Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler-4

15.3.2016
DNA’nın restriksiyon enzimleriyle
(RE) kesilmesi
Moleküler Biyolojide Kullanılan
Yöntemler-4
• Günümüzde 500 den fazla RE ticari olarak
üretilmektedir.
• RE’ler genellikle 10 U/ul konsantrasyonda satışa
sunulmaktadır.
• 1 U RE aktivitesi, uygun koşullar altında 1 ug DNA’yı 1
saatte kesebilen enzim olarak tanımlanmaktadır.
• RE’lerin büyük çoğunluğu %50 gliserol içeren
tamponlarda ve -20 C de saklanır.
• Enzim kullanılacağı zaman derin
dondurucudan buz kabına alınmalı, işlem
bitiminde hemen derin dondurucuya
konulmalıdır.
• Enzimlerin aktif olarak çalışacağı koşulları
sağlayan özel tamponlar üreticiler
tarafından enzimle birlikte verilmektedir.
• Bu tamponlar genellikle 10x
konsantrasyondadır ve kullanım sırasında
1x şeklinde sulandırılır.
DNA’nın RE’leri ile kesilmesi
• İzole edilen DNA, RE enzimleri ile kesime
bırakılmadan önce jel elektroforezi ile analiz
edilmelidir.
• 20 ul reaksiyon karışımı içerisinde 0.2-1 ug DNA
bulunmalıdır. DNA konsantrasyonu fazla ise reaksiyon
karışımının hacmi artırılmalıdır.
• Kesim reaksiyonunun kullanılması için çeşitli
yöntemler kullanılabilir. Yöntemin seçiminde örnekle
ilgili olarak bir sonraki aşama göz önüne alınmalıdır.
1
15.3.2016
• Eğer örnek jel elektroforezi ile analiz edilecekse kesim
reaksiyonu, sadece yükleme tamponu ile durdurulur.
• Eğer örnek ligaz etkisinde bırakılacaksa, RE kesinlikle inaktif
hale getirilmelidir.
• RE’lerinin çoğu 65 C’de 10-20 dak tutulduğunda inaktif hale
geçer.
• Üretici firmaların aynı enzim için önerdikleri inaktivasyon
sıcaklığı ve süresi farklı olabilir. Bu farklılık enzimin içinde
bulunduğu tamponun iyon kuvvetinden ileri gelmektedir.
• Reaksiyon durdurucu olarak EDTA’da
kullanılabilir. Kesimde kullanılan RE, Mg
iyonunu kofaktör olarak kullanır ve herbir
EDTA molekülü 2 Mg2+ iyonu bağlar
• RE kesimi sonucu elde edilen DNA parçalarının
kontrolü, boyutları bilinen standart DNA
fragmentleri kullanılarak jel elektroforezi ile
yapılmaktadır.
Plazmit DNA’sının kesimi
Reaksiyon karışımı
• Plazmid DNA’sı (0.5- 2 ug)
• 10x reaksiyon tamponu
• 1 U enzim ( EcoR1 ve/veya Hindlll
Yöntem
1) Reaksiyon karışımı 37 C de 1 saat bırakılır.
Genellikle fazla miktarda enzim veya uzun süre inkübasyona
bırakmak herhangi bir problem yaratmaz. Bu nedenle bu
koşullarda 1 saatlik süre kesilme için yeterli olmakla beraber
ortamdaki DNA nın tamamının kesilmesini sağlamak için 1
gece de inkübasyona bırakılabilir.
• 2) enzim aktivitesi, reaksiyon karışımının 10-15
dak, 65 C de tutulmasıyla veya son
konsantrasyon 10 mM olacak şekilde 0.5 M
EDTA (pH 7.5) eklenmesiyle durdurulur.
2
15.3.2016
DNA’nın jelden geri alınması
• DNA nın jelden geri kazanılmasına yönelik oldukça farklı
yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerle istenilen boyuttaki
DNA fragmentlerini saf olarak elde etmek veya DNA yı
herhangi bir aşamada saflaştırmak olasıdır.
• Büyük fragmentlerin jelden geri
kazanılmasındaki güçlük: Genellikle 5 kb’dan
daha küçük fragmentlerin geri kazanımı
başarılı olurken büyük fragmentler aynı başarı
ile izole edilemezler.
