PowerPoint Sunusu - mikrobiyoloji.org

Mikrobiyoloji Laboratuvarı/
Gözden Kaçabilenler
Prof. Dr. Kadir HALKMAN
Ankara Üniversitesi,
Gıda Mühendisliği Bölümü
09 Nisan 2015; Merck Millipore, İstanbul
Aerobik Koloni Sayısı 01
Önceden Toplam Mezofili Aerobik Bakteri sayısı iken
daha sonra Aerobik Koloni Sayısı olarak
standartlarda yer aldı. Gerekçesi bazı mayaların da
bu besiyerinde (PCA) ve aynı inkübasyon
koşullarında gelişerek koloni oluşturabileceği idi.
Gereksiz bir detaydır çünkü bu ifade analiz edilen
numunede genel mikrobiyolojik kalite hakkında bilgi
veren bir simgesel ifadedir. Bir numunede bütün
bakterileri sayabilecek bir besiyeri yoktur ve olamaz.
Bu nedenle sayım sonucu KOB (CFU) olarak ifade
edilir.
Koliform/ E. coli Analizleri 01
Enterobacteriaceae içinde koliform grup, yapay bir
gruptur, taksonomik özelliği yoktur. 5 tür bakteri
koliform grubu temsil eder: Escherichia coli;
Enterobacter aerogenes; Ent. cloacae, Citrobacter
freundii ve Klebsiella pnemoniae.
Bunlardan E. coli her koşulda dışkı kökenlidir, fekal
bulaşma indikatörüdür.
Diğer 4 tür, bitki/ toprak ya da dışkı kökenli olabilir.
Dışkı kökenli olanların tümü fekal koliform olarak
tanımlanır.
Koliform/ E. coli Analizleri 02
Önceki ISO 9308-1 numaralı standartta kullanılan
Lactose TTC Agar with sodium heptadecylsulfate
besiyerinde E. coli, diğer koliform grup üyelerinden
morfolojik olarak ayrılamaz. Bu besiyerinde gelişen
bütün koliformlar, laktozdan asit oluşturur ve oluşan
bu asitlik filtre altında sarı benek ile belirlenir. Koloni
rengi, besiyeri bileşimindeki TTC’nin indirgenmesi ile
ilişkilidir. Koliform grup TTC’yi zayıfça indirger ve
koloni rengi turuncu olur. Laktoz negatif diğer
bakteriler ise TTC’yi kuvvetli indirgeyerek kırmızı/
mor koloniler oluştururlar.
E. coli dahil olmak üzere koliform grup bakteriler
arasında TTC’yi indirgeme farkı yoktur.
Koliform/ E. coli Analizleri 03
Membran filtrasyon uygulamalarında fekal
koliformlar için önerilen mFC besiyeri 44,5 oC
yerine 37 oC’ta inkübe edilirse bütün koliformlar
gelişir. Fekal koliformlar için 44,5 oC’ta inkübasyon
gerekir. 37 oC’ta inkübe edilen besiyeri bileşiminde
fekal olan ve olmayan koliformları ayıracak bir
bileşen yoktur, Koliformlar arasında (E. coli dışında)
fekal olan ve olmayanları ayırabilecek yegâne fark
yükseltilmiş inkübasyon sıcaklığıdır.
CCA
Koliform/ E. coli Analizleri 04
LST+MUG Broth besiyerinde inkübasyon sonrası
floresan ışıma kesin değilse, tüpe 1 mL 1 N NaOH
eklenip, karıştırılır ve tekrar kontrol edilir. Oluşan
asitlik bazen floresan ışımayı maskeleyebilir, NaOH
bu asitliği giderir.
İndol testi de yapılacak ise, ilave edilen bu NaOH,
test sonucunu etkilemez.
İndol testi sonrası floresan ışıma testi yapılamaz.
Koliform/ E. coli Analizleri 05
E. coli dışındaki koliform grup üyesi 4 bakteri, bitki/
toprak kaynaklı olabileceği gibi dışkı kaynaklı da
olabilir. Dışkı kökenli tüm koliformlar “Fekal
Koliform” olarak tanımlanır. Bir numunede E. coli
yok iken dışkı kökenli koliformlar olabilir. Dolayısı
ile E. coli yerine fekal koliform aranması fekal
kontaminasyon açısından daha doğru sonuç verir.
Güncel uygulamada fekal koliform yerine E. coli
analizinin yaygın olma nedeni, E. coli analizinin çok
kolay olmasıdır.
