Yayma Kültür Yönteminde İnkübasyon - SABİS
advertisement
TC SAKARYA ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ GIDA MİKROBİYOLOJİSİ UYGULAMA KILAVUZU HAZIRLAYANLAR Arş. Gör. Ayşe SARIÇAM Arş. Gör. İnci CERİT EYLÜL 2015 MİKROBİYOLOJİ LABORATUVARI ÇALIŞMA KURALLARI Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarına yetkili kişiler dışında hiç kimse giremez.# Kullanımı iyi bilinmeyen alet ve ekipman ile mutlaka deneyimli bir kisinin denetiminde calıştılmalıdır. (etüv,otoklav) Laboratuvar temiz ve düzenli tutulmalıdır. Laboratuvarı terk ederken kullanılan alet ve malzemeler yıkanmalı, ilgili yerlere konmalıdır. Çalışılan materyalin "mikrop" olduğu asla unutulmamalıdır. Tüm laboratuvar personeli bu konuda eğitim görmüş olmalıdır. Laboratuvarda hiçbir şey yenilmez, içilmez. Laboratuvarda çanta, palto vb. kişisel eşyalar açıkta bırakılmaz. Laboratuvardaki hava akımı ekimlerde kontaminasyona neden olur. Bu nedenle özellikle ekim sırasında laboratuvarda hava akımı olmamalıdır. Çalışırken eller yüze sürülmemeli, ağza herhangi bir şey atılmamalıdır. Laboratuvarda klima kullanılıyorsa ekimden 15 dakika önce kapatılmalıdır. Klima özellikle 28 oC'da çalışan inkübatörler için gereklidir. Laboratuvara gelirken beyaz ve temiz önlük giyilmelidir. Önlüğün önü kapatılmalıdır. uzun saclı olanların saclarını toplamaları gerekmektedir. Laboratuvarda giyilen önlük ve kullanıyor ise bone ve galoş ile hiçbir koşulda laboratuvar dışına çıkılmaz. Sabah işe başlamadan ve akşam iş bitiminde tezgahlar dezenfekte edilmelidir. Personel her giriŞ ve çıkışta ellerini dezenfekte etmelidir. Laboratuvar çöp sepetleri içinde otoklavlanabilir poşet bulunmalı, çöpler otoklavlandıktan sonra atılmalıdır. Öze uçları her kullanımdan önce ve sonra Bunzen beki alevinde sterilize edilmelidir. Etil alkol gibi yanıcı, tutuşucu maddeler Bunzen beki alevi çevresinden uzak tutulmalıdır. Mikroorganizma üremiş materyalin kırılması ya da yere dökülmesi halinde gereken karantina ve dezenfeksiyon uygulanmalıdır. Mikrobiyolojik analiz laboratuvarında starter kültür üretimi yapılmaz. Laboratuvar buzdolaplarında, çekmecelerde ve diğer laboratuvar alanlarında tüketim amaçlı gıda maddesi bulundurulmaz. 2 Laboratuvarda acil durumda kullanılmak üzere yeterli sayıda ve steril olmak üzere boş erlen, boş tüp, boş Petri kutusu gibi cam malzeme ile günlük kullanılan besiyerlerinden depolanabilenler hazır halde ve yedek olarak bulundurulmalı, her15 günde bir bu malzeme yeniden hazırlanmalıdır. Hazırlanan çözeltiler, besiyerleri üzerine ismi, tarihi yazılmalıdır. Pipetler hiçbir şekilde ağızla çekilmemeli, personel puar, pipetör vb. yardımcı malzeme kullanmalıdır. Laboratuvardaki cihazların kalibrasyonu düzenli olarak yapılmalıdır. Analiz raporlarında gerekli ise inkübasyon sıcaklığı ve süresi yazılmalıdır. Kirli malzemenin nasıl temizleneceği ve atılacağı talimatlarla belirtilmelidir. **Standart bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı için, 20 m2 uygun bir alan olarak nitelendirilir. Daha büyük alana sahip laboratuvarlarda temizlik daha zor yapılmakta, buna bağlı olarak kontaminasyon riski artmaktadır. Laboratuvar doğrudan güneş ışığı almamalı, yeterli aydınlatma ve iyi bir havalandırma sağlanmalı ve sıcaklğıın 25 oC'dan fazla olması halinde klima kullanılmalıdır. Laboratuvar çalışma havasında mikroorganizma yükü olabildiğince az olmalıdır.15 dakika süre ile kapağı açık bırakılan bir Plate Count Agarda 15 koloni olması kabul edilebilir bir değerdir. "Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı" biyogüvenlik düzeyi "2" olarak ele alınmalı, ancak tehlikenin boyutu asla küçümsenmemelidir. Analiz edilecek gıdada havadan bulaşan bir mikroorganizma bulunmadığı kesin değildir. 3 ÇEŞİTLİ LABORATUVAR MALZEMELERİNİN TANITILMASI Deney tüpü Durham tüpü Otomatik pipet Dereceli pipet Balon Beher Drigalski spatülü Bunzen beki Tüplük Puar Öze Havan Petri kutusu Erlen Mezür Spatül Pipet kutusu Piset 4 KULLANILAN CİHAZLAR Otoklav İnkübatör Saf su cihazı Su banyosu Terazi Sterilizatör pH metre Stomacher (Homojenizatör) Manyetik karıştırıcı Steril kabin Vorteks Koloni sayıcı Mikroskop 5 İÇİNDEKİLER UYGULAMA 1: BESİYERİ HAZIRLAMA DÖKME…………………………………….7 UYGULAMA 2: ÖRNEK ALIM-TARTIMI, HOMOJENİZASYON VE DİLÜSYON, YAYMA KÜLTÜR YÖNTEMİ……………………………………………………………...9 UYGULAMA 3:DÖKME KÜLTÜR (ÇİFT KATLI EKİM) VE EMS YÖNTEMİ İLE KOLİFORM-E.coli SAYIMI, DEĞERLENDİRİLMESİ, IMVIC TESTİ İLE DOĞRULANMASI………………………………………………………………………….18 UYGULAMA 4:MEMBRAN FİLTRASYON İLE SU ANALİZİ, READYCULT VE ENVİROCHECK KULLANIMI…………………………………………………………...24 UYGULAMA 5: Cronobacter sakazakii İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU…28 UYGULAMA 6: Salmonella spp. İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU…………31 UYGULAMA 7:E.coli O157:H7 İZOLASYONU-İDENTİFİKASYONU………………35 UYGULAMA 8:Listeria monocytogenes İZOLASYONU-İDENTİFİKASYONU………40 UYGULAMA 9:Staphylococcus aureus İZOLASYONU-İDENTİFİKASYONU……….43 UYGULAMA 10:KAĞIT DİSK DİFÜZYONU İLE ANTİMİKROBİYEL AKTİVİTE TAYİNİ………………………………………………………………………………………45 6 UYGULAMA 1: BESİYERİ HAZIRLAMA-DÖKME Besiyerleri (besi ortamı, ortam, vasat, kültür ortamı, kültür vasatı, kültür besiyeri) mikroorganizmaların geliştirilmesi için formülize edilmiş ortamlardır. Bunlar, mikroorganizmaların geliştirilmesi, izolasyon, identifikasyon, sayım, duyarlılık testleri, sterilite testleri, klinik örneklerin incelenmesi, gıda, su ve çevre kontrolleri, biyolojik ürünlerin elde edilmesi, antibiyotik ve vitamin analizleri, endüstriyel analizler vb. gibi çok farklı amaçlara yönelik olabilir. Her besiyeri üzerinde yazan formülasyona göre distile su ile hazırlanır. Örneğin 1 litre besiyeri hazırlamak için 25 gram tartılması gerektiği yazıyorsa, 200 mL besiyeri hazırlamak için 5 gram besiyeri tartılır. 200 mL suyun yaklaşık 1/3'ü uygun bir kaba aktarılır, bunun üzerine tartılmış dehidre besiyeri ilave edilir. Böylelikle cam kabın tabanına dehidre besiyerinin yapışarak erimemesine bağlı sterilizasyon yetersizliğinin önüne geçilir. Daha sonra suyun geri kalan kısmı iç çeperlerden yıkanarak kaba ilave edilir. Besiyerlerinin bir kısmı otoklavda sadece kaynatılarak sterilize edilirken otoklavda sterilize edilecek besiyerinin çözünüp homojen hale gelmesi için ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda eritilir. Eritme sırasında erlenin ağzı alüminyum folyo ile hafifçe kapatılarak buharlaşma ve buharın laboratuvara dağılması önlenmelidir. Erime sağlandıktan sonra besiyeri kutusunun üzerinde yazan talimata göre sterilizasyon normları ayarlanarak otoklavda sterilize edilir. Otoklav sonrasında agarlı besiyerleri 45-50°C’lik su banyolarına yerleştirilerek besiyeri sıcaklığının sabitlenmesi sağlanır ve aseptik koşullarda steril petri kaplarına besiyeri dökümü gerçekleştirilir. Selektif besiyerlerinin bir kısmına sterilizasyon sonrasında çeşitli katkılar ilave edilir. 7 Besiyeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış, saf sudan geçirilmiş ve yeterince kurutulmuş olması gerekmektedir. Kırık ve çatlak cam malzeme kullanılmamalıdır. Besiyerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeterli büyüklükte olması ihmal edilmemelidir. Cam kapların hacmi mutlaka yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır. İdeal olarak, hazırlanacak besiyeri hacminin yaklaşık 2 katı hacimde cam kap kullanılmalıdır. Sıvı besiyerleri için, besiyeri hacmi cam kap hacminin en fazla 3/4'ü olabilir. Cam kabın büyük tutulmasının nedeni otoklavlama sırasında ısı geçişinin daha sağlıklı olması, otoklav sonrasında da rahat ve güvenilir çalışma sağlamasıdır. 