NÜKLEİK ASİTLER
advertisement
NÜKLEİK ASİTLER Prof.Dr.H.Asuman TOKULLUGİL 1.RNA: Ribonükleik asitler 2.DNA: Deoksiribonükleik asitler Genetik bilginin depolanmasında Genetik bilginin transferinde → DNA → RNA rol oynar. 2 Azotlu bir baz + şeker + fosforik asit nükleotid (monomer) nükleotidler=N.A oluşturur (polinükleotid) monomer polimer mononükleotid= N.A yapıtaşı,yapı birimi 3 Nükleotid Yapı Taşları 1.Azotlu baz: Pürin veya pirimidin 2.Şeker 3.Fosforik asittir : D-riboz veya 2 deoksi D- riboz 4 I.AZOTLU BAZLAR A-PURİNLER a.PURİNLER 5 B.PİRİMİDİNLER 6 İnozin : (pürin) Pseudoüridin : (pirimidin) → t.RNA yapısında metilli türevlerdir. 7 TAUTOMERİZASYON Molekülün farklı bölgeleri arasında proton alış-verişi oksopurin, oksopirimidinlerde keto → enol dengeli C=0 C -OH 8 Keto-enol izomerizasyonu Fizyolojik şartlarda keto formu 9 Nükleozid= baz + şeker Nükleotid= baz + şeker+ fosforik asit Nükleik asit= poli nükletid 10 b-N GLİKOZİD BAĞI A) PURİNLERDE 11 B)PİRİMİDİNLERDE 12 NÜKLEOTİDLERİN FONKSİYONLARI 1.ATP: Evrensel kimyasal enerji taşıyıcısı ATP ADP + Pi enerji → 7.3 kcal/mol ATP AMP + PPi PPi → 2Pi pirofosfataz 13 2.Biosentez reaksiyonlarında TAŞIYICI ve AKTİVATÖR a)S-adenozil methionin: Transmetilasyon reak.da 14 b)AMP 3 fosfoadenozin 5’fosfo sülfat =PAPS yapısında bulunur Kondroitin sülfatın sülfatlanması 15 c)ADP : Koenzim A’nın bir parçası 16 d)UTP: Uridin trifosfat UDP-glukoz UDP-galaktoz UDP-glukuronik asit 1- Glikojen sentezi 2- Galaktoz metab 3- Amino-şeker metab 4- Uronik asit yolu 5- Bilirubin metab 17 e)CTP:Sitidin trifosfat CDP-Kolin → fosfolipid sentezi CDP-digliserit → trigiserid sentezi CDP-Kolin (=sitidin difosfat kolin) 18 3-Nükleozid trifosfatlar (nükleotid), biyosentez reaksiyonunda gerekli fosfat ve pirofosfatı sağlarlar: Ör:ATP a)Fosforilasyon Reaksiyonu Heksokinaz Glukokinaz Fruktokinaz Proteinkinaz X +NTP kinaz Glukoz + ATP Mg++ X-P + NDP G.6.P +ADP glukokinaz 19 B) Pirofosforilasyon Reaksiyonu Ör: Nükleotid sentezinde kullanılan ribozun sentezi Riboz-1-P + ATP PRPP + AMP ( PRPP = 1 Fosforibozil-5-pirofosfat ) 20 4-Elektron transfer reaksiyonuna katılan koenzimler NAD NADP FMN FAD (nikotinamid adenin dinükleotid) (nikotinamid adenin dinükleotid fosfat) (Flavin adenin mononükleotid) (Flavin adenin dinükleotid) FAD FMN 1-D-riboz yerine D-ribitol (şeker alkolü) 2-Flavin azotlu baz ama N.A yapısında bulunmaz 21 ATP CTP GTP UTP RNA polinükleotidlerinin prekürsörü URASİL RİBOZ dATP dCTP dGTP dTTP DNA polinükleotidlerinin prekürsörü TİMİN DEOKSİRİBOZ 22 5)İkincil haberci =Secondary messenger= Hücre içi habercisi Ör: c.AMP (çembersel AMP) ATP Adenilat siklaz 3’5’ cAMP +PPi 23 24 DNA’nın YAPISI ve ÖZELLİKLERİ 1) 3’ 5’ fosfodiester bağı Adenin Urasil (DNA’da timin) Guanin Sitozin 25 2) Polinükleotid zincirinin 3’ ucunda : serbest OH 5’ ucunda : 5’ trifosfatlar bulunur (öncül molekül) 5’ → 3’ 26 3)RNA ile DNA’nın farkları Baz :RNA ‘da Urasil DNA’ da Timin Şeker : RNA’ da riboz 2’de OH grubu DNA’da deoksiriboz 2’de H grubu 27 HÜCRELER EUKARYOTİK PROKARYOTİK 28 I-Prokaryotik Hücrelerin Özellikleri