Sporlu Bakteri Analizi 01
Mikrobiyoloji laboratuvarında en fazla sahte negatif
sonuç alınan testlerdir. Numunede sporlu
olmayanların elimine edilmesi için pastörizasyon
uygulanır. Aynı bakterinin vejetatif formda olanları bu
aşamada ölür.
Bakteriler sadece hayatî bir tehlike varsa spor
oluştururlar.
Sporlu bakteri analiz sonucu, sadece analiz yapıldığı
anda spor oluşumunu tamamlamış bakteri sayısını
verir. Soğuk değil ama serinde (8-10 oC) depolanmış
çiğ sütte sporlu Bacillus cereus analizi yapılırsa
sonuç 0 çıkar çünkü bu sıcaklıkta tümü ya da tümüne
çok yakını vejetatif formdadır.
Clostridium analizi 01
Clostridium spor analizinde 0,2 µm porlu membran
filtreler kullanılır. Spor analizinde pastörizasyon
gereklidir.
Bu amaçla numune 755 oC’ta 15 dakika tutularak
vejetatif hücrelerin ölmesi sağlanır. Pastörize edilip
soğutulmuş numune filtre edilir.
Pastörizasyon sırasında spor oluşumu tamamlanmış
hücreler canlı kalır.
Staph. aureus Analizi 01
Baird-Parker Agar besiyerine yumurta sarısı tellurit
emülsiyonu eklenir. MYP Agar ya da başka besiyeri
katkısı olan yumurta sarısı eklenirse siyah renkli
koloni elde edilemez (sahte negatif sonuç alınır).
Baird-Parker Agar besiyerinde inkübasyondan sonra
tipik zonlu, parlak siyah koloniler Staphylococcus
aureus kolonileridir ancak bunların sayısı önemli
değildir. Gıda standartları koagülaz pozitif olanlarla
ilgilenir.
İnkübasyondan önce ya da sonra Baird-Parker Agar
besiyerinin bir gece buzdolabında tutulması ile daha
berrak zon elde edilir.
Staphylococcus analizi 02
Staphylococcus ile koagülaz pozitif Staph. aureus
kastedilmektedir. Baird-Parker Agar besiyerinde
kolaylıkla belirlenebilir. Arıtılmış içme sularında
bulunması beklenmez. Asıl olarak yüzme
havuzlarında yüzücülerden kaynaklanan bulaşma
söz konusu olabilir.
Baird-Parker Agar üzerinde saydam zon yapan siyah
renkli parlak koloniler Staph. aureus olarak
tanımlansa bile yeterli değildir.
Her koşulda koagülaz testi yapılarak patojen olup
olmadığı saptanmalıdır.
Salmonella Analizi 01
Tamponlamış Peptonlu Su, Salmonella analizinde
kullanılacaksa mutlaka 25,5 g/L olarak hazırlanmalıdır.
Ön zenginleştirme 371oC’ta 18 2 saat süre ile yapılır.
İnkübasyon süresi uzarsa refakatçi flora baskılaması
nedeni ile sahte negatif sonuç alınabilir.
ISO 6579 numaralı standarda göre Selektif
zenginleştirme için RVS Broth ve MKTTn Broth
kullanılmalıdır. Her ikisinin inokülüm miktarı ve
inkübasyon sıcaklıkları farklıdır.
Salmonella Analizi 02
Selektif zenginleştirmeden sonra her 2
besiyerinden ayrı ayrı 2’şer selektif katı besiyerine
sürme yapılır. Bunlardan biri XLD Agar’dır, diğeri
kullanıcının tercihine bırakılmıştır.
Tipik koloniler biyokimyasal ve serolojik testlerle
doğrulanır.
Tipik koloniler bir tüp içindeki saf suda iyice
çözülür ve usulüne uygun olarak Singlepath
Salmonella ile kontrol edilebilir. Bu amaçla çok
sayıda koloni tek tüpe aktarılabilir.
Salmonella Analizi 03
Singlepath Salmonella, selektif zenginleştirme
aşaması sonrası uygulanacak ise (laboratuvarın
planlaması bu şekilde ise) hem RVS hem de
MKTTn Broth kültürü kullanılmalıdır.
Singlepath Salmonella test sonucu negatif ise
daha fazla ilerlemeye gerek yoktur. Pozitif
sonuçta geleneksel kültür yöntemleri ile devam
edilmelidir.
Listeria monocytogenes
Analizi 01
Salmonella analizinden farkı kullanılan besiyerleri,
inkübasyon sıcaklık ve süreleridir. Selektif katı
besiyeri olarak 2 farklı besiyeri kullanılır, bunlardan
biri Listeria Selective Agar acc. to Ottaviani and
Agosti iken diğer besiyeri kullanıcı tercihine
bırakılmıştır.