1 litrelik bir erlende 1 litre besiyeri hazırlanırsa soğuk noktanın yeri nedeni ile ya soğuk nokta yeterince sterilize edilemeyecektir ya da çepere yakın yerler gereğinden fazla ısıya maruz kalmış olacaktır. Büyük miktarlardaki besiyerlerinin balonda hazırlanması aynı nedenle benimsenmez. Tartım için özel tartım kayıkçıkları ya da küçük beherler kullanılmalı, doğrudan erlen ya da balona tartım yapılmamalıdır. Tartım sırasında her madde için temiz spatül kullanılması, besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra tartımın elden geldiğince çabuk bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması gerekir. Tartım sırasında besiyeri ve/veya bileşenlerinin oluşturduğu toz bulutu kesinlikle solunulmamalı, çıplak deriye ve özelikle göze temas etmemesi sağlanmalıdır. Tartım sonrasında terazi üzerinde toz oluşmuş ise yumuşak fırça ile temizlenmeli ve damıtık su ya da %70 etil alkol ile silinmelidir. SORULAR 1. Agarlı besiyerinin döküm sıcaklığının neden 45-50°C olduğunu açıklayınız. 2. Aseptik koşul ne demektir? 3. Besiyeri dökümünün aseptik koşullarda yapılmaması ne gibi olumsuzluklara neden olur? 8 UYGULAMA 2: ÖRNEK ALIM-TARTIMI, HOMOJENİZASYON VE DİLÜSYON, YAYMA KÜLTÜR YÖNTEMİ A. ÖRNEK ALIM-TARTIMI, HOMOJENİZASYON VE DİLÜSYON Gıdaların mikrobiyal yükünün belirlenmesinde beş aşama mevcuttur; Örnek alımı-tartımı, homojenizasyon, dilüsyon, ekim, sayım ve değerlendirme. Yapılan ekimlerde ilk üç basamak aynıdır. Gıdalardan mikrobiyolojik analiz için örnek almak oldukça zordur. Örneğin, alındığı andaki mikrobiyolojik kriterleri koruyarak tüm gıdayı temsil edecek şekilde alınıp laboratuvara getirilmesi, açılması ve ekim için hazırlık yapılması konularında dikkat edilmesi gereken noktalar mevcuttur. 1.Örnek Alımı-Tartımı - Alınan örnekteki mikrobiyolojik yükün değişmeyecek şekilde laboratuvara getirilmesi esastır. Kontamine etmeden, soğutulmuş ise ısınmadan, donmuş ise çözünmeden hızlı bir şekilde örnek alınıp analiz yapılacak yere ulaştırılmalıdır. - Analiz edilecek gıda miktarı, sayım yapılacak analizler için 10 g(mL); patojen bakterilerde var/yok testi için 25 gram olarak alınır. Tartımın aseptik koşullarda yapılmalıdır. - Tartım esnasında havadan, tartım yapılacak tartım kabından, spatülden, bıçaktan vs. herhangi bir bulaşmanın olmaması için özen gösterilmelidir. Bu sebeple steril petriye, saat camına tartım yapılmalıdır. - Terazi üzerine gereksiz ağırlık konulması sakıncalıdır ve fazla miktar örnek aktarıldığında geri alınmasında zorluklar yaşanabileceğin dolayı tartım beher, erlen gibi kaplara değil steril saat camı, steril petri kutusu, steril alüminyum folyo gibi materyallerde tartılmalıdır. - Sıvı örnekler doğrudan analize alınabilir. Katı gıdalar ise tartım, homojenizasyon vb. gibi ön işlemlerden geçmek zorundadır. - Dondurulmuş örnek analiz öncesi çözündürülmeli ve çözünme tamamlandıktan sonra hızlıca analize alınmalıdır. Çözünme işlemi buzdolabında daha yavaş olacak şekilde veya hızlıca dışarda yapılabilir. 9 - Alınan örnek sayısı ilgili partiyi temsil edecek şekilde olmalıdır. Çabuk bozulan, hamileler, yaşlılar ve çocuklar için hazırlanan gıdalar, ambalaj boyutu küçük olan, patojen bakteri riski yüksek olan vs. gıdalardan daha çok örnek alınmalıdır. 2.Homojenizasyon Homojenizasyon, analize alınacak gıda maddesindeki mikroorganizmaların seyreltme sıvısına geçmesini sağlamak amacıyla yapılır. Özellikle katı gıdalarda mikroorganizmaların tamamen sayılabilmesi veya saptanabilmesi için gıdanın iyice parçalanması gerekmektedir. Gıdanın çeşidine göre homojenizasyon yapılması gerekebilir. Sıvı ya da kolay eriyen gıdalar için herhangi bir ön hazırlığa gerek yoktur. Seyreltme sıvısı içerisinde mekanik bir karıştırma ile homojenize edilebilirler. Tereyağı homojenizasyonunda kullanılan çözeltiler 25-30°C’de olmalıdır. Pipetleme esnasında da pipetin içerisinde yağın donup kalmaması için pipet alevden geçirilerek ısıtılır. Diğer ürünler blender, stomacher kullanılarak homojenize edilebilirler. Homojenizasyon işlemi genel olarak 1:9 oranında yapılır. Bunun için başlangıçta 10 g(mL) örnek 90 mL seyreltme sıvısı ile homojenize edilir. Homojenizasyondaki seyreltme aynı zamanda birinci dilüsyon olarak da kullanılır. Bu sebeple homojenizasyonda gıda ve seyreltme sıvısının miktarına özen gösterilmelidir. 3.Seyreltme (Dilüsyon) Seyreltme, gıdanın 1 gramında veya 1 mililitresinde çok yüksek sayıda bulunan mikroorganizma sayısını sayılabilecek düzeye indirgemektir. 10 Şekil 1. Dilüsyonun hazırlanması Bir gıdanın 1 mL’sinde 100000 adet bakteri bulunursa, bu gıda örneğinde petri kutusuna 1 mL aktarıp inkübasyona bıraktığımızda besiyeri üzerinde 100000 adet bakteri kolonisi gelişir. Bu kadar koloninin sayılması mümkün değildir. Seyreltme işlemi ile petri kutusuna sayılabilecek düzeyde bakteri aktarılması hedeflenir. İdeal olarak petri kutusunda 100 koloni gelişmesi istenir. Analizi yapılacak gıdanın tahmini olarak mikrobiyal yükünden hareketle seyreltme oranı belirlenir. Seyreltme standart olarak 1:9 oranında yapılır. 10 g (mL) örnek 90 mL seyreltme sıvısına karıştırılır. Ancak patojen bakterilerde yapılan var/yok analizinde 25 g(mL) gıda 225 mL seyreltme sıvısı ile karıştırılır. Burada seyreltme amacı yoktur; mikroorganizmaların gelişeceği ortamda yeterli besiyeri sağlamak amaçlanmaktadır. Kuru nane, un, hazır çorba, kuru maydonoz gibi ürünlerde 1:9 oranında seyreltme yapıldığında ise un ve hazır çorba pıhtılaşır, nane ve maydonoz tüm suyu çeker ve hamur haline gelir. Bu nedenle başlangıç seyreltme 1:19 oranında yapılır. Seyreltmenin 1:9 oranında yapılmasının nedeni, hesap kolaylığı sağlamak içindir. Petri kutusunda sayılan koloni basit olarak seyreltme faktörü ile çarpılır. Burada 1:9 oranı kullanıldığında, seyreltme faktörü olarak 10,100,1000 gibi değerlerle çarpılır. Şekil 2. Dilüsyonun hazırlanması Seyreltme işlemi yapıldıktan yaklaşık 15 dakika içinde ekim bitirilmiş olmalıdır. Bu süre uzarsa, koliformlar gibi hızlı çoğalan bakterilerin sayısı artabilir. - Seyreltme Sıvıları Seyreltme sıvısı olarak; 11 %0,1 peptonlu su %0,85 NaCl (FTS: fizyolojik tuzlu su) MRD (Maximum Recovery Diluent; %0,85 NaCl+ %0,1 pepton) Ringer Çözeltisi (süt ürünleri için) %0,2 sodyum sitrat çözeltisi (peynirler için) gibi çözeltiler kullanılmaktadır. Homojenizasyon ve seyreltme işlemlerinde seyreltme sıvıları, izotonik ortam oluşturarak mikroorganizmaların ozmotik şoka uğramalarını engellemek amacıyla kullanılır. Eğer bu işlemler seyreltme sıvısı yerine saf su ile yapılırsa hüzreler su alarak patlayabilirler (PLAZMOPTİZ). SORULAR: 1. Homojenizasyonun amacı nedir? 2. Seyreltmenin amacı nedir? 3. Seyreltme sıvısı olarak saf su yerine fizyolojik tuzlu su, %0,1 peptonlu su gibi çözeltilerin tercih edilme sebebi nedir? 4. Homojenizasyon ve seyreltme işlemlerinde 1:9 oranının kullanılma sebebi nedir? B.YAYMA KÜLTÜR YÖNTEMİ İLE MİKROORGANİZMA EKİMİ Ekim yöntemleri, besiyerinin katı veya sıvı olmasına göre sınıflandırılabilir. 