gen_muh_ders-2

BĠY 4008
GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE
GĠRĠġ
Doç. Dr. Nurettin YÖREK
DNA ile çalıĢırken göz önünde bulundurmanız gereken
temel özellikler:
DNA basit bir moleküldür. Gerçekten! Sadece A, T, C ve G
nükleotidlerini içerir . Bu ne demektir? AraĢtırma yaparken
„önceden tahmin edebilmek‟ demektir.
• DNA negatif yüklüdür. Elektronların büyük bir çoğunluğu
oksijen gruplarının etrafında dolanırlar.
• DNA çok sayıda halka yapısına sahiptir. Pi orbitali gibi
Ģeyleri ya da polar ve nonpolar bağlar arasındaki farkı
hatırlıyor musunuz?
• Asıl konu Ģudur ki; halka yapıları oldukça
• hidrofobiktir.
DNA çok dayanıklı bir moleküldür. Örnek tüpünüzü
düĢürdünüz mü? Muhtemelen bir sorun yoktur. Hafta sonu
boyunca oda ısısında bıraktınız mı? Sorun değil. Genellikle
çalıĢılması en kolay olan biyolojik makromoleküldür.
DNA çalışmaları pek çok ihtiyaç gerektirir. Bu molekülle ne
çalıĢtığınıza bağlı olarak bir çok Ģeye sahip olmalısınız. Bu sey
bir prosedür ya da spesifik bir enzim yada techizat olabilir.
UNUTMAYIN!!!
Bazı genel kurallar bütün DNA deneylerinde geçerlidir
•
Deneyi iyi bilmek. BaĢka bir Ģekilde söylemek gerekirse, prosedürünüzün
kimyasını bilmeniz gerekir. Bu, dikkat derecenizi ölçmeye yarar ve etkinliğinizi
yansıtır.
•
Örneğinizi olabildiği kadar saf elde edin. ġunu aklınızdan çıkarmayın:
Herhangi bir safsızlık birçok soruna davetiye çıkarır. Eğer kontaminasyonunuz
varsa takip eden aĢamalarınızda kötü sonuçlar elde edebilir hatta örneğinizi bile
kaybedebilirsiniz. DNA nükleazları sevmez ve nükleazlar her yerdedir.
•
Mümkün olduğunca her zaman dikkatli ve nazik olun. Deneyleri yaparken
dikkatli olun. Örneğin, her Ģeyi soğukta tutun çünkü enzimler fizyolojik
sıcaklıklarında daha çok aktiftir (soğuk buz kullanın). Eldiven giyin. DNA‟yı hızlı
vorteklemeyin ya da kuvvetli bir Ģekilde pipetaj yapmayın. Mutlaka önlük giyin.
Lab. da birĢeyler yemeyin. ……………..
•
•
Molekülünüzün özelliklerini çok iyi bilin. Molekülünüze herhangi bir
uygulama yaparken bilinçli olmanız lazım. Örneğin, genomik DNA plazmid
DNA‟sından PCR ürününden ya da EST fragmentinden farklıdır.
•
Gerçekten ihtiyacınız olan malzemelerin miktarlarını dikkatlice
düşünün. Küçük miktarlarla çalıĢmak genellikle daha kolaydır ve DNA
çalıĢmalarında miktarlar hep çok küçüktür. Yani eğer biliyorsanız, çok
fazlasına ihtiyacınız yoktur, o miktar yeterlidir.
GENOMİK DNA: Ne ve Neden?
Genomik DNA nedir?
• Aslında anlaĢılmaz bir terim gibidir fakat bir
hücredeki, organeldeki ve/veya virüsteki
bütün genleri içeren DNA örneği demektir.
Genomik DNA büyüktür, komplekstir ve sulu
ortamlarda visköz görünür.
Neden genomik DNA elde ediyoruz?
•
Profilleme/Fingerprinting: Kan/sperm örneklerini karĢılaĢtırmak
adli bilimlerde kullanılan bir metottur.
