Türk Toraks Derne¤i Okulu Genetik Tan› Yöntemleri Yrd. Doç. Dr. Ayfle Gül ZAMAN‹ Selçuk Üniversitesi Meram T›p Fakültesi, T›bbi Genetik Anabilim Dal›, KONYA e-mail: [email protected] Yak›n geçmiflte genetik hastal›klar Mendel kurallar›na göre kal›t›lan ve do€umlarda anomalilerle seyreden küçük bir grup sendrom olarak nitelendirildi. Kanser, diyabet, mental retardasyon ve kalp hastal›klar› gibi hastal›klar›n genetik temeli oldu€u düflünülürdü. DNA’n›n yap›s›n›n Watson ve Crick taraf›ndan keflfedilmesi ile genetik araflt›rmalar büyük ivme kazand› (1). Son y›llarda genlerin dizilimlerinin, yap›lar›n›n ve fonksiyonlar›n›n anlafl›lmas›yla da geneti€in t›ptaki yeri h›zla de€iflmeye bafllad›. ‹nsan Genom Projesi 1986 y›l›nda bafllad›€›nda bu noktaya gelinece€ini tahmin etmek mümkün de€ildi. Hatta 2005 y›l›nda tamamlanmas› öngörülen bu proje teknolojideki h›zl› geliflmeler sonucunda hedeflenenden dört y›l önce tamamland› (2). Bu tarihsel süreç içerisinde uygulanan genetik tan› yöntemleri de giderek çeflitlendi ve yeni geliflen tekniklerle çok say›da klinik branfla tan› ve araflt›rma baz›nda hizmet verir hale geldi. Genetik tan› yöntemlerini flöyle bir gözden geçirirsek afla€›daki gibi s›n›fland›rabiliriz. 1. I. Sitogenetik Tan› Yöntemleri 1. Klasik sitogenetik tan› yöntemleri, 2. Özelleflmifl sitogenetik tan› yöntemleri, a. Kardefl kromatid de€iflimi “Sister Chromatid Exchange (SCE)”, b. Mikronükleus (MN), c. Frajil bölge tayini. II. Moleküler Sitogenetik Tan› Yöntemleri 2. Moleküler Genetik Tan› Yöntemleri I. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), II. Allel-özgü oligonükleotid analizi “Allele-Specific Oligonucleotid (ASO)”, III. DNA dizi analizi, IV. Mikroarray analizi. I. S‹TOGENET‹K TANI YÖNTEMLER‹ ‹nsan kromozomlar› ilk kez 1857 y›l›nda Virchow taraf›ndan görüldü, kromozom sözcü€ü ise 1988 y›l›nda Waldeyer taraf›ndan kullan›ld› (3,4). Tjio ve Levan 1956 y›l›nda, insan fetal akci€er fibroblastlar› ile yapt›klar› kültürlerden elde ettikleri hücrelerde insan kromozomlar›n›n say›s›n›n 46 oldu€unu ve cinsiyet kuruluflunun XX ve XY oldu€unu kesin olarak saptad› (5). Sitogenetik, kromozom ad› verilen hücre organellerinin ifllev ve morfolojilerini mitotik/mayotik metafaz sürecinde inceleyen bilim dal›d›r. Sitoloji ve genetik bilimlerinin birleflmesiyle ortaya ç›km›flt›r. Genetik materyalin hücresel düzeyde incelenmesidir. Amaç, kromozomal evreye girmifl olan DNA’da meydana gelen yap›sal (translokasyon, delesyon, insersiyon, inversiyon, duplikasyon vs), say›sal (anöploidi, poliploidi vs.) de€ifliklikleri ve köken farkl›l›klar›n› (kimerizm, mozaisizm, vs) saptamak, elde edilen sonuçla fenotip ile genotip aras›ndaki iliflkiyi de€erlendirmektir (6,7). Sitogenetik tan› yöntemleri iki ana bafll›k alt›nda incelenebilir. 1. Ak›fl karyotiplemesi (Flow karyotyping), 1. Klasik Sitogenetik Tan› Yöntemleri 2. Floresans in situ hibridizasyon (FISH), Kromozom eldesi ve preparatlar›n haz›rlanmas› (harvesting): Spontan bölünme h›z› yüksek olan hücrelerden direkt olarak sitogenetik çal›flma yap›l›r; düflük olan hücreler ise önce kültüre edilerek yapay uyar›c›larla mitoz bölünmeye sokulur, ço€alt›l›r ve daha sonra sitogenetik çal›flmalar için kullan›l›r. Herhangi bir fiksatif solüsyon (örne€in; formol) içerisinde bulunan dokular kromozom elde etmek için uygun de€ildir (8). 3. Fiber FISH, 4. Multicolor-FISH, a. Spectral karyotyping (SKY), b. Multiplex-FISH (M-FISH), c. R-FISH, d. Cobra-FISH, e. Komparatif genomik hibridizasyon (CGH). TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Spontan olarak bölünen hücreler: kemik ili€i, lenf nodülleri, solid tümörler, plevra ya da assit s›v›lar›ndaki hücreler, kistik higroma, fetus ya da yenido€an kan› gibi dokular›n hücreleridir. 143 Türk Toraks Derne¤i Okulu 1. Giemsa bandlama yöntemi (G-Banding): G bandlaman›n birçok yöntemle yap›labilmesine ra€men en çok kullan›lan teknik tripsinizasyonu takiben Giemsa kullan›Hücre kültürü: Spontan bölünme h›z› düflük olan hüc- larak gerçeklefltirilen boyama yöntemidir. Enine aç›k ve reler kültüre edilerek ço€alt›l›r. Kültürler iki flekilde ku- koyu bandlar elde edilir. Koyu bandlar, adenin ve tirulabilir: k›sa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat), uzun minden zengin, transkripsiyon düzeyi düflük genleri, aç›k renk bandlar ise guanin sitozinden zengin, korunmufl süreli kültür (bir-üç hafta). genleri içerir. Koyu bölgelerdeki paketlenmenin daha s›Kültür kurmak için haz›rlanan kültür ortam›nda afla - k› olmas› sebebiyle, bu bölgede yer alan DNA ve pro€›daki materyaller yer al›r: teinlerin tripsinizasyonla kaybolmad›€› düflünülmektedir. 1. Besi Yerleri (vasat): Dengelenmifl tuz solüsyonu ile G bandlama ile 400-700 aras›nda band de€erlendirilir haz›rlan›rlar (Hanks ya da HBSS). Glukoz, esansiyel ami- (Resim 1). Kromozomlar›n ilk defa Paris Kongresinde noasitler, mineraller gibi hücre metabolizmas› için ge- (1971) idiogramlar› belirlenmifl, en son flekli 2005 rekli materyali içerirler. Hücre kültürlerinde TC Medium ISCN’de yay›nlanm›flt›r (fiekil 2) (10,11). Bu yöntemle 199, Minimal Essential Medium (MEM), McCoy’s 5A, Nut- genomu taranarak 10 Mb (1Mb= 1.000.000 baz çifti) borient Ham’s F-10, RPMI-1640 gibi besiyerleri s›kl›kla kul- yutundaki de€ifliklikler tespit edilir. Hücreleri senkronilan›l›r (9). Tümörler ve özellikli dokular için üretilmifl ze ederek maksimum say›da mitoz biriktirmek ve uygun spesifik besiyerleri de kullan›lmaktad›r (Leibovitz L15). konsantrasyonlarda kolflisin uygulayarak daha uzun band2. Serum: Dana serumu (FBS) ve s›€›r fetusu serumu lara sahip olan kromozomlar elde etmek amac›yla uy(FCS) kullan›l›r. Serumlar içlerinde hücre büyüme fak- gulanan yüksek rezolüsyonlu bandlama “High Resolution törleri, adezyon faktörleri, iz elementler, hormonlar ve Banding (HRB)” ile kromozomlar daha detayl› olarak de€erlendirilir (Resim 2). vitaminleri bulundurur. 