenip oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi.
B solüsyonunda 100 µl eklenip oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi.
C solüsyonunda 100 µl eklenip +4ºC’ de 15 dakika inkübe edildi.
Flow sitometri ile okutmalar yapıldı.
10
Şekil-14: Hücre döngüsü analizleri sırasında kullandığımız BD Cycletest Plus kit
Şekil-15 ve Şekil-16. Apoptoz ve hücre döngüsü analizleri sırasında kullandığımız Flow
Cytometer cihazı.
3. BULGULAR
CCT137690’ ınMCF-7 ve WI-38 hücreleri üzerindeki gösterdiği sitotoksisite
incelendiğinde IC50 dozusırasıyla 4,5 µM ve 9,19 µM olduğu tespit edildi (Çizelge 3 ve 4).
11
4,5
4,0
3,5
3,0
Cell Index
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
0,0
10,0
20,0
4,8
30,0
40,0
50,0
Time (in Hour)
60,0
70,0
80,0
90,0
1
Cell Index
4,0
3,2
2,4
1,6
0,8
0,0
-6,5
-6,0
-5,5
-5,0
-4,5
-4,0
-3,5
Log of concentration (M)
Çizelge 3 ve 4. MCF-7 hücre hattı için CCT137690’ ın IC50 dozu grafiği
CCT137690’ ınIC50 dozlarıile muamele edilen hücrelerde muamele edilmeyen kontrol
grubuna göre; Anneksin V yöntemi ile MCF-7 hücrelerinde 3,6 kat apoptoz artışı WI-38
hücrelerinde 2,1kat apoptoz artışı olduğu belirlendi (Çizelge 5 ve 6).
12
Çizelge 5. WI-38 hücre hattı için CCT137690’ ın IC50 dozu grafiği.
Çizelge 6. MCF-7 hücre hattı için Annexin V flow sitometri grafiği (CCT137690’ ın IC50 dozu
uygunlamış ve uygulanmamış kontrol hücreleri için)
13
Çizelge 7. WI-38 hücre hattı için Annexin V flow sitometri grafiği (CCT137690’ ın IC50 dozu
uygunlamış ve uygulanmamış kontrol hücreleri için)
Cell Cycle yöntemi ile MCF-7 meme kanseri hücre hattı için; CCT137690 ile muamele
edilmemiş kontrol grubu hücrelerinin %81.1 oranında G0/G1 evresinde, %5,04 oranında S
evresinde, %12,08 oranında G2/M evresinde bulunurken, CCT137690’ ın IC50 dozları ile
muamele edilen hücrelerinin%23.11 oranında G0/G1 evresinde, %10,96 oranında S
evresinde, %62,65 oranında G2/M evresinde bulunduğu belirlendi (Çizelge 7).
Çizelge 8. MCF-7 hücre hattı için Cell Cycle flow sitometri grafiği (CCT137690’ ın IC50 dozu
uygunlamış ve uygulanmamış kontrol hücreleri için)
Cell Cycle yöntemi ile WI-38 sağlıklı hücre hattı için; CCT137690 ile muamele
edilmemiş kontrol grubu hücrelerinin %78,75 oranında G0/G1 evresinde, %7,76 oranında S
evresinde, %12,25 oranında G2/M evresinde bulunurken, CCT137690’ ın IC50 dozları ile
muamele edilen hücrelerinin %82.24 oranında G0/G1 evresinde, %9,19 oranında S
evresinde, %7,32 oranında G2/M evresinde bulunduğu belirlendi (Çizelge 8 ve 9).
14
Çizelge 9. WI-38 hücre hattı için Cell Cycle flow sitometri grafiği (CCT137690’ ın IC50 dozu
uygunlamış ve uygulanmamış kontrol hücreleri için)
4. SONUÇLAR ve TARTIŞMA
Yapılan Anneksin V analizinde; MCF-7 hücre hattına CCT137690’ ın
IC50uygulandığında, kontrole göre yaklaşık 3,6 kat apoptotik artış gözlenirken, WI-38 sağlıklı
hücre hattına CCT137690’ ın IC50 uygulandığında, kontrole göre yaklaşık 2,1 kat apoptotik
artış gözlenmiştir. Kanser hücrelerinde sağlıklı hücrelere oranla daha yüksek apoptoz
gözlenmesi olumlu bir sonuçtır. İlaç meme kanseri hücrelerini sağlıklı hücrelere göre ölüme
daha çok yönlendirdiğinden dolayı sağlıklı hücreler tedavi sürecinden daha az etkilenip, daha
az zarar göreceklerdir. Ayrıca meme kanser hücrelerde ilaç nedeniyle gerçekleşen belirgin
G2/M fazında hücre döngüsü bloklanması, sağlıklı hücrelerde çok düşük seviyelerde
gözlenmiştir. Aşırı bölünme gözlenen kanser hücrelerinin, hücre döngüsünün durdurulması
tümör büyümesini de engelleyecektir. Sonuç olarak, CCT137690’ ın hem meme kanseri
hücrelerinin çoğalmalarını engelleyerek hem de hücreleri ölüme yönlendirerek tümör
gelişimini engelleyebileceğini düşünmekteyiz.
