Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler

advertisement
Moleküler Biyolojide Kullanılan
Yöntemler
I.
Genel Bakış
• Canlı organizmalar yaşamları boyunca kendini idare edebilen ve
kendini çoğaltabilen kimyasal sistemlerdir. Viroidler, virüsler gibi
bazı ayrıcalıklı gruplar dışında tüm canlılar kimyasal maddelerin
yoğun solüsyonlarıyla dolu ve küçük birimler olan hücrelerden
oluşur. Buna göre, canlılık olayları hücreler içerisindeki biyolojik
moleküllerin yapı ve işlevlerine bağlı olarak ortaya çıkar.
• Bir hücrenin ağırlığının yaklaşık %99’u sadece dört çeşit element
(C,H,N ve O) ile sınırlıdır.
• Hücreyi oluşturan temel organik moleküller başlıca iki grupta
toplanabilir: küçük moleküller hücrenin temel kimyasal yapı
taşlarının sentezinde ve enerji elde edilmesinde kullanılırlar;
küçük moleküllerin kovalent bağlarla bağlandığı polimerleri olan
büyük moleküller ise biyolojik süreçlerin özgüllüğünden ve
biyolojik bilginin transferinden sorumludurlar.
• Küçük organik moleküllerin ağırlıkları 100-1000
arasında değişir ve 30 ya da daha fazla sayıda C
atomu içerirler. Bunlar genellikle solüsyon içerisinde
serbest durumda bulunurlar ve bunların bir kısmı
daha sonra makromoleküllerin meydana geleceği bir
ürün havuzu oluştururlar.
• Küçük
moleküller
aynı
zamanda,
besin
kaynaklarından türev edilen enerjiyi hücre
tarafından kullanılabilecek biçime dönüştüren
kimyasal reaksiyonların da temel aracılarıdır.
• Küçük moleküllerin miktarı hücredeki toplam organik
maddenin yaklaşık onda birini oluşturur ve aşağı yukarı
bin kadar farklı çeşidi bulunur. Küçük moleküllerden
sentezlenen
tüm
biyolojik
makro
moleküller
yıkıldıklarında aynı basit moleküllere dönüşürler.
• Hücrelerde küçük moleküllere ait başlıca dört temel aile
vardır; basit şekerler, yağ asitleri, aminoasitler ve
nükleotidler. Bu ailenin hepsi ortak kimyasal özellikleri
olan çok farklı üyeleri içerirler.
• Makromolekül; küçük molekül ağırlıklı alt birimlerin
birbirine eklenmesi ile meydana gelen uzun ve zincir
biçimde polimerdir.
• Doğada milyonlarca farklı canlı türü bulunur. Bununla
beraber canlılar hücre ve molekül düzeyinde
araştırıldığında organizasyonda tek bir kalıp planı
bulunduğu ortaya çıkar. Buna göre moleküler biyolojinin
temel amacı; canlı formlarında hücre yapısını oluşturan
moleküllerin yapısal ve işlevsel analizini yapmaktır.
• Tüm organizmalarda hücreleri oluşturan temel
moleküllerin yapı, çeşit ve oranları yaklaşık olarak aynıdır.
Genelde her tür için aynı olan, C temelli küçük
moleküllerin belirleyici ve sınırlayıcı bir serisinden
oluşurlar.
Hepsinde
gerçekleştirilen
biyokimyasal
mekanizmalar aynıdır ve aynı genetik şifreyi paylaşırlar.
• Moleküler biyolojideki hızlı gelişmeler, büyük ölçüde
moleküllerin araştırılmasına olanak veren yeni yöntemlerin
geliştirilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu yöntemler, temelde
biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerin hücre ve dokulara
uygulanmalarının sonucudur. Ayrıca son 25-30 yılın olağanüstü
teknolojisi olan genetik mühendisliği (rekombinant DNA
teknolojisi) nükleik asit ve protein moleküllerinin hücrelerden
bol miktarda elde edilmelerine olanak vermesi nedeniyle bu
moleküllerle yapılacak çalışmalara büyük kolaylıklar sağlamış ve
moleküler biyolojideki bilgi birikiminin hız kazanmasına büyük
ölçüde yardımcı olmuştur. Zaten moleküler biyolojide önceleri
birbirinden ayrı olarak düşünülen biyokimya, hücre biyolojisi ve
genetik gibi bilim dallarındaki gelişmeler ve bunların birbirine
karışması sonucu ortaya çıkmıştır.
• Moleküler biyolojideki araştırmalar büyük ölçüde
saflaştırılmış moleküller ile yapılan analitik çalışmalara
dayanmaktadır.
• Çalışılacak biyolojik molekül grubunun yalıtımı (izolasyonu)
amacıyla
gerçekleştirilen
işlemlere
özütleme
(ekstraksiyon) adı verilir.
• Özütleme; parçalama, ayırma ve saflaştırma
aşamalardan oluşur. Daha sonra tam ya da
saflaştırılmış (nükleik asitler, proteinler gibi)
moleküllerin yapısal ve işlevsel analizlerine
yöntemler uygulanır.
ardışık
kısmen
makro
yönelik
1.1. Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri
• Bu aşamada, çalışılacak molekül grubunu (nükleik
asit ya da protein) içeren doku ve ya hücrelerin
çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilir. Elde
edilen karışıma homojenat adı verilir.
• Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta,
serbest ya da organeller içerisindeki hücre
bileşenleri (membran parçaları ve bir miktarda
parçalanmamış hücrelerle birlikte) parçalamanın
yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon
halinde bulunurlar.
1.1. Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri
• Hücreleri parçalayarak fraksiyonlarına ayırma yöntemleri
temelde hücre sınırlarının çeşitli fiziksel ya da kimyasal
tekniklerle yok edilmesini kapsar. Hücre elemanlarının
işlevlerini kaybetmeden parçalama sağlayan çeşitli
teknikler geliştirilmiştir. Bir dokudaki farklı hücre tiplerini
birbirinden ayırmak mümkün olduğu gibi, hücrelerde
işlevleri bozulmadan organellerine ve makromoleküllerine
ayrılabilir.
Eğer dikkatli bir uygulama yapılırsa nukleus, mitokondri,
kloroplast
gibi organeller oldukça sağlam durumda
kalabilirler.
1.1.1. Fiziksel Yöntemler
Mekanik İşlemler
• Bu tip tekniklerin en basit ve ilkel şekli materyali
bir havan içinde kumla öğütmektir. Ezerek
parçalama daha gelişmiş şekilde, doku ve ya
hücrelerin sıvı azotta (-196°C) ya da (-20) - (-70)
ºC’da dondurulduktan sonra soğuk havanlarda
yapılır. Donma sonucu kristal hale geçen yapılar
toz
haline
gelene
kadar
kolaylıkla
parçalanabilmektedir. İşlemin çözünme olmadan
kısa sürede bitirilmesi gerekmektedir. Ezme
sırasında alümina (Parlatmalarda, aşındırıcı olarak
kullanılan alüminyum oksit.), kum ya da cam tozu
katılacak olursa parçalama etkinliği artar.
Mekanik İşlemler
• Günümüzde mekanik olarak parçalamada daha çok
homojenizatör adı verilen aletler kullanılmaktadır. Çeşitli
tipte homojenizatörler geliştirilmiştir.
• Karıştırıcı tipinde olanlar (waring blender) evlerde
kullanılanların daha güçlü olanlarıdır.
(“waring blender”)
Mekanik İşlemler
• Metal ya da camdan yapılmış özel bir kap içinde
bulunan, yüksek hızda dönen bıçaklar yardımıyla
biyolojik materyaller kesilerek parçalanır. Bu tip
aletler daha çok hayvan ve bitki doku veya
organlarının parçalanması için kullanılmakta olup
bakteri gibi küçük boyuttaki organizmalar için
uygun değildir.
• Milli homojenizatörler (“ultra turrax”) ucunda özel
dişleri bulunan metal bir milin çok yüksek devirde
dönmesiyle parçalama yapar.
(“ultra turrax”)
• Pistonlu homojenizatörler ise, basınç etkisiyle
parçalama yapan ve ucunda genellikle teflondan
yapılmış bir pistonu bulunan aletlerdir. Özellikle
yumuşak dokuların parçalanmasında çok etkindir.
(Pistonlu homojenizatör)
• Basınç yardımıyla parçalama yapan diğer bir
homojenizatör; Fransız basınç hücresidir. Çelik bir kap,
piston ve silindir üzerindeki basıncın giderilmesi için
kullanılan bir vanadan oluşur.
(“French Press”)
• Balistik homojenizatörlerde dayanıklı cam veya metal
bir kap içine konulan hücre süspansiyonu çalkalanır. Bu
yöntem özellikle diğer parçalama yöntemlerine dirençli
mikroorganizmaların (örneğin kok biçimindeki bakteriler,
mayalar gibi) parçalanmasında kullanılır.
(Balistik homojenizatör)
Ultrasonikasyon
• İnsanın duyma sınırının üzerindeki frekanslarda
(18kHz üstü) ses dalgaları (ultrases, ultrason) sıvı bir
ortamdaki hücrelere uygulandığında parçalanmaya
yol açar. Bu uygulama süspansiyondaki su
moleküllerinin kinetik enerjilerini arttırır; basınç
farkları çok fazla sayıda mikro hava kabarcığının
oluşumuna yol açar. Bu kabarcıklar hızla hareket edip
ve bir süre sonra patlayarak yoğun şok dalgaları
yaratırlar. Patlama sırasında ses enerjisinin mekanik
parçalama enerjisine dönüşümüyle ortamdaki
hücreler (özellikle bakteri hücreleri) parçalanır.
Ozmatik Şok
• Hücrelerin yüksek ozmatik basınçlı bir çözeltiden
hipotonik bir ortama geçirilmesi durumunda,
suyun hücrelerin içine girmesi zarlarda patlamaya
yol açar. Bu yöntem hücre duvarı bulunmayan ya
da yok edilmiş hücreler için uygundur.
Dondurma-çözme
• Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde
(örneğin, -20°C) tutulup sonra yeniden
ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin birkaç
kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar.
İşlemin temelli, donan su moleküllerinin
hacminin genişlemesi ve hücrelerde oluşan
buz kristallerinin hücre zarına zarar vererek
parçalanmayı sağlamasıdır.
1.1.2 Kimyasal Yöntemler
Çözücülerin Kullanılması
• Bu uygulamaların prensibi: hücre zarındaki
bileşiklerin çözündüğü uygun çözücü (solvent)
yardımıyla zar yapısının eritilmesidir.
Bu amaçla kullanılan;
• Organik çözücüler (örn, etil asetat, toluen vb)
zardaki lipitler çözerek yapıyı bozarlar.
• Deterjanlar (sodyum dodesil sülfat) ise uygun pH
koşullarında zardaki protein ve lipoproteinlerle
etkileşime girerek onları uzaklaştırır.
• Bazik çözeltiler (pH 11-12,5) ise hücre duvarının
hidrolizini sağlar.
Enzimlerin Kullanılması
• Lizozim: bakterilerin peptidoglikan tabakasındaki β-1,4-glikozidik
bağları hidroliz etmektedir. Bu enzim, özellikle Gram (+) bakteriler
üzerine etkilidir.
• Gram(-) bakterilerin parçalanması için hücrelerin bir süre EDTA
uygulamasında tutulması gerekir. EDTA, lipopolisakkarit
moleküllerini birbirine bağlayan Ca+² iyonlarının ortamdan
çekilmesini sağlamakta ve böylece lizozim içteki peptidoglikan
tabakasına ulaşmasını kolaylaştırmaktadır.
• Ayrıca, tripsin, proteinaz K, gibi proteazlar ve zimoliyaz da (maya
hücreleri için) bu amaçla kullanılan enzimlerdir.
