Sınıf B metallo-beta

Araş.Gör.Dr.Fatma Esenkaya Taşbent
Danışman:Yrd.Doç.Dr.Mehmet Özdemir

Günümüzde antibiyotiklerin düzensiz kullanımının
artması, yoğun bakım ünitelerinde yatan ve immün
sistemi bozulmuş hasta sayısının artması, gıda
endüstrisinde antibiyotik kullanımı gibi nedenlerle
mikroorganizmalardaki antibiyotik direnci giderek
artmaktadır.

Antibiyotiklerin uygunsuz ve gelişigüzel kullanımı
ile gerek toplum kökenli gerekse de hastane
kökenli infeksiyonların tedavisinde önemli sorunlar
yaşanmaktadır.



Antibiyotik direnci, bir bakterinin antimikrobiyal bir
ajanın öldürücü veya üremeyi durdurucu etkisine
karşı koyabilme yeteneğidir.
Antibiyotik direncinin yalnızca yaygın antibiyotik
kullanımı sonucu değil, bakterilerin olumsuz çevre
koşulları için kullandığı savunma sürecinin bir
parçası olduğu da belirtilmektedir.
Günümüzde tüm dünyada bir yandan hızla yeni
ilaçlar geliştirilmekte iken, öte yandan bunlara hızla
direnç kazanan mikroorganizmalarla oluşan
infeksiyonlar bildirilmekte ve bu sorunun boyutları
giderek büyümektedir.

Bakterilerin antimikrobik maddelere karşı
gösterdiği direnç mekanizmaları üç grup altında
toplanabilir :
1) İntrinsik Direnç
2) Çevre ve koşullara bağlı direnç
3) Kazanılmış Direnç


Bir bakterinin genetik özelliği nedeniyle bazı
antibiyotiklere olan doğal direncini tanımlar.
Örneğin; hemen hemen bütün gram negatifler
vankomisine,enterokoklarda sefalosporinlere doğal
olarak dirençlidir.


Antibiyotiklerin invitro ve invivo etkinliklerinin
farklılık göstermesine neden olan dirençtir.
Dokudaki pH değişiklikleri, antibiyotiğin infeksiyon
bölgesine ulaşamaması ve oksijen basıncı
değişiklikleri gibi nedenlerle invitro testlerde etkili
olarak değerlendirilen antibiyotik invivo koşullarda
etki göstermeyebilir.

Bakterinin genetik özelliklerindeki değişimlere
bağlı olarak; ya kromozom, transpozon veya
plazmid DNA’sındaki mutasyonlarla ya da direnç
geni taşıyan DNA dizilerinin başka bakterilerden
transformasyon, transdüksiyon veya konjugasyon
yoluyla alınmasıyla ortaya çıkan dirençtir.



1.İlacın hedefinde olan değişiklikler
A)Antibiyotiğin bağlanma bölgesinde değişiklikler
sonucu afinite azalması
B)Bakterinin ilaçtan etkilenmeyen farklı bir
metabolik yol kullanması
2. Bakterinin sentezlediği enzimlerle antibiyotiğin
inaktive edilmesi
3.Bakteri içinde ilaç toplanmasının engellenmesi
A)Permeabilite azalması ve antibiyotiğin hücre
içine girememesi
B)Aktif pompalama ile antibiyotiğin hücre dışına
atılması

Bir bakteri,bu mekanizmalardan bir veya birkaçını
kullanarak, farklı etki mekanizmasına sahip
antibiyotiklere karşı direnç kazanabilmektedir

Kromozomal Direnç : Kromozomda spontan
mutasyon oluşmasına bağlıdır. Hücrenin ilaca
geçirgenliği azalır ya da ilacın hedefinde değişiklik
olur. Bir bakteri hücresinde spontan mutasyon
oluşma olasılığı her hücre bölünmesinde
10-5 - 10-10civarındadır ve bu nedenle klinikte bu
tip direnç çok nadirdir.


Plazmidlere Bağlı Direnç : Plazmidler,
kromozomlardan bağımsız olarak replike olan, çift
sarmallı DNA yapısında, kromozom dışı genetik
yapılardır. Klinikte görülen direnç daha çok
plazmidlere bağlıdır.
R- plazmidi adı verilen direnç plazmidleri, sayıları
10’ a varabilen farklı antibiyotiklere karşı direnç
genleri taşımaktadır. Bulaşıcı tipteki bu direnç,
daha çok antibiyotiği inaktive eden enzimlerle
olmaktadır. Özellikle hastane gibi yoğun antibiyotik
kullanılan yerlerde direnç genlerini taşıyan
bakterilerde artış görülmektedir.


