özel ege lisesi kanser tedavisi için yenilikçi nanomalzeme üretimi
advertisement
ÖZEL EGE LİSESİ KANSER TEDAVİSİ İÇİN YENİLİKÇİ NANOMALZEME ÜRETİMİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Selin Yağmur ÇAKMAK Bora BÖLÜKBAŞI DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Dr. Onur AKPINAR İZMİR 2017 İÇİNDEKİLER Sayfa 1. GİRİŞ….……………………………………………………………………….. 1 1.1 Nanoteknoloji ve İlaç Taşınımı………………………………...................... 1 1.2 Kanser……………………………………………………………………… 2 1.2.1 Akciğer Kanseri……………………………………………………….. 3 1.3 Geleneksel Kanser Tedavi Yöntemleri ve Dezavantajları…………………. 5 1.4 Kanser Tedavisinde Nanoteknolojinin Uygulanması……………………… 5 1.4.1 Altın Nanopartiküller………………………………………................. 6 1.4.2 Lipitler………………………………………………………………… 9 1.5 Projenin Amacı……………………………………………………………... 11 2. YÖNTEM…………………………………………………………………….... 11 2.1 Materyal……………………………………………………………………. 11 2.2. Sitrat Kaplı Altın Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu... 12 2.3 Lipitlerin Hazırlanması……………….......................................................... 13 2.3.1 Lipit Esaslı Altın Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu…......................................................................................... 13 2.4. Hücre Kültürü……………………………………………………………… 14 2.4.1 MTT Testi ile Hücre Canlılığı Üzerine Lipit Esaslı Altın Nanopartiküllerin Etkisinin Saptanması…………………………………….. 15 3. BULGULAR…………………………………………………………………… 16 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA……………………………………………….. 22 5. ÖNERİLER……………………………………………………………………. 25 KAYNAKLAR.…………………………………………………………………... 26 1. GİRİŞ 1.1 Nanoteknoloji ve İlaç Taşınımı Nanoteknoloji; multidisipliner bir alan olup, moleküler ölçekte (1-100 nm veya daha küçük boyutta) fonksiyonel sistemlerin dizayn edilmesinde görev alır. Buradaki “nano” terimi bir metrenin bir milyarda biri olan (1 nm = 10-9 m) ölçü değeridir. Nanopartikülün çapı biyomoleküllerin ölçülerine çok benzemektedir: proteinlerin boyutu 1-20 nm, DNA’nın çapı 2 nm, virüs 20 nm, hücre yüzey reseptörü 10 nm, hemoglobin 5 nm, hücre zarının çapı 6-10 nm. Dolayısıyla bilim insanları, nano ölçekte bu materyallerin özelliklerini anlamaya çalışarak onları tıpta kullanmak üzere geliştirmeye çalışmaktadırlar (Patra ve ark., 2010). Nanopartiküllerin normal bir insan hücresinden yüzlerce hatta binlerce kat daha küçük olmasından dolayı; nano ölçekli cihazlar hücrelerin içine ve organellerin içine kolayca girebilir ve DNA, protein, enzim ve hücre reseptörleriyle etkileşebilir. 20 nm’den küçük olan nanopartiküller, kan damarları yoluyla tüm vücutta dolaşabilirler. Kansere yol açan durumların da dâhil olduğu biyolojik süreçler hücre içinde nano ölçekte meydana gelir. Nanoteknoloji çok küçük hacimlerdeki hücre veya dokulardaki hastalığı saptayabilmek için yeni araçlar sunmaktadır. Genel olarak, nanoteknoloji bilim insanlarının şu anda yapmakta oldukları çalışmalardan daha hızlı ve daha etkili yöntemler ortaya koymaktadır (Patra ve ark., 2010). Nano-tıp, moleküler nano teknoloji disiplinin en yeni üyesidir. Nano-tıp, nano materyal ve nano sistemler kullanılarak moleküler seviyede biyolojik sistemlerin izlenmesi, tamir edilmesi, yapımı ve kontrolünde kullanılmaktadır. Bir ilacın nano boyutta taşınabilmesi araştırmacılar için çok büyük bir önem taşımaktadır. Yeni bir ilacın gelişimi temel olarak iki ana konuda yer almaktadır: var olan hastalığa karşı maksimum etki ve olası yan etkilerinin minimum olmasıdır. Bununla birlikte, ilaç taşınımıyla ilişkili, ilacın çözünürlüğü, biyolojik aktivitesi, kan dolaşımında kısa süre kalması, hedef organa ulaşamaması gibi bazı zorluklar bulunmaktadır. İlaçların nanopartikül aracılı hedeflenmiş taşınması, onların dozajının düşürülmesine, ilaç yüklemesinin düzenlenmesine, özelliklerinin daha net ortaya çıkmasına, hedefte spesifikliğinin ve biyobulunabilirliğinin artmasına, toksisitesinin azaltılmasına ve raf ömrünün uzamasına olanak sağlar. İlaç taşıyıcısı olarak bu nanopartiküllerin avantajı, kanser ilaç direncinin üstesinden gelmesidir (Drbohlavova ve ark., 2013). İlaç taşınım sistemleri, hedef hücrede etkili olan ilacın konstantrasyonunu optimize etmek için geliştirilmiştir. İlaç taşınım sistemlerinin fonksiyonu 3 ana başlıkta incelenmiştir. Birincisi, bu sistem katalitik enzimler gibi biyokimyasal şartlara karşı ilacı korumalıdır. İkincisi, bu ilaç taşıma sistemi, ilacı spesifik hedef bölgeye taşımalı ve yeterli miktarlarda ilacın salınımına olanak sağlamalıdır. Üçüncü olarak da, bu sistem aracılığıyla nanopartiküller vücuda enjekte edildiğinde, hiçbir zaman toksik özellik göstermemesi ve biyolojik olarak parçalanması gerekmektedir (Viitala ve ark., 2016). Klasik terapötik ajanlar vücutta spesifik olmayan şekilde dağılım gösterdiklerinden hem hedefi (hastalıklı hücre veya doku) hem de normal hücreleri etkilemektedir. Bu olay hedef hücreye ulaşan ilaçların etkili dozunun normalden daha az olmasına sebep olduğundan vücutta yanlış reaksiyonlara sebep olmaktadır (Khodabandehloo ve ark., 2016). İlaç parçalanması ve kaybını en aza indirmek, zararlı yan etkilerini ortadan kaldırmak, biyobulunabilirliği yüksek ilaçlar elde etmek adına son yıllarda ilaç taşıma sistemleri geliştirilmiştir (Kulkarni ve ark., 2011). Nanopartiküllerle tümörlerin hedeflenmesi, pasif veya aktif yol ile gerçekleşmektedir (Drbohlavova ve ark., 2013). Pasif hedeflemenin bir örneği, kemoterapötik ajanın sağlıklı dokularla kıyaslandığında tümör dokularının damar geçirgenliğinin arttırılmasına sebep olan solid tümörlerde birikmesidir. Ligand içeren ilaç -1- taşıyıcıların yüzeyi ilgili hücrenin yüzeyindeki reseptörü tanıyan antikorlarla fonksiyonel hale getirilmesi seçicilik sağlayan aktif hedeflemeye örnektir (Kulkarni ve ark., 2011). Bu partiküller aralarında biyomoleküllerin de bulunduğu farklı materyal tipleri ile modifiye edilerek kanserli hücrelerin hedeflenmesi gerçekleştirilmektedir. Nanopartiküller ile aktif tümör hedefleme, tümör hücreleri tarafından ifade edilen reseptörlere nanopartiküllerin ligand aracılı bağlanmasına dayanmaktadır. Bu ligand molekülleri, antikorlar, peptitler, nükleik asit aptamerler, karbohidrat ve küçük moleküllerden oluşmaktadır (Drbohlavova ve ark., 2013; Kang ve Ko, 2015; Kulkarni ve ark., 2011; Viitala ve ark., 2016). Anti-kanser nanopartiküllerin en önemli özellikleri genel olarak nano boyutta, hidrofobiklik gibi yüzey özelliklere ve hedeflenmiş ligandlara sahip olmasıdır. Genel olarak 200 nm nanopartikül boyutunda üst sınır olarak düşünülürken, 10 nm’lik nanopartikül boyutu en alt sınır olarak literatürde geçmektedir. Nanopartikül özellikleri, kanser tipi, hastalığın safhası, vücutta bulunduğu bölge gibi tümör karakteristliklerine bağlı gereksinimleri de bulunmaktadır (Drbohlavova ve ark., 2013). İlaç taşıyıcıları arasında lipozomlar, lipitler, polimerler, dendrimerler, altın nanopartiküller, manyetik taşıyıcılar, viral taşıyıcılar, karbon nanotüp gibi nanomateryaller sıklıkla kullanılmaktadır (Drbohlavova ve ark., 2013; Kang ve Ko, 2015; Khodabandehloo ve ark., 2016; Kulkarni ve ark., 2011; Li ve ark., 2010; Viitala ve ark., 2016). 1.2 Kanser Kanser, dünya genelinde en sık rastlanan toplumsal sağlık problemlerinden biridir. İlk zamanlarda bir tedavi yöntemi olmadığı düşünülürken, günümüzde erken teşhis ile birlikte kanserle mücadele mümkün hale gelmiştir (Patra ve ark., 2010). Buna rağmen, kanser; son yıllarda hem teşhis, hem tedavi olanaklarındaki önemli gelişmelere rağmen, en çok ölüme sebep olan hastalıklar arasında kardiyovasküler hastalıklardan sonra ikinci sırada yer alıp Dünya Sağlık Örgütü’ne (WHO) bağlı Uluslararası Kanser Araştırmaları Kurumunun (IARC) 2030 yılı için öngörüsü birinci sırada olacağı yönündedir. Bunlara ek olarak giderek artan hazır gıda (fast food) yeme alışkanlıkları, çok miktarda şeker ve tuz tüketimi, kanserojen tekstil boyaları ve kumaşlar, katkı maddesi içeren kozmetikler, alkol ve sigara kullanımı, aşırı stres, radyasyon, ultraviyole ışınları gibi pek çok etken sebebiyle kanserin yayılma hızı gün geçtikçe artmaktadır (Donaldson, 2004). Günümüzde kanser sözcüğü malignant tümörü tanımlamak için popüler bir şekilde kullanılır. Onkoloji, tümörlerlerin gelişimi, epidemiyolojisi, teşhisi ve tedavisiyle ilgilenen tıp dalıdır. Tümör, benign (iyi huylu) veya malignant (kötü huylu) olabilen anormal hücre topluluğudur. Benign tümörler genellikle çok yavaş büyürler ve diğer dokulara yayılmazlar. Bu tür tümörler yalnızca dokunun normal fonksiyonuyla etkileşiyorsa veya beyin gibi belirli bir alanda büyüyerek baskı yaratıyorlarsa zararlıdırlar (Ahmed ve ark., 2007). Malignant kanser hücreleri, hücre döngüsünün hızlanması, genlerin değişimi, kontrolsüz büyüme, artan hücre hareketliliği, hücre yüzeyindeki değişiklikler ve litik faktörlerin salgılanması gibi olaylar ile nitelendirilir. Morfolojik olarak malignant bir kanserli hücrenin, büyük bir nükleusa sahip olması, normalden farklı bir şekil ve büyüklüğünün olması, nükleoinin belirgin olması, sitoplazmanın az ve koyu renkli ya da tam tersine çok soluk renkli olması en belirgin özellikleridir (Baba ve Câtoi, 2007). Kanser dünyada bir yılda 8,2 milyon, Türkiye’de ise 422,000 kişinin ölümüne sebep olmaktadır. Günümüzde birbirinden farklı tanı ve tedavi yöntemine sahip 100 farklı kanser türü olduğu bilinmektedir. Bu kanser türleri içerisinde akciğer, prostat, kolon, mide ve karaciğer kanseri erkeklerde en sık görülen kanser türleriyken; göğüs, akciğer, kolon, rahim ve mide kanseri de kadınlarda en sık görülen kanser türleridir. Kansere özellikle endüstrileşmiş batı ülkelerinde daha sık rastlanır, fakat gelişmekte olan ülkelerde de bu -2- hastalığın yayılma hızı gittikçe yükselmektedir. Önümüzdeki iki yılda kanser vakalarındaki oranın %70 artması beklenmektedir (Dünya Sağlık Örgütü, 2015) (Şekil 1). Şekil 1. Dünya Sağlık Örgütüne göre erkeklerde (A) ve kadınlarda (B) cinsiyete bağlı kanserin insidans ve mortalite oranları (GLOBOCAN, 2012). 