• Düşük konsantrasyonda DNA kullanımı: Eğer
az miktarda DNA jele yüklenmişse geri kazanım
işlemleri sırasında önemli kayıplar
olabileceğinden 500 ng dan az miktardaki DNA
ile işleme başlamamak yararlı olur.
• 2) Düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz
kullanılarak saflaştırma: Agaroza hidroksietil
grupları eklenerek yaklaşık 30 C de donması ve
65 C’nin altında erimesi sağlanır. Bu özellikte
agaroz kullanılarak istenen DNA yı içeren jel
parçası kesilip eritildikten sonra
fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol
çöktürmesi sonucunda DNA saf olarak elde
edilebilir.
Bununla beraber uygulamada başarılı sonuç
alınmasını güçleştiren bazı noktalar vardır.
Bunlar:
• Saf olmayan agaroz kullanımı: DNA’nın jelden
geri kazanılması sırasında agaroz içindeki
yabancı maddelerin DNA solüsyonunda
bulunması sonraki aşamalarda kullanılacak
olan enzimleri inhibe etmektedir. Fakat
günümüzde oldukça saf olarak üretilen agaroz
kullanımı ile bu problem ortadan kaldırılmıştır.
DNA’nın jelden geri kazanılmasına yönelik
geliştirilmiş yöntemler:
• 1) Ticari olarak üretilen küçük sefarasil
kolonlarla yapılan saflaştırma: Üretici
firmanın önerdiği tamponlar kullanılarak
istenilen boyuttaki DNA yı içeren jel
parçaları kolona yüklenir ve DNA’nın
kolona bağlanması sağlanır.
• Daha sonra elüsyon tamponu kullanılarak
DNA kolondan geri alınır.
• 3) DNA fragmentlerini içeren agaroz parçası,
içinde yürütme tamponu bulunan diyaliz
tüpüne konur ve elektriksel alana bırakılır.
DNA nın jelden ayrılıp tampona geçmesi için
bir süre beklenir.
• DNA nın tamamının diyaliz tüpündeki
tampona geçip geçmediği UV ışık altında
zaman zaman kontrol edilir. Daha sonra
Etidium bromürün izoamil alkol kullanılarak
uzaklaştırılması ile DNA saf olarak elde edilir.
3
15.3.2016
• 4) “Gene Clean” yöntemiyle DNA nın jelden geri
kazanılması: Oldukça başarılı bir yöntemdir
RNA izolasyonu ve analizi
• DNA nın içinde bulunduğu agaroz jel eritilir ve toz
halinde cam boncuk solüsyonu örneğe eklenir. DNA
cam boncuklara yapışır, diğer maddeler santrifüjleme
ile uzaklaştırılır.
• Daha sonra, DNA elüsyon tamponu ve distile su
kullanılarak cam boncuklardan ayrılır ve etanol ile
çöktürülür.
Genetik bilgi akışının moleküler
işlemleri 3 basamağa ayrılır
Genler ve genetik kod
Gen: DNA’nın genetik bilgiyi taşıyan bölümleri. Bütün genler DNA’dan oluşur.
1 replikasyon
• Bir gendeki bilgileri A,G,T,C bazlarının sıralanışı belirler.
2) Transkripsiyon (kopyalama): DNA bir ara molekül
olan RNA aracılığıyla protein sentezinde rol
oynar. Bilgilerin RNA’ya dönüşümüne
transkripsiyon denir. Bir veya birden fazla
polipeptiti şifreleyen RNA molekülüne de Elçi
(mesajcı) RNA (mRNA) denir.
• DNA’da bulunan bilgiler RNA’ya taşınır ve RNA aracılığı ile proteinlere
dönüştürülür
Moleküler biyolojinin
santral dogması
• Bazı genler Transfer RNA (tRNA) ve ribozomal
RNA (rRNA) sentezi için gerekli bilgileri içerirler.
Bunlar protein sentezinde rol oynarlar ancak,
protein yapacak genetik bilgileri kodlamazlar.
• DNA, RNA ve proteinlerin 3’ü de genetik bilgi içerdiğinden bilgi
makromolekülleri olarak isimlendirilirler.
