moleküler biyolojide kullanılan yöntemler

3/6/2016
HÜCRE PARÇALAMA YÖNTEMLERİ
• Moleküler biyolojideki araştırmalar büyük ölçüde
saflaştırılmış moleküllerle yapılan analitik
çalışmalara dayanmaktadır.
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE
KULLANILAN YÖNTEMLER-2
• En basit hücre bile karmaşık bir yapıya sahiptir ve
binlerce farklı çeşitteki moleküllerden oluşur.
• Bu nedenle öncelikle ilgilenilen molekül grubunu
hücredeki diğer kısımlardan moleküllerden
ayırmak ve daha sonra da yapılacak çalışmanın
amacına göre saflaştırmak gerekir.
1
2
PARÇALAMA (homojenizasyon)
YÖNTEMLERİ
• Çalışılacak biyolojik molekül grubunun izolasyonu
amacıyla gerçekleştirilen işlemlere ekstraksiyon
(özütleme) denir.
• Bu aşamada çalışılacak molekül grubunu
içeren doku veya hücrelerin çeper ve zar
yapıları parçalanıp yok edilir. Elde edilen
karışıma homojenat denir.
Ekstraksiyon işlemi;
 parçalama,
 ayırma
 ve saflaştırma aşamalarından oluşur.
Daha sonra tam veya kısmen saflaştırılmış
makromoleküllerin (nükleik asitler, proteinler) yapısal
ve/veya işlevsel analizlerine yönelik çeşitli yöntemler
uygulanır.
3
• Hücre yapısı ortadan kalkmış olan
homojenatta, serbest ya da organeller
içerisindeki, hücre bileşenleri parçalamanın
yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon
halinde bulunur.
4
1. Fiziksel yöntemler
a) Mekanik işlemler:
Bu yöntemlerin en basit ve ilkel şekli materyali bir havan içinde kumla öğütmektir.
Hücre parçalama yöntemleri
FİZİKSEL YÖNTEMLER
Mekanik Yöntemler
Ultrasonifasyon
Ozmotik şok
Dondurma-çözme
KİMYASAL YÖNTEMLER
Çözücülerin kullanılması
enzimlerin kullanılması
5
•
Ezerek parçalama daha gelişmiş şekilde, doku veya hücrelerin sıvı azotta (-196 C) ya
da -20 , -70 C ‘de dondurulduktan sonra soğuk havanlarda yapılır.
•
Donma sonucu kristal hale geçen yapılar toz haline gelene kadar kolaylıkla
parçalanabilmektedir.
•
İşlemin çözünme olmadan kısa sürede bitirilmesi gereklidir.
•
Ezme sırasında alumina, kum ya da cam tozu katılırsa , parçalanma etkinliği artar.
6
1
3/6/2016
• Milli homojenizatör (Ultra
turrax): ucunda özel dişleri
bulunan metal bir milin çok
yüksek devirde döndürülmesi
ile parçalama yapar.
• Günümüzde mekanik olarak parçalamada
daha çok homojenizatör denilen aletler
kullanılmaktadır. Bunlar:
• Karıştırıcı tipinde olanlar (blender): Evlerde
kullanılanların daha güçlü olanlarıdır. Yüksek
hızda dönen bıçaklar yardımıyla biyolojik
materyaller kesilerek parçalanır. Bunlar daha
çok bitki ve hayvan doku veya organlarının
parçalanmasında kullanılır.
• Bakteri gibi m.o ların parçalanması için
uygun değildir.
7
• Dişli kısım parçalanacak
materyali içeren tampona
daldırılır; motor
çalıştırıldığında mil döner ve
materyal dişler arasında
kesilerek parçalanır.
8
Fransız basınç hücresi (French pressure cell):
Basınç yardımıyla parçalama sağlar.
• Çelik silindir bir kap, piston ve silindir
üzerindeki basıncın giderilmesi için kullanılan
bir vanadan oluşur.
• Sistem gerek biçim gerekse çalışma
mekanizması açısından büyük metal bir
şırıngaya benzer
• Pistonlu homojenizatörler: Basınç etkisiyle
parçalama yapan ve ucunda genellikle
teflondan yapılmış bir pistonu bulunan
aletlerdir.
• Basınç uygulaması elle veya motor gücüyle
yapılabilir.