• Enzimatik parçalama genelde mekanik parçalamaya dayanıklı
yapılar için uygulanmaktadır.
Kullanılacak parçalama yöntemi;
- Amaçlanan çalışmaya,
- Kullanılan biyolojik materyalin tipine(organizma, doku
veya hücre tipine)
- İzole edilecek molekül grubuna,
- Eldeki olanak ve kabul edilebilir etkinliğe bağlıdır.
Böylece ya tek bir yöntem yada fiziksel ve kimyasal
işlemlerden karma olarak yararlanılabilir.
Ayırma (Seperasyon),
Saflaştırma (Pürifikasyon)
Ve Analiz Yöntemleri
Parçalamadan Sonra Uygulanacak Yöntemler;
• Ayırma (Seperasyon): Çalışılacak molekül grubunun
homojenattaki diğer moleküllerden ayırma
• Saflaştırma (Pürifikasyon): Homojenattan çalışılacak
molekülün saf olarak elde edilmesi
• Ham Özüt (Crude Extract): Homojenattaki zar
parçalarını, parçalanmamış doku veya hücreleri
uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ön ayırma
işleminden sonra elde edilen ve çalışılacak molekülle
birlikte birçok molekülüde içeren karışımdır.
Ayırma, Saflaştırma ve Analiz Yöntemleri
• Ham özüt ya direkt olarak kullanılabilir yada
çalışılacak molekül, hedeflenen saflık derecesine
göre uygulanılan yöntemlerle ham özütteki diğer
moleküllerden ayrılır.
• Bu yöntemler, karışımdaki;
- molekül gruplarının çözünme özellikleri yada
- kitle, yoğunluk, elektriksel yük gibi fiziksel
karakterlerine veya da
- diğer moleküllere afinitesine göre birbirlerinden
ayrılmasını sağlayan işlemlerdir. Bu tekniklere
HAZIRLAYICI (PREPARATİVE) TEKNİKLER de denir.
Ayırma, Saflaştırma ve Analiz Yöntemleri
• Ayırma, saflaştırma işlemlerinden sonra üzerinde
çalışılan molekülün kalitatif veya kantitatif analizi
(örn miktar tayini, alt tiplerinin saptanması,
yapısal analiz, aktivite belirlenmesi gibi)
yapılabilir. Bu amaçla kullanılan tekniklere de
ANALİTİK TEKNİKLER denilir.
• Bir makromolekülün homojenattan ayrılması,
saflaştırılması ve analizi için kullanılan teknikler
basitten karmaşığa doğru sıralanabilir.
1. Süzme (Filtrasyon)
• Homojenatın filtre edici bir materyalden
geçirilerek,
süspansiyonda
bulunan
partiküllerin sıvı kısımdan ayrılmasıdır.
• Bu yolla, kullanılan filtre edici materyalin
gözeneklerinin çapına göre, filtreden geçen
kısımda
belli
büyüklükte
partikül
bulunabileceği gibi bunların tamamı da
filtrenin üzerinde kalabilir.
1. Süzme (Filtrasyon)
En çok kullanılan filtre edici materyaller filtre kağıdı,
sinterli cam huni ve zar (membran) filtrelerdir. Kullanılan
sisteme vakum veya basınç uygulanarak süzme işlemi
hızlandırılabilir.
Filtre kağıtları
• Süzme işleminde geniş çapta kullanılır.
Homojen por çapına sahip olmayan kaba filtre
kağıtlarından, çok duyarlı ayırım yapan çeşitli
boyutlara kadar farklı amaca uygun tipleri
vardır.
Membran Filtreler
• Çok küçük gözenekleri olan polimer yapıdaki
filtrelerdir.
• Biyolojik olarak eylemsiz(inert) ve çoğunlukla saf
selüloz esterlerinden yapılırlar.
• Por çapları 0.25-150 nm arasında değişebilir.
• Akışkanlık değerine, ilgilenilen molekülün özelliğine
ve ağırlığına göre seçim yapılabilir.
Membran Filtrelerin Kullanım Amaçları;
• Mikrometre boyutundaki partikülleri ortadan kaldırarak
solüsyonların bulanıklığını yok etmek
• Otoklavlanamayan solüsyonların sterilizasyonunu sağlamak
• Çok az miktardaki örnekleri (özellikle radyoaktif çökeltileri)
toplamak
• Biyomolekülleri (pr,na) içeren solüsyonları konsantre etmek
• Tamponlardaki ve diğer solüsyonlardaki tuz vb küçük
molekülleri yok etmektir.
Ultrafiltrasyon
• Membran filtrelerle yapılır ve moleküllerin boyut, biçim
ve/veya yüklerine göre ayrılmaları sağlanır.
• Ayırımı yapılacak molekülleri içeren solüsyon dışarıdan
oluşturulan kuvvetle yarı geçirgen zardan geçmeye
zorlanır.
• Filtrelerden sıvının geçişini sağlamak için emme, basınç ya
da santrifüj kuvveti gerekir.
• Kullanılan porların çapları
1-20 nm arasında değişir. Zarın
por çapı çalışılacak molekülün
geçişine izin vermeyecek boyutta
seçilmelidir.
• NMWC (Nominal Molecular Weight Cut-Off);
Zarlara özgü bir değerdir. NMWC değeri zardan geçemeyen bir
molekülün ağırlığına eşdeğerdir. Ultrafiltrasyonda kullanılan
NMWC değeri genelde 100-1.000.000 arasında değişir.
Bu filtrelerin genellikle iki tabakalı olanları kullanılır; birinci
tabaka yüzeyde bulunan ince (0.1-0.5µm), selüloz asetat, naylon
veya polivinilidinden yapılmış bir zar, ikinci tabaka daha kalın,
inert bir destek tabanıdır. Bu tip filtreler partiküllerin yüzeyde
kalmasını sağlar.
• Kısaca çalışma prensibi, filtre
tarafından
partikül
veya
moleküllerin fiziksel yakalanması
sonucu ayrılmalarına dayanır.
Ultrafiltrasyon
• Özütleme ve çeşitli saflaştırma aşamalarında elde
edilen nükleik asit ve protein solüsyonları daha sonraki
aşamalar için genellikle fazla seyreltiktir.
• Çözücünün yüksek sıcaklıkta uçurulması yoluyla
konsantre edilemedikleri için, bu tip çözeltilerin
hacimlerini azaltmakta genellikle ultrafiltrasyondan
veya liyofilizasyondan yararlanılır.
• Her iki yöntemde nazik ve oldukça etkili yöntemlerdir.
2. Diyaliz
• Biyolojik moleküllerin ayırımında kullanılan en
eski yöntemlerinden biridir.
• Bu teknik seyreltik bir çözeltideki moleküllerin
boyutlarına göre ayrılması temeline dayanır.
• Tekniğin uygulaması değişik büyüklüklerdeki
molekülleri içeren çözeltinin, makromolekülleri
geçirmeyen fakat su vb. küçük moleküllerin
geçişine izin veren, yarı geçirgen bir zardan
yapılmış diyaliz tüpüne konulup düşük iyonik
kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya)
daldırılması şeklinde gerçekleştirilir.
• Zarların porları genellikle molekül ağırlığı
10.000’den fazla olan makromoleküllerin geçişine
izin vermeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle,
diyaliz tüpünün içindeki su(ve küçük iyonlar) dışarı
çıkarken içeride ayırımı istenen molekülün
konsantre bir çözeltisi kalır. Küçük moleküllerin
çıkışı tüpün
içi
ile dıştaki
tamponun
konsantrasyonları eşit oluncaya kadar devam eder.
Dengeye, çalışılan hacme bağlı olmak kaydıyla
genellikle 4-6h’de ulaşılır. Dengeye ulaşıldıktan
sonra, eğer dışarıdaki solüsyon taze tamponla
yenilenince diyalizin devam etmesiyle tüpün
içindeki küçük moleküllerin konsantrasyonundaki
azalma devam eder. Böylece istenilen ayırım
yapılıncaya kadar diyaliz 1-2 gün sürdürülebilir.
• Diyaliz için kullanılan yarı geçirgen zarlar (diyaliz tüpleri)
çeşitli materyallerden(kollodyon, sellofon, selüloz gibi)
yapılmış, 1-20 nm por çapına sahip malzemelerdir. Por
çapı zardan geçecek moleküllerin büyüklüğünü belirler.
NMWC değeri 15.000-20.000 arasında olan tipleri geniş
çapta kullanılmaktadır.
• Diyaliz, iyonik olan ve olmayan, tüm küçük molekülleri
yok etmek ve çözeltileri konsantre etmek için basit, ucuz
ve etkin bir yöntemdir. Genellikle solüsyonlardaki tuzları
ve küçük molekülleri ortamdan uzaklaştırmakta
kullanılır. Ayrıca biyolojik moleküllere zayıf şekilde bağlı
küçük iyonlar ve molekülleri (NAD, FAD gibi kofaktörler
veya metal iyonları) de bu yöntemle ortadan kaldırmak
mümkündür.
3. Liyofilizasyon (Dondurarak Kurutma)
Liyofilizasyon, donmuş durumdaki bir çözücünün vakum altında
doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan
süblimasyon temeline dayalı bir dondurma tekniğidir. Genellikle,
yüksek ısıya duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre
edilmesi için en etkin yöntemlerden biridir.
Biyolojik materyallerin saklanma ve
taşınmasında sağladığı kolaylıktan
dolayı
oldukça
yaygın
olarak
kullanılmaktadır.
Liyofilizasyon Uygulaması
• Dondurma işlemi için, örnekle yarıya kadar
doldurulmuş kap kuru buz-aseton banyosuna
yerleştirilerek 45 açı yapacak pozisyonda tutularak
yavaşça döndürülür.
• Sulu çözelti kabın çeperinde tabakalar halinde donar;
buda suyun buharlaşması için geniş bir yüzey sağlar.
Kap daha sonra soğutma ünitesi ve bir vakum
pompasından oluşan liyofilizatöre bağlanır.
• Biyolojik materyalin stabilitesini korumak amacıyla, 40ºC civarında tutulan örneğe yaklaşık 5-25 mm Hg
vakum uygulaması yapılır. Sulu çözeltiden oluşan buz
süblimasyona uğrar. Böylece uçucu olan tüm materyal
ortamdan uzaklaşırken, uçucu olmayanlar (pr, n.a)
konsantre halde bazende tüysü şekilde çökelirler.
Avantaj-Dezavantajları
• Biyolojik materyallerin saklanma ve taşınmasında
sağladığı kolaylıktan dolayı oldukça yaygın olarak
kullanılmaktadır.
• Bu şekilde dondurularak kurutulan örnekler çok uzun
süre stabil halde kalabilir ve yıllarca canlılıklarını korurlar.
Sıvı ortama alındıklarında yeniden çözünürler.
• Liyofilizasyonun sadece sulu çözeltiler için uygun olması
bu tekniğin kullanımında bazı kısıtlamalara yol açar.
• Organik çözücüler sulu çözeltilerin erime (melting)
noktasını düşürür ve örneğin erime olasılığını artırarak
işlem esnasında denatürasyona yol açar. Yine organik
buharların vakum pompası içerisine girerek zarar
vermeleri tehlikesi de vardır.
Vakum altında santrifüjleme
• Pek çok biyolojik örneğin kurutulmasında
kullanılır.
• Öncelikle örnek organik bir çözücüde veya suda
çözündürülür. Çözücüde santrifüjde vakum
altında uçurulur ve örneğin tüpün dip kısmında
çökelmesi sağlanır.
• Hızlı olması, ön dondurma işlemine gerek
olmaması, örneğin tamamen kazanılması ve
sudan başka çözücülerin de kullanılabilmesi
bakımından dondurarak kurutmadan daha
kullanışlıdır.
4. Çöktürme
• Su veya başka bir çözücü içeren bir ortamda
istenilen yada istenmeyen moleküllerin
çöktürülerek katı halde ayrılması temeline
göre yapılır.