21
Genetik kod
3) Translasyon (tercüme): mRNA’daki bilgiyi kalıp
olarak kullanarak protein sentezleme
• Bir protein zincirindeki amino asitlerin sırası, mRNA’daki bazların özel dizilişi
tarafından tanımlanır.
• Bir proteinin amino asit sırası ile bir genin baz sırası arasında doğrusal bir
ilişki vardır.
Translasyon işlemi mRNA ile
olduğundan, genetik kod DNA
olarak değilde mRNA olarak
yazılır
• bir mRNA molekülü üzerindeki her 3 baz bir amino asidi kodlar . Amino
asitleri kodlayan bu 3’lü bazlara Kodon denir.
mRNA’nın muhtemel 64 (43)
kodonu bulunmaktadır.
22
Ancak bunlardan 61’i a.a’leri
kodlamaktadır. 3 kodon a.a
kodlamaz. Bunlar stop
kodonudur.
Genetik kodun en ilginç özelliği bir
amino asidin farklı kodonlar tarafından
kodlanmasıdır.
• Her bir kodon özel bir aminoasidi kodlar
• Genetik kod protein kodlayan sistemle proteine dönüştürülür. Bu sistem
ribozomlar (protein ve rRNA’dan oluşur), tRNA ve çeşitli enzimlerden oluşur.
23
Bu nedenle herhangi bir yerdeki
aminoasit bilindiğinde bu yerdeki
kodonun otomatik olarak bilinmesi
sözkonusu değildir.
Diğer yandan DNA dizisini ve
doğru okuma zincirini bilerek
proteindeki aminoasit
belirlenebilir
24
4
15.3.2016
PROTEİN SENTEZİ
• Canlı bir hücrede pek çok metabolik olay ve reaksiyon proteinler
tarafından yürütülür
• Proteinler yapısal eleman olarak da önem taşırlar
Kan plazma proteinleri
Hormonlar
Antikorlar
Enzimler
Kloroplast
Mitokondri
Hücre duvarında yer alan proteinler vb yapısal ve işlevsel protein
gruplarıdır
• Bu durum DNA dizisinden aminoasit dizisini
belirlemeye müsaade eder ve genetik devrin
kalbini oluşturur.
25
26
Protein sentezi
• Protein sentezi çok karmaşık bir olay olmakla birlikte çok hızlı
gerçekleşir. Örn E.coli ribozomlarında 100 amino asitlik bir
polipeptit zinciri 5 sn’de sentezlenir.
Ribozomlar
• Genç bir hücre içinde 5.000-50.000 arasında bulunan
ribozomlarda aynı anda yüzlerce, binlerce proteinin
sentezlenmesi söz konusudur.
• Ribozomların translasyon için seçicilikleri yoktur , hangi genetik bilgi
gelirse onun çevirisini yaparlar.
• mRNA üzerindeki 3’lü baz dizilerinin belli bir düzene göre okunduğu
ve aminoasit diline çevrildiği yer ribozomlardır. O nedenle
ribozomlar tercüme bürolarına benzetilir.
• Hücrede bulunan proteinlerin ne zaman ve hangi miktarda
sentezleneceği diğer moleküller tarafından kontrol altında
tutulduğundan bu karmaşık olaya temel komponentler yanında
yüzlerce molekül ve faktör katılmaktadır
• Ribozomlara bilgiyi getiren mRNA üzerinde bulunan ve herbiri bir
aminoasidi belirleyen kodonlar ile doğru aminoasitler arasındaki
ilişkiyi kuran adaptör moleküller ise tRNA’lardır.
• Kısaca kodonlar ile aminoasitlerin doğru buluşmalarını ribozomlar
sağlar.
27
•
Ribozomlar hücre yapıları içinde en
karmaşık ve anlaşılması en zor
organellerden biridir.
•
Temel olarak RNA ve proteinlerden oluşan
ribozomlar oldukça ayrıntılı
düzenlenmişlerdir.
•
Ribozomal proteinlerin oranları hem çok
yüksektir (%60) hem de çeşitleri çok
fazladır.
•
Prokaryotlarda 52, ökaryotlarda ise en az
82 farklı protein bulunmaktadır.