•
Yeni bir gen klonlamaya ilk adım
Karakterizasyon/Tanımlama. Temel araĢtırmada birçok örnek vardır. Mesela
transgenik/knockout bir organizma yapıyorsunuz ve modifikasyonun gerçekleĢip
gerçekleĢmediğini kontrol etmeniz gerekir. Ġlginç bir fenotip elde ettiniz ve daha derine
bakmak istiyorsunuz.
Gen ifadesi ve regülasyonunu araştırmak
Genomik DNA izolasyonu : Hücre lizizi
•
Hücreleri hazırlayın. Soğukta tutun. Herhangi bir fiziksel Ģart gerekirse
sağlayın. Örnek olarak oldukça sert bir doku ile (mısır bitkisi gibi)
çalıĢıyorsanız. Ġçerisinde sıvı azot bulunan havan ve havan tokmağı
kullanacaksınız. Akılda tutmanızda yarar vardır; bu aĢama hücreleri
lizise etmekten ziyade, bitki hücrelerinin duvarlarını yıkmaya yöneliktir
ve böylece hücreler serbest kalır.
•
Sonra hücre içinde bulunan DNA‟yı almak için hücreleri lizis edin.
Devam eden iĢlemlerde DNA‟ya daha rahat ulaĢırsınız.
Hücreleri Ģunlarla lizise edin:
•
•
•
•
•
•
Tris (tamponlama maddesi pH 6-8)
EDTA DNase aktivitesi için gerekli kofaktörler olan divalent katyonları
Ģelatlar (nükleazları kapatma yolu)
NaCl fizyolojik Ģartlarda (genellikle 100-150 mM olması gerekir). Bütün
molekülleri mutlu (özellikle de proteinaz K‟yı) eder ve istenmeyen
çökelmeleri önler.
SDS, iyonik deterjandır. Membranları yıkma iĢleminde iyidir. Genel
denatüre edicidir (enzim aktivitesini inhibe eder). DNA çok dayanıklı
olduğu için SDS muamelesinden etkilenmez.
Not: Bitki materyali ile çalıĢırken SDS‟in yerini çok yaygın bir deterjan
olan Sarkosyl alır. SDS ile aynı Ģekilde davranır.
Proteinaz K, serin proteaz (55 C‟de iyi çalıĢır). Çok etkili olduğu için ve
SDS ya da diğer denatüre edici ajanlara karĢı (üre gibi) hassas olmadığı
için kullanılır. Proteinaz K DNA‟ya bağlı olan proteinleri (ökromatin
yapısındaki/histonlar vb) parçalayarak DNA‟nın serbest kalmasını
sağlar. Taze olarak kullanılması en iyisidir (oldukça önemlidir bu
aĢama).
•
Ġnkübasyon süresi genellikle en az bir saattir. Bazı prosedürler daha
uzun sürer (kullanılan materyale göre değiĢir örneğin birçok prosedür
16 saatten fazla gece boyu inkübasyon süresi kullanır).
•
Lizis prosedürünün birçok çeĢidi olduğunu anlamak çok önemlidir.
Bazısı daha hızlı, bazısı daha etkin, bazısı daha pahallı, bazısı belirli
Ģartlarda çalıĢır. SDS/proteinaz K oldukça standart bir yöntemdir.
DNA extraksiyonu (Fenol/kloroform ile)
•
•
Dikkat!!!! Fenol oldukça tehlikelidir. Yanıcıdır. (bir zamanlar birinin bana
söylediği gibi eğer vücudunun %5‟ni kaplarsa, ölürsün) Ancak biz mantıklı
miktarlarda ve çekerbaca içerisinde kullandığımız için sorun olmayacaktır.
Eğer üzerinize dökülürse paniklemeyin. Hemen soğuk su ile durulayın.
Fenol, genellikle bir tamponla doyurulur. (hazır olarak aldığınızda ya da
kendiniz hazırladığınızda iki faz içerdiğini görürsünüz. Üst faz tamponun
fazlasıdır, alt faz ise tamponla doyurulmuĢ fenoldür.) Bu pH için önemlidirsizin saflaĢtırma iĢleminiz için nötral pH‟da fenol gerekilidir. (asidik pH,
DNA fenol içinde çözülür hale geleceği için iyi değildir.) Aynı zamanda
doygunluk da önemlidir çünkü bu herhangi bir sulu çözelti (örn.su)
eklendiğinde, onun da kendi sıvı tabakasını yaratacağı anlamına
gelmektedir.
