FMF 7 BÖLGE REAL TIME PCR KĐTĐ Kat. No: SNPFMF-7 GĐRĐŞ SAKLAMA KOŞULLARI FMF (Ailesel Akdeniz Ateşi) genellikle Akdeniz ülkeleri halklarında görülen, • Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır. otozomal resesif kalıtılan hastalıktır. Bu kalıtımsal farklılığın tespiti amacıyla kit • Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine içerisinde kadar kullanılabilir. beş bölge taranmaktadır. Marenostrin-Encoding Fever (MEFV) genindeki farklı mutasyonlar hastalığa sebep olabilmektedir. Kitiniz içerisinde • Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir. ekzon 10 içinde M694I, M694V, M680I(G/C-A), V726A, R761H, ekzon 3 içinde P369S ve ekzon 2 içindeki E148Q mutasyonları çalışılmaktadır. DNA ĐZOLASYONU Örnekler steril, EDTA’lı (mor kapaklı) tüplere alınmalı, örnek alındıktan sonra TEST SĐSTEMĐNĐN PRENSĐBĐ kanın pıhtılaşmasına engel olmak amacı ile tüp hafifçe karıştırılmalıdır. Alınan kan Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır. örnekleri izolasyon aşamasına kadar +4°C’de saklanmalı, kan örnekleri bir aydan Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya fazla bir süre bekletilecek ise -20°C’de muhafaza edilmelidir. bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı Sistemimiz, MN NucleoSpin®Blood kitine göre optimize edilmiştir. Đzolasyonun zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR son aşamasında, elde edilen DNA’ nın 150 µl elüsyon solüsyonu ile esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob sulandırılması tavsiye edilmektedir. parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir. TEST PROSEDÜRÜ Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma • doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit Her mutasyonun normal ve mutantmaster miksleri ayrı ayrı tüplerde hazırlanmalıdır. edilmektedir. • ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ • Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20,5 µl master miks ve 0,3 µl Hot Start Taq DNA Polimeraz kullanılır. Her hasta için her mutasyon bölgesine uygun, patenti alınmış Normal ve Mutant olmak üzere iki master miks çalışılır. Sistem patenti alınmış SNP analizinde Sadece E148Q mutasyonu için hem normal hem de mutant miksine 1,25 µl E148Q Aktivatörü eklenir. • kullanılan 5’ nükleaz PCR için özel olarak hazırlanmış kullanıma hazır kimyasalları Daha sonra 4,5 µl (~10-100 ng) örnek DNA ‘sı her tüpe ayrı ayrı konulur. sağlamaktadır. Sistem, ilgili mutasyonlara uygun sekans spesifik primerler ve • Hafifçe pipetlenerek karıştırılır ve aşağıda belirtilen programla çalıştırılır. prob için hazırlanmıştır. • Birden fazla örnek için, Master miks, Hot Start Taq ve aktivatör çalışılacak Sistem iki farklı primer-prob seti içermektedir. Mutasyon analizleri için FAM örnek sayısı ile çarpılmalı, gerekli miktarda normal ve mutant master miks işaretli, sistemin doğru şekilde çalışıp çalışmadığını kontrol eden internal kontrol ilgili tüplere aktarılmalı ve gerekli miktarda Hot Start Taq DNA Polimeraz analizi için ise HEX/JOE boyası ile işaretli prob kullanılmaktadır. eklenmelidir. Taq DNA Polimeraz’ ın her tüpe eşit dağılması amacı ile striplere dağıtmaya başlamadan önce pipetlenerek iyice karıştırılması SĐSTEM ĐÇERĐĞĐ Bileşen • M694I Normal PCR Master Miks • M694I Mutant PCR Master Miks • M694V Normal PCR Master Miks • M694V Mutant PCR Master Miks • M680I Normal PCR Master Miks • M680I Mutant PCR Master Miks • V726A Normal PCR Master Miks • V726A Mutant PCR Master Miks • R761H Normal PCR Master Miks • R761H Mutant PCR Master Miks • P369S Normal PCR Master Miks • P369S Mutant PCR Master Miks • E148Q Normal PCR Master Miks • E148Q Mutant PCR Master Miks • E148Q Aktivatör • Hot Start Taq DNA Polimeraz • Kontrol DNA gerekmektedir. Daha sonra striplere 20.5’ar µl master miks dağıtılır ve DNA 20 Test 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 430 µl 75 µl 100 µl 65 µl lar ayrı ayrı konulur. PCR PROGRAMI 95 °C 10 Dk. 95 °C 15 Saniye 62 °C 1 Dk. 32 Döngü 62 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir. Eğer; • ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none” seçeneğini seçiniz. • Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız, seçiniz. Bu sistemin çalışabileceği cihazlar; ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900 Mx3000P/Mx3005P Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5 Roche LightCycler® 480 System lütfen referans boya olarak “rox” u ANALĐZ PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz edebilirsiniz. Aşağıdaki analiz resimleri ABI7500 cihazına aittir. Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile analiz edilmelidir. DNA eklenmiş tüm kuyularda internal kontrol pikleri gözlenmelidir. CT değeri ise 22 ≤ ct ≤ 26 aralığında olmalıdır. OLASI PROBLEMLER Eğer internal kontrol çalışmıyorsa, • DNA eksikliği, • Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği, • Test’te inhibitör varlığı söz konusudur. Eğer pikler geç başlıyorsa, Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa, • Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir. • Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz. Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz. Mutasyon değerlendirmesi FAM boyası ile analiz edilmelidir. Bu aşamada cihazınıza uygun olarak yapılması gereken analiz ayarlar hakkında [email protected] adresinden bilgi alabilirsiniz. Bu boyada görülmesi gereken CT değer aralığı ise 21 ≤ ct ≤ 25 dir. Bu değer, kullanılan DNA konsantrasyonuna bağlı olarak 2-3 siklus öne veya arkaya kayabilmekle birlikte, güvenilir bir sonuç için bu değerler arasında elde edilen pik değerleri kabul edilmektedir. UYARILAR • Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır. • Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır. • PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir. • Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir. Aynı şekilde heterozigot bir örnek için normal ve mutant piklerden elde edilen ct değerleri arasında ki fark en fazla 3 siklus olmalıdır. Fark 7 siklustan fazla ise geriden gelen pik ihmal edilbilmekte, fakat normal ve mutant pikler arasında ki ct değerinin 4 ≤ ct ≤7 olduğu durumlarda testin tekrar edilmesi önerilmektedir. • Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır. • Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır. • PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır. • PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine dikkat edilmelidir. Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012