Singlepath L’ mono sadece Listeria monocytogenes
sonucunu verir, diğer Listeria türleri bu test ile
negatif sonuç gösterir. Koloni karışımına
uygulanabilir. Selektif zenginleştirme aşamasında
kullanılacaksa 1/1 Fraser zenginleştirme sonrası
kullanılması önerilir.
Pseudomonas aeruginosa
Analizi 01
Özellikle suların analizinde çok sıklıkla sahte
pozitif sonuca rastlanmaktadır. Cetrimide Agar
besiyerinde Ps. fluorescens ve Ps. aeruginosa
aynı morfolojik görünümde koloni oluştururlar ve
her ikisi de floresan ışıma verir.
İnkübasyondan sonra tipik koloniye Asetamit testi
uygulanmalıdır. Ps. aeruginosa pozitif, Ps.
fluorescens negatif sonuç verir.
Tipik koloni herhangi bir sıvı ya da katı genel
besiyerine inoküle edilip 42 oC’ta 24 saat inkübe
edilir. Ps. aeruginosa pozitif, Ps. fluorescens
negatif sonuç verir.
Ps. aeruginosa Analizi 02
Cetrimide Agarın ekimden sonra doğrudan 42 oC’ta
inkübasyonu da mümkündür.
Ya da aynı numuneden 2 Cetrimide Agar besiyerine
ekim, bunlardan birisinin 37 oC, diğerinin 42 oC’ta
inkübasyonu da mümkündür ve muhtemelen analizin
bu şekilde yapılması en akılcı çözümdür.
Şahit Testler 01
Laboratuvarda uygulanan her analiz için belirli
süreler ile (ayda 1; 2 ayda 1 vb.) pozitif ve negatif
şahitler ile biyokimyasal ve fizyolojik doğrulama
testleri yapılmalıdır. Örneğin; Pseudomonas çalışan
her laboratuvar asetamit testinde pozitif kontrol
olarak Ps. aeruginosa ve negatif kontrol olarak Ps.
fluorescens; 42 oC gelişme testinde yine pozitif
kontrol olarak Ps. aeruginosa ve negatif kontrol
olarak Ps. fluorescens ile kontrol yapmalıdır.
Bu amaçla laboratuvarda Ps. aeruginosa ve Ps.
fluorescens kültür koleksiyonunda bulunmalıdır.
Şahit Testler 02
Patojen analizi yapan laboratuvarlar belirli aralıklarla
ilgili patojeni numuneye yapay olarak ekleyip analiz
sonucunu pozitif olarak almalıdırlar.
Çoğu işletme laboratuvarı, patojen bakterinin kültür
koleksiyonunda bulunmasını ve yapay olarak gıdaya
bulaştırılmasını güvenlik nedeni ile kabul etmez. Bu
durumda Üniversite, Gıda Tarım ve Hayvancılık
Bakanlığı, Sağlık Bakanlığı, Belediye hatta özel
laboratuvarlardan yardım alınmalıdır.
Basit bir örnekle Listeria Selective Agar acc. to
Ottaviani and Agosti besiyerinde L. monocytogenes
kolonisi besiyeri üreten tüm firmaların kataloglarına
göre çok tipiktir ancak ilgili laboratuvar personeli
bunu Petri kutusunda görmelidir.
Şahit Testler 03
Her analizde şahit olarak 1 Petri kutusu ekilmeden
inkübatöre konulmalıdır.
Özellikle toplam bakteri ve maya-küf analizlerinde
kullanılan Petri kutusu kapağı tam olarak açılmalı ve
analiz boyunca bu şekilde tutulmalı ve açık kaldığı
süre kaydedilip inkübatöre yerleştirilmelidir. Bu Petri
kutusunda dakikada 1 koloni düşmesi normaldir,
daha fazla koloni varsa laboratuvar havasının
temizlenmesi için düzeltici faaliyet uygulanmalıdır
(Ozon gazı, UV lamba vb.)
Şahit Testler 04
Yayma kültürel yöntemle analiz yapılıyorsa VRBL
Agar gibi yeterince selektif besiyerlerine dahi,
alkolden çıkartılmış Drigalski spatülü alevden
geçirilmeden agarlı besiyerine sürülmeli ve
inkübatöre bırakılmalıdır. Bu, kullanılan alkolün
etkinlik testidir.
