Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler
advertisement
Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler I. Genel Bakış • Canlı organizmalar yaşamları boyunca kendini idare edebilen ve kendini çoğaltabilen kimyasal sistemlerdir. Viroidler, virüsler gibi bazı ayrıcalıklı gruplar dışında tüm canlılar kimyasal maddelerin yoğun solüsyonlarıyla dolu ve küçük birimler olan hücrelerden oluşur. Buna göre, canlılık olayları hücreler içerisindeki biyolojik moleküllerin yapı ve işlevlerine bağlı olarak ortaya çıkar. • Bir hücrenin ağırlığının yaklaşık %99’u sadece dört çeşit element (C,H,N ve O) ile sınırlıdır. • Hücreyi oluşturan temel organik moleküller başlıca iki grupta toplanabilir: küçük moleküller hücrenin temel kimyasal yapı taşlarının sentezinde ve enerji elde edilmesinde kullanılırlar; küçük moleküllerin kovalent bağlarla bağlandığı polimerleri olan büyük moleküller ise biyolojik süreçlerin özgüllüğünden ve biyolojik bilginin transferinden sorumludurlar. • Küçük organik moleküllerin ağırlıkları 100-1000 arasında değişir ve 30 ya da daha fazla sayıda C atomu içerirler. Bunlar genellikle solüsyon içerisinde serbest durumda bulunurlar ve bunların bir kısmı daha sonra makromoleküllerin meydana geleceği bir ürün havuzu oluştururlar. • Küçük moleküller aynı zamanda, besin kaynaklarından türev edilen enerjiyi hücre tarafından kullanılabilecek biçime dönüştüren kimyasal reaksiyonların da temel aracılarıdır. • Küçük moleküllerin miktarı hücredeki toplam organik maddenin yaklaşık onda birini oluşturur ve aşağı yukarı bin kadar farklı çeşidi bulunur. Küçük moleküllerden sentezlenen tüm biyolojik makro moleküller yıkıldıklarında aynı basit moleküllere dönüşürler. • Hücrelerde küçük moleküllere ait başlıca dört temel aile vardır; basit şekerler, yağ asitleri, aminoasitler ve nükleotidler. Bu ailenin hepsi ortak kimyasal özellikleri olan çok farklı üyeleri içerirler. • Makromolekül; küçük molekül ağırlıklı alt birimlerin birbirine eklenmesi ile meydana gelen uzun ve zincir biçimde polimerdir. • Doğada milyonlarca farklı canlı türü bulunur. Bununla beraber canlılar hücre ve molekül düzeyinde araştırıldığında organizasyonda tek bir kalıp planı bulunduğu ortaya çıkar. Buna göre moleküler biyolojinin temel amacı; canlı formlarında hücre yapısını oluşturan moleküllerin yapısal ve işlevsel analizini yapmaktır. • Tüm organizmalarda hücreleri oluşturan temel moleküllerin yapı, çeşit ve oranları yaklaşık olarak aynıdır. Genelde her tür için aynı olan, C temelli küçük moleküllerin belirleyici ve sınırlayıcı bir serisinden oluşurlar. Hepsinde gerçekleştirilen biyokimyasal mekanizmalar aynıdır ve aynı genetik şifreyi paylaşırlar. • Moleküler biyolojideki hızlı gelişmeler, büyük ölçüde moleküllerin araştırılmasına olanak veren yeni yöntemlerin geliştirilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu yöntemler, temelde biyokimyasal ve biyofiziksel tekniklerin hücre ve dokulara uygulanmalarının sonucudur. Ayrıca son 25-30 yılın olağanüstü teknolojisi olan genetik mühendisliği (rekombinant DNA teknolojisi) nükleik asit ve protein moleküllerinin hücrelerden bol miktarda elde edilmelerine olanak vermesi nedeniyle bu moleküllerle yapılacak çalışmalara büyük kolaylıklar sağlamış ve moleküler biyolojideki bilgi birikiminin hız kazanmasına büyük ölçüde yardımcı olmuştur. Zaten moleküler biyolojide önceleri birbirinden ayrı olarak düşünülen biyokimya, hücre biyolojisi ve genetik gibi bilim dallarındaki gelişmeler ve bunların birbirine karışması sonucu ortaya çıkmıştır. • Moleküler biyolojideki araştırmalar büyük ölçüde saflaştırılmış moleküller ile yapılan analitik çalışmalara dayanmaktadır. • Çalışılacak biyolojik molekül grubunun yalıtımı (izolasyonu) amacıyla gerçekleştirilen işlemlere özütleme (ekstraksiyon) adı verilir. • Özütleme; parçalama, ayırma ve saflaştırma aşamalardan oluşur. Daha sonra tam ya da saflaştırılmış (nükleik asitler, proteinler gibi) moleküllerin yapısal ve işlevsel analizlerine yöntemler uygulanır. ardışık kısmen makro yönelik 1.1. Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri • Bu aşamada, çalışılacak molekül grubunu (nükleik asit ya da protein) içeren doku ve ya hücrelerin çeper ve zar yapıları parçalanıp yok edilir. Elde edilen karışıma homojenat adı verilir. • Hücre yapısı ortadan kalkmış olan homojenatta, serbest ya da organeller içerisindeki hücre bileşenleri (membran parçaları ve bir miktarda parçalanmamış hücrelerle birlikte) parçalamanın yapıldığı ortamda dağılmış bir süspansiyon halinde bulunurlar. 1.1. Parçalama (Homojenizasyon) Yöntemleri • Hücreleri parçalayarak fraksiyonlarına ayırma yöntemleri temelde hücre sınırlarının çeşitli fiziksel ya da kimyasal tekniklerle yok edilmesini kapsar. Hücre elemanlarının işlevlerini kaybetmeden parçalama sağlayan çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bir dokudaki farklı hücre tiplerini birbirinden ayırmak mümkün olduğu gibi, hücrelerde işlevleri bozulmadan organellerine ve makromoleküllerine ayrılabilir. Eğer dikkatli bir uygulama yapılırsa nukleus, mitokondri, kloroplast gibi organeller oldukça sağlam durumda kalabilirler. 1.1.1. Fiziksel Yöntemler Mekanik İşlemler • Bu tip tekniklerin en basit ve ilkel şekli materyali bir havan içinde kumla öğütmektir. Ezerek parçalama daha gelişmiş şekilde, doku ve ya hücrelerin sıvı azotta (-196°C) ya da (-20) - (-70) ºC’da dondurulduktan sonra soğuk havanlarda yapılır. Donma sonucu kristal hale geçen yapılar toz haline gelene kadar kolaylıkla parçalanabilmektedir. İşlemin çözünme olmadan kısa sürede bitirilmesi gerekmektedir. Ezme sırasında alümina (Parlatmalarda, aşındırıcı olarak kullanılan alüminyum oksit.), kum ya da cam tozu katılacak olursa parçalama etkinliği artar. Mekanik İşlemler • Günümüzde mekanik olarak parçalamada daha çok homojenizatör adı verilen aletler kullanılmaktadır. Çeşitli tipte homojenizatörler geliştirilmiştir. • Karıştırıcı tipinde olanlar (waring blender) evlerde kullanılanların daha güçlü olanlarıdır. (“waring blender”) Mekanik İşlemler • Metal ya da camdan yapılmış özel bir kap içinde bulunan, yüksek hızda dönen bıçaklar yardımıyla biyolojik materyaller kesilerek parçalanır. Bu tip aletler daha çok hayvan ve bitki doku veya organlarının parçalanması için kullanılmakta olup bakteri gibi küçük boyuttaki organizmalar için uygun değildir. • Milli homojenizatörler (“ultra turrax”) ucunda özel dişleri bulunan metal bir milin çok yüksek devirde dönmesiyle parçalama yapar. (“ultra turrax”) • Pistonlu homojenizatörler ise, basınç etkisiyle parçalama yapan ve ucunda genellikle teflondan yapılmış bir pistonu bulunan aletlerdir. Özellikle yumuşak dokuların parçalanmasında çok etkindir. (Pistonlu homojenizatör) • Basınç yardımıyla parçalama yapan diğer bir homojenizatör; Fransız basınç hücresidir. Çelik bir kap, piston ve silindir üzerindeki basıncın giderilmesi için kullanılan bir vanadan oluşur. (“French Press”) • Balistik homojenizatörlerde dayanıklı cam veya metal bir kap içine konulan hücre süspansiyonu çalkalanır. Bu yöntem özellikle diğer parçalama yöntemlerine dirençli mikroorganizmaların (örneğin kok biçimindeki bakteriler, mayalar gibi) parçalanmasında kullanılır. (Balistik homojenizatör) Ultrasonikasyon • İnsanın duyma sınırının üzerindeki frekanslarda (18kHz üstü) ses dalgaları (ultrases, ultrason) sıvı bir ortamdaki hücrelere uygulandığında parçalanmaya yol açar. Bu uygulama süspansiyondaki su moleküllerinin kinetik enerjilerini arttırır; basınç farkları çok fazla sayıda mikro hava kabarcığının oluşumuna yol açar. Bu kabarcıklar hızla hareket edip ve bir süre sonra patlayarak yoğun şok dalgaları yaratırlar. Patlama sırasında ses enerjisinin mekanik parçalama enerjisine dönüşümüyle ortamdaki hücreler (özellikle bakteri hücreleri) parçalanır. Ozmatik Şok • Hücrelerin yüksek ozmatik basınçlı bir çözeltiden hipotonik bir ortama geçirilmesi durumunda, suyun hücrelerin içine girmesi zarlarda patlamaya yol açar. Bu yöntem hücre duvarı bulunmayan ya da yok edilmiş hücreler için uygundur. Dondurma-çözme • Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde (örneğin, -20°C) tutulup sonra yeniden ısıtılarak çözündürülmesi ve bu işlemin birkaç kez tekrarlanması parçalanmaya yol açar. İşlemin temelli, donan su moleküllerinin hacminin genişlemesi ve hücrelerde oluşan buz kristallerinin hücre zarına zarar vererek parçalanmayı sağlamasıdır. 