E.koli gibi bakteriler Riketsiya Spiroket Küçük ilkel canlılar 1) Hücreler küçük 2) Sitoplazma: -depo granülleri -nükleer zon (çekirdeğimsi bölge) -sitoplazma zarı (tek zar) 3)Ribozomlar: Protein sentez yeri Ultrasantrifüjde 70 s çökme hızı 30 s , 50 s’lik iki alt birim 4)DNA : - Tek bir dev makromolekül - DNA-protein ilişkisi yok - Küçük sitoplazmik - DNA plazmid,epizom denir 29 II-Eukaryotik Hücrelerin Özellikleri: Yüksek bitki, hayvan, insan hücreleri 1)Hücreler 1000-10000 kat büyük 2)Sitoplazma: Zarla çevrili, sınırlı, şekilli organeller -mitokondri, kloroplast -Golgi cisimcikleri -Düz ve kaba EPR -lizozom -çekirdek 3)Ribozomlar: daha büyük 80 s de çöker : 40 s ve 60 s lik 2 alt birim 4)DNA:Kromozomlar halinde dağılmış durumda Drosofilia 8 kromozom İnsan 46 kromozom Tavuk 78 kromozom 30 Kromozom = 1 veya daha fazla sayıda DNA molekülü içerir Kromatin= DNA + bazik protein(histonlar) = (nükleoprotein) NÜKLEOLUS= Çekirdekçik:Ribozom sentez bölgesi -% 0.1, 0.2 DNA mitokondri veya kloroplastlar içinde yer alır 31 DNA’nın Kimyasal Analiz Sonuçları 1)Adenin = Timin Guanin= Sitozin A/T= 1 G/C=1 2)Pürin nükleotid sayısı=Pirimidin nükleotid sayısı (A+G=T+C) 3) 4 ve 6. C da (NH2) grubu içeren bazların toplamı = 4 ve 6. C da (=O) grubu içeren bazların toplamı (A+C=G+T) (NH2) A=T G=C (=O) 4)Dissimetri oranı = A+T/G+C Belirli bir tür için sabit ve karakteristik, türler arası değişim gösterir. 32 DNA X- Işını Kırınımı Bulguları 1953’te Watson ve Crick DNA çift sarmal yapısı 33 Watson-Crick DNA Modeli 1)Bazlar sarmal eksenine dik düzlem yapar 2)İki baz düzlemi arası arası =0.34 nm 3)Sarmalın bir tam dönüşü= 10 nükleotid=3.4 nm 4) Her 2 zincir birbirine komplementer A=T G=C 34 Hidrojen Bağları 35 5) Fosfodiester iskeleti 2 nükleotid birbirine fosfat grubu aracılığı ile 3’, 5’ grubları vasıtasıyla bağlanır. 5’ 3’ ne doğru uzar. 36 3’, 5’ fosfodiester bağı Fosfoester iskeleti 37 6)DNA Sarmalının Stabilitesi 1-Hidrojen bağları 2- Bazlar arası hidrofobik etkileşimler 7) pH= 7’ de fosfat grubları (-) yüklü. Bu nedenle asidik özellik Bu nedenle N.A denir Hidrofilik Hidrofobik 38 Denaturasyon, Renaturasyon: İzole edilmiş DNA çözeltisi Oda sıcaklığında pH 7 de Aşırı pH Isı 80-90 olunca viskoz çözelti viskozite ↓ DNA da fiziksel değişim H bağları Hidrofob etkileşimler bozulur ↓ karşıt zincirler kısmen veya tamamen açılır DNA denaturasyonu= DNA erimesi Tersinir olaydır 39 Hibrit DNA’ların Oluşumu DNA’lar izole edilir insan Karıştırılır sıçan Ayrı ayrı denatüre edilir 65°C birkaç saat bekletilir İnsan sıçan Hibrid DNA 40 İki tür birbirine ne kadar yakınsa -Hibridleşme -DNA da sarmal yapı oluşturma oran olur Ör: İnsan –sıçan hibritleşmesi İnsan – maya hibritleşmesi 41 Hibritleşme deneyleri genetik biyokimyada; 1)Akrabalık derecesinin tayini, 2)DNA-RNA hibridleşmesi → DNA-RNA ilişkisi 3)Genlerin izolasyonu için kullanılır 42 Prokaryotik Hücrelerin DNA’ları Prokaryotik hücre → E.coli (bakteri) 200 misli DNA DNA virusu → Lamda faj.