9
• Hücre süspansiyonu silindirik
kabın haznesine döküldükten
sonra piston arada hava
kalmayacak şekilde takılır ve
hidrolik basınç motoru ile
süspansiyon üzerine basınç
(yaklaşık 10 ton/cm2)
uygulanır. Basınç istenilen
değere ulaşınca vana biraz açılır
ve hücre süspansiyonunun
damla damla akması sağlanır.
10
Balistik homojenizatörler: dayanıklı cam veya metal bir kap
içine konulan hücre süspansiyonu çapları 0.2-1.0 mm arasında
değişen cam, plastik veya çelik kürecikler ile birlikte yüksek
hızda çalkalanır.
Çalkalama sırasında küreciklerin birbirine çarpması ile hücre
parçalanması gerçekleşir.
Bu yöntem özellikle diğer parçalama yöntemlerine dirençli m.o
ların parçalanmasında kullanılır
11
12
2
3/6/2016
b) Ultrasonikasyon:
• Bu yöntemin en basit uygulama şekli içerisine
cam boncuklar eklenmiş hücre
süspansiyonunun vorteks de karıştırılmasıdır.
İnsanın duyma sınırının üzerindeki frekanslarda (18 kHz üstü) ses
dalgaları (ultrases, ultrason) sıvı bir ortamdaki hücrelere
uygulandığında parçalanmaya yol açar.
• Bu uygulama süspansiyondaki su moleküllerinin kinetik
enerjilerini arttırır. Basınç farkları çok sayıda mikro hava
kabarcığının oluşumuna yol açar. Bu kabarcıklar hızla hareket
eder ve bir süre sonra patlayarak yoğun şok dalgaları yaratır.
• Patlama sırasında ses enerjisinin mekanik parçalama
enerjisine dönüşümüyle ortamdaki hücreler (özellikle bakteri
hücreleri) parçalanır.
13
• Ultrasonikatörler elektrik enerjisini kesikli karakterde mekanik
enerjiye çevirerek, titanyumdan yapılmış bir prob yardımıyla
ultrases dalgalarını solüsyon içindeki materyale iletirler.
• Mekanik yolla veya ultrasonikasyonla yapılan parçalama
sırasında sürtünme nedeniyle açığa çıkan ısıyı yok etmek için
işlem kabı soğuk ortamda tutulmalıdır (buz veya sıvı azot)
14
c) Ozmotik şok:
Hücrelerin yüksek ozmotik basınçlı bir çözeltiden (örneğin %20
sakkaroz) hipotonik bir ortama (örn su) geçirilmesi ile suyun
hücrelerin içine girmesi zarlarda patlamaya yol açar.
Bu yöntem hücre duvarı bulunmayan ya da yok edilmiş
hücreler için uygundur.
15
16
2. Kimyasal yöntemler
• D) Dondurma-çözme:
• Hücrelerin çok düşük sıcaklıklarda (-20, -80 C) tutulup
sonra yeniden ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin
birkaç kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar.
• İşlemin temeli, donan su moleküllerinin hacminin
genişlemesi ve hücrelerde oluşan buz kristallerinin
hücre zarına zarar vererek parçalanmayı sağlamasıdır.
Çözücülerin kullanılması
•
Bu uygulamaların prensibi: hücre zarındaki bileşiklerin çözündüğü
uygun çözücü (solvent) yardımıyla zar yapısının eritilmesidir.
Bu amaçla kullanılan;
• Organik çözücüler (örn, etil asetat, toluen vb) zardaki lipitler çözerek
yapıyı bozarlar.
• Deterjanlar: (sodyum dodesil sülfat) ise uygun pH koşullarında
zardaki protein ve lipoproteinlerle etkileşime girerek onları
uzaklaştırır.
• Bazik çözeltiler (pH 11-12.5) ise hücre duvarının hidrolizini sağlar.
17
18
3
3/6/2016
Enzimlerin kullanılması:
• Lizozim: bakterilerin peptidoglikan tabakasındaki β-1,4- glikozidik
bağları hidroliz etmektedir. Bu enzim, özellikle Gram (+) bakteriler
üzerine etkilidir.
• Gram (-) bakterilerin parçalanması için hücrelerin bir süre EDTA
uygulamasında tutulması gerekir. EDTA, lipopolisakkarit
moleküllerini birbirine bağlayan Ca+2 iyonlarının ortamdan
çekilmesini sağlamakta ve böylece lizozimin içteki peptidoglikan
tabakasına ulaşmasını kolaylaştırmaktadır.