1.2.1 Akciğer Kanseri 20.yüzyılın başlarında var olmayan bir maligniteden, akciğer kanseri günümüzde, dünya genelinde en yaygın görülen kanser halini almıştır ve birçoğu ülkede en çok ölüme sebep olan kanser olmuştur (Lu ve ark., 2010). Her yıl erkeklerde 900,000 ve kadınlarda 330,000 insana akciğer kanseri tanısı konmaktadır (Brambilla ve Travis, 2014). Dünyada 2012 yılında 1,8 milyon kişiye akciğer kanseri tanısı konulurken yaklaşık 1,6 milyon kişi akciğer kanseri nedeniyle hayatını kaybetmiştir. (Akyay ve ark., 2015) Akciğer kanseri hastalarında beş yıl kurtulma oranı (the five-year survival rate), etkili bir tedavi yönteminin bulunmamasından dolayı, %15’ten daha azdır. Histopatalojik ve biyolojik perspektiflerden bakıldığında akciğer kanseri kompleks bir neoplazmdır. En yaygın histolojik tiplerinden bir tanesi, küçük olmayan hücre akciğer kanseridir (non-small-cell lung cancer, NSCLC). Bu türdeki akciğer kanserlerinin üç tipi vardır. Bunlar; skuamöz, hücre karsinoması, adenokarsinoma (Bronşiolo alveoler karsinomanın invaziv olmayan tipi de dâhil olarak) ve büyük hücreli karsinomadır. Bir diğer histolojik tipi ise, küçük hücre karsinomasıdır (small-cell lung cancer, SCLC) (Lu ve ark., 2010). Akciğer kanserlerinin yaklaşık %40’ı adenokarsinomadır ve bu genellikle periferik akciğer dokusunda oluşur. Skuamöz, hücre karsinoması ise akciğer kanserlerinin %30’unu oluşturur. Tipik olarak büyük solunum yollarına yakın yerlerde meydana gelir. Hücre ölümleri genellikle tümörün merkezinde gerçekleşmektedir. Akciğer kanserinin %9’u büyük hücreli karsinomadır ve bunun adı kanser hücrelerinin, fazladan sitoplazmalı, büyük çekirdekli ve dikkat çeken yapıda nükleolusa sahip olmasıdır (Lu ve ark., 2010). Küçük hücre akciğer kanserinde hücreler yoğun miktarda nöro-endokrin hormon içeren veziküller bulundurur. Bunlar, tümöre endokrin/paraneoplastik sendrom ilişkisi verir (Rosti ve ark., 2006). Çoğu durumda büyük solunum yollarında (primer ve sekonder bronşlarda) ortaya çıkar (Collins ve ark., 2007). Akciğer kanseri genellikle, yıllarca tütün kullanımı sebebiyle belirli protoonkogenlerde ve tümör baskılayıcı genlerinde, genetik ve epigenetik değişiklikler olmasından -3- kaynaklanır. Diğer birçok kanser türünde olduğu gibi onkogenin aktivasyonu veya tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu ile başlar (Cooper ve ark., 2013). Birçok çalışma, tütün kaynaklı karsinogenin 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), akciğer karsinogenezine yol açtığı ve yalnızca genetik merkezli mekanizmalar ile değil, aynı zamanda hasar gören DNA’yı taşıyan hücreleri apoptozdan koruyan çeşitli sinyal yollarıyla etkili olduğunu kanıtlamıştır (Boo ve ark., 2016). Akciğer kanserinin diğer mesleki ve çevresel nedenleri arasında ise radon, arsenik, krom, nikel, vinil klorür ve iyonize radyasyona maruz kalmak gibi etkenler de sayılabilir. Ayrıca kronik obstrüktif akciğer hastalığı, idio patik pulmoner fibroz ve tüberküloz gibi önceden var olan kötü huylu olmayan akciğer hastalıkları akciğer kanseri oranlarının artması ile ilişkilidir (Collins ve ark., 2007). Akciğer kanseri teşhisinde, erken teşhis önemlidir. Daha yeni oluşmuş akciğer kanseri hücrelerinin tespiti için günümüzde balgam sitolojisi, esnek bronkoskopi ve transtorastik iğne aspirasyonu gibi seçenekler mevcuttur. Balgam sitolojisi, merkezi yerleşimli tümörleri belirlemede yardımcı olabilecek invaziv olmayan bir testtir. Bu test, merkezi tümörlerin %71’ini tespit ederken, periferal tümörlerin %50’den daha az bir miktarını tespit edebildiğinden dolayı, daha ileri testler olumsuz sonuç izlemektedir. Esnek bronkoskopi yöntemi merkezi tümörlü hastalarda sıklıkla tercih edilen testtir ve bu hastalarda %88 oranında bir hassasiyet vardır. Floroskopik ve bilgisayarlı tomografi (BT) kılavuzluğunda transbronşiyal iğne aspirasyonu eklenmesine rağmen, bronkoskopinin duyarlılığı %70'e düşmektedir. Transtorastik iğne aspirasyonu yöntemininde ise periferik akciğer tümörlü hastalarda bronkoskopiden daha duyarlı olduğu gösterilmiştir ve transbronşiyal iğne aspirasyonu yetersiz olduğunda veya cerrahi aday olmayan hastalarda kullanılabilir (Collins ve ark., 2007). Akciğer kanseri için önemli olan bir diğer husus evrelendirmedir. Akciğer kanserinin doğru evrelendirilmesi, hastalığın uygun tedavisi ve yönetimi için gereklidir ve hastanın sağlığı için öngörüler sağlar. Bronkojenik karsinomun anatomik patolojik tanısı yapıldıktan sonra ilk aşama hastalığın veya evrenin derecesinin belirlenmesidir, çünkü bu uygun terapiyi yönlendirecek ve sağ kalımı öngörecektir. Bu aşamada en önemli karar, neoplazmalarını cerrahi rezeksiyon ile alabilen hastalar ile, kemoterapi ya da radyoterapi veya ikisini birden alması gereken hastaların belirlenmesidir. Hastanın cerrahi rezeksiyona olan potansiyelinin belirlenmesi genellikle küçük olmayan hücre akciğer kanserinde uygulanabilir, çünkü bu yöntem küçük hücreli akciğer karsinoması için bir tedavi alternatifi değildir. Bununla birlikte, küçük hücreli kanser için, sınırlı ve yaygın hastalıkların daha basitleştirilmiş evreleme sınıflandırması kullanılır. Küçük hücreli kanserli hastaların büyük bir kısmı tek başına kemoterapi ile tedavi edilirken, sınırlı hastalık kemoterapi ve radyasyon ile tedavi edilir. Küçük olmayan hücre akciğer kanseri için TMN evreleme sistemi, klinik evreler halinde gruplandırılmış TMN alt kümeleri ile birlikte kullanılır (Barker ve Silvestri, 2002). Akciğer kanserlerinin yaklaşık olarak %85-%90’ına küçük olmayan hücreli akciğer kanseri (NSCLC) tanısı konur ve bu durumda platin yapılı kemoterapi standart ve ilk sırada yer alan alternatif tedavi yöntemidir. NSCLC’nin yanında adenokarsinoma en yaygın akciğer kanseri tipidir. Kanser tedavisindeki gelişmelere rağmen, tedavi çoğu durumda olumsuz sonuç getirir; bu da hastalığın ilerlemesine, metastaza ve kanserin tekrarlanmasına sebebiyet vermektedir. Tedavinin başarısız olmasındaki en önemli sebeplerden bir tanesi intratümöral heterojeneritedir (Jeon ve ark., 2016). -4- 1.3 Geleneksel Kanser Tedavi Yöntemleri ve Dezavantajları Kanser oluşumu çeşitli çevresel, sosyal, kültürel, hormonal ve genetik faktörler gibi faktörlerle ilişkilidir. Sigara içmeye ek olarak, azalan fiziksel aktivite, yüksek kalorili yiyecekler de kansere sebebiyet veren büyük etkenlerdir. Tıbbın gelişmesi ve tedavi yöntemlerinin araştırılmaya başlanmasıyla, kanser yaygın olarak cerrahi işlemlerle tedavi edilmeye başlanmıştır. Fakat günümüzde bile cerrahi işlemin risk faktörleri olan organ kaybı, kanserin tekrarlama olasılığına sahip olması ve bazı kanser tiplerine uygulanamaması, tıp dünyasını yeni tedavi yöntemlerini araştırmaya itmiştir. Bu süreçte teknolojinin de gelişmesiyle günümüzde de sıklıkla kullanılan radyoterapi ve kemoterapi yöntemleri ortaya çıkmıştır (Aslam ve ark., 2014). Günümüzde birçok kanser tedavi yöntemi bulunmasına rağmen hepsinin yan etkileri de mevcuttur. Malignant tümörlerin tedavisinde kullanılabilen en etkili yöntem kemoterapidir. İlk zamanlarda, kemoterapi ilaçlarının spesifik olarak sadece kanser hücrelerini öldürdüğü düşünülse de son yıllarda kemoterapinin normal hücrelere de zarar verdiği ayrıca bu ilaçları kullanan insanlarda bitkinlik, kusma, saç dökülmesi, ishal, ağızda kuruluk ve hatta ölümlere sebebiyet verebilmektedir (Chabner ve Roberts Jr., 2005). Klasik kemoterapi ilaçları vücutta hedefe yönelik hareket etmemektedir. Kullanılan ilaçlar kanserli hücrelere etki ettiği gibi sağlıklı hücrelere de etki etmektedir. Ayrıca kanserli hücrelere, tedavi için gereken dozlar da ulaşmamaktadır (Conde ve ark., 2013). Kemoterapi, hastanın bağışıklık sistemini zayıflatmakta ve hasta, diğer hastalıklara daha duyarlı hale gelmektedir. Karşılaşılan bir diğer sorun, antikanser bileşenlere karşı gelişen çoklu ilaç direnci (Multi Drug Resistance) durumudur. Tüm bu önemli yan etkiler, kemoterapi ilaçlarının dokuya özgü etki etmemesinden kaynaklanır. Radyoterapi, kanser hücrelerini çekirdeklerindeki DNA’lara hasar vererek öldürmek için yüksek enerjili ışınları kullanan bir tedavi yöntemidir. Genel olarak tümör bölgesinin ışın tedavisi dışarıdan (harici ışın tedavisi) uygulanmaktadır. Seed olarak isimlendirilen radyoaktif madde içeren kapsüllerin direkt olarak tümörün içine yerleştirilmesi de radyoterapinin bir başka çeşididir. Klinik uygulamalarda hastalara verilen radyasyon dozu, genellikle yan etkilerin şiddetini ve sayısını azaltmak ihtiyacıyla sınırlanır. Tedavinin tamamlanmasından üç ay ve daha fazla sürede görülmeye devam eden veya oluşan geç yan etkiler genellikle daha kalıcı ve ilerleyebilir seviyede olduğu için akut etkilere göre daha doz sınırlıdır. Radyasyon sekellerinin gelişimi, ışına maruz kalmış normal dokuların hacmine bağlıdır. Ancak bu ilişki birçok doku türü için belirsiz olup ışın terapisinin yan etkileri, çoğunlukla tamamen önlenemez. Bu yan etkiler; yorgunluk, cildin tahriş olması, ateş, ağzın yara olması ve kurumasıdır. Aynı zamanda radyoterapi sırasında kanserli hücreler kadar olmasa da sağlıklı hücrelerde belli bir oranda zarar görür (Dearnaley ve ark., 1999). Cerrahi yöntemler, kanserli dokunun çıkarılmasından ibarettir. Organ kaybı, kanserin tekrarlama riski ve tüm kanser tiplerine uygulanamaması bu yöntemlerin dezavantajlarındandır (Nehru ve Singh, 2008). Günümüzde en yaygın şekilde kullanılmakta olan bu tedavi çeşitleri her ne kadar başarıya ulaşsa da gösterdiği ciddi yan etkileri sebebiyle hastaların eski sağlığına kavuşmaları mümkün olmamaktadır. Bu yüzden yalnızca kanser hücrelerini hedef alan, toksik özelliği ve yan etkileri az veya bulunmayan yeni yöntemler araştırılmaktadır. 