Transpozonlara Bağlı Direnç : Transpozonlar, bir
DNA molekülünden diğerine geçebilen DNA
dizileridir. Plazmidlerden farkı bağımsız olarak
replike olamamalarıdır. Kromozom veya plazmid
içinde bulunmakta, bunlar arasında yer
değiştirebilmektedir.
Son yıllarda bazı transpozon veya plazmidlerde "
integron " adı verilen ve yeni genlerin kazanılmasını
sağlayan genetik yapılar bulunduğu gösterilmiştir.
Bir bakterinin çok kısa bir süre içinde bir çok
antibiyotiğe birden “çoğul dirençli " duruma
gelişinde bu elementlerin rolü olduğu anlaşılmıştır.

Çapraz Direnç : Belli bir ilaca karşı dirençli olan
bazı mikroorganizmaların, aynı veya benzer
mekanizmalar ile etki eden diğer ilaçlara da dirençli
olması halidir. Bu durum genellikle yapıları benzer
ilaçlar arasında gözlenmektedir. Ancak bazen
tümüyle ilgisiz ilaçlar arasında da görülebilir.
Kromozomal veya ekstrakromozomal orjinli
olabilir.


Yanlış ve gereksiz antibiyotik kullanımı dirence
neden olmaz.Bakterilerde dirence neden olan
genler doğada zaten var olan genetik
yapılardır.İnsanlar bu genlerin varlığından değil, bu
genlerin yayılıp yaygınlaşmasından sorumludur.
Gereksiz, yaygın ve yanlış antibiyotik kullanılması
durumunda duyarlı bakteriler ölürken, mutasyonlar
ile direnç kazanan az sayıdaki bakteri seleksiyona
uğrar.Sonraki infeksiyonlarda sadece bu dirençli
bakteriler ortamda bulunur.

Beta-laktamazlar, beta laktam grubu
antibiyotiklerde beta-laktam halkasının amid
bağlarını parçalayarak etki gösterirler. Kromozomal
ya da plazmid kaynaklıdırlar.


Beta-laktamazlar ilk olarak penisilinleri hidrolize
etmeleriyle tanımlanmıştır. Bundan sonra her yeni
beta laktam grubu antibiyotik kullanılmasıyla bu
tabloya yeni betalaktamazlar eklenmiştir.
Oksimino sefalosporinlerin 1980’ lerin başında
kullanılmasıyla GSBL, 1980’lerin sonlarına doğru
beta laktam/beta laktam inhibitörlerinin yaygın
kullanımıyla inhibitör rezistan TEM enzimleri,
1990’larda sefamisinlerin kullanımıyla plazmid
kaynaklı Amp-C type enzimler, daha sonra da
karbapenemlerin yaygın kullanımıyla
karbapenemazlar ortaya çıkmıştır.

Son yıllarda genişlemiş spektrumlu beta
laktamazlar, inhibitör-rezistan beta-laktamazlar,
AmpC-tipi enzimler ve metallo-beta-laktamaz ve
non metallo-beta-laktamaz tip karbapenemazlarda
oldukça fazla sayıda artış gözlenmiştir

Beta Laktamazların sınıflandırılmasında en çok
Bush-Jacopy-Medeiros ve Ambler sınıflandırmaları
kullanılmaktadır.




Sınıf A: Aktif bölgelerinde serin aminoasiti taşıyan,
penisilinleri hidroliz eden beta-laktamazlardır.
Sınıf B: Aktivite gösterebilmeleri için çinkoya bağlı tiyol
grupları gerektiren metallo-beta-laktamazlardır.
Sınıf C: Kromozomal AmpC geni tarafından kodlanması
nedeniyle AmpC enzimler olarak da adlandırılan
öncelikle sefalosporinazlardan oluşan enzimlerdir.
Sınıf D: Oksasilini hidroliz eden serin betalaktamazlardır.