• Ayrıca, tripsin, proteinaz K, gibi proteazlar ve zimoliyaz da (maya
hücreleri için) bu amaçla kullanılan enzimlerdir.
• Enzimatik parçalama genelde mekanik parçalamaya dayanıklı yapılar
için uygulanmaktadır.
19
20
• Sonuç olarak, kullanılan parçalama yöntemi,
amaçlanan çalışmaya, kullanılan biyolojik materyalin
tipine (organizma, doku, veya hücre tipine), izole
edilecek molekül grubuna, eldeki olanaklara ve kabul
edilebilir etkinliğe bağlıdır.
AYIRMA (SEPERASYON),
SAFLAŞTIRMA (PÜRİFİKASYON)
VE ANALİZ YÖNTEMLERİ
• Buna göre, fiziksel veya kimyasal yöntemlerden ya da
iki tipi de içeren karma yöntemlerden yararlanılabilir.
21
22
• Ham özüt bazı biyokimyasal analizlerde doğrudan
kullanılabildiği gibi moleküler biyolojik çalışmalarda ilgilenilen
molekül, hedeflenen saflık derecesine göre uygulanan
yöntemlerle, ham özütteki diğer moleküllerden ayrılabilir.
• Parçalama sonrasında, üzerinde çalışılacak
molekül grubunu homojenattaki diğer
molekülllerden ayırmaya ve saf bir şekilde
elde etmeye yönelik bir seri işlem uygulanır.
• Homojenattaki zar parçalarını, parçalanmamış
doku veya hücreleri uzaklaştırmak amacıyla
uygulanan ön ayırma işlemlerinden sonra elde
edilen ve çalışılacak molekülle birlikte birçok
karışıma ham özüt (crude extract) denir.
23
•



Bu yöntemler karışımdaki molekül gruplarının
çözünme özelliklerine
Kitle, yoğunluk elektriksel yük gibi fiziksel özelliklerine
Veya diğer moleküllere ilgisine göre (affinite) ayrılmalarını
sağlayan işlemleri kapsar
Bu tekniklere hazırlayıcı (preparative ) teknikler denir.
Hazırlayıcı süreç oldukça fazla miktardaki bir biyolojik materyalin
saflaştırılmasına yöneliktir.
24
4
3/6/2016
• Bu yöntemlerin amacı daha sonraki belirleyici analitik
çalışmalar için ilgilenilen moleküllerin elde
edilmesidir.
• Ayırma/saflaştırma işlemlerinden sonra, üzerinde
çalışılan molekülün nicel ve/veya nitel analizi
yapılabilir. Örn. miktar tayini, alt tiplerinin
saptanması, yapısal analiz, aktivite belirlenmesi vb.
• Bir makromolekülün homojenattan ayrılması, saflaştırılması ve
analizi için kullanılan yöntemlerin başlıcaları aşağıda
açıklanmaktadır.
• Çalışmanın biyolojik materyalin çeşidi ve eldeki olanaklara
bağlı olarak bu yöntemlerin uygulanma sıraları değişebilir ve
aynı zamanda birden çok yöntemden yararlanılabilir.
• Burada açıklanan yöntemler, uygulamadaki kullanım
sıralarından çok dayandıkları temele göre basitten karmaşığa
doğru açıklanmıştır.
25
1. Süzme (Filtrasyon)
• Homojenatin filtre edici bir materyalden geçirilerek,
süspansiyonda bulunan partiküllerin sıvı kısımdan
ayrılmasıdır.
• Bu yolla, kullanılan filtre edici materyalin gözeneklerinin
çapına göre, filtreden geçen kısımda belli büyüklükte partikül
bulunabileceği gibi bunların tamamı da filtrenin üzerinde
kalabilir.
26
• En çok kullanılan filtre edici materyaller filtre
kağıdı, sinterli cam huni, membran (zar)
filtrelerdir.
• Kullanılan sisteme vakum veya basınç
uygulanarak süzme işlemi hızlandırılabilir.