•
Prokaryotik ve ökaryatik ribozomlarının
büyüklük ve sayıları farklı olmakla birlikte
temel yapıları benzemektedir.
•
Her iki tip te bir büyük bir de küçük alt
birim içermektedir.
28
• Ökaryotlarda 80S, prokaryotlarda ise 70S ribozomlar
tanımlanmıştır
PROKARYOTLAR (70 S ribozom)
ÖKARYOTLAR (80S ribozom)
Büyük alt birim
(50S)
Küçük alt birim
(30S)
Büyük alt birim
(60S)
Küçük alt birim
(40S)
23S rRNA (2904
nükleotit)
+ 31 protein
16S rRNA (1541
nükleotit)
+ 21 protein
28S rRNA (4718
nükleotit) + 49
protein
18S rRNA (184
nükloetit)
+ 33 protein
5S rRNA (120
nükleotit)
29
5.8S rRNA (120
nükleotit)
S: Svedberg
unitesi (10-13 sn
30
5
15.3.2016
Transfer RNA
• Translasyonda doğru aminoasitleri
ribozomlara getirmekle görevli tRNA’lar farklı
aminoasitleri taşır.
• Her aminoasit (a.a) için en az bir tRNA
molekülü görev yapar.
• Bazı a.a’ler için iki,üç veya dört tRNA bulunur.
• Sedimantasyon katsayıları 4 S’tir
• Hücrede bulunan en küçük
nükleik asitlerdir (73-93
nükleotit).
• Molekülün %50-70’lik bölümü
bazlar arası hidrojen köprüleri
kurarak çift zincirler
oluşturmaktadır.
• Prokaryotlarda yaklaşık 60,
ökaryotik hücrelerde 100-110
farklı tRNA bulunmaktadır.
31
RNA izolasyonu ve analizi
32
• Hücrelerdeki toplam RNA,
 bakterilerde toplam hücre ağırlığının %6’sını,
 gelişmiş yapılı canlılarda ise %1’ini kapsamaktadır.
• Örneğin, tipik bir memeli hücresi yaklaşık 10-15 g total RNA
içerir. Bu miktarın;
 %80-85’i rRNA’ ya (28S, 18S ve 5S rRNA) aittir.
 Kalan %10-15’lik miktar ise düşük moleküler ağırlıklı
RNA türlerini (tRNA, nükleusa ait küçük RNA’lar)
içermektedir.
• mRNA ise total RNA’nın %1-5’ini kapsayan, boyutları ve dizisi
birkaç yüz bazdan birkaç kb’a kadar değişen bir heterojenlik
göstermektedir.
• Parçalanmamış ve temiz RNA izolasyonu,
klonlama ve gen anlatımı çalışmalarında oldukça
önemli aşamalardan biridir.
• Herhangi bir hücre tipinden izole edilen toplam
RNA’dan mRNA’ nın izolasyonu ve bu işlemi
takiben komplementer DNA (cDNA) elde etmek
mümkündür.
• Böylece istenen dokudan cDNA kitaplığı
oluşturulabilir ve istenen gen klonlanabilir.
• RNA çalışmalarının tümünde başlıca ön koşul
yapısını koruyan parçalanmamış (intact) RNA’nın
izolasyonudur.
• İzolasyon sırasında en fazla karşılaşılan problem,
aktivitesini uzun süre koruyan, ribonükleaz (RNaz)
kontaminasyonudur.
• Çok az miktarlarda RNaz varlığı bile RNA’ nın
bütün olarak eldesini engelleyebilmektedir. Bu tür
sorunlardan kurtulmak için çözeltiler, cam ve
plastik eşyalar özel yöntemlerle hazırlanmalı ve
steril edilmelidir.
6
15.3.2016
• RNaz özellikle çalışanın ellerinden bulaştığı için RNA
izolasyonu sırasında kesinlikle eldiven giyilmelidir.
• Tartımlarda daha önce elle tutulmuş spatül gibi araçların
kimyasalların içine sokulması bile RNaz kontaminasyonuna
yol açtığından, bunların cam eşyalar gibi fırında steril
edilmesi gerekmektedir.
• Kirli cam eşya ve yüzeylerle temas edilmişse eldivenler
değiştirilmelidir.