• Amonyum ve sodyum sülfat, proteinleri
çöktürmede oldukça yaygın kullanılan
anorganik tuzlardır.
• İzoproponal, etanol da genellikle nükleik
asitleri çöktürmede kullanılır.
5. Enzim Uygulaması
• Ayırma işlemi enzim uygulaması ile yapılır.
• Örn: Proteinlerin proteazlarla, nükleik asitlerin
de nükleazlarla parçalanarak ortamdan
uzaklaştırılması mümkündür.
6. Santrifüjleme
• Bu teknik, Santrifüj adı verilen aletler
yardımıyla, yüksek hızda döndürülerek
merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda
partiküllerin davranışı temeline dayanır.
Santrifüjleme sonunda
Üst faz (sıvı faz)
“süpernatant”
Alt faz (çökelti)
“pellet”
“Santrifüj kuvveti”
• Makromolekül halindeki bir partikül veya bir
hücre organeli yüksek hızda döndürüldüğünde
bir santrifüj kuvvetinin etkisinde kalır.
• F = m x 2 x r
F = sanrifüj kuvvetinin derecesi
m = çöken partikülün kütlesi
 = açısal hız
r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı
Göreceli (Rölatif) Santrifüj Kuvveti (RCF)
• Çökelen bir partikül üzerindeki kuvvet, dönüm hızı ve
partikülün dönüm eksenine uzaklığı ile artar. F değerinin,
yerçekimi kuvvetiyle (g) ilgili olarak, daha genel bir ifade
Göreceli (Rölatif) Santrifüj Kuvveti (RCF) ‘dir.
RCF değeri:
RCF = 1.118 x 10-5 x rpm2 x r
rpm = örneğin dakikadaki dönüm sayısı
(devir/dakika)
r = çökelen partikülün dönüm
eksenine uzaklığı (cm)
Santrifüjleme
• Genellikle ortalama RCF’nin hesaplanmasında,
santrifüj tüpünün tepesi ile dibi arasındaki
uzaklığın ortasındaki rort değeri kullanılır.
• RCF, sayısal bağıntı çizelgesinden (nomogram)
yararlanılarak da kolaylıkla saptanabilir.
• RCF değeri, x g olarak gösterilir.
RCF hesaplama
• Örn; 20.000 devir/dakikada ortalama
r değeri 7cm. ise, RCF=32.000xg
Resim A : RCF değerinin, çökelen partiküllerin dönüm eksenine
olan uzaklıkları r ile değişimi
Resim B :RCF tayini için sayısal bağlantı çizelgesi.
Santrifüjleme
• Santrifüjleme temelde biyolojik materyain
hazırlanmasında, moleküllerin yalıtımı ve
saflaştırılmasında kullanılan etkin bir teknik
olduğu
gibi
saflaştırılmış
moleküllerin
hidrodinamik özelliklerinin (biçim, boyut,
yoğunluk vb) analitik olarak ölçülmesinde de
oldukça kullanışlıdır.
• Temelde dönmeyi sağlayan bir motor ile tüplerin
konduğu bir rotor’dan oluşur. Düşük devirliden
karmaşık donanıma sahip ve analitik işlemler de
yapabilen pek çok santrifüj tipi geliştirilmiştir.
Düşük Hızlı Santrifüjler
• Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde düşük hızlı (devirli)
santrifüjlerin en yüksek hızları 4.000-5.000 devir/dakikadır
(3000xg).
• Bu aletler genelde oda sıcaklığında çalışırlar ve sıcaklık
kontrolleri yoktur.
• Rotorları, sabit açılı (“fixed angle”) veya açılan kova
(“swinging bucket”) tipindedir.
Düşük Hızlı Santrifüjler
• Genellikle 12 veya 50 ml’lik santrifüj tüpleri
kullanılır.
• Daha çok sıvı besi ortamları ya da
süspansiyonlardaki hücrelerin hızlı şekilde
çöktürülmesinde yararlanılır.
• Santrifüjleme sonunda tüpün dibinde
hücreleri içeren bir çökelti (pellet) oluşur;
çökeltinin üstündeki üst sıvı (supernatant)
dökülerek uzaklaştırılır.
Düşük Hızlı Santrifüjler
• Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde
kullanılır.
• En yüksek hızları 4.000-5.000 dev/dak’ dır.
• Genellikle oda sıcaklığında çalışırlar, sıcaklık
kontrolleri yoktur.
Yüksek Hızlı Santrifüjler
• Daha duyarlı uygulamalar için, yüksek devirli ve ısı
kontrollü santrifüjler gereklidir.
• Sıcaklığı (4 °C civarında ) ve hızın kontrol altında
tutulması, özellikle yüksek sıcağa duyarlı biyolojik
materyalin santrifüjlenmesi sırasında önemlidir.
• Yüksek hızda santrifüjleme de başlıca 3 tip rötor
kullanılır:
1. Sabit açılı
2. Açılan kova
3. Dikey rötorlar
Rotor Çeşitleri
Sabit açılı rotor
Açılan kova
Dikey
Yüksek Hızlı Santrifüjler
• Günümüzde rotorlar daha çok karbon-fiber
karışımı malzemelerden imal edilmektedir.
• Bunlar hafif olduklarından hızlanma ve durma
süreleri kısadır.
• Bu santrifüjler içinde en çok kullanılan orta
hızda dönüm yapan mikrosantrifüjlerdir.
• Maksimum hızları genellikle 12.000-15.000
rpm’dir.(11.000-12.000xg)
Yüksek Hızlı Santrifüjler
• Biyolojik örneklerin hazırlanmasında orta ya
da yüksek hızlı santrifüjlerin kullanımı
gereklidir.
• Bu santrifüjlerde, parçalama sürecinden sonra
hücresel atıklar yok edilebildiği gibi hücre
organelleri (nukleus, mitokondri, kloroplast
gibi) ve kimyasal uygulamalar sonrasında
makromoleküller (nükleik asit, proteinlerv.b.)
çöktürülebilir.
Ultrasantrifüjler
• En karmaşık yapılı olan santrifüjlerdir.
• Ultrasantrifüjlerle
çok
yüksek
devirlere
ulaşılabilmesi nedeniyle rotorda yüksek derecede
ısı artışı oluşacağından çalışma sırasında cihazın
içinin soğutulması ve sürtünmenin engellenmesi
için yüksek vakumda tutulması gerekir.
• Metal rotorların yüksek basınç etkisiyle nadir de
olsa parçalanma tehlikesi olduğundan aletin içi
çelik tabaka ile kaplıdır.
Ultrasantrifüjler
• Hücre bileşenlerinin ayrılmasında (organel
veya moleküllerin)
• Saflaştırılmış
moleküllerin
analitik
ölçümlerinin yapılmasında kullanılır. Örneğin;
saflık derecesi, molekül ağırlığı, yoğunluğu,
biçimi, bileşenlerin özellikleri ve oranların
belirlenmesi gibi.
Santrifüjleme Uygulamaları
Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi
• Üzerinde çalışılan örneğin ilk aşamada belli bir
süre uygun hızda döndürülmesiyle elde edilen iki
ayrı fazda (çökelti ve üst sıvı) preparatif amaçlı
olarak daha ileri düzeyde ayırım yapmak üzere
hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi kullanılır.
• Bu santrifüjlemede, kaba çökeltilerden hücre
organellerine ve makromoleküllere kadar farklı
boyuttaki partiküller birbirinden ayrılır.
Santrifüjleme Uygulamaları
Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi
• Bu temele dayalı olarak hücre bileşenlerinin daha
özgül biçimde ayrılmasını sağlamak üzere farklılığa
bağlı (differantial) santrifüjleme geliştirilmiştir.
• Bu yöntemde giderek artan hızlarda ardışık
santrifüjleme uygulanır.
• Santrifüjlemenin başında, tüm partiküller
homojen şekilde dağılmıştır.
• İşlem devam ederken partiküller sedimentasyon
derecelerine göre çökerler.
Santrifüjleme Uygulamaları
Diferansiyel santrifüjleme
• Diferansiyel santrifüjleme kullanılarak partiküllerin
çökelme hızını ifade eden çökelme katsayıları(s)
hesaplanabilir.
• Birimi saniye olan s terimi genellikle standart
koşullarda, 200C’ de ortam olarak su kullanarak
yapılır.
• S değeri, biyolojik makromolekülleri ve hücre
organellerini sınıflandırmada kullanılan bir
özelliktir. Bir molekülün ya da organelin boyutunu
(molekül ağırlığı, baz çifti v.b.) hesaplamakta
kullanılır.
Santrifüjleme Uygulamaları
• Çökelme
katsayıları
1x10-13-10.000x10-13
arasında değişir.
• Sayısal açıdan kolaylık sağlamak için çökelme
katsayıları Svedberg birimi(S) ile ifade edilir.
• 1S= 1x10-13 saniyedir.
Santrifüjleme Uygulamaları
Yoğunluk derecelemesi santrifüjleme (density
gradient )
• Örnek yoğunluk tüpün tepesinden dibine
doğru giderek artan akışkan bir ortamda
santrifüjlenir.
• Differansiyel santrifüjlemeden farklı olarak, bu
yöntemde değişik boyuttaki partiküllerin tek
bir santrifüjleme ile ayrılması mümkün olur.
Santrifüjleme Uygulamaları
Yoğunluk derecelemesi santrifüjleme( density gradient )
• Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin ayrılması ve
saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır.
• Bu yöntemle s ölçümü de yapılabilir.
• Özellikle nükleik asitler bu yöntemlerin kullanılmasıyla
ayrıntılı şekilde araştırılabilmektedir.
• DNA ve RNA s değerlerine göre sınıflandırılabilir ve
DNA’nın farklı yapısal biçimleri ayırt edilebilir.
• Bu yöntem ayrıca, ribozom, mitokondri, kloroplast gibi
hücre bileşenlerinin izolasyonu ve saflaştırılmasında da
kullanılmaktadır.
Yoğunluk derecelemesi santriifüjleme
(density gradient)
Yoğunluk derecelenmesinde başlıca iki yöntem
kullanılır:
1. Hız-bölgesel (rate-zonal) santrifüjleme
• İşlemden
önce,
otomatik
derecelenme
karıştırıcısı yardımıyla, sakkaroz veya gliserol
gibi küçük molekül ağırlıklı solüsyonlarla bir
yoğunluk derecelenmesi hazırlanır.
• Örnek derecelenme tabakasının tepesine yayılır
ve tüpler açılan kova tipindeki rotora yerleştirilir.
• İşlem sırasında partiküller s değeriyle bağlantılı
bir hızda hareket ederler.
Yoğunluk derecenlemesi santriifüjleme
(density gradient )
1. Hız-bölgesel (rate-zonal) santrifüjleme
• Partiküller bölgeler (zonlar) halinde çökerler
ve birbirlerinden ayrılmış olarak kalırlar.
• İşlem partiküller tüpün dibine
ulaşmadan sona erdirilir.
• Tüpteki değişik bölgeler ayrı
ayrı toplanır.
Yoğunluk derecenlemesi santrifüjleme( density
gradient )
2. Eşit yoğunluk (Isopycnic) santrifüjleme
• Bu yöntemde yoğunluk derecelenmesi işlem
sırasında oluşur.
• Ayırımı yapılacak olan molekülü içeren
karışım, sezyum klorür veya sezyum sülfat
gibi ağır metal tuzu çözeltisi içinde çözülür
• Ultrasantrifüj
tüpüne
doldurulur
ve
santrifüjlenir.