(bakteri virusu) E.coli’de DNA -Tek ve çok büyük molekül -Çift sarmal yapısında , halkasal -4 milyon baz çiftinden m.g. -DNA’ nın uzunluğu, hücrenin uzunluğundan 700 kat -Süpercoiling ( DNA fonks. için gerekli) -Nükleer zon (=Çekirdeğimsi bölge) -Topoizomeraz(DNA giraz): Supercoiling yapan ya da açan enzimler -Halkasal DNA :plazmid- sitoplazmada 43 Nükleer DNA: Bir kaç bin gen Küçük halkasal DNA: Bir kaç gen GEN: Tek bir protein veya enzim kodlamak için gerekli DNA parçası (nükleotid dizisi) 44 Eukaryotik Hücre DNA’ları -E.coli’ ye göre : Drosofilia ‘da 25 misli İnsanda 600 misli DNA -E.coli DNA sı=1.4 mm -İnsan hücre DNA sı = 2m 45 KROMOZOM: -nükleoprotein kümeleri -genetik materyal kromozomlara bölünmüş -kromozom organizmanın türüne özgü sayıda -kromozomların DNA içeriği ve hacmi farklıdır 46 Her KROMOZOMDA 1) 1 DNA sarmalı 2) Proteinler (histonlar) 3) E.coli DNA’ sının 4-100 katı kadar nükleotid içerir (E.coli DNA’sı= 4 milyon baz çifti) -Eukoryotik hücre DNA’ları doğrusal yapıda 47 GENOM: Bir hücredeki genlerin hepsi İnsan KC hücresi Hücre çapı = 25 μmetre Çekirdek çapı= 5 μmetre 46 kromozom DNA’ların toplam uzunluğu = 2 metre (=2.106 μ m) 48 KROMATİN -Kromozom materyali -Dağınık, koyu boyanan, ağımsı %60 protein %35 DNA %5 RNA dan oluşur 49 DNA sarmalı Nükleozom çekirdeği H1 histon 10 nm Ayırıcı DNA NÜKLEOZOMLAR 50 KROMATİNDE: DNA + Histonlar = NÜKLEOZOM Histonlar: -Bazik proteinlerdir. -Lizin,arjinin -MA:11000-21000 -Prokaryot hüc.de bulunmazlar. 51 NÜKLEOZOM: -10-11 nm çapında -Her nükleozomda 2’şer tane H2A, H2B, H3 ,H4 proteinleri bulunur (toplam 8 histon prot.) -DNA sarmalı nükleozomun çevresine 2 kez sarılır -Bir nükleozomda 200 baz çifti bulunur -20-120 nükleotidlik AYIRICI DNA SARMALI -H1 prot. = Ayırıcı bölgede 52 DNA REPLİKASYONU Watson-Crick Hipotezi ll Ebeveyn ll ll Yavru sarmallar - Yeni sentezlenen DNA zincirleri - Ebeveyn DNA’lar kalıp rolü oynar 53 Messelson ve Stahl Deneyi(1957) 1) E.Coli NH4Cl, (15N)’li besi yerinde üretiliyor Cecium Cl içinde ultrasantrifüj i)Normal E.coli -14N içeren ii)15N ‘li besi yerinde üretilen E.coli Hafif DNA(14N) Ağır DNA(15N) 54 2)15N içeren E.coli ler 1 nesil sonra 14N LÜ ortama alınıyor 14N Hibrit DNA 15N Orta noktaya çöker 55 3) 2 nesil sonra 14N 14N 14N 15N Hafif DNA(14N) Hibrit DNA (14N 15N) DNA replikasyonunda ; yavru DNA’ nın bir zinciri ebeveynden diğer zinciri yeni sentezleniyor 56 Semikonservatif replikasyon 57 Halkasal DNA’ nın Replikasyonu 58 Halkasal DNA’nın replikasyonu: - Replikasyon yönünde DNA’nın açılması - Çift yönlü - Origin:Başlangıç noktası 100-200 nükleotidlik bir bölge, özel bir protein tarafından tanınır 59 E.Coli’de DNA replikasyon çatalı oluştuktan sonra ; → 37 C de 45000 nükleotid/dakikada ilerler (replike olur) → 1 DNA sarmalı = 10 nükleotidde tam dönüş Bu nedenle ters yönde dönmesi gerekir 4500 devir / dk ters yönde döner ve DNA sarmalı açılır (Bu hız = 70 mil/saat) 60 Eukaryotik DNA’ların Replikasyonu -Birçok origin mevcut -Çift yönlü -Hızı prokaryotların 10 da biri kadar Tek origin olsa → 2 ayda replikasyon (Binlerce origin → binlerce replikasyon çatalı Bu nedenle → replikasyon hızlı olur ) 61 Kabarcıklar