1.1.2 Kimyasal Yöntemler Çözücülerin Kullanılması • Bu uygulamaların prensibi: hücre zarındaki bileşiklerin çözündüğü uygun çözücü (solvent) yardımıyla zar yapısının eritilmesidir. Bu amaçla kullanılan; • Organik çözücüler (örn, etil asetat, toluen vb) zardaki lipitler çözerek yapıyı bozarlar. • Deterjanlar (sodyum dodesil sülfat) ise uygun pH koşullarında zardaki protein ve lipoproteinlerle etkileşime girerek onları uzaklaştırır. • Bazik çözeltiler (pH 11-12,5) ise hücre duvarının hidrolizini sağlar. Enzimlerin Kullanılması • Lizozim: bakterilerin peptidoglikan tabakasındaki β-1,4-glikozidik bağları hidroliz etmektedir. Bu enzim, özellikle Gram (+) bakteriler üzerine etkilidir. • Gram(-) bakterilerin parçalanması için hücrelerin bir süre EDTA uygulamasında tutulması gerekir. EDTA, lipopolisakkarit moleküllerini birbirine bağlayan Ca+² iyonlarının ortamdan çekilmesini sağlamakta ve böylece lizozim içteki peptidoglikan tabakasına ulaşmasını kolaylaştırmaktadır. • Ayrıca, tripsin, proteinaz K, gibi proteazlar ve zimoliyaz da (maya hücreleri için) bu amaçla kullanılan enzimlerdir. • Enzimatik parçalama genelde mekanik parçalamaya dayanıklı yapılar için uygulanmaktadır. Kullanılacak parçalama yöntemi; - Amaçlanan çalışmaya, - Kullanılan biyolojik materyalin tipine(organizma, doku veya hücre tipine) - İzole edilecek molekül grubuna, - Eldeki olanak ve kabul edilebilir etkinliğe bağlıdır. Böylece ya tek bir yöntem yada fiziksel ve kimyasal işlemlerden karma olarak yararlanılabilir. Ayırma (Seperasyon), Saflaştırma (Pürifikasyon) Ve Analiz Yöntemleri Parçalamadan Sonra Uygulanacak Yöntemler; • Ayırma (Seperasyon): Çalışılacak molekül grubunun homojenattaki diğer moleküllerden ayırma • Saflaştırma (Pürifikasyon): Homojenattan çalışılacak molekülün saf olarak elde edilmesi • Ham Özüt (Crude Extract): Homojenattaki zar parçalarını, parçalanmamış doku veya hücreleri uzaklaştırmak amacıyla uygulanan ön ayırma işleminden sonra elde edilen ve çalışılacak molekülle birlikte birçok molekülüde içeren karışımdır. Ayırma, Saflaştırma ve Analiz Yöntemleri • Ham özüt ya direkt olarak kullanılabilir yada çalışılacak molekül, hedeflenen saflık derecesine göre uygulanılan yöntemlerle ham özütteki diğer moleküllerden ayrılır. • Bu yöntemler, karışımdaki; - molekül gruplarının çözünme özellikleri yada - kitle, yoğunluk, elektriksel yük gibi fiziksel karakterlerine veya da - diğer moleküllere afinitesine göre birbirlerinden ayrılmasını sağlayan işlemlerdir. Bu tekniklere HAZIRLAYICI (PREPARATİVE) TEKNİKLER de denir. Ayırma, Saflaştırma ve Analiz Yöntemleri • Ayırma, saflaştırma işlemlerinden sonra üzerinde çalışılan molekülün kalitatif veya kantitatif analizi (örn miktar tayini, alt tiplerinin saptanması, yapısal analiz, aktivite belirlenmesi gibi) yapılabilir. Bu amaçla kullanılan tekniklere de ANALİTİK TEKNİKLER denilir. • Bir makromolekülün homojenattan ayrılması, saflaştırılması ve analizi için kullanılan teknikler basitten karmaşığa doğru sıralanabilir. 1. Süzme (Filtrasyon) • Homojenatın filtre edici bir materyalden geçirilerek, süspansiyonda bulunan partiküllerin sıvı kısımdan ayrılmasıdır. • Bu yolla, kullanılan filtre edici materyalin gözeneklerinin çapına göre, filtreden geçen kısımda belli büyüklükte partikül bulunabileceği gibi bunların tamamı da filtrenin üzerinde kalabilir. 1. Süzme (Filtrasyon) En çok kullanılan filtre edici materyaller filtre kağıdı, sinterli cam huni ve zar (membran) filtrelerdir. Kullanılan sisteme vakum veya basınç uygulanarak süzme işlemi hızlandırılabilir. Filtre kağıtları • Süzme işleminde geniş çapta kullanılır. Homojen por çapına sahip olmayan kaba filtre kağıtlarından, çok duyarlı ayırım yapan çeşitli boyutlara kadar farklı amaca uygun tipleri vardır. Membran Filtreler • Çok küçük gözenekleri olan polimer yapıdaki filtrelerdir. • Biyolojik olarak eylemsiz(inert) ve çoğunlukla saf selüloz esterlerinden yapılırlar. • Por çapları 0.25-150 nm arasında değişebilir. • Akışkanlık değerine, ilgilenilen molekülün özelliğine ve ağırlığına göre seçim yapılabilir. Membran Filtrelerin Kullanım Amaçları; • Mikrometre boyutundaki partikülleri ortadan kaldırarak solüsyonların bulanıklığını yok etmek • Otoklavlanamayan solüsyonların sterilizasyonunu sağlamak • Çok az miktardaki örnekleri (özellikle radyoaktif çökeltileri) toplamak • Biyomolekülleri (pr,na) içeren solüsyonları konsantre etmek • Tamponlardaki ve diğer solüsyonlardaki tuz vb küçük molekülleri yok etmektir. Ultrafiltrasyon • Membran filtrelerle yapılır ve moleküllerin boyut, biçim ve/veya yüklerine göre ayrılmaları sağlanır. • Ayırımı yapılacak molekülleri içeren solüsyon dışarıdan oluşturulan kuvvetle yarı geçirgen zardan geçmeye zorlanır. • Filtrelerden sıvının geçişini sağlamak için emme, basınç ya da santrifüj kuvveti gerekir. • Kullanılan porların çapları 1-20 nm arasında değişir. Zarın por çapı çalışılacak molekülün geçişine izin vermeyecek boyutta seçilmelidir. • NMWC (Nominal Molecular Weight Cut-Off); Zarlara özgü bir değerdir. NMWC değeri zardan geçemeyen bir molekülün ağırlığına eşdeğerdir. Ultrafiltrasyonda kullanılan NMWC değeri genelde 100-1.000.000 arasında değişir. Bu filtrelerin genellikle iki tabakalı olanları kullanılır; birinci tabaka yüzeyde bulunan ince (0.1-0.5µm), selüloz asetat, naylon veya polivinilidinden yapılmış bir zar, ikinci tabaka daha kalın, inert bir destek tabanıdır. Bu tip filtreler partiküllerin yüzeyde kalmasını sağlar. • Kısaca çalışma prensibi, filtre tarafından partikül veya moleküllerin fiziksel yakalanması sonucu ayrılmalarına dayanır. Ultrafiltrasyon • Özütleme ve çeşitli saflaştırma aşamalarında elde edilen nükleik asit ve protein solüsyonları daha sonraki aşamalar için genellikle fazla seyreltiktir. • Çözücünün yüksek sıcaklıkta uçurulması yoluyla konsantre edilemedikleri için, bu tip çözeltilerin hacimlerini azaltmakta genellikle ultrafiltrasyondan veya liyofilizasyondan yararlanılır. • Her iki yöntemde nazik ve oldukça etkili yöntemlerdir. 2. Diyaliz • Biyolojik moleküllerin ayırımında kullanılan en eski yöntemlerinden biridir. • Bu teknik seyreltik bir çözeltideki moleküllerin boyutlarına göre ayrılması temeline dayanır. • Tekniğin uygulaması değişik büyüklüklerdeki molekülleri içeren çözeltinin, makromolekülleri geçirmeyen fakat su vb. küçük moleküllerin geçişine izin veren, yarı geçirgen bir zardan yapılmış diyaliz tüpüne konulup düşük iyonik kuvvette uygun bir tampona (veya saf suya) daldırılması şeklinde gerçekleştirilir. • Zarların porları genellikle molekül ağırlığı 10.000’den fazla olan makromoleküllerin geçişine izin vermeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle, diyaliz tüpünün içindeki su(ve küçük iyonlar) dışarı çıkarken içeride ayırımı istenen molekülün konsantre bir çözeltisi kalır. Küçük moleküllerin çıkışı tüpün içi ile dıştaki tamponun konsantrasyonları eşit oluncaya kadar devam eder. Dengeye, çalışılan hacme bağlı olmak kaydıyla genellikle 4-6h’de ulaşılır. Dengeye ulaşıldıktan sonra, eğer dışarıdaki solüsyon taze tamponla yenilenince diyalizin devam etmesiyle tüpün içindeki küçük moleküllerin konsantrasyonundaki azalma devam eder. Böylece istenilen ayırım yapılıncaya kadar diyaliz 1-2 gün sürdürülebilir. • Diyaliz için kullanılan yarı geçirgen zarlar (diyaliz tüpleri) çeşitli materyallerden(kollodyon, sellofon, selüloz gibi) yapılmış, 1-20 nm por çapına sahip malzemelerdir. Por çapı zardan geçecek moleküllerin büyüklüğünü belirler. NMWC değeri 15.000-20.000 arasında olan tipleri geniş çapta kullanılmaktadır. • Diyaliz, iyonik olan ve olmayan, tüm küçük molekülleri yok etmek ve çözeltileri konsantre etmek için basit, ucuz ve etkin bir yöntemdir. Genellikle solüsyonlardaki tuzları ve küçük molekülleri ortamdan uzaklaştırmakta kullanılır. Ayrıca biyolojik moleküllere zayıf şekilde bağlı küçük iyonlar ve molekülleri (NAD, FAD gibi kofaktörler veya metal iyonları) de bu yöntemle ortadan kaldırmak mümkündür. 3. Liyofilizasyon (Dondurarak Kurutma) Liyofilizasyon, donmuş durumdaki bir çözücünün vakum altında doğrudan gaz haline geçmesini (buharlaşmasını) sağlayan süblimasyon temeline dayalı bir dondurma tekniğidir. Genellikle, yüksek ısıya duyarlı materyallerin kurutulması ya da konsantre edilmesi için en etkin yöntemlerden biridir. Biyolojik materyallerin saklanma ve taşınmasında sağladığı kolaylıktan dolayı oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Liyofilizasyon Uygulaması • Dondurma işlemi için, örnekle yarıya kadar doldurulmuş kap kuru buz-aseton banyosuna yerleştirilerek 45 açı yapacak pozisyonda tutularak yavaşça döndürülür. • Sulu çözelti kabın çeperinde tabakalar halinde donar; buda suyun buharlaşması için geniş bir yüzey sağlar. Kap daha sonra soğutma ünitesi ve bir vakum pompasından oluşan liyofilizatöre bağlanır. • Biyolojik materyalin stabilitesini korumak amacıyla, 40ºC civarında tutulan örneğe yaklaşık 5-25 mm Hg vakum uygulaması yapılır. Sulu çözeltiden oluşan buz süblimasyona uğrar. Böylece uçucu olan tüm materyal ortamdan uzaklaşırken, uçucu olmayanlar (pr, n.a) konsantre halde bazende tüysü şekilde çökelirler. Avantaj-Dezavantajları • Biyolojik materyallerin saklanma ve taşınmasında sağladığı kolaylıktan dolayı oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. • Bu şekilde dondurularak kurutulan örnekler çok uzun süre stabil halde kalabilir ve yıllarca canlılıklarını korurlar. Sıvı ortama alındıklarında yeniden çözünürler. • Liyofilizasyonun sadece sulu çözeltiler için uygun olması bu tekniğin kullanımında bazı kısıtlamalara yol açar. • Organik çözücüler sulu çözeltilerin erime (melting) noktasını düşürür ve örneğin erime olasılığını artırarak işlem esnasında denatürasyona yol açar. Yine organik buharların vakum pompası içerisine girerek zarar vermeleri tehlikesi de vardır. Vakum altında santrifüjleme • Pek çok biyolojik örneğin kurutulmasında kullanılır. • Öncelikle örnek organik bir çözücüde veya suda çözündürülür. Çözücüde santrifüjde vakum altında uçurulur ve örneğin tüpün dip kısmında çökelmesi sağlanır. • Hızlı olması, ön dondurma işlemine gerek olmaması, örneğin tamamen kazanılması ve sudan başka çözücülerin de kullanılabilmesi bakımından dondurarak kurutmadan daha kullanışlıdır. 4. Çöktürme • Su veya başka bir çözücü içeren bir ortamda istenilen yada istenmeyen moleküllerin çöktürülerek katı halde ayrılması temeline göre yapılır. • Amonyum ve sodyum sülfat, proteinleri çöktürmede oldukça yaygın kullanılan anorganik tuzlardır. • İzoproponal, etanol da genellikle nükleik asitleri çöktürmede kullanılır. 5. Enzim Uygulaması • Ayırma işlemi enzim uygulaması ile yapılır. • Örn: Proteinlerin proteazlarla, nükleik asitlerin de nükleazlarla parçalanarak ortamdan uzaklaştırılması mümkündür. 