1.2.7. Kromatografi
• Kromatografi, katı veya sıvı bir durağan (stationary)
fazın yüzeyine veya içine uygulanmış bir karışımdaki
moleküllerin, sıvı veya gaz halindeki bir hareketli faz
aracılığıyla
hareket
ederken
birbirlerinden
ayrılmaları temeline dayanmaktadır. Bu ayrılmaya yol
açan etkenler, moleküllerin tutunma (adsoption),
dağılma(partition), iyon değişimi, ilgi (afinite)
özellikleri ya da molekül ağırlıklarındaki farklılıklardır.
Bu farklılıklar nedeniyle karışımdaki bileşenlerden
bazıları durağan fazda daha uzun süre kalırlar ve
kromatografi sistemindeki hareketleri yavaş olur.
Diğerleri ise hareketli faza daha çabuk geçer ve
sistemden daha hızlı ayrılır.
Kromatografi
• Kromatografi, bir karışımdaki çeşitli maddeleri, maddelerin
özelliklerindeki farklılıklara dayalı olarak ayıran analitik tekniktir.
Polarite, çözünürlük, affinite (ilgi) iyonik güç ve/veya çap
farklılıklarına bağlı olarak karışımdaki maddeler ayrılabilir.
• Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda,
tercihen kullanılır. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok
benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi
yönteminin kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmektedir.
• Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir
karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit
bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı
hızlarla hareket edebilmeleridir.
Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır.
1. Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine
emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur.
2. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur.
3. Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler
arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey
tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular
temel etkileşim türlerini oluştururlar.
• Kromatografi yöntemleri, çözünen moleküllerin
durağan faza bağlanma veya onunla etkileşime
girme biçimine göre iki tipe ayrılır.
• Dağılım
(partition)
kromatografisi
çözünen
materyalin iki sıvı faz arasındaki dağılımına dayanır.
Uygulamada doğrudan iki sıvı kullanılabildiği gibi,
(ince tabaka ve gaz-sıvı kromatografilerinde)
sıvılardan biri katı bir destek (matris,matriks)
üzerinde sabitleştirilmiş olabilir. Araştırılan örneğin
bileşenlerinin iki faz arasındaki dağılımı temelde
onların çözünürlük farklarından kaynaklanır.
• Tutunma (adsorbsiyon) kromatografisinde,
örnekteki moleküller için sınırlı sayıda özgül
bağlanma yerleri içeren (iyon değiştirici reçine
gibi) bir durağan faz ya da destek bulunur. Bu
kromatografi tipi moleküller ile durağan fazın
yüzeyindeki bağlanma yerleri arasındaki özgül
etkileşimlere dayanır. Moleküllerle destek
arasındaki çekim kuvvetleri iyonik, hidrojen
bağları oluşumu veya hidrofobik etkileşimler
olabilir ve bu reaksiyonlar geri dönüşümlüdür.
Adsorpsiyon (Tutunma) Kromatografisi
• Sabit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit
faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)"
etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı polaritelere
(kutuplaşmalara)
sahip
maddelerin,
farklı
derecelerde yüzey tutunması göstermeleri doğaldır.
Buna bağlı olarak, hareketli faz yardımı ile sabit faz
üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir.
Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin
tümü "adsorpsiyon kromatografisi" genel adı ile
anılırlar.
• Tutunmaya dayalı olanlar (örneğin iyon değişimi
kromatografisi) nükleik asitler ve proteinler gibi
makromoleküllerin ayırımında daha etkindir.
Dağılım Kromatografisi
• Sabit faz bir "sıvı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz
arasında "çözünme" etkileşimi gerçekleşir. Bu
durumda farklı maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda
farklı çözünürlüklere sahip olmaları söz konusudur.
Yani farklı maddelerin iki faz arasındaki dağılımları ön
plana geçmektedir. Buna bağlı olarak hareketli faz
yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı
olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren
kromatografik
yöntemlerin
tümü
"dağılım
kromatografisi" genel adı ile anılırlar.
• Dağılım esasına dayalı kromatografi yöntemleri
özellikle aminoasitler, karbonhidratlar ve yağ asitleri
gibi küçük moleküllerin ayrımı ve tanımlanmasında
çok etkindir.
İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903)
tarafından geliştirilen bir yöntemdir.
Tsvett bu yöntemi; bitki pigmentlerinin
(klorofil A, klorofil B ve ksantofil) renkli
bileşenlerini
ayırmakta
kullanılmıştır.
Kullandığı
kolonda
renkli
bantlar
oluştuğundan, bu ayırma yöntemine
kromatografi
(renkli
yazmak)
adını
vermiştir.
Bir parça kağıt şeridin aşağı
hizasından 1 cm kadar yukarısına
bir
damla
siyah
mürekkep
damlatınız
Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız
kısım su hizasının üstünde kalacak
şekilde su tankına batırınız ve dik bir
şekilde tutunuz. Su, kapiler etkisiyle
kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken
mürekkebi çözer ve sürüklemeye
başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler
kağıt
üzerinde
farklı
hızlarda
ilerleyerek ayrılmış olur.
•
•
Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda,
tercihen kullanılır. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok
benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi
yönteminin kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmektedir.
Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki
çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz
üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket
edebilmeleridir.
Kromatografi
Kromatografi’nin Sınıflandırılması
1-Uygulama Biçimine Göre
2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre
3-Faz Tiplerine Göre
1-Uygulama Biçimine Göre
- Düzlemsel kromatografi
Kağıt kromatografisi
İnce tabaka kromatografisi (TLC)
-Kolon kromatografisi
Gaz kromatografisi (GC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
Süperkritik akışkan kromatografisi
2- Ayrılma Mekanizmalarına Göre
• Adsorpsiyon kromatografisi
• Dağılma kromatografisi
• İyon değiştirme kromatografisi
• Jel filtrasyon (Moleküler eleme)
kromatografisi
• İyon çifti kromatografisi
• Afinite kromatografisi
3-Faz Tiplerine Göre
-Sıvı kromatografisi
Sıvı-Katı kromatografisi
Sıvı-Sıvı kromatografisi
-Gaz kromatografisi
Gaz-Katı kromatografisi
Gaz-Sıvı kromatografisi
Kolon Kromatografi
Kolon Kromatografisi
•Kolon kromatografisi: biyomoleküllerin
saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır.
•Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir
maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur.
depo
(tampon)
mobil faz
(tampon)
 SABİT FAZ
•biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir.
HAREKETLİ FAZ
Protein
•Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan
karışımı
sabit faz
kolon tarafından,
(katı porlu matriks)
adsorbe edilmeyenler  önce
adsorbe edilenler  daha geç
kolonu terkeder.
elüent
Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır:
• Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler
için uygundur.
• Alumina: Genellikle nötr ve bazik yapıdaki bileşikler
için uygundur.
• Selüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için
uygundur.
Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler;
• Sikloheksan, Petrol eteri, Dietil eter, CCl4, Benzen,
Toluen, CHCl3, CH2Cl2, Etil asetat, Aseton, n-Butanol,
İzopropanol, Etanol, Metanol olabilir.
1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle
çalışırken kolon dolgu maddesi olarak
kireç kullanmıştı.
Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve
alumina kullanılmaktadır.
Kolon Kromatografisi
• En kullanışlı ve yararlı kromatografi tekniklerinden
biri olan kolon kromatografisi katı bir durağan faz ile
sıvı bir hareketli fazdan oluşur.
• Durağan faz cam veya plastik bir çubuk içerisine
konur ve hareketli faz katı tutucudan geçirilir.
Kolonun tepesine uygulanan az miktardaki karışım
kolondan geçerken karışım oluşturan moleküller iki
fazdaki tutunma veya dağılma özelliklerindeki farka
göre kolonda farklı hızda ilerlerler. Kolondan çıkan
sıvı fazın fraksiyonlar halinde toplanmasıyla değişik
moleküllerin ayrımı yapılabilir.
Kolon Kromatografi Tipleri
Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre
gruplandırılır:
i.
Jel filtrasyonu  büyüklük
i.
İyon değişim  yük
i.
Affinite  (bağlanma)
Jel Geçirgenlik Kromatografisi
• Jel filtrasyonu veya moleküler elek kromatografisi olarak da
adlandırılan jel geçirgenlik kromatografisinde şimdiye kadar
açıklanan tekniklerden farklı olarak ayırma molekülün
büyüklüğüne göre yapılır. Bu teknik binlerce protein, nükleik
asit,
polisakkarit
ve
diğer
biyolojik
moleküllerin
saflaştırılmasında önem taşır.
• Jel filtrasyonu için kullanılan bir kolonda durağan faz kontrollü
boyutta küçük porlu inert partiküllerden oluşur. Farklı
boyutlarda moleküller içeren solüsyon devamlı bir çözücü
akışıyla kolondan geçirilir. Porlardan daha büyük olan
moleküller jeldeki partiküllerin içerisine girmezler ve
partiküllerin arasında sınırlı bir alanda kalırlar. Sonuçta bu
moleküller yavaşlamazlar ve kolondan hızla çıkarlar.
Partiküllerin içinde ve dışında yayılabilen küçük moleküllerin
kolondaki hareketleri ise daha yavaş olur.
Biyomolekül karışımını
kolondan geçirilir
içeren
tampon,
Küçük moleküller, jel boncuklar arasındaki
boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar.
Büyük moleküller, jel boncuklar arasındaki
boşluklara giremez ve kolondan hızlı bir
biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.
•
Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğe
uğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik
moleküllerin birbirinden ayrılması için kullanılır.
• Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayin
edilebilir.
•Avantaj Büyük
miktarda
:
biyomolekül
karışımı
saflaştırılabilir.
•Dezavantaj:
Yavaş ayırım
İyon Değişim Kromatografisi
• Bu teknik iyon molekülleri yüklü bir durağan faz ile
geriye
dönüşebilen
elektrostatik
etkileşime
girebildikleri bir tutunma kromatografi biçimidir.
İyon değişimi kromatografisi kolon iyonik işlevsel
gruplarla etiketlenmiş sentetik reçineden oluşan
durağan fazla doldurulur.
• İşlemin ilk aşaması kolondaki çözünmeyen özellikteki
pozitif yüklü reçinenin tampondaki zıt yüklü iyonla
çevrilmesidir. İkinci aşamada ayrılacak karışımın
kolona yüklenmesiyle farklı yüklü moleküllerin iyon
değiştirici ortama girmesi sağlanır.
İyon exchange (değiş-tokuş) Kromatografi
Biyomolekül karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla [(+) -> (+) veya (-)
-> (-) ile] yer değiştirerek kolona bağlanırlar. Bağlanmayan proteinler, kolondan en
önce çıkarlar. Daha sonra, iyonik gücü/pH’sı farklı bir tampon kolondan geçirilir
bağlı moleküllerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır.
İlgi (Affinite) Kromatografisi
• Bundan önce açıklanan kromatografik ayrımlar
durağan destekler ile moleküller arasında özgül
olmayan fizikokimyasal etkileşimlere dayanır. Büyük
boyut ve polarite gibi moleküler özellikler biyolojik
moleküllerin ayrım ve izolasyonunda yüksek bir
seçicilik sağlamaz.
• İlgi kromatografisi ise biyolojik etkileşim temeline
dayanır. Bu nedenle son derece özgül ayrımların
yapılabilmesini sağlar.
• Makromoleküllerin çoğunun meydana getirdikleri
biyolojik işlevler ligand adı verilen özgül moleküllerle
etkileşimlerinin sonucudur.
A (makromolekül) + B (ligand) ↔ Biyolojik Yanıt
Affinite Kromatografisi
Enzim,
hormon
vb
spesifik
proteinlerin
saflaştırılmasında
kullanılır. Kolonun dolgu maddesine
(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)
spesifik protein ile kompleks
yapabilen bir ligand bağlanır. Ligand
ile kompleks yapan spesifik protein,
katı desteğe bağlanarak kolonda
tutulurken; serbest proteinler kolonu
terkederler.
Bağlı protein, daha sonra, pH
değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand
ilavesiyle kolondan elüe edilir.