•
•
•
•
Fenol-kloroform saflaĢtırma yöntemi “diferansiyel (kademeli) çözünürlük” prensibine bağlı olarak
çalıĢmaktadır.
1. Lizat üzerine eĢit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol (genellikle hacimsel olarak 24:23:1
oranında hazırlanır) eklenir. Fenol- organik çözücü/ nükleik asitler çözünmez. Bundan dolayı,
DNA/RNA sulu faz içinde çözünmüĢ halde kalır. Lipidler ve polisakkaritler tercihen fenol fazına
geçerler. Proteinler de seçici olarak fenol çözeltisine geçerler.
2. Ayrıca fenol bir denatüre edici olarak davranır, proteinler denatüre olarak çökelek oluĢtururlar
ve ara fazda toplanırlar.
3. Kloroform, fenolle genel olarak benzer özelliklere sahiptir (çözücü özellikleri), ayrıca sulu ve
organik fazlar arasındaki dayanıklı olmayan bağları stabilize eder. Izoamil alkol de ara fazın
stabilizasyonuna katkı sağlar ve aynı zamanda kabarcık oluĢumunun önlenmesine yardım eder.
•
Genellikle bu basamak 2 ya da 3 kez tekrarlanır. Daha fazla tekrar edilmesi, örneği daha
temiz hale getirir (her tekrarda ara fazın daha temiz hale geldiğini gözlemleyebilirsiniz). Bu
prosedür oldukça güvenilirdir ve DNA verimi fazladır. Bu nedenle halen laboratuvarların
çoğunda kullanılmaktadır.
Genomik DNA İzolasyonu: DNA’nın çöktürülmesi
Alkol ve Tuz ile Çöktürme
•
•
•
•
•
Hacmin yarısı kadar amonyum asetat ekleyin. Neden? Etanol varlığında DNA‟nın
çökmesine yardımcı olur. NaCl de kullanılabilir, ya da tamamen bu basamağı
atlayabilirsiniz (DNA konsantrasyonuna bağlı olarak) Tuz DNA‟nın negatif yükünün
nötralize olmasına yardım eder (böylece çözücü moleküllerden ayrılır- bu durumda çözücü
sudur). Tuz aynı zamanda su ile etkileĢime girerek DNA‟nın çözünürlüğünü zayıflatır. Bu
“salting out” olarak bilinir.
%100‟lük etanol kullanılır. Etanol su kadar iyi bir çözücü değildir. %65‟den daha çok etanol
içeren çözeltilerde DNA çözünmez. Ancak etanolle çöktürmenin etkinliği çok sayıda etkene
bağlıdır: sıcaklık, zaman, DNA miktarı.
Çöktürme basamağı için izopropanol de kullanılabilir. Bu çözücü için de RNA da stabil
kalabilir (seçici çöktürme). Bu nedenle bazen bu amaçla da kullanılır. %50‟den daha çok
izopropanol varlığında DNA çökelti halinde kalır.
Cam bir pastör pipeti ya da çubuk kullanılarak DNA dikkatlice dıĢarı alınır. %70 etanolle
muamele edilir ve TE çözeltisi içerisinde çözülür. Cam pipet kullanmak hız kazandırır. %70
etanol yıkamasıyla ortamda bulunan fazla tuz uzaklaĢtırılır.
ALTERNATĠF. Bazı laboratuvarlarda DNA santrifüj edilerek çöktürülür. Bu az miktarda
DNA‟nın olduğu durumlarda daha etkili sonuç verir. Ancak %70 etanol ile pellet yine yıkanır
ve örnek tekrar spin edilir.
DNA Miktar Tayinine (Kantitasyon) Genel BakıĢ
Kantitasyon, miktarın tayin edilmesidir
Niçin kantitasyon yapılır?