1. Katı besiyeri kullanılan yöntemler: Dökme Kültür Yöntemi Yayma Kültür Yöntemi Damla Kültür Yöntemi 2. Sıvı besiyeri kullanılan yöntemler: EMS (En Muhtemel Sayı) Yöntemi Katı besiyeri kullanılan yöntemlerde, her bir canlı hücrenin katı besiyeri üzerinde bir koloni oluşturduğu varsayılır ve oluşan koloniler sayıldıktan sonra gerekli hesaplamalar yapılarak örnekteki mikroorganizma sayısı belirlenir. Sonuç k.o.b./g veya k.o.b./mL olarak verilir. [k.o.b.: koloni oluşturan birim c.f.u.: colony forming unit] 12 Şekil 3. Besiyerinde Oluşan Koloniler YAYMA KÜLTÜR YÖNTEMİ Ekim yapılacak dilüsyonlardan katı besiyeri bulunan petri kutularına 0,1’er mL aktarılır ve drigalski spatülüyle* yayılır. *Drigalski spatülü ince bir cam bagetin özel bir şekilde kıvrılmasıyla elde edilir. Şekil 4. Drigalski Spatülünün Besiyeri Üzerinde Kullanımı Yayma yönteminde dikkat edilecek en önemli nokta, spatülün sterilizasyonudur. Drigalski spatülü kullanılmadan önce alkole daldırılıp alevden geçirilerek sterilize edilmelidir. Spatül üzerinde kalan alkol, besiyerine aktarılan mikroorganizmalar üzerinde olumsuz etki yapabilir. Bir kez alevden geçirilerek alkolün uzaklaşması sağlanır. Alkolün uçması yeterlidir, uzun süre alevde tutulmamalıdır. Aksi halde soğuması uzun zaman alır. Soğumadan muamele edildiğinde ise sıcaklık yine mikroorganizmalar üzerinde olumsuz etki yapabilir. Spatülün sterilizasyonunda dikkat edilecek diğer husus, alkolde kalma süresidir. Seri bir ekim sırasında spatülün alkolde 2 dakikadan daha az kalması yeterli bir sterilizasyon sağlamayabilir. Bu nedenle ekim yoğunluğuna göre çok sayıda spatül kullanılması, bunların sıra ile alkolden çıkarılarak kullanılması gerekmektedir. 13 Şekil 5. Drigalski Spatülü ile Yayma Kültür Yöntemi Yayma işlemine geçilmeden önce, drigalski spatülü öncelikle petri kutusunun kapağının iç kısmına daha sonra da besiyeri yüzeyinde örnek bulunmayan bir bölgeye sürülerek soğutulmalıdır. Eğer soğutulmadan yayma işlemine geçilirse de örnekteki mikroorganizmaların zarar görmesine neden olabilir. *** Dilüsyonların hazırlanmasından sonra, ekim yapılacak örneğin mikrobiyal yükü hakkında yaklaşık bir fikrimiz varsa, ekim, o tahmini yüke göre ardışık 3 dilüsyondan yapılır. Yayma Kültür Yönteminde İnkübasyon Ekim yapıldıktan sonra petri kutuları derhal inkübasyona bırakılmalıdır. Sayımı istenen mikroorganizmaya göre belli bir sıcaklıkta inkübasyona bırakılır. Petri kutuları inkübatöre kapakları alta gelecek şekilde yani ters olarak yerleştirilir. Bunun amacı, oluşan su buharının yoğunlaşınca besiyerine değil kapağa damlamasını sağlamaktır. Aksi halde, olduğundan fazla sayıda ve büyük koloni oluşabilir ve sayım hatasına sebep olabilir. İnkübasyon süresi önemli bir husustur. İnkübasyonda gerektiğinden fazla veya az kalması yanlış sonuçların alınmasına yol açabilir. İnkübasyon sonunda petri kutularındaki koloniler hemen sayılmalı; hemen sayılamıyorsa da en çok 24 saat olacak şekilde buzdolabında (4°C) depolanmalıdır. İnkübasyon sonunda petri kutularında oluşan koloniler sayılır. Sayım sonuçları hesaplanırken,15-300 adet koloni (bazı kaynaklarda 30-300 koloni olarak geçer) içeren petriler dikkate alınır. 14 Şekil 6. Besiyerinde oluşan koloniler Yayma Kültür Yönteminde Değerlendirme Sayım sonrası ettiğimiz verilere göre örneğimizdeki canlı hücre sayısı aşağıdaki oranla hesaplanır. Örneğimizin mL'sindeki canlı hücre sayısı, dilüsyon oranına, saydığımız koloni sayısına ve kaç mL pipetlediğimize bağlıdır. Dilüsyon oranı 10-7 olan tüpten 0,1 mL pipetleyerek yaptığımız ekimde petri kutusunda 60 koloni sayılmıştır. 10-7 oranındaki dilüsyondaki sayı 60 ise 60 sayısı Ekim yaptığımız tüpün 0,1 ml'sindeki sayıdır. Eğer ki tüpten 1 mL aktarsaydık örneğin 1mL'sindeki sayı 60x107 olurdu. Ancak 1 mL değil de 0,1 mL pipetlediğimiz için mL'deki sayı 60x107/0,1 işleminden 0,6x1010 olur. Sonuç, a,b X 10c olacak şekilde verilir. İşlemi formüle edersek, sayı/ml = (koloni sayısı X seyreltme faktörü) / petri kutusuna aktarılan hacim (ml) *** Sayım sonuçlarının güvenilirliğini artırmak için aynı tüpten 2 veya 3 Petri kutusuna ekim yapılır. Sayım sonuçları paralel ekim sonuçlarının ortalaması olarak verilir. Örnek: Katı bir gıdadan yayma yöntemi kullanılarak ekim yapılmış ve aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir. Gıdadaki mikroorganizma sayısını hesaplayınız. 10-5 ..... 150 / 154 10-6......12 / 14 Sayı = [(150 + 154)/2 x 105] / 0,1 = 1,52 x 108 = 1,5 x 108 kob/g [(12+ 14)/2 x 106] / 0,1 = 2,6 x 107 kob/g Sayım sonucu, bu iki sonucun da ortalaması alınarak verilir [8,8 x 107 kob/g]. 15 SORULAR 1. Dilüsyon oranı 10-3 olan tüpten 0,05 mL pipetlenen petri kutusunda, inkübasyon sonrasındaki koloni sayısı 30 çıkmıştır. Örneğin 1 mL'sindeki canlı hücre sayısını bulunuz. 2. Eğer en yüksek dilüsyonda sayı 300’ü geçiyor ise ne yapabiliriz? 3. Neden adet/g veya adet/mL yerine kob/g veya kob/mL ifadesi kullanılır? Gıdalarda Toplam Mezofil Aerob Bakteri (TMAB) ve Maya-Küf Sayımı Gıdalarda uygulanan rutin mikrobiyolojik analizlerdir. TMAB ve maya-küf sayısı gıdanın üretim koşulları, üretimden sonraki depolama koşulları vs. hakkında fikir verir. Bu nedenle TMAB ve maya-küf sayısı ile ilgili olarak her gıda maddesi için belirlenmiş bir üst sınır vardır. TMAB SAYIMI: Kullanılan besiyeri: Plate Count Agar (PCA)(Genel bir besiyeri) İnkübasyon sıcaklığı: 28-30oC İnkübasyon süresi: 48 saat ***Tipik sarı koloniler oluşur. Şekil 7. PCA besiyerindeki tipik sarı koloniler MAYA-KÜF SAYIMI: Kullanılan besiyeri: Oksitetrasiklin Glukoz Yeast Ekstrakt Agar (OGYEA) İnkübasyon sıcaklığı: 28-30oC 16 İnkübasyon süresi: 72 saat (gerektiğinde 1 haftaya kadar uzatılabilir) ***Maya-küf sayımında, inkübasyona bırakılan petriler, farklı olarak kapakları üste gelecek şekilde inkübatöre konulur. Şekil 8. OGYE agarda maya ve küf oluşumu Maya ve küflerin sayımı amacıyla yapılacak ekimde yayma ve dökme kültürel yöntemi kullanılabilmektedir. Yayma kültürel yöntem, besiyeri yüzeyinde maya ve küflerin daha hızlı üremesi, düzgün ve standart koloni oluşumu, sayım sonrası izolasyon, identifikasyon kolaylığı nedenleriyle daha avantajlıdır. Maya-küf sayımında, 10 ila 150 koloninin oluştuğu petri kutuları sayım için kullanılmalıdır. Maya küf sayımı sırasında, örnekte bulunması muhtemel bakterilerin gelişimini engellemek amacıyla ya besiyerinin pH'sı 3,5-5,4 düzeyine düşürülmekte ya da besiyerinin antibiyotik veya inhibitör renk maddesi ilave edilmektedir. OGYE Agar'da bulunan oksitetrasiklin antibiyotiği bakteri gelişimini engeller. Bu besiyeri her tür örnekte maya küf sayımı ve belirlenmesi amacıyla kullanılan bir besiyeridir. SORULAR “Toplam bakteri” ile “Toplam Mezofil Aerob Bakteri” ifadeleri arasındaki farkı tartışınız. Neden maya-küf sayımında inkübasyon süresi daha uzundur? OGYE Agar’da bakteriler gelişebilir mi? Besiyeri üzerinde küf ve maya kolonisini birbirinden nasıl ayırırsınız? OGYEA ve PCA besiyerleri arasındaki farklar nelerdir? 