Seçiciliği fazla olan bu yöntem,
kromatografi
tekniklerinin
en
yenisidir.
Antijen – Antikor
Enzim – Substrat
Reseptör– İlaç gibi oldukça
spesifik etkileşimlere dayanır.
Kolon Kromatografisi
a)Gaz Kromatografi
(GC)
b)Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi
(HPLC)
Gaz Kromatografisi (Gas Chromatography-GC)
• Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan
faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı
olduğunda bu tekniğe gaz-sıvı kromatografisi ya da
kısaca gaz kromatografisi denir.
• Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır.
Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı,
paslanmaz çelik ve ya camdan bir tüp içerisine
doldurulur. İnert bir gaz halindeki hareketli faz yüksek
basınç altında kolondan geçirilir. Çalışan materyale ait
örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan
fazdan geçmesi sağlanır. Durağan faza ilgisi olan
moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur.
• Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son
derece iyi ayrılmasını sağlayan, basit, hızlı, çok
yönlü bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla
birlikte bu kromatografideki en önemli kısıtlama
kullanılan örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık
derecelerine dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu
nedenle gaz kromatografisi ancak uçucu ya da
uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin
ayrımında kullanılabilir.
Gaz Kromatografi (Gas Chromatography-GC)
• Bu teknik laboratuvarda basit aletlerle yürütülemez.
Yöntemin uygulanmasında çok gelişmiş otomatik
cihazlar gereklidir.
Gaz kromatografisinde, ilk
olarak
örneğin
buharlaştırılması
için
ısıtılan bir bölme vardır.
Hemen ardından sıcaklığı
programlanabilen bir fırın
içine yerleştirilmiş olan
kolon gelmektedir. Sıvı
örnekler bir şırıngayla bir
septumdan giriş kısmına
enjekte edilirler. Kolon
çıkışına yerleştirilen bir
dedektörden sinyal izlenir
ve bir integratör ile
kaydedilir.
Yüksek Basınçlı (Performanslı) Sıvı Kromatografisi
(High Performance Liquid Chromatography-HPLC)
• Son yıllarda yeni kolon dolgu maddelerinin değiştirilmesiyle
biyomoleküllerin ayrılmasında kullanılır. Böylece birçok
molekülün yapısal ve işlevsel analizlerini yapmak üzere çok kısa
sürede ve etkin biçimde saflaştırılmaları mümkün olmaktadır.
• Aminoasitler, karbonhidratlar, lipitler, nükleik asitler, proteinler,
pigmentler, steroidler ve diğer biyolojik aktif moleküllerin
ayrımının yapılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar
veren bu teknikte otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı
kromatografisidir.
• Ayrıştırma ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir,
kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli
kullanılabilir, ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde
kontrol edilebilindiğinden tekrarlanabilirliği son derece
yüksektir.
• HPLC ve GC sistemleri arasında da büyük benzerlik vardır.
Sadece GC deki gazın yerine HPLC de çözücü almıştır.
Yüksek Basınçlı (Performanslı) Sıvı Kromatografisi
(High Performance Liquid Chromatography-HPLC)
Ayırma tekniği olan bir HPLC cihazının temel bileşenleri;
•
•
•
•
•
Çözücü deposu
Yüksek basınç pompası
Ticari olarak hazırlanmış kolon
Algılayıcı (dedektör)
Yazıcı
GC’deki taşıyıcı gazın yerini
HPLC’de çözücü almıştır.
HPLC
• Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde
bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı
etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler.
• Kolonu değişik zamanlarda terk ederler ve böylece birbirlerinden
ayrılırlar.
• Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından
yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve
tam olarak gerçekleşmektedir.
• Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle
tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir.
• Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı
kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC)
denir
Maddelerin tanımlanması tüm HPLC uygulamalarında en kritik
kısımdır. Bunun için detektör seçimi çok önemlidir. Kolon ve hareketli
fazın seçimi de kritik noktalardır. Miktar analizi ise, bir maddenin
çözelti içindeki yoğunluğunun bulunmasıdır. Öncelikle standart
bileşiklerin madde konsantrasyonlarının ölçülmesi gerekir. Bu
bileşiklerin kromatografisiyle elde edilen grafikler (kromatogram)
bilinmeyen maddeyle karşılaştırılır ve miktar tayini yapılabilir.
HPLC Avantajları;
• HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez kullanılabilir.
• HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve
tekrarlanabilirlik daha yüksektir.
• Nitel ve nicel analizlerde kullanılabilir.
• Ayrıştırma ve analiz hızı yüksektir.
• Duyarlık yüksektir.
• Aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir.
• Büyük boyuttaki ayırım süreçlerine uygulanabilir.
Düzlemsel Kromatografi
(Kağıt ve ince Tabaka Kromatografileri)
• Kağıt kromatografisinde destek ortamı suyla yüksek
derecede
doyurulmuş
durumdaki
selüloz
tabakasından oluşur.
• İnce tabaka kromatografisinde ise ince bir silika jel,
alumina veya selüloz ile kaplanmış cam, aluminyum
ya da plastik bir tabaka olabilir. Araştırılan örnek
genellikle uçucu bir çözücü içerisinde çözündürülür,
destek ortamına çok az miktarda damlatılır ve
kurumaya bırakılır. Damlatma işlemine uygun
miktarda örnek uygulanana kadar birkaç kez devam
edilir. Daha sonra, kağıt ya da ince tabaka içinde az
miktarda çözücü bulunan bir kaba konur ve
çözücünün kılcal hareketi ile ayırım başlar.
• Örnekteki moleküllerin renkli olmadığı durumlarda
bunların kromatogram üzerindeki yerleşim yerlerini
saptamak için renk meydana getirmek üzere
fluoresans, radyoaktivite veya kimyasal madde gibi
çeşitli uygulamalar yapılabilir. Renk oluşumu,
görünür ışık ya da UV altında gözlenebilir.
• Karışımdaki her bir molekülün yerleşim durumu,
molekülün hareketinin çözücünün hareketine
oranlanmasıyla ölçülebilir. Bu ölçüm değerine
göreceli hareketlilik (relative mobility) adı verilir ve
Rƒ simgesiyle gösterilir.
• Rƒ
değerinden,
moleküllerin
nitel
olarak
tanımlanmalarında yararlanılır.
Yürüme hızı, Rf değeri
ile ifade edilir ve
substansın
yürüme
mesafesinin, çözücünün
yürüme
mesafesine
oranından hesaplanır. Rf
değeri 0 ile 1 arasında
bulunur ve doğal olarak
hızlı
yürüyen
komponentler
için
alınan mesafe büyük
olacağından Rf değeri
büyük
daha
yavaş
yürüyenler için daha
küçüktür
• Kağıt ve ince tabaka kromatografileri için çok az
miktarda örnek yeterlidir, analiz hızlı ve ucuzdur,
saptama çok belirgindir. Bununla birlikte, bu
tekniklerin duyarlılığı pek yüksek değildir.
• Günümüzde, ince tabaka kromatografisi kağıt
kromatografisinden
daha
yaygın
şekilde
kullanılmaktadır; çünkü çözücü gücünün daha
fazla olmasına ek olarak, daha hızlı sonuç
vermektedir.
İnce Tabaka Kromatografi
(Thin Layer Chromatography-TLC)
İnce
tabaka
kromatografisi,
kromatografisidir."
bir
"katı-sıvı
adsorpsiyon
Bu yöntemde sabit faz,
çeşitli
boyutlardaki
"cam plakalar üstüne,
ince bir tabaka halinde
sıvanmış katı adsorban
maddedir.
Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm
katılar (alumina, siliko jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. Bu yöntemde
hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi, aşağıdan yukarı doğru
olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası
üzerinde yürür. Bu işlem sırasında, plakanın alt kesimlerine bir
damlalıkla önceden damlatılmış olan karışımı da farklı hızlarla yukarıya
sürükler.
Elektroforez
• Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki
hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Çözünmüş durumdaki
moleküllerin elektrik yüklerinin, kitlelerine oranıyla
belirlenen hızlarla elektriksel alanda hareket etmeleri
prensibine dayanır.
• Bu sistemde analiz yapılacak örnek bir destek ortamına
uygulanır. Modern elektroforez tekniklerinden destek
ortamı olarak daha çok jeller tercih edilmektedir. Jeller
içerisinde uygun bir tampon bulunan bir elektroforez
aygıtına yerleştirilerek işlem gerçekleştirilir.
• Analiz edilecek örnek jele bir leke ya da ince bir bant halinde
uygulanır. Katı jel desteğiyle ayrımı yapılacak moleküllerin
hareketi moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine, kimyasal
içeriğine ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır.
• Oldukça hızlı ve kullanışlı bir teknik olan
elektoroforezin bir homojenattaki farklı molekülleri
ayırma kapasitesi genellikle fazla yüksek değildir. Bu
nedenle bu teknikten preparatif olarak sınırlı ölçüde
yararlanılmaktadır. Buna karşılık az miktardaki
protein ya da nükleik asit karışımlarını saflaştırmakta
ve
analizlerini
yapmakta
geniş
çapta
kullanılmaktadır.
• Ohm yasasına göre, elektrik alanı, akım ile direncin
çarpımına eşittir. (V=I.R)
• Elektroforez aygıtında oluşan direncin hemen
tamamı jel tarafından ortaya konulur.
• İkinci eşitliğe göre sistemin ürettiği güç direnç ile
akımın karesinin çarpımına eşittir.
• Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve
elektroforez aygıtı jelin sıcaklığını arttırmaksızın,
ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Belli bir
noktanın üstünde voltajdaki ufak artışlar bile jelin
sıcaklığında önemli ve zararlı bir yükselmeye yol
açar. Kullanılan aygıtın kolaylıkla dağıtabileceği
gücü miktarının iyi bilinmesi ve buna göre jelin
sıcaklığının dikkatle izlenmesi gerekir.
Elektroforez Yöntemleri
• Tüm elektroforez tiplerinin temeli, elektriksel
eşitliklere dayanır. Aralarındaki başlıca fark
destek ortamının tipi ve konumudur.
• Dikey ya da yatay konumdaki destek ortamı
selüloz ya da ince jellerden hazırlanmış olabilir.
Selüloz, aminoasitler ve karbonhidratlar gibi
düşük molekül ağırlıklı olan moleküller için, jeller
ise daha büyük olanlar için destek ortamı olarak
kullanılır.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)
• Akrilamidin polimerizasyonuyla hazırlanan poliakrilamid
jellerin elektroforetik ayırımlarda çeşitli üstünlükleri
vardır. küçük ya da orta boydaki nükleik asit ve proteinler
için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir; oldukça büyük
boyuttaki örnekler için uygundur; göç eden moleküllerle
destek materyali arasındaki etkileşim en düşük
düzeydedir; destek materyali fiziksel olarak oldukça
kararlı ve dayanıklıdır.
• Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez örnekteki
bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar. Çünkü ayırım
hem moleküler elekleme hem de elektroforetik ayırıma
dayanır. PAGE’nin, jel geçirgenlik kromatografisinden
farkı poliakrilamid jelde küçük molekülerin büyük
moleküllerden daha hızlı hareket etmeleridir.
Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N’-metilen-bisakrilamidin serbest radikal polimerizasyonuyla hazırlanır. Kimyasal
polimerizasyon bir başlatıcı-katalizör sistemi tarafından kontrol
edilir. Fotokimyasal polimerizasyon, UV ışık altında riboflavin
tarafından başlatılır. Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart
bir jelde genelde %7,5 poliakrilamid jel içerir.