3. Antibiyotik: Penisilin ve streptomisin bakteri infek- 2. Floresans bandlama yöntemi (Q banding): Quinacsiyonu engellemek için en çok kullan›lan antibiyotikler- rine mustard/Quinacrine dihydrochloride gibi floresan dir. Bunlara mantar infeksiyonlar›n› engellemek için am- veren boyalar kullan›larak yap›lan bandlamad›r. Parlak ve soluk bandlar elde edilir. Parlak bandlar G bandlafoterisin ve nistatin eklenebilir. madaki koyu renk bandlara, soluk bandlar aç›k renk 4. L-Glutamin: Esansiyel bir aminoasittir. bandlara karfl›l›k gelir. Bir, dokuz ve onalt› no’lu kro5. Mitoz uyaran›: Fitohemaglutinin, EBV (Epstein-Bar mozomlar›n sentromer bölgelerinde ve Y kromozomunvirüs), Pokeweed mitojen (PWM), Forbol ester (TPA) da farkl›l›klar izlenir. Trizomilerde fazladan bulunan kullan›l›r. kromozomun parental orijininin tespit edilmesinde kulDirekt hücre materyalinden ve hücre kültürlerinden lan›l›r (9,10). Spontan olarak bölünme h›z› düflük olan hücreler ise kan lenfositleri, amniyon s›v›s›, koryonik villus, deri ve fibroblast içeren di€er dokulard›r. preparatlar›n haz›rlanmas› (Harvesting): Kültürlere veya elde edilen direkt hücre materyaline çal›flmaya bafllamadan iki saat önce mitozu durdurmak için kolflisin ya da demekolflin eklenir. S›v› faz santrifüjlenerek uzaklaflt›r›l›r. Tüpte kalan hücre faz› hipotonik solüsyonu (0.075 M KCl) ile 20 dakika muamele edilir. Kromozomlar›n birbirlerinden ayr›lmas› sa€lan›r. Süre sonunda s›v› faz santrifüjlenerek uzaklaflt›r›l›r. Hücre faz› üç kere fiksatif (3 Metanol: 1 Asetik Asit) ile y›kan›r. Daha sonra elde edilen hücre faz› lamlara yay›larak boyan›r (fiekil 1). S›kl›kla kullan›lan boyama yöntemleri: Normal kromozomlar›n tan›mlanmas› ve anormalliklerin tespiti için elde edilen preparatlar›n boyanmas› gereklidir. Çeflitli boyalar kullan›larak yap›lan bandlama ifllemleri kullan›lan boyan›n, boyanan bölgenin veya yöntemin ismiyle adland›r›l›r. Klasik bandlama yöntemleri oldukça basit ve fiyat› uygun yöntemlerdir. Bu nedenle in situ hibridizasyon yöntemleri uygulanmadan önce modern sitogenetik analizlerin temel çal›flmas› olarak kullan›l›rlar. 144 3. Reverse bandlama yöntemi (R-Banding): G bandlamadaki koyu renk bandlar aç›k, aç›k renk bandlar koyu renkte boyan›r. G bandlaman›n negatifi gibidir. Yüksek ›s› ve kontrollü pH ile muamele edilen preparatlar Giemsa ile boyan›r. G ve Q bandlamada soluk olarak boyanan telomerik bölgelerin koyu olarak boyanmas›na imkan tan›r. Kromozomlar›n uç k›s›mlar›n› kapsayan anomalilerin de€erlendirilmesinde kullan›l›r (8-10). 4. C-Bandlama yöntemi (C-Banding): C-band bölgesinde bulunan histon olmayan proteinlerin bölge DNA’s›na çok s›k› ba€lanmas› ve tekrarlayan satellit DNA’n›n histonlarca s›k›ca paketlenmifl olmas› nedeniyle, asit ve alkali muamelesi sonucunda C-band bölgesi d›fl›nda yer alan fragmentlere ayr›lm›fl DNA kaybolurken, C-band bölgesindeki DNA korunarak kal›r. Sentromere yak›n C-band bölgeleri koyu, di€er bölgeler aç›k boyan›r. Bir, dokuz ve onalt› no’lu kromozomlar›n sentromer bölgelerinde ve Yq’da spesifik bandlar izlenir (Resim 3). Kromozom polimorfizmi bu yöntemle de€erlendirilir. TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 1. Kandan kromozom analizi basamaklar› (Passarge E. Renkli atlas. ‹stanbul: Nobel T›p Kitabevleri, 2000: 179. TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› 145 Türk Toraks Derne¤i Okulu Resim 1. G-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olguda metafaz örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi). 5. NOR-bandlama yöntemi: Gümüfl nitrat ile akrosentrik kromozomlar›n (13, 14, 15, 21 ve 22’nin k›sa kollar›) satellitlerinde yer alan nükleer organizer bölgeler siyah noktalar fleklinde boyan›r (Resim 4). Bu bölgede 18S ve 28S ribozomal RNA genleri yer almaktad›r. Bu bandlamalar›n d›fl›nda daha özel amaçlarla kullan›lan birçok boyama ve bandlama yöntemleri de vard›r: florokromlar ve z›t-boyama teknikleri, antikinetekor antikorlar› ile yap›lan boyamalar, restriksiyon endonükleaz-Giemsa bandlama vs. (9). Bandlanan preparatlar›n mikroskobik analizi ve görüntüleme: Bandlama sonras› mikroskopta 10 x 100 büyütme ile görüntü analiz sisteminde rutin analizler için en az 25 metafaz de€erlendirilir. 2. Özelleflmifl Sitogenetik Tan› Yöntemleri 146 Sitogenetik tan›da spesifik durumlar ve baz› kromozomal hastal›klar›n tan›s› için veya mutajenite testi olarak kullan›lan çok özelleflmifl teknikler de vard›r. Bunlardan en çok kullan›lanlar› flunlard›r: TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 2. Normal insan kromozomlar›n›n Giemsa bant örneklerinin flemas›= ‹diyogram› (Nussbaum LR, Malnnes RR, Willard HF. Thompson ve Thompson T›bbi Genetik. Ankara: Günefl Kitabevi; 2005: 137). a. Kardefl kromatid de€iflimi “Sister Chromatid Exchange (SCE)”: Metafaz kromozomlar›nda morfoloji de€iflmeksizin, özdefl segmentlerin simetrik de€iflimi sonucu kromatidlerin karfl›l›kl› farkl› boyanmas›d›r. Mutajen veya karsinojenlerin oluflturdu€u genetik harabiyetin gösterilmesinde ve kromozom k›r›€› sendromlar›n› de€erlendirmek amac›yla kullan›l›r (örne€in; Bloom Sendromu) (8-10). Genotoksik etmenler en baflta sigara olmak üzere maruz kal›nan kimyasal ve fiziksel ajanlar olabilece€i gibi tan› ve tedavi amac›yla kullan›lan ilaçlar da olabilir. Kültür ortam›na eklenen bromo-deoksi-uridin (BrdU) sentez faz› esnas›nda kendini eflleyen DNA’n›n yap›s›na girerek timin nükleotidinin yerini al›r. ‹kinci kez mitoza giren hücrelerde, biri ana hücreden gelen di€eri de yeni sentezlenen iki kromatid aras›nda parça de€iflimleri