17 UYGULAMA 3: DÖKME KÜLTÜR (ÇİFT KATLI EKİM) VE EMS YÖNTEMİ İLE KOLİFORME.coli SAYIMI, DEĞERLENDİRİLMESİ, IMVIC TESTİ İLE DOĞRULANMASI A.DÖKME KÜLTÜR YÖNTEMİ Örneğin dilüsyonları hazırlandıktan sonra, ekim yapılacak olan dilüsyon tüplerinden, steril petri kutularına 1’er mL aktarılır. Üzerine 45-50°C’deki su banyosunda bekletilen besiyerinden 10-15 mL olacak şekilde dökülür. Düz bir zeminde yavaşça 8 çizerek besiyeri ile örneğin karışması sağlanır. Çift katlı ekim için, dökülen besiyeri katılaştıktan sonra yüzeyi kaplayacak şekilde, besiyerinden ikinci bir kat daha dökülür. İkinci kat da katılaştıktan sonra, örnek inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası sayım yapılarak örnekteki mikroorganizma sayısı bulunur. *** Besiyeri dökme sıcaklığı önemlidir. 45°C’nin altında besiyeri donabileceği gibi daha sıcak dökülmesi de mikroorganizmalara zarar verebilir. *** Besiyerini petri kutusuna döktükten sonra karıştırma işlemi hemen tamamlanmalıdır. Döktükten sonra besiyeri hızla soğur ve katılaşır. Gıdalarda Koliform ve E.coli Sayımı o Koliform grup bakteriler gıdalarda hijyen indikatörü olarak değerlendirilir. Gıdalarda koliform grup bakteri sayısının yüksek olması istenmez. Bazı gıdalarda belirli bir miktar örnekte yok olması hedeflenirken, pastörize içme sütü dahil pek çok gıdada bitki ve toprak kökenli koliformların belirli sayılarda bulunmalarına izin verilmektedir. Buna bağlı olarak gıda analizinde sayım ya da var/yok testleri uygulanır. o E.coli, en tipik Gram negatif bakteridir. Herhangi bir örnekte E.coli’ye rastlanılması o örneğe doğrudan veya dolaylı olarak kanalizasyon suyu ile dışkı bulaştığının kesin göstergesidir. Tüketime hazır gıdada E.coli bulunması istenmez. Kullanılan besiyeri: VRB Agar İnkübasyon sıcaklığı: 37°C 18 İnkübasyon süresi: 18-24 saat o VRB Agar: Hazırlanmış besiyeri parlak ve kırmızı-kahve renklidir. Besiyeri bileşiminde bulunan safra tuzları ve kristal viyole başta Gram pozitifler olmak üzere refakatçi floranın gelişimini inhibe eder. Laktoz pozitif bakterilerin varlığı ise pH indikatörü ile koloni renginin kırmızıya dönüşmesini ve safra asitlerinin de koloni etrafında çökelti oluşturması ile belirlenir. *** Koliform grup bakterilerin, laktozdan asit oluşturmaktadır. İnkübasyon sonunda, VRB agar besiyerinde 1-2 mm çaplı koyu kırmızı renkli koloniler koliform grup bakteri olarak sayılır. Şekil 9. VRB Agar’da Koliformlar - Koliform grup sayısı standart şekilde hesaplanır ve kob/g(mL) olarak verilir. - Değerlendirme sonrası, mikroorganizma gelişmesi olmayanlar da dahil olmak üzere inkübatörden çıkan tüm malzeme otoklavda steril edildikten sonra yıkanır/atılır. B.GIDALARDA KOLİFORM VE E.coli SAYIMI (EMS YÖNTEMİ) Dilüsyon, Ekim, İnkübasyon - Örnek, uygun dilüsyon sıvısı ile 1:9 oranında standart bir şekilde seyreltilir. - Ekim yapılmak istenen her bir dilüsyondan, içerisinde durham tüpü ve fluorocult özellikte* LST Broth bulunan 3 tüpe 1’er mL aktarılır. - Tüpler, 37°C’de 48 saat inkübasyona** bırakılır. *Fluorucult özellik; inkübasyon sonunda, enzimatik faaliyet sebebiyle floresan ışıma ile koloninin ayırt edilmesine yarayan bir özelliktir. ** Koliformlar, 37°C’de 48 saatte laktozdan asit ve gaz oluşturan bakterilerdir. 19 Şekil 10. EMS Yönteminin Uygulanışı Hesaplama ve Değerlendirme: - Tüplerin içerisinde bulunan durham tüpü, gaz oluşup oluşmadığını dolayısıyla ortamda koliform olup olmadığını anlamamızı sağlar. Gaz oluşumu varsa durham tüpünde birikerek koliform varlığını ortaya koyar. Şekil 11. Soldaki tüp; bakteri ekimi yapılmamış tüp, Ortadaki tüp; ekimi yapılan bakteri üremiş fakat gaz oluşturmamış, Sağdaki tüp; ekimi yapılan bakteri gaz oluşturmuş. Gaz oluşumu olan tüpler (+) olarak değerlendirilir ve 3lü ekim sisteminden bir kod elde edilir. Elde edilen kod ile istatistiksel olarak hazırlanmış çizelgelerden mikroorganizma sayısı hesaplanır (Çizelge 1). - E.coli sayımında veya varlığının tespitinde ise, gaz oluşumu gerçekleşmiş tüplere UV ışığı altında bakılarak floresan özellik gösteren tüpler işaretlenir. *** Fluorocult özellikteki besiyeri, E.coli varlığında, UV ışığı altında parlaklık verir. 20 Şekil 12. Floresan Parlaklık Veren Tüpler Çizelge 1. EMS Çizelgesi 21 C.IMVIC TESTLERİ a. İNDOL TESTİ Bu test, mikroorganizmaların bir aminoasit olan triptofanı ayrıştırarak indol meydana getirebilme yeteneğini belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda, bakterilerin cins (Salmonella (-), Edwardsiella (+), E. coli (+), Klebsiella (-), Enterobacter (+), ve türlerin (P. multocidea (+), P. haemolytica (-), P. mirabilis (-), P. vulgaris (+) ayırımında da işe yarar. Analizin Yapılışı: Mikroorganizmalar sıvı besiyerine (Tripton Water) ekildikten sonra 37 °C de 24 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyondan sonra kültürlerin üzerine Kovac’s ayıracından 0,5 ml ilave edilir. Tüplerin üst kısmında bir iki dakika içinde kırmızı bir halkanın oluşması pozitif olarak değerlendirilir. Sarımsı halka indolun oluşmadığını gösterir ve negatif olarak değerlendirilir. Renk, indol içinde bulunan pyrrole'den ileri gelir. Şekil 14. Negatif İndol ve Pozitif İndol Tüpler b. METİL RED-VOGES PROSKAUER (MR-VP) TESTİ Bu test, bazı mikroorganizmaların glikozu fermente ederek, nötral bir ürün olan acetylmethylcarbinol'u (acetoin) meydana getirme yeteneğini tayinde kullanılır. Bakteri türlerini (K. pneumoniae (+), E. coli (-)) belirlemede kullanılır. Glikoz, önce pirüvik asit'e metabolize olur. Pirüvik asidin ayrışması, bakterilerin türlerine göre aerobik veya anaerobik yolla olur. Glikozun fermentasyonu sonu acetoin ve bunun bir nötral redüksiyon ürünü olan 2,3 -butanediol'da (CH3.CHOH.CH3) meydana gelmektedir. 22 Voges Proskauer testi ile metil red testi, ortamlarının aynı olması nedeniyle birlikte uygulanabilirler. Metil red pozitif olanlarda (organik asit fazla olması nedeniyle), VP reaksiyonu negatif olabilir. Nötral ürünler meydana gelmeyebilir (genel bir kural değil). İlk başlangıçta MR testi pozitif görülebilir. İnkübasyon süresi uzarsa acetoin oluşabilir. Analizin Yapılışı: 1. Bir öze dolusu 18-24 saatlik kültür, MRVP besiyerine aşılanır. 2. 37°C’de 48 saat inkübasyona bırakılır. 3. İnkübasyon sonrası bu kültürden 1 mL, VP testi için başka bir tüpe aktarılır. 4. Tüpte geri kalan kısım MR testinde kullanılır. - Metil-red testi: Tüpte kalan kültüre 5-6 damla metil kırmızı solüsyonu damlatılır ve tüp çalkalanır. **MR (+) ise tüpte kırmızı, **MR (-) ise tüpte sarı renk oluşur. Şekil 16. Metil Red Testinde Pozitif (soldaki) ve Negatif (sağdaki)Tüpler -Voges-Proskauer testi: İnkübasyon sonrası ayrılan 1 mL kültüre, 0,6 mL alfa-naftol solüsyonu, 0,2 mL KOH solüsyonu katılarak iyice çalkalanır. Sonuç 5-10 dakika içinde belirlenir. ** VP (+) ise tüpte parlak kırmızı renk oluşur. Şekil 17. Voges-Proskauer Testinde VP (+) Tüp 23 UYGULAMA 4: MEMBRAN FİLTRASYON İLE SU ANALİZİ, READYCULT VE ENVİROCHECK KULLANIMI A.MEMBRAN FİLTRASYON Bu yöntem, hem toplam bakteri sayısının hem de canlı bakteri sayısının belirlenmesine uygundur. Aynı zamanda, nispeten oldukça az sayıda bakteri içeren bakteriyolojik analizler için de kullanılabilir. Belli hacimdeki bir bakteri süspansiyonunun, alanı belli bir filtre yüzeyinden süzülmesi, bu yöntemin prensibini oluşturur. Eğer filtre edilecek sıvının bakteri yoğunluğu çok daha fazla ise, materyal önce steril su ile seyreltilmelidir. Uygun tarzda seyreltilen örnek, emilmek suretiyle filtre edildikten sonra, örneğin konulduğu haznenin kenarları steril su ile yıkanarak, bu suyun da