1.4 Kanser Tedavisinde Nanoteknolojinin Uygulanması Kanser nanoteknolojisi, nanoteknolojinin medikal uygulamaları kapsayıp kanser tanı ve tedavisinde yeni yöntemlerin uygulanmasında, zarar görmüş hücre ve dokuların tamir edilmesinde ve ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesinde umut vadeden kullanışlı bir -5- uygulama sunmaktadır. Ayrıca kanser nanoteknolojisi, kanser tanı ve tedavisi ile ilişkili spesifik olarak nano boyutta kullanılan biyo-araçların karakterize edilmesinde kullanılmıştır. Çok küçük boyutlara sahip olan ve ilaçları taşıyan nano-partiküllerle modifiye edilmiş yüzeyler, kanser hücrelerine karşı yüksek derecede spesifiklik göstererek sadece kanser hücrelerini hedeflemiştir. Nano-partiküller bir insan hücresinden yüzlerce hatta binlerce kat daha küçük yapılar olup hücre içine girip organeller ya da DNA ile etkileşerek veya hücre dışında bulunan reseptörlere bağlanarak kanser hücrelerinin tanı ve tedavisinde kullanılabileceklerdir (Patra ve ark., 2010). Nanopartiküller tümörlerin hedeflenmiş tedavisi için dizayn edilebilmektedir. Bu amaçla, demir oksitler, altın, biyoparçalanabilir polimerler, dendrimerler, lipozom ve miselleri de içeren lipit temelli taşıyıcılar, virüsler ve hatta organometal bileşikler kullanılmaktadır (Drbohlavova ve ark., 2013). 1.4.1 Altın Nanopartiküller Altın, insanlık tarihi boyunca en sık kullanılan ve en değerli metallerden birisidir. Altın yüzyıllar boyunca kullanılmış olsa da, akademik aşamada kendine yer bulması oldukça eskidir. Altının tıbbi kullanımı kısaca aşağıda tarif edilmiştir: Altının biçimsel ve şifa amaçlı kullanımının en erken kayıtları Mısır İskenderiye'den gelmektedir. 5000 yıl önce Mısırlılar; zihinsel, bedensel ve ruhsal arınma için altın yutarak kullanmıştır. Eski Yunanlılar paradoksal olarak zengin bir yakut kırmızısı haline getiren cam renklendirmek için ince zemin altın kullandılar. Altının en erken tıbbi kullanımı, M.Ö. 2500'de Çin’ de görülmüştür. Kırmızı kolloidal altın ilk defa hazırlanmış ve "uzun ömürlü ilaç" olarak kullanılmıştır. Kırmızı kolloidal altın; günümüzde Hindistan'da, Ayurveda tıbbı olarak eski çağında yenilenme ve canlanma için Swarna Bhasma ("Swarna" altın, "Bhasma" kül anlamını ifade eder) adı altında hala kullanılmaktadır. 1900'lü yıllarda cerrahlar tarafından diz veya dirsek gibi iltihaplı bir deriye yakın bir yere altın bir parça implante edilmiştir ve sonuç olarak, ağrı genellikle azaltılmış veya tamamen sona erdirilmiştir (Patra ve ark., 2010). Au-NP'lerin kontrollü boyut ve şekillerinin hazırlanmasında çok sayıda yöntem önerilmiştir. Bu yöntemler arasında elektrokimyasal ve fotokimyasal yöntemler günümüzde ıslak kimya yöntemlerinden daha az kullanılmaktadır. Islak-kimya yöntemi ile altın nanopartikül hazırlama işlemleri, genelde herhangi bir şeklin ve geniş aralıktaki altın nanopartiküllerin üretilmelerini sağlarken elektrokimyasal yöntemle nanomateryal boyutunun belirlenmesinde sınırlamaları olmalarına rağmen nanomateryal morfolojinin doğrudan hazırlanmasına izin verir (Cioffia ve ark., 2011). Faraday, 1899 yılında altının kırmızı renginin, altın koloidal boyutundan kaynaklanabileceğini öne sürdü. Bu keşif; birkaç on yıl bilim insanları tarafından unutulmuş olsa da 1951 yılında Turkevich ve arkadaşları, kaynayan suda sitrik asit ile hidrojen tetra kloroaurat (HAuCl4) kullanılarak kolloidal kırmızı renkli altını üretmişlerdir. Frens, bu yöntemi altın – sitrat oranını değiştirerek partikül boyutunu kontrol edebilmiştir. Bu yöntemle 10 – 20 nm çapındaki sferik altın nanopartüküllerin üretilmesine olanak sağlamaktadır. Brust ve Schriffin 1994 yılında altın nanopartikülü faz transfer ajanı olarak tetraoktilamonyum bromür (TOAB) ve indirgeyici ajan olarak sodyum borohidrür (NaBH4) kullanılarak alkanetiol stabilize edilmiş altın nanopartiküller sentezlenmiştir (Yeh ve ark., 2012). Literatürde çekirdek-aracılı yüzey aktif madde yardımlı altın nanoçubuk sentezi, hekzadesilsetilmetil amonyum bromür (CTAB), hidrojen tetra kloroaurat (HAuCl4) ve sodyum borohidrürün sıvı solüsyonları karıştırılması ile yaklaşık 1,5 nm çapında altın çekirdeklere oluşturulması ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonra; bu altın çekirdeklere konsantre CTAB, gümüş nitrat, hidrojen tetra kloroaurat ve askorbik asit büyüme solüsyonuna eklenir. Askorbik asit zayıf indirgeyici ajan olup çekirdek partikülünün yüzeyinde heterojen altın birikmesine sebep olmaktadır. Altın nanoçubukların tek yönde büyümesinde altın yüzeyine -6- tutunmuş gümüş iyonları etkili olduğu bulunmuştur. Gümüş konsantrasyonu arttırılarak nanoçubukların en/boy oranı 4,5 kat artarken; ortamda Ag+ iyonu yokluğunda altın nanoçubuk sentezi çok düşük verime yol açmaktadır. CTAB, nanoçubuk yüzeyini bilayer olarak kaplayarak nanoçubukların büyümesine olanak sağladığı bildirilmiştir (Smith ve Korgel, 2008). Nikoobakht ve El-Sayed (2003), belirli bir altın miktarı için gümüş nitrat miktarını değiştirerek farklı en-boy oranlarına sahip GNR'leri ürettiler. Frens tarafından önerilen altın nanopartikül sentezi Şekil 2’de şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 2. Sodyum sitratla stabilize edilmiş altın nanopartikül sentezinin şematik gösterimi (Ghosh ve Chattopadhyay, 2013). Altın nano-partiküller, moleküler proplara elverişli bir yüzey sağlaması ve lokalize plazmon rezonansı ile ilişkili dikkat çekici optik özelliklerinden dolayı nanobiyoteknoloji ve nano-tıp için yenilikçi bir yaklaşım olarak karşımıza çıkmaktadır (Liopo ve ark., 2012). Nanoteknolojide altın nano-partiküllerin kullanılması için birçok sebep vardır: i. İlk olarak, altın bileşikleri uygarlık tarihi boyunca tıpta kullanılmıştır. ii. Altın nano-partikülleri, ıslak (wet) kimya gibi güvenilir yöntemlerle kolay ve ucuz bir şekilde sentezlenmektedir. iii. Reaksiyon parametreleri sentezlenmektedir. iv. Kalıp materyalin değiştirilmesi ile farklı şekillerde (küresel, çubuk, boru, şerit, plaka ve hekzagonal şeklinde) kolay bir şekilde sentezlenmektedir. v. Altın nano-partiküllerin yüzeyi üzerinde negatif yükün varlığından dolayı birçok çeşitli biyo-molekülün kullanılarak altın nano-partiküllerin yüzeyi üzerinde modifiye edilmesine yardımcı olmaktadır. Altın yüzey ile tiol/amin içeren moleküller (organik moleküller, DNA, protein, enzim gibi) arasında güçlü etkileşim olmasından dolayı altın nano-partiküllerin yüzeyi kolay bir şekilde modifiye edilmektedir. vi. Altın nano-partiküller, bir yüzey plasmon rezonans (SPR) bandının varlığından dolayı kolay bir şekilde karakterize edilirler. vii. Elektronik davranış gibi kendine özgü optik özelliğe sahip olmasından dolayı bu partiküller biyo-sensörlerde de kullanılabilir. viii. Altın nanopartiküller biyo-uyumlu bir malzemedir. değiştirilerek boyutları 2–500 nm arasında Küre biçimindeki altın nanopartiküller boyut ve şekil-ilişkili optoelektronik özellikler, büyük yüzey-hacim oranına sahip olması, mükemmel biyouyumluluk ve düşük toksisite göstermesi gibi kullanışlı karakteristiklere sahiptir. Bu özellikler altın nanopartikülleri biyo-7- nanoteknolojide önemli bir araç kılmaktadır. Altın nanopartiküllerin önemli fiziksel özellikleri yüzey plazmon rezonans (SPR) ve fluoresans indirgeme yetenekleri sayılabilir (Yeh ve ark., 2012). 1 – 100 nm arasında çapa sahip küresel altın nanopartiküller, sıvı solüsyonlarda birçok renge (kahverengi, turuncu, kırmızı ve mor) sahiptirler ve 500 – 550 nm boyutuna bağlı olarak nispi absorpsiyon pikine sahiptir (Yeh ve ark., 2012). Bununla birlikte, altın nanoçubuklar, küresel altın nanopartiküllerden 700 nm civarında absorbans pikine sahip olması nedeniyle kolayca ayrılabilmektedir (Smith ve Korgel, 2008). Bu absorpsiyon bandı, yüzey plazmon rezonansı olarak isimlendirilen olay uyarıcı foton tarafından rezonant uyarıma bağlı olarak iletiliş elektronun birlikte titreşiminden kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, bu band 2 nm’den küçük nanopartiküllerde ve kitlesel malzemede bulunmamaktadır. Bu olay sadece nanopartikülün boyutu ile ile değil aynı zamanda nanopartikülün şekli, çözgeni, yüzey ligandı, merkez yükü, sıcaklığı gibi durumlara da bağlıdır (Yeh ve ark., 2012). Altın nanoçubukların yaklaşık 520 nm’ de küçük bir pik vermesi onun enini gösterirken, 700 nm veya üzerinde pik verilmesi ise onun boyunu göstermektedir (Liao ve Hafner, 2005; Smith ve Korgel, 2008). Çekirdek aracılı altın nanopartikül sentezin esnasında altının Au+3Au0 indirgenmesi sonucunda elde edilen yüksüz altın nanopartiküller sitotoksik olmayıp reaktif oksijen ve nitrit türlerinin üretimini de azaltmaktadırlar. Ayrıca, 1 – 2 nm boyutunda olan altın nanopartiküller oldukça yüksek toksik özellik gösterirken 15 nm’ den büyük altın nanopartiküller genellikle toksik değildirler (Patra ve ark., 2010). Altın nanopartiküller kızıl ötesi bölgede ışığı soğurduklarında konjuge oldukları dokuların etrafında sıcaklık yayılması gerçekleşir ve bu özelliklerinden dolayı düşük güçte kızıl ötesi ışın gönderildiğinde bağlı olduğu dokularda ışıma yaparak kanserleşen bölgelerin tanısında; lazerin gücü arttırıldığı takdirde de bağlı olduğu dokuları ısı ile yok ederek kanser tedavisinde de kullanılabilir (Patra ve ark., 2010). Ayrıca, altın nanopartiküllerin yanısıra nano-kabuk, nano-çubuk ve nano-kafes gibi farklı tipleri yakın kızıl ötesi ışını (NIR) absorplayarak kanserin fototermal tedavisinde ışık enerjisinin ısıya dönüşmesinde kullanılmaktadır (Joshi ve ark., 2013). Altın nanopartiküller tarafından terapötik ajanların taşınması biyomedikal uygulamalarda kritik bir süreci temsil etmektedir. Çeşitli araştırma grupları ilaç taşıma etkinliğini arttırmak için hücre zarı ile ilişkileri araştırmak için fonksiyonelleşmiş altın nanopartikülleri kullanmışlardır. Örneğin, bir araştırmada altın nanopartikülün üzerine yüzey ligandlarının yerleştirilmesi ile hücre membranına penetrasyonu düzenleyebilmişlerdir. Altın nanopartikül terapötikleri hücre içerisine ya pasif ya da aktif hedefleme mekanizmaları ile taşınabilmektedirler. Arttırılmış geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisine dayanan pasif hedeflemede altın nanopartiküller, endotele doğru geçebilecek daha büyük partiküller düzensiz damarlanmasıyla tümör içerisine birikmektedir. Bir hücre; yüzey ligandına dayanan aktif hedeflemede, spesifiklik ve seçicilik sağlamada analitin hedeflenmesi için dizayn edilebilir. Altın nanopartikülleri kullanan etkili hedefleme ve taşıma stratejileri fototermal terapi, genetik düzenleme ve ilaç tedavilerini de içeren terapötik uygulamalar için geliştirilmiştir (Yeh ve ark., 2012). Altın nanopartiküller; konfokal yansıma mikroskopisi, karanlık alan görüntüleme, ikifoton lüminasens, faz-duyarlı optik tutunum tomografisi, Raman spektroskopisi ve fotoakustik görüntülemede hücre ve doku görüntülemede yüksek kontrast sağlamaktadır (Joshi ve ark., 2013). Altın nanopartiküllerinin yüksek elektron yoğunluğu ve atom numarasından dolayı altın nanopartiküller günümüzde kontrast ajanı olarak kullanılan iyottan daha kullanışlıdır (Yeh ve ark., 2012). Son gelişmeler ışığında, altın nanopartiküller siRNA ya -8- da antisens DNA gibi nükleik asitlerin ışık radyasyonunu kullanarak aktif hale gelmesinde ve gen susturulmasında da görev almaktadırlar (Joshi ve ark., 2013). 