Çift yönlü replikasyon sonucu oluşur REPLİKASYON 62 DNA POLİMERAZ I ENZİMİ 63 Deoksiribonükleozid 5’trifosfat = NTP (dNMP)n + dNTP DNA (dNMP) n+1 + PPi Uzamış DNA 64 DNA POLİMERAZ I ENZİMİ Substratları : dATP, dTTP, dCTP, dGTP, bir DNA çifti sarmalı Kofaktörleri : Mg++ ve Zn++ iyonları DNA çift sarmalı = başlangıç ve kalıp Mevcut DNA zinciri kalıp kabul edilir Buna KOMPLEMENTER= KARŞIT zincir sentezlenir Sentez (zincirin uzaması) 5’ → 3’ yönünde olur 65 Uzayan DNA zinciri Zincire yeni girecek dNTP dGTP 66 67 REPLİKASYON OLAYI 1)Başlama noktasının tanınması(origin) 2)Ebeveyn sarmalın dönerek açılması 3)Yavru komplementer zincirlerin oluşumu 4)Zincirin uzaması 5)Zincirin sarmal şeklini alması 6)Replikasyonun sonlanması 20 veya enzim = DNA replikaz sisitemi (REPLİZOM) 68 E.coli bakterisinde : DNA polimeraz I : Hücre içinde en fazla DNA poimeraz II : İşlevi ? DNA polimeraz III: DNA sarmalının uzamasından esas sorumlu enzim DNA polimeraz III holoenzim (subuniteleri) -550.000 M.a ‘da -Zn++ iyonları mevcut, aktivite için Mg++ gerekli 69 DNA polimeraz I ve III a)Endonükleaz aktivitesi: 5’ → 3’ ucuna doğru yeni nükleotidler takarak ilerler b)Her iki enzimde - DNA kalıp zincirine ve buna sarmal olarak sarılmış PRIMER zincire gerek duyar b alt birimi = Ebeveyn DNA ‘daki primer zinciri tanıyarak ona bağlanır c) Ekzonükleaz aktivitesi Hem 3’ → 5’, hemde 5’ → 3’ yönünde zincirden nükleotid koparma aktivitesidir 70 OKAZAKİ PARÇALARI: -Normalde DNA replikasyonu 5’ → 3’ yönünde Replikasyonda karşıt zincir oluşturulur A zinciri : 5’ → 3’ yönünde normal replikasyon B zinciri : 3’ → 5’ yönünde replike olmaz.Bu nedenle 5’ → 3’ yönünde okazaki parçaları ile replike olur 71 72 Replikasyondaki enzimler ve işlevleri 1)PRİMAZ Enzimi -Okazaki parçalarınn oluşumu için gerekli -Açılan replikasyon çatalının ucuna birkaç tane ribonükleotid takarak → primer sarmal m.g (öncül) 2)DNA polimeraz III : Primer sarmala → deoksiribonükleotidleri takar, zincir uzar 3)DNA polimeraz I : a) Ekzonükleotidaz aktivitesi ile ribonükleotidleri çıkarır sonra b) Aynı yere : kalıba uyan deoksiribonükleotidleri takar -Okazaki parçaları meydana gelmiş olur 73 4)DNA ligaz Okazaki parçalarını birleştirir 5)Helikaz enzimi -DNA sarmalını ters yönde döndürerek, zinciri DÜZLEŞTİREN ve AÇAN enzim -Çatalın hemen önünde bulunur 6)DNA bağlayıcı protein(DBP) -Düzleşip açılan DNA’nın tekrar kapanmasını önler 7)Topoizomerazlar -Sarmal 4500 devir/dak hızla düzelir -Dengeleyici oynak nokta olmasa → bu hızda replikasyon çatalının önündeki kromozom ters yönde dönebilirdi 74 Topoizomerazlar a)Dengeleyici oynak nokta: Helikazın önüne oturur. Helikazla aynı hızda, helikazla kendi arasındaki DNA segmentini 180ºlik dönmelere tabi tutar. DNA düzleşmesine yardımcı olur Topoizomeraz Helikaz b)Superkoling olayı: Topoizomeraz sarmalın düzleştirilmesine yardımcı olur Helikaz sarmalı açar (Prokaryotlarda :Topoizomeraz=DNA giraz) 75 76 HİSTONLARIN REPLİKASYONU Kesikli DNA zincirinin bulunduğu yavru sarmalda yeni histonlar yeni nükleozomları oluştururlar. Replikasyon çatalında DNA sentez yönü bir zincirde :5’→3’ , diğer zincirde ise 3’→5’ dir. 3’→5’ yönünde sentez kesikli zincir şeklindedir. 