filtreden süzülmesi sağlanır. Eğer örnek çok seyreltikse, yani çok az sayıda bakteri içeriyorsa, daha fazla miktarda örnek filtreden geçirilir. Canlı hücrelerin sayımı amacıyla materyalin oldukça yüksek oranda seyreltilmesi gerekir. Seyreltme işlemi, çapı 50 mm olan filtre yüzeyinde toplam 50 -100 hücreden fazla bulunmayacak şekilde yapılmalıdır. Sayımda her bir alandaki ortalama hücre sayısı, toplam filtre alanı ve filtrat hacminden yararlanılarak orijinal örneğin 1 ml 'sindeki toplam hücre sayısı hesaplanır. Filtrasyon aletinin filtresi ile birlikte otoklavda (120 °C 'da 10 dakika) veya metal kısımlarının alevle, steril olmayan filtrenin de kaynatılarak sterilize edilmeleri gerekir. Filtrasyon işleminden sonra filtre, steril bir pens ile alınıp, içinde uygun bir agarlı besiyeri bulunan Petri kutusuna filtre yüzeyi üstte kalacak şekilde konur. Uygun bir inkübasyon sıcaklığı ve süresi sonucunda gelişen koloniler, bir koloni sayıcısı yardımıyla sayılır. Burada, yalnızca seçilen kültürel koşullarda gelişme yeteneğinde olan bakterilerin koloni oluşturabilecekleri açıktır. Materyalin filtrasyonundan sonra filtrenin steril destile su ile yıkanması, bazı hallerde çok fazla miktarda suyun kullanılmasını gerektirebilir. Şöyle ki, incelenecek örneğin, suda çözünen ancak mikroorganizma gelişmesini olumlu veya olumsuz yönde etkileyecek unsurlar içermesi halinde, bu unsurların filtrasyon sırasında destile su ile yıkanarak uzaklaştırılması gerekebilir. 24 Analizin yapılışı: - Belli miktarda su, membran filtrasyon sisteminden geçirilir, filtre sayılmak istenen mikroorganizmaya özgü besiyeri üzerine yerleştirilir. ***Filtrenin, bakterilerin tutulmuş olduğu üst kısmı, Petri kutusuna yerleştirmede yine yukarıda olmalıdır. - Petri kutusu tabanı üzerinde olacak şekilde 30-32°C ya da 35-37°C'de 24 saat inkübasyona bırakılır. - İnkübasyon sonrasında sayım ve değerlendirme yapılır. B.READYCULT VE ENVİROCHECK KULLANIMI READYCULT COLİFORMS In vitro(canlı hücre dışında) yapılan standart mikrobiyolojik analizlerde sularda koliform grup bakteri ve Escherichia coli aranması için kullanılır. Etki Şekli: besiyeri bileşimindeki lauryl sulfate refakatçi florayı inhibe ederken, kromojenik substrat X-GAL koliform bakterilerin; MUG ise E.coli belirlenmesinde kullanılır. Analizin yapılışı: - Analiz edilecek suya hazır olarak mevcut olan paketten ilave edilir. 100 veya 50 mL’lik paketler mevcuttur. Analiz edilmek istenen miktara göre paket tercihi yapılır. - 37°C’de 18-24 saat inkübasyona bırakılır Sonuçların değerlendirilmesi: - Süre sonunda besiyerinin mavi-yeşil olması koliform varlığını gösterir. Besiyerinin sadece üst kısmında renk değişimi gözlenirse aynı şekilde koliform grup bakteri pozitif olarak değerlendirilir. - Koliform grup pozitif bulunan örneklere UV el lambası ile bakılarak floresan ışıma verip vermediği incelenir. Floresan ışıma E.coli varlığını gösterir. ** Bu besiyeri su analizinde kullanılır. Besiyeri su örneğine ilave edilirken aseptik koşullarda çalışılmalıdır. 25 Şekil 18. Readycult Coliform testinde, koliform negatif (sarı), koliform pozitif (yeşil), E.coli pozitif (floresan parlaklık) olan su örnekleri READYCULT ENTEROCOCCİ In vitro(canlı hücre dışında) yapılan standart mikrobiyolojik analizlerde sularda enterokok aranması için kullanılır. Etki Şekli: besiyeri bileşimindeki Sodium-azide, refakatçi florayı ve özellikle enterokoklarla birlikte bulunabilen Gram negatif bakterileri inhibe eder. Seçilmiş peptonların desteği ile XGLU (5-bromo-4chloro-3indolyl-B-D-glucopyranoside), eterokoklar için karakteristik olan BD-glukozidaz enzimi ile yoğun mavi-yeşil renk veren bileşiğe parçalanır. Sodium-azide konsantrasyonu, aynı enzime sahip refakatçi floranın inhibisyonu açısından önemlidir. 26 Analizin yapılışı: - Analiz edilecek 100 mL suya hazır olarak mevcut olan paketten bir tane ilave edilir - 37°C’de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. Sonuçların değerlendirilmesi: - Süre sonunda besiyerinin mavi-yeşil olması enterokokların varlığını gösterir. Besiyerinin sadece üst kısmında renk değişimi gözlenirse aynı şekilde koliform grup bakteri pozitif olarak değerlendirilir. - Besiyerinde enterokoklardan başka bakteriler de mavi-yeşil renk oluşturmadan gelişebilir. Enterokok varlığı suda bulanıklık oluşmasıyla değil, besiyerinde mavi-yeşil renk oluşması ile belirlenir. ** Besiyeri su örneğine ilave edilirken aseptik koşullarda çalışılmalıdır. Şekil 19. Readycult enterokok testinde, enterokok pozitif (soldaki), üreme mevcut ama enterokok negatif (ortadaki), ekim yapılmamış örnek (sağdaki). 27 UYGULAMA 5: Cronobacter sakazakii İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU Cronobacter sakazakii’nin Özellikleri Cronobacter sakazakii, Enterobacteriaceae familyasında yer alan, hareketli, Gram-negatif, Katalaz-(+), çubuk şekilli bakteridir. Enterobacter sakazakii olan bakteri 2007 yılından itibaren Cronobacter sakazakii adını almıştır. Şekil 20. Cronobacter sakazakii’nin ESA ve TSA’da görünümü E. sakazakii enfeksiyonlarının özellikle toz bebek mamalarından kaynaklandığı ifade edilmektedir. Bu bakteri bebek mamalarının dışında; peynir, et, sebze, hububat, bitki ve baharatlar vb gıdalardan da izole edilmektedir. Enterobacter sakazakii’nin toz bebek maması üretiminin pastörizasyon prosesinde canlı kalamadığı ancak bu ürünün pastörizasyonu takiben yapılan mikronutrientlerin eklenmesi ve rekonstitüsyon işlemleri sırasında kontamine olduğu belirtilmektedir. İZOLASYON 1. İçerisinde Cronobacter sakazakii bakterisinin bulunulup bulunmadığından şüphelenilen gıdadan 25 g tartılıp 225 mL tamponlanmış peptonlu suya (TPS) eklenir ve homojenizasyon işlemi gerçekleştirilir. *** Patojen bakterilerin homojenizasyon işleminde 25:225 oranı kullanılır. Amaç seyreltmek değildir! Patojen bakterilerde sayı önemli değildir. Önemli olan var ya da yok olduğudur. 28 2. Homojenizasyonu yapılmış gıda, ön zenginleştirme için 37˚C’de 24 saat inkübasyona bırakılır. SORU 1: Ön zenginleştirme nedir? Ne amaçla yapılır? 3. Ön zenginleştirme yapılan gıdadan Enterobacter sakazakii agar (ESA) besiyerine izolasyonu gerçekleştirmek amacıyla sürme yapılır. 37 ˚C’de 24 saat inkübasyona bırakılır. 4. İnkübasyon sonunda gelişmiş olan turkuvaz koloniler şüpheli Cronobacter sakazakii bakterileri olarak tanımlanır. *** C. sakazakii’nin biyokimyasal özelliklerinden yola çıkılarak bazı kromojenik besiyerleri geliştirilmiştir. Cronobacter sakazakii bakterisi ESA’da turkuvaz koloni oluşturur. SORU 2: Kromojenik besiyeri nedir? Özellikleri nelerdir? SORU 3: Cronobacter sakazakii bakterisi ESA’da turkuvaz koloni oluşturma mekanizması nasıldır? 5. Şüpheli 5 Cronobacter sakazakii kolonisi alınarak Tyriptic Soy Agar (TSA) besiyerine sürme yapılır ve 37˚C’de 24 saat inkübasyona bırakılır. *** Cronobacter sakazakii bakterisi TSA besiyerinde sarı koloni oluşturur. SORU 4: Cronobacter sakazakii bakterisinin TSA besiyerinde sarı koloni oluşturma sebebi nedir? 5. Şüphelenilen kolonilere bakteriyi doğrulamak amacıyla biyokimyasal testlerden KOH testi ve katalaz testi uygulanır. İDENTİFİKASYON a.KOH Testi Gram boyama metodu çok daha güvenilir olmakla birlikte, bu test kabaca yapılan genel durum tespit çalışmalarında hızlı bir yöntem olarak yeterlidir. Katı besiyerinde doğrulaması yapılmak istenen koloninin yoğun olduğu bölgeye 1-2 damla %3’lük potasyum hidroksit çözeltisi (KOH) damlatılır ve öze yardımı ile bastırılarak karıştırılır. Yaklaşık 5-10 saniye sonra öze dikkatli bir şekilde damla üzerinden kaldırılır. 