1995 yılında Bush ve arkadaşları beta laktamazları;
penisilin, oksasilin, karbenisilin, sefaloridin,
genişlemiş spektrumlu sefalosporinler ve
imipeneme karşı hidrolitik spektrumları ve
klavulanik asite duyarlılıklarını esas alarak 4 grup
ve bazı alt gruplarda toplamışlardır.
Bush-Jacopy-Medeiros
(Fonksiyonel Sınıflama)
Ambler (Moleküler Sınıflama)
Grup 1 sefalosporinazlar
Sınıf C sefalosporinazlar
Grup 2 penisilinazlar
Sınıf A penisilinazlar
2a Stafilokokal penisilinazlar
2b TEM-1 ve SHV-1
Betalaktamazlar
2be-ESBL’ler
2br-inhibitör dirençli Betalaktamazlar
2c-karbenisilinazlar
2e-sefalosporinazlar
2f-karbapenemazlar
Grup 2d
Sınıf D kloksasilin hidrolize eden
enzimler
(OXA)
Grup 3 (3a, 3b, 3c)
Sınıf B metallo-beta-laktamazlar
Grup 4
Sınıflanmamış


Bush ve arkadaşları substrat özgüllüğü ve betalaktamaz inhibitörlerine duyarlılığının temel alındığı
fenotipik sınıflandırma ile tüm enzimleri sınıflandırmış
ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarında antibiyogram ile
ilişki kurulabilmesi gibi avantajlar sağlamıştır.
Dezavantajı ise tek bir nokta mutasyonu ile substrat
özgüllüğünün değişebilmesidir.
Bu enzimlerin moleküler sınıflandırılması ise 1980
yılında Ambler tarafından yapılmıştır.Moleküler sınıf A,
C ve D’nin aktif bölgelerinde serin bulunurken, sınıf B’
de ise çinko bulunur. Beta-laktamazların nükleotid
dizilenmesini esas alan bu sınıflama mutasyonlardan
etkilenmemektedir





Karbapenemleri hidrolize eden beta-laktamazlar
karbapenem kullanımına paralel olarak son yıllarda
artan oranlarda bildirilmektedir.
Saptanmaları çok önemli çünkü GSBL (+) se ilk
tedavi seçeneği karbapenemlerdir.
Bu direnç mekanizmalarını edinen bakteriler tüm
karbapenemlere dirençli olacaktır fakat testlerde
duyarlı gözükebilirler.
Plazmid ve integron kökenliler kolayca yayılmakta
infeksiyon kontrolü için saptanmaları gereklidir.
GSBL (+) lerde atlanmamalı!




Karbapenemazlar Ambler sınıflamasında üç grupta
yer alırlar:
Moleküler sınıf A’ daki karbapenemazların aktif
bölgesinde serin iyonu vardır ve klavulanik asit ile
inhibe olur.
Moleküler sınıf B’ de enzimin aktif bölgesi çinko
iyonu içerir ve Metallo-Beta-Laktamaz (MBL) olarak
sınıflandırılan bu grup klasik beta-laktam
inhibitörlerine dirençlidir. Metal şelatörlere ya da
thiol kompenentlerine duyarlıdırlar.
Moleküler sınıf D karbapenemazlar enzimin aktif
bölgesinde serin içerirler, beta-laktamaz
inhibitörlerine zayıf duyarlıdırlar.
Sınıf
Enzim
En sık görülen tür
Sınıf A
KPC, SME,
IMI, NMC,
GES
Enterobacteriaceae
Sınıf B
(metallo-blaktamaz)
IMP, VIM,
GIM, SPM,
IND, NDM1
P. aeruginosa
Enterobacteriacea
Acinetobacter spp.
Sınıf D
OXA
Acinetobacter spp.
Enterobacteriaceae
(OXA-48)
(P. aeruginosa’da nadir)






Serin beta-laktamazlardır
Klavulanik asit ile inhibe olmazlar
İn vitro olarak NaCl ile inhibe olurlar
Karbapenemleri genellikle düşük düzeyde etkilerler
3. Kuşak sefalosporinleri etkilemezler
En sık Acinetobacter spp. Fakat
Enterobacteriaceae’de de yayılmaya başladı


Karbapenem direncinin yanında penisilin ve
aztreonam direnci de mevcuttur. En fazla
tazobaktam olmak üzere diğer beta-laktam
inhibitörlerine duyarlıdırlar.
Meropenemden ziyade imipenem direnci daha
belirgindir. Bu direnci taşıyan suşlarda
karbapenemazların yanında Amp-C tip betalaktamazları ve TEM-1 tip beta laktamazları birlikte
sentezleyebilmelerinden dolayı geniş spektrumlu
bir beta laktam antibiyotik direnci oluşturabilirler



Ambler sınıf B veya Bush grup 3’ de yer alan
karbapenemazlar MBL olarak bilinirler, klinik açıdan
en önemli karbapenemazlardır.
Metallo beta laktamazlar, diğer beta
laktamazlardan farklı olarak aktif bölgelerinde
çinko iyonu bulunan enzimlerdir.
Bu enzimler klavulanik asit, tazobaktam, sulbaktam
gibi klasik beta laktamaz inhibitörlerinden
etkilenmezler ama EDTA (etilen diamin tetra
asetikasit) gibi bir metal şelatörü ile inaktive
olurlar.