27
28
Membran filtreler çok küçük gözenekleri olan polimer yapıdaki
Filtre kağıtları Süzme işleminde kullanılan filtre
filtrelerdir.
kağıtları çok çeşitlidir. Homojen por çapına sahip
olmayan kaba filtre kağıtlarından, çok duyarlı ayırım
yapabilen çeşitli boyutlardaki tiplerine kadar farklı
seçeneklerden amaca uygun olanı belirlenebilir.
• Biyolojik olarak inert ve çoğunlukla saf selüloz esterlerinden yapılırlar
• Por çapları 0.25-150 nm arasında değişen membran filtreler
bulunmaktadır.
• Bu filtreler en uygun akışkanlık değerine, ilgilenilen molekülün özelliğine
ve ağırlığına göre seçilebilir.
29
30
5
3/6/2016
Ultrafiltrasyon: Membran filtrelerle yapılan bir filtrasyon
Membran filtrelerin en genel kullanım amaçları:
uygulamasıdır.
 Mikrometre boyutundaki partikülleri ortadan kaldırarak
çözeltilerin bulanıklığını yok etmek
• Moleküllerin boyut, biçim veya yüklerine göre ayrılmaları
sağlanır.
 otoklavlanamayan çözeltilerin sterilizasyonunu sağlamak
• Ayırımı yapılacak olan molekülleri içeren solüsyon dışarıdan
oluşturulan bir kuvvetle yarı geçirgen bir zarda gecmeye
zorlanır.
 çok az miktardaki örnekleri toplamak ve biyomolekülleri
içeren çözeltileri konsantre etmek
 Tamponlardaki ve diğer çözeltilerdeki tuz vb küçük molekülleri
yok etmektir.
• Filtrelerden sıvının geçişini sağlamak için vakum, basınç yada
santrifüj kuvveti gerekir.
31
32
• Ultrafiltrasyonda kullanılan zarların por çapı genelde
1-20 nm arasında değişir
• Kullanılacak zarın por çapı çalışılan molekülün
geçmesine izin vermeyecek şekilde olmalıdır.
NMWC (Nominal Molecular Weight Cut-Off)
• Zarlara özgü bir değerdir. Zardan geçemeyen bir
molekülün ağırlığına eşdeğerdir.
• Ultrafiltrasyonda kullanılan membran filtrelerin
NMWC değerleri genelde 100-1.000.000 arasındadır.
33
34
• Ekstraksiyon ve çeşitli saflaştırma aşamalarında elde
• Bu filtrelerin genellikle iki tabakalı olanları
kullanılır; birinci tabaka yüzeyde bulunan, ince
(0.1-0.5 ɥm) selüloz asetat, naylon veya
polivinilidinden yapılmış bir zar, ikinci tabaka
daha kalın, inert bir destek tabanıdır. Bu tip
filtreler partiküllerin yüzeyde kalmasını sağlar.
edilen nükleik asit ve protein çözeltileri daha sonraki
aşamalar için genellikle fazla seyreltiktir.
• Çözücünün yüksek sıcaklıkta uçurulması yoluyla
konsantre edilemedikleri için, bu tip çözeltilerin
hacimlerini azaltmakta daha nazik ve çok etkili bir
yöntem olarak genellikle ultrafiltrasyondan veya
liyofilizasyondan yararlanılır.
35
36
6
3/6/2016
2. Diyaliz
• Biyolojik moleküllerin
yöntemlerden biridir.
ayırımında
kullanılan
en
eski
• Bu yöntem seyreltik bir çözeltideki moleküllerin boyutlarına
göre ayrılması temeline dayanır.
• Bu yöntemin en genel uygulaması değişik büyüklükteki
molekülleri içeren çözeltinin, makromolekülleri geçirmeyen
fakat su vb küçük moleküllerin geçişine izin veren, yarı
geçirgen bir zardan yapılmış bir diyaliz tüpüne konulup düşük
iyonik kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya) daldırılması
şeklinde gerçekleştirilir.
37
• Zarların porları genellikle molekül ağırlığı 10.000’den fazla olan
makromoleküllerin geçişine izin vermeyecek kadar küçüktür.
• Böylece, diyaliz tüpünün içindeki su (ve küçük iyonlar) dışarı
çıkarken içeride ayırımı istenen molekülün konsantre bir
çözeltisi kalır.
38
• Dengeye ulaşıldıktan sonra, eğer dışarıdaki solüsyon taze
tamponla değiştirilecek olursa, diyalizin devam etmesiyle
tüpün içindeki küçük moleküllerin konsantrasyonundaki
azalma devam eder.