5. ÖNERİLER
CCT137690’ ın hem meme kanseri hücrelerinin çoğalmalarını engelleyerek hem de
hücreleri ölüme yönlendirerek tümör gelişimini engelleyebileceğini düşünmekteyiz.
KAYNAKLAR
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/
http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx
Masaaki Kawai, Akio Nakashima, Shinji Kamada, Ushio Kikkawa (2015) “Midostaurin
preferentially attenuates proliferation of triple-negative breast cancer
cell lines through
inhibition of Aurora kinase family” Kawai et al. Journal of Biomedical science DOI 10.1186/
s12929-015-0150-2.
Sarah L. Larsen, Christina W Yde, Anne-Vibeke Laenkholm, Birgitte B Rasmussen,
Anne Katrine Duun-Henriksen, Martin Bak, Anne E Lykkesfeldt, Tove Kirkegaard (2015)
“Aurora kinase B is important for antiestrogen resistant cellgrowth and a potential biomarker
for tamoxifen resistant breast cancer” 15:239 DOI 10.1186/ s12885-015-1210-4.
15
Hiufeng Niu, Mark Manfredi, Jeffrey A. Ecsedy (24 August 2015)”Scientific rationale
supporting the clinical development strategy for the investigational Aurora A kinase inhibitor
alisertib in cancer” Frontiers in Oncology, Volume 5, article 189
David Neumark, Cathy J. Bradley, Miguel Henry, Bassam Dahman (2015) “Work
continuation while treated for breast for breast cancer: the role of work
place
accommadations” ILR Review, 68(4) August 2105, pp. 916-954
Xiaoyu Wu, Wentao Liu, Qinhang Cao, Che Chen, Zhiwei Chen, Zhe Xu, Weisu Li,
Fukun Liu, XueganYao “İnhibition of Aurora B by CCT137690 sensitizes colleractal cells to
radiotherapy” Department of Surgical Oncology, Affiliated Hospitalof NanjingUniversity of
Traditional Chinese Medicine, 155 Guangzhou Road, Nanjing 210029, China and
Department of Surgery Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai İnstitute of
DigestiveSurgery, 2015
Giet R, Petretti C, Prigent C: Aurora kinases, an euploidy and cancer, a coincidence
or a real link? Trends Cell Biol15:241-250, 2005
Qi W, Cooke LS, Liu X, et al: Alisertib (MLN8237) an investigational agent
suppresses Aurora A and Aurora B activity, inhibits proliferation, promotes endoreduplication
and induces apoptosis in T-HNL cell lines supporting its importance in PTCL treatment Leukı
Res 37:434-439, 2013
Bavetsias V, Large JM, Sun C, Bouloc N, Kosmopoulou M, Matteucci M; Wilsher NE,
Martins V, Reynisson J, Atrash B, et al: İmidazo [4,5-b] pyridine derivates as inhibitors of
Aurora Kinases: lead optimization studies toward the identification of an orally bioavailable
preclinical development candidate. J Medchem 2010, 53:5213-5228
Faisal A, Vaughan L, Bavetsias V; Sun C, Atrash B, Avery S, Jamin Y, Robinson SP,
Workman P, Blagg J, et al: the Aurora kinase inhibitor CCT137690 downregulate MYCN and
sensitizes MYCN-amplified neuroblastoma in vivo. Mol Cancer Ther 2011, 10:2115-2123
Yoon MJ, Park SS, Kang YJ, Kim IY, Lee JA, Lee JS, Kim EG, Lee CW, Chaoi KS:
Aurora B confers cancer cell resistance to TRAIL-induced apoptosis via phosphorylation of
survivin. Carcinogenesis 2012, 33:492-500
Yoshida A, Zokamasu K, Wano Y, Yamauchi T, Imamura S, takagi K, Kishi S, Urasaki
Y, Tohyama K, Ueda T: Marked upregulation of Survivinand Aurora-B kinase is associated
with disease progression in the myelody plastic syndromes. Haematologica 2012, 97:13721379
16