MBKY II-3 RNA Çalışmaları
advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II RNA Çalışmaları Transkriptom RNA • Bakteri hücresinin %6’sı • Memeli hücresinin %1.1’i – Total 10-15µg RNA’nın %80-85’i rRNA %15-20’si tRNA ve nukleusa ait küçük RNA’lar %1-5’i mRNA RNA’dır RNA • Transkripsiyon: DNA’daki bilginin RNA’ya aktarılması Protein translasyonu için geçici olarak bilgi iletir. -­‐ Tek zincirli bir polinükleotid -­‐ Riboz seker içerir. -­‐ DNA’daki timin yerine urasil içerir. -­‐ Olgunlaşmış mRNA moleküllerinin 5’ ve 3’ uçları işlevsel önem taşır. RNA • RNA eşleniklik kuralına uygun olarak kalıp DNA zinciri üzerinden transkribe olur. • Genlerin büyük kısmı proteinleri kodlarken az bir kısım gen ise transle olmayan işlevsel RNA’ları kodlar. • Genin nükleotid dizilimi bir proteindeki aminoasitlerin sırasını belirler. Bu dizilim proteinin şeklini, boyutunu ve işlevini belirler. • mRNA üçlü nükleotid grupları (kodon) halinde tRNA antikodonunun mRNA kodonu ile eşleşmesi aracılığı ile ribozomlarda transle olur. RNA Çeşitleri • mRNA; Protein kodlayan RNA -­‐ Transkriptlerdir. -­‐ Ökaryotlarda transkripsiyon sonrası işlemden geçirilir. -­‐-­‐5’ ve 3’ uç modifikasyonu, intronların uzaklaştırılması • İşlevsel/Yapısal RNA -­‐tRNA; a.a’leri ribozomlara taşır. -­‐rRNA; ribozomların yapısal ve katalitik bileşenleridir. -­‐snRNA(küçük çekirdek RNA); splaysozomun yapısal ve katalitik bileşenleridir. -­‐snoRNA (küçük nükleolar-­‐çekirdekçik-­‐ RNA); rRNA’ların olgunlaşmasına katılır. -­‐scRNA; stoplazmadaki protein trafiğini yönlendirir. -­‐siRNA (small interfering RNA); gen ifadesinin kontrolünde kullanılır. -­‐miRNA (Mikro RNA): transkripsiyon sonrası gen düzenlemesinde görev alır. Transkripsiyon • RNA polimeraz; RNA sentezini katalizler -­‐ DNA zincirlerinden birini kalıp olarak kullanır. -­‐-­‐-­‐-­‐Belirli bir gen için hep aynı zincir üzerinden gerçekleşir. -­‐ DNA ifade edilecek kısmı ile açılır. -­‐ Uzayan RNA zincirinin 3’ ucuna serbest nükleotidleri takar. -­‐-­‐-­‐-­‐5’ den 3’ yönüne RNA sentezi Transkripsiyon • Transkripsiyon asimetriktir – DNA’nın yalnızca bir zinciri “kalıp zincir” • RNA’ya transkribe olur. • RNA transkripti kalıp olmayan zincirle aynı dizilime sahiptir. • RNA yalnızca 5’ den 3’ yönüne transkribe olur. • Kalıp zincir 3’ 5’ yönünde okunur. RNA polimeraz • Prokaryotlar: tek bir RNA polimeraz – mRNA, rRNA and tRNA – Trankripsiyon ve translasyon birbiri ile eşli gider. • Ökaryotlar: 3 RNA polimeraz – RNA polimeraz I: rRNA genleri – RNA polimeraz II: mRNA Transkriptler işlenir. – RNA polimeraz III: tRNA, 5S rRNA • Ökaryotlarda transkripsiyon çekirdekte, translasyon sitoplazmada ribozomlarda gerçekleşir. Transkripsiyon basamakları • Başlangıç – Genin 5’ ucundan – RNA polimeraz promotora bağlanır. – DNA çift zinciri ayrılır. • Uzama – Nükleotidler 3’ uçtan ilave olur. – GTP’den enerjisi sağlar. • Sonlanma – Genin 3’ ucunda gerçekleşir. Ökaryotik mRNA işlenmesi • 5’ uç: şapka/capping – 5’ uca 7-­‐methylguanosine ilavesi • 3’ uç: poly(A) kuyruğu – 3’uca 150-­‐200 adenin nükleotidi eklenir. • Intron çıkarılması – 5’GU ve 3’AG – snRNP splaysozom katalizi sağlar. RNA İzolasyonu • Gen anlatımı • Gen anlatımının analizi • Gen anlatımının düzenlenmesi • İşlenme • Klonlama çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna dayanır. • Klonlama çalışmalarında cDNA kitaplığının kurulması ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu için total RNA’dan mRNA izolasyonu gereklidir. RNA Ekstraksiyonu • Hücre çeperi ve membranının parçalanması (LİZİS) • Hücre lizatının santrifüjlenmesi (diğer makromoleküllerden ayrılması) Genomik