• Böylece istenilen ayırım tamamlanıncaya kadar diyaliz 1-2 gün
sürdürülebilir.
• Küçük moleküllerin çıkışı tüpün içi ile dıştaki tamponun
konsantrasyonları eşitleninceye kadar devam eder.
• Diyaliz için kullanılan yarı geçirgen zarlar (diyaliz tüpleri)
kollodyon, selofan, selüloz gibi çeşitli materyallerden yapılmış,
1-20 nm por çapına sahip malzemelerdir.
• Dengeye çalışılan hacme bağlı olarak, genellikle 4-6 saatte
ulaşılır.
• Por çapı zardan geçecek moleküllerin büyüklüğünü belirler.
NMWC değeri 10.000-20.000 arasında olan tipleri yaygın
olarak kullanılır.
39
• Por büyüklüğünün her tarafta eşit olmasını
sağlamak ve ağır metallerden ileri gelen
kontaminasyonu yok etmek için tüplerin bir ön
işlemden geçirilerek hazırlanması gerekir.
• Ancak böyle bir hazırlığı gerektirmeyen, sadece
tampon ile ıslatılarak kullanılan tipleri de
vardır.
41
40
• Diyaliz, iyonik olan ve olmayan, tüm küçük
molekülleri yok etmek veya çözeltileri
konsantre etmek için basit, ucuz ve etkin bir
yöntemdir.
• Genellikle çözeltideki tuzları ve diğer küçük
molekülleri
ortamdan
uzaklaştırmakta
kullanılır.
42
7
3/6/2016
3. Liyofilizasyon
Vakum altında santrifüjleme
• Donmuş durumdaki bir çözücünün vakum altında
doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını)
sağlayan süblimasyon temeline dayalı bir dondurma
tekniğidir.
• Bu yöntem bir çok biyolojik örneğin kurutulmasında
kullanılabilir.
• Örnek önce bir organik çözücüde veya suda çözündürülür.
• Genellikle yüksek ısıya duyarlı materyallerin
kurutulması ya da konsantre edilmesi için en etkin
yöntemlerden biridir.
• Bu yöntemin avantajlarından biri de biyolojik
materyallerin saklanma ve taşınmasında sağladığı
kolaylıktır.
• Çözücü santrifüjde vakum altında uçurulur ve böylece örneğin
tüpün dibinde çökelti halinde kalması sağlanır.
• Bu yöntem hızlı olması, ön dondurma işlemine gerek
olmaması, örneğin tamamının kazanılması ve sudan başka
çözücülerin de kullanılabilmesi bakımında liyofilizasyondan
daha avantajlıdır
43
44
4. Çöktürme
• Bu yolla ayırma, su veya başka çözücü içeren bir
ortamda istenilen ya da istenmeyen moleküllerin
çöktürülerek katı halde ayrılması temeline dayanır.
• Amonyum ve sodyum sülfat proteinleri çöktürmekte
kullanılan organik tuzlardır.
• Nükleik asitler için ise izopropanol ve etanol kullanılır.
45
5. Enzim uygulaması
46
6. Santrifüjleme
Bu yöntem santrifüj adı verilen aletler yardımıyla, yüksek hızda
döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin
davranış temeline dayanır.
• Ayırma işleminde enzim kullanımıyla, örneğin
proteinlerin proteazlarla, nükleik asitlerin de
nükleazlarla parçalanarak ortamdan
uzaklaştırılması mümkündür.
Makromolekül halindeki bir partikül veya bir hücre organeli yüksek hızda
döndürüldüğünde bir santrifüj kuvvetinin etkisinde kalır.
Santrifüj kuvveti (F) şu şekilde ifade edilir:
F= mω2r
F=santrifüj kuvveti
m= çökelen partikülün kütlesi
ω= dönümün açısal hızı (radyan/sn)
r= göç eden partiküllerin merkezdeki dönüm eksenine olan uzaklığı (cm)
47
48
8
3/6/2016
• Çökelen bir partikül üzerindeki kuvvet, dönüm
hızı ve partikülün dönüm eksenine uzaklığı ile
artar. F değerinin, yerçekimi kuvvetiyle (g) ilgili
olarak RCF (göreceli yer çekimi kuvveti)
kullanılır.