1.4.2 Lipitler Lipit nanotaşıyıcılar, maligant hücreleri seçici olarak hedefleyen ilaçların kapsüllenmesinde kullanılabilen, lipit nanokapsülleri, miselleri ve lipozomlar gibi çeşitli sistemleri kapsar. Lipit nanokapsüller yağlı bir fazdan iyonik olmayan bir hidrofilik yüzey aktif madde ve bir lipofilik yüzey aktif madde içeren bir yağ/su mikro emülsiyonunun oluşumunu izleyen bir faz ters çevirme işlemi ile üretilir. Dar bir dağılımla 20 ila 100 nm arasında ayarlanabilirler (Drbohlavova ve ark., 2013) (Şekil 3). Şekil 3. Pozitif ve negatif yüklü nanopartikülleri taşıyan dipolar zwitterionic lipit bilayerin şematik gösterimi (Velikonja ve ark., 2013). Lipozomlar, birçok veya sadece bir fosfolipit bilayerden oluşan bir vezikül şeklidir. Lipozomal çekirdeğin kutupsal karakteri polar ilaç moleküllerinin kapsüllenmesini sağlar. Amfifilik ve lipofilik moleküller, fosfolipitlere olan yakınlıklarına göre fosfolipit çift katman içinde çözünür hale getirilir. Çift katmanlı oluşumda fosfolipitlerin yerine iyonik olmayan yüzey aktif cisimcikler katılması, niosomlara neden olur. Kanal proteinleri vezikül zarlarının hidrofobik alanı içindeki aktivitelerini kaybetmeden, büyüklük-seçici bir filtre gibi hareket ederek, sadece iyonlar, besinler ve antibiyotikler gibi küçük çözünür maddelerin pasif difüzyonuna izin verilebilir. Dolayısıyla, kanal proteinleri ile fonksiyonel hale getirilmiş ilaçlar nano-kafeslerin içerisinde olmalarından proteolitik parçalanmadan korunmaktadırlar. Bununla birlikte, ilaç molekülü nano-kafesin iç ve dış konsantrasyon farkı tarafından yönlendirilerek kanal boyunca hücre içine girmektedir (Kulkarni ve ark., 2011). Lipozomların hem toksik olmaması hem de biyoparçalanabilir olması onların en önemli avantajlarını oluşturmaktadır. Lipozomlar içerisinde kapsüllenen biyolojik olarak aktif maddeler, ilaçların ve diğer biyoaktif kapsüllerin hastalıktan etkilenen organlara taşınması için ilaç taşıyıcı sistemlerinin olduğunu düşündüren derhal seyreltme veya bozulmadan farklı derecede korunmaktadır (Kulkarni ve ark., 2011; Drbohlavova ve ark., 2013). Lipozomların terapötikleri hem sulu hem de lipit fazına hapseden benzersiz kabiliyeti, ilaç taşıma sistemi olarak onları hidrofilik ve hidrofobik ilaçlar için çekici kılmaktadır. Dahası, bu gibi kapsüllemenin ilaç toksisitesini düşürdüğü, terapötik etkinliği koruduğu veya geliştirdiği gösterilmiştir. Birçok laboratuvar, kanser, leishmaniasis, metabolik bozukluklar ve fungal hastalıkların tedavisinde ilaç taşıyıcıları olarak lipozomların kullanımını bildirmiştir (Kulkarni ve ark., 2011). Lipozomların sınıflandırılmasında ya yapısal özelliklerine ya da hazırlama yöntemine göre sınıflandırılmaktadırlar. Yapısal özelliklerine dayanan lipozom sıınıflandırılmasında; uni-lamilar vezikül, oligo-lamilar vezikül, multi-lamilar veziküller, küçük uni-lamilar vezikül, -9- orta boyutlu uni-lamilar vezikül ve büyük boyutlu uni-lamilar vezikül gibi türleri bulunmaktadır (Kulkarni ve ark., 2011). Sitotoksik ilaçlar, vücudun her yerine spesifik olmayan bir şekilde dağılabilir, normal ve habis hücrelere ölüme yol açabilir, dolayısıyla çeşitli zehirli yan etkilere neden olabilir. Bu ilaçların lipozomlara yüklenmesi, dolaşım ömrünün uzamasına, enfekte dokularda birikimin artmasına, ilacın metabolik bozulmasından korunmasına, ilacın doku dağılımında değişikliklere neden olurken, mononükleer fagositik hücrelerden zengin organlarda (karaciğer, dalak ve kemik iliği) alınımını arttırırken böbrek, miyokard ve beyindeki alınımı azalmaktadır (Kulkarni ve ark., 2011). Bununla birlikte, ilaç taşıyıcısı olarak kullanılan lipozomların dolaşım sisteminde kalma süresi yüzey modifikasyonu (lipit bilayere bağlı polietilen glikol, dekstran ve poli-N-vinilpirrolidonlar gibi) ile de arttırılabilir. Ayrıca, monoklonal antikor veya aptamer gibi hedeflenen ligandlarla lipozomların konjuge edilmesi onların doku spesifikliğini de arttırmaktadır (Drbohlavova ve ark., 2013) (Şekil 4). Şekil 4. Lipozom yapısının şematik gösterimi (Andros Pharmaceuticals, 2016). Metalik nanoparçacıkların lipitlerle kapsüllenmesi veya kaplanması, yüzey kimyasını stabilize etmek ve hücresel zarda bulunan yapısal bileşenler tarafından belirlenen biyouyumluluk oranını arttırmak için yararlı bir kovalent olmayan yaklaşımdır (Kang ve Ko, 2015). Didodesil dimetil amonyum bromür (DDAB), basit, yapay bir lipittir. Vezikül çalışmalarında ve diğer biyomembran modellerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Aynı zamanda organik bir ortamda altın nanopartiküllerin (AuNP) oluşumu için koruyucu reaktif olarak da kullanılmaktadır (Zhang ve ark., 2006). Katyonik bir lipit olan (DDAB) altın nanopartikülleri kaplayarak (DDAB-AuNPs), DDAB tek başına DNA ile birliktelik oluşturmasındansa daha güçlü stabilite sağlamaktadır. Ayrıca, DDAB-AuNP yüksek derecede lipozomun transfeksiyon etkinliğini de arttırmıştır (Li ve ark., 2010). Dipalmitoilfosfatidilkolin, akciğer yüzeyinde en çok bulunan fosfolipittir. Temel olarak, akciğer yüzey aktif maddesinin, nefes alıp verme sırasında yüzey geriliminin 0 mN/m civarına erişmesini sağlama kabiliyetinden sorumludur. Sulu ortamda bir zvitteryondur. Fosfatdilkloinler, düşük pH’ta hidrojen iyonlarına bağlanır ve hem hidrojen hem hidroksil iyonlarıyla denge halinde olabilir. DPPC ile yapılan iki katlı fosfolipit veziküller biyolojik membranlarda ve ilaç taşıma sistemlerinde kullanılabilir. Hafif asidik pH’ta destabilize hale gelen lipozomlar, suda çözünebilir ilaçların hücre sitoplazmasına taşınımında kullanılabilir (Kaviratna ve Banerjee, 2009) Bu projede DPPC, lipozom yapımında DDAB’ın yanında, toksisiteyi azaltacak bir madde olarak kullanılmıştır. Bu projede, lipit kaplı altın nanopartiküller kanserin fototermal tedavisinde yeni bir yaklaşım sağlamak için üretilmiştir. - 10 - 1.5 Projenin Amacı Günümüzde; gelişen yaşam şartlarının getirdiği stres, genetik faktörler, sigara, alkol kullanımı ve gündelik hayatta maruz kalınan radyasyon sebebiyle kansere yakalanan insan sayısı hızla artmaktadır. Bu sebeple kanser teşhis ve tedavi yöntemleri her geçen gün gelişmektedir. Buna rağmen kanser, 20. yüzyılın başlarında ölüme neden olan hastalıklar arasında 7. veya 8. sırada iken; Dünya Sağlık Örgütü’ne (WHO) bağlı olan Uluslararası Kanser Araştırmaları Kurumu (IARC), 2030 senesinde kanserin bu sıralamada birinci sırada olacağını öngörmektedir. Son yıllarda kanserden kurtulma oranları hızla artsa da; kullanılan kemoterapi, radyoterapi veya cerrahi işlemler gibi geleneksel kanser tedavi yöntemlerinin vücuda verdiği büyük çaplı hasarlar sebebiyle kanserden kurtulan insanlar eski sağlıklarına kavuşamamaktadır. Bu hasarlar genellikle bağışıklık sisteminin zayıflaması veya durması, kanserli hücrelerin yanında sağlıklı hücrelerin de etkilenmesi, cerrahi işlemlerden doğabilecek risklerdir. Bunların yanında kanserli hücrelerin, uygulanan ilaç tedavisine direnç göstermesi durumunda daha agresif yöntemlere başvurulması ve hasta olan kişinin ağır yan etkilere maruz kalması söz konusudur. Bu araştırmanın temel amacı; dünya genelinde oldukça yaygın bir kanser türü olan akciğer kanserinin fototermal teşhis ve tedavisi için kullanılabilecek nano boyutta, vücuttaki sağlıklı hücreler için minimum bir toksisiteye sahip olan ve tamamen biyo-uyumlu lipit konjugeli altın nanopartiküllerin üretilmesidir. Lipitlerin katyonik ve biyouyumlu yapısı sayesinde; sentezlenen altın nanopartiküllerin herhangi bir savunma sistemiyle karşılaşmadan kolayca hücre zarından geçebilir hale getirilmesi hedeflenmiştir. Geleneksel kanser tedavi yöntemlerine nazaran tedavi süresince vücudu ve bağışıklık sistemini en az hasara maruz bırakmak ve yalnızca kanserli hücreleri hedefleyen bir yöntemle kanserden kurtulma oranlarını yükseğe çekmek amaçlanmıştır. 2. YÖNTEM Projemizin deney planı 4 aşamadan oluşmaktadır. Planın ilk aşamasında altın nanopartikül (AuNP) sentezlenmiştir ve sentezlenen altın nanopartiküllerin LSPR, SEM ve DLS ile karakterizasyonu yapılmıştır. İkinci aşamada, DDAB ve DPPC lipitleri hazırlanmış ve farklı komposizyonlarda birleştirilmiştir ardından elde edilen lipozomların karakterizasyonu yapılmıştır. Deneyin üçüncü aşamasında; farklı konsantrasyonlarda AuNPlipit konjugasyonları yapılmıştır. Son aşamada da; hazırlanan nano-malzemelerin toksisiteleri, sağlıklı (BEAS) ve kanserli (A-549) akciğer hücreleri üzerinde denenmiştir. 2.1. Materyal Sodyum sitrat (HOC(COONa)(CH2COONa)2, Sigma, %99), Sodyum Borohidrat (NaBH4, Sigma Aldrich, %99.99 granüler, eser metal esaslı), Hidrojen Tetrakloroaurat (III) Hidrat (HAuCl4, %99.999, Alfa Aesar), Kloroform (CHCl3, Merck, >%99), Aseton (C3H6O, Tekkim, %95), Dezenfektan (Deconex, Reiniger), RPMI 1640 (+L-Glutamin, Gibco), tuzlu fosfat tamponu (PBS), penisilin/streptomisin, Fosfat Tamponlu Tuz (1X PBS, Gibco), Tripan Mavi Boya (Biological Industries), MTT (Tiazol Mavi Tetrazolyum Bromid, Sigma), Silikon alttaş (Silicon Inc., USA). Dimetil distearil ammonyum bromür (DDAB, Alfa Aesar‘dan tedarik edilmiştir. 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) NofAmerica firmasından sağlanmıştır. Bütün kimyasallar alındığı gibi kullanılmıştır. Akciğer hücre dizisi A549 (ATCC CCL-185) ve BEAS (ATCC CRL-9609) İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü’nden Prof. Dr. Volga Bulmuş tarafından temin edilmiştir. - 11 - 2.2. Sitrat Kaplı Altın Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu Altın nanopartikül sentezinde sıklıkla kullanılan, Frens tarafından geliştirilmiş olan yöntem tercih edilmiştir. Kullanımdan önce tüm cam gereçler dezenfektant ile temizlenmiş ve distile su ile 2 defa durulanmıştır. Tüm kimyasallar taze olarak hazırlanmış ve ultra saf suda çözülmüştür. 