meydana gelir (fiekil 3). Parça de€iflimlerini görüntülemek için preparatlar Giemsa ile boyan›r. BrdU TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› ba€layan bölgeler boyay› tutmad›klar› için kromozomlar üzerinde aç›k renk ve koyu renk bölgeler oluflur. De€erlendirme bu renk de€iflimlerinin say›s›na göre yap›l›r. Say› normal s›n›r›n üzerine ç›kt›€› zaman SCE pozitifli€i söz konusu olur. Kromozomal instabilite testi olarak da adland›r›l›r. b. Mikronükleus tekni€i: Mikronükleuslar (MN) hücre bölünmesi s›ras›nda ortaya ç›kan, esas çekirde€e dahil olmayan kromozomlar veya asentrik kromozom parçalar›ndan köken alan oluflumlard›r (Resim 5). MN say›s›ndaki art›fl anöploidiyi uyaran çeflitli mutajen veya karsinojenlerin hücrede yol açt›€› say›sal ve yap›sal kromozom anomalilerinin dolayl› olarak de€erlendirilmesini sa€lar. Genotoksisite de€erlendirme testidir. MN testi karsinojenlerin ya da farmasötik ajanlar›n yapt›€› sitogenetik harabiyetin tesbitinde kolay uygulanabilmesi, çok fazla say›da hücrenin de€erlendirilebilmesi ve ista- 147 Türk Toraks Derne¤i Okulu Resim 2. HRB-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olgudan karyotip örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi). Resim 3. C-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olguda metefaz örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi). 148 Resim 4. NOR-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olguda metefaz örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi). TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 3. Kardefl kromatid de¤ifliminin mekanizmas›.Kal›n çizgiler do¤al DNA zincirini, ince çizgili zincir BrdU içeren DNA zincirini göstermektedir (Verma SM, Babu A. Human chromosomes manual of basic techniques. New York: Pergamon Press, 1989: 130). tistiksel yönden anlaml› sonuçlar elde edilmesi avantaj› ile yayg›n kullan›lan bir tetkiktir (6,12). c. Frajil bölge tespiti: Frajil bölgeler kromozomlar üzerinde yer alan, özel kültür koflullar› alt›nda baz› faktörler taraf›ndan indüklenince gözlenen boyanmayan aral›klar (boflluklar), k›r›klar, yeniden düzenlenmeler veya triradiyal bölgelerdir (Resim 6) (13,14). Frajil bölgeleri gösterebilmek için hücreleri de€iflik koflullar› olan ortamlarda ço€altmak ya da kimyasallarla karfl› karfl›ya b›rakmak gerekir. Frajil bölgeler toplumda görülme s›kl›klar› ve indükleyici ajan tipi dikkate al›narak s›n›fland›r›l›rlar: 1. Nadir gözlenen frajil bölgeler: Toplumda %2.5’ten daha az s›kl›kla izlenirler. Folat stresi, BrdU veya distamisin-A ile indüklenerek ortaya ç›karlar. 2. S›k gözlenen frajil bölgeler: Bütün bireylerde izlenirler. Afidikolin, 5-azasitidin, kafein ve etanol taraf›ndan indüklenince ortaya ç›karlar. Frajil bölgelerin kal›t- TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› lanabilir varyantlar› mevcuttur. Klinik olarak anlaml› oldu€u aç›kça gösterilmifl olan Frajil X sendromundan sorumlu olan fra Xq27.1 bölgesidir. Frajil bölgelerde kansere yol açan genlerin yerleflti€i gösterilmifltir. Bu genlerin kanser hücrelerinde s›kl›kla delesyona u€ramas›, frajil bölgelerin kanser gelifliminde genomik karars›zl›k aç›s›ndan önemini ortaya koymaktad›r (13,14). En s›k görülen frajil bölge olan 3p14.1’de yer alan FHIT geni muhtemelen tümör süpressör gen olarak görev yapmaktad›r (15). II. MOLEKÜLER S‹TOGENET‹K TANI YÖNTEMLER‹ 1. Ak›fl Karyotiplemesi (Flow Karyotyping) Flow sitometri ile kromozomlar›n analizi için iki lazerli floresan-aktive edici hücre sayac› “Fluorescent-Activated Cell Sorter (FACS)” kullan›l›r. Birinci lazer 364 nm dalga boyunda ›fl›k dalgas› göndererek Hoechst 33258 149 Türk Toraks Derne¤i Okulu Resim 5. MN örne¤i (Dr. HG. Durakbafl›-Dursun’un izniyle). Resim 6. Fra15q içeren bir hasataya ait kromozom 15 örnekleri (Dr. AG Zamani arflivi). boyas›n›n, ikinci lazer 458 nm dalga boyunda ›fl›k dalgas› göndererek Chromomycin A3 boyas›n›n floresan ›fl›mas›n› sa€lar. Mitotik hücre popülasyonundan elde edilen kromozom süspansiyonu Hoechst 33258 ve Chromomycin A3 boyalar› içeren poliamin buffer içinde boyan›r. Hoechst 33258 → adenin ve timinden zengin, Chromomycin A3 → guanin ve sitozinden zengin DNA bölgelerini boyar. Daha sonra kromozomlar flow sitometrinin ›fl›k demetinden tek tek geçirilmek suretiyle analiz edilir. ‹ki lazerden iki farkl› dalga boyunda gönderilen ›fl›n demetlerinden yans›yan floresan ›fl›n›m fotomultiplier taraf›ndan ölçülür ve FACS taraf›ndan depolan›r (fiekil 4) (16,17). Daha sonra bilgisayar taraf›ndan yap›lan analiz sonucunda birkaç yüz bin kromozomdan elde edilen verilerin toplam› ile bir ak›fl karyotipi oluflturulur. Her kromozomun kendi rezolüsyonuna göre ayr› ayr› ya da ortak bir pik izlenir. Dokuz, 10, 11 ve 12 numaral› kromozomlar›n genetik içeri€i birbirine benzer oldu€u için bu kromozomlara ait tek bir noktada birikim saptan›r (fiekil 5) (16). 150 fiekil 4. Floresan-aktive edici hücre sayac› ile ak›fl karyotiplemesi (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential Cell Biology. 2nd ed. Spain: Garland Science; 2004: 326.)’dan modifiye edilerek al›nm›flt›r. 2. Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH) Sitogenetik ve moleküler genetik teknikleri biraraya getiren bir tetkiktir. Genomda istenilen hedef DNA bölgesinin floresan veren DNA veya RNA problar› ile boyanarak “in situ” olarak gözlenmesine imkan tan›yan moleküler sitogenetik bir yöntemdir. ‹nterfaz hücre çekirde€inin ve metafaz kromozomlar›n›n de€erlendirilmesini sa€lar. Yöntemin temelinde, görüntülenmesi hedeflenen DNA bölgesine komplementer florokromlarla (floresans veren moleküller) iflaretlenmifl olan tek iplikçikli (oligonukleotid) DNA dizileri kullan›l›r. Bu florokromlarla iflaretli DNA dizilerine Prob denir. Morfolojik olarak korunmufl kromozom preparasyonlar›na, fikse edilmifl hücrelere ya da doku kesitlerine uygulanabilmektedir. Klinik sitogenetikte say›sal ve yap›sal anomalilerin, mikrodelesyon sendromlar›n›n, kriptik translokasyonlar›n, marker kromozomlar›n tan›mlanmas›nda, tümör gelifli- TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 5. Ak›fl karyotiplemesi analiz sonucu (Thompson MW,McInnes RR,Willard HF. Thompson and Thompson Genetics in Medicine. 