5’→3’ yönünde lider zincir sentezlenir. 77 Eski ve yeni histonlar nasıl dağılım gösterir ? In vitro DNA sentezi yapılıyor Bir protein sentez inhibitörü olan sikloheksimid ortama ekleniyor (Böylece yeni histon sentezi engelleniyor) Bu şartlar altında DNA sentezi 15 dk devam ediyor Yeni sentezlenen DNA’ nın yarısı DNAaz I’le tamamen yıkılıyor Diğer yarısı ise 200 baz çifti içeren parçalara ayrılıyor. 78 Bu deney ve density-labeling çalışmaları şunu düşündürmüştür; Ebeveynden gelen histonlar yeni DNA sarmallarından sadece birisinde bulunur Diğer yavru sarmalda ise önce histon yoktur ve çıplaktır E/M da da replikasyon çatalında bir tarafta histonlar bulunurken diğer tarafta bulunmadığı görülüyor Özellikle replikasyon esnasında ebeveynden gelen histonlar konservatif olarak ayrılı (veya tek bir yavru DNA sarmalında toplanır) 79 Özetle; Replikasyon esnasında ebeveynden gelen histonlar konservatif olarak ayrılır (veya tek bir yavru DNA sarmalında toplanır) 80 Bu bulgular; Histonların replikasyon esnasında DNA’ dan ayrışmadığını gösterir Gerçekte, eski histonlar lider zincirin olduğu yavru sarmalda durur Buna karşın yeni sentezlenen histonlar kesikli DNA zincirinin olduğu yavru DNA sarmalında toplanır 81 Bu farkın bir olası nedeni şu olabilir : Histonlar, tek sarmallı DNA’ya kıyasla, çift sarmallı DNA’ya çok daha kuvvetle bağlanırlar Eski histonlar olasılıkla kesikli sarmalı bırakırlar Çünkü bunda okazaki parçalarının birleşmesinden önce tek sarmallı bölgeler vardır. Bu nedenle öbür zincire geçerler. 82 TRANSKRİPSİYON DNA’ daki baz dizilişi= genetik bilgi içerir Bazların özel dizilişi= genetik şifre DNA nın ufak bir kısmının açılması (=gen= Bir protein kodlayacak baz dizesi) Transkripsiyon RNA sentezi Translasyon Protein sentezi 83 TRANSKRİPSİYON → -DNA’ daki baz dizilişine göre genetik şifrenin RNA’ya aktarılması -Komplementer olay 84 RNA’lar 1)Habercil (messenger RNA= mRNA) DNA Ribozomlara gider Transkripsiyon 2)Taşıyıcı RNA(transfer RNA= tRNA) Her aa’e özgü bir tRNA vardır 3)Ribozomal RNA (rRNA) Hepsi nükleusta DNA’dan transkripsiyonla sentezlenirler 85 mRNA Uzunluğu değişik, tek zincir halinde molekül MONOGENİK (MONOSİSTRONİK): Tek genin bilgisini POLİGENİK (POLİSİSTRONİK): Çok genin bilgisini taşıyorsa denir -Prokaryotlardaki mRNA’lar poligenik -Eukaryotlardaki mRNA’lar monogenik mRNA mol. uzunluğu kodladığı polipeptid zincirinin uzunluğu ile sınırlı. 3 baz → 1 aa kodlar Bu nedenle 100 aalik bir polipeptid zinciri için en az 300 bazlık RNA gereklidir 86 Prokaryot mRNA ları gen.la kodladıkları polipeptid zinciri için gerekenden daha uzun →5’ ucunda :LİDER bölge (25-150 baz) polipeptid kodlamaz Poligenik mRNA’larda, INTERGENİK BÖLGE polipeptid kodlamaz Lider bölge Gen I İntergenik bölge Gen II 5’ Protein kodlamaz 3’ Protein kodlar -Bir metabolik yol enzimleri için poligenik mRNA kullanılır 87 mRNA Sentezi: DNA’ya bağımlı RNA polimeraz enzimi -DNA ‘nın bir zincirini kalıp gibi kullanır -Buna komplementer