29 Mukoza benzeri (çekince uzayan) bir oluşum veya ipliklenme görülürse, bakterinin Gram (-) olduğu düşünülür. *Mukoza benzeri oluşum, bakteri hücre çeperlerinin yıkımı ve bunun sonucu olarak DNA’nın açığa çıkmasıyla açıklanabilmektedir. b.Katalaz Testi Katı besiyerinde doğrulaması yapılmak istenen koloninin yoğun olduğu bölgeye %3’lük H 2O2 çözeltisinden damlatılır. Petride gaz kabarcıkları oluşumu katalaz pozitif olarak değerlendirilir. 7. Çıkan sonuçlara göre bakterinin Cronobacter sakazakii bakterisi olup olmadığı kısmen doğrulanmış olur. SORU 5: Cronobacter sakazakii bakterisinin katalaz aktivitesi ve Gram pozitif veya negatif olma durumu nedir? 30 UYGULAMA 6: Salmonella spp. İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU İZOLASYON - 25 g/mL örnek alınıp 225 mL tamponlanmış peptonlu suya aseptik koşullarda eklenir. Gerekirse homojenize edilir. Ön zenginleştirme amacıyla 37°C’de 24 saat inkübe edilir. - Ön zenginleştirme işlemini takiben selektif zenginleştirme amacıyla, içlerinde selenit sistin broth bulunan tüplere 1 mL zenginleştirme homojenizatından ilave edilerek 3537°C’de 24-48 saat inkübe edilir. - Selektif zenginleştirme besiyerlerinden 24. ve 48. Saatlerde bir öze dolusu alınarak XLT4 Agar besiyerine çizme yöntemi ile ekim yapılarak petri kutuları 37°C’de 24-48 saat inkübe edilir. - XLT4 Agardaki siyah veya siyah merkezli sarı çeperli tipik Salmonella kolonilerinden 3-5’i seçilerek Nutrient Agara geçilerek biyokimyasal testleri yapılır. ***XLT4 Agar besiyeri bileşimindeki besin maddeleri Salmonella 'nın gelişimini teşvik ederken, Tergitol-4 ve Sodium tetra-decylsulfate refakatçi florayı inhibe eder. 35-37 oC'da 1824 saat inkübasyondan sonra Salmonella kolonileri hidrojen sülfür oluşumuna bağlı olarak siyah renkli görülür. Şekil 21. Salmonella spp. bakterisinin XLT4 agar besiyerinde görünümü (solda) ve XLT4 agar besiyerinin ekim yapılmamış hali 31 *Burada üreyen kolonilerden biyokimyasal reaksiyonlar için Triple Sugar Iron Agar, Urea Agar Base ve Lysine Iron Agara ekim yapılarak 37°C’de 24- 48 saat inkübasyona bırakılır. *Test sonuçlarına göre TSI Agarda besiyerinin dip kısmının sarı (glikozun kullanımı) ve siyah olması (hidrojen sülfür oluşumu), yüzeyin kırmızı olması (laktoz ve sakkarozun kullanılmaması), LIA testinde besiyerinin dip kısmı ve yüzeyin menekşe renkli olması ve dipte siyah renk oluşması (hidrojen sülfür oluşumu), SCA testinde besiyeri yüzeyinde mavi renk oluşumu pozitif olarak kabul edilir. Ayrıca üreaz testinde üre agarda besiyerinin sarıya dönüşmesi (üre negatif) durumunda koloniler Salmonella olarak değerlendirilir. İDENTİFİKASYON a. TSI (Triple sugar iron agar): Triple sugar iron agar besiyeri kullanılarak yapılır. Bu besiyeri tüpte yatık agar olarak hazırlanır. Besiyeri ekim yapılmadan önce berrak kırmızıdır. Ekim TSI besiyerinin yüzeyine öze ile sürme ve dibe aşılama işlemi iğne uçlu özeyi dip kısma doğru daldırmayla yapılır. 37°C’de 48 saat inkübasyon sonunda besiyerindeki renk değişimine göre değerlendirme yapılır. + _ Dipte sarı renk Glikozun kullanıldığını Glikozun kullanılmadığını Dipte siyah renk H2S oluşturduğunu H2S oluşturmadığını Yüzeyde sarı renk Dipte çatlak ve yarıklar Laktoz ve/veya sakarozun Laktoz ve/veya sakarozun kullanıldığını kullanılmadığını Glikozdan gaz oluşturduğunu 32 Glikozdan oluşturmadığını gaz Şekil 22. TSI agar ile yapılan analiz sonuçları b. Üre Testi Şüpheli Salmonella kolonisi, Urea Broth besiyerine inoküle edilir. 37oC'da 48 saate kadar süren inkübasyon sonunda, besiyerinin orijinal portakal kırmızısı renginin sarıya dönüşmesi negatif (Salmonella), kırmızıya dönüşmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir c. Lisin Dekarboksilaz Testi Dekstroz, fermente olabilen bir karbonhidrat kaynağı olarak hizmet eder. pH göstergesi, bromkresol moru, pH 5,2 veya altında sarıya döner ve pH 6,8 veya üzerinde mordur. Besiyeri bileşimindeki lisin, LDC pozitif bakteriler tarafından kadeverine çevrilir. Bu reaksiyon pH indikatörünün menekşe renk almasına neden olur. Bu nedenle önce glikoz fermentasyonu sonucu ortam asitlenir. LDC enzimi olmayan bakterilerde besiyeri rengi sarı olarak kalırken, bu enzime sahip bakterilerde mor rengini alır. İnkübasyonun uzaması halinde alkalinizasyon gerçekleşip sahte pozitif sonuçlar çıkabilir. Bu nedenle inkübasyon süresi 24 saati geçmemelidir. Bazı bakteriler de lisin, lar çıkabilir. Bu nedenle inkübasyon süresi 24 saati geçmemelidir. Bazı bakteriler de lisini a-ketokarboksilik asit oluşacak şekilde deamine eder. Bu bileşik yüzeyin hemen altında oksijen etkisi ile demirle reaksiyona girer ve kırmızımsı kahverengi bir bileşik oluşturur. Hidrojen sülfür oluşumu dipte siyah renkle belirlenir. Lisin, lisin dekarboksilaz ve lisin deaminaz enzimlerini saptamada kullanıma yönelik bir substrattır. Bu test ile enterik mikroorganizmaların lisini dekarboksile veya deamine etme yeteneğine bakılarak değerlendirme yapılır. Analizin Yapılışı: 1. Bu test için Lysine Iron Agar kullanılır. Yatık agar olarak hazırlanır. 2. 18-24 saatlik kültürden besiyerine ekim yapılır; yatık yüzeyine kültüre batırılmış yuvarlak uçlu öze ile sürme yapılırken, kültüre daldırılmış iğne uçlu öze ile besiyerinin yüzeyinden dibine doğru olacak şekilde daldırarak aşılama yapılır. 33 ** Besiyeri sarı ise, lisin dekarboksilaz (-) Besiyeri mor ise, lisin dekarboksilaz (+) *** H2S oluşumuna bağlı olarak tüpün dip kısmında siyah renk oluşumunu gözlense de lisin dekarboksilaz testi TSI gibi H2S oluşumunu ölçmede sağlıklı, güvenilir bir test değildir. Şekil 23. Lisin dekarboksilaz ile yapılan analiz sonuçları Soldaki tüp; bakteri aşılanmamış tüp Soldan ikinci tüp; lisin dekarboksilaz (-) Soldan üçüncü tüp; lisin dekarboksilaz (+); H2S (+) Sağdaki tüp; lisin deaminaz (+) d. Sitrat Testi Bu test, mikroorganizmaların, besiyerlerine katılan sitratı karbon kaynağı ve amonyum tuzlarını da nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yeteneğini saptamada, bakteri cins ve türlerini identifikasyonda kullanılır. Bakteriler tarafından sitratın ayrışması (sitrat metabolizması) enzim sistemi tarafından gerçekleştirilir. Bu enzime citritase (citrate oxalacetate-lyase) veya citrate demolase adı verilir. Sitrat fermentasyonu için kullanılan besi yerlerinde amonyum tuzlarının bulunması nedeniyle de, bakterilerin bu tuzu nitrojen kaynağı olarak kullanabilme yetenekleri de ölçülmektedir. Amonyum tuzu ayrışınca amonyak (NH3) meydana gelerek ortamın pH sı yükselir. Bakteriler tarafından organik asit ve tuzlarının karbon kaynağı olarak kullanılması sonucu karbonatlar ve bikarbonatlar meydana gelir. Analizin yapılışı - 18-24 saatlik kültür tüp içindeki yatık Simmons sitrat agar besiyerine iğne ile inokülasyon yapılır ve yüzeye öze ile sürme yapılır. - 2-7 gün 37°C’de inkübasyona bırakılır. 