4th ed. Philadelphia: WB Saunders, 1999: 176). minde ortaya ç›kan anomalilerin tan›mlanmas›nda, gen haritalamada kullan›lan bir tekniktir (8,18,19). FISH prosedürü genel olarak flu basamaklardan oluflur (fiekil 6): • Hedef DNA (metafaz kromozomu ya da interfaz nukleusu) ve prob haz›rlan›r. • Hedef DNA ve prob birlikte ya da ayr› ayr› yüksek ›s›da denature edilir (72-75ºC). DNA’n›n çift zincirli yap›s› aç›larak tek zincirli hal al›r. Hedefin haz›rlanmas› Probun haz›rlanmas› • Hedef DNA ve probun 37ºC’de hibridizasyonu sa€lan›r (süre probun tipine göre de€iflir: 1-16 saat). Bu aflamada problar hedef kromozom üzerindeki komplementeri olduklar› bölgeye ya da bölgelere ba€lan›r. • Hibridizasyon süresi bitince nonspesifik ba€lanmalardan ve artefaktlardan (kirliliklerden) kurtulmak için çeflitli s›cakl›klarda ve çeflitli yo€unluklardaki tuz ve deterjan türevi maddelerle y›kama ifllemi yap›l›r=Posthibridizasyon y›kama. • Kromozomlar kontrast oluflturan bir renkle (örne€in; DAPI=4’-6-diamidino-2-phenylidole/Antifade) boyanarak görünür hale getirilir. • Floresans mikroskopta incelenir. • Hedef kromozom ya da kromozom bölgesine ve amaca ba€l› olarak kullan›lan çeflitli problar vard›r: Denaturasyon a. Tüm kromozom boyama problar› (kromozom painting prob): Kromozom ya da kromozom kollar›n›n identifikasyonu için kullan›lan problard›r (Resim 7). Hibridizasyon b. Sentromer spesifik problar: Sentromer yak›n›ndaki alfa satellit bölgesine özgü problard›r (Resim 8). Sadece 13/21 ve 14/22 kromozomlar› sentromerik bölgelerinde homolog dizilere sahiptirler. Ay›rt edilebilmeleri için ekstra bir prob ile kombine edilirler (8,18,19). Hibridizasyon sonras› y›kama Kromozomlar›n boyanmas› Floresans mikroskobi fiekil 6. FISH analizi basamaklar›. TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› c. Lokus spesifik problar= Tek gen problar›: Delesyon ya da duplikasyonlar› tespit etmek ve gen lokalizasyonunu belirlemek için kullan›lan bir gen/lokus bölgesine özgü problard›r (Resim 9). Tümör geneti€inde s›kl›kla kullan›l›r (8,18,19). d. Telomerik problar: Kromozomlar›n terminal bölgelerini tan›mlayan problard›r. Hücre yafllanmas› (senescence), kromozomal yeniden düzenlenmeler ve delesyonla- 151 Türk Toraks Derne¤i Okulu Resim 9. SRY lokus spesifik prob kullan›larak yap›lm›fl FISH örne¤i. SRY/X probu kullan›ld› (X kromozomu yeflil, SRY k›rm›z›) (Dr. AG. Zamani ve HG. Durakbafl›-Dursun’un arflivi). Resim 7. Tüm kromozom boyama probu kullan›larak sekinizci kromozom boyanm›flt›r (Dr. AG. Zamani ve HG. Durakbafl›-Dursun’un arflivi). Resim 8. ‹nterfaz FISH. 7 ve 8 no’lu kromozomlara ait sentromerik problar (7. kromozom yeflil, 8. kromozom k›rm›z›) kullan›lm›flt›r (Dr. AG. Zamani ve HG. Durakbafl›-Dursun’un arflivi). r›n araflt›r›lmas›nda kullan›l›r. Her kromozoma özgü telomerik problar bulunmaktad›r. 3. FIBER-FISH Kromozom fiberleri metafazda kondanse olurlar bu nedenle ancak birbirinden 2-3 Mb (1 Mb= 10.000 bp) uzakl›ktaki bölgelerde problarla elde edilen floresan tespit edilebilir. Daha yak›n mesafelerde prob ›fl›n›mlar› üst üste biner ve elde edilen sinyal kombine olarak alg›lan›r. E€er interfazda bu hibridizasyon gerçeklefltirilir ve fiberler aç›k olarak izlenebilirse iki probun sinyalinin izlenebilmesi için aradaki en az mesafe oran› 50 kb’ye (1 kb= 1000 bp) kadar düfler (20). 152 4. Multicolor-FISH Daha sonraki y›llarda FISH metodunu temel alarak gelifltirilmifl uygulamalard›r. a. Spektral karyotipleme (SKY): Tekni€in esas› her biri 5 florokromun farkl› kombinasyonlar›yla haz›rlanm›fl 24 farkl› kromozom boyama probu ile 24 kromozomun efl zamanl› hibridizasyonu ve tek bir filtreye sahip floresans mikroskopu ile analizine dayan›r. Befl farkl› floresan boyan›n kombine edilip kullan›lmas›yla 31 farkl› hedefi ay›rt edebilmek mümkündür. Efl zamanl› olarak bir metafaz pla€›nda yer alan tüm kromozomlar›n farkl› renklerde görüntülenmesine imkan tan›r. Her bir kromozomun yayd›€› floresans›n tek bir optik filtre kullan›larak spektral görüntülenmesi ve emisyonlar›n›n ölçülmesi hibridizasyonun de€erlendirilmesine olanak sa€lar. Her kromozom kendine ait farkl› karakteristik bir dalga boyunda veya floresansta izlenir. SKY ile 1.5 Mb’nin alt›ndaki parça de€iflimleri bile saptanabilir (19,21). Kansere neden olan genomik de€iflikliklerin standart bantlama yöntemlerinden daha iyi anlafl›lmas›n› sa€lar. Yeniden düzenlenmeler kolayl›kla tan›mlan›r. ‹liflkili kromozomlar saptan›r. Bandlama tekniklerine üstünlü€ü çok küçük boyutlardaki anomalilerin daha kolay tan›nabilmesine olanak vermesidir (22). b. M-FISH (Multiplex FISH): SKY gibi 5 florokromun çeflitli kombinasyonlar›yla haz›rlanm›fl problar›n hibridizasyonu ve farkl› floresan sinyaller ile analizine dayal› bir yöntemdir. Befl florokromun her birinin ayr› ayr› ›fl›n›m›n›n dar band-geçiflli bir ›fl›ma saptama filtresi ile tespit edilmesi ve elde edilen befl floresan ›fl›ma tabakas›n›n bilgisayarda üst üste çak›flt›r›larak de€erlendirilmesi esas›na dayan›r. Sadece sentromerler için uygulanan TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu CM-multiplex FISH ve telomerler için uygulanan TM-Multiplex FISH tetkikleri mevcuttur (19,23). c. COBRA-FISH= Combined binary ratio FISH: Di€er FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullan›l›r. Yirmidört kromozomun 12’si bir gruba di€er 12’si di€er bir gruba ayr›l›r. ‹lk grup üç ayr› florokromla hibridize olurken, ikinci grupta ek olarak dördüncü bir florokrom kullan›l›r. Bu metod, beflinci florokromla da yap›labilir. Kromozom kollar›na özgü boyama sa€lad›€› için kullan›l›r (24). d. R x FISH=Cross-species colour FISH: Jibon kromozomlar› prob olarak kullan›l›r. Jibon ve insan kromozomlar›n›n homolojisi yaklafl›k %98’dir. RxFISH ile yaln›zca kromozom aras› parça de€iflimleri de€il, ayn› zamanda kromozom içi de€iflimler de belirlenebilmektedir (delesyon, inversiyon). G-bantlama tekni€i ile birlikte kullan›ld›€›nda 400 kat daha hassas sonuçlar vermektedir (25). e. Karfl›laflt›rmal› genomik hibridizasyon=comparative genomic hybridization (CGH): FISH’de dahil olmak üzere klasik sitogenetik yöntemlerin, kanser sitogeneti€inde karfl›lafl›lan yap›sal anomalileri do€ru olarak tan›mlamada yetersiz kalmas› yeni yöntem aray›fllar›n› beraberinde getirdi. Sitogenetik ve moleküler genetik tekniklerin birlikte kullan›ld›€› CGH bu sorunun çözümlenmesini sa€lad›. Kallioniemi ve ark. taraf›ndan uygulamaya sokulan bu teknikte amaç DNA kopya say›s›ndaki art›fl› veya eksilmeleri ortaya koymakt› (26,27). Yöntem, kontrol ve test DNA’lar›n›n anomali içermeyen normal metafaz pla€› üzerinde hibridize edilmesi esas›na dayan›r. Genomdaki dengesiz materyalin daha ayr›nt›l› ve do€ru analizi ve özellikle dengeli görünen bir genomda yer alan belirgin olmayan sapmalar› göstermek için kullan›l›r. Ayr›ca, gen amplifikasyonu bak›m›ndan tümör genomunun taranmas› ve amplifikasyonun kromozomal lokalizasyonunun saptanmas› amac›yla da kullan›l›r. Yöntem ile hasta DNA’s›ndaki kromozomal kay›p (loss) veya belli bir bölgenin amplifikasyonu (gain) gösterilir. Bu yöntemle metaplazik de€ifliklikler de saptan›r. PZR (polimeraz zincir reaksiyonu) ile kombine edilirse az say›da hücreden elde edilen az miktarda DNA ile çal›flmaya imkan tan›r (28). CGH için analiz edilecek DNA (test DNA’s›) ile normal DNA (kontrol DNA’s›) farkl› florokromlarla iflaretlenir ve normal hücrelerden elde edilen metafaz kromozomlar› ile hibridize edilir (fiekil 7). Test DNA yeflil (Biotin-avidin), kontrol DNA k›rm›z› (Digoksin-antidigoksigenin) iflaretlidir. Farkl› floresan fenotipi gösteren DNA’lar normal metafaz kromozomlar› ile hibridize olduklar› zaman birbirleri ile tam örtüflüyorlarsa, mavi-turuncu bir renkte izlenirler. E€er test DNA’s›nda bir delesyon söz konusu olursa bu bölgede hibridizasyon gerçekleflmez, dolay›s›yla bölge k›rm›z› renkte izlenir. Buna karfl›l›k DNA’da bir amplifikasyon varsa, bu bölgede hibridizas- TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› yon daha yo€un oldu€u için bölge di€er bölgelerden daha parlak yeflil olarak izlenir (26-28). Görüntü analiz sisteminin program›yla bilgisayarda hibridizasyon oranlar›na göre kromozom hibridizasyon profilleri (CGH oran profili)hesaplanabilir (fiekil 8). Tekni€in Temel Avantaj›, iki renkli görüntüleme sistemi kullan›lmas› sonucunda metafaz pla€› üzerinde kromozom anomalilerinin normal karyotip analizine göre daha güvenilir saptanabilmesi ve en az iki genomun birbirleri ile karfl›laflt›r›lmas›na olanak sa€lamas›d›r. Dezavantaj› ise düflük kararl›l›k (10.000-20.000 kb) ve verimliliktir. 2. MOLEKÜLER GENET‹K YÖNTEMLER ‹nsan Genom Projesi (HUGO) kapsam›nda yap›lan çal›flmalar sonucunda, insan genomunun yaklafl›k olarak 33.000 adet gene sahip oldu€u anlafl›lm›fl ve bunlar›n büyük ço€unlu€unun özellikleri belirlenmifltir. Günümüzde klinikte konulan hastal›k tan›lar›, moleküler tan› ile desteklenmektedir (29,30). Ayr›ca, ilaç etkinli€inde genotip-fenotip iliflkisi giderek önem kazanmakta ve kullan›lan ilaçlardan en az zararla, en etkin flekilde yararlanma olanaklar› araflt›r›lmaktad›r. Afla€›da genetik hastal›klar›n moleküler genetik tan›s›nda kullan›lan temel yöntemlerden bahsedilecektir. I. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)= (Polymerase Chain Reaction) Kary Mullis’in buluflu olan ve kendisine Nobel ödülü kazand›ran PZR, hücre içinde do€al olarak gerçekleflen DNA replikasyonunun tüp içinde taklit edilmesiyle istenilen bir bölgenin çok fazla say›da ço€alt›lmas›n› sa€layan bir yöntemdir (31). Çok az miktarda DNA yeterlidir. PZR spesifik DNA ve RNA dizilerinin in vitro amplifikasyon tekni€idir. ‹ki oligonükleotid primer dizilimi aras›nda yer alan hedef DNA bölgesinin enzimatik olarak birkaç milyon kat ço€alt›lmas› ifllemidir. Bir çeflit in vitro klonlama yöntemidir. Çok az miktardaki örnekten spesifik bir gen bölgesini ço€altmak ve tan›ya yönelik incelemeler yapmak için yeterli genetik materyal sa€lamak amac›yla kullan›lmaktad›r. Primerlerden biri hedef bölgenin 5’→3’ yönündeki zincirinin, di€eri 3’→5’ yönündeki zincirinin bafllang›ç bölgesine komplementerdir. Ortamda ço€alt›lacak olan kal›p DNA örne€i, DNA’da ço€alt›lmas› planlana bölgenin iki ucunda yer alan DNA dizilerini özgül olarak tan›y›p ba€lanacak primerler, bu primerlere ba€lan›p sentez yapacak olan ›s›ya dayan›kl› "Taq" polimeraz enzimi, sentez iflleminde kullan›lacak deoksiribonükleotid trifosfatlar (dNTPs=dATP, dTTP, dGTP, dCTP), gerekli pH ve iyon (Mg+2) koflullar›n› sa€layan tampon kar›fl›m› bulunmal›d›r (32). PZR ile DNA’n›n iki zincirinin yüksek ›s› ile birbirinden ayr›lmas› (denatürasyon), daha sonra sentetik oligonük- 153 Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 7. CGH protokolü (Özon YH. Komperatif genomik hibridizasyon tekni¤inin prenatal tan›da uygulanmas›. [Doktora Tezi]. Eskiflehir Osmangazi Üniversitesi, 2000: 22. 