• Bir jelin ayrıştırma gücü ve
molekül
boyutu
aralığı
akrilamidin ve bis akrilamidin
konsantrasyonuna bağlıdır. Düşük
konsantrasyonda daha büyük
porlar oluşur ve yüksek molekül
ağırlıklı biyolojik moleküllerin
analizi
yapılabilir;
yüksek
konsantrasyonlarda ise, daha
küçük porların oluşumu düşük
molekül
ağırlıklı
olanların
analizine izin verir.
• Poliakrilamid jel elektroforezi çubuk biçiminde veya
düzlemsel biçimde hazırlanmış jellerle gerçekleştirilir.
Çubuk tipinde, cam tüpler jel materyaliyle doldurulur;
polimerizasyon 30-40 dakikada tamamlanır. Jel tüpü, iki
ayrı tampon deposu arasına yerleştirilir. Üstteki depoda
genellikle katod, alttakinde anod bulunur. Biyolojik
moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda doğru
hareket edeceklerinden, jel elektroforezi genellikle bazik
pH da gerçekleştirilir. Analiz edilecek örnek, bir izleme
boyasıyla birlikte, jelin tepesine uygulanır ve sistemden
elektrik akımı geçirilir. Örnekteki bileşenlerden daha hızlı
hareket eden izleme boyası jelin bitimine ulaştığında akım
kesilir, jel tüpten çıkarılır ve boyanır.
• Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta tutulan iki cam
tabaka arasında hazırlanır.
• Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen
plastik bir tarak belli küçük kuyucukların oluşmasını sağlar.
Kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok
etmek üzere tamponla yıkanır. Jel kasedi iki tampon
deposu arasına yerleştirilir; kuyucuklara örnekler konulur
ve akım geçirilir. Elektroforez bitiminde görüntüleme için
jel genellikle uygun şekilde boyanır.
• Akrilamid monomeri bir nörotoksindir. Kanser oluşturma
tehlikesi olan bir maddedir. Bu nedenle eldivenle
çalışılması gerekir.
Agaroz Jel Elektroforezi
• PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA
parçalarının ayırımı ve analizi için kullanışlıdır.
Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA
parçalarının ayırımı için uygun değildir. 200-50.000
bç boyutuları arasındaki DNA ve RNA moleküllerini
tanımlamakta kullanılan standart yöntem destek
ortamı olarak agarozun kullanıldığı elektroforezdir.
• Bir algden elde edilen agaroz galaktopiranoz
türevlerinin lineer bir polimeridir. Jel elektroforez
tamponuna konulmuş agarozun yüksek sıcaklıkta
çözündürülmesiyle hazırlanır.
• Agaroz çözeltisi yaklaşık 50°C a kadar soğutulduktan
sonra jel kasetleri arasına veya jel tepsilerine dökülür.
Ayırımı yapılacak örnek taraklarla oluşturulmuş
kuyucuklara konur ve ayırımı tamamlanıncaya kadar
voltaj uygulanır.
Nükleik asitlerin agaroz
jeldeki hareketleri agaroz
konsantrasyonu ile nükleik
asit
moleküllerinin
boyutları ve şeklinden
etkilenir. Nükleik asitlerin
ayırımı için en etkin agaroz
konsantrasyonları %0,32,0 dır.
• Proteinler gibi, nükleik asitler de molekül
ağırlıklarının logaritmasıyla ters orantılı hızda göç
ederler; bu nedenle, analiz edilen moleküllerin
ağırlıkları aynı jelde molekül ağırlıkları bilinen
standart
nükleik
asit
parçalarının
da
yürütülmesiyle tayin edilebilir.
Agaroz
• Polimerize olmus agaroz porlu bir yapıdır ve
DNA nin hareketine olanak sağlar.
• Doğrusal bir polisakkarittir.
Elektroforez Gereçleri
Agaroz Jelin Hazırlanması
• Agaroz jeller toz haldeki agaroz ile tampon çözeltilerin uygun
miktarda karıştırılmasıile hazırlanır.
Agarozun Kaynatılması
Jelin Hazırlanması
Agaroz Jele
Örneklerin
Yüklenmesi
Jelin yurutulmesi
Jelin Görüntülenmesi
Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel
Elektroforezi
• Geleneksel agaroz jel elektroforezi genelde
50.000 bç.’den daha küçük nükleik asit
parçalarının ayırımı için uygundur; yüksek ayırışım
istendiğinde bu sınır 20.000-30.000 bç ye kadar
düşer. Değişken alanlı elektroforez ile çok büyük
DNA molekülleri ayrılabilmektedir.
• PFGE’nin standart jel elektroforezinden en
belirgin fark, uygulanan elektrik alanının sabit
olmaması, ayırma sırasında yönünün ve şiddetinin
tekrarlanan biçimde değiştirilmesidir.
İzoelektrik Odaklanma (isoelectric
focusing-IEF)
• Proteinlerin elektroforetik analizi için geliştirilmiş etkin bir
tekniktir. Bu teknikte elektroforetik hareket pH’nın fonksiyonu
olarak ele alınır. Bir proteinin net yükü pH’ya bağlımlıdır.
Proteinler izoelektrik pH’ların altında pozitif olarak yüklüdürler
ve sabit pH’lı bir ortamda negatif yüklü elektroda (katoda)
doğru göç ederler. İzoelektrik noktalarının üstündeki pH’da ise,
protein proton kaybeder, negatif yüklü hale geçer ve pozitif
yüklü elektroda (anoda) doğru göç eder. Eğer elektroforez
ortamının pH’ı proteinin pH’ına eşitse, proteinin net yükü sıfır
olacağından elektrodların hiçbirine doğru hareket etmez.
• Anoda bir asit, katoda bir baz yerleştirilir ve elektrodlar
arasındaki jel ortamının pH’ı 2-10 arasında derecelenme
yapacak şekilde, elektroforezdan önce ya da elektroforez
sırasında ayarlanarak düzenek kurulur.
İki Boyutlu Elektroforez
• SDS-PAGE ile proteinlerin ayırımının molekül boyutuna göre
yapılmasına karşılık IEF ile ayırım yüke dayanır. Bu iki yöntemin
bileşimi olan iki boyutlu (2D-) elektroforez, kompleks protein
karışımlarının ayrışımında önemli ilerlemelere yol açmıştır. Son
yılarda sıkça ve etkili biçimde kullanılan 2D-elektroforez
proteomik çalışmalarının da temel tekniklerinden biridir.
• Bu yöntemin iki farklı uygulama şekli vardır: ya önce IEF, daha
sonra SDS-PAGE yapılır ya da “ISO-DALT” adı verilen sistem
yardımıyla her ikisi de aynı anda gerçekleştirilir. En yaygın
olarak kullanılan O’Farrell sisteminde birinci boyutta iyonik
olmayan deterjanlar ve üre varlığında, denatüre koşullarda
çubuk jelde IEF gerçekleştirilir; ikinci boyutta ise çubuk jel SDSPAGE jeli üzerine uygulanır. Ayırım sonunda jel boyandığında,
tek bir jelde en az 1.000 farklı proteinin görüntüsünü elde
etmek mümkün olabilir.
Kılcal (Kapiller) Elektroforez
• Kılcal elektroforez(CE) elektroforezin yüksek
ayrıştırma gücü ile HPLC’nin hız, çok yönlülük ve
otomasyon yönlerini birleştiren yeni bir tekniktir.
Çok az miktardaki (5-10nL) örneğin, yüksek
çözünürlükte ayrışımını ve attomol düzeyinde
duyarlılıkla
analizini
sağlar.
Bu
nedenle
aminoasitlerin, peptitlerin, proteinlerin, nükleik
asitlerin analizinde geniş çapta kullanılan bir teknik
olmaya başlamıştır.
• Bu teknikte kullanılan alet bir güç kaynağı, iki
tampon deposu, tamponla doldurulmuş kılcal bir tüp
ve sürekli çalışan bir algılayıcıdan ibarettir.
• CE’nin en önemli üstünlüğü, HPLC gibi birçok
analitik deney tasarımına uygun olmasıdır. Bu çok
yönlülük, kılcal kolonun değişik materyallerle
doldurulmasıyla sağlanır. Örneğin küçük ve yüklü
moleküller için destek materyali olarak silika veya
poliimid ile kaplanmış tüpler, moleküler
eleklemeye göre ayırım istendiğinde ise
poliakrilamid veya SDS poliakrilamid ile
doldurulmuş tüpler kullanılır.
İmmünoelektroforez
• İmmünoelektroforezde
(IE)
kompleks
proteinlerin
analizinde uygulanan ardışık iki işlem vardır: (1) karışımdaki
proteinlerin agaroz jel elektroforezi ile ayrılması (2) ayrılan
proteinlerin antijenik özelliklerini belirlemek üzere özel
antikorlarla etkileşime sokulmaları.
• Bu yöntemde, önce protein karışımı küçük cam tabakada
hazırlanmış agaroz jelde elektroforezle ayrılır. Daha sonra,
ayrılmış proteinler özel antikor uygulamasına bırakılırlar.
Uygulanmış antikorların jelde yayılması sağlanır. Eğer bu
antikorların proteinlerden birine ilgisi (affinitesi) varsa
antijen ve antikor arasında suda çözünmeyen bir kompleks
oluşur ve gözle görülebilir bir çökelme meydana gelir.
• Bu teknik, bir proteinin saflığının, kompozisyonunun ve
antijenik özelliğinin analizi için çok yararlıdır.
Spektral yöntemler
Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki elektromanyetik radyasyon
enerjisidir.
Dalga boyu, iki dalga piki arasındaki mesafedir ki genellikle nanometre (nm), bazen
angström (Ao) ve milimikron (mµ) olarak ifade edilir.
Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık, insan gözünün beyaz olarak
tanımladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır.
Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki görünür
ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa
(absorpluyorsa) siyah görünür.
Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir madde sarı renkli, sarı rengi soğuran bir
madde mavi renkli görünür.
yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı rengi soğuran bir madde yeşil
renkli görünür.
Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri:
• Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon)
• Yayılım (emisyon)
• Geçiş (transmittans)
• Tutulum (absorbans)
• Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans)
ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ
Ölçülen Özellik
Aletli Analiz Yöntemi
Işın Absorpsiyonu
Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi
Işın Emisyonu
Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans,
Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi
Işın Saçılması
Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi
Işın Kırılması
Refraktometri, interferometri
Işın Difraksiyonu
X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri
Işın rotasyonu
Polarimetri, dairesel dikroizm
Elektrik potansiyeli
Potansiyometri, Kronopotansiyometri
Elektrik yükü
Kulometri
Elektrik akımı
Amperometri, Polarografi
Elektriksel direnç
Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü)
Kütle
Gravimetri
Kütle/yük
Kütle spektroskopisi
Tepkime Hızı
Kinetik yöntemler
Termal Özellikler
Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik
Radyoaktivite
Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri
Spektral yöntemler
• Bu yöntemlerin temeli çeşitli ışınların enerjilerine
dayanarak yapılan ölçümlerdir. Elektromanyetik
spektrum birbirini izleyen farklı özelliklerdeki
dalgalardan oluşur. Bu spektrumda, özellikle X
ışınlarının 7nm ye kadar olan bölgesi ile, UV’nin 180340nm arasındaki, görünür ışığın 340-800nm
arasındaki, IR nin 1000-100.000 nm arasındaki ve
radyo dalgalarının 106-1010 nm arasındaki bölgeleri
moleküler biyoloji çalışmalarında önem taşır.
• Uzun yıllardan beri biyomoleküllerin değişik dalga
boylarındaki elektromanyetik radyasyonla etkileşime
dayalı ölçümleri yapılmaktadır. Optik sistemler
özellikle nicel çalışmalar için çok elverişlidir.
Spektral yöntemler
• Molekülleri içeren solüsyonlar veya molekül kristallarine
ışık uygulandığında en az iki farklı olay meydana gelir:
ışığın saçılması ve ışığın emilmesi (absorpsiyon) bunların
ikisi de biyomoleküllerin nitelendirilmesi ve analizlerinde
kullanılan temel tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır.