RNA zinciri oluşturur -Aktif merkezinde Zn++ -Mg++ ‘a gerek duyar -Substratları: ATP, GTP, UTP, CTP -5’ → 3’ yönünde zincir uzaması -3’ ucuna ribonükleotid birimlerini takar 88 RNA polimeraz reaksiyonu: n(NMP)n + NTP grubları) (NMP) n+1 + PPi Ribonükleosid 5’ trifosfat uzamış RNA (b ve fosfat ( fosfat grupları) 89 DNA kalıp görevi görür DNA’da : A T G C RNA’da : U A C G (deoksiribonükleotid) (ribonükleotidler) - Primer zincire gerek yok, ama ÖZGÜL BİR BAŞLAMA noktası gerekli -RNA polimeraz bu noktaya oturduktan sonra→ TRANSKRİPSİYON başlar 90 TRANSKRİPSİYON’un Safhaları RNA polimerazın→ 1- Başlama noktasına oturması 2- Birkaç fosfodiester bağı yapması 3- Sigma birimi (enzimin bir alt birimi, holoenzimden ayrılması 4- Zincirin uzaması 5- Genin transkripsiyonunun bitme sinyali= DNA kalıbı üzerindeki DURMA DİZİSİ 6- RNA ve RNA polimerazın DNA’dan ayrılması. (Rho) P proteini 91 RNA polimeraz : Prokaryotlarda: -M:A 500.000 -Kompleks, holoenzim -5 polipeptid subuniti var (2, b, b’, ) -mRNA, tRNA; rRNA sentezler Eukaryotik hücrelerde: RNA polimeraz I : Nukleolusta lokalize rRNA sentezler RNA polimeraz II : Kromatin içinde lokalize mRNA sentezler RNA polimeraz III :Kromatin içinde lokalize tRNA ve 5s’lik rRNA sentezler 92 93 Transkripsiyonun İnhibisyonu Aktinomisin D: Prokaryot ve eukaryotlarda ; DNA sarmalında G-C arasına oturur, transkripsiyonu kitler ve zincir uzayamaz Akridin D: Aktinomisin D gibi aktivite Rifampicin D: Prokaryotlarda RNA polimerazın bir alt birimine bağlanarak enzimi bloke eder 94 Posttranskripsiyonel İşlem Enzimatik olarak RNA’ya bazı grubların takılması ve çıkarılması → RNA’nın AKTİFLEŞMESİ DNA AKTİF RNA RNA zinciri transkrip. Posttranskripsiyonel işlem 95 Heterojen nükleer RNA =hnRNA Eukaryotik hücrelerde önce nükleer RNA’lar sentezlenir Heterojen nükleer RNA mRNA + sRNA(small RNA) 96 Eukaryotik mRNA’ların, Prokaryotik mRNA’lardan Farkları: 1) Eukaryotik mRNA’lar :MONOGENİK 2) Eukaryotik mRNA 3’ ucunda POLİ-A KUYRUĞU (100-200 tane –A-A-A-) (Poliadenilat polimeraz, substrat ATP) 3) Eukaryotik mRNA 5’ ucunda → 7-METİL GUANOSİN şapkası Şapka → Translasyonu başlatmak üzere ribozoma bağlanmada yardımcı Şapka ve kuyruk → mRNA’ yı enzimatik yıkımdan korur 97 98 Reverse Transkriptaz (Ters transkripsiyon yapıcı) ve Kanser Oluşumu Viral RNA Reverse transkriptaz Komplementer DNA (cDNA) Kuşlarda Rous sarkomu etkeni :RNA virusu Bunda ; RNA’ ya bağımlı DNA polimeraz (reverse transkriptaz) 99 100 Hormon Üretimi Reverse transkriptaz E.coli’ye verilir Hızla çoğalır sentetik gen sentezi Plazmid oluşturma (cDNA) Translasyon Sonuçta istenen protein,Ör:İNSULİN 101 TRANSLASYON Replikasyon DNA Transkripsiyon Reverse Transkripsiyon (R.Transkriptaz) RNA Translasyon PROTEİN 102 PROTEİN SENTEZİ (Translasyon) a) Protein sentezi çok karmaşık bir olaydır Eukaryotik hücrelerde : 70 tane ribozomal protein 20 tane protein: aa aktivasyonu için 12 tane protein: translasyonda enzim 100 tane protein: posttranslasyonel işlemlerde 100 tane rRNA, mRNA, tRNA -Yaklaşık 300 tane makromolekül → 1 polipeptid zincirinin sentezi için gerekir b) Protein sentezi çok hızlı gerçekleşir. 