34 ***Simmons citrate besiyerinde, uygun bir inkübasyon süresi sonunda hiçbir üremenin olmaması ve ortamın orijinal yeşil rengini muhafazası negatif reaksiyon ve ekim hattı boyunca üreme ile birlikte koyu mavi rengin meydana gelmesi de pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. ***Besiyerlerine çok fazla ekim yapılmamalıdır. Yanlış pozitif reaksiyon görülebilir. İnokulum uygun oranda sulandırılmalıdır. 35 UYGULAMA 7: E.coli O157:H7 İZOLASYONU-İDENTİFİKASYONU E.coli O157:H7 bakterisinin gıdalardaki sayısı önemli değildir; gıdalarda var/yok testi ile aranır. Selektif zenginleştirme, selektif katı besiyerine sürme, izolasyon, biyokimyasal identifikasyon ve serolojik yöntemlerle doğrulama aşamaları var/yok ile yapılan analizinde mevcuttur. Bu serotipin belirlenmesinde iki kriter vardır; 1.Sorbitolü kullanamaması 2.MUG reaksiyonunun negatif olması Bu iki özellik ile katı besiyerinde olası E.coli O157:H7 serotipleri seçilebilir. Selektif zenginleştirme ve özellikle selektif katı besiyerine ekim aşamasında sefiksim-tellürit katkısı yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Sorbitol MacConkey (SMAC) Agar Base Bu serotipin sorbitol negatif olması nedeniyle standart MacConkey Agar besiyerinden farklı olarak laktoz yerine sorbitol bulunmaktadır. Sorbitol negatif olan bakteriler renksiz koloni oluştururlar. SMAC Agar besiyeri doğrudan kullanılabilmekle birlikte refakarçı floranın yoğun baskılaması sahte negatif sonuçlara yol açabileceğinden CT (cefixim-tellürit) katkısı ile kullanılır. Selektif zenginleştirme kültüründen doğrudan ya da seyreltilerek alınır ve öze ile sürme yapılır. 37˚C’de 24 saat inkübasyon sonunda sorbitolü kullanamayan E.coli O157:H7 renksiz koloni oluşturur; sorbitol pozitif olanlar ise kırmızı koloni oluşturur. 36 Şekil 24. E.coli O157:H7’nin SMAC agarda görünümü (arkada) ve ekim yapılmamış SMAC agar besiyeri (önde) İZOLASYON - 25 g/mL örnek 225 mL önzenginleştirme besiyerine (mTSB-Broth with Novobiocin) ilave edilir; gerekirse homojenize edilir. - 37 ˚C’de 16-20 saat inkübasyona bırakılır. - Homojenizattan alınarak CT-SMAC Agar besiyerine öze ile ekim yapılır. 37˚C’de 24 saat inkübasyona bırakılır. - İnkübasyon sonunda sorbitol negatif (renksiz koloniler) kolonilerden fluorocult VRB Agar besiyerine ekim yapılır; 37˚C’de 24 saat inkübasyona bırakılır. - İnkübasyon sonunda UV ışığı altında floresan ışıma vermeyenlere doğrulama testleri yapılır. *** Ayrıca SinglePath hızlı test kiti kullanılarak da var/yok analizi yapılır. İDENTİFİKASYON Hareket Testi 1. Bu test için yarı katı agar besiyeri (soft agar-yumuşak agar) kullanılır. 2. 18-24 saatlik kültüre batırılan iğne uçlu öze ile, besiyerinin ortasından dibine doğru olacak şekilde ekim yapılır. 3. Tüpler 37°C’de 24-48 saat inkübe edilir. 4. İnkübasyon sonunda; 37 ** Hareket (+) ise, ekim çizgisinin dışında da üreme olacağından besiyerinin tümü bulanık hal alır. ** Hareket (-) ise, sadece ekim çizgisinde üreme olur; besiyerinin kalan kısmı parlak rengini korur. ** Gaz (+) ise, besiyerinde çatlamalar, hava kabarcıkları görülür. Şekil 25. Hareket testi Singlepath Hızlı Test Kiti - Ne amaçla kullanılır? Singlepath E.coli O157 gıda analiz laboratuarlarında çeşitli gıdalardan muhtemel nitel E.coli O157 (H7 dahil) belirlenmesinde kullanmak amacıyla tasarlanmıştır. Test, kıyma ve pastörize tam yağlı sütün 25 gram ya da mililitresinde, 18 saat zenginleştirmeden sonra 1 adet kadar az E.coli O157 saptanabilmesinde kullanılması amacıyla AOAC tarafından onaylanmış ve kabul edilmiştir. E.coli O157 ‘nin sebep olduğu gıda enfeksiyonlarındaki artış nedeniyle güvenilir ve hızlı metotlar talep edilmiştir. Geleneksel kültür yöntemleri dışında, immünolojik teknikler daha iyi spesifiklik ve hassasiyete sahip olduğu için kullanıcılar tarafından daha fazla popüler olmaktadır. Singlepath E.coli O157 immün akış prensibine dayanan immünolojik tarama testidir ve zaman harcanması ve yoğun işgücü çalışmasından uzak tutmaktadır. - Singlepath’in çalışma prensibi nedir? Singlepath E.coli O157 altın kaplı antikorlar temelinde bir immünokromatografik hızlı test kitidir. Alet dairesel örnek deliği ve oval şekilli test (T) ve kontrol (C) penceresinden oluşmaktadır. 38 1- Numune dairesel örnek deliği vasıtasıyla kromatografik kağıda uygulanır. 2- Numune E.coli O157 ye özgü olan altın kaplı antikor içeren reaksiyon zonundan absorbe edilir. 3- Var olan her hangi bir E.coli O157 antijeni altın kaplı antikorla kompleks yapar ve açıklık boyunca test alanındaki bağlayıcı zona girene kadar göç eder. 4- Bağlayıcı zon (T) başka bir E.coli O157 antikoru içerir ve var olan her E.coli O157 antikor kompleksini sabitler. Altın kaplama sayesinde kırmızı şerit oluşur. 5- Örneğin kalanı kontrol zonu (C ) içerisindeki ikinci bağlayıcı bölgeye doğru hareket eder ve ikinci kırmızı çizgiyi oluşturur(pozitif kontrol). E.coli O157 olsun ya da olmasın bu kırmızı çizgi her zaman kontrol zonunda (C) oluşur, bu testin doğru çalıştığını gösterir. - Deneyin Yapılışı 1. Gıda örneğinde zenginleştirilmiş kültürden yaklaşık 1-2 ml’si uygun tüpe transfer edilir ve 15 dakika boyunca kaynayan su banyosunda kaynatılır. Tüp alınır ve kullanmadan önce oda sıcaklığına ( 18o-26oC) soğutulur. ***Kaynatma basamağı zorunlu değildir fakat yaşayan bakteri kontaminasyonu riskini azaltmak için uygulanmalıdır! 3. Zenginleştirme kültüründen 150 mikrolitre çekilir ve test kitinin dairesel deliğine 150 mikrolitre örnek dağıtılır. 4. Test kiti oda sıcaklığında inkübe edilir ve test sonucu uygulamadan 20 dakika sonra gözlemlenir. - Sonuçların Yorumlanması 1. 20 dakika içerisinde kontrol panelinde (C) belirgin kırmızı çizgi oluşursa test doğru çalışıyor demektir. 2. Kırmızı çizgi 20 dakika içerisinde hem test (T) hem de kontrol (C) panelinde oluşuyorsa örnek pozitif olarak değerlendirilir. 3. Uygulamadan sonra 20 dakika içerisinde kontrol panelinde (C) belirgin kırmızı çizgi oluşur fakat test (T) panelinde oluşmaz ise örnek negatif olarak düşünülür. SORU 2: Kontrol (C) panelinde kırmızı çizgi oluşmaz; test (T) panelinde oluşursa nasıl yorumlanır? *** 20 dakika sonra her iki zonda da kesin çizgi görünmezse testin tekrarlanması gerekmektedir. 39 Ön zenginleştirme aşamasından sonra 20 dakika içinde sonucu doğrudan E.coli O157 serotipi olarak verdiği için hızlı kit olarak değerlendirilir ve dolayısıyla başka malzemeye gerek duymadığı için ekonomiktir. 40 UYGULAMA 8: Listeria monocytogenes İZOLASYONU-İDENTİFİKASYONU Patojen bir bakteri olan Listeria monocytogenes'in 25 g (mL) gıdada bulunmasına izin verilmez. Salmonella spp. ile birlikte kayıtlara geçmiş, ölüme en fazla neden olan gıda kaynaklı patojendir. L. monocytogenes Gram pozitif, sporsuz, çubuk şekilli bakterilerdir; bir insan ve hayvan patojeni olarak anılmaktadır. Listeriosis, L. monocytogenes’ in sebep olduğu hastalıklar, kan zehirlenmesinin yanında esasen menenjit veya beyin iltihabıdır. L. monocytogenes, plasenta bariyerini geçebildiği zaman, hamile bayanlarda fetus veya yeni doğan bebek için özel bir enfeksiyon riski oluşturmaktadır. L. monocytogenes, ayrıca bağışıklık yetersizliği olan hastalarda birçok enfeksiyondan sorumludur. Listerianın çevreye dağılarak yayılmasının ve buzdolabı sıcaklığında gelişebilmesinin bir sonucu olarak, gıdalar enfeksiyonun ana kaynaklarından birini oluşturur. Temel analiz metodu var/yok testi ile kontroldür. İZOLASYON 1. 25 g gıda örneği 225 mL yarım konsantrasyonda inhibitör içeren FRASER Broth (1/2 FRASER Broth) besiyerinde homojenize edilir. 