DNA’dan ayrılması için asidik solüsyonlarla muamele Trizol, Guanidinium HCl veya guanidinium tiyosiyanat (güçlü denaturanlar) homojenatı, ile fenol:kloroform ekstraktı uygulanabilir. Pürifikasyon • RNA’nın yoğunlaştırılması • Kalite ve saflığının tespiti RNA İzolasyonu • BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONU, diğer moleküllerle kontamine olmamış ve yıkılmamış RNA’ların saflaştırılması demektir. • Riboz rezidüleri 2’ ve 3’ pozisyonunda halkasal grup taşıdıklarından kimyasal olarak DNA’dan daha reaktiftir ve Rnaz ile kolayca yıkılır. RNA saflaştırılmasının en güç yanı endojen RNaz’ların RNA’yı parçalamalarıdır !!! Ekzojen Rnaz’lar Endojen ve Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları; • Endojen RNaz için; -­‐Guanidinium isothiocyanate (GITC) -­‐RNAzol/Trizol/Ultraspec (14M GITC and urea salts) -­‐Qiagen RNeasy – kullanılmalı • Eksojen RNaz profilaktik tedbirlerin kullanılması ile ortadan kaldırılabilir. • Eksojen Rnaz kontaminasyonu en sık; -­‐Kontamine bufferlar -­‐Otomatik pipet uçları ile olur. dikkatli Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları; • Bazı cam eşyalar %0.1 oranında çözünmüş DEPC bulunan suda 2 h 37oC’de bekletilip steril dH2O ile yıkanarak 15 d. otoklavlanır. • Cam eşyalar 180oC’de 8 h, 300oC’de 4h veya kloroform ile yıkanarakda Rnaz inaktive edilebilir. DEPC ciddi karsinojen maddedir!! RNA Analizi • • • • Northern Analizi (Gen ekspresyonu için) cDNA kütüphanesi için kaynak RT-­‐PCR RNase koruma metotları Splicing defects GEN İFADESİ • Genom statik, transkriptom ve proteom dinamik. • Transkriptom ve proteom; hücre/doku’ya özgül profile sahip. • DNA >>>>>>RNA>>>>>> Protein GEN EKSPRESYONU ANALİZİ 5’ 3’ PROMOTOR Reporter gene analysis hnRNA exon 1 intron exon 2 transcription 3 ’ 5 ’ RNA processing RNA analysis mRNA 5 ’ 3 ’ AAAAAA m7GpppN degradation protein mRNA Analiz Yöntemleri • Northern Analizi (Tek gen analizi) • RT-­‐PCR (Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu) (Tek gen analizi) • Mikroarray-­‐Mikroçip (Genom boyunca analiz) Splicing defects Northern Analizi • Bu yöntemde DNA yerine mRNA veya viral RNA kullanılarak işlem yürütülür. 1.RNA izolasyonu, 2. RNA’nın jel elektroforezinde yürütülmesi 3. Uygun bir membrana aktarılması 4.Membrandaki RNA’ların, radyoaktif işaretli ve tek zincirli bir DNA prob ile melezlenmesi ve sonucun otoradyografi veya boyamayla saptanması Bu yöntemin avantajı, genin RNA kopyasının boyutunun belirlenmesi ve farklı dokularda farklı RNA ürünü olasılığının araştırılmasında kullanılmasıdır. Ancak işlem hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas değildir. Northern Blotting 5 –10µg izole edilen RNA 260/280nm ~ 2.0 (c.f. DNA 1.8) Denatürasyon için formamide ile ısıtılır. Agaroz jel elektroforezi Formaldehyde 0.66M/2.2mM Glyoxal/Methyl Mercuric Hydroxide Tuz solüsyonu kullanılarak membrana RNA Blotlamazı/transfer Northern Blotting RNA transferi naylon yada nitroselüloz membran/filtre Hibridizasyon bufferı oldukça önemlidir. (Rapid Hyb ~ 1hr) Prob (cDNA fragment/antisense RNA) kemolimünesan yada radyoaktif olarak işaretlenebilir. Random işaretleme yaygın olarak kullanılan metottur. Northern Blotting Ambion RNAlater Glyceraldehyde 3’ phosphate dehydrogenase (GAPDH), β-actin, β2-microglobulin Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR • Total veya polyA RNA üzerinden transcriptase” enzimi ile cDNA sentezlenir. “reverse • Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır. • Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir. • İşlem hacmi northern mikroarraylerden düşüktür. blot’tan yüksek Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR • Genler etkilerini mRNA üretimi ile ortaya çıkarırlar. • Normal koşullarda RNAz enzimlerinin aktivitesi ile çok çabuk parçalandıklarından, mRNA’lar ile laboratuvar şartlarında çalışılması oldukça güçtür. Bu nedenle mRNA preparatları mRNA’nın DNA karşılığı olan cDNA’ya çevrilirler ve bu halde kullanılırlar. • RT-­‐PCR’dan mRNA veya viral RNA’nın çoğaltılmasında faydalanılır. • Bu PCR çeşidinde bir ters transkriptaz enzimi (RT) ve DNA primeri kullanılır. Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR • RT-­‐PCR iki aşamalı olup RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi (ters transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA (cDNA)’nın da standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar. • RT-­‐PCR’da reaksiyonun ilk basamağı olan ters transkripsiyon aşamasında kullanılan primerler (oligo dT veya random) poliadenillenmiş bölgeye bağlanırlar. Bu nedenle RT-­‐PCR ile 3’-­‐ poly (A) kuyruğuna sahip mRNA’ların çoğaltma işlemleri yapılabilir. • Primer bağlanma yerlerinin genelde transkriptin tam ucunda olmaması nedeniyle tüm RNA molekülünün tam kopyasının çoğu kez elde edilememesi yöntemin zayıf yönüdür. İşlem hacmi Northern blot’tan yüksek mikroçiplerden düşüktür. Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR Revers transkriptaz enzimi ile RNA DNA’ya dönüştürülür. Oligo dT 5’ Random primers (pdN6) 5’ 3’ AAAAAAA TTTTTTT 3’ NNNNNN Gene-specific primer NNNNNN 5’ 3’ AGCGA *Semi-­‐quantitative PCR *Quantitative Real-­‐Time PCR e.g. TaqMan AAAAAAA AAAAAAA Revers transkripsiyon (RT)-­‐PCR RT Reaksiyonu; 1 µg total RNA 500ng primer (pdN6) 0.1 mM DTT 1mM dNTPs 1U RNase inhibitor Nuclease free H2O Toplam 1µl 1µl 1µl 2µl 1µl 13µl 19µl –80°C 4’ ısıt, snap on ice + 1µl 200U MMLV – superscript (Invitrogen) 25°C – 10’ 42°C – 50’ 95°C-­‐2’ 1-­‐20µl into 50 µl typical PCR Reverse transcription (RT)-­‐PCR For rare messages –other RT enzymes available e.g. ImProm (Promega) RT ve PCR reaksiyonu aynı tüp içerisinde gerçekleştirilebilir. (QIAGEN OneStep RT-­‐PCR Kit) DNA Mikroarray (DNA Mikrodizin) • cDNA array: 500-­‐5000 bç uzunluğunda probların cam yüzeylere basılması ile üretilir. • Oligo array: 20-­‐80 bç uzunluğundaki oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip yüzeyine immobilize edilmesi veya doğrudan çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir. Mikroarray • İleri derecede genotip ve gen ekspresyon analizleri için geliştirilmiş bir tekniktir. • Küçük örnek hacimleri kullanılarak tek deneyde mikroçipler, Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) veya değişik (örn: hastalıklı) ve normal fizyolojik koşullardaki modifiye gen ekspresyonunun (mRNA’daki artış ve azalışlar) hızlı bir şekilde çalışılmasını sağlar. • Mikroçip teknolojisi ile yaklaşık 1.8*1.8 cm ebatlarındaki bir cam üzerinde (dizi veya array) birden fazla DNA bölgesini (neredeyse tüm bir genomunu) tek bir seferde yüksek hassasiyette incelemek mümkündür. • DNA mikroçipleri aktif proteinlere çevrilebilen ya da çevrilemeyen RNA’ların saptanmasında da kullanılabilir. Bu tip analizler ekspresyon analizi ya da ekspresyon profili belirleme şeklinde adlandırılır. Mikroçip yönteminin kullanım amaçları iki hedefe yönelik olarak uygulanmaktadır. 