100 aa’lik polipeptid 5 sn’de c) Hücre içi protein sentezi çok sıkı kontroldedir.Gerektiği kadar protein sentezlenir 103 Translasyonu Evreleri 1- AA’lerin aktivasyonu 2- Polipeptid zincirinin başlaması 3- Uzama 4- Sonlanma ve ribozomdan ayrılma 5- Kıvrılma ve işlenme 104 I.evre :AA’lerin aktivasyonu aa + tRNA + ATP Mg 2+ aminoasil-tRNA +AMP + PPi a.asil-tRNA sentetaz Tersinmez reak. Gº’ = -7.0 kcal/mol 105 Ör: isolösil-tRNA sentetaz =E a) isolösin + ATP + E E-İsölösil-AMP + PPi a) E-[isolosil- AMP] +tRNA ile → İsolosil-tRNA ile + E + AMP Gº’ = -7 kcal/mol 106 107 T=ribotimidin =Pseudoüridin DHU=Dihidrouridin tRNA 108 Polipeptid zincirinin başlaması 109 II.evre: Polipeptid zincirinin başlaması 1) RİBOZOMLAR: 110 21 tane polipeptid 34 tane polipeptid Prokaryot Eukaryot 111 2) Başlangıç amino asiti Prokaryotlarda: Peptid zincirinin aminoterminalinde : N-FORMİL METHİONİN bulunur H COO ı l H-C-N-C-H ll l O CH2 l N-formil CH2 grubu l S l CH3 112 Bu aa 2 reaksiyonla oluşur ATP a) Methionin + tRNA fmet AMP + PP methionil- tRNAfmet Mg ++ Methionil –tRNA sentetaz b)Formil grubunun methionil’in amino grubuna transferi N10- Formil tetrahidrofolat + Met-tRNAfmet tetrahidrofolat +fmet-tRNAfmet N10- FH4 transformilaz -Transformilaz serbest methionine formil bağlayamaz.Özgül substratı Met-tRNAfmet tRNAmet :Peptid zinciri içindeki methionine özgü tRNAfmet :Başlangıçtaki formillenmiş methionine özgü.Bu tRNA sadece formil grubu alabilir 113 EUKARYOTLARDA: -Ekstramitokondrial ribozomlarda, methioninle sentez başlar. t-RNAmet -Mitokondri ve kloroplastlardaki ribozomlarda, N-formil Met-tRNAfmet ile başlar *Mitokondrilerin bakteriden oluşumu; simbiotik yaşam teorisini destekler 114 B)Polipeptid sentezinin Başlaması Prokaryotlarda gerekli yapılar; 1) 30 S subuniti (16 s rRNA içerir) 2) Sentezlenilecek polipeptidi kodlayacak mRNA 3) Başlangıç aa-tRNA=N-formil methionil-tRNA fmet 4) Başlama faktörleri BF-1 (IF-1) BF-2 (IF-2) BF-3 (IF-3) 5) GTP 115 Başlama kopmleksinin oluşumu 3 safhada gerçekleşir. 116 1.safha 30 s ribozom üniti + BF-3 → Bağlanır (30 s ve 50 s‘ın birleşmeleri engellenir) mRNA + 30 s subünitine → Bağlanır 6-8 tane A ve G A 5’ Başlangıç sinyali 30 s deki 16 s rRNA İle koplementer baz oluşturur U G 3’ Başlangıç kodunu N-fmet-tRNAfmet deki UAC ile karşıttır 117 İşte başlangıç sinyali sayesinde; a) mRNA 30 s’te doğru yere oturur b) Başlangıçtaki Zincir içindeki bağlar AUG kodonu= N fmet tRNAfmet AUG kodonu= met-tRNAmet 118 2. safha 30 s subüniti BF-3 mRNA GTP-BF-2 + Nfmet-tRNAfmet BÜYÜK BAŞLANGIÇ KOMPLEKSi 119 3.safha 120 1- mRNA ‘da AUG kodonu fmet-tRNAfmet’de UAC’nin anti kodonu başlangıç aasil-tRNA doğru yere oturmasını sağlar 2- Ribozomal P noktası 121 Ribozomlarda aminoasil-tRNA’ları bağlamak için 2 bölge vardır A Bölgesi : Aminoasil kısmı P Bölgesi : Peptidil kısmı - Bu bölgeler 50 s ve 30 s subunitelerinin spesifik kısımlarından m.g -P bölgesine sadece başlangıç fmettRNAfmet bağlanırken A bölgesine ise diğer yeni gelen aminoasil-tRNA’ lar bağlanır 