1,214 ml 10 mM HAuCl4 çözeltisi üzerine 50 ml ultra saf su eklenip geri soğutucu altında kaynatılmıştır. Çözelti kaynamaya başladığında, içerisine 3 ml sodyum sitrat (10 mM) eklenmiştir. Çözelti yarım saat karıştırılmıştır. Süre sonunda rengi kırmızıya dönmeye başlamıştır. Altın nanopartiküller sonraki kullanımlar için karanlıkta saklanmıştır (Liu ve ark., 2013) (Şekil 5). Şekil 5. Sitrat kaplı altın nanopartiküllerin sentez aşamaları; a: HAuCl4 çözeltisi ile saf suyun karıştırılması; b: sodyum sitratın kaynayan çözeltiye eklenmesi; c: reaksiyon sonunda çözeltinin kırmızı renge dönmesi ile altın nanopartiküllerin oluşması. Sentezlenmiş altın nanopartiküllerin karakterizasyonu lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) spektroskopi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) yöntemleri ile saptanmıştır (Zhang ve ark., 2006). Bu çalışmada, lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) spektroskopisi, bütün spektrumlar standart transmisyon geometri-mod ile alınmıştır. Işınlar örnek içinden 20X (NA=0.45) veya 10X (NA=0.25) mikroskop objektifi ile alınmıştır. Mikroskop objektifi ışığı toplarken, geçen ışık 400 μm çapındaki optik fiber kabloya odaklanıp, 400 nm ile 1100 nm aralığında olan spektrometreye yöneltilmiştir. Uç-ışık nokta dedektör çapı yaklaşık 4 mm’dir. LSPR spektrumu 1000 ms’lik biriktirme süreli 10 farklı noktadan alınan ortalamalar data işleyici bir yazılım programı (SpectraSuite, Ocean Optics Inc.) yardımıyla görüntülenmiştir. Gösterilen bütün veriler işlenmiştir. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi için silikon yüzeyler önce aseton ile temizlenmiştir ve analiz edilecek her bir örnek silikon yüzeylere damlatılıp desikatörde kurumaya bırakılmıştır. SEM görüntüleri örnek yüklenmesine bağlı olarak 5-20 keV aralığında çalışan mercek içi ikincil-elektron detektörlü Zeiss Ultra Plus High Resolution FESEM cihazı ile alınmıştır. Dinamik ışık saçılımı (DLS) altın nanopartiküllerin modifikasyon öncesi ve sonrası yüzey yüklerini belirlemek için gerçekleştirilmiştir. Malvern Zeta Sizer (Malvern Instruments LTD. Southborough, MA, USA) 25°C’ de 60 saniyelik ölçümler ile her örnek için kullanılmıştır. Ölçümler her örnek için 3 kere tekrarlanmış ve bu ölçümlerin ortalamaları alınmıştır. - 12 - 2.3 Lipitlerin Hazırlanması 1,5 mM kurutulmuş DPPC ve DDAB lipit filmleri, 30 ml kloroform çözeltisi içerisindeki lipit çözeltisinin döner buharlaştırıcıda (evaporatör) buharlaştırılmasıyla hazırlanmıştır. Kurutulmuş filmler içerisinde mevcut olan tüm organik çözücüleri uzaklaştırmak için yüksek vakum altında bir gece bekletilmiştir. Daha sonra lipit filmler 30 ml saf su eklenerek çözülmüş ve 45°C’ de 2 saat boyunca bekletilmiştir (Zhang ve ark., 2006) (Şekil 6). Şekil 6. Lipit filmlerinin hazırlanma aşamaları. a: Lipit filmi, b: lipit filmine kloroform eklenmesi, c: kloroform ile çözülmüş lipit filmi, d: evaporatör cihazı. 2.3.1 Lipit Esaslı Altın Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu Altın nanopartikül içeren lipit esaslı nano-yapıların sentezi aşağıda detaylandırıldığı şekilde üç farklı kompozisyonda lipit karışımı kullanılarak yapılmıştır. Burada in vivo çalışmalara yönelik olarak biyo-uyumluluğu arttırmak için FDA onaylı lipitler ile altın nanopartikül üretilmesine çalışılmıştır. 15 mM kurutulmuş DDAB lipit filmleri, 30 ml kloroform çözeltisi içerisindeki lipit çözeltisinin döner buharlaştırıcıda buharlaştırılmasıyla hazırlandı. Kurutulmuş filmler içerisinde mevcut olan tüm organik çözücüleri uzaklaştırmak için yüksek vakum altında bir gece bekletildi. Daha sonra lipit filmler 30 ml saf su eklenerek çözüldü ve 45°C’ de 2 saat boyunca bekletildi. Karıştırıldıktan sonra 30 dakika sonikasyon işlemi 4 kez tekrar edildi. Bir sonraki adımda lipit çözeltisi 13500 rpm’de 20 dakika boyunca santrifüj edildi. Süpernatant kısım 0.22 μm‟lik filtreden geçirildikten sonra su eklenerek 10 mM’ a seyreltildi. (Zhang ve ark., 2006). DDAB:DPPC çözeltisine (1 no’lu %60 DDAB ve %40 DPPC; 2 no’lu %40 DDAB ve %60 DPPC; 3 no’lu %100 1,5 mM DDAB gibi değişen konsantrasyonlarda, 30 ml) HAuCl4 (0.05 M, 188 μl) sulu çözeltisi eklendi. Bu çözeltiye NaBH4 (0,4 M, 100 μl) yavaşça eklendi ve 2 dakika boyunca karıştırıldı. Oluşturulan çekirdek çözeltisi daha sonraki aşamada kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında bekletildi. 24 saat sonunda santrifüj edilerek 2 kez saf su ile yıkama gerçekleştirildi (Manosroi ve ark., 2009; Manosroi ve ark., 2011) (Şekil 7). Şekil 7. Lipit-altın nanopartikül konjugatlarının hazırlanması. a: hazırlanan lipit filmlerinin su banyosunda çözünmesi; b ve c: farklı konsantrasyonlara sahip DDAB:DPPC çözeltilerine HAuCl4 eklenmesi; d ve e: çözeltilere NaBH4 eklenerek lipit esaslı altın nanopartiküllerinin sentezi. - 13 - Elde edilen altın nanopartikül çözeltisi içerisinde oluşan istenmeyen farklı yapıdaki ürünler ve fazla lipit iki kez olmak koşuluyla 13500 rpm’ de 20 dakika santrifüj yoluyla uzaklaştırılmıştır. Son döngüde, çökeltileri deiyonize su ile süspanse edilmiş ve lipit esaslı altın nanopartiküllerinin karakterizasyonu lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) spektroskopi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve dinamik ışık saçılımı (DLS) yöntemleri ile saptanmıştır (Zhang ve ark., 2006) (Şekil 8). Şekil 8. Biyouyumlu materyallerin karakterizasyon aşamaları. a: altın nanopartikül ve lipit esaslı altın nanopartiküller; b: LSPR cihazı; c: SEM cihazı; d: DLS cihazı. 2.4. Hücre Kültürü A549 (akciğer kanser hücresi), BEAS (sağlıklı akciğer hücresi) hücre hatları, % 1 LGlutamin, 100 U/ml penisilin/streptomisin ve % 10 inaktif fetal sığır serum (FBS) içeren RPMI–1640 besiyerinde 37°C‘ de, % 5 CO2‘ li inkübatörde çoğaltılmıştır. Hücreler %80 doluluk oranına ulaştığı zaman her iki günde bir pasajlanmışlardır. Hücrelerin logaritmik büyüme fazları tüm deneyler için kaydedilmiştir (Şekil 9). Şekil 9. Olympus CKX 41 ışık mikroskobu ile 20X büyütmede incelenmiş hücrelerin morfolojileri. A) A549, B) BEAS. Kültür ortamını uzaklaştırmak için hücreler 800 rpm’de 5 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjden sonra, besiyeri pipet ile nazikçe çekilip ve hücreler yeni besiyeri içerisinde pipetaj yapılarak tekrar süspansiyona alınmıştır. Hücre beslemesinden önce, ölü hücreleri mavi renkte gösteren tripan mavi boyası canlı hücre sayısını belirlemek için kullanılmıştır. Hücreler Neuber lamı ile ışık mikroskobu altında sayılmış ve hücre süspansiyonları 10.000 hücre/100 µl olacak şekilde 96 kuyucuklu plakaya taşınmıştır (de Vlieghere ve ark., 2016) (Şekil 10). - 14 - Şekil 10. A549 ve BEAS hücre hatlarının sayım aşamaları. a: trypan blue boyası; b: Neuber lamından hücrelerin boyanması; c: mikroskopta canlı ve ölü hücrelerin sayılması. 2.4.1 MTT Testi ile Hücre Canlılığı Üzerine Lipit Esaslı Altın Nanopartiküllerin Etkisinin Saptanması A549 ve BEAS hücre hatları, flaskta 24 saat yukarıda bahsedilen şartlarda inkübe edildikten sonra yapışkan hücrelerden besiyeri uzaklaştırılmış ve 1,5 ml PBS ile yıkanmış ve PBS uzaklaştırılmıştır. Daha sonra, hücreleri birbirinden ayırmak için 3 ml tripsin ilave edilmiş ve hücrelerin birbirinden ayrıldığı mikroskopla kontrol edilmiştir ve hücreler birbirinden ayrıldıktan sonra tripsini inhibe etmek için 3 ml serum içeren RPMI–1640 besiyeri eklenmiştir. Hücreler, stok çözeltisinden elde edilen farklı konsantrasyondaki altın nanopartiküllere maruz bırakılmıştır. Mikroplakanın her kuyucuğunda bulunan 104 hücreye (100 µl), stok çözeltisinden elde edilen farklı konsantrasyondaki (0 µM, 10 µM, 25 µM, 50 µM ve 100 µM) sadece altın nanopartikül (%100 AuNP) ve lipit esaslı altın nanopartiküllere (AuNP + DDAB; AuNP + %60 DDAB + %40 DPPC; AuNP + %40 DDAB + %60 DPPC) 100 µl’si eklenmiştir ve mikroplaka 37°C’ de %5 CO2 atmosferinde 24 ve 48 saat inkübe edilmişlerdir. Nanopartiküller ile gerçekleştirilen in vitro çalışmalarda örnekler için kullanılan kodlar Çizelge 1’ de açıklanmıştır. Bulunan IC50 değerleri üzerinden uygulanacak ‘güvenli doz’ belirlenmiştir. Çizelge 1. Nanopartiküller ile gerçekleştirilen in vitro çalışmalarda kullanılan örnek kodları. Örnek kodu AuNP DDAB-AuNP DDAB/DPPC(1)-AuNP DDAB/DPPC(2)-AuNP Örnek Açıklaması Sitrat stabilize altın nanopartikül DDAB ile modifiye edilmiş altın nanopartikül %60DDAB/%40 DPPC ile modifiye edilmiş altın nanopartikül %40DDAB/%60 DPPC ile modifiye edilmiş altın nanopartikül İnkübasyondan sonra PBS çözeltisinde, MTT boyası (5 mg/ml) her kuyucuğa eklenmiştir (kuyucuk başına 20 µl olacak şekilde) ve plakalar 3 saat inkübatörde inkübe edilmişlerdir. Bunun ardından plakalar hücreleri çöktürmek için 1800 rpm’de 10 dk santrifüj edilmişlerdir. Çukurlardaki her çözelti nazikçe alınmıştır. Hücreler dimetilsülfoksit (DMSO) ile çukur başına 100 ul olacak şekilde işlem görmüştür. DMSO eklendikten sonra plakalar 125 rpm’de 5 dk çalkalanmıştır. Çözeltilerin absorbans değerleri Varioscan cihazı ile 570 nm’de ölçülmüştür (Şekil 11). - 15 - Şekil 11. A549 ve BEAS hücre hatlarının MTT testi aşamaları. a: MTT boyası ile A549 ve BEAS hücre hatlarının muamele edilmesi; b: mikroplakaların santrifüj edilmesi; c: Mikroplaka okuyucuda MTT sonuçlarının alınması. 