154 TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 8. Analiz edilen kromozomlardaki kopya say›s›ndaki de¤ifliklikleri gösteren bilgisayar sonuç örne¤i (Wegner RD. Diagnostic cytogenetics. Berlin: Springer-Verlag, 1999: 377). leotidlerin hedef DNA’ya ba€lanmas› (primer hibridizasyonu, annealing), enzimatik DNA sentezi (polimerizasyon: ekstansiyon) döngüsünün 25-40 kere tekrarlanmas› sonucu hedef DNA’n›n bir kaç milyon kopyas›n›n elde edilmesi sa€lan›r (fiekil 9). Sonuçta tek bir DNA fragmentini 2n kadar ço€alt›l›r (n= döngü say›s›). Her ad›m farkl› ›s›larda gerçekleflir; s›ras›yla birinci basamak 9498°C; ikinci basamak 37-65ºC; üçüncü basamak 72ºC. Bütün ifllem bir-iki saat içerisinde tamamlan›r. • DNA protein interaksiyonunun araflt›r›lmas›nda (footprinting) kullan›labilir. PZR’nin genetikte kullan›m alanlar›: PZR yönteminin her geçen gün kullan›m alan› genifllemektedir. Uygulanan PZR çeflitlerinin say›s› da her geçen gün artmaktad›r. PZR uygulamalar› aras›nda, Nested-PZR, RT-PZR, Inverse-PZR, DOP-PZR, Asimetrik PZR, vb. say›labilir. PZR tekni€i giderek moleküler araflt›rmalarda ön ifllem halini almaktad›r. • Onkogenezis araflt›rmalar›, • Kal›tsal hastal›klarda tafl›y›c›n›n ve hastan›n tan›s› (mutasyon analizi), • Prenatal tan›, • Klinik örneklerde patojen organizmalar›n saptanmas›, • Adli t›p (DNA parmak izi araflt›rmas› vb.), • Prob oluflturulmas›/klonlama/gen ekspresyon araflt›rmalar›, • DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluflturulmas›nda, • Bilinmeyen dizilerin tayininde, • Geçmifl DNA’n›n incelenmesinde, • Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analizinde, • ‹n vitro fertilizasyon yap›lan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yap›lmas›, TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› ‹lgili DNA bölgesi PZR ile ço€alt›ld›ktan sonra bu bölgedeki mutasyonlar birkaç de€iflik metod ile direkt olarak analiz edilebilir: PZR ürünlerinin agaroz veya poliakrilamid jel ile analizi, PZR/RFLP, “Allele Specific Oligonucleotid (ASO)” veya Dot Blot analizi, “Amplification Refractory Mutation System (ARMS)”, DNA dizi analizi, microarray analizi vb. II. Allel-Özgü Oligonükleotid “Allele-Specific Oligonucleotid (ASO)” Bu yöntemle hastal›€a sebep olan mutasyon biliniyorsa, hastadan al›nan DNA örne€inde bu mutasyonun bulunup bulunmad›€› tespit edilir. Biri normal gene özgül, di€eri bilinen bir genetik mutasyona özgün sentetik oligonükleotidler, prob olarak kullan›l›r. Problar›n k›sa oluflu analiz edilen örnekte bulunabilecek tek bir baz çifti uyuflmazl›€›n› bile duyarl› olarak saptama olana€› verir (18). Problar sadece tam olarak komplementer olan diziyle hibridize olur tek bir baz uyuflmazl›€› bile hibridizasyonu engeller. Bu yöntemle homozigot ve heterozigot bireyler birbirinden ay›rt edilebilir (fiekil 10A,B). ASO analizlerinde al›nan sonuçlar yorumlan›rken dikkat edilme- 155 Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 9. PZR amplifikasyonu (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential Cell Biology. 2nd ed. Spain: Garland Science; 2004: 349)’dan modifiye edilerek al›nm›flt›r). lidir. ASO ile araflt›r›lan dizilimin d›fl›nda yer alan bölgelerde mutasyonlar olabilir. Yaln›zca s›n›rl› ve az say›daki farkl› mutasyonlarla karakterize genetik hastal›klar için uygundur. III. DNA Dizi Analizi En yayg›n kullan›lan yaklafl›m Sanger dizi analizidir. Günümüzde bu ifllemi yapan aletler bulunmaktad›r. Yöntem, rekombinant Taq polimerazlar›n gelifltirilmesi ile PCR ile gerçeklefltirilebilir hale gelmifltir. Hem normal hem de mutant genlerin analizi için rutin kullan›l›r. Birçok dizi analizi yöntemi olmas›na ra€men burada otomatik dizi analiz sistemlerinin kulland›€› zincir sonland›rma (chain termination, Sanger yöntemi) yöntemi anlat›lacakt›r. Sanger dizi analizinin avantaj› DNA polime- 156 raz› inhibe etmek için nükleotidlerin kimyasal analoglar›n›n kullan›lmas›d›r. Bu analoglar dideoksinükleotidtrifosfatlar (ddNTP)’d›r. 2’,3’ dideoksinükleotidtrifosfat’lar›n (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP’lerden farkl›l›€› deoxyriboz’un 3’ karbonunda hidroksil grubunun bulunmamas›d›r. Büyüyen/sentezlenen DNA zincirine, dNTP’ler DNA polimerazlar arac›l›€› ile ba€lan›rlar. Bu ba€lanma 5’trifosfat gruplar› arac›l›€› ile olur. Fakat, ddNTP’lerde 3’hidroksil grubunun olmamas› nedeniyle, ard›ndan gelen dNTP’lerin fosfodiester ba€› oluflturmas› engellenir (fiekil 11). Do€al olarak DNA zincirinin daha fazla uzamas› imkans›z hale gelir ve zincir sonlan›r. ddNTP ile klasik dört dNTP bir reaksiyon kar›fl›m›n›n içine konuldu€uda, DNA zincir uzamas› için TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu için) birer reaksiyon elde edilir. Ürünler poliakrilamid jel veya kapiller elektroforezde yürütülerek radyoizotop ya da floroforlar görüntülenir (fiekil 12). Görüntü otomatik görüntüleme aletine aktar›larak analiz edilir (fiekil 13). Çok aç›k ve net bir yöntem olmas›na ra€men bazen teknik güçlükler yaflanabilir. Heterozigot bireylerde tek nükleotidlik de€iflimlerin görüldü€ü mutant alel jelde zay›f bir band, otomatik görüntüleme aletinde de zay›f bir pik verip yanl›fl negatif sonuçlara yol açabilir (18,32,33). IV. Mikroarray Tekni€i Tek bir array üzerinde tüm genomu inceleme yöntemidir. ‹lk kez 1997 de Solinas-Toldo ve ark. hedef (target) diziyi cam matriks üzerine immobilize ederek mikroarrayin temelini att› (34). Pollack ve ark. array platformu üzerine cDNA dizisini (target) immobilize ederek genom düzeyinde DNA’daki kopya say›s›ndaki de€iflmeleri inceledi (35). Moleküler biyolojik ve robotik tekniklerin bir arada kullan›m› sonucunda, cam matriks üzerinde her biri spesifik bir geni temsil eden binlerce DNA parças›n›n (sentetik oligonükleotidler, cDNA’lar, BAC, PAC ve kozmitler, PZR ürünleri) yap›flt›r›lmas› ile elde edilen arrayler ile hücrelerde, gen ekspresyon