fv leıden real tıme pcr kđtđ

FV LEIDEN REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPFV
GĐRĐŞ
SAKLAMA KOŞULLARI
Venöz trombozisin en yaygın olarak bilinen genetik risk faktörüdür. FV Leiden
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
mutasyonu, FV geninin 10. ekzonunda 1691 pozisyonunda yer alan tek nokta baz
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
değişimi (A>G) ile gerçekleşir. Bu mutasyon derin ven tromboz riskini
kadar kullanılabilir.
arttırmaktadır.
•
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
TEST SĐSTEMĐNĐN PRENSĐBĐ
DNA ĐZOLASYONU
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
Örnekler steril, EDTA’lı (mor kapaklı) tüplere alınmalı, örnek alındıktan sonra
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
kanın pıhtılaşmasına engel olmak amacı ile tüp hafifçe karıştırılmalıdır. Alınan kan
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
örnekleri izolasyon aşamasına kadar +4°C’de saklanmalı, kan örnekleri bir aydan
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
fazla bir süre bekletilecek ise -20°C’de muhafaza edilmelidir.
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
Sistemimiz, MN NucleoSpin®Blood kitine göre optimize edilmiştir. Đzolasyonun
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
son aşamasında, elde edilen DNA’ nın 150 µl elüsyon solüsyonu ile
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
sulandırılması tavsiye edilmektedir.
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
TEST PROSEDÜRÜ
edilmektedir.
•
Mutasyonun
normal
ve
mutant
master
miksleri
ayrı
ayrı
tüplerde
hazırlanmalıdır.
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
•
Her hasta için mutasyon bölgesine uygun, patenti alınmış Normal ve Mutant
olmak üzere iki master miks çalışılır. Sistem patenti alınmış SNP analizinde
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20,5 µl master miks ve
0,3 µl Hot Start Taq DNA Polimeraz kullanılır.
•
kullanılan 5’ nükleaz PCR için özel olarak hazırlanmış kullanıma hazır kimyasalları
Daha sonra 4,5 µl (~10-100 ng) örnek DNA ‘sı her tüpe ayrı ayrı
konulur.
sağlamaktadır. Sistem, ilgili mutasyonlara uygun sekans spesifik primerler ve
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır ve aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
prob için hazırlanmıştır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks, Hot Start Taq ve aktivatör çalışılacak
Sistem iki farklı primer-prob seti içermektedir. Mutasyon analizleri için FAM
örnek sayısı ile çarpılmalı, gerekli miktarda normal ve mutant master miks
işaretli, sistemin doğru şekilde çalışıp çalışmadığını kontrol eden internal kontrol
ilgili tüplere aktarılmalı ve gerekli miktarda Hot Start Taq DNA Polimeraz
analizi için ise HEX/JOE boyası ile işaretli prob kullanılmaktadır.
eklenmelidir. Taq DNA Polimeraz’ ın her tüpe eşit dağılması amacı ile
striplere dağıtmaya başlamadan önce pipetlenerek iyice karıştırılması
SĐSTEM ĐÇERĐĞĐ
Bileşen
•
FV Leiden Normal PCR Master Miks
•
FV Leiden Mutant PCR Master Miks
•
Hot Start Taq DNA Polimeraz
•
Kontrol DNA
gerekmektedir. Daha sonra striplere 20.5’ar µl master miks dağıtılır ve DNA
20 Test
430 µl
430 µl
25 µl
20 µl
lar ayrı ayrı konulur.
PCR PROGRAMI
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
32 Döngü
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
Mx3000P/Mx3005P
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Aşağıdaki analiz resimleri ABI7500 cihazına aittir.
Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile analiz edilmelidir. DNA eklenmiş tüm
kuyularda internal kontrol pikleri gözlenmelidir. CT değeri ise 22 ≤ ct ≤ 26
aralığında olmalıdır.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
•
Test’te inhibitör varlığı söz konusudur.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
Mutasyon değerlendirmesi FAM boyası ile analiz edilmelidir. Bu aşamada
cihazınıza
uygun
olarak
yapılması
gereken
analiz
ayarlar
hakkında
[email protected] adresinden bilgi alabilirsiniz. Bu boyada görülmesi gereken CT
değer aralığı ise 21 ≤ ct ≤ 25 dir. Bu değer, kullanılan DNA konsantrasyonuna
bağlı olarak 2-3 siklus öne veya arkaya kayabilmekle birlikte, güvenilir bir sonuç
için bu değerler arasında elde edilen pik değerleri kabul edilmektedir.
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
Aynı şekilde heterozigot bir örnek için normal ve mutant piklerden elde edilen ct
değerleri arasında ki fark en fazla 3 siklus olmalıdır. Fark 7 siklustan fazla ise
geriden gelen pik ihmal edilbilmekte, fakat normal ve mutant pikler arasında ki ct
değerinin 4 ≤ ct ≤7 olduğu durumlarda testin tekrar edilmesi önerilmektedir.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012