3. BULGULAR 3.1 Sitrat Kaplı Altın Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu Bu çalışmada, günümüzde kanser tedavisinde uygulanan kemoterapi ve radyoterapi gibi kanser tedavi yöntemlerinin hastaya verdiği zararları, neden olduğu yan etkileri ortadan kaldıracak ve bununla birlikte kanser hücrelerinin tedavisinde etkili olabilecek biyo-uyumlu lipit konjugeli altın nanopartiküllerin üretilmesi çalışılmıştır. Altın nanopartiküllerin sentezinde Frens tarafından geliştirilen yöntem tercih edilmiştir. Bu yöntem kullanıldığında solüsyonun sarı renkten koyu kırmızı renge döndüğü görülmüştür (Şekil 5). Bu renk değişimi aurik asitte bulunan altının, nano boyutta altın küreciklerine nitel olarak dönüştüğünü göstermektedir. Aurik asitten altın nanopartiküllerin nicel olarak sentezi LSPR, SEM ve DLS analizleri ile ispatlanmıştır. Altın nanopartikül çözeltilerinin absorpsiyon spektrumları LSPR ile ölçülmüştür. Nanopartiküllerin plazmon bandı, Şekil 12A ve 12B’ de yaklaşık olarak 530 nm’de Şekil 12 C’de ise 520 nm’de gözlenmiştir. Elde edilen grafiklerden, sentezlenen altın nanopartiküllerin tipik LSPR absorbansları olan 520-530 nm de görülmesi aurik asitten altın nanopartiküllerin nicel olarak sentezlendiği ispatlanmıştır. Şekil 12. Farklı çaplara sahip altın nanopartiküllerin LSPR spektrumu. - 16 - Şekil 14’de altın nanopartiküllerin lipit ile modifiye edilmeden önce taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerini içermektedir. Şekil 14 A, sitrat stabilize altın nanopartiküllerin büyük alan SEM görüntüsüdür. SEM görüntüsüne göre meydana gelen altın nanopartikülerin yüksek konsantrasyonda sentez edildiklerini göstermektedir. Şekil 14 B’ de ise altın nanopartiküllerin yüksek büyütme görüntüsü alınmıştır ve şekilde de göründüğü gibi altın nanopartiküllerin oluşumu daha net olarak gözlemlenmiştir. SEM görüntülerinden altın nanopartiküllerin çapı 25-35 nm olarak hesaplanmıştır. Dinamik ışık saçılımı (DLS) ölçümü altın nanopartiküllerin üzerindeki yüzey yükünün belirlenmesinde kullanılır ve yapılan işlemin başarılı olup olmadığını da göstermektedir. Sitrat-stabilize altın nanopartiküllerin zeta potansiyeli -18 mV olarak ölçülmüştür (Şekil 15 A). 3.2 Lipit Esaslı Altın Nanopartiküllerin Sentezlenmesi ve Karakterizasyonu Altın nanopartiküllerin yüzeyi lipit ile modifiye edilmiştir. Burada amaç altın nanopartikülleri biyouyumlu hale getirmektir. Altın nanopartikül çözeltisinin lipit ve lipit karışımları ile etkileşiminden sonraki spektrumları Şekil 13’ te gösterilmektedir. Şekil 13 A ve 13 B’ de DDAB ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerin LSPR karakteristiğini göstermektedir, kullanılan DDAB’ in farklılığı ise yarı sentetik (A) ve doğal (B) olmasıdır. Şekil 13 C ve 13 D’ de farklı oranlardaki DDAB/DPPC lipit karışımı ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerin spektrumlarını göstermektedir. Her spektrumda da mavi pik santrifüj ile yıkama öncesini, kırmızı pik ise santrifüj ile yıkama sonrasına ait sonucu göstermektedir. Sonuçlara bakılarak, yıkama sonrasında istenmeyen yan ürünler temizlenerek sadece altın nanopartiküllerin varlığından söz etmek mümkündür. Şekil 13 Altın nanopartiküller ve lipit esaslı altın nanopartiküllerin LSPR spektrumu. A: Sentetik; B: doğal DDAB ile modifiye edilmiş altın nanopartikülleri; C: %60 DDAB ve %40 DPPC ve D: %40 DDAB ve %60 DPPC karışımı ile modifiyeli altın nanopartikülleri göstermektedir. - 17 - Şekil 14’de altın nanopartiküllerin lipit ile modifiye edildikten sonra taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerini içermektedir. Şekil 14 C’ de altın nanopartiküllerin DDAB ile modifiye edildikten sonraki elektron mikroskop görüntülerini göstermektedir ve altın nanopartiküller etrafındaki lipit katmanı ve lipit agregasyonları net bir şekilde görülmektedir. Şekil 14 D ve 14 E ise sırasıyla %60 DDAB / %40 DPPC ve %40 DDAB / %60 DPPC lipit karışımıyla modifiye edilmiş altın nanopartiküllere ait SEM görüntüleridir. Yüksek oranda DDAB içeren altın nanopartiküllerin görüntülerinde lipozomların varlığından daha fazla bulutumsu şekilde lipit tabakası görülmektedir ki bu karışımda DDAB’ in yüksek oranda bulunmasını doğrulamaktadır. DPPC’nin kritik misel konsantrasyon değerinden yukarıda bir değerde kullanılmasından dolayı lipozom oluşumları görülmektedir. Şekil 14 E’ de ise karışımda DDAB oranının DPPC’ ye kıyasla düşük olmasından dolayı görüntü kalitesini etkileyecek düzeyde yoğun lipit tabakası gözlemlenmemiştir. Ayrıca, lipozomların varlığı daha net bir şekilde görülmektedir. Elde edilen görüntülere göre altın nanopartiküllerin lipozomların çevrelerinde bölgesel olarak kümeleştiği bazı bölgelerde ise tek tek yerleştiği de gözlenmiştir. Şekil 14. Sitrat stabilize altın nanopartiküllerin (A) büyük alan ve (B) yüksek büyütme, (C) DDAB, (D) %60 DDAB / %40 DPPC lipit karışımı ve (E) %60 DDAB / %40 DPPC lipit karışımı ile modifiye edildikten sonra farklı büyütmelerdeki mercek içi SEM görüntüleri. - 18 - Altın nanopartiküllerin yüzey aktif türlerini sitrattan lipite değiştirdiğimizde yüzey fonksiyonelliğinde büyük bir etki görülür. Bu etkileri daha iyi anlamak adına öncelikle DLS ile üretilen malzemeler incelenmiştir. Altın nanopartiküllerin lipit ile etkileştirilmeden önce ve etkileştirildikten sonra zeta potansiyeli ölçüm sonuçları Şekil 15’ te verilmiştir. DDAB ile etkileştirildikten sonra altın nanopartiküller yüzeylerinde lipit moleküllerinin yer aldığının göstergesi olarak, zeta-potansiyeli -18 mV’ dan 38 mV’ a (Şekil 15 B) kaymıştır. Zetapotansiyelinde meydana gelen artış, hidrofilik uç grup olarak kuaterner amonyuma sahip lipit moleküllerinin bağlanmış olması ile açıklanır. DDAB/DPPC lipit karışımı ile etkileştirildikten sonra da altın nanopartiküller beklendiği gibi katyonik bir yüzeye sahip olmuştur (Şekil 15 CD, sırasıyla 57 ve 55 mV). Zeta potansiyeldeki meydana gelen artış iki farklı katyonik lipitin kullanılmasından kaynaklanmaktadır. Şekil 15. (A) Sitrat-stabilize altın nanopartiküller, (B) DDAB modifiyeli altın nanopartiküller ve (C) %60 DDAB / %40 DPPC lipit karışımı ve (D) %40 DDAB / %60 DPPC lipit karışımı ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerin dinamik ışık saçılım ölçümleri. 3.3 Hücre Canlılığı Üzerine Lipit Esaslı Altın Nanopartiküllerin Etkisinin Saptanması Karakterizasyon işlemleri yapılan altın nanopartikül (%100 AuNP) ve lipit esaslı altın nanopartiküllerin (AuNP + DDAB; AuNP + %60 DDAB + %40 DPPC; AuNP + %40 DDAB + %60 DPPC) sağlıklı (BEAS) ve kanserli akciğer hücrelerinde (A549) MTT analizleri ile hücre canlılığı üzerine etkileri 24 ve 48 saatler arasında araştırılmıştır. Sağlıklı akciğer epitel hücreleri olan BEAS hücre hattı yukarıdaki nano-malzemelere 24 saat maruz bırakıldıklarında meydana gelen değişiklikler Çizelge 2 ve Şekil 16’ da; 48 saat sonucunda meydana gelen değişiklikler Çizelge 3 ve Şekil 17’ de gösterilmiştir. Çizelge 2. Akciğer epitel BEAS hücre hatlarında 24 saat sonra canlılık yüzde (%) değerleri. Doz Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM AuNP 100 64.68 59.99 29.28 26,33 DDAB-AuNP 100 57,76 51,38 40,75 17,23 DDAB/DPPC1-AuNP 100 88,15 70,86 64,45 62,97 - 19 - DDAB/DPPC2-AuNP 100 70,86 65,29 64,78 60,35 AuNP DDAB-AuNP DDAB/DPPC1-AuNP DDAB/DPPC2-AuNP 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM Şekil 16. BEAS hücrelerin farklı dozlarda AuNP, DDAB-AuNP, DDAB/DPPC(1)-AuNP ve DDAB/DPPC(2)-AuNP nanopartiküller ile 24 saat inkübasyonu sonrası canlılık sonuçları. Çizelge 3. Akciğer epitel BEAS hücre hatlarında 48 saat sonra canlılık yüzde (%) değerleri. Doz Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM AuNP 100 64,58 52,22 47,68 37,29 DDAB-AuNP 100 24,53 23,82 21,92 11,13 DDAB/DPPC1-AuNP 100 78,88 75,74 65,28 59,05 DDAB/DPPC2-AuNP 100 57,35 52,28 51,04 40,77 AuNP-48h DDAB-AuNP-48h DDAB/DPPC1-AuNP-48h DDAB/DPPC2-AuNP-48h 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM Şekil 17. BEAS hücrelerin farklı dozlarda AuNP, DDAB-AuNP, DDAB/DPPC(1)-AuNP ve DDAB/DPPC(2)-AuNP nanopartiküller ile 48 saat inkübasyonu sonrası canlılık sonuçları. A549 akciğer kanser hücre hattı yukarıdaki nano-malzemelere 24 saat maruz bırakıldıklarında meydana gelen değişiklikler Çizelge 4 ve Şekil 18’ da; 48 saat sonucunda meydana gelen değişiklikler Çizelge 5 ve Şekil 19’ de gösterilmiştir. - 20 - Çizelge 4. A549 akciğer kanser hücre hatlarında 24 saat sonra canlılık yüzde (%) değerleri. Doz Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM AuNP 100 79,21 59,59 51,29 45,22 DDAB-AuNP 100 62,79 49,11 8,78 7,23 AuNP DDAB-AuNP DDAB/DPPC1-AuNP 100 79,90 74,43 63,64 57,89 DDAB/DPPC1-AuNP DDAB/DPPC2-AuNP 100 71,53 70,38 62,39 54,43 DDAB/DPPC2-AuNP 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM Şekil 18. A549 hücrelerinin farklı dozlarda AuNP, DDAB-AuNP, DDAB/DPPC(1)-AuNP ve DDAB/DPPC(2)-AuNP nanopartiküller ile 24 saat inkübasyonu sonrası canlılık sonuçları. Çizelge 5. A549 akciğer kanser hücre hatlarında 48 saat sonra canlılık yüzde (%) değerleri. Doz Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM AuNP 100 56,87 53,46 49,75 44,77 DDAB-AuNP 100 55,77 38,78 21,45 7,06 DDAB/DPPC1-AuNP 100 84,71 69,11 60,08 54,93 DDAB/DPPC2-AuNP 100 57,91 48,53 47,49 42,74 AuNP-48h DDAB-AuNP-48h DDAB/DPPC1-AuNP-48h DDAB/DPPC2-AuNP-48h 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% Kontrol 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM Şekil 19. A549 hücrelerinin farklı dozlarda AuNP, DDAB-AuNP, DDAB/DPPC(1)-AuNP ve DDAB/DPPC(2)-AuNP nanopartiküller ile 48 saat inkübasyonu sonrası canlılık sonuçları. - 21 - 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Literatürde biyouyumlu malzeme üretmek için ilk başvurulan yöntemler genel olarak metal parçacıkların PEG (polietilen glikol) ya da polielektrolit malzemelerle kaplanmasıdır (Fernández-López ve ark., 2009). Kullanılan bu metotlar dışında yapılan çalışmalarda biyouyumlu malzemeleri üretmek için lipit nanopartiküller ile konjuge edildiği zaman nanopartiküllerin ortam içerisinde stabilizasyonu sağlar ve nanopartiküllerin in vivo çalışmalarda hedef dokuya ulaşması arttırmaktadır (Stephen ve ark., 2014). Ayrıca bu metodla sentezlenen nanopartiküller biyomedikal analizler hastalık tedavilerinde terapötik etkiyi arttırmakta ve yan etkileri azalmaktadır. Lipit konjugasyonlu nanopartiküllerin üretiminde genellikle doğal lipit türevi olan fosfolipit ve kolesterol kullanılmaktadır. (Kang ve Ko, 2015). Yapmış olduğumuz çalışmada katyonik lipit türevi olan DDAB’ ın toksik etikisini azaltmak için membranına uyumlu fosfotil kolin türevi lipit olan DPPC kullanılmıştır. Kanser günümüzde yaşam şartlarının getirdiği başta stres ve diğer çevresel maruz kalınan