122 123 İkinci kodon 124 III. Evre:Uzama Gerekli yapılar 1-Başlangıç kompleksi : 70 s ribozom mRNA fmet-tRNAfmet 2- Bağlanılacak bir sonraki aminoasil-tRNA (mRNA’ da AUG’den sonraki kodona uyan antikodonlu aasil-tRNA) 125 3- Uzama Faktörleri Tu Ts G 4- GTP 126 Uzamanın Safhaları 1. safha Bir sonraki aasil-tRNA + Tu- GTP aasil-tRNA-Tu-GTP + 70s başlangıç kompleksi → aasil-tRNA –Tu-GTP Tu-GDP+Pi Yeni aasil-tRNA 70 s (kompleks) 127 Rejenerasyon Reaksiyonu Ts Tu-GDP GTP Tu-GTP GDP 128 Bir sonraki kodon 129 2. Safha: P ve A bölgelerinde oturan aa’ler arasında peptid bağı m.g 50 s subunitindeki; peptidil transferaz enzimi 130 3. safha: TRANSLOKASYON Ribozomun mRNA üzerinde 3’ ucuna doğru bir kodon kaymasıdır Böylece → A bölgesindeki dipeptidil-tRNA P bölgesine P bölgesindeki- boş tRNA → sitoplazmaya 131 Translokasyonda 1)G= Translokaz (uzama faktörü) 2) GTP GDP + Pi (enerji) gerekir 132 Dipeptidil t-RNA2 Translokasyon kademesi A kısmı bir sonraki Aasil t-RNA için hazır 133 IV-Sonlanma ve Ribozomdan Salınma mRNA’daki şifreye göre son aa takıldıktan sonra SONLANMA KODONLARI; UAA, UAG, UGA ‘dır. Bunlar hiçbir aa kodlamaz Bu kodonlara gelinince 3 tane SONLANMA veya SALINIM FAKTÖRÜ işe karışır R1, R2, S → Sonlanma proteinleridir 134 SONLANMA veya SALINIM FAKTÖR’lerinin işlevleri : 1- Polipeptid zincirini son tRNA’dan ayırma ve polipeptid zincirini sitoplazmaya salma 2- P kısmında boş kalan tRNA’ yı → sitoplazmaya 3- 70 s ribozomu 30s + 50 s’li subunitelere ayırma (Böylece yeni bir polipeptid zinciri sentezlenebilir) 135 mRNA Başlama sinyali Aa kodlayan kodonlar Başlama kodonu Sonlanma kodonları 136 V.Kıvrılma ve İşlenme Posttranslasyonel Modifikasyonlar -Polipeptid zincirinin biolojik aktif hale gelmesi için geçirdiği değişimler; Sekonder, tersiyer, kuarterner yapıların oluşumu Bazı grupların takılması Bazı grupların çıkarılması 137 PROTEİN SENTEZİNİN DÜZENLENMESİ 1- Transkripsiyonel Kontrol → Bakterilerde 2-Translasyonel Kontrol → Eukaryotlarda (karmaşık, ?) 138 TRANSKRİPSİYONEL KONTROL Bir hücredeki enzimler; A) YAPISAL enzimler: Her hücrenin tipine göre sabit miktarda B) UYARILABİLİR enzimler: Yapımı şartlara göre veya (uyarılabilen- baskılanabilen enzimler) 139 A) BASKILANABİLEN enzim E.coli → tek N kaynağı NH4+ tuzları → tüm aa’leri sentezler *Ortama histidin ilavesiyle, histidin sentezleyen enzimler baskılanır (son ürün inhibisyonu) 140 B)UYARILABİLEN enzim Normalde mikterı az, ama bazı şartlarda yapım miktarı artan enzimler Ör: b-Galaktozidaz Laktoz → D-Glukoz + D-Galaktoz E.coli’de - b-Galaktozidaz normalde 5-6 tane. - Ortamda glukoz varsa bu enzim hiç kullanılmaz - Tek C kaynağı laktozlu besi yerinde -1-2 dk’da 1000 tane b - Galaktozidaz sentezi 141 OPERON: Birbiriyle fonksiyonel olarak ilişkili ve şartlara göre açılıp, kapatılabilen genler grubudur 142 LAC OPERONU Yapısal genler : z → b-Galaktozidaz y → permeaz a → A proteini Düzenleyici gen : i → represör protein Kontrol genleri : p → promoter 0 → operator İndükleyici allolaktose (Laktozun izomeri) : 143 DNA’ da Lak operon’unun genetik yapısı 144