2. 30˚C’de 24 saat inkübe edilir. 3. Ön zenginleştirme kültüründen inhibitörleri normal konsantrasyonda içeren 10 mL FRASER Broth besiyerine 0,1 mL aktarılarak 35-37˚C’de 48 saat inkübasyona bırakılır. 5. İnkübasyonun 24. ve 48. saatlerinde yine PALCAM agar besiyerine sürme yapılır. 6. Katı besiyeri 37˚C’de 24-48 saat inkübe edilir. ***PALCAM agar; Besiyeri bileşimindeki antibiyotikler ve lityum klorür ile refakatçi flora olarak bulunan Gram negatiflerin ve çoğu Gram pozitiflerin inhibisyonu sağlanır. Listeria 'nın β-D-glucosidase aktivitesi eskulin ve amonyum demir (III) sitrat ile belirlenir. Eskulin β-Dglucosidase enzimi ile eskuletin ve glikoza parçalanır. Eskuletin demir (III) sitrat ile zeytin yeşili-siyah renk veren kompleks yapar. Stafilokok ve enterokok gibi mannitol pozitif bakteriler eğer inhibe olmamışlar ise sarı renkli ve sarı zonlu koloni oluştururlar. ***L. monocytogenes bu besiyerinde 1,5-2 mm çapında zeytin yeşili-gri renkli, bazen siyah merkezli ancak her zaman siyah zonlu koloni oluşturur. 41 Şekil 26. Listeria monocytogenes Deneyin Yapılışı 1. Gıda örneği ön zenginleştirme aşamasına tabii tutulur. 2. Zenginleştirilmiş örnekteki Listeria monocytogenes varlığı hızlı test kiti ile kontrol edilir. 3. Zenginleştirilmiş örneğe karbonhidrat fermentasyon testi uygulanır. İDENTİFİKASYON Karbonhidrat fermentasyon testi Purple Broth Base mikroorganizmaların fermentasyon reaksiyonlarını belirlemek adına kullanılan sıvı bir besiyeridir. Durham tüpleri konulmuş test tüplerine hazırlanmış besiyeri ilave edilir ve 121 ˚C’de 15 dk otoklavlanır. Sterilizasyondan sonra, denenecek şeker 1 g/ 10 mL olarak hazırlanıp, filtre ile sterilize edilir ve tüplerdeki 10 mL besiyeri üzerine 1 mL eklenir. ** Burada verilen şeker konsantrasyonu %1'dir ve bu konsantrasyon literatürde yaygın olarak %0,5–1 olarak belirtilmektedir. Bununla birlikte, şeker konsantrasyonun %1'den az olması halinde sahte negatif sonuçlar alnabilmektedir. Şüpheli koloniden 1 öze alınarak besiyerine inoküle edilir ve inkübasyon 37°C'de 24 saat olarak yapılır. Bu süre sonunda besiyeri renginin sarıya dönmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilir. Besiyerindeki pH indikatörü brom kresol morudur. Karbonhidratın fermentasyonu sonucu asit oluşmasıyla indikatör sarı renk verir. Gaz oluşumu da durham tüplerinde belirlenir. ** Belirli bir karbohidratın karbon kaynağı olarak kullanılması sonunda asidik ürünler ortaya çıkar. Oluşian bu asitlik basit olarak pH indikatörünün renk değiştirmesi ile belirlenir. 42 - Sonuçların değerlendirilmesi Fermentasyon (karbonhidrattan asit oluşumu); Pozitif sonuç= sarı renk gelişimi Negatif sonuç= Mor renk, renk değişimi yok Gaz üretimi; Pozitif sonuç= durham tüpünde gaz oluşumu Negatif sonuç= durham tüpünde gaz oluşumu yok Şekil 27. Karbonhidrat fermantasyon testi - Hızlı test kiti ile var/yok testi yapılır. ***L’mono test kitinin, çiğ et/kıyma örneğindeki düşük miktardaki L.monocytogenes’i ve diğer yoğun floralı gıdalardaki L. monocytogenes’i belirleyemediği kanıtlanmıştır. SORU: E.coli O157 hızlı test kiti ile Listeria monocytogenes hızlı test kiti arasındaki fark nedir? 43 UYGULAMA 9: Staphylococcus aureus İZOLASYONU-İDENTİFİKASYONU İZOLASYON - Gıda örneğinden 10 g-mL örnek alınıp 90 mL dilüsyon sıvısına aktarılır. Gerekirse homojenize edilir. - Egg Yolk-Tellurite emülsyon ilave edilen Baird Parker Agar besiyerine örneklerin 101 ’lik dilüsyonundan ekim yapılır. ***1 mL homojenizat 3 standart Petri kutusundaki Baird-Parker Agar besiyerine dağıtılır. Alternatif olarak 14 cm çaplı büyük Petri kutusu da kullanılabilir. - Ekim yapılan petriler 37 °C sıcakliktaki etüvde 24 saat inkubasyona bırakılır. İnkübasyondan sonra etrafı saydam zonlu 1-1,5 mm çaplı siyah parlak koloniler S. aureus olarak değerlendirilir. ***S. aureus analizinde en çok kullanılan besiyeri Baird Parker Agar’dır. Agar’ın çalışma prensibi, S. aureus’un potasyum tellüriti indirgemesi ve yumurta sarısını hidrolize etmesi özelliğine dayanır. -Baird Parker Agar besiyeri refakatçi floranın inhibisyonu için lityum klorür ve tellürit içerirken besiyeri bileşimindeki pirüvat ve glisin stafilokokların gelişimini selektif bir şekilde destekler. -S. aureus kolonileri lipoliz ve proteoliz sonucunda koloni etrafında tipik zon ve halka oluşturma, tellüritin tellüriyuma indirgenmesi sonucunda siyah koloni oluşturma olmak üzere 2 tipik karakteristik özellik ile belirlenirler. ***Baird–Parker Agar besiyerinde yumurta sarısı yerine kan plazması ilavesi ile hemoliz testi de yapılabilir. - Gerekli biyokimyasal testler yapılarak kanlı agarda β hemoliz oluşturan koagülaz pozitif koloniler S. aureus olarak değerlendirilir. 44 Şekil 28. S. aureus’un BPA’da görünümü Hemoliz testi Şüpheli kolonilerin Kanlı Agar besiyerine sürme işleminden sonra petri kutuları 37°C'de 24 saat olarak inkübasyona bırakılır. Bu süre sonunda gelişen kolonilerin etrafında berrak zonlar görülmesi hemoliz pozitif olarak değerlendirilir. Koagülaz testi - Koagülaz pozitif S. aureus sayısının belirlenmesinde Baird Parker Medium’da tipik 5 koloniye koagülaz testi uygulanır. - Koagülaz testte pozitif çıkan koloni sayısı ile Staphylococcus mikroorganizmasının sayısı çarpılır, sonuç pozitif koloni sayısına bölünerek koagülaz pozitif mikroorganizma sayısı belirlenir. ***Özellikle stafilokoklar için yapılan bir testtir. Bu bakterilerde bulunan koagülaz enzimi kan plazmasını pıhtılaştırır. Çok genel bir yaklaşım ile koagülaz enzimine sahip olan stafilokokların patojen olduğuna karar verilir. 45 UYGULAMA 10: KAĞIT DİSK DİFÜZYONU İLE ANTİMİKROBİYEL AKTİVİTE TAYİNİ Disk diffüzyon yöntemi, hızlı üreyen aerob ve fakültatifanaerob bakteriler icin önerilen kolay, pratik, standartlara uygun yapılırsa halen dünyada rutin laboratuvarlar için tercih edilen bir testtir. Bu test ile antibiyotiğin veya ekstraktın inhibisyon etkisi kalitatif olarak ölçülür. ***Disk etrafında inhibisyonun görülmemesi, bakterinin o antimikrobiyele karşı dirençli olduğunu veya kullanılan ekstraktın antibakteriyel etkisinin olmadığını gösterir. Karşılaştırma yapmak amacıyla kontrol diskleri kullanılır. Şekil 29.İnhibisyon zon görünümleri Deneyin Yapılışı 1. Antimikrobiyel aktivitesine bakılmak istenen maddeler çözgen olarak etanol kullanılarak ekstrakte edilir. 2. Etkinliği test edilecek olan 18-24 saatlik bakteri kültürü TSA, Mueller Hinton Agar gibi genel besiyerlerine yayma kültür yöntemi ile ekilir veya sürme yapılır. 3. Steril diskler aseptik koşullar altında ekim yapılan petri üzerine belli aralıklarla yerleştirilir. 4. Disklerin üzerlerine ekstraktlardan 20µL aktarılır. Disklerden birine sadece etanol aktarılır. ***Ekstrakt aktarımı yaptıktan sonra petri kutuları oynatılmamalıdır!!! SORU: Bir diske sadece etanol aktarılmasının sebebi nedir? 5. Aktarılan ekstraktların kuruması sağlandıktan sonra ekimi yapılan bakterinin optimum gelişme sıcaklığına bağlı olarak bir sıcaklıkta 18 saat inkübe edilir. 46 6. Sonuçlar petride oluşan inhibisyon zon çapının milimetrik cetvelle ölçülmesiyle değerlendirilir. ***Ekstrakt ekilen bakteriye karşı etkili ise üremenin engellendiği bir inhibisyon zonu oluşur. Şekil 30. İnhibisyon zon çaplarının milimetrik cetvelle ölçümü 47