Özellikle ultraviyole ve görünür ışık dalga boylarının
emilmesi moleküler yapı analizleri için çok değerli bir
olaydır. Bazı moleküllerde ışığın emilmesini farklı dalga
boyunda ışığın yayılması (emisyonu) izler. Fluoresans adı
verilen bu süreç molekülün yapısı ile çevresel etmenlere
bağlıdır ve biyolojik açıdan önemli moleküllerin,
moleküller arasındaki
meydana
gelen
dinamik
etkileşimlerin analizi ve tanımlanmasında yardımcı olur.
İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UVgörünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir
kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini
ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir
(transmisyon).
Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan
ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io)
daha küçüktür.
Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine
oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır.
Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir.
Transmittansın tersinin logaritması Absorbans (Optik dansite,
A) olarak tanımlanır ki bu, çözeltinin içinden geçen ışığın ne
kadarının absorbe edildiğinin (soğurulduğunun) ifadesidir.
Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya
konsantrasyonu ile % Transmittans (%T) arasında doğrusal
olmayan bir ilişki olduğu halde Absorbans (A) arasında
doğrusal bir ilişki vardır.
Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki
maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert-Beer
yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir küvetten geçen
ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu veya küvet çapının (l)
artmasıyla azalır; ayrıca dilüe çözeltinin absorbansı (A),
çözeltinin konsantrasyonu (c) ile doğru orantılıdır. 
absorpsiyon
katsayısı
(ekstinksiyon
katsayısı)
olarak
gösterildiğinde Lambert-Beer yasasının matematiksel ifadesi şu
şekilde olur.
• Spektrofotometre’de nicel ölçümler Beer-Lambert
yasasinin kullanımıyla değerlendirilir.
A=ℇλcd= log I/I0
A= Emme (absorbans)
I0= Örneğe giren ışığın şiddeti
I= Örnekten çıkan ışığın şiddeti
ℇλ= belli bir dalga boyundaki emme katsayısı
c= örnekteki emme yapan maddenin derişimi
d= ışığın örnekten geçiş yolu uzunluğu
(spektrofotometrede küvetin eni)
ℇλ; Belirlenmiş dalga boyu ve çözücü koşullarında 1 cm’lik
küvetteki saf emici materyalin 1M’lık solüsyonunun
absorbansı olarak ifade edilir. Birimi M-1 cm-1(mmol1cm2)’dir.
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltinin renginden
faydalanarak ölçme işlemine kolorimetri, bu tip ölçümde
kullanılan cihazlara da kolorimetre denir.
Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek çözeltinin rengi
değişik
konsantrasyonlardaki
standartların
rengiyle
karşılaştırılarak değerlendirilir.
Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya
çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine
fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre
denir.
Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da
ölçülebilir.
Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler
kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya
fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar
aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak
adlandırılırlar.
Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir standart
çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik dansite)
ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık
miktarı karşılaştırılır.
Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli
absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı
için yeşil dalga boyunda ( yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga
boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli
sıvı için mavi dalga boyunda) ışık seçilir.
Spektrofotometrelerde çözeltideki madde için uygun seçilen dalga
boyundaki ışığın örneğe ve standarda (bilinen konsantrasyondaki
çözelti) ait absorbansları veya optik dansiteleri (A, OD)
karşılaştırılıp matematiksel işlemler yapılarak örnekteki maddenin
konsantrasyonu bulunur.
İstenirse, çeşitli konsantrasyonlardaki standart çözeltilerin, belirli
uygun bir dalga boyunda ışık için absorbans değerleri bir köre
(absorbansı sıfır kabul edilen) karşı ayrı ayrı ölçülüp bir grafik
kağıdına konsantrasyonlara karşı işaretlenerek standart grafiği
çizilir. Örneğin absorbansı da aynı köre (absorbansı sıfır kabul
edilen) karşı ölçülür ve ölçülen absorbansa karşı gelen
konsantrasyon standart grafikten bulunur.
Spektrofotometre
• Optik tekniğe dayalı bu yöntem moleküler biyolojide en fazla
kullanılan yöntemdir.
• Seçilmiş dalga boyunda ışık oluşturup ışığı (küvette çözücü
içerisinde bulunan numune) örneğin içinden geçirerek
örnekten geçen ışığın şiddetini ölçer.
• Temel öğeleri; ışık kaynağı (çeşitli filtreler, ışığın geçtiği aralıklar
ve aynalardan oluşan), monokromatör, örneğin konulduğu
oda, algılayıcı (dedektör) ve kaydedici (yazıcı)’dır. Yeni
modelleri bilgisayar kontrollüdür.
Spektrofotometre
• Işık kaynağı; UV ışık bölgesindeki ölçümlerde 200-340 nm dalga
boyları arasında radyasyon oluşturan yüksek basınçlı hidrojen
ve döteryum lambası, görünür ışık bölgesi için 300-840 nm
dalga boyları arasında ışık veren tungsten halojen lamba
kullanılır (standart ölçüm için bir süre ısınması (yaklaşık 15 dk
önceden açılması) ve ölçüm arasında fazla zaman farkı yoksa
kapatılmaması gerekir).
• Monokromatik
(tek
dalga
boyunda) ışığın seçilmesi için özel
bir düzenek (monokramatör)
bulunur. Buradan çıkan ışık seçilen
dalga boyundaki ışığın çok
yükseltilmiş
şeklidir.
monokromatik
ışık
buradan
örneğin yetiştirildiği odaya girer.
Klasik tek ışık yollu spektrofotometre.
• Örnek Kapları (küvetler): Genellikle bir cm, geçirgenlik özelliği
yüksek cam, silika, kuartz veya plastik türevi malzemeden
yapılmış olabilir. Kare yada dikdörtgen prizma yapısında
borosilikat cam küvetler görünür bölge spekrumlarının
ölçülmesinde, bazı plastik hücreler ise hem görünür hem de
UV bölgede yeterli berraklık gösterirler fakat organik çözücü
tarafından lastiklerin etkilenebilir olması bazı problemlere de
yol açabilir. Küvetlerin temiz olması alkalen çözeltilerde uzun
süre bekletilmemesi hafif deterjanda asit, su ve etenol
karışımında (1: 3: 4 oranında) bekletilmeleri temizlik için en
uygun yöntemdir. Özellikle UV bölgede görülmeyen çizgiler ve
parmak izleri dahi ölçümleri olumsuz etkileyebilmektedir.
Küvetlerin optik geçirgenlik özellikleri
(a) Standart
(b) Küçük hacim std.
(a) Mikro
(b) Akışkan tip
• İçerisine tek küvet konulabilen odalar tek-ışınlı (single-beam),
aynı anda iki küvet konulanlar ise çift-ışınlı (double-beam)
olarak adlandırılır.
• Çift-ışınlı olanlarda, kontrol olarak kullanılan küvetteki
maddenin spektrumu analiz edilen örneğin spektrumundan
çıkartılarak gerçek absorpsiyon değeri işlem sırasında bulunur.
Örnekten geçen ışığın şiddeti
moleküller tarafınan emilen
ışığın miktarına bağlıdır. Bu
yoğunluk ışığa duyarlı bir
algılayıcı (detektör) tarafından
ölçülür. Detektör az miktardaki
ışık enerjisini algılar, onun
şiddetini artırır ve kaydedici
veya
yazıcı
tarafından
alınabilecek bir elektrik sinyali
biçimine dönüştürür.
Çift ışık yollu spektrofotometre
Spektrofotometre Kullanım Amaçları
• Bir solüsyondaki çözünmüş maddelerin derişimlerinin ve saflık
derecelerinin belirlenmesi
• Bilinmeyen biyomoleküllerin tanımlanması
• Biyokimyasal reaksiyonların kinetiğinin incelenemesi
• Makromolekül ligand etkileşimlerinin tanımlanması
• Çalışılan moleküllerin her dalga boyundaki emmenin ölçülerek
emme (absorbans) spektrumunun belirlenmesi
Spektrofotometre Çeşitleri
• Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi
• Raman spektroskopisi
• X ışınları Spektroskopisi
X ışınları absorpsiyonu, emisyonu, floresansı ve difraksiyonu ile
ilgilidir. İç kabuk elektronlarında değişmeler gözlenir. Yapı
analizleri ve kantitatif analizlerde kullanılır. XPS, Auger
Spektroskopisi, XRD
• UV-VIS Spektroskopi
• Fluoresans Spektrofotometrisi
• Nüklear Manyetik Rezonans Spektroskopisi
Kuvvetli bir manyetik alana konan bir molekülde manyetik çekirdeklerin radyo
frekansları absorplamasına dayanır. Özellikle organik yapı aydınlatılmasında kullanılır.
• Kütle Spektrometrisi
Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi
Atomik absorpsiyon spektrometri (AAS), elementlerin derişimlerini ölçen bir
tekli element tekniğidir. Temel durum atomları hava/asetilen veya azotoksit/asetilen alevi ile üretilmektedir. Ölçülen elemente özel kullanılan oyuklu
katot lambasından yayılan ışınım mevcut alevden geçirilerek parçalı katı hal
dedektör tarafından ölçülür. Analizi yapılacak örnek aleve gönderilir, örneğin
içinde ilgili element mevcutsa, lambadan gelen ışınımın absorplar ve böylece
ışınımın şiddeti azalır. Absorplanan ışınım miktarı örneğin içinde bulunan
elementin derişimiyle doğrudan bağlantılıdır.
Raman Spektroskopisi
Raman spektroskopisi, molekül ve kristal örgülerdeki bağlı atomların elektron
bulutlarının, gelen ışıkla etkileşerek titreşmesi sonucunda meydana gelen
Raman saçılma sürecine dayanmaktadır. Raman cihazı, katı, sıvı veya toz
şeklindeki organik ve inorganik madde ve malzemelerin makroskopik ve
mikroskobik karakterizasyonuna imkan vermektedir
XRD; X’Pert Pro X-ışınları kırınımı cihazı
özellikle ince filmlerin kristallinitesinin
incelenmesinde kullanılmaktadır. her bir
kristalin fazın kendine özgü atomik
dizilimlerine bağlı olarak X-ışınlarını
karakteristik bir düzen içerisinde kırması
esasına dayanır. Her bir kristalin faz için bu
kırınım profilleri bir nevi parmak izi gibi o
kristali tanımlar.
XPS
X-ışını fotoelektron spektroskopisi
(XPS), malzemenin yüzeyi ile ilgili
olarak atomik ve moleküler bilgi
sağlanması
amacıyla
kullanılan
sayısal bir analiz tekniğidir. Çekirdekseviyelerinin incelenmesi ve bunu
takiben
yayılan
çekirdek
fotoelektronların analiz edilmesiyle
numune yüzeyinin bileşimi ve
elektrostatik seviyesi hakkında bilgi
verir.
Ultraviyole-görünür Işık (UV-VIS) Absorpsiyonu
Spektrofotometrisi
• UV ve VIS bölgelerindeki ışık, moleküllerdeki değerlik
elektronlarını uyaracak yeterli enerjiye sahiptir. Işığın
yayılması, birbirlerine dikey durumda olan, bir
elektrik alanı bileşeni (E) ile bir manyetik alan
bileşenine (M) bağlıdır.
• Aşağıdaki eşitlikte tanımlanan ışığın dalga boyu (λ),
şeklinde gösterilen birbirine komşu iki tepe noktası
arasındaki uzaklığın karşılığıdır.
• λ=c/V
• C: ışık hızı
• V: frekans, birim zamanda belli bir noktadan geçen
dalga sayısı
UV-VIS Absorpsiyonu Spektrofotometrisi
• Işık, aynı zamanda enerji partiküllerinden (foton)
oluşan bir karaktere de sahiptir. Bu partiküllerle ilgili
enerji miktarı;
E=hv
h; Planck değişmezi (6.626x10-34 J.s)
Bir foton bir molekülle etkileşime girdiğinde saçılabilir
ya da molekülde uyarılmış bir durum yaratmak üzere
kendi enerjisini moleküle aktarılabilir.