• Cam eşyalar 180 oC’de 8 saat veya 300 oC’de 4 saat
tutularak, ya da kloroform ile yıkanarak RNaz’ın
inaktivasyonu sağlanabilir.
• İzolasyonda kullanılacak çözeltiler RNaz’ın aktivitesini yok
eden dietil pirokarbonat (DEPC) ile hazırlanmalıdır.
• Bazı cam eşyalar, içinde %0.1 oranında çözünmüş DEPC
bulunan su ile doldurularak 2 saat 37 oC’de bekletilir.
• Bununla birlikte, Tris,DEPC’ yi inaktive ettiği için Tris içeren
çözeltiler DEPC ile hazırlanmamalıdır. Çözelti
hazırlanmasında kullanılan tüm kimyasalları mümkünse
sadece RNA çalışmalarına ayırmak en kesin yoldur.
• Daha sonra birkaç kez steril distile su ile yıkanır ve 15 dak
otoklavlanır. Bu işlem DEPC’nin uzaklaştırılması için
gereklidir.
RNA izolasyon aşamaları
1. RNA izolasyonu protokollerinin tümünde ilk
aşama hücre çeperinin ve membranının
parçalanmasıdır.
2. Daha sonra hücre lizatının sentrifüjlenmesi ile
RNA diğer hücresel moleküllerden ayrılır.
3. RNA’ nın saflaştırılmasında proteinler ve
ribonükleazların denatürasyonunu solvent
ekstraksiyonuyla yapılır.
 Hücre komponentleri, fenol içeren solventlerle ayrılır.
Setrifügasyonla 3 faz oluşur:
-en altta organik faz (proteinler, lipitler
-ortada DNA
- en üstte ise RNA bulunur
4. RNA içeren sıvı faz çeşitli RNA’ lar alkol ve tuz ile
çöktürülür:
 mRNA 0.1 M NaCl ve % 70 etanolde;
rRNA 3M sodyum asetat ve % 70 etanolde;
 tRNA ise 1M NaCl ve % 66’ lık soğuk etanolde
çöktürülür.
Yöntem
1. 10 ml E.coli kültürü 12.000xg’ de 4 oC’ de 5 dak santrifüj edilir.
Bakterilerden Total RNA izolasyonu
Gram (-) bakterilerden total RNA izolasyonu
Organizma : E. coli
Gerekli malzemeler
Protoplast tamponu, pH 8.0
Tris-HCl
15 mM
Sakkaroz 0.45 M
EDTA
8 mM
Lizozim
50 mg/ml
Lizis tamponu, pH 8.0
Tris-HCl 10 mM
NaCl
10 mM
Sodyum sitrat 1mM
SDS
% 1.5
DEPC’ li su
2. Hücre çökeltisi 10 ml protoplast tamponu içinde çözündürülür ve
80 l lizozim (50 mg/ml) eklenerek 15 dak buz içinde tutulur.
3. Protoplastlar 5.900xg’de 4 oC’ de 10 dak sentrifüjlenerek
çöktürülür ve 0.5 ml lizis tamponunda çözündürülür.
4. 15 l DEPC eklenerek karıştırılır ve mikrosentrifüj tüpüne
aktarılır, 5 dak 37 oC’ de bekletilir ve daha sonra buz içinde
soğutulur.
DEPC 0.2 ml
Distile su
NaCl ile doyurulmuş DEPC’li su
NaCl
40 g
7
15.3.2016
5. 250 l NaCl ile doyurulmuş DEPC’ li su eklenerek 10 dak
buz içinde tutulur.
oC’de mikrosentrifüjde yüksek
6. 10 dak, 4
dev/dak) sentrifüj edilir.
hızda (14.000
7. Üst sıvı 2 mikrosentrifüj tüpüne eşit hacimde aktarılır. Her
bir tüpe 1 ml soğuk (-20 oC) saf etanol eklenir ve bir gece -20
oC’ de bekletilir.
8. 15 dak yüksek hızda (14.000 dev/dak) 4 oC’de
sentrifüjleme sonucu elde edilen çökelti 500 l soğuk % 70’
lik etanol ile yıkanır ve havada kurutulur.