6. Santrifüjleme • Bu teknik, Santrifüj adı verilen aletler yardımıyla, yüksek hızda döndürülerek merkezkaç kuvveti oluşturulan bir alanda partiküllerin davranışı temeline dayanır. Santrifüjleme sonunda Üst faz (sıvı faz) “süpernatant” Alt faz (çökelti) “pellet” “Santrifüj kuvveti” • Makromolekül halindeki bir partikül veya bir hücre organeli yüksek hızda döndürüldüğünde bir santrifüj kuvvetinin etkisinde kalır. • F = m x 2 x r F = sanrifüj kuvvetinin derecesi m = çöken partikülün kütlesi = açısal hız r = partikülün dönüm eksenine uzaklığı Göreceli (Rölatif) Santrifüj Kuvveti (RCF) • Çökelen bir partikül üzerindeki kuvvet, dönüm hızı ve partikülün dönüm eksenine uzaklığı ile artar. F değerinin, yerçekimi kuvvetiyle (g) ilgili olarak, daha genel bir ifade Göreceli (Rölatif) Santrifüj Kuvveti (RCF) ‘dir. RCF değeri: RCF = 1.118 x 10-5 x rpm2 x r rpm = örneğin dakikadaki dönüm sayısı (devir/dakika) r = çökelen partikülün dönüm eksenine uzaklığı (cm) Santrifüjleme • Genellikle ortalama RCF’nin hesaplanmasında, santrifüj tüpünün tepesi ile dibi arasındaki uzaklığın ortasındaki rort değeri kullanılır. • RCF, sayısal bağıntı çizelgesinden (nomogram) yararlanılarak da kolaylıkla saptanabilir. • RCF değeri, x g olarak gösterilir. RCF hesaplama • Örn; 20.000 devir/dakikada ortalama r değeri 7cm. ise, RCF=32.000xg Resim A : RCF değerinin, çökelen partiküllerin dönüm eksenine olan uzaklıkları r ile değişimi Resim B :RCF tayini için sayısal bağlantı çizelgesi. Santrifüjleme • Santrifüjleme temelde biyolojik materyain hazırlanmasında, moleküllerin yalıtımı ve saflaştırılmasında kullanılan etkin bir teknik olduğu gibi saflaştırılmış moleküllerin hidrodinamik özelliklerinin (biçim, boyut, yoğunluk vb) analitik olarak ölçülmesinde de oldukça kullanışlıdır. • Temelde dönmeyi sağlayan bir motor ile tüplerin konduğu bir rotor’dan oluşur. Düşük devirliden karmaşık donanıma sahip ve analitik işlemler de yapabilen pek çok santrifüj tipi geliştirilmiştir. Düşük Hızlı Santrifüjler • Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde düşük hızlı (devirli) santrifüjlerin en yüksek hızları 4.000-5.000 devir/dakikadır (3000xg). • Bu aletler genelde oda sıcaklığında çalışırlar ve sıcaklık kontrolleri yoktur. • Rotorları, sabit açılı (“fixed angle”) veya açılan kova (“swinging bucket”) tipindedir. Düşük Hızlı Santrifüjler • Genellikle 12 veya 50 ml’lik santrifüj tüpleri kullanılır. • Daha çok sıvı besi ortamları ya da süspansiyonlardaki hücrelerin hızlı şekilde çöktürülmesinde yararlanılır. • Santrifüjleme sonunda tüpün dibinde hücreleri içeren bir çökelti (pellet) oluşur; çökeltinin üstündeki üst sıvı (supernatant) dökülerek uzaklaştırılır. Düşük Hızlı Santrifüjler • Oldukça ağır partiküllerin çökelmesinde kullanılır. • En yüksek hızları 4.000-5.000 dev/dak’ dır. • Genellikle oda sıcaklığında çalışırlar, sıcaklık kontrolleri yoktur. Yüksek Hızlı Santrifüjler • Daha duyarlı uygulamalar için, yüksek devirli ve ısı kontrollü santrifüjler gereklidir. • Sıcaklığı (4 °C civarında ) ve hızın kontrol altında tutulması, özellikle yüksek sıcağa duyarlı biyolojik materyalin santrifüjlenmesi sırasında önemlidir. • Yüksek hızda santrifüjleme de başlıca 3 tip rötor kullanılır: 1. Sabit açılı 2. Açılan kova 3. Dikey rötorlar Rotor Çeşitleri Sabit açılı rotor Açılan kova Dikey Yüksek Hızlı Santrifüjler • Günümüzde rotorlar daha çok karbon-fiber karışımı malzemelerden imal edilmektedir. • Bunlar hafif olduklarından hızlanma ve durma süreleri kısadır. • Bu santrifüjler içinde en çok kullanılan orta hızda dönüm yapan mikrosantrifüjlerdir. • Maksimum hızları genellikle 12.000-15.000 rpm’dir.(11.000-12.000xg) Yüksek Hızlı Santrifüjler • Biyolojik örneklerin hazırlanmasında orta ya da yüksek hızlı santrifüjlerin kullanımı gereklidir. • Bu santrifüjlerde, parçalama sürecinden sonra hücresel atıklar yok edilebildiği gibi hücre organelleri (nukleus, mitokondri, kloroplast gibi) ve kimyasal uygulamalar sonrasında makromoleküller (nükleik asit, proteinlerv.b.) çöktürülebilir. Ultrasantrifüjler • En karmaşık yapılı olan santrifüjlerdir. • Ultrasantrifüjlerle çok yüksek devirlere ulaşılabilmesi nedeniyle rotorda yüksek derecede ısı artışı oluşacağından çalışma sırasında cihazın içinin soğutulması ve sürtünmenin engellenmesi için yüksek vakumda tutulması gerekir. • Metal rotorların yüksek basınç etkisiyle nadir de olsa parçalanma tehlikesi olduğundan aletin içi çelik tabaka ile kaplıdır. Ultrasantrifüjler • Hücre bileşenlerinin ayrılmasında (organel veya moleküllerin) • Saflaştırılmış moleküllerin analitik ölçümlerinin yapılmasında kullanılır. Örneğin; saflık derecesi, molekül ağırlığı, yoğunluğu, biçimi, bileşenlerin özellikleri ve oranların belirlenmesi gibi. Santrifüjleme Uygulamaları Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi • Üzerinde çalışılan örneğin ilk aşamada belli bir süre uygun hızda döndürülmesiyle elde edilen iki ayrı fazda (çökelti ve üst sıvı) preparatif amaçlı olarak daha ileri düzeyde ayırım yapmak üzere hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi kullanılır. • Bu santrifüjlemede, kaba çökeltilerden hücre organellerine ve makromoleküllere kadar farklı boyuttaki partiküller birbirinden ayrılır. Santrifüjleme Uygulamaları Hıza bağlı çökelme santrifüjlemesi • Bu temele dayalı olarak hücre bileşenlerinin daha özgül biçimde ayrılmasını sağlamak üzere farklılığa bağlı (differantial) santrifüjleme geliştirilmiştir. • Bu yöntemde giderek artan hızlarda ardışık santrifüjleme uygulanır. • Santrifüjlemenin başında, tüm partiküller homojen şekilde dağılmıştır. • İşlem devam ederken partiküller sedimentasyon derecelerine göre çökerler. Santrifüjleme Uygulamaları Diferansiyel santrifüjleme • Diferansiyel santrifüjleme kullanılarak partiküllerin çökelme hızını ifade eden çökelme katsayıları(s) hesaplanabilir. • Birimi saniye olan s terimi genellikle standart koşullarda, 200C’ de ortam olarak su kullanarak yapılır. • S değeri, biyolojik makromolekülleri ve hücre organellerini sınıflandırmada kullanılan bir özelliktir. Bir molekülün ya da organelin boyutunu (molekül ağırlığı, baz çifti v.b.) hesaplamakta kullanılır. Santrifüjleme Uygulamaları • Çökelme katsayıları 1x10-13-10.000x10-13 arasında değişir. • Sayısal açıdan kolaylık sağlamak için çökelme katsayıları Svedberg birimi(S) ile ifade edilir. • 1S= 1x10-13 saniyedir. Santrifüjleme Uygulamaları Yoğunluk derecelemesi santrifüjleme (density gradient ) • Örnek yoğunluk tüpün tepesinden dibine doğru giderek artan akışkan bir ortamda santrifüjlenir. • Differansiyel santrifüjlemeden farklı olarak, bu yöntemde değişik boyuttaki partiküllerin tek bir santrifüjleme ile ayrılması mümkün olur. Santrifüjleme Uygulamaları Yoğunluk derecelemesi santrifüjleme( density gradient ) • Bu yöntem biyolojik makromoleküllerin ayrılması ve saflaştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. • Bu yöntemle s ölçümü de yapılabilir. • Özellikle nükleik asitler bu yöntemlerin kullanılmasıyla ayrıntılı şekilde araştırılabilmektedir. • DNA ve RNA s değerlerine göre sınıflandırılabilir ve DNA’nın farklı yapısal biçimleri ayırt edilebilir. • Bu yöntem ayrıca, ribozom, mitokondri, kloroplast gibi hücre bileşenlerinin izolasyonu ve saflaştırılmasında da kullanılmaktadır. Yoğunluk derecelemesi santriifüjleme (density gradient) Yoğunluk derecelenmesinde başlıca iki yöntem kullanılır: 1. Hız-bölgesel (rate-zonal) santrifüjleme • İşlemden önce, otomatik derecelenme karıştırıcısı yardımıyla, sakkaroz veya gliserol gibi küçük molekül ağırlıklı solüsyonlarla bir yoğunluk derecelenmesi hazırlanır. • Örnek derecelenme tabakasının tepesine yayılır ve tüpler açılan kova tipindeki rotora yerleştirilir. • İşlem sırasında partiküller s değeriyle bağlantılı bir hızda hareket ederler. Yoğunluk derecenlemesi santriifüjleme (density gradient ) 1. Hız-bölgesel (rate-zonal) santrifüjleme • Partiküller bölgeler (zonlar) halinde çökerler ve birbirlerinden ayrılmış olarak kalırlar. • İşlem partiküller tüpün dibine ulaşmadan sona erdirilir. • Tüpteki değişik bölgeler ayrı ayrı toplanır. Yoğunluk derecenlemesi santrifüjleme( density gradient ) 2. Eşit yoğunluk (Isopycnic) santrifüjleme • Bu yöntemde yoğunluk derecelenmesi işlem sırasında oluşur. • Ayırımı yapılacak olan molekülü içeren karışım, sezyum klorür veya sezyum sülfat gibi ağır metal tuzu çözeltisi içinde çözülür • Ultrasantrifüj tüpüne doldurulur ve santrifüjlenir. 1.2.7. Kromatografi • Kromatografi, katı veya sıvı bir durağan (stationary) fazın yüzeyine veya içine uygulanmış bir karışımdaki moleküllerin, sıvı veya gaz halindeki bir hareketli faz aracılığıyla hareket ederken birbirlerinden ayrılmaları temeline dayanmaktadır. Bu ayrılmaya yol açan etkenler, moleküllerin tutunma (adsoption), dağılma(partition), iyon değişimi, ilgi (afinite) özellikleri ya da molekül ağırlıklarındaki farklılıklardır. Bu farklılıklar nedeniyle karışımdaki bileşenlerden bazıları durağan fazda daha uzun süre kalırlar ve kromatografi sistemindeki hareketleri yavaş olur. Diğerleri ise hareketli faza daha çabuk geçer ve sistemden daha hızlı ayrılır. Kromatografi • Kromatografi, bir karışımdaki çeşitli maddeleri, maddelerin özelliklerindeki farklılıklara dayalı olarak ayıran analitik tekniktir. Polarite, çözünürlük, affinite (ilgi) iyonik güç ve/veya çap farklılıklarına bağlı olarak karışımdaki maddeler ayrılabilir. • Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılır. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi yönteminin kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmektedir. • Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket edebilmeleridir. Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır. 1. Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. 2. Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. 3. Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini oluştururlar. • Kromatografi yöntemleri, çözünen moleküllerin durağan faza bağlanma veya onunla etkileşime girme biçimine göre iki tipe ayrılır. • Dağılım (partition) kromatografisi çözünen materyalin iki sıvı faz arasındaki dağılımına dayanır. Uygulamada doğrudan iki sıvı kullanılabildiği gibi, (ince tabaka ve gaz-sıvı kromatografilerinde) sıvılardan biri katı bir destek (matris,matriks) üzerinde sabitleştirilmiş olabilir. Araştırılan örneğin bileşenlerinin iki faz arasındaki dağılımı temelde onların çözünürlük farklarından kaynaklanır. • Tutunma (adsorbsiyon) kromatografisinde, örnekteki moleküller için sınırlı sayıda özgül bağlanma yerleri içeren (iyon değiştirici reçine gibi) bir durağan faz ya da destek bulunur. Bu kromatografi tipi moleküller ile durağan fazın yüzeyindeki bağlanma yerleri arasındaki özgül etkileşimlere dayanır. Moleküllerle destek arasındaki çekim kuvvetleri iyonik, hidrojen bağları oluşumu veya hidrofobik etkileşimler olabilir ve bu reaksiyonlar geri dönüşümlüdür. Adsorpsiyon (Tutunma) Kromatografisi • Sabit faz bir "katı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "yüzey tutunması (adsorpsiyon)" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı polaritelere (kutuplaşmalara) sahip maddelerin, farklı derecelerde yüzey tutunması göstermeleri doğaldır. Buna bağlı olarak, hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "adsorpsiyon kromatografisi" genel adı ile anılırlar. • Tutunmaya dayalı olanlar (örneğin iyon değişimi kromatografisi) nükleik asitler ve proteinler gibi makromoleküllerin ayırımında daha etkindir. Dağılım Kromatografisi • Sabit faz bir "sıvı" ise, karışımdaki maddelerle sabit faz arasında "çözünme" etkileşimi gerçekleşir. Bu durumda farklı maddelerin, sabit ve hareketli fazlarda farklı çözünürlüklere sahip olmaları söz konusudur. Yani farklı maddelerin iki faz arasındaki dağılımları ön plana geçmektedir. Buna bağlı olarak hareketli faz yardımı ile sabit faz üzerinden geçiş hızlarının da farklı olmaları beklenir. Bu tür etkileşim gösteren kromatografik yöntemlerin tümü "dağılım kromatografisi" genel adı ile anılırlar. • Dağılım esasına dayalı kromatografi yöntemleri özellikle aminoasitler, karbonhidratlar ve yağ asitleri gibi küçük moleküllerin ayrımı ve tanımlanmasında çok etkindir. İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903) tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi; bitki pigmentlerinin (klorofil A, klorofil B ve ksantofil) renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bantlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi (renkli yazmak) adını vermiştir. Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız kısım su hizasının üstünde kalacak şekilde su tankına batırınız ve dik bir şekilde tutunuz. Su, kapiler etkisiyle kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken mürekkebi çözer ve sürüklemeye başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek ayrılmış olur. • • Diğer ayırma yöntemlerinin tam yeterli olamadığı durumlarda, tercihen kullanılır. Özellikle fiziksel ve kimyasal nitelikleri çok benzeyen maddelerin ayrılma işlemlerinde, kromatografi yönteminin kullanımı ile başarılı sonuçlar elde edilmektedir. Kromatografi tekniğinde yararlanılan temel prensip, bir karışımdaki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit bir faz üzerinden geçirilmeleri ve bu geçiş sırasında farklı hızlarla hareket edebilmeleridir. Kromatografi Kromatografi’nin Sınıflandırılması 1-Uygulama Biçimine Göre 2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre 3-Faz Tiplerine Göre 1-Uygulama Biçimine Göre - Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) -Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) Süperkritik akışkan kromatografisi 2- Ayrılma Mekanizmalarına Göre • Adsorpsiyon kromatografisi • Dağılma kromatografisi • İyon değiştirme kromatografisi • Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi • İyon çifti kromatografisi • Afinite kromatografisi 3-Faz Tiplerine Göre -Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisi Sıvı-Sıvı kromatografisi -Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi Kolon Kromatografi Kolon Kromatografisi •Kolon kromatografisi: biyomoleküllerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır. •Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur. depo (tampon) mobil faz (tampon) SABİT FAZ •biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir. HAREKETLİ FAZ Protein •Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan karışımı sabit faz kolon tarafından, (katı porlu matriks) adsorbe edilmeyenler önce adsorbe edilenler daha geç kolonu terkeder. elüent Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır: • Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur. • Alumina: Genellikle nötr ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur. • Selüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur. Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; • Sikloheksan, Petrol eteri, Dietil eter, CCl4, Benzen, Toluen, CHCl3, CH2Cl2, Etil asetat, Aseton, n-Butanol, İzopropanol, Etanol, Metanol olabilir. 1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı. Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina kullanılmaktadır. Kolon Kromatografisi • En kullanışlı ve yararlı kromatografi tekniklerinden biri olan kolon kromatografisi katı bir durağan faz ile sıvı bir hareketli fazdan oluşur. • Durağan faz cam veya plastik bir çubuk içerisine konur ve hareketli faz katı tutucudan geçirilir. Kolonun tepesine uygulanan az miktardaki karışım kolondan geçerken karışım oluşturan moleküller iki fazdaki tutunma veya dağılma özelliklerindeki farka göre kolonda farklı hızda ilerlerler. Kolondan çıkan sıvı fazın fraksiyonlar halinde toplanmasıyla değişik moleküllerin ayrımı yapılabilir. Kolon Kromatografi Tipleri Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: i. Jel filtrasyonu büyüklük i. İyon değişim yük i. Affinite (bağlanma) Jel Geçirgenlik Kromatografisi • Jel filtrasyonu veya moleküler elek kromatografisi olarak da adlandırılan jel geçirgenlik kromatografisinde şimdiye kadar açıklanan tekniklerden farklı olarak ayırma molekülün büyüklüğüne göre yapılır. Bu teknik binlerce protein, nükleik asit, polisakkarit ve diğer biyolojik moleküllerin saflaştırılmasında önem taşır. • Jel filtrasyonu için kullanılan bir kolonda durağan faz kontrollü boyutta küçük porlu inert partiküllerden oluşur. Farklı boyutlarda moleküller içeren solüsyon devamlı bir çözücü akışıyla kolondan geçirilir. Porlardan daha büyük olan moleküller jeldeki partiküllerin içerisine girmezler ve partiküllerin arasında sınırlı bir alanda kalırlar. Sonuçta bu moleküller yavaşlamazlar ve kolondan hızla çıkarlar. Partiküllerin içinde ve dışında yayılabilen küçük moleküllerin kolondaki hareketleri ise daha yavaş olur. Biyomolekül karışımını kolondan geçirilir içeren tampon, Küçük moleküller, jel boncuklar arasındaki boşluklara girer, kolondan geç çıkarlar. Büyük moleküller, jel boncuklar arasındaki boşluklara giremez ve kolondan hızlı bir biçimde sürüklenerek önce çıkarlar. • Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğe uğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik moleküllerin birbirinden ayrılması için kullanılır. • Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayin edilebilir. •Avantaj Büyük miktarda : biyomolekül karışımı saflaştırılabilir. •Dezavantaj: Yavaş ayırım İyon Değişim Kromatografisi • Bu teknik iyon molekülleri yüklü bir durağan faz ile geriye dönüşebilen elektrostatik etkileşime girebildikleri bir tutunma kromatografi biçimidir. İyon değişimi kromatografisi kolon iyonik işlevsel gruplarla etiketlenmiş sentetik reçineden oluşan durağan fazla doldurulur. • İşlemin ilk aşaması kolondaki çözünmeyen özellikteki pozitif yüklü reçinenin tampondaki zıt yüklü iyonla çevrilmesidir. İkinci aşamada ayrılacak karışımın kolona yüklenmesiyle farklı yüklü moleküllerin iyon değiştirici ortama girmesi sağlanır. İyon exchange (değiş-tokuş) Kromatografi Biyomolekül karışımındaki iyonlar, sabit fazdaki aynı yüklü iyonlarla [(+) -> (+) veya (-) -> (-) ile] yer değiştirerek kolona bağlanırlar. Bağlanmayan proteinler, kolondan en önce çıkarlar. Daha sonra, iyonik gücü/pH’sı farklı bir tampon kolondan geçirilir bağlı moleküllerin yükü değiştirilerek elüsyonu sağlanır. İlgi (Affinite) Kromatografisi • Bundan önce açıklanan kromatografik ayrımlar durağan destekler ile moleküller arasında özgül olmayan fizikokimyasal etkileşimlere dayanır. Büyük boyut ve polarite gibi moleküler özellikler biyolojik moleküllerin ayrım ve izolasyonunda yüksek bir seçicilik sağlamaz. • İlgi kromatografisi ise biyolojik etkileşim temeline dayanır. Bu nedenle son derece özgül ayrımların yapılabilmesini sağlar. • Makromoleküllerin çoğunun meydana getirdikleri biyolojik işlevler ligand adı verilen özgül moleküllerle etkileşimlerinin sonucudur. A (makromolekül) + B (ligand) ↔ Biyolojik Yanıt Affinite Kromatografisi Enzim, hormon vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır. Kolonun dolgu maddesine (dekstran, poliakrilamid, selüloz vb) spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır. Ligand ile kompleks yapan spesifik protein, katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler. Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir. Seçiciliği fazla olan bu yöntem, kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen – Antikor Enzim – Substrat Reseptör– İlaç gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır. Kolon Kromatografisi a)Gaz Kromatografi (GC) b)Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC) Gaz Kromatografisi (Gas Chromatography-GC) • Kromatografik bir sistemde hareketli faz gaz, durağan faz da inert katı partiküller üzerini kaplayan bir sıvı olduğunda bu tekniğe gaz-sıvı kromatografisi ya da kısaca gaz kromatografisi denir. • Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik ve ya camdan bir tüp içerisine doldurulur. İnert bir gaz halindeki hareketli faz yüksek basınç altında kolondan geçirilir. Çalışan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi sağlanır. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin kolondaki hareketleri daha yavaş olur. • Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son derece iyi ayrılmasını sağlayan, basit, hızlı, çok yönlü bir tekniktir ve çok duyarlıdır. Bununla birlikte bu kromatografideki en önemli kısıtlama kullanılan örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık derecelerine dayanıklı olması gerekliliğidir. Bu nedenle gaz kromatografisi ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen moleküllerin ayrımında kullanılabilir. Gaz Kromatografi (Gas Chromatography-GC) • Bu teknik laboratuvarda basit aletlerle yürütülemez. Yöntemin uygulanmasında çok gelişmiş otomatik cihazlar gereklidir. Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir. Yüksek Basınçlı (Performanslı) Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography-HPLC) • Son yıllarda yeni kolon dolgu maddelerinin değiştirilmesiyle biyomoleküllerin ayrılmasında kullanılır. Böylece birçok molekülün yapısal ve işlevsel analizlerini yapmak üzere çok kısa sürede ve etkin biçimde saflaştırılmaları mümkün olmaktadır. • Aminoasitler, karbonhidratlar, lipitler, nükleik asitler, proteinler, pigmentler, steroidler ve diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrımının yapılmasında ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren bu teknikte otomatik hale getirilmiş modern bir sıvı kromatografisidir. • Ayrıştırma ve analiz hızı klasik yöntemlerden çok yüksektir, kolonları yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin sürekli kullanılabilir, ayırma gücünü etkileyen değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebilindiğinden tekrarlanabilirliği son derece yüksektir. • HPLC ve GC sistemleri arasında da büyük benzerlik vardır. Sadece GC deki gazın yerine HPLC de çözücü almıştır. Yüksek Basınçlı (Performanslı) Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography-HPLC) Ayırma tekniği olan bir HPLC cihazının temel bileşenleri; • • • • • Çözücü deposu Yüksek basınç pompası Ticari olarak hazırlanmış kolon Algılayıcı (dedektör) Yazıcı GC’deki taşıyıcı gazın yerini HPLC’de çözücü almıştır. HPLC • Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. • Kolonu değişik zamanlarda terk ederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. • Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. • Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. • Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir Maddelerin tanımlanması tüm HPLC uygulamalarında en kritik kısımdır. Bunun için detektör seçimi çok önemlidir. Kolon ve hareketli fazın seçimi de kritik noktalardır. Miktar analizi ise, bir maddenin çözelti içindeki yoğunluğunun bulunmasıdır. Öncelikle standart bileşiklerin madde konsantrasyonlarının ölçülmesi gerekir. Bu bileşiklerin kromatografisiyle elde edilen grafikler (kromatogram) bilinmeyen maddeyle karşılaştırılır ve miktar tayini yapılabilir. HPLC Avantajları; • HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez kullanılabilir. • HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir. • Nitel ve nicel analizlerde kullanılabilir. • Ayrıştırma ve analiz hızı yüksektir. • Duyarlık yüksektir. • Aletin çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla otomatikleştirilir. • Büyük boyuttaki ayırım süreçlerine uygulanabilir. Düzlemsel Kromatografi (Kağıt ve ince Tabaka Kromatografileri) • Kağıt kromatografisinde destek ortamı suyla yüksek derecede doyurulmuş durumdaki selüloz tabakasından oluşur. • İnce tabaka kromatografisinde ise ince bir silika jel, alumina veya selüloz ile kaplanmış cam, aluminyum ya da plastik bir tabaka olabilir. Araştırılan örnek genellikle uçucu bir çözücü içerisinde çözündürülür, destek ortamına çok az miktarda damlatılır ve kurumaya bırakılır. Damlatma işlemine uygun miktarda örnek uygulanana kadar birkaç kez devam edilir. Daha sonra, kağıt ya da ince tabaka içinde az miktarda çözücü bulunan bir kaba konur ve çözücünün kılcal hareketi ile ayırım başlar. • Örnekteki moleküllerin renkli olmadığı durumlarda bunların kromatogram üzerindeki yerleşim yerlerini saptamak için renk meydana getirmek üzere fluoresans, radyoaktivite veya kimyasal madde gibi çeşitli uygulamalar yapılabilir. Renk oluşumu, görünür ışık ya da UV altında gözlenebilir. • Karışımdaki her bir molekülün yerleşim durumu, molekülün hareketinin çözücünün hareketine oranlanmasıyla ölçülebilir. Bu ölçüm değerine göreceli hareketlilik (relative mobility) adı verilir ve Rƒ simgesiyle gösterilir. • Rƒ değerinden, moleküllerin nitel olarak tanımlanmalarında yararlanılır. Yürüme hızı, Rf değeri ile ifade edilir ve substansın yürüme mesafesinin, çözücünün yürüme mesafesine oranından hesaplanır. Rf değeri 0 ile 1 arasında bulunur ve doğal olarak hızlı yürüyen komponentler için alınan mesafe büyük olacağından Rf değeri büyük daha yavaş yürüyenler için daha küçüktür • Kağıt ve ince tabaka kromatografileri için çok az miktarda örnek yeterlidir, analiz hızlı ve ucuzdur, saptama çok belirgindir. Bununla birlikte, bu tekniklerin duyarlılığı pek yüksek değildir. • Günümüzde, ince tabaka kromatografisi kağıt kromatografisinden daha yaygın şekilde kullanılmaktadır; çünkü çözücü gücünün daha fazla olmasına ek olarak, daha hızlı sonuç vermektedir. İnce Tabaka Kromatografi (Thin Layer Chromatography-TLC) İnce tabaka kromatografisi, kromatografisidir." bir "katı-sıvı adsorpsiyon Bu yöntemde sabit faz, çeşitli boyutlardaki "cam plakalar üstüne, ince bir tabaka halinde sıvanmış katı adsorban maddedir. Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina, siliko jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyişi, aşağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür. Bu işlem sırasında, plakanın alt kesimlerine bir damlalıkla önceden damlatılmış olan karışımı da farklı hızlarla yukarıya sürükler. Elektroforez • Elektroforez, yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin, kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarla elektriksel alanda hareket etmeleri prensibine dayanır. • Bu sistemde analiz yapılacak örnek bir destek ortamına uygulanır. Modern elektroforez tekniklerinden destek ortamı olarak daha çok jeller tercih edilmektedir. Jeller içerisinde uygun bir tampon bulunan bir elektroforez aygıtına yerleştirilerek işlem gerçekleştirilir. • Analiz edilecek örnek jele bir leke ya da ince bir bant halinde uygulanır. Katı jel desteğiyle ayrımı yapılacak moleküllerin hareketi moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine, kimyasal içeriğine ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır. • Oldukça hızlı ve kullanışlı bir teknik olan elektoroforezin bir homojenattaki farklı molekülleri ayırma kapasitesi genellikle fazla yüksek değildir. Bu nedenle bu teknikten preparatif olarak sınırlı ölçüde yararlanılmaktadır. Buna karşılık az miktardaki protein ya da nükleik asit karışımlarını saflaştırmakta ve analizlerini yapmakta geniş çapta kullanılmaktadır. • Ohm yasasına göre, elektrik alanı, akım ile direncin çarpımına eşittir. (V=I.R) • Elektroforez aygıtında oluşan direncin hemen tamamı jel tarafından ortaya konulur. • İkinci eşitliğe göre sistemin ürettiği güç direnç ile akımın karesinin çarpımına eşittir. • Üretilen güç ısı şeklinde ortaya çıkar ve elektroforez aygıtı jelin sıcaklığını arttırmaksızın, ancak belli miktarda gücü dağıtabilir. Belli bir noktanın üstünde voltajdaki ufak artışlar bile jelin sıcaklığında önemli ve zararlı bir yükselmeye yol açar. Kullanılan aygıtın kolaylıkla dağıtabileceği gücü miktarının iyi bilinmesi ve buna göre jelin sıcaklığının dikkatle izlenmesi gerekir. Elektroforez Yöntemleri • Tüm elektroforez tiplerinin temeli, elektriksel eşitliklere dayanır. Aralarındaki başlıca fark destek ortamının tipi ve konumudur. • Dikey ya da yatay konumdaki destek ortamı selüloz ya da ince jellerden hazırlanmış olabilir. Selüloz, aminoasitler ve karbonhidratlar gibi düşük molekül ağırlıklı olan moleküller için, jeller ise daha büyük olanlar için destek ortamı olarak kullanılır. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) • Akrilamidin polimerizasyonuyla hazırlanan poliakrilamid jellerin elektroforetik ayırımlarda çeşitli üstünlükleri vardır. küçük ya da orta boydaki nükleik asit ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir; oldukça büyük boyuttaki örnekler için uygundur; göç eden moleküllerle destek materyali arasındaki etkileşim en düşük düzeydedir; destek materyali fiziksel olarak oldukça kararlı ve dayanıklıdır. • Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar. Çünkü ayırım hem moleküler elekleme hem de elektroforetik ayırıma dayanır. PAGE’nin, jel geçirgenlik kromatografisinden farkı poliakrilamid jelde küçük molekülerin büyük moleküllerden daha hızlı hareket etmeleridir. Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N’-metilen-bisakrilamidin serbest radikal polimerizasyonuyla hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı-katalizör sistemi tarafından kontrol edilir. Fotokimyasal polimerizasyon, UV ışık altında riboflavin tarafından başlatılır. Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart bir jelde genelde %7,5 poliakrilamid jel içerir. • Bir jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamidin ve bis akrilamidin konsantrasyonuna bağlıdır. Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı biyolojik moleküllerin analizi yapılabilir; yüksek konsantrasyonlarda ise, daha küçük porların oluşumu düşük molekül ağırlıklı olanların analizine izin verir. • Poliakrilamid jel elektroforezi çubuk biçiminde veya düzlemsel biçimde hazırlanmış jellerle gerçekleştirilir. Çubuk tipinde, cam tüpler jel materyaliyle doldurulur; polimerizasyon 30-40 dakikada tamamlanır. Jel tüpü, iki ayrı tampon deposu arasına yerleştirilir. Üstteki depoda genellikle katod, alttakinde anod bulunur. Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda doğru hareket edeceklerinden, jel elektroforezi genellikle bazik pH da gerçekleştirilir. Analiz edilecek örnek, bir izleme boyasıyla birlikte, jelin tepesine uygulanır ve sistemden elektrik akımı geçirilir. Örnekteki bileşenlerden daha hızlı hareket eden izleme boyası jelin bitimine ulaştığında akım kesilir, jel tüpten çıkarılır ve boyanır. • Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta tutulan iki cam tabaka arasında hazırlanır. • Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak belli küçük kuyucukların oluşmasını sağlar. Kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır. Jel kasedi iki tampon deposu arasına yerleştirilir; kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir. Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel genellikle uygun şekilde boyanır. • Akrilamid monomeri bir nörotoksindir. Kanser oluşturma tehlikesi olan bir maddedir. Bu nedenle eldivenle çalışılması gerekir. Agaroz Jel Elektroforezi • PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının ayırımı ve analizi için kullanışlıdır. Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA parçalarının ayırımı için uygun değildir. 200-50.000 bç boyutuları arasındaki DNA ve RNA moleküllerini tanımlamakta kullanılan standart yöntem destek ortamı olarak agarozun kullanıldığı elektroforezdir. • Bir algden elde edilen agaroz galaktopiranoz türevlerinin lineer bir polimeridir. Jel elektroforez tamponuna konulmuş agarozun yüksek sıcaklıkta çözündürülmesiyle hazırlanır. • Agaroz çözeltisi yaklaşık 50°C a kadar soğutulduktan sonra jel kasetleri arasına veya jel tepsilerine dökülür. Ayırımı yapılacak örnek taraklarla oluşturulmuş kuyucuklara konur ve ayırımı tamamlanıncaya kadar voltaj uygulanır. Nükleik asitlerin agaroz jeldeki hareketleri agaroz konsantrasyonu ile nükleik asit moleküllerinin boyutları ve şeklinden etkilenir. Nükleik asitlerin ayırımı için en etkin agaroz konsantrasyonları %0,32,0 dır. • Proteinler gibi, nükleik asitler de molekül ağırlıklarının logaritmasıyla ters orantılı hızda göç ederler; bu nedenle, analiz edilen moleküllerin ağırlıkları aynı jelde molekül ağırlıkları bilinen standart nükleik asit parçalarının da yürütülmesiyle tayin edilebilir. Agaroz • Polimerize olmus agaroz porlu bir yapıdır ve DNA nin hareketine olanak sağlar. • Doğrusal bir polisakkarittir. Elektroforez Gereçleri Agaroz Jelin Hazırlanması • Agaroz jeller toz haldeki agaroz ile tampon çözeltilerin uygun miktarda karıştırılmasıile hazırlanır. Agarozun Kaynatılması Jelin Hazırlanması Agaroz Jele Örneklerin Yüklenmesi Jelin yurutulmesi Jelin Görüntülenmesi Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel Elektroforezi • Geleneksel agaroz jel elektroforezi genelde 50.000 bç.’den daha küçük nükleik asit parçalarının ayırımı için uygundur; yüksek ayırışım istendiğinde bu sınır 20.000-30.000 bç ye kadar düşer. Değişken alanlı elektroforez ile çok büyük DNA molekülleri ayrılabilmektedir. • PFGE’nin standart jel elektroforezinden en belirgin fark, uygulanan elektrik alanının sabit olmaması, ayırma sırasında yönünün ve şiddetinin tekrarlanan biçimde değiştirilmesidir. İzoelektrik Odaklanma (isoelectric focusing-IEF) • Proteinlerin elektroforetik analizi için geliştirilmiş etkin bir tekniktir. Bu teknikte elektroforetik hareket pH’nın fonksiyonu olarak ele alınır. Bir proteinin net yükü pH’ya bağlımlıdır. Proteinler izoelektrik pH’ların altında pozitif olarak yüklüdürler ve sabit pH’lı bir ortamda negatif yüklü elektroda (katoda) doğru göç ederler. İzoelektrik noktalarının üstündeki pH’da ise, protein proton kaybeder, negatif yüklü hale geçer ve pozitif yüklü elektroda (anoda) doğru göç eder. Eğer elektroforez ortamının pH’ı proteinin pH’ına eşitse, proteinin net yükü sıfır olacağından elektrodların hiçbirine doğru hareket etmez. • Anoda bir asit, katoda bir baz yerleştirilir ve elektrodlar arasındaki jel ortamının pH’ı 2-10 arasında derecelenme yapacak şekilde, elektroforezdan önce ya da elektroforez sırasında ayarlanarak düzenek kurulur. İki Boyutlu Elektroforez • SDS-PAGE ile proteinlerin ayırımının molekül boyutuna göre yapılmasına karşılık IEF ile ayırım yüke dayanır. Bu iki yöntemin bileşimi olan iki boyutlu (2D-) elektroforez, kompleks protein karışımlarının ayrışımında önemli ilerlemelere yol açmıştır. Son yılarda sıkça ve etkili biçimde kullanılan 2D-elektroforez proteomik çalışmalarının da temel tekniklerinden biridir. • Bu yöntemin iki farklı uygulama şekli vardır: ya önce IEF, daha sonra SDS-PAGE yapılır ya da “ISO-DALT” adı verilen sistem yardımıyla her ikisi de aynı anda gerçekleştirilir. En yaygın olarak kullanılan O’Farrell sisteminde birinci boyutta iyonik olmayan deterjanlar ve üre varlığında, denatüre koşullarda çubuk jelde IEF gerçekleştirilir; ikinci boyutta ise çubuk jel SDSPAGE jeli üzerine uygulanır. Ayırım sonunda jel boyandığında, tek bir jelde en az 1.000 farklı proteinin görüntüsünü elde etmek mümkün olabilir. Kılcal (Kapiller) Elektroforez • Kılcal elektroforez(CE) elektroforezin yüksek ayrıştırma gücü ile HPLC’nin hız, çok yönlülük ve otomasyon yönlerini birleştiren yeni bir tekniktir. Çok az miktardaki (5-10nL) örneğin, yüksek çözünürlükte ayrışımını ve attomol düzeyinde duyarlılıkla analizini sağlar. Bu nedenle aminoasitlerin, peptitlerin, proteinlerin, nükleik asitlerin analizinde geniş çapta kullanılan bir teknik olmaya başlamıştır. • Bu teknikte kullanılan alet bir güç kaynağı, iki tampon deposu, tamponla doldurulmuş kılcal bir tüp ve sürekli çalışan bir algılayıcıdan ibarettir. • CE’nin en önemli üstünlüğü, HPLC gibi birçok analitik deney tasarımına uygun olmasıdır. Bu çok yönlülük, kılcal kolonun değişik materyallerle doldurulmasıyla sağlanır. Örneğin küçük ve yüklü moleküller için destek materyali olarak silika veya poliimid ile kaplanmış tüpler, moleküler eleklemeye göre ayırım istendiğinde ise poliakrilamid veya SDS poliakrilamid ile doldurulmuş tüpler kullanılır. İmmünoelektroforez • İmmünoelektroforezde (IE) kompleks proteinlerin analizinde uygulanan ardışık iki işlem vardır: (1) karışımdaki proteinlerin agaroz jel elektroforezi ile ayrılması (2) ayrılan proteinlerin antijenik özelliklerini belirlemek üzere özel antikorlarla etkileşime sokulmaları. • Bu yöntemde, önce protein karışımı küçük cam tabakada hazırlanmış agaroz jelde elektroforezle ayrılır. Daha sonra, ayrılmış proteinler özel antikor uygulamasına bırakılırlar. Uygulanmış antikorların jelde yayılması sağlanır. Eğer bu antikorların proteinlerden birine ilgisi (affinitesi) varsa antijen ve antikor arasında suda çözünmeyen bir kompleks oluşur ve gözle görülebilir bir çökelme meydana gelir. • Bu teknik, bir proteinin saflığının, kompozisyonunun ve antijenik özelliğinin analizi için çok yararlıdır. Spektral yöntemler Işık, insan gözüyle görülebilir dalga boylarındaki elektromanyetik radyasyon enerjisidir. Dalga boyu, iki dalga piki arasındaki mesafedir ki genellikle nanometre (nm), bazen angström (Ao) ve milimikron (mµ) olarak ifade edilir. Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan ışık, insan gözünün beyaz olarak tanımladığı, farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir karışımıdır. Bir madde elektromagnetik dalga spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki görünür ışınların hepsini geçiriyor veya yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa (absorpluyorsa) siyah görünür. Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir madde sarı renkli, sarı rengi soğuran bir madde mavi renkli görünür. yeşil rengi soğuran bir madde kırmızı renkli, kırmızı rengi soğuran bir madde yeşil renkli görünür. Elektromanyetik ışıma - Madde etkileşmeleri: • Kırılması ve yansıması (difraksiyon ve refleksiyon) • Yayılım (emisyon) • Geçiş (transmittans) • Tutulum (absorbans) • Başka dalga boyunda ışına çevrilebilir (floresans) ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ Ölçülen Özellik Aletli Analiz Yöntemi Işın Absorpsiyonu Spektrofotometri (X-ışını, UV, GB, IR), NMR, ESR, Fotoakustik spektroskopisi Işın Emisyonu Emisyon spektroskopisi (X-ışınları, UV, GB, elektron, Auger, ) Floresans, Fosforesans ve Lüminesans Spektroskopisi Işın Saçılması Türbidimetri, Nefolometri, Raman Spektroskopisi Işın Kırılması Refraktometri, interferometri Işın Difraksiyonu X-ışınları ve elektron difraksiyon yöntemleri Işın rotasyonu Polarimetri, dairesel dikroizm Elektrik potansiyeli Potansiyometri, Kronopotansiyometri Elektrik yükü Kulometri Elektrik akımı Amperometri, Polarografi Elektriksel direnç Kondüktometri (İletkenlik Ölçümü) Kütle Gravimetri Kütle/yük Kütle spektroskopisi Tepkime Hızı Kinetik yöntemler Termal Özellikler Termal gravimetri, DTA, Termal İletkenlik Radyoaktivite Nötron Aktivasyon Analiz, İzotop seyreltme yöntemleri Spektral yöntemler • Bu yöntemlerin temeli çeşitli ışınların enerjilerine dayanarak yapılan ölçümlerdir. Elektromanyetik spektrum birbirini izleyen farklı özelliklerdeki dalgalardan oluşur. Bu spektrumda, özellikle X ışınlarının 7nm ye kadar olan bölgesi ile, UV’nin 180340nm arasındaki, görünür ışığın 340-800nm arasındaki, IR nin 1000-100.000 nm arasındaki ve radyo dalgalarının 106-1010 nm arasındaki bölgeleri moleküler biyoloji çalışmalarında önem taşır. • Uzun yıllardan beri biyomoleküllerin değişik dalga boylarındaki elektromanyetik radyasyonla etkileşime dayalı ölçümleri yapılmaktadır. Optik sistemler özellikle nicel çalışmalar için çok elverişlidir. Spektral yöntemler • Molekülleri içeren solüsyonlar veya molekül kristallarine ışık uygulandığında en az iki farklı olay meydana gelir: ışığın saçılması ve ışığın emilmesi (absorpsiyon) bunların ikisi de biyomoleküllerin nitelendirilmesi ve analizlerinde kullanılan temel tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Özellikle ultraviyole ve görünür ışık dalga boylarının emilmesi moleküler yapı analizleri için çok değerli bir olaydır. Bazı moleküllerde ışığın emilmesini farklı dalga boyunda ışığın yayılması (emisyonu) izler. Fluoresans adı verilen bu süreç molekülün yapısı ile çevresel etmenlere bağlıdır ve biyolojik açıdan önemli moleküllerin, moleküller arasındaki meydana gelen dinamik etkileşimlerin analizi ve tanımlanmasında yardımcı olur. İçerisinde organik moleküller bulunan bir çözeltiden UVgörünür bölge ışınları geçerse, çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon). Bir küvet içine konmuş renkli bir çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür. Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. Transmittansın tersinin logaritması Absorbans (Optik dansite, A) olarak tanımlanır ki bu, çözeltinin içinden geçen ışığın ne kadarının absorbe edildiğinin (soğurulduğunun) ifadesidir. Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya konsantrasyonu ile % Transmittans (%T) arasında doğrusal olmayan bir ilişki olduğu halde Absorbans (A) arasında doğrusal bir ilişki vardır. Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert-Beer yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir küvetten geçen ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu veya küvet çapının (l) artmasıyla azalır; ayrıca dilüe çözeltinin absorbansı (A), çözeltinin konsantrasyonu (c) ile doğru orantılıdır. absorpsiyon katsayısı (ekstinksiyon katsayısı) olarak gösterildiğinde Lambert-Beer yasasının matematiksel ifadesi şu şekilde olur. • Spektrofotometre’de nicel ölçümler Beer-Lambert yasasinin kullanımıyla değerlendirilir. A=ℇλcd= log I/I0 A= Emme (absorbans) I0= Örneğe giren ışığın şiddeti I= Örnekten çıkan ışığın şiddeti ℇλ= belli bir dalga boyundaki emme katsayısı c= örnekteki emme yapan maddenin derişimi d= ışığın örnekten geçiş yolu uzunluğu (spektrofotometrede küvetin eni) ℇλ; Belirlenmiş dalga boyu ve çözücü koşullarında 1 cm’lik küvetteki saf emici materyalin 1M’lık solüsyonunun absorbansı olarak ifade edilir. Birimi M-1 cm-1(mmol1cm2)’dir. Çözelti içindeki madde miktarını çözeltinin renginden faydalanarak ölçme işlemine kolorimetri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da kolorimetre denir. Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek çözeltinin rengi değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırılarak değerlendirilir. Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanarak ölçme işlemine fotometri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da fotometre denir. Fotometrik ölçümde, renksiz çözeltilerin konsantrasyonu da ölçülebilir. Analiz edilen örnek üzerine ışık demetinin bir kısmını filtreler kullanarak ayıran ve gönderen aletler kolorimetre veya fotometre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar. Spektrofotometrelerde konsantrasyonu bilinen bir standart çözeltinin absorpladığı ışık miktarı (absorbans, optik dansite) ile konsantrasyonu bilinmeyen çözeltinin absorpladığı ışık miktarı karşılaştırılır. Spektrofotometrelerde kullanılacak ışık, çözeltinin kuvvetli absorpladığı dalga boyunda seçilir; örneğin kırmızı renkli sıvı için yeşil dalga boyunda ( yeşil renkli sıvı için kırmızı dalga boyunda), mavi renkli sıvı için sarı dalga boyunda (sarı renkli sıvı için mavi dalga boyunda) ışık seçilir. Spektrofotometrelerde çözeltideki madde için uygun seçilen dalga boyundaki ışığın örneğe ve standarda (bilinen konsantrasyondaki çözelti) ait absorbansları veya optik dansiteleri (A, OD) karşılaştırılıp matematiksel işlemler yapılarak örnekteki maddenin konsantrasyonu bulunur. İstenirse, çeşitli konsantrasyonlardaki standart çözeltilerin, belirli uygun bir dalga boyunda ışık için absorbans değerleri bir köre (absorbansı sıfır kabul edilen) karşı ayrı ayrı ölçülüp bir grafik kağıdına konsantrasyonlara karşı işaretlenerek standart grafiği çizilir. Örneğin absorbansı da aynı köre (absorbansı sıfır kabul edilen) karşı ölçülür ve ölçülen absorbansa karşı gelen konsantrasyon standart grafikten bulunur. Spektrofotometre • Optik tekniğe dayalı bu yöntem moleküler biyolojide en fazla kullanılan yöntemdir. • Seçilmiş dalga boyunda ışık oluşturup ışığı (küvette çözücü içerisinde bulunan numune) örneğin içinden geçirerek örnekten geçen ışığın şiddetini ölçer. • Temel öğeleri; ışık kaynağı (çeşitli filtreler, ışığın geçtiği aralıklar ve aynalardan oluşan), monokromatör, örneğin konulduğu oda, algılayıcı (dedektör) ve kaydedici (yazıcı)’dır. Yeni modelleri bilgisayar kontrollüdür. Spektrofotometre • Işık kaynağı; UV ışık bölgesindeki ölçümlerde 200-340 nm dalga boyları arasında radyasyon oluşturan yüksek basınçlı hidrojen ve döteryum lambası, görünür ışık bölgesi için 300-840 nm dalga boyları arasında ışık veren tungsten halojen lamba kullanılır (standart ölçüm için bir süre ısınması (yaklaşık 15 dk önceden açılması) ve ölçüm arasında fazla zaman farkı yoksa kapatılmaması gerekir). • Monokromatik (tek dalga boyunda) ışığın seçilmesi için özel bir düzenek (monokramatör) bulunur. Buradan çıkan ışık seçilen dalga boyundaki ışığın çok yükseltilmiş şeklidir. monokromatik ışık buradan örneğin yetiştirildiği odaya girer. Klasik tek ışık yollu spektrofotometre. • Örnek Kapları (küvetler): Genellikle bir cm, geçirgenlik özelliği yüksek cam, silika, kuartz veya plastik türevi malzemeden yapılmış olabilir. Kare yada dikdörtgen prizma yapısında borosilikat cam küvetler görünür bölge spekrumlarının ölçülmesinde, bazı plastik hücreler ise hem görünür hem de UV bölgede yeterli berraklık gösterirler fakat organik çözücü tarafından lastiklerin etkilenebilir olması bazı problemlere de yol açabilir. Küvetlerin temiz olması alkalen çözeltilerde uzun süre bekletilmemesi hafif deterjanda asit, su ve etenol karışımında (1: 3: 4 oranında) bekletilmeleri temizlik için en uygun yöntemdir. Özellikle UV bölgede görülmeyen çizgiler ve parmak izleri dahi ölçümleri olumsuz etkileyebilmektedir. Küvetlerin optik geçirgenlik özellikleri (a) Standart (b) Küçük hacim std. (a) Mikro (b) Akışkan tip • İçerisine tek küvet konulabilen odalar tek-ışınlı (single-beam), aynı anda iki küvet konulanlar ise çift-ışınlı (double-beam) olarak adlandırılır. • Çift-ışınlı olanlarda, kontrol olarak kullanılan küvetteki maddenin spektrumu analiz edilen örneğin spektrumundan çıkartılarak gerçek absorpsiyon değeri işlem sırasında bulunur. Örnekten geçen ışığın şiddeti moleküller tarafınan emilen ışığın miktarına bağlıdır. Bu yoğunluk ışığa duyarlı bir algılayıcı (detektör) tarafından ölçülür. Detektör az miktardaki ışık enerjisini algılar, onun şiddetini artırır ve kaydedici veya yazıcı tarafından alınabilecek bir elektrik sinyali biçimine dönüştürür. Çift ışık yollu spektrofotometre Spektrofotometre Kullanım Amaçları • Bir solüsyondaki çözünmüş maddelerin derişimlerinin ve saflık derecelerinin belirlenmesi • Bilinmeyen biyomoleküllerin tanımlanması • Biyokimyasal reaksiyonların kinetiğinin incelenemesi • Makromolekül ligand etkileşimlerinin tanımlanması • Çalışılan moleküllerin her dalga boyundaki emmenin ölçülerek emme (absorbans) spektrumunun belirlenmesi Spektrofotometre Çeşitleri • Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi • Raman spektroskopisi • X ışınları Spektroskopisi X ışınları absorpsiyonu, emisyonu, floresansı ve difraksiyonu ile ilgilidir. İç kabuk elektronlarında değişmeler gözlenir. Yapı analizleri ve kantitatif analizlerde kullanılır. XPS, Auger Spektroskopisi, XRD • UV-VIS Spektroskopi • Fluoresans Spektrofotometrisi • Nüklear Manyetik Rezonans Spektroskopisi Kuvvetli bir manyetik alana konan bir molekülde manyetik çekirdeklerin radyo frekansları absorplamasına dayanır. Özellikle organik yapı aydınlatılmasında kullanılır. • Kütle Spektrometrisi Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi Atomik absorpsiyon spektrometri (AAS), elementlerin derişimlerini ölçen bir tekli element tekniğidir. Temel durum atomları hava/asetilen veya azotoksit/asetilen alevi ile üretilmektedir. Ölçülen elemente özel kullanılan oyuklu katot lambasından yayılan ışınım mevcut alevden geçirilerek parçalı katı hal dedektör tarafından ölçülür. Analizi yapılacak örnek aleve gönderilir, örneğin içinde ilgili element mevcutsa, lambadan gelen ışınımın absorplar ve böylece ışınımın şiddeti azalır. Absorplanan ışınım miktarı örneğin içinde bulunan elementin derişimiyle doğrudan bağlantılıdır. Raman Spektroskopisi Raman spektroskopisi, molekül ve kristal örgülerdeki bağlı atomların elektron bulutlarının, gelen ışıkla etkileşerek titreşmesi sonucunda meydana gelen Raman saçılma sürecine dayanmaktadır. Raman cihazı, katı, sıvı veya toz şeklindeki organik ve inorganik madde ve malzemelerin makroskopik ve mikroskobik karakterizasyonuna imkan vermektedir XRD; X’Pert Pro X-ışınları kırınımı cihazı özellikle ince filmlerin kristallinitesinin incelenmesinde kullanılmaktadır. her bir kristalin fazın kendine özgü atomik dizilimlerine bağlı olarak X-ışınlarını karakteristik bir düzen içerisinde kırması esasına dayanır. Her bir kristalin faz için bu kırınım profilleri bir nevi parmak izi gibi o kristali tanımlar. XPS X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS), malzemenin yüzeyi ile ilgili olarak atomik ve moleküler bilgi sağlanması amacıyla kullanılan sayısal bir analiz tekniğidir. Çekirdekseviyelerinin incelenmesi ve bunu takiben yayılan çekirdek fotoelektronların analiz edilmesiyle numune