• Genellikle ortalama RCF’nin hesaplanmasında,
santrifüj tüpünün tepesi ile dibi arasındaki
uzaklığın ortasındaki değer (rort) kullanılır.
• RCF, sayısal bağıntı çizelgesinden yararlanılarak
hesaplanabilir.
• RCF= 1.119 x rpm x r
• RCF , örneğin dakikadaki dönüm sayısı (rpm)
ve çökelen partikülün dönüm eksenine uzaklığı
ile değişir.
• RCF değeri x g şeklinde gösterilir (örn: 12.000 x
g)
49
50
• Santrifüjleme biyolojik materyalin hazırlanmasında,
moleküllerin izolasyonu ve saflaştırılmasında
kullanılan preparatif bir yöntemdir.
• Bunun yanında saflaştırılmış molekülerin biçim,
boyut, yoğunluk gibi özelliklerinin ölçülmesinde de
kullanılır.
51
• Santrifüjler, dönüm sağlayan bir
motor ile tüplerin konulduğu bir
rotordan oluşur.
52
Düşük hızlı santrifüjler
• Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde
kullanılır.
• Düşük devirliden çok karmaşık
donanıma sahip ve analitik
işlemler yapabilenlere doğru
geniş yelpazede çok çeşitli
santrifüjler geliştirilmiştir.
• En yüksek hızları 4.000-5.000 dev/dak dır.
• Genellikle oda sıcaklığında çalışırlar sıcaklık
kontrolleri yoktur.
53
54
9
3/6/2016
Yüksek hızlı santrifüjler
• Daha duyarlı uygulamalar için, yüksek devirli ve ısı kontrollü santrifüjler
gereklidir.
• Sıcaklığı (4 C civarında) ve hızın kontrol altında tutulması, özellikle yüksek
sıcaklığa duyarlı biyolojik materyalin santrifüjlenmesi sırasında önemlidir.
• Yüksek hızda santrifüjlerde başlıca 3 tip rotor kullanılır
 Sabit açılı
 Açilan kova
 Dikey rotorlar
55
• Biyolojik örneklerin hazırlanmasında orta ya
da yüksek hızlı santrifüjlerin kullanımı
gereklidir.
• Günümüzde rotorlar daha çok karbon-fiber
karışımı malzemelerden imal edilmektedir.
• Bunlar hafif olduklarından hızlanma ve durma
süreleri kısadır.
• Bu santrifüjler içinde en çok kullanılanları orta
hızda dönüm yapan mikrosantrifüjlerdir
• Maksimum hızları genellikle 12.000-15.000
rpm dir (11.000-12.000 xg)
56
57
• Bu santrifüjlerle, parçalama sürecinden sonra
hücresel atıklar yok edilebildiği gibi hücre
organelleri (nukleus, mitokondri,kloroplast
gibi) ve kimyasal uygulamalar sonrasında
makromoleküller (nükleik asitler, proteinler
vb) çöktürülebilir.
58
Ultrasantrifüjler
• En karmaşık yapılı olan santrifüjlerdir.
• Ultrasantrifüjlerle çok yüksek devirlere (100.000-150.000 rpm)
ulaşılabilmesi nedeniyle rotorda yüksek derecede ısı artışı
oluşacağından çalışma sırasında cihazın içinin soğutulması ve
sürtünmenin engellenmesi için yüksek vakumda tutulması
gerekir.
• Metal rotorların yüksek basınç etkisiyle nadir de olsa
parçalanma tehlikesi olduğundan aletin içi çelik tabaka ile
kaplidir.
59
60
10
3/6/2016
Santrifüjleme uygulamaları
Ultrasantrifüjler;
Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi
• hücre bileşenlerinin ayrılmasında (organel
veya moleküllerin)
• saflaştırılmış moleküllerin analitik ölçümlerinin
yapılmasında kullanılır. Örn. saflık derecesi,
molekül ağırlığı, yoğunluğu, biçimi,
bileşenlerin özellikleri ve oranlarının
belirlenmesi gibi.
• Üzerinde çalışılan örneğin ilk aşamada belli bir süre uygun
hızda döndürülmesiyle elde edilen iki ayrı fazda (çökelti ve üst
sıvı) preparatif amaçlı olarak daha ileri düzeyde ayırım yapmak
üzere hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi kullanılır.