Özet olarak her analizde ilgili 3 Petri kutusu kontrol
olarak kullanılmalıdır: Ekim yapılmamış besiyeri
(sterilizasyon kontrolü); analiz boyunca kapağı tam
açık Petri kutusu (laboratuvar havası kontrolü) ve
alkol yayılmış Petri kutusu (alkol etkinlik kontrolü).
Şahit Testler 05
Kullanılan otomatik pipetler pipet ucu takılmamış
şekilde, analize başlanmadan önce alkolde 4-5 cm
derinlik olacak şekilde 30 dk. tutulmalıdır. Çoğu
uygulayıcı otomatik pipet kullanmada gereken özeni
göstermemektedir ve hızlı çek/ boşalt sonunda
pipetler kontamine olmaktadır.
Drigalski spatülleri üzerinde film tabakasına dikkat.
Bu spatüller kullanma sıklığına bağlı olarak belirli
aralıklarla 1 gece boyunca çamaşır suyuna
bırakılmalı, iyice durulanıp otoklavda 121 oC’ta 15 dk.
sterilize edilmelidir.
Petri kutularının inkübasyonu 01
Pek çok kaynakta Petri kutusuna yerleştirilen
membran filtrenin düşme olasılığına karşı tabanı
üzerinde inkübasyon önerilir.
EPA (US Environmental Protection Agency) ise Petri
kutularının kapağı üzerinde inkübasyonunu
önermektedir. Filtre, kapağa düşecek olursa koloni
gelişmesi olmayacağı açıktır.
Tabanı üzerinde inkübasyonun sakıncası ise su
damlaların besiyeri/ filtre üzerine düşerek kolonilerde
aşırı gelişmedir.
HGMF 01
Hydrophobic Grid Membrane
Filter; ABD’de kullanılan özel
bir membran filtrasyon
sistemidir. 40x40 olmak
üzere filtrasyon alanı 1600
kareden oluşur. Karelerin
sınırında hidrofobik bir
ızgara sistemi vardır.
Filtrasyon sonunda hücre ızgara üzerinde
kalamaz, her koşulda ya alttaki ya üstteki ya
sağdaki ya da soldaki kareye geçer ve burada
koloni oluşturur. İnkübasyon sonunda koloniler
değil, pozitif kareler sayılır ve sonuç, özel bir
formül ile hesaplanarak EMS olarak verilir.
HGMF 02
HGMF + YM11 Agar besiyeri ile
48 saat sonunda küf sayımı
yapılabilir. Prensibi, küf
kolonileri henüz çıplak gözle
fark edilemeyecek kadar küçük
olmasına rağmen metabolitlerin
besiyerindeki bir indikatör
aracılığı ile renk değişimi
sağlamasıdır.
1600 karenin her birinin alanı yaklaşık 1,5 mm2 olup,
metabolitler 48 saatlik inkübasyon sonunda bu
alanda fark edilebilir renk değişikliği yapar. Tek
başına YM11 Agar 48 saatte küf sayısını veremez.
Besiyerleri 01
Membran filtrasyon sisteminde kullanılan çok
farklı yaklaşımlarla hazırlanmış besiyerleri vardır.
Koloni elde edilmesi esas olduğuna göre katı
besiyeri kullanılması gerekir. 3 ana grup vardır.
-Filtre, önceden agarlı besiyeri dökülmüş Petri
kutusu üzerine yerleştirilir. Bu besiyerleri,
laboratuvarda hazırlanabileceği gibi hazır ticari
formda da sağlanabilir.
-Filtre, absorban pede besiyeri eklenmiş,
kurutulmuş ve kullanma anında steril su ile
ıslatılarak aktifleştirilen besiyeri üzerine
yerleştirilir.
Besiyerleri 02
-Filtre, bir Petri kutusu içinde absorban pet
bulunan ve kullanım anında steril sıvı besiyeri
dökülerek aktifleştirilen besiyeri üzerine
yerleştirilir. Bu besiyerleri, hazır ticari formda
sağlanabileceği gibi steril boş Petri kutusu içinde
steril pet sağlanarak laboratuvarda da
hazırlanabilir.
Bu 3 ana gruptan hangisinin seçileceği
laboratuvarın kararıdır. Bu amaçla üretilmiş yerli ya
da yabancı pek çok marka bulunmaktadır. Kaliteye
dikkat edilmesi önceliklidir. Düşük fiyat, ucuz
anlamına gelmez.
Kalibrasyon 01
.  Nokta
Teşekkürler,
Sorularınız/ katkılarınız
Prof. Dr. A Kadir Halkman
Ankara Üniv. Gıda Mühendisliği Bölümü