yüzeyinin bileşimi ve elektrostatik seviyesi hakkında bilgi verir. Ultraviyole-görünür Işık (UV-VIS) Absorpsiyonu Spektrofotometrisi • UV ve VIS bölgelerindeki ışık, moleküllerdeki değerlik elektronlarını uyaracak yeterli enerjiye sahiptir. Işığın yayılması, birbirlerine dikey durumda olan, bir elektrik alanı bileşeni (E) ile bir manyetik alan bileşenine (M) bağlıdır. • Aşağıdaki eşitlikte tanımlanan ışığın dalga boyu (λ), şeklinde gösterilen birbirine komşu iki tepe noktası arasındaki uzaklığın karşılığıdır. • λ=c/V • C: ışık hızı • V: frekans, birim zamanda belli bir noktadan geçen dalga sayısı UV-VIS Absorpsiyonu Spektrofotometrisi • Işık, aynı zamanda enerji partiküllerinden (foton) oluşan bir karaktere de sahiptir. Bu partiküllerle ilgili enerji miktarı; E=hv h; Planck değişmezi (6.626x10-34 J.s) Bir foton bir molekülle etkileşime girdiğinde saçılabilir ya da molekülde uyarılmış bir durum yaratmak üzere kendi enerjisini moleküle aktarılabilir. UV-VIS Absorpsiyonu Spektrofotometrisi 1. Rayleigh saçılımı; foton bir molekülle çarpıştığı ve frekansı değişmeden kırıldığı yada saçıldığı zaman meydana gelir. Işığın saçılması, makromolekülleri nitelendirmede bazı yöntemlerin fiziksel temelini oluşturur. Elektroforezin keşfinden önce mm’in molekül ağırlığının ölçülmesinde faydalanılmıştır. X ışını kırınımı, elektron mikroskobisi, lazer ışık yayılımı ve nötron yayılımı gibi teknikler ışığın saçılması sürecine dayanır. UV-VIS Absorpsiyonu Spektrofotometrisi • 2. Enerjinin bir fotondan bir moleküle aktarımı emilme (absorpsiyon)’dir. Bir fotonun emilmesi için enerjisinin molekülün iki enerji düzeyi arasındaki enerji farkına denk olması gerekir. • Moleküller bir seri enerji düzeyine sahiptirler. Elektron değerliklerinin dağılımı bakımından farklı düzeylere geçmesi ile gerçekleşen elektron geçişleri UV ve görünür ışık enerjileri ile mümkündür (elektronların bir yörüngeden diğerine hareket etmesini sağlar). • Bir örnek tarafından emilen çeşitli dalga boylarındaki ışığın ölçülmesiyle UV-VIS spektrumu elde edilir. • UV-VIS ile görüntülenmesi, molekülün tanımlanmasına (emme spektrumu ile) yardımcı olur. Zira emilen dalga boyları atomların yerleşimine veya işlevsel gruplara bağlı olduğundan spektrumda birden fazla noktada tepe oluşabilir. Oluşan en yüksek tepe noktası (λmax) bilinmeyen moleküllerin tanımlanmasında önem taşır. Fluoresans Spektrofotometrisi Fluoresans Spektrofotometrisi 1. UV Spek. da çözeltiye verilen ışık ile çözelti soğurduktan sonra gecen ışığın dalga boylari aynıdır. Yani onemli olan o dalga boyundaki ışığı ne kadar soğurduğudur. 2. Floresans Spek. de ise çözeltiye yollanan ışık ile çözeltiden alinan isigin dalga boylari farklıdır. Çözelti ışığı sogurur ve farklı dalga boyda her yöne doğru yayar. Bu nedenle, UV Spek. de ışığın işledigi yol doğrusal iken, floresans Spek. de ışığın yönü 90 derecedir. Yani çözelti içinden geçip giden ışık ölçülmez de, çözeltinin farklı dalga boyda yaydığı ışığın şiddeti ölçülür ve bunun için giren ile çıkan ışığın açısı 90 derecedir. Nüklear Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) • NMR; organik bileşiklerin yapılarının belirlenmesinde (özellikle kovalent bileşiklerin yapılarının aydınlatılmasında) kullanılan en güçlü tekniktir. • Kuvvetli bir manyetik alana konan bir molekülde manyetik çekirdeklerin radyo frekansları absorplamasına dayanır. Kütle Spektrometrisi • Maddeler moleküler düzeyde tartılır (özellikle molekül ağırlıklarının tam olarak ölçümünde). Önceleri organik kimya açısından önemli iken günümüzde biyolojik moleküllerin analizinde (özellikle ortak çalışan cihazlar ve bilgisayar desteği gibi yöntemlerin geliştirilmesi ile) kullanılmaktadır. • Nötr moleküller iyonlaştırılır ve pozitif olarak yüklenen iyonlar bir elektrik ve/veya manyetik alandan geçerken kütle/yük oranına göre (m/z) ayrılması esasına dayanır. • 25 aminoasitlik veya daha kısa polipeptidlerin dizilenmesinde de kullanılır. İyonizasyon hızlı atom bombardımanı (FAB) ile sağlanarak kütle analizi birbirine bağlantılı iki kütle spektrometresinde gerçekleştirilir. GC-MS Gaz kromatografisi/kütle spektroskopisi, iki güçlü analitik tekniğin kombinasyonudur. • Gaz kromatografisi, karışımdaki bileşenleri ayırır. • Kütle spektroskopisi, her bir bileşenin yapısal olarak tanımlanmasında yardımcı olur. Çok düşük miktarlardaki örneklerin tanımlanması, güçlü yapısal analiz, hızlı analiz süresi gibi önemli avantajları bulunmaktadır. RADYOİZOTOPLARIN KULLANIMI • Radyoizotopların kullanımı; biyolojik süreçler hakkında bilgilerin zenginleşmesini sağlamıştır. N.a ve proteinlerle ilgili araştırmada yararlanılan pek çok yöntem radyoizotopların kullanımına dayanır. • Radyoizotoplarla işaretlenmiş makromolekül öncülleri kullanılması ile kompleks bir karışımda özel veya çok az bulunan bir molekül izlenebilir. • Radyoizotopların kullanılmasındaki özellik, genellikle, kullanılan elementin bir doku veya dokuların biyokimyasına girmesidir. Örneğin: Au, S karaciğer; Na, K, Br kan dokusuna ve hücre metabolizmasına; Tc tiroit ve beyin, Hg böbrek biyokimyasına girer. Bu bileşikleri izleyebilmek için radyoizotopların biyokimyalarının bilinmeleri gereklidir. RADYOİZOTOPLARIN KULLANIMI • Radyoizotoplarla işaretlenmiş moleküller tamalayıcı özellikte hazırlanarak moleküllerin saptanmasında prob (sonda) olarak kullanılabilirler ve böylece otoradyografi probla melezlenen molekülün pozisyon ve/veya miktarının saptanmasına olanak verir. • Analitik tekniklere göre 2 üstünlüğü vardır. 1. duyarlı aletlerin kullanımıyla çok az miktarlarda (pikomol 10-12) radyoaktif materyal saptanabilir. 2. kimyasal olarak ayırt edilemeyen maddeler arasındaki farklılıklar fiziksel olarak belirlenebilir. Radyoaktivite Kökeni, Özellikleri ve Birimleri • Radyoaktivite, kararsız izotopların kendiliğinden çekirdek bozunumuna uğramasıyla oluşur. Örn; bir protonda oluşmuş Hidrojen çekirdeği H11 ile gösterilir. Hidrojen çekirdeğinin bir ve iki nötron içeren, sırasıyla döteryum H21 ve trityum H31 izotoplarıda vardır. Proton sayıları aynı nötron sayıları farklı bu izotoplardan trityum radyoaktiftir. • Bir çekirdeğin kararlılığı nötronların, protonlara oranına bağlıdır. Bazı çekirdekler kararsızdır, kendiliğinden parçalanır (bozunur) ve bu sırada partikül yayılımı (emisyonu) meydana gelir. Bu tipteki kararsız izotoplara Radyoizotop denir. • 3 tip radyoizotop vardır (∝, β partikülleri ve y ışınları) Radyoaktivite Kökeni, Özellikleri ve Birimleri • Radyoizotoplar kullanılarak deney tasarlanırken yarılanma ömrü (yarı ömür=half-life t1/2) dikkate alınmalıdır. • Yarılanma ömrü bozunmaya uğrayacak bir örnekte başlangıçtaki radyoaktiflerin atomların sayısının yarıya inmesi için gereken süredir. Yö kısa bir radyoizotopun kullanımı zordur. P32 en sık kullanılan izotoptur (t1/2=14 gün) . • Temel radyoaktivite birimi Curie (Ci= dakikada 2.2x1012 bozunma hızında partiküller yayan radyoaktif materyal miktarıdır. )’dir. Dakikada Mili (mCi, 2.2x109 dakika-1) yada mikrocurie (µCi 2.2x106 dakika-1) ya da Becquerel (saniyede bozunum 1 Ci= 3.7x1010Bq) en fazla kullanılan birimlerdir. Radyoaktivite birimi ve ölçümü • Radyoaktivitenin ölçümünde aletin etkinlik oranı % olarak radyoaktivitesi bilinen standart bir bileşiğin sayımıyla ve saptanan aktivite değerinin (dakikadaki sayım değerlerinin (cpm)) gerçek aktiviteye (dakikadaki parçalanma) oranlanmasıyla bulunur. • % etkinlik = standartın saptanan cpm değeri x 100 1µCi standartın dpm değeri • % etkinlik = saptanan cpm x 100 2.2x106 dpm Radyoizotop Uygulamaları • Radyoizotop uygulamasıyla biyolojik materyallerin yapısına girmiş olan radyoaktivitenin yerleşimi saptanabilir ve/veya miktarı belirlenebilir.Moleküler biyolojide en fazla yararlanılan β yayan radyoizotopların ölçümünde kullanılan başlıca teknikler ışıma (scintillation) sayımı ve Guiger-müller (gaz iyonizasyon odasının kullanımı) sayımıdır. • Yine makromoleküllerle yapılan çalışmalarda radyoziotopların nicel analizlerine ek olarak yerleşim durumlarının belirlenmesi de önem taşır. Bu amaçlada otoradyografi tekniği ile hücre ya da organellerdeki rayoaktif bir maddenin (atom yada molekül) varlığı ve yerleşimi saptanabilir. Otoradyografi • Bu yöntem radyoaktif bir materyalin doğrudan fotoğrafik emülsiyonda saptanmasıdır. • Öncelikle hücre yada molekül radyoizotopla işartelenir ve fotoğraf filmiyle kaplanır. Materyaldeki radyoizotopların yaymış oldukları radyasyon fotoğraf filmini etkileyerek gümüş tuzu kristallerinden elektron atılmaına neden olur. Bu elektronlar da + yüklü gümüş iyonlarını çekerek gümüş atomlarının çökelmesini sağlarlar. Fotoğraf filminin banyosu yapıldığında radyoaktif materyalin yerleşimi ve miktarı hakkında bilgi alınmış olur. • Otorayografik tarama ve radyoaktivite miktarını belirleme amacıyla densitometrede kullanılır.Bu teknikte agaroz ve poliakrilamid jellerde elektroforez yapıldıktan sonra membrana aktarılmış ve biyomoleküllerle melezlenmiş radyoaktif moleküllerin nitel ve/veya nicel olarak değerlendirilmesinde de geniş çapta kullanılmaktadır. İzotopik olmayan işaretlemeler • Doğrudan işaretleme yöntemleri (kemogenik veya kemoluminesan bir reaksiyonu katalizleyen enzimler vaya floresan bir molekül olabilir) • Dolaylı etiketler (ardışık belirleme için bir taq (fiş,etiket) için kullanılan küçük moleküllerdir.) hapten, biotin gibi • Floresan kısım doğrudan etiket olabilir yada bir substratı ürüne dönüştüen enzimatik reaksiyonun sonucu olabilir. • Kromogenik etiketler de genellikle enzimatik reaksiyon sonucu bir renklenme oluşur. Altın partikülleri kromogenik olarak kullanılarak ışık veya elektron mikroskobuyla görüntülenebilir. • Kemoluminesan bir substratın enzimatik reaksiyonla aktif duruma geçmesini ve ışık yayarak bozunmasını kapsar.