UV-VIS Absorpsiyonu Spektrofotometrisi
1. Rayleigh saçılımı; foton bir molekülle çarpıştığı
ve frekansı değişmeden kırıldığı yada saçıldığı
zaman meydana gelir.
Işığın saçılması, makromolekülleri nitelendirmede
bazı yöntemlerin fiziksel temelini oluşturur.
Elektroforezin keşfinden önce mm’in molekül
ağırlığının ölçülmesinde faydalanılmıştır.
X ışını kırınımı, elektron mikroskobisi, lazer ışık
yayılımı ve nötron yayılımı gibi teknikler ışığın
saçılması sürecine dayanır.
UV-VIS Absorpsiyonu Spektrofotometrisi
• 2. Enerjinin bir fotondan bir moleküle aktarımı emilme
(absorpsiyon)’dir. Bir fotonun emilmesi için enerjisinin
molekülün iki enerji düzeyi arasındaki enerji farkına denk
olması gerekir.
• Moleküller bir seri enerji düzeyine sahiptirler. Elektron
değerliklerinin dağılımı bakımından farklı düzeylere geçmesi
ile gerçekleşen elektron geçişleri UV ve görünür ışık enerjileri
ile mümkündür (elektronların bir yörüngeden diğerine hareket
etmesini sağlar).
• Bir örnek tarafından emilen çeşitli dalga boylarındaki ışığın
ölçülmesiyle UV-VIS spektrumu elde edilir.
• UV-VIS ile görüntülenmesi, molekülün tanımlanmasına
(emme spektrumu ile) yardımcı olur. Zira emilen dalga boyları
atomların yerleşimine veya işlevsel gruplara bağlı olduğundan
spektrumda birden fazla noktada tepe oluşabilir. Oluşan en
yüksek tepe noktası (λmax) bilinmeyen moleküllerin
tanımlanmasında önem taşır.
Fluoresans Spektrofotometrisi
Fluoresans Spektrofotometrisi
1. UV Spek. da çözeltiye verilen ışık ile çözelti soğurduktan
sonra gecen ışığın dalga boylari aynıdır. Yani onemli olan
o dalga boyundaki ışığı ne kadar soğurduğudur.
2. Floresans Spek. de ise çözeltiye yollanan ışık ile
çözeltiden alinan isigin dalga boylari farklıdır. Çözelti ışığı
sogurur ve farklı dalga boyda her yöne doğru yayar. Bu
nedenle, UV Spek. de ışığın işledigi yol doğrusal iken,
floresans Spek. de ışığın yönü 90 derecedir. Yani çözelti
içinden geçip giden ışık ölçülmez de, çözeltinin farklı dalga
boyda yaydığı ışığın şiddeti ölçülür ve bunun için giren ile
çıkan ışığın açısı 90 derecedir.
Nüklear Manyetik Rezonans Spektroskopisi
(NMR)
• NMR; organik bileşiklerin
yapılarının belirlenmesinde
(özellikle
kovalent
bileşiklerin
yapılarının
aydınlatılmasında) kullanılan
en güçlü tekniktir.
• Kuvvetli bir manyetik alana
konan
bir
molekülde
manyetik çekirdeklerin radyo
frekansları absorplamasına
dayanır.
Kütle Spektrometrisi
• Maddeler moleküler düzeyde tartılır (özellikle molekül
ağırlıklarının tam olarak ölçümünde). Önceleri organik
kimya açısından önemli iken günümüzde biyolojik
moleküllerin analizinde (özellikle ortak çalışan cihazlar ve
bilgisayar desteği gibi yöntemlerin geliştirilmesi ile)
kullanılmaktadır.
• Nötr moleküller iyonlaştırılır ve pozitif olarak yüklenen
iyonlar bir elektrik ve/veya manyetik alandan geçerken
kütle/yük oranına göre (m/z) ayrılması esasına dayanır.
• 25 aminoasitlik veya daha kısa polipeptidlerin
dizilenmesinde de kullanılır. İyonizasyon hızlı atom
bombardımanı (FAB) ile sağlanarak kütle analizi birbirine
bağlantılı iki kütle spektrometresinde gerçekleştirilir.
GC-MS
Gaz kromatografisi/kütle
spektroskopisi, iki güçlü
analitik
tekniğin
kombinasyonudur.
• Gaz
kromatografisi,
karışımdaki bileşenleri
ayırır.
• Kütle spektroskopisi,
her
bir
bileşenin
yapısal
olarak
tanımlanmasında
yardımcı olur.
Çok düşük miktarlardaki
örneklerin tanımlanması,
güçlü yapısal analiz, hızlı
analiz süresi gibi önemli
avantajları bulunmaktadır.
RADYOİZOTOPLARIN KULLANIMI
• Radyoizotopların kullanımı; biyolojik süreçler hakkında
bilgilerin zenginleşmesini sağlamıştır. N.a ve proteinlerle
ilgili araştırmada yararlanılan pek çok yöntem
radyoizotopların kullanımına dayanır.
• Radyoizotoplarla işaretlenmiş makromolekül öncülleri
kullanılması ile kompleks bir karışımda özel veya çok az
bulunan bir molekül izlenebilir.
• Radyoizotopların kullanılmasındaki özellik, genellikle,
kullanılan elementin bir doku veya dokuların
biyokimyasına girmesidir.
Örneğin: Au, S karaciğer; Na, K, Br kan dokusuna ve hücre
metabolizmasına; Tc tiroit ve beyin, Hg böbrek
biyokimyasına girer. Bu bileşikleri izleyebilmek için
radyoizotopların biyokimyalarının bilinmeleri gereklidir.
RADYOİZOTOPLARIN KULLANIMI
• Radyoizotoplarla işaretlenmiş moleküller tamalayıcı
özellikte hazırlanarak moleküllerin saptanmasında
prob (sonda) olarak kullanılabilirler ve böylece
otoradyografi probla melezlenen molekülün pozisyon
ve/veya miktarının saptanmasına olanak verir.
• Analitik tekniklere göre 2 üstünlüğü vardır.
1. duyarlı aletlerin kullanımıyla çok az miktarlarda
(pikomol 10-12) radyoaktif materyal saptanabilir.
2. kimyasal olarak ayırt edilemeyen maddeler
arasındaki farklılıklar fiziksel olarak belirlenebilir.
Radyoaktivite Kökeni, Özellikleri ve Birimleri
• Radyoaktivite, kararsız izotopların kendiliğinden
çekirdek bozunumuna uğramasıyla oluşur. Örn; bir
protonda oluşmuş Hidrojen çekirdeği H11 ile gösterilir.
Hidrojen çekirdeğinin bir ve iki nötron içeren, sırasıyla
döteryum H21 ve trityum H31 izotoplarıda vardır. Proton
sayıları aynı nötron sayıları farklı bu izotoplardan trityum
radyoaktiftir.
• Bir çekirdeğin kararlılığı nötronların, protonlara
oranına bağlıdır. Bazı çekirdekler kararsızdır,
kendiliğinden parçalanır (bozunur) ve bu sırada
partikül yayılımı (emisyonu) meydana gelir. Bu tipteki
kararsız izotoplara Radyoizotop denir.
• 3 tip radyoizotop vardır (∝, β partikülleri ve y ışınları)
Radyoaktivite Kökeni, Özellikleri ve Birimleri
• Radyoizotoplar
kullanılarak
deney
tasarlanırken
yarılanma ömrü (yarı ömür=half-life t1/2) dikkate
alınmalıdır.
• Yarılanma ömrü bozunmaya uğrayacak bir örnekte
başlangıçtaki radyoaktiflerin atomların sayısının yarıya
inmesi için gereken süredir. Yö kısa bir radyoizotopun
kullanımı zordur. P32 en sık kullanılan izotoptur (t1/2=14
gün) .
• Temel radyoaktivite birimi Curie (Ci= dakikada 2.2x1012
bozunma hızında partiküller yayan radyoaktif materyal
miktarıdır. )’dir. Dakikada Mili (mCi, 2.2x109 dakika-1)
yada mikrocurie (µCi 2.2x106 dakika-1) ya da Becquerel
(saniyede bozunum 1 Ci= 3.7x1010Bq) en fazla kullanılan
birimlerdir.
Radyoaktivite birimi ve ölçümü
• Radyoaktivitenin ölçümünde aletin etkinlik oranı %
olarak radyoaktivitesi bilinen standart bir bileşiğin
sayımıyla ve saptanan aktivite değerinin (dakikadaki
sayım değerlerinin (cpm)) gerçek aktiviteye
(dakikadaki parçalanma) oranlanmasıyla bulunur.
• % etkinlik = standartın saptanan cpm değeri x 100
1µCi standartın dpm değeri
• % etkinlik = saptanan cpm x 100
2.2x106 dpm
Radyoizotop Uygulamaları
• Radyoizotop uygulamasıyla biyolojik materyallerin
yapısına girmiş olan radyoaktivitenin yerleşimi saptanabilir
ve/veya miktarı belirlenebilir.Moleküler biyolojide en fazla
yararlanılan β yayan radyoizotopların ölçümünde
kullanılan başlıca teknikler ışıma (scintillation) sayımı ve
Guiger-müller (gaz iyonizasyon odasının kullanımı)
sayımıdır.
• Yine
makromoleküllerle
yapılan
çalışmalarda
radyoziotopların nicel analizlerine ek olarak yerleşim
durumlarının belirlenmesi de önem taşır. Bu amaçlada
otoradyografi tekniği ile hücre ya da organellerdeki
rayoaktif bir maddenin (atom yada molekül) varlığı ve
yerleşimi saptanabilir.
Otoradyografi
• Bu yöntem radyoaktif bir materyalin doğrudan fotoğrafik
emülsiyonda saptanmasıdır.
• Öncelikle hücre yada molekül radyoizotopla işartelenir ve
fotoğraf filmiyle kaplanır. Materyaldeki radyoizotopların
yaymış oldukları radyasyon fotoğraf filmini etkileyerek
gümüş tuzu kristallerinden elektron atılmaına neden olur.
Bu elektronlar da + yüklü gümüş iyonlarını çekerek gümüş
atomlarının çökelmesini sağlarlar. Fotoğraf filminin
banyosu yapıldığında radyoaktif materyalin yerleşimi ve
miktarı hakkında bilgi alınmış olur.
• Otorayografik tarama ve radyoaktivite miktarını belirleme
amacıyla densitometrede kullanılır.Bu teknikte agaroz ve
poliakrilamid jellerde elektroforez yapıldıktan sonra
membrana aktarılmış ve biyomoleküllerle melezlenmiş
radyoaktif moleküllerin nitel ve/veya nicel olarak
değerlendirilmesinde de geniş çapta kullanılmaktadır.
İzotopik olmayan işaretlemeler
• Doğrudan işaretleme yöntemleri (kemogenik veya
kemoluminesan bir reaksiyonu katalizleyen enzimler vaya
floresan bir molekül olabilir)
• Dolaylı etiketler (ardışık belirleme için bir taq (fiş,etiket)
için kullanılan küçük moleküllerdir.) hapten, biotin gibi
• Floresan kısım doğrudan etiket olabilir yada bir substratı
ürüne dönüştüen enzimatik reaksiyonun sonucu olabilir.
• Kromogenik etiketler de genellikle enzimatik reaksiyon
sonucu bir renklenme oluşur. Altın partikülleri kromogenik
olarak kullanılarak ışık veya elektron mikroskobuyla
görüntülenebilir.
• Kemoluminesan bir substratın enzimatik reaksiyonla aktif
duruma geçmesini ve ışık yayarak bozunmasını kapsar.
Download