analizleri ve tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) genotiplemelerini yapmak mümkün oldu. BAC, PAC ve kozmitlerden elde edilen problar, PZR, cDNA, oligonukleotidlerden elde edilen problara göre daha güçlü sinyal yo€unlu€u verir. Standart bir mikroarray matriksi, yaklafl›k olarak, bir cm2’sinde 100 µm çap›nda 40.000 spot (benek) içerir. Tekni€in kullan›m alanlar›: • Kanser araflt›rmalar›, • Gen ekspresyon çal›flmalar›, • Normal ve patolojik durumlarda gen ekspresyon farkl›l›klar›n›n incelenmesi, • Mutasyon ve polimorfizm tespiti, • ‹laç hedeflerinin tan›mlanmas›, • Gen haritalamas›, • DNA dizi analizi, • SNP analizleri • Epigenetik modifikasyonlara yönelik çal›flmalard›r. fiekil 10. ASO analizi (Nussbaum LR, Malnnes RR, Willard HF. Thompson ve Thompson t›bbi genetik. Ankara: Günefl Kitabevi, 2005: 41). aralar›nda bir yar›flma olur, seyrek fakat spesifik sonlanmalar oluflur. Sonuçta sentez sonras› farkl› uzunlukta DNA parçalar› ortaya ç›kar. Dört farkl› enzimatik reaksiyonda, dört farkl› ddNTP kullan›larak (A, C, G, T TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Tekni€in aflamalar›; test ve referans hücrelerden genomik DNA izole edilir (fiekil 14). ‹zole edilen DNA veya RNA’dan elde edilen cDNA’lar farkl› renkte florokromlarla [Cy 3 (yeflil) ve Cy5 (k›rm›z›)] iflaretlenir. Ard arda tekrarlanan bölgelerden kaynaklanabilecek hatal› eflleflmeleri önlemek için Human Cot-1 DNA ile muamele edilir. Test ve referans DNA örnekleri array üzerinde bulunan prob DNA’lar ile uygun koflullarda hibridize edi- 157 Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 11. dNTP ve ddNTP'nin flematik görünümü (Deichmann K. Sequencing. In: Hildebrant F, Igarashi P (eds). Techniques in molecular medicine. Berlin: Springer-Verlag, 1999: 187-8. lir. Hibridizasyondan sonra fazla olan iflaretli DNA örneklerini ortamdan uzaklaflt›rmak için cam matriks y›kama ifllemine tabi tutularak kurutulur. Floresan lazer ile elde edilen ›fl›malar bir dedektör yard›m›yla alg›lan›r. Ifl›ma emisyon spektrumu ölçülür. Okunan emisyon spektrumu bilgisayar ortam›na aktar›larak çeflitli analiz programlar› ile de€erlendirilir. Test ve referans DNA örneklerinin verileri birbiri üzerine çak›flt›r›larak, her noktac›€›n yeni bir renk vermesi sa€lan›r. Noktalar›n k›rm›z›/yeflil oranlar› kaydedilir. Bu oranlara göre de€erlendirme yap›l›r. Oran bir ise gen ekspresyonunda de€iflim yok, birden yüksek ise gen ekspresyonunda art›fl, birden düflük de€erlerde ise gen ekspresyonunda düflme olarak de€erlendirilir (33,36,37). Mikroarray tekni€inin avantajlar› flunlard›r; farkl› renklerde florokromlar›n kullan›lmas› genom boyunca DNA kopya say›s›ndaki de€iflimlere ba€l› olarak ortaya ç›kan kromozom anomalilerinin güvenilir flekilde tespit edilmesini ve s›n›fland›r›labilmesini sa€lar, birden fazla ge- 158 nomun birbirileri ile karfl›laflt›r›labilmelerine olanak sa€lar, az miktarlarda DNA örne€i yeterlidir, metafaz pla€› gerekli de€ildir, yüksek kararl›l›k ve verim elde edilir ve DNA üzerindeki tek baz de€ifliklikleri bile saptanabilir. Mikroarray tekni€inin s›n›rland›€› noktalar da mevcuttur. Bunlar; heterojen doku ve hücre popülasyonlar› ile çal›flman›n zorlu€u, standardizasyonun zorlu€u, dolay›s›yla tetkiki sadece alan›nda uzman kiflilerin yapabilmesidir. M‹N‹ GENET‹K SÖZLÜK Akrosentrik: Sentromeri bir uca çok yak›n oldu€u için kollar›ndan biri çok k›sa olan kromozom. Allel: Özdefl kromozomlar›n özel bir loküsünde oturmufl olan herhangi bir genin seçenekli biçimlerinden biri. Anöploidi: Kromozom say›s›ndaki temel kromozom say›s›n›n katlar› kadar olmayan artma ya da eksilmeler. Delesyon: Bir kromozomdan DNA dizisinin koparak kaybolmas›. TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 13. Otomatik dizi analizi yapan aletlerden elde edilen bir dizi analizi sonucu (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential cell biology. 2nd ed. Spain: Garland Science, 2004: 333). Genom: Bir efley hücresinin, kiflinin veya türün tüm genetik bilgisini tafl›yan DNA dizisinin tümü. Genotip: (1) Fenotipten ayr› olarak bir kiflinin genetik yap›s›. (2) Bir loküsteki tüm alleller. Heterozigot: Diploid organizmalarda ayn› gen loküsünde birbirinden farkl› iki allel tafl›yan kifli. Homozigot: Diploid organizmalarda herhangi bir gen loküsünde bulunan iki allelin birbiri ile özdefl olmas› durumu ya da böyle bir kifli. ‹nsersiyon: Bir kromozom parças›n›n homolog olmayan farkl› bir kromozomun içine yerleflmesi durumu. ‹nversiyon: Bir kromozom parças›n›n kopup 180° ters dönerek koptu€u yerlere yap›flmas›d›r. Sentromeri içerir veya içermez. Kimerizm: Ayn› organizmada, farkl› zigotlardan kaynaklanm›fl ve farkl› genetik yap›da birden çok hücre grubunun bir arada bulunmas›d›r. fiekil 12. Zincir sonland›rma ile yap›lan dizi analizi reaksiyonu ve jel görütüsü flematik gösterimi (Deichmann K. Sequencing. In:Hildebrant F, Igarashi P (eds). Techniques in molecular medicine. Berlin: Springer-Verlag, 1999:187-8). Duplikasyon: Kromozom materyalinde ortaya ç›kan, belli bir nükleotidin ya da belli bir dizilime sahip DNA parças›n›n gen yap›s›na tekrar sokulmas› sonucunda ortaya ç›kan baflkalafl›m. Fenotip: Bir organizma ya da hücrenin genotip ve çevre aras›ndaki etkileflim sonucu oluflan ve varl›€› türlü yollarla ortaya konabilen özelliklerinden biri ya da tümü. TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Loküs: Üzerinde genlerin bulundu€u varsay›lan kromozom kesimi. Mozaisizm: Ayn› organizmada, ayn› zigottan kaynaklanm›fl, fakat genetik yap›lar› birbirinden farkl› olan birden fazla hücre grubunun bir arada bulunmas› durumu. Polimorfizm: Birbirlerinden kesinlikle ayr›labilen fakat ayn› loküsteki genlerle oluflturulan iki ya da daha çok seçenekli fenotipin ayn› toplumda ve hemen hemen ayn› s›kl›kta birlikte bulunmas› durumudur. Poliploidi: Herhangi bir bireydeki kromozom say›s›n›n, haploid kromozom say›s›n›n üç ya da daha çok kat› olmas› durumu. Sentromer: Kromozomlar üzerinde kardefl kromatidlerin tutundu€u ve kinetekorun oluflturdu€u ana bo€um. 159 Türk Toraks Derne¤i Okulu fiekil 14. Mikroarray yöntemi (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential cell biology. 