Bu enzimlerin en önemli özelliği monobaktamlar
dışında tüm beta-laktamları ve karbapenemleri
hidrolize edebilmeleridir.


1960 yılında ilk olarak metallo beta laktamaz
enzimi Bacillus cereus’ta tanımlandı, sonra 1980’ li
yılların başında Stenotrophomonas maltophilia’da
gösterildi.
Daha sonra imipenemi hidrolize eden metallo beta
laktamaz enzimi Bacillus fragilis ve Aeromonas
hydrophiliada da tanımlandı.



Aktarılabilir metallo beta laktamaz enziminin
bulunmasıyla karbapenemlere direnç gelişimi ile
ilgili endişeler artmıştır.
Metallo beta laktamazları kodlayan genler genelde
klas1 (bazen klas3) integronlarca taşınıp, sonra
transpozonların içine yerleştirilip yüksek derecede
aktarılabilir bir genetik araç elde edilir.
Ayrıca integron içindeki başka gen kasetleri,
aminoglikozid direncine neden olarak bu
antibiyotiklerin alternatif tedavide kullanımını
engeller.



Aminoasid dizilim homolojisini araştırılarak yapılan
çalışmalarda 4 tip MBL saptanmıştır. Bunlar IMP,
VIM, SPM ve GIM tipi MBL’ dir.
Ayrıca MBL’ler imipenem ve diğer beta laktamları
hidrolize etme temeline göre alt gruplara ayrılmıştır
(alt grup 3a, 3b, 3c)
Grup 3a’ da imipenem ve penisilinler güçlü,
sefalosporinler zayıf hidrolize olur. 3b enzimleri
gerçek karbapenemazlardır. Çünkü karbapenem
hidrolizi spesifiktir.





Metallo beta laktamazların moleküler düzeyde
sınıflanması ve standardize edilmesi oldukça
zordur.
Bu enzimler üç alt sınıfta gruplandırılmıştır.
Sınıf B1: çinko iyonuyla birleşecekleri aktif
bölgelerinde üç histidin, bir sistin aminoasidi
içeren enzimlerden oluşur. Bu grup içerisinde
transfer edilebilen IPM, VIM, GIM ve SPM-1
enzimleri bulunur.
Sınıf B2: Bu enzimlerde ise birinci pozisyonda
histidin yerine asparajin bulunur. Bu gruba örnek
olarak SFH–1 enzimi verilebilir.
Sınıf B3: Tetramer yapısındaki L1 enzimi bulunur.



Bütün metallo beta laktamazların inaktivatörü
olarak EDTA (diaminotetra asetik asit) , 10phenanthrolin ve dipikolinik asit rapor edilmiştir.
Dipikolinik asit (özellikle Enterobacteriaceae) Tiyol
bileşikleri (öz. Acinetobacter)
◦ Merkaptopropiyonik asit (MPA)ve merkaptoasetik
asit (SMA)
Metallo beta laktamaz enzimi üreten bakteriler ile
oluşan infeksiyonların tedavisinde beta
laktam/beta laktamaz inhibitör kombinasyonlarının
kullanılması tedavide etkili olmamaktadır.


Metallo beta laktamaz enzimlerinin yapılarındaki
aktif bölgelerin farklılığından dolayı bütün MBL
enzimlerine etkili olabilecek tek bir inhibitörün
bulunması oldukca güçtür.
B-laktamaz inhibitörü olan klavulonik asit düşük
toksisiteye sahip ve memeli hücreleri ile
etkileşmezken MBL enzim inhibitörleri ile ilgili
diğer önemli sorunda MBL lerin aktif bölge
yapılarının memelilerdeki hücresel fonksiyonlarda
yaşamsal önemi olan enzimlerle benzer özellikte
olmasıdır.