• Bu santrifüjlemede, kaba çökeltilerden hücre organellerine ve
makromoleküllere kadar farklı boyuttaki partiküller
birbirinden ayrılır.
61
• Bu temele dayalı olarak hücre bileşenlerinin daha özgül biçimde
ayrılmasını sağlamak üzere farklılığa bağlı (differential) santrifüjleme
geliştirilmiştir.
• Bu yöntemde giderek artan hızlarda ardışık santrifüjleme uygulanır.
• Santrifüjlemenin başında, tüm partiküller homojen şekilde dağılmıştır.
• İşlem devam ederken partiküller sedimantasyon derecelerine göre
çökerler
62
• Diferansiyel santrifüjleme kullanılarak partiküllerin çökelme
hızını ifade eden çökelme katsayıları (s) hesaplanabilir.
• Birimi saniye olan s terimi genellikle standart koşullarda, 20 C
de ortam olarak su kullanılarak yapılır.
• S değeri, biyolojik makromolekülleri ve hücre organellerini
sınıflandırmada kullanılan bir özelliktir. Bir molekülün ya da
organelin boyutunu (molekül ağırlığı, baz çifti vb)
hesaplamakta kullanılır.
63
• Çökelme katsayıları 1x10-13 -10.000x10-13
arasında değişir.
• Sayısal açıdan kolaylık sağlamak için çökelme
katsayıları Svedberg birimi (S) ile ifade edilir.
• 1S= 1x10-13 saniyedir.
64
Yoğunluk derecelenmesi santrifüjleme (density
gradient)
• Örnek yoğunluğu tüpün tepesinden dibine
doğru giderek artan akışkan bir ortamda
santrifüjlenir.
• Differansiyel santrifüjlemeden farklı olarak, bu
yöntemde değişik boyutttaki partikullerin tek
bir santrifüjleme ile ayrılması mümkün olur.
65
66
11
3/6/2016
• Yoğunluk derecelenmesinde başlıca 2 yöntem kullanılır:
1. Hız-bölgesel (rate-zonal) santrifüjleme
• Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin ayrılması ve
saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır.
• Bu yöntemle s ölçümü de yapılabilir.
İşlemden önce, otomatik derecelenme karıştırıcısı yardımıyla,
sakkaroz veya gliserol gibi küçük molekül ağırlıklı solusyonlarla
bir yoğunluk dercelenmesi hazırlanır.
• Özellikle nükleik asitler bu yöntemlerin kullanımıyla ayrıntılı
şekilde araştırılabilmektedir.
Örnek derecelenme tabakasının tepesine yayılır ve tüpler açılan
kova tipindeki rotora yerleştirilir.
• DNA ve RNA s değerlerine göre sınıflandırılabilir ve DNA’nın
farklı yapısal biçimleri ayırt edilebilir.
İşlem sırasında partiküller s değerleriyle bağlantılı bir hızda
hareket ederler.
• Bu yöntem ayrıca, ribozom, mitokondri, kloroplast gibi hücre
bileşenlerinin izolasyonu ve saflaştırılmasında da
kullanılmaktadır.
67
68
69
70
Partiküller bölgeler (zonlar)
halinde çökerler ve
birbirlerinden ayrılmış olarak
kalırlar.
İşlem partiküller tüpün dibine
ulaşmadan sona erdirilir.
Tüpteki değişik bölgeler ayrı ayrı
toplanır.
2. Eşit yoğunluk (Isopycnic) santrifüjlemesi
(denge yoğunluk derecelenmesi-equilibrium-density gradient)
• Santrifüj kuvvetinin etkisi altında,
sezyum tuzu tepeden dibe doğru
devamlı artan bir yoğunluk
derecelenmesi oluşturur.
Bu yöntemde yoğunluk derecelenmesi işlem sırasında oluşur.
Ayırımı yapılacak olan molekülü içeren karışım, Sezyum klorür
veya sezyum sülfat gibi ağır metal tuzu çözeltisi içinde
çözündürülür .
• Örnekteki moleküller kendi
yoğunluklarına eşdeğer olan
yoğunluk bölgelerinde kalırlar.
Ultrasantrifüj tüpüne doldurulur ve santrifüjlenir.
• Böylece tüpte bileşenlere ait farklı
bölgeler oluşur ve moleküller
buradan izole edilip analiz
edilebilirler
71
72
12
3/6/2016
73
13