kimyasal ve radyasyon sebebiyle en sık rastlanan ikinci hastalık olmakla birlikte Dünya Sağlık Örgütü’ne (WHO) bağlı olan Uluslararası Kanser Araştırmaları Kurumu (IARC), 2030 senesinde kanserin bu sıralamada birinci sırada olacağını öngörmektedir. Son yıllarda kanser tedavisinde kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi işlemler ya tek tek ya da birlikte uygulanmaktadır. Ancak bu geleneksel tedavi yöntemleri kanser hastalarının bağışıklık sisteminin zayıflaması, kanserli hücreler dışında sağlıklı hücrelerin de ölmesi, cerrahi işlemler sonucunda organ kayıpları gibi büyük çaplı hasarlara da sebep olmaktadır. Nanoteknolojide meydana gelen gelişmelerle birlikte, kanser tedavisinde nanopartiküllerden faydalanılmaya başlanmıştır. Altın nanopartiküllerin biyomedikal endüstride ilaç taşıyıcısı olarak, fototermal terapi, karşıtlık ajanı olarak görüntülemede kullanılması düşünülmektedir. Altın elementi, insanlık tarihi boyunca tıbbi amaçlar için kullanılmıştır. Ancak nano boyuttaki altının sitotoksik etkileri birçok bilimsel yayında belirtilmiştir. Bu projede, lipit esaslı altın nanopartiküller sentezlenerek kanser oranlarında hem ülkemizde hem de dünyada en üst basamakta yer alan akciğer kanseri örneğinde nano boyutta, vücuttaki sağlıklı hücreler için herhangi bir toksisiteye sahip olmayan biyo-uyumlu nanomalzeme üretilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Frens tarafından önerilen yöntem kullanılmış ve altın nanopartiküllerin sentez başında sarı renkten reaksiyon sonunda koyu kırmızıya dönmesiyle nitel olarak; aynı zamanda altın nanopartiküllerin LSPR, SEM ve DLS ölçümleri ile nicel olarak sentezlendiği saptanmıştır. Altın nanopartikül ve lipit-modifiyeli altın nanopartikül çözeltilerinin absorpsiyon spektrumları LSPR spektroskopisi ile ölçülmüş ve 520 - 530 nm aralığında olduğu gözlemlenmiştir. Altın nanopartiküller 500-550 nm dalga boyu aralığında belirli bir absorpsiyon pikine sahiptir ve nanopartiküllerin çapı ile ilgilidir (Smith ve Korgel, 2008; Yeh ve ark., 2012). Altın nanopartiküllerin yüzeyi lipit ile modifiye edilmiştir. Burada amaç altın nanopartikülleri biyouyumlu hale getirmektir. Modifiye sonrası, altın nanopartikül yüzeylerinin kırılma indislerinin değişmesi dolayı yüzey plazmon rezonansında değişime yol açmaktadır (Nehl ve ark., 2006). Sitrat ile sentezlenen ve lipit ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerin LSPR spektrumlarının karşılaştırılması Şekil 20’de gösterilmektedir. Genel olarak, lipit ile etkileştirilmeden sonra altın nanopartiküllerin 520 nm osilasyon moduna karşılık gelen plazmon bandı 520 nm’ den 535 nm’ ye kadar kayma göstermiştir ki bu kaymanın sebebi yan yana parçacıklar arası etkileşim ve altın nanopartiküllerin yüzeyindeki lipit tabakalarıdır (Nehl ve ark., 2006; Smith ve Korgel, 2008). Ayrıca, etkileştirilmeden sonra pikte genişleme görülmesi ortamda farklı yapıların olduğunun göstergesidir. Absorbsiyon pikinde meydana - 22 - gelen bu kırmızıya kaymanın fiziksel değişimlerden kaynaklanan nedenleri vardır. Bunlar altın nanoparçacık çapı, lokal kırılma indisindeki artış ya da nanoparçacık etkileşimlerinden kaynaklı plazmon eşleşmesidir. DDAB’nin kırılma indisi sitrat’ın kırılma indisiyle benzer olduğundan enine absorbsiyondaki kırmızıya kaymanın sebebi nanopartiküller arasındaki eşleşme ve lipit tabakasının boyut değişiminden kaynaklı olabilir. Bu da lipit modifiyeli altın nanopartiküllerin çözelti içerisinde yan yana öz düzenli hale geldiğini ve bunun da enine absorbsiyonda plazmon eşleşmesine ve kırmızıya kaymaya sebep olduğunu göstermektedir. DDAB/DPPC lipit karışımında kullanılan DPPC’ nin konsantrasyon değeri, kritik misel konsantrasyon değerinin yukarısında olduğu için lipozom oluşmuştur ki bu SEM görüntüleri ile desteklenmektedir. Bu oluşum, absorbsiyon pikinde daha fazla genişleme görülmesini açıklamaktadır. Şekil 20. Sitrat-stabilize altın nanopartiküller (mavi pik), DDAB ile modifiye edilmiş altın nanopartiküller (kırmızı ve yeşil pik), DDAB/DPPC karışımı ile modifiye edilmiş altın nanopartiküllerin (mor ve turkuaz pik) UV-Vis spektrumları. Altın nanopartiküllerin taramalı elektron mikroskopisi (SEM) görüntüleri alınmış ve altın nanopartiküllerin çapı 25-35 nm olarak hesaplanmıştır. Sentezlenen altın nanopartiküllerin fonksiyonlaştırılmadan önce de biyouyumlu olduğu düşünülebilir. Çünkü 1 – 2 nm boyutunda olan altın nanopartiküller oldukça yüksek toksik özellik gösterirken 15 nm’ den büyük altın nanopartiküllerin genellikle toksik olmadığı literatürde belirtilmiştir (Patra ve ark., 2010). DLS ölçümlerinde, altın nanopartiküllerin sentezinde tercih edilen sitrat-stabilize altın nanopartiküllerin zeta-potansiyeli -18 mV olarak ölçülmüştür. Sitrat anyonik bir molekül olduğu için sitrat ile stabilize edilmiş altın nanopartiküller anyonik yüzey özelliği göstermiştir (Şekil 21). Sitrat ile stabilize edilmiş altın nanopartiküller DDAB/DPPC lipit karışımı ile etkileştirildikten sonra zeta-potansiyeli -18 mV’ dan +57 mV’ a çıkarak katyonik bir yüzeye sahip olmuştur. Zeta potansiyeldeki meydana gelen artış iki farklı katyonik lipitin (DDAB ve DPPC) kullanılmasından kaynaklanmaktadır (Şekil 21). - 23 - Şekil 21. Proje kapsamında kullanılan kimyasal maddelerin yapıları. A: negatif yüklü sodyum sitrat, B: pozitif yüklü DDAB ve C: pozitif yüklü DPPC. Farklı konsantrasyonlarda sentezlenen altın nanopartikül (%100 AuNP) ve lipit esaslı altın nanopartiküllerin (AuNP + DDAB; AuNP + %60 DDAB + %40 DPPC; AuNP + %40 DDAB + %60 DPPC) sağlıklı (BEAS) ve kanserli akciğer hücrelerinde (A549) MTT analizleri ile hücre canlılığı üzerine etkileri 24 ve 48 saatler arasında araştırılmıştır. Sağlıklı akciğer epitel hücreleri olan BEAS hücre hattı yukarıdaki nano-malzemelere 24 saat maruz bırakıldıklarında AuNP ve DDAB-AuNP yüksek toksisiteye sahip olduğu için düşük dozlarda hücrelere ölümcül etki göstermiştir. Lipit karışımı ile modifiyeli nanopartiküllerde ise denenen dozlarda ölümcül etki göstermemiştir. BEAS hücre hattı aynı nano-malzemelere 48 saat maruz bırakıldığında DDAB-AuNP denenen tüm dozlarda hücrelere ölümcül etki göstermiştir. Lipit karışımı ile modifiye nanopartiküllerden DDAB/DPPC(1) ‘de denenen dozlarda ölümcül etki görülmezken, DDAB/DPPC(2) denenen en yüksek doz olan 100 µM’ da ölümcül etki göstermiştir. Sonuçlara göre lipit modifiyeli nanopartiküllerden DDAB/DPPC(1), IC50 değeri 100 μM değerinden fazla olduğu saptanmıştır. Kanserli akciğer hücrelerinde (A549) MTT sonuçları değerlendirildiğinde DDAB-AuNP düşük dozlarda da hücrelere ölümcül etki göstermiştir. Lipit karışımı ile modifiyeli nanopartiküllerden DDAB/DPPC(1) ‘de denenen dozlarda ölümcül etki görülmezken, DDAB/DPPC(2) sadece denenen en düşük doz olan 10 µM’ da ölümcül etki göstermemiştir. Sonuçlara göre lipit modifiyeli nanopartiküllerden DDAB/DPPC(1), IC50 değeri 100 μM değerinden fazla olduğu saptanmıştır. Tüm canlılık sonuçlarına bakılacak olursa, AuNP ve DDAB-AuNP ‘nin ölümcül doz etkisi DDAB/DPPC-AuNP‘de gözlemlenmemiştir. Ayrıca 48 saatlik inkübasyon sonuçlarında AuNP ve DDAB-AuNP’li örneklerde olduğu gibi DPPC karışımlı malzemeli örneklerde hücre canlılığında ciddi azalmalar meydana gelmemiştir. Lipit karışımı ile modifiyeli nanopartiküllerde ise, DDAB/DPPC(1), DDAB/DPPC(2)’e kıyasla denenen dozlarda ölümcül etki göstermemiştir. Sonuçlardan, DPPC’ nin, DDAB’ in toksik etkisini azalttığı görülmektedir. Ancak karışım içerisindeki DPPC oranı arttırıldığı zaman stabilite sorunu yaşanmaktadır ve belirli bir düzeyin üzerinde de etkili sonuçlar göstermemektedir (Huang ve ark., 2007). DDAB/DPPC(2)’nin DDAB/DPPC(1)’e kıyasla ölümcül etki göstermesinin nedeni bu şekilde açıklanabilir. Çalışmaların devamı için ‘güvenli doz’ olarak DDAB/DPPC(2) için 100 μM olarak tespit edilmiştir. Altın nanopartiküller kızıl ötesi bölgede ışığı soğurduklarında konjuge oldukları dokuların etrafında sıcaklık yayılması gerçekleşir ve bu özelliklerinden dolayı düşük güçte kızıl ötesi ışın gönderildiğinde bağlı olduğu dokularda ışıma yaparak kanserleşen bölgelerin tanısında; lazerin gücü arttırıldığı takdirde de bağlı olduğu dokuları ısı ile yok ederek kanser tedavisinde de kullanılabilir (Patra ve ark., 2010). Ayrıca, altın nanopartiküllerin yanısıra nano-kabuk, nano-çubuk ve nano-kafes gibi farklı tipleri yakın kızıl ötesi ışını (NIR) - 24 - absorplayarak kanserin fototermal tedavisinde ışık enerjisinin ısıya dönüşmesinde kullanılmaktadır (Joshi ve ark., 2013). Altın nanopartiküller konfokal yansıma mikroskopisi, karanlık alan görüntüleme, ikifoton lüminesans, faz-duyarlı optik tutunum tomografisi, Raman spektroskopisi ve fotoakustik görüntülemede hücre ve doku görüntülemede yüksek kontrast sağlamaktadır (Joshi ve ark., 2013). Altın nanopartiküllerinin yüksek elektron yoğunluğu ve atom numarasından dolayı günümüzde kontrast ajanı olarak kullanılan iyottan daha kullanışlıdır (Yeh ve ark., 2012). Lipitlerin katyonik ve biyouyumlu yapısı sayesinde, sentezlenen altın nanopartiküller, herhangi bir savunma sistemiyle karşılaşmadan kolayca hücre zarından geçebilir hale getirilmiştir. Bu sayede lipit esaslı altın nanopartiküller, ilgili hücrelerin hücre zarında ya da sitoplazmasında birikir. Hedef hücrelerde biriken altın nanopartiküller, kontrast ajanı olarak iş görüp ilgili hücrelerin görüntülenmesi ile hastalığın teşhisinde; aynı zamanda hücrelere, yakın kızıl ötesi ışın gönderilerek altın nanopartiküllerin yüzey plazmon rezonans özelliği sayesinde hücrelerin fototermal tedavi ile yakılarak yok edilmesinde kısacası tedavisinde kullanılabilir. Sonuç olarak; projede geliştirilen biyo-uyumlu altın nanopartiküller, geleneksel kanser tedavi yöntemlerinin neden olduğu olumsuz durumları ortadan kaldırmasından dolayı gelecek vaat etmektedir. 