1. Gen ekspresyon düzeyinin ve düzey farklılıklarının ölçülmesi: 2. Genom baz dizisinin ve genomlar arası dizi farklılıklarının ortaya konması: Tek nükleotid polimorfizmi (single nucleotide polymorphism) gibi teknikler ile mutasyon analizleri yapılabilmektedir. Bu amacı gerçekleştirmek için bir gende olabilecek tüm farklı mutasyon ihtimalleri tek bir çip ü zerinde test edilir. SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya hastalığa yatkınlığa neden olan genler saptanabilmektedir. Avantajları • Aynı anda binlerce hatta genomdaki tüm genlerin ekspresyon düzeyleri incelenebilmektedir. • Belli bir hücre türünün belirli bir ortam için gen ifadesi profili belirlenip, bu profiller farklı hücre tipleri ve/veya farklı çevre koşullarındaki gen ifadesi profilleriyle karşılaştırılabilirler. • Bu işlemler için yüksek kararlılık ve verim elde edebilmek amacıyla az miktarlarda DNA örneği yeterli olmaktadır. • Mikroçip teknolojisi sayesinde, DNA üzerindeki tek baz değişiklikleri bile saptanabilmekte, kısa sürede ve oldukça pratik olarak birkaç bin genin analizini yapmak mümkün olabilmektedir. • Otomasyona dayalı bir sistem olduğu için insan kaynaklı hataların ortaya çıkma ihtimali de oldukça düşüktür . Dezavantajları • Tüm deney düzeneği nükleik asit hibridizasyon yöntemine bağlıdır ve yüksek oranda benzerlik gösteren DNA dizileri problem yaratabilmektedir. Bu nedenle mikroçipten elde edilen veriler klasik gen ekspresyon analiz yöntemleriyle doğrulanmalıdır. • Ayrıca tüm mikroçip deneylerinin aynı hassasiyette olmayışı, ekspresyondaki küçük değişikliklerin analizde fark edilemeyecek boyutta olması, birbirinden farklı çipler kullanılarak yapılan deneylerin karşılaştırılmasında yaşanan zorluklar, optimizasyon ve standardizasyon sorunları ve herhangi bir deneyden elde edilen sonuçları her yönüyle değerlendirebilecek biyoinformatik programların henüz tam geliştirilememiş olması karşılaşılan sorunlardan birkaçıdır. Bu tür sorunları çözebilmek amacıyla Microarray Gene Expression Data Society gibi bazı yeni kuruluşlar oluşturulmaktadır. • Microarray’lerin gen ekspresyonu için kullanımı ile ilgili çalışmalar ilk kez 1995’de Science Dergisi’nde yayınlanmıştır. 39 • Microarray ile tamamlanan ilk ökaryotik genom ise Saccharomyces cerevisiae’ ninki olmuştur ve bununla ilgili çalışma da yine Science Dergisi’nde, 1997 yılında yayınlanmıştır. Bitkilerde mikroçip teknolojisi ilk defa Arabidopsis’te 40 • Mikroçip teknolojisinin temeli moleküler hibridizasyondur. Bu teknikle hazırlanan bir gen dizisinin (prob) araştırmak istenilen örnekte (DNA, RNA veya protein) komplementerinin olup olmamasının bulunması esasına dayanır. 41 Mikroarray Çalışma Tekniği 1. Hedef DNA/cDNA dizilerine tamamlayıcı diziler içeren probların immobilize edildiği mikroarray platformunun hazırlanması veya ticari olarak temin edilmesi. 2. İncelenecek numuneden floresan ile işaretlenmiş cDNA/DNA/cRNA’nın hazırlanması. 3. İşaretlenmiş cDNA/DNA/cRNA ile mikroçip platformunun hibridizasyon solüsyonu içerisinde karşılaştırılması. Mikroarray Çalışma Tekniği 4. Yıkama sonrasında platform yüzeyinde hibridizasyonun varlığının tarayıcı veya okuyucu aracılığıyla analiz edilmesi ve görüntünün bir bilgisayarda depolanması. 5. Depolanan görüntünün bir yazılım aracılığıyla değerlendirilmesi ile mikroçip platformu üzerindeki hangi noktalarda hibridizasyon olup olmadığının ve niceliksel olarak düzeyinin (koyu mavi-­‐yeşil-­‐sarı-­‐ kırmızı renk yelpazesinde) değerlendirilmesi ve yorumlanması. • İncelenecek örnek (kan, beyin omurilik sıvısı, tümör gibi değişik dokulardan elde edilen DNA veya RNA molekülleri) floresans veya radyoaktif olarak işaretlendikten sonra amaca uygun çipler ile hibridizasyona bırakılır. 45 • Sinyallerin büyüklüğü ve lokalizasyonu bilgisayar yardımı ile değerlendirilerek sonuca gidilir. 46 Mikroçipler; hastalıklı ve normal bir hücrede gen ekspresyonunun karşılaştırılması suretiyle hastalık ile alakalı genlerin belirlenmesinde kullanılabilmektedir. 47