9. Çökelti 100 l DEPC’ li suda çözündürülür.
Yöntem
Gram (+) bakterilerden Total RNA izolasyonu
Organizma: B. subtilus
Gerekli Malzemeler:
Lizis tamponu, pH 7.4
Tris-HCl pH 7.4 30 mM
NaCl
100 mM
EDTA
5 mM
SDS
%1
Proteinaz K
100 g
Fenol/kloroform/izoamil alkol 25:24:1
Kloroform/izoamil alkol
24:1
NaCl
5M
Saf etanol
Etanol
% 70
DNA parçalama tamponu pH 8.0
Tris-HCl pH 7.0 20 mM
MgCl2
10 mM
2.5 mg/ml DNaz I (RNaz içermeyen)
TE tamponu, pH 8.0
DEPC’ li su
1.10 ml B. subtilus kültürü 12.000xg’ de 4 oC’ de 5 dak sentrifüj edilir.
7. 15 dak 4 oC’de yüksek hızda sentrifüjleme sonrası oluşan çökelti 500 l soğuk
% 70’lik etanol ile yıkanır ve havada kurutulur.
2. Çökelti 0.5 ml lizis tamponunda çöktürülür, mikrosentrifüj tüpüne aktarılır ve
kuru buz üzerinde dondurulur.
8. Çökelti 95 l DNA parçalama tamponunda çözdürüldükten sonra ve 4 l
DNaz I eklenir ve 60 dak 37 oC’de bekletilir.
3. Örnek çözündürüldükten sonra 3 kez 10’ar sn mikrotip sonikatör ile 30W’ da
köpürmeye izin vermeden sonikasyon gerçekleştirilir ve 60 dak 37 oC’ de
bekletilir.
9. Eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek ekstraksiyon yapılır.
Üst faz yeni tüpe alınır. Alt faza 100 l TE eklendikten sonra 5 dak oda
sıcaklığında sentrifüjleme yapılır. Üst faz bir önceki üst faz ile birleştirilir.
4. Eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek karıştırılır. Daha sonra
karışım oda sıcaklığında 5 dak yüksek hızda sentrifüjlenir. Üst faz yeni bir
mikrosentrifüj tüpüne aktarılır.
10. Bu sıvı, kloroform/izoamil alkol ile ektrakte edilir. Yeni üst faza 10 l 5M
NaCl ve 600 l soğuk saf etanol eklenerek bir gece –20 oC’de bekletilir.
5. Önce eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol ile bir kez, daha sonra eşit
hacimde kloroform/izoamil alkol eklenerek ekstraksiyon yapılır.
6.Toplam 400 l üst faza 15 l 5 M NaCl eklenir ve tüp soğuk saf etanol ile
dondurulup karıştırılır, -20 oC’de bir gece bekletilir.
11. 30 dak 4 oC’de yüksek devirde sentrifüjleme sonucu elde edilen çökelti 500
l soğuk % 70’lik etanol ile yıkanarak havada kurutulur. 100 l DEPC’ li suda
çözündürülür.
RNA’nın analizi
• Spektral yöntemler
• RNA’nın konsantrasyonunun saptanmasında
kullanılan spektrofotometrik yöntemler
DNA’nın spektral analizi ile tamamen aynıdır
Elektroforetik yöntemler
• RNA’nın analizinde formaldehit-agaroz jeli
kullanılır.
Bu jelde yükleme hacmi arttırılabilir
Ayrıca çözünme gücü daha yüksektir.
RNA’nın doğrusal biçimde kalmasını sağlar
• RNA, DNA agaroz jellerinde olduğu gibi
etidium bromürle boyanır.
8
• Parçalanmamış toplam RNA jel üzerinde
oldukça belirgin 28S (veya 23S) ve 18S (veya
16S rRNA bantlarına sahiptir.
Parçalanmış RNA
15.3.2016
• 28S rRNA bantı 18S rRNA bantının yaklaşık 2
katı kadar daha yoğun bir parlaklık oluşturur.
• Bu 2:1 oranı toplam RNA’nın parçalanmadan
elde edildiğinin en kesin göstergesidir.
• Kısmen parçalanmış RNA ise bulutumsu yaygın
bir görüntü verir.
9