MBL inhibitörü olarak çok çeşitli, yapısal olarak
farklı bileşikler incelenmiş bunlarla ilgili çeşitli
çalışmalar yapılmıştır;
Tiyoester türevleri, triflorometil alkolleri,
ketonlar, tiyoller, sülfonil hidrozonlar, trisiklik
doğal ürünler, süksinik asit türevleri, bifenil
tetrazoller, sisteinilpeptidler,
merkaptokarboksilatlar, 1-β metilkarbapenem,
sefotetan, tiyoksi- sefalosporinler ve penisilin
türevleri sayılabilir


Yeni geliştirilen bileşikler beta laktam yapısı
çevresinde sentez edilmektedir ve bu bileşikler
farmokokinetik açıdan daha umut verici olabilirler.
Tedavi edici olarak, klinikte kullanılabilen βlaktamlar (örneğin aztreonam), kompetatif
inhibisyona bağlı potansiyel bir MBL inhibitörü
olduğu için ayrıca önerilebilir



Bakterilerde MBL enzim genlerinin tespit edilmesi
GSBL’ nin erken tespiti kadar önemlidir.
MBL enzimi taşıyan bakterilerin tanımlanmasında
çeşitli fenotipik yöntemler kullanılmaktadır.
MBL üreten etkenle infekte hastaların optimal
tedavisi için bu direncin tanınması ve yayılmasının
kontrol edilebilmesi gerekmektedir. Ancak halen
CLSI’ ın önerdiği bir tarama testi bulunmamaktadır.



Örneğin; Enterobacteriaceae’ların çoğu ve bazı
Acinetobacter spp türleri MBL enzimi taşıdığı halde
1–2 μg/ml imipenem MIC değerleri ile duyarlı
görünecektir.
Bu nedenle MBL tespitinde tarama plağı
uygulamasında bakteri türü dikkate alınmalıdır.
. Örneğin Pseudomonaslar,
Enterobacteriaceae’lardan daha yüksek
karbapenem MIC değerlerine sahiptir.



Hodge ve arkadaşları N. gonorhoeae’de penisilinaz
aktivitesinin gösterilmesi için Hodge testini
kullanmışlardır.
Lee ve arkadaşları ise MBL enziminini saptamak için
Modifiye Hodge testini geliştirmişlerdir.
Bu test için imipenem hassas E. coli ATCC 25922
kökeni, imipenem diski ( 10 μg ) ve test edilecek
bakteri kökeni gerekmektedir. MHA yüzeyine 0.5
McFarland’ı ayarlanmış, bir gece inkübasyona
bırakılmış standart E.coli kökeni kültür
süspansiyonunun ekimi yapılır, plak kuruyunca
ortasına 10 μg imipenem diski yerleştirilir.

İmipenem diskinin tam kenarından başlanıp dışa
doğru doğrusal olarak imipenem dirençli suşun
ekimi yapılır. Bir gecelik inkübasyon sonrasında
inhibisyon zonunda yonca yaprağı şeklinde
bozulmanın olması MBL pozitifliği olarak kabul
edilir.
Modifiye HodgeTesti
ATCC
25922
E.coli
Klinik
izolat
Pozitif
kontrol
Klinik
izolat
Negatif
kontrol


Kombine disk testi: Plak içerisine yerleştirilen 2
imipenem diskinden bir tanesine EDTA eklendikten
sonraki inhibisyon zon çapı farkına göre
değerlendirmenin yapıldığı testtir.
EDTA solüsyonunun eklendiği imipenem/EDTA
diskinin inhibisyon zonu tek başına imipenem diski
zon çapından ≥ 7 mm büyük ise MBL pozitif
bakteri izolatı kabul edilmektedir.


Çift disk sinerji testi: Amaç imipenem inhibisyon
zonunun EDTA varlığında genişleyip
genişlemediğini tesbit ederek MBL pozitif bakteri
izolatlarını tanımlamaktır.
İmipenem diski ve merkezinden 10mm uzağına
daha önce hazırlanan boş disk yerleştirilerek
yapılan testtir. Boş disk üzerine EDTA eklendikten
sonra imipenem diski inhibisyon zonunun EDTA
eklenmiş boş diske doğru genişlemesi sinerjistik
inhibisyon zonu olarak değerlendirildi.


Test stribinin bir tarafında imipenem diğer
tarafında ise imipenem ve EDTA bulunmaktadır.
İmipenem MİK değerinin EDTA’nın olduğu taraftaki
MİK değerinden 8 kat yüksek ve üzerinde bir değer
olması ya da fantom zonunun görülmesi MBL
pozitifliği olarak değerlendirilir.