5. ÖNERİLER Bu projede geliştirilen biyo-uyumlu altın nanopartikül-lipit konjugatlarının yalnızca akciğer kanserinde değil diğer kanser ve metabolik hastalıkların teşhis ve tedavisinde kullanımı önerilebilir. Bu önerinin hayata geçirilebilmesi için geliştirilen nano-malzemeye antikorlar (hedef hücrelere spesifik) konjuge edilerek modifiyeli nano-malzemenin ilgili hücreye ulaşması arttırılabilir. Geliştirilen nano-malzemenin hedefe ulaşıp ulaşmadığını bu proje çalışmasında olduğu gibi sadece in vitro testlerle değil aynı zamanda in vivo testlerle diğer bir ifade ile model organizmalarda denenerek nano-malzemelerin hedef hücre veya dokulara ulaşması saptanabilir. Ayrıca altın nanopartikül-lipit konjugat temelli nanomalzeme, kemoterapi ilaçlarından farklı olarak, vücuda verildiğinde hedef hücreye ulaşırken sağlıklı hücrelere zarar vermeden hedef hücreye ulaşarak ilgili hücrelerde birikmektedir. Bunun sonucunda, altın nanopartiküllerin eşsiz özelliği olan yüzey plazmon rezonansı ile düşük güçteki (mili Watt) yakın kızıl ötesi ışın varlığında, hücrelerde ışıma yaparak hücre lokasyonunun belirlenmesi ile hedef hücrenin teşhisinde ve aynı ışının gücü (Watt) arttırıldığında ise hücrelerin mikro-çevrelerinde ani sıcaklık artışı sağlayarak hücrelerin yok edilmesi başka bir ifade ile tedavisinde kullanılabilir. - 25 - KAYNAKLAR Ahmed N., Dawson M., Smith C. ve Wood E. (2007), Biology of Disease, sayfa 475480. Akyay, Ö.Z., Selek, A., Tarkun, İ. (2015), Akciğer Kanseri, Endokrinopatiler ve Paraneoplastik Sendromlar. Toraks Cerrahisi Bülteni, 9: 283 – 287. Andros Pharmaceuticals, (2016), Liposomes. http://www.andros.com.tw/en/technology_en.htm Erişim Tarihi: 12.12.2016 Aslam, M.S., Naveed, S., Ahmed, A., Abbas, Z., Gull, I., Athar, M.A. (2014), Side effect of chemotherapy in cancer patients and evaluation of patients opinion about starvation based differential chemotherapy. Journal of Cancer Therapy, 5, 817 – 822. Baba, A., Câtoi C. (2007), Comparative Oncology, The Publishing House of the Romanian Academy, Bükreş. Barker, J.M., Silvestri, G.A. (2002), Lung cancer staging. Current Opinion Pulmunar Medicine, 8(4): 287-293. Boo, H.-J., Min, H.Y., Jang, H.-J., Yun, H. J., Smith, J.K., Jin, Q., Lee, H.-J., Liu, D., Kweon, H.S., Behrens, C., Lee, J.J., Wistuba, I.I., Lee, E., Hong, W.K., Lee, H.Y. (2016), The tobacco-specific carcinogen-operated calcium channel promotes lung tumorigenesis via IGF2 exocytosis in lung epithelial cells. Nature Communications, 7: 12961. Brambilla, E. ve Travis, W.D. (2014). World Cancer Report. Editörler: Stewart, B.W., Wild, C.P., World Health Organization, Lyon, Fransa. Chabner, B.A., Roberts Jr., T.G. (2005), Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer, 5, 65-72. Cioffia, N., Colaiannib, L., Ievac, E., Pilollia, R., Ditarantoa, N., Angionea, M.D., Cotronea, S., Buchholtd, K., Spetzd, A.L., Sabbatinia, L., Torsia, L. (2011), Electrosynthesis and characterization of gold nanoparticles for electronic capacitance sensing of pollutants. Electrochimica Acta, 56, 10: 3713–3720. Collins, L.G., Haines, C., Perkel, R., Enck, R.E. (2007), Lung Cancer: Diagnosis and Management. American Academy of Family Physicians, 75(1): 56 – 63. Conde, J., de la Fuente, J.M., Baptista, P.V. (2013), Nanomaterials for reversion of multidrug resistance in cancer: a new hope for an old idea? Frontiers in Pharmacology, 4(134): 1 – 5. Cooper, W.A., Lam, D.C.L., O’Toole, S.A., Minna, J.D. (2013), Molecular biology of lung cancer. Journal of Thoracic Disease, 5: S479-S490. Dearnaley, D.P., Khoo, V.S., Norman, A.R., Meyer, L., Nahum, A., Tait, D., Yarnold, J., Horwich, A. (1999), Comparison of radiation side-effects of conformal and conventional radiotherapy in prostate cancer: a randomised trial. The Lancet, 23;353(9149):267-272. de Vlieghere, E., Carlier, C., Ceelen, W., Bracke, M., De Wever, O. (2016), Data on in vivo selection of SK-OV-3 Luc ovarian cancer cells and intraperitoneal tumor formation with low inoculation numbers. Data in Brief, 6, 542 – 549. Donaldson, M.S. (2004), Nutrition and cancer: a review of the evidence for an anticancer diet, Nutrition Journal, 3, 19–40. - 26 - Drbohlavova, J., Chomoucka, J., Adam, V., Ryvolova, M., Eckschlager, T., Hubalek, J., Kizek, R. (2013), Nanocarriers for Anticancer Drugs - New Trends in Nanomedicine. Current Drug Metabolism, 14: 547-564. Dünya Sağlık Örgütü, (2015), Kanser, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/. Erişim Tarihi: 21.11.2016, Fernández-López, C., Mateo-Mateo, C., Álvarez-Puebla, R.A., Pérez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L.M. (2009), Highly Controlled Silica Coating of PEGCapped Metal Nanoparticles and Preparation of SERS-Encoded Particles. Langmuir, 25 (24), 13894–13899. Ghosh, D., Chattopadhyay, N. (2013), Gold Nanoparticles: Acceptors for Efficient Energy Transfer from the Photoexcited Fluorophores. Scientific Research: Optics and Photonics Journal, 3: 18-26. GLOBOCAN, (2012), 2012 yılında dünya çapında kanser insidans ve mortalite oranları, Erişim Tarihi: 21.11.2016, http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx Huang, G.S., Chen, Y.-S., Yeh, H.-W. (2007), Differential lethality of gold nanoparticles is associated with immunogenecity. NSTI-Nanotech, 2, 295-298. Jeon, J.H., Kim, D.K., Shin, Y., Kim, H.Y., Song, B., Lee, E.Y., Kim, J.K., You, H.J., Cheong, H., Shin, D.H., Kim, S.-T., Cheong, J.H., Kim, S.Y., Jang, H. (2016), Migration and invasion of drug-resistant lung adenocarcinoma cells are dependent on mitochondrial activity. Experimental and Molecular Medicine, 48, e277. Joshi, P.P., Yoon, S.J., Hardin W.G., Emelianov S., ve Sokolov K. V. (2013), Conjugation of Antibodies to Gold Nanorods through Fc Portion: Synthesis and Molecular Specific Imaging, Bioconjugate Chemistry, 24, sayfa 878−888. Kang, J.H., Ko, Y.T. (2015), Lipid-coated gold nanocomposites for enhanced cancer therapy. International Journal of Nanomedicine, 10: 33 – 45. Kaviratna, A.S., Banerjee, R. (2009), The effect of acids on dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC) monolayers and liposomes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 345: 155 – 162. Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A.A. (2016), Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy. Iranian Journal of Cancer Prevention, 9(2): 1 – 7. Kulkarni, P.R., Yadav, J.D., Vaidya, K.A. (2010), Liposomes: A Novel Drug Delivery System, International Journal of Current Pharmaceutical Research, 3(2): 10 – 18. Li, D., Li, G., Li, P., Zhang, L., Liu, Z., Wang, J., Wang, E. (2010), The enhancement of transfection efficiency of cationic liposomes by didodecyldimethylammonium bromide coated gold nanoparticles. Biomaterials, 31(7): 1850 – 1857. Liao, H. ve Hafner, J.H. (2005), Gold Nanorod Bioconjugates, Chemical Materials, 17, sayfa 4636-4641. Liopo, A. V., Conjusteau A.ve Oraevsky A.A. (2012), PEG-coated gold nanorod monoclonal antibody conjugates in preclinical research with optoacoustic tomography, photothermal therapy and sensing, Proc. SPIE, sayfa 822344. Liu, X., Huang, N., Li, H., Jin, Q., Ji, J. (2013). Surface and Size Effects on Cell Interaction of Gold Nanoparticles with Both Phagocytic and Nonphagocytic Cells, Langmuir, 29: 9138−9148. - 27 - Lu, C., Onn, A., Vaporciyan, A.A., Chang, J.Y., Glisson, B.S., Komaki, R., Wistuba, I.I., Roth, J.A., Herbst, R.S. (2010), Cancer of the Lung. Editörler: Holland-Frei Cancer Medicine 8, Hong, W.K., Bast, R.C., Hait, W.N., Kufe, D.W., Pollock, R.E., Weichselbaum, R.R., Holland, J.F., Frei, E., People’s Medical Publising House-Shelton, Connecticut, USA, 999 – 1040. Manosroi1, A., Thathang, K., Manosroi, J., Werner, R.G., Schubert, R., Peschka-Süss, R. (2009), Expression of luciferase plasmid (pCMVLuc) entrapped in DPPC/Cholesterol/DDAB liposomes in HeLa cell lines. Journal of Liposome Research, 19(2), 131–140. Manosroi1, A., Khositsuntiwong, N., Komno, C., Manosroi, W., Werner, R.G., Manosoi, J. (2011), Chemical Stability and Cytotoxicity of Human Insulin Loaded in Cationic DPPC/CTA/DDAB Liposomes. Journal of Biomedical Nanotechnology, 7, 308–316. Nehl, C.L., Liao, H., Hafner, J.H. (2006), Optical Properties of Star-Shaped Gold Nanoparticles. Nano Letters,6,4, 683-688. Nehru, M. R. ve Singh, P. O. (2008), Nanotechnology and Cancer Treatment, Asian J. Exp. Sci., 22(2), sayfa 45 – 50. Nikoobakht, B., El-Sayed, M.A. (2003), Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods (NRs) Using Seed-Mediated Growth Method. Chemistry of Materials, 15, 19571962. Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukhopadhyay D. ve Mukherjee P. (2010), Fabrication of gold nanoparticles for targeted therapy in pancreatic cancer, Advanced Drug Delivery Reviews, 62, sayfa 346-361. Rosti, G., Bevilacqua, G., Bidoli, P., Portalone, L., Santo, A., Genestreti, G. (2006), Small cell lung cancer, Annals of Oncology, 17: (Supplement 2): ii5–ii10. Smith, D. K. ve Korgel, A. (2008), The Importance of the CTAB Surfactant on the Colloidal Seed-Mediated Synthesis of Gold Nanorods, Langmuir 24, sayfa 644-649. Stephen, Z.R., Kievit, F.M., Veiseh, O., Chiarelli, P.A., Fang, C., Wang, K., Hatzinger, S.J., Ellenbogen, R.G., Silber, J.R., Zhang, M. (2014), Redox-responsive magnetic nanoparticle for targeted convection-enhanced delivery of O6-benzylguanine to brain tumors. ACS Nano. 28; 8 (10): 10383-10395. Velikonja, A., Santhosh, P.B., Gongadze, E. Kulkarni, M., Elersi, K., Perutkova, S., Kralj-Iglic, V., Ulrih, N.P., Igli, A. (2013), Interaction between Dipolar Lipit Headgroups and Charged Nanoparticles Mediated by Water Dipoles and Ions. International Journal of Molecular Sciences, 14, 15312-15329. Viitala, L., Pajari, S., Lajunen, T., Kontturi, L.-S., Laaksonen, T., Kuosmanen, P., Viitala, T., Urtti, A., Murtomäki, L. (2016), Photothermally Triggered Lipit Bilayer Phase Transition and Drug Release from Gold Nanorod and Indocyanine Green Encapsulated Liposomes. Langmuir, 32: 4554 – 4563. Yeh, Y.-C., Creran, B., Rotello, V.M. (2012), Gold nanoparticles: preparation, properties, and applications in bionanotechnology. Nanoscale, 4: 1871–1880. Zhang, L., Sun, X., Song, Y., Jiang, X., Dong, S., Wang, E. (2006), Didodecyldimethylammonium Bromide Lipit Bilayer-Protected Gold Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Self-Assembly. Langmuir, 22: 2838 – 2843. - 28 -