2nd ed. Spain: Garland Science; 2004: 339. 160 TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› Türk Toraks Derne¤i Okulu Telomer: Her kromozomun kollar›n›n ucu Translokasyon: Bir kromozom parças›n›n di€er bir kromozoma aktar›lmas›. Trizomi: ‹nsan kromozomlar›n›n herhangi birinin iki yerine üç tane bulunmas› durumudur (2n + 1=47). KAYNAKLAR 1. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953; 171: 737-8. 2. Ba€c› H. ‹nsan genom projesi. DEU T›p Fakültesi Dergisi Özel Say›s›, 2002: 11-9. 3. Vogel F, Motulsky AG. Human genetics. 3rd ed. New York: Springer-Verlag, 1998. 4. Waldeyer, W. Ueber karyokine und ihre Beziehung zu den. Befruchtungsvorgangen. Arch Mikr Anat 1888; 32: 1. 5. Tjio JH, Levan A. The chromosome number of man. Heredi tas 1956; 42: 1-6. 6. Bozkurt G, Tabakç›o€lu K. Psikiyatrik genetik araflt›rmalarda kullan›labilecek genetik yöntemler: III. Psikiatri ve sitogene tik. 3P Dergisi 2004; 12: 20-30. 7. Baflaran N. T›bbi genetik. ‹stanbul: Bas›m Nobel t›p kitabev leri, 1999. 8. Barch MJ, Knutsen T, Spurbeck JL. The AGT cytogenetics la boratory manual. 3rd ed. Washington: Lippincott-Raven, 1997. 9. Verma SM, Babu A. Human chromosomes manual of basic techniques. New York: Pergamon Press, 1989. 10. Lüleci G, Baflaran S, Ba€c› G, Keser ‹. Sitogenetik uygulama yöntemleri. Ankara: Meteksan, 1990. 11. Shaffer, LG, Tommerup, N. ISCN 2005: An international sys tem for human cytogenetics nomenclature. Basel: Karger, 2005. 12. Demirel S, Zamani AG. Mikronükleus tekni€i ve kullan›m alan lar›. Genel T›p Derg 2002; 12: 123-7. 13. Karabacak H. Çeflitli kanser türlerinde aphidicolin ile uyar›l m›fl fragile bölgelerin incelenmesi. [Y. Lisans Tezi]. Konya: Selçuk Üniversitesi, 2006. 14. Finnis M, Dayan S, Hobson L, et al. Common chromosomal fragile site FRA16D mutation in cancer cells. Hum Mol Genet 2005; 14: 1341-9. 15. Smith DI, Zhu Y, McAvoy S, Kuhn R. Common fragile sites, extremely large genes, neural development and cancer. Can cer Lett 2005; 323: 48-57. 16. Ferguson-Smith MA, Smith K. Cytogenetic analysis. In: Rimo in DL, Connor JM, Pyeritz RE, Korf BR (eds). Emery and Ri moin’s principles and practice of medical genetics. 4th ed. China: Elsevier, 2002: 690-722. 17. Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential cell biology. 2nd ed. Spain: Garland Science, 2004: 323-59. 18. Nussbaum LR, Malnnes RR, Willard HF, Boerkoel CF. Thomp son and Thompson genetics in medicine. 6th ed. Philadelphi a: WB Saunders, 2001. 20. Trask BJ. Fluorescence in situ hybridisation:applications in cytogenetics and gene mapping. Trends Genet 1991; 7: 149-54. 21. Schröck E, Du Manoir S, Veldman T, et al. Multicolor spec tral karyotyping of human chromosomes. Science 1996; 273: 494-7. 22. Lee C, Gisselson D, Jin C, et al. Limitations of chromosome classification by multicolor karyotyping. Am J Hum Genet 2001; 68: 1043-7. 23. Speicher M, Barllard SG, Ward DC. Karyotyping human chro mosomes by combinatorial multifluor FISH. Natur Genet 1996; 12: 368-75. 24. Tanke HJ, Wiegant J, van Gijlswijk RPM, et al. New strategy for multi-colour fluorescence in situ hybridisation: COBRA: Com bined Binary Ratio labelling. Eur J Hum Genet 1999; 7: 2-11. 25. Müller S, Rocchi M, Ferguson-Smith MA, Wienberg J. Toward a multicolor chromosome bar code for the entire human kar yotype by fluorescence in situ hybridization. Hum Genet 1997; 100: 271-8. 26. Kallioniemi A, Kallioniemi O, Sudar D, et al. Comparative ge nomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of so lid tumors. Science 1992; 258: 818-21. 27. Özon YH. Komperatif genomik hibridizasyon tekni€inin prena tal tan›da uygulanmas›[Doktora Tezi]. Eskiflehir: Osmangazi Üniversitesi, 2000. 28. Bryndorf H, Kirchoff M, Rose H, et al. Comparative genomic hybridization in clinical cytogenetics. Am J Hum Genet 1995; 57: 1211-20. 29. Zamani A, Zamani AG. Akci€er hastal›klar› geneti€i. Sendrom 1999; 11: 104-9. 30. Zamani AG, Kutlu R, Durakbafl›-Dursun HG, et al. Y chromo some microdeletions in Turkish infertile men. Ind J Hum Ge net 2006; 12: 66-71. 31. Mullis KB. The unusual origin of polimerase chain reaction. Sci Am 1990; 262: 56-65. 32. Akar N. Klinik moleküler patolojiye girifl. Ankara: Ant›p Afi T›p Kitaplar› ve Bilimsel Yay›nlar, 1999. 33. Yürür Kutlay N, Tükün A. Akci€er hastal›klar›na moleküler yaklafl›m. ‹ç: Zamani A (editör). Gö€üs hastal›klar›nda tan› yöntemleri-II özel say›s›. Türkiye Klinikleri J Int Med Sci 2006; 2: 81-8. 34. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, et al. Matrix-ba sed comparative genomic hybridisation: Biochips to screen for genomic imbalances. Genes Chromosomes Cancer 1997; 20: 399-407. 35. Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, et al. Genom-wide analy sis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet 1999: 23; 41-6. 36. Yurter HE. Gen ekspresyon analizinde microarray teknolojisinin kullan›m›. DEÜ T›p Fakültesi Dergisi Özel Say›s›, 2002: 41-7. 37. Atabey N, Eresen Ç, Sak›zl› M. Psikiyatrik genetik araflt›rma larda kullan›labilecek genetik yöntemler: IV-B. ‹nsan genomu projesi ve psikiatri geneti€i. 3P Dergisi 2004: 12; 50-62. 19. Wegner RD. Diagnostic cytogenetics. Berlin: Springer-Verlag; 1999. TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar› 161