Kantitasyon yöntemleri




Spektrofotometre
Slot Blot (Quantiblot)
Microplak okuyucu
Real Time PCR
DNA Kantitasyonu
DNA izolasyonunu takiben, DNA konsantrasyonunun ve
diğer maddelerin varlığının belirlenmesi amacıyla yapılır.
Örneğimde ne kadar DNA var?
Kantitasyon ekstraksiyonun baĢarısı hakkında ipucu verir.
Neden önemli?
STR bölgelerinin ya da mtDNA‟nın amplifikasyonu örneğin
içerdiği DNA miktarından etkilenir.
DNA Kantitasyonu
Kantitasyonun temel nedeni:
Çoğu PCR yöntemi DNA yeterli düzeydeyse en iyi sonucu verir.
DNA ekstraksiyonun çok az olması:


DNA amplifikasyonunda baĢarısızlık
Allel drop out (tamamlanmamıĢ amplifikasyon) ile sonuçlanır
DNA ekstraksiyonunun çok fazla olması:
 Amplifiye STR pikleri ölçüm alanını aĢar
 PCR inhibitörlerinin artması
• DNA saflığı
• Saflık belirlemede 260/280 nm sonucuna bakılır.
• Saf bir DNA 260/280=1.8 olmalıdır.
260/280>1.8 ise RNA kontaminasyonu
260/280< 1.8 ise protein kontaminasyonu
DNA Miktar Tayini
•
•
•
•
Spektorfotometrik okumalar: UV absorbansı kullanılarak DNA/RNA miktarı ve saflığı
belirlenebilir. Halkalı yapılar UV dalga boylarını absorbe edebilir. Ancak pek çok molekül
halkalı yapı içerir (nükleik asitler, proteinler, organikler, deterjanlar, lipidler, ve liste sürer...)
Hem DNA hem de RNA halkalı yapıları yaklaĢık 260 nm de güçlü absorbans verir.
Proteinler, bazı amino asitler fenilalanin, triptofan ve tirozin 280 nm‟de maksimum
absorbans verir.
Alt çizgi tuz taneciklerinin miktarı ile iliĢkilidir. Kaba hesapla, pek çok sey UV absorblar.
Aynı zamanda pH‟a oldukça duyarlıdır, bu nedenle sulandırmada kullanılan TE tamponu ile
spektrofotometre kalibre edilmelidir.
•
•
•
260nm’deki absorbansın 280nm’deki absorbansa oranıyla saflık değeri elde edilebilir
DNA = A260/A280 yaklaşık 1.8
RNA= A260/A280 yaklaşık 2.0
•
Bunlar saflaĢtırma ürünleri için iyi sonuçlardır ve aynı zamanda iyi kantitasyon değerine de
sahip olacaktır (OD değerlerini DNA miktarına çevirirken 260 nm‟de ölçülen DNA için
katsayı 50ug/ml, RNA için 40ug/ml‟dir).
DNA Kantitasyonu
Spektrofotometre:
DNA UV ıĢığını 260nm‟de absorblar
 Daha çok DNA = Daha çok absorbans
 Ġnsan DNA‟sına özgül değildir

DNA Kantitasyonu
Ayrıca DNA miktarını belirlemek için genellikle DNA miktarıyla iliĢkili olarak yapıya
bağlanan Etidyum bromür ve sybr green boyaları da kullanılır. Daha güçlü bir
yöntemdir, ancak daha pahalıdır. Etidyum bromürle boyanmıĢ bir jelde bant
yoğunlukları karĢıklaĢtırılarak DNA fragmentlerinin kantitasyonu yapılabilir, ölçü
olarak bir marker kullanılır.
DNA agaroz jelde ayrılır
 Etidyum bromür ile boyanır (çift
zincirli DNA gerekli)
 Ġnsan DNA‟sına özgül değil

DNA Kantitasyonu
Mikroplak okuyucu:



Picogreen interkalasyon yapan bir boyadır.
Çift zincirli DNA‟da baz çiftleri arasına bağlanır, floresansı arttırır.
Floresan miktarı çözeltideki DNA miktarı ile iliĢkilidir.
DNA Kantitasyonu
Mikroplak okuyucu: