p ın ar öz istan b ul ü niv ers it esi s ağ . bil. en s t. yü ksek lis an s tez
advertisement
PINAR ÖZ İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞ. BİL. ENST. YÜKSEK LİSANS TEZİ İSTANBUL-2012 T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ATP BİYOLUMİNESANS HİJYEN MONİTOR SİSTEMİNİN PERFORMANSININ KLASİK MİKROBİYOLOJİK METOT (SWAP) İLE KARŞILAŞTIRMAK SURETİYLE ÖLÇÜLMESİ PINAR ÖZ DANIŞMAN PROF. DR. ÖZGE ÖZGEN ARUN BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI BESİN HİJYENİ VE TEKNOLOJİSİ PROGRAMI İSTANBUL-2015 ii TEZ ONAYI iii BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmasıyla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığı beyan ederim. iv İTHAF Yapmış olduğum bu çalışmayı çok değerli aileme ithaf ediyorum. v TEŞEKKÜR Başarının bir varış noktası değil zirveye giden yolda çıkılan bir basamak olduğunu öğreten ilk öğretmenlerim canım annem Gönül ÖZ’e ve canım babam Atıf ÖZ’e, bilimsel bir rapor hazırlamadaki deneyim, bilgi ve tecrübelerini paylaşan canım ağabeyim Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Uzmanı Op. Dr. Cem ÖZ’e, canım kardeşim Tekstil Müh. Damla ÖZ’e ve 18 Temmuz 2015 tarihinde kaybettiğimiz asaleti, özgüveni ve merhametini örnek aldığım rahmetli anneannem Hikmet TEMEL’e desteklerinden dolayı gönülden teşekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim süresince bana yol gösteren, bilimsel düşünme ve uygulama fırsatı sunan, çalışmalarımı takip ederek beni doğruya yönlendiren çok saygıdeğer danışman hocam Prof. Dr. Özge ÖZGEN ARUN’a, Çalışmalarım süresince desteklerini esirgemeyen İ. Ü. Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Özer ERGÜN’e, Çok değerli bilgileriyle tezime katkıda bulunan Prof. Dr. Bülent EKİZ’e, teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 14970 vi İÇİNDEKİLER TEZ ONAYI .................................................................................................................... İİ BEYAN………………………………………………………………………………...İİİ İTHAF ............................................................................................................................ İV TEŞEKKÜR…………………………………………………………………………….V İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. Vİ TABLOLAR LİSTESİ…………………………………………………………………İX SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ……………………..…………………….X ÖZET…………………………………………………………………………………...Xİ ABSTRACT.................................................................................................................. Xİİ 1. GİRİŞ VE AMAÇ .........................................................................................................1 2. GENEL BİLGİLER ......................................................................................................3 2.1. Gıda Güvenilirliği ve Gıda Hijyeninin Tanımı…………………………………..…3 2.2. Gıda Güvenilirliği Tehlikeleri………………………………………………………3 2.2.1.Fiziksel Tehlikeler……………………………………………………………..…..3 2.2.2. Kimyasal Tehlikeler………………………………………………………...…….4 2.2.3. Mikrobiyolojik Tehlikeler……………………………………………………...…4 2.2.3.1. Gıda Bozulmaları…………………………………………………………….…5 2.2.3.2. Gıda Zehirlenmeleri…………………………………………………………….5 2.3. Gıda İşletmelerinde Gıda Güvenilirliğini Güvence Altına Alan Sistemler…….…..6 2.4. Gıda İşletmelerinde Hijyen Uygulamalarının Doğrulanması İçin Kullanılan Metotlar………………………………………………………………………………….7 2.4.1. Kültürel Metot…………………………………………………………………….8 2.4.2. 3MTM PetrifilmTM....................................................................................................9 2.4.3. Compact Dry…………………………………………………………………….10 2.4.4. Hazır Agarlı Plakalar………………………………………………………...…..10 2.4.5. Direkt Epifluoresan Filtre Tekniği (DEFT)………………………………….….11 2.4.6. Enzimle Bağlı İmmunosorbent Ölçüm Metodu (ELISA) Ve Enzimle Bağlı Floresan Ölçüm Metodu (ELFA)………………………………...……………….........12 vii 2.4.7. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)…………………………………………….13 2.4.8. Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR, Q-PCR...…14 2.4.9. ATP Biyolüminesans…………………………………………………………….15 2.4.9.1. ATP Biyolüminesans Metodunun Prensibi……………………………………15 2.4.9.2. Biyoluminesans Reaksiyonu……………………………………………….…..15 2.4.9.3. ATP Biyolüminesans Metodunun Gıda Mikrobiyolojisindeki Uygulamaları…16 2.5. Kanatlı Endüstrisi………………………………………………………………….17 2.5.1. Kanatlı Kesimhanelerinde Hijyen Uygulamaları……………………………..…17 2.5.2. Kanatlı Kesimhanelerinde Hijyen Doğrulama İhtiyacı………………………….18 3. GEREÇ VE YÖNTEM ...............................................................................................20 3.1. GEREÇ…………………………………………………………………………….20 3.1.1. Model Yüzeyler………………………………………………………………….20 3.1.2. Referans Kültürler……………………………………………………………….20 3.1.3. Kullanılan Cihazlar………………………………………………………………20 3.1.4. Analizlerde Kullanılan Besiyeri ve Çözeltiler………………………………...…21 3.2. YÖNTEM………………………………………………………………………….21 3.2.1.Model Çalışma Yüzeylerinin Dezenfeksiyonu……………...………………...….21 3.2.2. Temiz Yüzeylerin Mikroorganizma Yükünün Kontrolü……………….………..22 3.2.3. Kontaminasyon için Kullanılacak Kültürlerin Hazırlanması……………………22 3.2.4. Yüzeylerin Kontaminasyonunda Kullanılacak Kültürleri İçeren Çözeltinin Hazırlanması ve Mikroorganizma Yükünün Belirlenmesi…………………………..…22 3.2.5. Yüzeylerin Kirletilmesi………………………………………………………….22 3.2.6. ATP Ölçümleri…………………………………………………………..………23 3.2.7. Klasik Swap Yöntemi için Örneklerin Alınması…………………………..…….23 3.2.8. Swap Örneklerinin Mikrobiyolojik Ekimleri……………………………………23 3.2.8.1. Seri Seyreltimlerin Yapılması…………………………………………………23 3.2.8.2. E. coli Sayımı………………………………………………………………….23 3.2.8.3. Salmonella Sayımı…………………………………………………………..…23 3.2.8.4. S. aureus Sayımı……………………………………………………………….24 3.2.8.5. S.cerevisiae Sayımı…………………………………………………………….24 3.2.8.6. Toplam Aerobik Bakteri Sayımı……………………..…………………..…….24 viii 3.2.9. Kanatlı Kesimhanesinden Alınan Örneklerin Analizi………………………..….25 3.2.10. İstatistiksel Analizler…………………………………………………..……….25 3.2.11. RLU Değerlerinin Yorumlanması…………………………………………..….25 4. BULGULAR ...............................................................................................................26 4.1. Temiz Yüzeylerin Mikroorganizma Yükünün Kontrolü…………………………..26 4.2. Model Çalışma Yüzeylerinde Salmonella Bulguları………………………………26 4.3. Model Çalışma Yüzeylerinde E. coli Bulguları……………………………………27 4.4. Model Çalışma Yüzeylerinde S. aureus Bulguları………………………………...28 4.5. Model Çalışma Yüzeylerinde S. cerevisiae Bulguları……………………………..29 4.6. ATP Metodu İle Klasik Külterel Metot Arasındaki Korelasyon Değerleri ……….30 4.7. Bir Kanatlı Kesimhanesinden Alınan Numunelerle Yapılan Çalışma Sonuçları….31 5. TARTIŞMA ..........................................................................................................…..32 KAYNAKLAR….. .........................................................................................................37 ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................51 ix TABLOLAR LİSTESİ Tablo 4-2 : Model çalışma yüzeylerinde Salmonella bulguları (log10 kob/cm2)…….26 Tablo 4-3 : Model çalışma yüzeylerinde E. coli bulguları (log10 kob/cm2)…….……27 Tablo 4-4 : Model çalışma yüzeylerinde S. aureus bulguları (log10 kob/cm2)…........28 Tablo 4-5 : Model çalışma yüzeylerinde S. cerevisiae bulguları (log10 kob/cm2)…...29 Tablo 4-6 : ATP metodu ile klasik kültürel metot arasındaki korelasyon değerleri..........................................................................................................................30 Tablo 4-7 : Bir kanatlı kesimhanesinden alınan numunelerle yapılan çalışma sonuçları……………..……………………………………………….…..………..…...31 x SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ ATP : Adenozin Trifosfat BRC : İngiliz Perakendecilik Konsorsiyumu Standardı CDC : ABD Hastalık Kontrol ve Korunma Merkezleri DEFT : Direkt Epifloresan Filtre Tekniği ELISA : Enzimle Bağlı Immunosorbent Ölçüm Metodu ELFA : Enzimle Bağlı Floresan Ölçüm Metodu FDA : Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi HACCP : Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktaları IFS : Uluslararası Gıda Standardı IMS : Immuno Manyetik Seperasyon ISO : Uluslararası Standartlar Örgütü kob : Koloni Oluşturan Birim PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu RLU : Relatif Işık Ünitesi RT-PCR (Q-PCR) : Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu sa. : saat TSE : Türk Standartları Enstitüsü USDA : Amerikan Tarım Departmanı WHO : Dünya Sağlık Örgütü xi ÖZET Öz, P. (2015). ATP Biyoluminesans Hijyen Monitor Sisteminin Performansının Klasik Mikrobiyolojik Metot (Swap) İle Karşılaştırmak Suretiyle Ölçülmesi. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Besin Hijyeni ve Teknolojisi AbD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. Gıda işletmelerinde uygun bir hijyen prosedürünün uygulanması ve etkinliğinin doğrulanması gıda güvenilirliğini sağlamanın önemli şartlarından biridir. Bu nedenle, araştırmacılar, gereksinimlerinin kuruluşların karşılanması üretim için prosesindeki hızlı ve rutin güvenilir hijyen doğrulama alternatif metotların geliştirilmesine yönelmiştir. ATP biyoluminesans hijyen görüntüleme metodu hızlı ve kolay uygulanabilir olması nedeniyle geniş bir kullanım alanı bulmuştur. Bu tez çalışmasında, ATP biyoluminesans metodunun performansı ve uygulanabilirliği, klasik metot ile karşılaştırılarak incelenmiştir. Bunun için, paslanmaz çelik yüzeyler dört farklı mikroorganizmanın yüksek, orta ve düşük olmak üzere üç farklı kontaminasyon seviyesi ile kirletilmiş ve buralardan elde edilen ATP biyoluminesans RLU değerleri ve klasik metot ile sayılan kob değeri karşılaştırılmıştır. Elde edilen bulgular metodun performansının mikroorganizma yükü, yüzeydeki kirlilik ve florada mevcut bulunan mikroorganizma türüne göre farklılık gösterdiğini kanıtlamıştır. Buna göre metot fiziksel kir bulunmayan ve yüksek mikroorganizma seviyesinde daha güvenilir sonuçlar vermektedir. İncelenen mikroorganizma türleri içerisinde en anlamlı sonuçlar Salmonella taşıyan yüzeylerden elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: ATP Biyoluminesans, Gıda Hijyeni, Hijyen Monitor, Kanatlı, Hızlı metot Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 14970 xii ABSTRACT Öz, P. (2015). Evaluation of the Performance of ATP Bioluminescense Hygiene Monitoring System by Comparing with Conventional Microbiological Method (Swap). Istanbul University. Institute of Health Science. Department of Food Hygiene and Technology. Master Degree Thesis. İstanbul. Application of an appropriate hygiene practice and verification of the practice is a major necessity for food safety. Therefore, researchers put significant effort on development of rapid and reliable alternative methods to meet the requirement of routine hygiene monitoring in food production. ATP bioluminescense hygiene monitoring method is widely accepted in this area due to its rapid results and easy applicability. In this study, the performance and the applicability of ATP bioluminescense method was compared with conventional swabbing method. For this aim, stainless steel surfaces have been contaminated with high, medium and low contamination levels of four different microorganisms. The RLU values recorded with ATP bioluminescense method and the cfu values counted with conventional method were compared. Results indicated that the performance of method has differed for microorganism load, contamination level of the surface and the species of microorganism in the flora. According to our results ATP bioluminescense gives more reliable results in surface which do not have any physical dirth and contaminated with high level of microorganisms. The most reliable results were obtained from Salmonella contaminated surfaces. Key Words: ATP Bioluminescense, Food Hygiene, Hygiene monitoring, Poultry, Rapid method This Project was supported by Research Fund of Istanbul University, Project No: 14970 1. GİRİŞ VE AMAÇ Son yıllarda tüketici farkındalığının da artmasıyla gıda endüstrisinde gıda güvenilirliği öncelikli amaç haline gelmiştir. Gıda işletmelerinde besin değerini yitirmemiş ve hijyenik özellikleri korunmuş güvenilir gıda üretmek ve üretiminin devamlılığını sağlamak amacıyla işletme koşullarının standardizasyonu ve bu koşulların rutin kontrolünün kolaylaştırılmasına yönelik teknolojik çalışmalar yapılmaktadır. Gıdaların hammaddeden başlayarak üretim, işleme, saklama, taşıma ve dağıtım aşamalarında gerekli hijyen kurallarının uygulanması ve önlemlerin alınması gıda güvenilirliğinin ana teması olarak kabul edilmektedir (Serpen 2007; Keeratipibul ve ark. 2009). Gıda ürünleri “çiftlikten çatala” kadar olan bu üretim sürecinde çok sayıda fiziksel, kimyasal ve mikrobiyolojik tehlikeye maruz kalabilmektedir. Gıdalara sonradan bulaşan bu tehlikeler “gıda kontaminantları” olarak adlandırılmaktadır. Özellikle mikrobiyolojik tehlikeler başlığı altında yer alan bakteri, virus, parazit gibi gıda patojenleri gıda zehirlenmelerinin temel etmenleridir (Giray ve Soysal 2007; Serpen 2007). Günümüzde yaygınlaşan gıda kaynaklı zehirlenme vakalarının önüne geçilebilmesi ancak, hammadde üretiminden başlayarak, tüketiciye ulaşıncaya kadar ki süreçte gıda işletmelerinin üretim proseslerinde uluslararası kalite ve gıda güvenilirliği yönetim sistemi standartlarını uygulamalarıyla gerçekleşebilmektedir (Rosmini ve ark. 2004). Gıda güvenilirliği yönetim sistemlerinin önemli bir aşaması olan doğrulama süreçleri, hijyen uygulamalarında periyodik doğrulamaların yapılmasını zorunlu kılmaktadır. Bu faaliyet için klasik mikrobiyolojik metotlardan yararlanılması, gerek çok uzun sürmeleri, gerekse önemli iş yükü getirmesi sebebiyle çok pratik değildir. Bu amaçla, bu metotların yerine kullanılabilecek alternatif hızlı metotların geliştirilmesi önemli bir araştırma konusu olmuştur (Rosmini ve ark. 2004). Klasik metotlara kıyasla daha hızlı, pratik ve kolay uygulanıyor olması nedeniyle geliştirilen bu alternatif metotlar üretim yerlerindeki hijyenin doğrulanmasını ve dolaylı olarak gıdalarda varolan patojenlerin sebep olduğu gıda kaynaklı 2 zehirlenmelerin de daha kısa sürede tespit edilmesini sağlamaktadır. Yüzey hijyeninin doğrulanmasında yaygın kullanım alanı olan alternatif metotlara örnek; klasik swap metodu, 3MTM PetrifilmTM, CompactDry, Contact Plate, Dipslide, DEFT, ELISA, PCR ve ATP biyoluminesans hijyen görüntüleme metodudur (Ünlütürk ve Turantaş 1999; Jasson ve ark. 2010). Bu alternatif metotlardan ATP biyoluminesans yöntemi 1960’lı yıllardan bu yana biyolojik proseslerdeki mikrobiyel aktivitenin online teknik kullanılarak ölçümünün yapılması amacıyla önerilmiştir (Chu ve ark. 2001). Enzim _ substrat kompleksi olan lusiferin _ lusiferaz ile ATP’nin reaksiyona girerek kimyasal enerjiyi ışık enerjisine dönüştürmesi ve bu şekilde açığa çıkan ışığın şiddetinin, lüminometre ile ölçülmesi prensibine dayanan metot gıda endüstrisinde yaygın kullanım alanı bulmuştur (Griffith ve ark. 1997). Bu metot gıda endüstrisi içinde gıda kaynaklı zehirlenmelerin sıklıkla rastlandığı ürünlerin başında gelen kanatlı eti üretimi sektöründe de kullanım olanağı sunmaktadır (İşeri ve Erol 2009). Bu sektörde uygulanan kalite ve gıda güvenilirliği yönetim sistemleri kapsamında, hem işgücü hem de zamandan kazanç sağlayarak, hijyen ve sanitasyon uygulamalarının doğrulanmasında kullanılmaktadır (Sala ve ark. 2008). Bu çalışma ATP biyoluminesans hijyen görüntüleme metodunun performansının ve uygulanabilirliğinin klasik metot ile karşılaştırılmak suretiyle incelenmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Bu doğrultuda yapay olarak farklı mikroorganizmalarla kirletilmiş deneysel ortamlardaki kirlilik seviyesi her iki metot kullanılarak karşılaştırılmıştır. Ayrıca ATP biyoluminesans hijyen görüntüleme metodunun gıda işletmelerindeki kullanım olanaklarının değerlendirilmesi amacıyla bir kanatlı kesimhanesinin doğal kontamine üretim alanlarından alınan numuneler yine her iki metot karşılaştırılarak incelenmiştir. 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Gıda Güvenilirliği ve Gıda Hijyeninin Tanımı Gıda güvenilirliği, sağlıklı gıda üretebilmek amacıyla gıdaların, hammaddeden başlayarak, üretim, işleme, depolama, taşıma ve dağıtım aşamalarında gerekli hijyen kurallarına uyulması ve önlemlerin alınması olarak belirtilmekte ve sağlığa yararlı olma durumu korunmuş gıda kavramını içermektedir (TSE 2003; TSE 2006; Serpen 2007). Bu doğrultuda, güvenilir gıda üretme çabası ile gıdaların güvenilirliklerini olumsuz yönde etkileyecek faktörlerin ortadan kaldırılması ya da en az düzeye indirilmesi amaçlanmaktadır (Güder 2006; Keeratipibul ve ark. 2009). Türk Gıda Kodeksi, Gıda Hijyeni Yönetmeliği’nde gıda hijyeni; tehlikenin kontrol altına alınması ve gıdaların kullanım amacı dikkate alınarak, insan tüketimine uygunluğunun sağlanması için gerekli her türlü önlem ve koşullar olarak tanımlanmaktadır (Anonim 2011). 2.2. Gıda Güvenilirliği Tehlikeleri 5996 sayılı Veteriner Hizmetleri, Bitki Sağlığı, Gıda ve Yem Kanunu’nda tehlike; sağlık bakımından olumsuz etki yaratma potansiyeli bulunan, gıda ve yemdeki biyolojik, kimyasal veya fiziksel etmenler ile gıda ve yemin durumu olarak tanımlanmaktadır (Anonim 2010). Gıdalardan kaynaklanan riskler gıdanın üretimden tüketim aşamasına kadar geçirdiği işleme, taşıma, depolama, satın alma, saklama, hazırlama, pişirme aşamalarında ayrı ayrı değerlendirilmekte ve fiziksel, kimyasal ve biyolojik tehlikeler olarak gruplandırılmaktadır (Güder 2006; Serpen 2007; Engez ve Ergönül 2009). 2.2.1. Fiziksel Tehlikeler Gıdalarda bulunmaması gereken cam kırıkları, metal parçaları ve tozları, plastik, kemik, kâğıt, taş, toprak, tahta, saç, tırnak, sinek, böcek ve boya kalıntıları gibi yabancı maddeler fiziksel tehlikelerdir. Bunlar hammadde elde edilmesi, üretim, saklama, paketleme, taşıma veya tüketim aşamalarında çevreden gıdalara bulaşabilmekte veya hile amacıyla eklenebilmektedir (Giray ve Soysal 2007; Özkaya ve Cömert 2008; Engez ve Ergönül 2009). 4 2.2.2. Kimyasal Tehlikeler Gıdalarda bulunan tehlikeli kimyasallar çok çeşitlidir ve bunlar gıdaya ve yeme, üretim, işleme, taşıma, hazırlama ve tüketim aşamalarının herhangi bir noktasında bulaşabilmektedir. Son yıllarda, bitki koruma ürünlerinin kalıntıları, doğal toksik maddeler (mikotoksinler, bitki toksinleri vb.), işleme sırasında oluşan toksinler (akrilamid, heterosiklik aromatik aminler, furanlar vb.), gıda alerjenleri, ağır metaller (kurşun, arsenik, civa, kadmiyum vb.), endüstriyel kimyasallar (dioksinler, benzen, perklorat vb.), ambalaj materyallerinden geçen maddeler ve hile amaçlı katılan maddeler (melamin vb.) gibi kimyasallar gıda güvenilirliğini, dolayısıyla halk sağlığını tehdit etmektedir (Ünlütürk ve Turantaş 1999; Çömlekoğlu ve ark. 2000). Yılmaz ve ark. (2006)’nın çalışmalarının sonuçları, 1 yıllık bir süre içerisinde tespit edilen akut zehirlenme vakalarının %9’unun tarım ilacına, %24’ünün gıda ve mantar zehirlenmesine bağlı oluştuğunu göstermiştir. Benzer olarak, Özcan ve İkincioğulları (2009), 2008 yılı içerisinde gıdalardan kaynaklanan zehirlenme başvuru sayısını toplam 2590 olarak bildirmişler ve bu başvuruların 185’inin kimyasal bulaşlar ve 428’inin gıda ve gıda katkı maddeleri ile ilişkili olduğunu açıklamışlardır. 2.2.3. Mikrobiyolojik Tehlikeler Halk sağlığı açısından büyük bir risk haline gelen mikrobiyel tehlikeler, patojen bakteriler, küf ve mayalar, viruslar ve parazitler dolayısıyla ortaya çıkmaktadır. Mikroorganizmalar gıdalara fekal kontaminasyon, hasta hayvanların et ve sütünün tüketilmesi, enfekte yaralar, çöpler, kirli sular, kontamine alet-ekipmanlar, haşere, kemirgen, toprak ya da evcil hayvanlar ile bulaşabilmektedir (Özkaya ve Cömert 2008). Özcan ve İkincioğulları (2009)’nın ‘Ulusal Zehir Danışma Merkezi 2008 Yılı Çalışma Raporu Özeti’ne göre, toplam 2590 gıda kaynaklı zehirlenme başvurusunun 493 adedinin mikroorganizmalardan ya da toksinlerinden kaynaklandığı bildirilmiştir. Mikroorganizmalar gıdalarda iki bozulmaları ve gıda kaynaklı zehirlenmeler. şekilde tehlike oluşturmaktadır; gıda 5 2.2.3.1. Gıda Bozulmaları Gıdalarda bozulma, gıdanın yapısında bulunan protein, karbohidrat ve yağlarla, çeşitli organik asitler, alkoller, aldehitler, selüloz ve pektin gibi bileşiklerin yıkımlanması sonucu gıdada istenmeyen bir görünüş, tat ve kokunun ortaya çıkması olarak tanımlanmaktadır (Özkaya ve Cömert 2008). Mikrobiyel bozulma sebepleri bakteriler ya da küf ve mayalar olabilmektedir. Mikroorganizmalar gıdaların fiziksel, kimyasal ve duyusal özelliklerini değiştirmektedir. Fiziksel ve kimyasal bozulmalar, nem içeriği düşük veya orta düzeyde olan gıdaların raf ömrünü sınırlarken, nem içeriği yüksek ve su aktivitesi (aw)>0,85 olan gıdalarda bakteri, maya ve küflerin yol açtığı mikrobiyel bozulmalar ortaya çıkabilmektedir (Özkaya ve Cömert 2008). Süt ürünleri, kırmızı et, kanatlı eti, balık ve diğer su ürünleri gibi yüksek protein değerine sahip ürünler mikrobiyel bozulmaya karşı daha duyarlıdır (Kaymaz 1987; Bostan ve ark. 2001; Çaklı ve Kışla 2003). 2.2.3.2. Gıda Zehirlenmeleri Gıda zehirlenmesi herhangi bir besin maddesinin tüketimi sonucu meydana gelen enfeksiyon veya intoksikasyon durumudur. Gıda enfeksiyonları, zararlı bakterilerin ürediği gıdanın tüketilmesi sonucu oluşan rahatsızlıkları, gıda intoksikasyonu ise toksin üreten bazı bakterilerin ürettiği toksini taşıyan gıdanın tüketilmesi ile oluşan zehirlenmeleri ifade etmektedir (Codex Alimentarius/WHO 2011; WHO 2013). Biyolojik etmenle hastalık oluşabilmesi için gıdanın mikroorganizmanın gelişmesine elverişli olması, mikroorganizmanın sayısının yeterli olması, ısı, zaman, nem, pH, oksijen basıncı gibi uygun çevre koşullarının sağlanması, gıda maddesine mikroorganizma ya da toksinleri yok edecek asepsi, filtrasyon, ısı, radyasyon gibi işlemlerin uygulanmamış olması ve gıdanın konakçı tarafından yenmesi gerekmektedir (Güler ve Çobanoğlu 1994). Gıda maddesinde mikroorganizma yükünün fazla olmasının nedenleri olarak, yetersiz ısı işlemi, kontamine malzemeler, uygun olmayan ortamlarda muhafaza, yetersiz işleme, çapraz kontaminasyon ve hijyen eğitimi verilmeyen personel sayılabilmektedir (Uğur ve ark. 2001; Erol 2007). 6 Gıda kaynaklı zehirlenme vakalarının %46’sı yetersiz soğutmaya, %21’i üretim ve tüketim arası sürenin uzatılmasına, %20’si enfekte personele, %16’sı yanlış ısı uygulamasına, %16’sı yetersiz ısıtma ve pişirme işlemlerine, %11’i kontamine malzeme kullanımına, %7’si çapraz kontaminasyona ve %7’si yetersiz hijyen uygulamalarına bağlıdır (Öğüt ve Polat 2009). Sağlık Bakanlığı istatistikleri 2005 yılı verilerine göre ülkemizde etkeni Salmonella typhi olan 5168 klinik tifo vakası ve 10.514 olası tifo vakası bildirilmiştir. Mikroorganzimaların neden olduğu salgın vakalarında Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfiringens, Listeria monocytogenes en sık izole edilen mikroorganizmalardandır (Kartal 2010). Amerika’da her yıl patojen bakterilerle kontamine gıda tüketimi nedeniyle 48 milyon hastalık vakası oluştuğu ve bu vakalardan 3000 adedinin ölüm ile sonuçlandığı bildirilmiştir (USDA 2013). Amerika’da gıda kaynaklı hastalıklara neden olan Campylobacter spp., Cryptosporidium spp., Cyclospora spp., L. monocytogenes, Salmonella spp., E. coli O157, Shigella spp., Vibrio spp. ve Yersinia spp. gibi patojen bakterilerin 2006-2013 yılları boyunca enfeksiyon oluşturma insidensinin incelendiği bir çalışmada 2013 yılında 19.056 adet gıda kaynaklı enfeksiyon vakasının olduğu, bunlardan 4200’ünün hastanede yatarak tedavi edildiği ve 80 adet vakanın ise ölüm ile sonuçlandığı bildirilmiştir (Centers for Disease Control 2014). 2.3. Gıda İşletmelerinde Gıda Güvenilirliğini Güvence Altına Alan Sistemler Günümüzde gıda üretimi ve dağıtımı işi ile uğraşan kuruluşlar açısından gıda zincirinde güvenilirlik ve hijyen, rekabet ve rekabetin sürdürülebilirliğinin sağlanması açısından büyük önem taşımaktadır. Bu durum gıda güvenilirliği ve gıda zinciri boyunca kalite yönetim sistemleri ve programlarının gerek ulusal gerek uluslararası düzeyde uygulanmasını gerektirmektedir (Serpen 2007; Erkan ve ark. 2008; Karaman ve ark. 2011). Bu sistemlerin gıda endüstrisinde kullanılan başlıcaları Uluslararası Standartlar Organizasyonu (ISO) tarafından yayınlanan ISO 9000:2005 Kalite Yönetim Sistemi, ISO 22000 Gıda Güvenliği Yönetim Sistemi ve çeşitli organizasyonların standartlarıdır (TSE 2006; ISO 2009a; BRC 2015). 7 Codex Alimentarius Komisyonu tarafından geliştirilen HACCP sistemi, ülkemizde Türk Standartları Enstitüsü (TSE) tarafından TSE 13001 adı altında ulusal bir gıda güvenliği standardı olarak yayınlanmıştır (TSE 2003). İlk uluslararası Gıda Güvenliği Standardı ise HACCP prensiplerini temel alan ISO 22000 standardı olup, ISO tarafından yayınlanmıştır (TSE 2006). Uluslararası geçerliliği olan bu standartlar ile halk sağlığı açısından önemli olan kalite kontrol ve belgelendirme sistemlerinde güncelleme çalışmalarına başlanmıştır (TSE 2003; Cevizci ve Önal 2009). Türkiye de dahil olmak üzere bir çok ülkedeki üreticiler hem yeni müşteri beklentileri doğrultusunda hem de uluslararası piyasalarda daha çok yer alabilmek amacıyla, tesislerinde Gıda Güvenliği Yönetim Sistemleri’nin uygulanmasını yaygınlaştırmış ve bu sistemlerin gereği olarak gıda risklerini kabul edilebilir düzeylere indirebilmek için sistematik yaklaşımlarla işletmelerine özgü bazı gıda güvenilirliği programları oluşturmuşlardır (Karaman ve ark. 2011). Bu yaklaşımla hazırlanan ve HACCP prensiplerinin de yer aldığı ISO 22000 Gıda Güvenliği Yönetim Sistemi, gıda zincirinin her aşamasında uygulanabilmektedir (TSE 2006). Bahsedilen bu standartlarda gıda güvenilirliğinin ve gıda hijyeninin sağlanabilmesi için hammaddeden ürünün işlenmesine ve tüketiciye sunulmasına kadar olan tüm aşamalarda etkin kontrol önlemlerinin alınması gerekmektedir (Uğur ve ark. 2001; Koçak 2007; Cevizci ve Önal 2009). Bu kontrol önlemleri kapsamında gıda işletmelerinde hijyen ve sanitasyon kurallarına uyulması, temizlik ve dezenfeksiyon uygulamalarının belli bir program çerçevesinde, işletme ve prosese uygun ve etkin bir şekilde gerçekleştirilmesi gibi gereklilikler önemli bir yer tutmaktadır (TSE 2003; TSE 2006; Topalakçı 2007). Bu sistemlerin önemli bir ayağını da yerine getirilen faaliyetlerin uygunluğunun belirlenmesi için yapılan doğrulama aktiviteleri kapsar. Bu kapsamda hijyen doğrulama özel bir öneme sahiptir (TSE 2006; ISO 2009b; BRC 2015). 2.4. Gıda İşletmelerinde Hijyen Uygulamalarının Doğrulanması İçin Kullanılan Metodlar Hijyen doğrulama; gıda işletmelerindeki kontrol sisteminin önceden planlanan sisteme uygun olarak gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini belirlemek için, numune alma ve analiz metodları da dahil olmak üzere izleme, ölçme, deney metodlarının 8 kullanılması olarak tanımlanmaktadır. Bu kapsamda doğrulama metotları kullanılarak hijyen uygulamalarının etkinliğinin belirlenmesi tüm gıda güvenliği standartlarının bir şartıdır (TSE 2006; ISO 2009b; BRC 2015). Doğrulanma aşamalarının gerekliliğine ve önemine ISO 22000 Gıda Güvenliği Yönetim Sistemi ve çeşitli organizasyonların (BRC-IFS) standartları gibi bir çok uluslararası standartta da yer verilmiştir (TSE 2006; IFS 2014; BRC 2015). Nitekim gıda güvenilirliğini sağlamaya yönelik hazırlanmış mevzuatların bir çoğu da gıda güvenliği yönetim sisteminin etkinliğini arttırmak ve sürekliliğini sağlamak için ön gereksinim programlarının ve doğrulama aşamasının da yer aldığı diğer programların gerçekleştirilmesini gerekli kılmaktadır (Güder 2006; TSE 2006; Karaman ve ark. 2011). Doğrulama metodlarında aranan özelliklerin başında doğruluk, duyarlılık, düşük tespit limiti ve hızlı sonuç alınabilmesi yer almaktadır (Noble ve Weisberg 2005; Chen ve Godwin 2006). Özellikle kanatlı ve kırmızı et gibi riski yüksek ama raf ömrü bir o kadar kısa olan ürünlerde riskli noktalardaki mikrobiyolojik yükün kısa süre içinde belirlenmesi, önlemlerin zamanında alınabilmesi açısından büyük önem taşımaktadır (Efe ve Gümüşsoy 2005). Bu amaçla endüstride çeşitli metodlar geliştirilmiş ve kullanılmaktadır. 2.4.1. Kültürel Metot Kültürel metot, swap çubukları ile alınan örneklerin klasik mikrobiyolojik yöntemlerle besiyerine ekilmesi ve mikroorganizma gelişiminin izlenmesi ve/veya sayılmasıdır. Kültürel metot ön zenginleştirme veya dilüsyon hazırlığı, mikrobiyolojik ekim ve sayım ve/veya ayırıcı tanı için uygulanan biyokimyasal testlerin yer aldığı uzun proseslerden oluşmaktadır (ISO 2004). Kusumaningrum ve ark. (2003) Hollanda’da paslanmaz çelik yüzeylerde gıda kaynaklı patojenleri ve bu patojenlerin çapraz kontaminasyon ile gıdalara transferini inceledikleri çalışmalarında 107 kob/100 cm2, 105 kob/100 cm2, 103 kob/100 cm2 olmak üzere 3 farklı kontaminasyon seviyesinde yapay olarak kirletilen yüzeylerden swap ile aldıkları örneklerin selektif besiyerlerine mikrobiyolojik ekimini yaparak Salmonella 9 enteritidis, S. aureus ve C. Jejuni’nin paslanmaz çelik yüzeylerde gelişimini incelemişlerdir. Dümen ve Çetin (2009) Türkiye’nin 5 farklı coğrafik bölgesinde bulunan unlu mamül işletmelerindeki temas yüzeylerinin mikrobiyolojik kirliliğini araştırdıkları çalışmalarında toplam 14.389 adet yüzey örneğini incelemişlerdir. Buna göre, toplam aerob mezofil bakteriyi 2380 örnekte (%16,5), toplam koliform grubu bakteriyi 1215 örnekte (%8,5), E. coli’yi 1585 örnekte (%11), S. aureus’u ise 2037 örnekte (%14) kabul edilemez olarak değerlendirmişlerdir. Moore ve Griffith (2002), paslanmaz çelik yüzeylerden klasik metot ile mikroorganizma tespitini etkileyen faktörleri inceledikleri çalışmada, ıslak ve kuru swaplarla yüzeylerdeki bakteri sayısını değerlendirmişler ve ıslak swaplarla yapılan çalışmanın daha güvenilir olduğunu tespit etmişlerdir. Kültürel metot doğru sonucu vermesine karşın zahmetli olması ve uzun zamanda sonuçlanması nedeniyle HACCP sisteminde rutin yüzey temizliğinin izlenmesinde pratik değildir. Bu durum araştırmacıları hızlı test tekniklerinin geliştirilmesi konusuna yönlendirmiştir (Moore ve ark. 2010; Aras 2011). 2.4.2. 3MTM PetrifilmTM Petrifilm üzerinde soğuk suda çözünebilen spesifik besiyeri bulunan ince plastik filmlerdir. Petri kaplarına kıyasla gerek ince oluşu, gerek inkubatörde daha az yer kaplaması gibi avantajları ile öne çıkmaktadır. İnkubasyonun ardından spesifik renkli koloniler filmin arka yüzünden çıplak gözle kolaylıkla sayılabilmektedir. Hepsi birarada olarak tanımlanan bu sistemde mikroorganizma türlerine göre koloni oluşumunu sağlayacak farklı petrifilmler kullanılmaktadır (Schmelder ve ark. 2000; Rosmini ve 2004; Silva ve ark. 2005; Nyachuba ve Donnelly 2007; Nero ve ark. 2008). Nyachuba ve Donnelly (2007) paslanmaz çelik, yapay reçine, briket ve tahta özellikte ve 100 cm2’lik 4 farklı yüzeyden aldıkları örneklerin L. monocytogenes identifikasyonu için 3MTM PetrifilmTM metodunu klasik metot ile karşılaştırdıkları çalışmalarında metodlar arasında önemli bir fark olmadığını tespit etmiş ve gıda işletmelerinde yüzey örneklerinden L. monocytogenes identifikasyonunda her iki metodun da kullanılabileceğini belirlemişlerdir. 10 Benesh ve ark. (2013) çalışmalarında paslanmaz çelik yüzeylerden aldıkları 20 adet örneği Listeria identifikasyonu için düşük ve yüksek kontaminasyon seviyelerinde değerlendirmişlerdir. Petrifilm metodunu Kanada’nın ulusal referans metoduyla karşılaştırdıkları bu çalışmada iki metot arasında anlamlı bir fark bulmadıklarını bildirmişlerdir. Bu metot da uygulama kolaylığı getirmekle beraber 35ºC’de 24-48 saat’lik uzun inkubasyon süresi gerektirmektedir. 2.4.3. Compact Dry Dehidre edilmiş agar ve supplementleri içeren küçük çukurlardan oluşan plastik yapılardır. Petrifilm ile benzerlik göstermekle birlikte daha ince, parlak ve ergonomik yapıdadır. İnkubasyon süresinin sonunda kromojenik substrat ve redoks indikatörünün varlığı ile farklı renklerde gelişen kolonilerin kolayca tayini prensibine dayanmaktadır (Beuchat ve ark. 1998). Ayçiçek ve ark. (2006) GATA’daki hastane mutfağındaki yüzeylerde toplam bakteri sayımı için Compact Dry-TC metodunu kullanmışlardır. Kültürel metot ile benzer sonuçlar göstermesi ve petride hazır agar şeklindeki pratik kullanımı düşünüldüğünde bir avantaj olarak görülmüş, ancak 35ºC’de 48 saat süren uzun inkubasyon süresinin bir dezavantaj olduğu kanısına varılmıştır. 2.4.4. Hazır Agarlı Plakalar Yüzey hijyeninin doğrulanmasında kullanılan yöntemlerden biri olan hazır agarlı plakalar zemin, duvar, gıdayla temas eden çalışma tezgahları, personel eli gibi özellikle düz yüzeylerin kontamine ve/veya enfekte olup olmadığının belirlenmesi, mikrobiyel yükünün ve uygulanan temizliğin etkinliğinin ölçülmesi gibi analizlerde kullanılmaktadır. Hazır agarlı plakalar, örneklemede kullanılacak olan konveks yüzünde agar olan petri kapları şeklindedir. Benzer amaçla kullanılan plastik agar çarkları ile işletmelerde kullanılan alet ve ekipmanların girintili çıkıntılı bölmelerinde de örnekleme yapabilirken, hazır agarlı plakalar metodunda örnekleme yalnızca düz yüzeylerde yapılabilmektedir (Kastango ve Faylor 2000). Hazır agarlı plakalardan dipslide yöntemi ise içerisinde hazır bulunan agarın örnekleme yapılacak yüzeye, personelin eline, personel çalışma kıyafetlerine direkt 11 teması ve inkubasyon süresinin ardından verdiği sonuç ile görüntülenmesi esasına dayanmaktadır (Taban ve Aytaç 2008; Arda ve Aydın 2011). Carroscosa ve ark. (2012) çalışmalarında İspanya’daki beş farklı peynir üretim yerinin dört farklı üretim hattındaki toplam aerob mezofil bakteri kontaminasyonunun seviyesini tespit etmek amacıyla contact plate, dipslide ve ATP biyolüminesans metotlarını karşılaştırmışlardır. Özelllikle contact plate ve dipslide metotları karşılaştırıldığında birçok yüzey örneğinde benzer ve anlamlı sonuçlar tespit etmişlerdir. Benzer olarak, Salo ve Laine (2000) Finlandiya’da yapay olarak kirletilen paslanmaz çelik yüzeylerde 3 farklı kontaminasyon seviyesi ve 3 farklı inkubasyon ısısı ve süresi boyunca dipslide, contact plate ve klasik metodu karşılaştırdıkları çalışmalarında 3 metodun da benzer sonuçlar verdiğini ve klasik swap ile örnekleme metodunun dipslide ve contact plate metodlarına göre daha az tekrarlanabilir ve tekrarüretilebilir olduğunu belirlemişlerdir. Kültürel metot ile benzer sonuçlar göstermesi, jel agar preperatı şeklindeki pratik kullanımı düşünüldüğünde bir avantaj olarak görülmüş ancak analizi yapılan bakteriye göre değişmekle beraber uzun inkübasyon süresi gerektirmesinin metot için bir dezavantaj olduğu kanısına varılmıştır. 2.4.5. Direkt Epifloresan Filtre Tekniği (DEFT) DEFT bir mikroskopik hücre sayımı yöntemidir. Deterjanlar ve proteolitik enzimler gibi ön-işlenmiş örnekler bir polikarbonat membran üzerinde filtre edilmekte ve mikroorganizmaların bu membran üzerinde toplanması sağlanmaktadır. Filtre yüzeyinin kontrolünde ışık aydınlatma (epifloresans) kullanılmaktadır. Bu tetkik mikroskobun bir görüntü analiz sistemine bağlanması ile otomatik hale getirilebilmektedir. Esas boyama ve sayma işlemi 0,5-1 saatten az sürmektedir ancak numune ön işlem aşamaları toplam algılama süresini uzatmaktadır. Tespit sınırı 104-105 hücre/ml olarak belirlenmiştir (Pettipher ve ark. 1992; Sierra ve ark. 1997; Rosmini ve ark. 2004). Holah ve ark. (1988) gıdalarla temas eden yüzeylerdeki bakteri yükünü tespit etmek amacıyla DEFT metodunu klasik canlı bakteri sayımı metoduyla karşılaştırmışlardır. Buna göre DEFT metodunun yüzeylerde nikroorganizma sayılarını 12 belirlemedeki hata oranının klasik canlı bakteri sayımı metoduna göre çok daha düşük olduğunu tespit etmişlerdir. Mikrobiyel hücrelerin varlığının belirlenmesinde çok hızlı bir yöntem olan DEFT metodunun, standart kültürel metot ile karşılaştırıldığında canlı ve ölü hücreleri beraber sayması gibi bir dezavantajı bulunmaktadır (Yücel ve Halkman 2006). 2.4.6. Enzimle Bağlı Immunosorbent Ölçüm Metodu (ELISA) ve Enzimle Bağlı Floresan Ölçüm Metodu (ELFA) Enzimle işaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyona girmesi ve oluşan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spesifik substrat varlığında ortaya konması, esasına dayanan ölçüm tekniğidir. Farklı adımlardan oluşan bu metot ile hedef antijeni bilinmeyen örneğin, antikorla bağlanması amaçlanmaktadır. Bağlanmayan antijenler yıkama basamağı ile uzaklaştırılmaktadır. İkinci adımda antikor ve hedef antijen çukurlara yerleştirilmektedir. Bu adımı enzimle barkodlanan ikinci antikorun eklenmesi takip etmektedir. İkinci antikor bir önceki antikorun bağlanmasını sağlamaktadır. İkinci antikorlardan bağlanmayanlar yine yıkama basamağında temizlenmektedir. Son adımda enzimle reaksiyona girerek belirleyici bir sinyal vermesi için substrat ilave edilmektedir. ELISA metodu ile 2-3 saat içerisinde antijen belirlenebilmektedir (Thacker ve ark. 1996; Lilja ve Hanninen 2001; Kumar ve ark. 2008; Szabo ve ark. 2008). Slade (1992) bir gıda üretim yerinde gıdayla temas eden yüzeylerde, zeminde, drenlerde ve konveyörlerde Listeria gelişimini incelemiş olduğu çalışmasında, izolasyon metodlarından FDA ve ELISA metodlarını karşılaştırmış ve sonuç olarak ELISA metodunun tüm Listeria pozitif örneklerin tespitinde uygun olmadığı ve metottan ancak kültürel metot ile birlikte kullanıldığı sürece faydalanılabileceği kanısına varmıştır. Duncanson ve ark. (2003) Birleşik Krallık’da satış yerlerinden alınan 24 adet yüzey ve 6 adet personel eli örneklerinden Salmonella spp. izolasyonu ve identifikasyonunda immunomanyetik ayırma ve enzim immunasssay (AIMS-EIA) metodunu kültürel swap metodu ile karşılaştırmışlardır. Çalışmanın sonuçlarına göre 24 adet yüzey örneğinden 14’ü klasik metot ile, 13’ü ise immunomanyetik ayırma ve enzim immunasssay (AIMS-EIA) metodu ile pozitif sonuç vermiştir. İmmunomanyetik 13 ayırma ve enzim immunasssay (AIMS-EIA) metodunun 24 saat olan analiz süresinin ön zenginleştirme basamaklarıyla 72-96 saate kadar varan kültürel metottan daha kısa olması avantaj olarak belirlenmiştir. Son yıllarda kullanılan birçok ELISA kiti yüksek standartta ve otomatik olması ile hız ve verimi arttırmakta, insan hatalarını da azaltmaktadır. ELISA metodunun prosedürü ile çalışabilen, L. monocytogenes, Salmonella, E. coli O157:H7, Staphylococcal enterotoxin, ve Campylobacter tespiti yapabilen ve daha hassas bir florasan immunassay ile otomatik çalışan ELFA (VIDAS) sisteminin ise; test kitine göre değişen 45 dk ile 2 saat arası bir inkübasyon süresi ile analiz yapabilmesi, fazla sayıda solvent gerektirmemesi ve uygulamasının basit olması gibi avantajları da bulunmaktadır (Fung 2002). 2.4.7. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR metodu DNA polimeraz zincirinin DNA iplikçiği kopyalamak prensibine dayalı 1980’li yıllarda tanımlanan bir metottur. Her döngüde çift zincirli DNA, tek DNA iplikleri üretmek için ısıtılarak denatüre edilmektedir. Daha sonra reaksiyon karışımı primerlerin tek ipliklilere bağlanabilmesi için soğutulmaktadır. Bu sırada ısıya dayanıklı, sentez yapabilen DNA polimerazı tekrar çift iplikçik oluşturabilmesini sağlamaktadır. Kopyalanan DNA konvansiyonel olarak agaroz jel elektroferez ile tespit edilmektedir (Mullis ve Faloona 1987; Harris ve Griffiths 1992; Hanna ve ark. 2005). PCR metodunun mikrobiyoloji alanında da kullanımı söz konusudur. Örneğin Bonaventura ve ark. (2008) L. monocytogenes’in paslanmaz çelik, cam, poliester yüzeylerde biyofilm oluşturabilme özelliğini tespit etmek amacıyla yapmış oldukları çalışmada PCR metodunu kullanmışlardır. Buna göre 37ºC’de cam ve paslanmaz çelik yüzeylerdeki biyofilm seviyesi poliester yüzeylere kıyasla daha yüksek çıkmış gıda endüstrisinde önemli bir risk olan L. monocytogenes’in biyofilm oluşturabilme özelliğinin sıcaklık artışıyla doğru orantılı olduğu PCR metodu kullanılarak saptanmıştır. Kültürel metot ile kıyaslandığında, nükleik asit bazlı yöntemlerin en önemli avantajları kısa sürede sonuç alınabilmesi, hijyen kontrollerinde kontaminasyon kaynağını gösterebilmesi, canlı hücre gereksinimi olmaması, hasar görmüş hücrelerin de tespit edilebilmesi ve spesifik bir teknoloji ile çalışmalarından dolayı doğruluk 14 oranlarının yüksek olmasıdır. Bunun yanında bu tekniklerin bazı dezavantajları ise canlı mikroorganizmaların ölülerden ayırt edilememesi, genetik metotların yalnızca hedef patojen tespiti yapabilmesi, epidemiyolojik veya rutin çevre kontaminasyonlarında bakteri identifikasyonu için uygun olmadığı ve PCR metoduyla pozitif bulunan bir örneğin bir sonraki analizin reaksiyon sistemini kontamine ederek metodun yanlış pozitif sonuç vermesine neden olabilmesi olarak belirtilmektedir (Fung 2002). 2.4.8. Gerçek Zamanlı Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR, QPCR) Gerçek zamanlı kantitatif PCR nükleik asitlerin miktarlarının belirlenmesinde günümüzde kullanılan bir metottur. Bu teknoloji “kinetik PCR” ve “homogenous PCR” isimleriyle de tarif edilmektedir. “Real-time PCR”da oluşan ve miktarı reaksiyon boyunca kopyalanan DNA miktarıyla orantılı olarak artan, floresan boya ve probların verdiği sinyalin izlenmesiyle anlaşılır ve amplifikasyonun devir sayısı belirli miktardaki DNA moleküllerinin elde edilmesi için gereklidir. Real-time PCR metodunun kullanım alanı; patojen saptanması, gen analizi, kromozomlardaki sayısal-yapısal bozuklukların analizi, kantitatif mRNA analizi, genomik veya viral DNA’ların DNA kopya sayısı ölçümlerini, allellerin ayırımını veya SNP genotiplemelerini, ilaç tedavisinde etkinliği, DNA hasar ölçümleri ve son zamanlarda real-time immüno PCR ile protein belirlemesi olarak sıralanmaktadır (Fung 2002). Mafu ve ark. (2009) gıda ile temas eden yüzeylerden E. coli O157:H7, L. monocytogenes ve S. enterica patojenlerinin identifikasyonu için real-time PCR metodunu standart metot ile karşılaştırdıkları çalışmada yüzeyleri 10 dk ve 16 sa olmak üzere 2 ayrı süre boyunca kontamine etmişlerdir. Buna göre yüzey kısa süre kontamine edildikten sonra her iki metot sonuçları birbiriyle benzerlik gösterirken, uzun süre kontamine edildikten sonra yapılan analizlerde düşük kontaminasyon seviyeleri realtime PCR metodu ile belirlenebilmiş ancak klasik metot ile mümkün olmamıştır. Gen ekspresyonunda daha hassas, verimli, hızlı ve daha üretken olan real-time PCR, bugün birçok bilimsel araştırmada kullanılmaktadır. Guilbaud ve ark. (2005) gerçek zamanlı PCR’ın, bir örnekteki hedef genin kopya sayısının ölçümünde kullanılabileceğini ve konvansiyonel PCR’la kıyaslandığında daha hassas bir metot olduğunu belirtmişlerdir. Ancak, oldukça donanımlı bir laboratuvar alt yapısı ve analizlerin gerçekleştirilmesi, sonuçların doğru yorumlanabilmesi için tecrübeli 15 personel gerektirmektedir. Aksi halde özellikle gıda endüstrisinde uygulanan kontaminant aranması analizlerinde yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar verebilmektedir (Settanni ve Corsetti 2007; Fach ve ark. 2009; Günel ve Aydınlı 2009; Kawasaki ve ark. 2009). 2.4.9. ATP Biyolüminesans ATP biyolüminesans hijyen görüntüleme metodu gıda işletmelerinde üretimin ve rutin hijyen kontrollerinin yapılacağı yüzeylerde mikrobiyel kontaminasyonun varlığını tespit etmek amacıyla kullanılan bir metottur. Bu metot ile örneklemenin yapıldığı yüzeylerde mikroorganizmalara ait ATP’nin varlığı tespit edilerek kontaminasyon olup olmadığı belirlenmektedir (Griffith 1993; Hawronskyj ve Holah 1997; Salo ve Laine 2000; Jasson ve ark. 2010). 2.4.9.1. ATP Biyoluminesans Metodunun Prensibi ATP biyolüminesans hijyen görüntüleme metodunda bütün canlı organizmaların ATP içermesi ve tüm mikroorganizmalarda hücre içi ATP konsantrasyonunun belirli bir değer aralığında bulunması ilkelerine dayanılarak mikrobiyel biomas ölçülmektedir. Metot mikroorganizma hücrelerinde bulunan ATP’nin lusiferin-lusiferaz enzimi ile reaksiyona girmesi sonucu biyoluminesans ışık vermesi ve açığa çıkan bu biyoluminesansın bir lüminometre ile ölçülmesi esasına dayanmakta olup ölçüm birimi RLU (Relatif Işık Ünitesi) olarak ifade edilmektedir (Stanley 1992; Griffith ve ark. 1994). 2.4.9.2. Biyoluminesans Reaksiyonu ATP’nin lusiferin-lusiferaz enzimi ile reaksiyona girmesi sonucu ateş böcekleri (phontinus pylaris) tarafından ışık enerjisi üretilmektedir. Bu ışık verme reaksiyonuna biyolüminesans denilmektedir. Biyoluminesans reaksiyonunun biyokimyası ilk 1940’lı yılların sonlarına doğru, lusiferin-lusiferaz reaksiyonu ise ilk 1949 yılında tanımlanmıştır. Bu reaksiyon ATP (Adenozin Trifosfat)’ye özel bir reaksiyondur ve bu reaksiyonun gerçekleşebilmesi için enzim-substrat sistemine, oksijene ve bazı kofaktörlere gereksinim vardır. Örneğin ateş böceklerinde ATP’ye bağımlı biyolüminesans olayı aşağıdaki gibi gerçekleşmektedir (McElroy 1947; McElroy ve Strehler 1949). 16 Lusiferaz + Lusiferin + ATP ---- Mg2 ---- → Lusiferaz – lusiferin – AMP + PP Lusiferaz – lusiferin – AMP + O2 → Oksilusiferin + CO2 + AMP + Işık Birinci reaksiyonda substrat olan lusiferin normalde ateş böceklerinin kuyruk kısımlarında bulunmaktadır. Bu reaksiyon sonucunda lusiferaz-lusiferin-adenozin monofosfat (AMP) okside olarak oksilusiferine dönüşmektedir ve AMP ve CO2 açığa çıkmaktadır. Bunun sonucu olarak biyolüminesans reaksiyonu görülmektedir (Griffith 1993; Hawronskyj ve Holah 1997). Bu reaksiyonda açığa çıkan ışık spektrumu içindeki 560 nm dalga boyundaki ışık maksimum düzeydedir. Reaksiyon için optimum sıcaklık 20-22ºC, optimum pH ise 7,75 arasındadır. Ortamda çinko, kalsiyum, klor, iyot gibi iyonların bulunması ışığı azaltmaktadır. Reaksiyon sonucu lusiferaz enzimi inaktive olur ve tekrar yeni bir reaksiyonu katalizleyebilmesi için ko-enzim A ve pirofosfat ile rejenere edilmesi gerekmektedir (Stanley 1992; Griffith ve ark. 1994). Sonuç olarak her lusiferin-lusiferaz reaksiyonu sonunda açığa çıkan ışık tek bir fotondur. Bu nedenle de üretilen toplam ışık şiddeti lusiferin-lusiferaz ikilisi tepkimede kısıtlayıcı bir faktör oluşturmadığı sürece ortamdaki ATP miktarıyla doğru orantılıdır. Ortamdaki ATP miktarına bağlı olarak açığa çıkan ışık luminometrede ölçülebilmektedir (Griffith 1993; Griffith ve ark. 1994; Hawronskyj ve Holah 1997). Biyoluminesans doğada ateş böcekleri dışında deniz bakterilerinde, bazı deniz canlıları ve tuzlu su balıklarında yaygın olarak görülmektedir. Son yıllarda luminus bakterilerinin veya lux geni taşıyan rekombinant mikroorganizmaların kullanıldığı yöntemler de geliştirilmiştir (Ahmad ve Stewart 1991). 2.4.9.3. ATP Biyolüminesans Metodunun Gıda Mikrobiyolojisindeki Uygulamaları ATP Biyoluminesans yöntemi üzerinde ilk çalışmalar bir Hollanda firması tarafından yapılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda içme ve kullanma suları, meyve suları, bira gibi sıvı içeceklerde ve fabrikalarda hijyen ve sanitasyon uygulamalarının kontrolü için özel hazırlanmış kitler piyasaya sürülmüş ve dünyanın pek çok yerinde kullanıma girmiştir (Ünlütürk ve Turantaş 1999). Günümüzde ise ATP biyolüminesans metodu özellikle taşınabilir el tipi bir cihaz olması sayesinde gıda endüstrisinde gerek gıdalarda, gerek yüzeylerde kontaminasyonun ölçülmesinde geniş bir kullanım alanına ulaşmıştır. Pratik kullanımı 17 ile, işletmedeki yetersiz hijyen ve sanitasyon uygulamaları kısa sürede saptanmakta ve bu alanların kullanılmadan önce tekrar temizlenmesi veya dezenfekte edilmesi mümkün olabilmektedir. Bu metot işletmelere kazandırmış olduğu işgücü ve zaman avantajı sayesinde, geniş bir kullanım sahası bulmuştur (Siragusa ve ark. 1995; Chen ve Godwin 2006; Chollet ve ark. 2008). Birçok ülkede farklı gıda üretim işletmelerinde ATP biyolüminesans metodunun kullanım olanaklarının incelenmesi ve hijyen doğrulamadaki etkinliğinin tespiti için çok sayıda çalışma yapılmıştır (Davidson ve ark. 1999; Moore ve Griffith 2002; Larson ve ark. 2003; Valat ve ark. 2003; Ayçiçek ve ark. 2006; Chen ve Godwin 2006; Costa ve ark. 2006; Sala ve ark. 2008; Boyce ve ark. 2009; Moore ve ark. 2010; Lehto ve ark. 2011; Carroscosa ve ark. 2012). Lehto ve ark. (2011) Finlandiya’da taze doğranmış sebze üretim tesisinde gerçekleştirdikleri çalışmalarında ATP biyolüminesans metodunu kullanmışlar ve çalışmalarında gıdayla temas yüzeylerinde hijyenik seviyeyi araştırmışlardır. Elde ettikleri sonuçlara göre ATP biyolüminesans metodunun düşük kontaminasyon seviylerinde de ölçüm yapabildiğini ve hassas bir metot olduğunu bildirmişlerdir. Ayçiçek ve ark. (2006) GATA’daki hastane mutfağında doğal kontamine yüzeylerde yapmış oldukları çalışmada hem klasik metot hem de ATP metodu ile hijyenik seviyeyi incelemiş ve iki metodu karşılaştırmıştır. Buna göre aradaki farkın kabuledilebilir limitlerde ve kullanımının uygun olduğunu ifade etmişlerdir. 2.5. Kanatlı Endüstrisi 2.5.1. Kanatlı Kesimhanelerinde Hijyen Uygulamaları Tavuk eti ve ürünleri tüketiminin gün geçtikçe artan miktarlara ulaştığı bilinen bir gerçektir. Beslenmede önemli bir yer tutan tavuk eti, hayvansal gıdalar arasında uygun bileşimi, yüksek protein değeri ve özellikle kırmızı ete kıyasla daha uygun fiyatlarda olması nedeniyle tercih edilmektedir. Ancak kanatlı eti olumsuz çevre koşulları ve yetersiz soğutma durumunda mikroorganizmaların gelişimi açısından önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Bu durum, tavuk işletmelerinde temizlik ve dezenfeksiyon işlemlerinin önemini daha da arttırmaktadır. Bütün bu nedenlerden dolayı tavuk işletmelerinde işletmeye özgü, etkin temizlik ve dezenfeksiyon 18 maddelerinin seçimi ve kullanımı hem toplum sağlığı hem de ekonomik yönden önemlidir (Şener ve Temiz 2004). Modern ve ileri teknoloji uygulayan ve hijyenik üretim sağlayan tavuk kesimhane ve işletmelerinde mikrobiyel kontaminasyonu önlemek ya da en aza indirmek amacıyla temizlik ve dezenfeksiyon işlemlerinin belli program dahilinde ve etkin bir şekilde uygulanması gerekmektedir. Hijyen uygulamaları ön temizlik ve dezenfeksiyon prosesleri içermelidir. Kanatlı işletmelerinde ön temizlik amaca uygun olarak, genellikle 50-70°C’de su ve deterjan kullanılarak gerçekleştirilmektedir. Kullanılacak olan deterjan veya deterjan karışımlarının seçimi, işletmedeki kirlenme tipleri ve bunların nitelikleri, uygulama tekniği, temizlenecek materyalin niteliği ve yüzey özelliğine göre yapılmalıdır. Tavuk işletmelerinde en yaygın olarak protein ve yağ kirlenmelerine rastlanmaktadır. Bu amaçla kullanılan temizlik maddeleri arasında alkali bileşikler, asit bileşikler, yüzey aktif bileşikler, kalsiyum bağlayıcı bileşikler, korozyon inhibitörü maddeler, süspansiyon halini devam ettiriciler, köpük önleyiciler ve enzimler ile köpük temizleyiciler ve jeller yer almaktadır (Hayes 1992). Dezenfeksiyon işlemi ile ön temizlik aşamasından sonra, ortamdaki ürüne kontaminasyon kaynağı olabilecek mikroorganizmaların öldürülmesi ya da zararlı etki yapmayacak en düşük düzeye indirilmesi hedeflenmektedir (Gray ve Killinger 1966). Gıda işletmelerinde dezenfeksiyon, genel olarak yüksek sıcaklık, radyasyon uygulaması ve yüksek konsantrasyonlarda mikrobisit, düşük konsantrasyonlarda ise mikrobiyostatik etkiye sahip dezenfektan kullanımı şeklinde gerçekleştirilmektedir. Halojenler (klor ve klorlu bileşikler, iyotlu bileşikler) gıda işletmelerinde en sık kullanılan dezenfektandır. Tavuk işletmelerinde de mikrobiyel dekontaminasyon amacıyla fiziksel ve kimyasal bir takım işlemler uygulanmaktadır. Fiziksel işlemler arasında sıcaklık uygulamaları, ışınlama, UV, yüksek voltajlı elektriksel uygulamalar, yüksek basınç, ultrasonik vibrasyon ve negatif hava akımı sayılabilir. Kimyasal işlemler ise çeşitli kimyasallar, antibiyotikler, mikrobiyositler ve biyoaktif pestisitlerin kullanımı şeklinde gerçekleştirilmektedir (Yang ve ark. 1998). 2.5.2. Kanatlı Kesimhanelerinde Hijyen Doğrulama İhtiyacı Gıda işletmelerinde üretim prosesi içerisinde uygulanan temizlik ve sanitasyonun gıda üretim hattı boyunca patojen gelişimini inhibe edebilecek konsantrasyon seviyelerinde olması ve işletmenin rutin temizlik uygulamalarının 19 doğrulanması gerekmektedir. Bunun için uluslararası standartlarda üretim yapmayı hedefleyen kanatlı işletmelerinin yüzey temizliğinin kontrolünde yaygın kullanım alanına sahip hızlı metotları bir program dahilinde uygulaması gerekmektedir (Sala ve ark. 2008). Bu kapsamda kullanılan çok sayıdaki metottan biri de ATP biyolüminesans metodudur. Nitekim, Sala ve ark. (2008) Romanya’da bir kanatlı kesimhanesinde üretim prosesinde yüzeylerin kontaminasyonun ölçümünde hızlı, pratik ve kullanımı kolay olan ATP biyolüminesans metodunun etkinliğini inceledikleri çalışmalarında hedef mikrorganizma tespiti hariç işletmenin rutin temizliğinin doğrulanmasında metodun kullanılabileceğini belirlemişlerdir. izlenmesinde ve 20 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. GEREÇ 3.1.1. Model Yüzeyler Kanatlı işletmelerinde kullanılan yüzey materyallerini temsil edecek nitelikte 30 cm x 40 cm boyutlarında paslanmaz çelik yüzeyler yapay olarak kirletilmek suretiyle kullanılmıştır. 3.1.2. Referans Kültürler Gıda üretim yüzeylerinden izole edilen yaygın mikroorganizmaları temsil edecek, sertifikalı kültürler kullanılmıştır. Bunlar sertifikalı lyofilize E. coli ATCC 25922 (Oxoid, R4607050/CL7050), S.enterica subsp.enter.serovar typhi. ATCC 14028 (Oxoid, R4606000/CL6000), S. aureus subsp. aureus ATCC 11632 (MBL, 0462P), Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 (Oxoid, R4608201/CL8201) olup bu kültürlerden çalışma sırasında üretici talimatına göre hazırlanan stok kültürler kullanılmıştır. 3.1.3. Kullanılan Cihazlar ATP Biyoluminesans cihazı (Hygiena, UK, ABD) Benmari (Memmert, Almanya ) Buzdolabı (Bosch, Almanya) Distile su cihazı (Nüve, Türkiye) Hassas terazi (Sartorius, Almanya) İnkubatör (Memmert, Almanya) McFarland cihazı (Biosan, Letonya) Mikropipet, 10-100 µL ,100-1000 µL (Eppendorf, Almanya) Otoklav (Hirayama, Japonya) pH metre (Hanna Instruments, ABD) Vorteks-Tüp Karıştırıcı (Velp Scientifica, İtalya) 21 3.1.4. Analizlerde Kullanılan Besiyeri ve Çözeltiler Baird Parker Agar (BPA, Oxoid, CM0275) Brain Hearth Infusion Broth (BHIB, Oxoid, CM1135) Chloramphenicol Supplement (Oxoid, SR0078E) Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC, Oxoid, CM0727B) Egg Yolk Tellurite Emulsiyon (Oxoid, SR0047C) Plate Count Agar (PCA, Oxoid, CM0325) Tryptone Bile X-glukuronide Medium (TBX, Oxoid, CM0945B) Xyloselysine Deoxycholate Agar (XLD, Oxoid, CM0469B) Fizyolojik tuzlu su (FTS), (0.009’luk NaCl çözeltisi) 3.2. YÖNTEM: Çalışmalar İ.Ü. Veteriner Fakültesi Besin Hijyeni ve Teknolojisi AbD laboratuvarlarında yapılmıştır. 3.2.1. Model Çalışma Yüzeylerinin Dezenfeksiyonu Model yüzeylerin temizlik ve dezenfeksiyon işlemlerinde ticari kanatlı işletmelerinde kullanılan bir temizlik ve dezenfeksiyon prosedürü izlenmiştir. Bunun için ilk ön yıkama aşamasında temizlik ve sanitasyon için optimum dezenfektan ve sanitizer formülasyonu olan Antec DSC 1000 (Refarm İstanbul) 1/250-1/500 oranında sulandırılarak spreyleme ile uygulanmış ve 2-3 dk sonra bol su ile durulanmıştır. Daha sonra dezenfeksiyon amacıyla Antec Ambicide (Refarm İstanbul) kullanma talimatında belirtilen değerlere göre 1/200 oranında sulandırılmış, hazırlanan solüsyon hesaplanan çalışma yüzey alanının tamamına uygulanacak şekilde 300 ml/m2 oranında spreylenmiştir. Köpükleme için de yine kullanma talimatında belirtilen değerlere göre 1/50 oranında hazırlanan solüsyon yine hesaplanan tüm yüzey alanına göre 150 ml/m2 oranında uygulanmış ve 2-3 dk sonra bol su ile durulanmıştır. Kanatlı işletmelerinden farklı olarak son aşamada tüm yüzeye alkol dökülüp alevlendirilerek flambaj uygulaması yapılmıştır. 22 3.2.2. Temiz Yüzeylerin Mikroorganizma Yükünün Kontrolü Uygulanan dezenfeksiyonun ardından yüzeyin temizliğinin kontrolü için steril bir swap ile tüm yüzeyden örnek alınmış, PCA agara yayma ekim yapılmış ve 37°C’de 24 saat inkubasyona bırakılmıştır (FDA, 2001a). 3.2.3. Kontaminasyon İçin Kullanılacak Kültürlerin Hazırlanması Her bir mikroorganizmaya ait lyofilize kültürden içerisinde 5 ml BHIB (Brain Hearth Infusion Broth) bulunan tüpe inökülasyon yapılmış ve 35°C’de 4-6 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkubasyon sonrası bulanıklık oluşan tüplerden PCA içeren yatık agarlı tüplere tek koloni düşürecek şekilde çizgi ekim yapılarak 35°C’de 18 saat inkubasyona bırakılmıştır. Bu tüpler daha sonra 4°C’de saklanarak çalışma kültürü olarak kullanılmıştır. 3.2.4. Yüzeylerin Kontaminasyonunda Kullanılacak Kültürleri İçeren Çözeltinin Hazırlanması ve Mikroorganizma Yükünün Belirlenmesi Çalışma kültürlerinden alınan tek bir koloni öze aracılığı ile 5 ml BHIB içeren tüplere aktarılıp 18 saat boyunca 35°C’de inkube edilmiştir. Stok içerisindeki tahmini mikroorganizma sayısının belirlenmesi için McFarland cihazı (Biosan, 050102-11080341) kullanılarak ölçüm yapılmış ve elde edilen tahmini sayı doğrultusunda içerisinde 9 ml FTS bulunan tüplere 1/10’luk seri seyreltimler yapılarak yüzeylerin kirletileceği konsantrasyonlardaki dilüsyonlar hazırlanmıştır. Stok kültür solüsyonundaki kesin mikroorganizma sayılarının belirlenmesi için kirletme işlemine parelel olarak mikroorganizma çözeltisinden seri seyreltimler ve PCA agara ekim yapılmış ve 35°C’de 24-48 saat inkubasyon sonrası sayımlar gerçekleştirilmiştir. Bu işlem her bir mikroorganizma kültürü için ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir. 3.2.5. Yüzeylerin Kirletilmesi Yüzeylerde yanyana belirlenmiş olan 100 cm2 lik 2 parelel yüzey parçasının herbirine yüksek (105-106 kob/cm2), orta (102-104 kob/cm2) ve düşük (101-102 kob/cm2) seviyede mikroorganizma içerecek şekilde ilgili bakteri konsantrasyonunu içeren tüplerden 0,1 ml damlatılmış, her kirletmeden önce alkole batırıldıktan sonra ateşten geçirilip soğutulan çelik spatula ile yayılarak tüm kareye dağılması sağlanmıştır. 23 3.2.6. ATP Ölçümleri Çalışmamızda ATP Biyoluminesans Hygiena (SystemSURE Plus, INS0047) cihazı kullanma kılavuzuna uygun olarak kullanılmıştır. Buna göre cihazın özel swapları kullanılarak 100 cm2 lik yüzeylerin bir parelelinden alınan numune cihazın swap bölmesine yerleştirilip, kapağı kapatıldıktan sonra okuma başlatılmış ve ölçümün gerçekleştiği 15 saniyelik sürenin sonunda ekranda okunan RLU değeri kaydedilmiştir. 3.2.7. Klasik Swap Yöntemi İçin Örneklerin Alınması Kirletilmiş parelel yüzeylerin ikincisinden steril swap kullanılarak alınan örnek 10 ml'lik FTS içeren tüp içerisine bırakılmış ve madde 3.2.8.’e göre seri seyreltim ve ekimler gerçekleştirilmiştir. 3.2.8. Swap Örneklerinin Mikrobiyolojik Ekimleri 3.2.8.1. Seri Seyreltimlerin Yapılması Kirletilmiş ikinci parelel yüzeyden steril swap kullanılarak alınan örnek 10 ml'lik FTS içeren tüp içerisine bırakılmış ve vorteks yardımıyla swaptaki örneğin dilusyon sıvısına homojen bir şekilde yayılması sağlanmıştır. Her tüpten otomatik pipet ile 1’er ml alınmış, 9 ml’lik FTS’lere seri seyreltimler yapılmış ve bu dilusyon tüplerinden 2’şer paralel olmak üzere spesifik agara ekimler gerçekleştirilmiştir (FDA 2003; ISO 2004). 3.2.8.2. E. coli Sayımı E. coli sayımı amacıyla TBX agar (Oxoid, CM0945B)’da yayma plak yöntemi kullanılmıştır. Madde 3.2.8.1.’e göre hazırlanan seyreltimlerden aseptik şartlarda alınan 0,1 ml seyreltim sıvısı besiyeri içeren petrilere iki parelel olarak inöküle edilmiştir ve steril drigalski çubuğu ile seyreltim sıvısının besiyeri yüzeyine iyice dağılması sağlanmıştır. Petriler ters çevrilerek 44ºC’de 24-48 saat inkübe edildikten sonra üreyen mavi-yeşil renkli tipik koloniler sayılmıştır (ISO 2001; ISO 2004). 3.2.8.3. Salmonella Sayımı Salmonella sayımı amacıyla XLD agar (Oxoid, CM0469B)’da yayma plak yöntemi kullanılmıştır. Madde 3.2.8.1.’e göre hazırlanan seyreltimlerden aseptik 24 şartlarda alınan 0,1 ml seyreltim sıvısı besiyeri içeren petrilere iki parelel olarak inöküle edilmiş ve steril drigalski çubuğu ile seyreltim sıvısının besiyeri yüzeyine iyice dağılması sağlanmıştır. Petriler ters çevrilerek 35ºC’de 24 saat inkübe edildikten sonra üreyen merkezi siyah, etrafı pembe renkli yuvarlak koloniler sayılmıştır (ISO 2004; FDA 2007). 3.2.8.4. S. aureus Sayımı S. aureus sayımı amacıyla yumurta sarısı ve potasyum tellürit ilave edilmiş BPA agar (Oxoid, CM0275)’da yayma plak yöntemi kullanılmıştır. Madde 3.2.8.1.’e göre hazırlanan seyreltimlerden aseptik şartlarda alınan 0,1 ml seyreltim sıvısı besiyeri içeren petrilere iki parelel olarak inöküle edilmiş ve steril drigalski çubuğu ile seyreltim sıvısının besiyeri yüzeyine iyice dağılması sağlanmıştır. Petriler ters çevrilerek 35ºC’de 48 saat inkübe edildikten sonra çapı yaklaşık olarak 3 mm olan siyah-gri renkli ve etrafında şeffaf zonlar bulunan parlak koloniler S. aureus olarak değerlendirilmiştir (FDA 2001b; ISO 2004). 3.2.8.5. S. cerevisiae Sayımı S. cerevisiae sayımı amacıyla DRBC agar (Oxoid, CM0727B)’da yayma plak yöntemi kullanılmıştır. Madde 3.2.8.1.’e göre hazırlanan seyreltimlerden aseptik şartlarda alınan 0,1 ml seyreltim sıvısı besiyeri içeren petrilere iki parelel olarak inöküle edilmiş ve steril drigalski çubuğu ile seyreltim sıvısının besiyeri yüzeyine iyice dağılması sağlanmıştır. Petriler ters çevrilerek 25ºC’de 5-7 gün inkübe edildikten sonra beyaz renkli, parlak ve yuvarlak tipik koloniler sayılmıştır (FDA 2001c; ISO 2004). 3.2.8.6. Toplam Aerobik Bakteri Sayımı Steril petri kutularına her bir dilüsyondan 1’er ml alınıp, üzerine 45˚C’ye kadar soğutulmuş olan PCA agar (Oxoid, CM0325) dökülmüştür. Dökme plak ekim tekniği ile hazırlanan petriler 35˚C’de 48 saat inkübe edildikten sonra üreyen tüm koloniler sayılmıştır (FDA 2001a; ISO 2004). Tüm çalışmalar her bir mikroorganizma türü için 3’er kez tekrar edilmiştir. 25 3.2.9. Kanatlı Kesimhanesinden Alınan Örneklerin Analizi Kontamine edilmiş yüzeylerin yanısıra doğal kontaminasyonun izlenmesi için bir kanatlı kesimhanesinden de canlı tavuğun girişinden paketleme aşamasına kadar olan üretim hattından seçilen 6 farklı noktadan iki paralel numune alınmıştır. Numune alma noktaları şu şekildedir; parçalama masası, personel eli, göğüs fleto bandı, transfer bandı I, kesme tahtası, transfer bandı II. Bunun için örneklenen yüzeylere de asetat kağıdı ile 100 cm2 lik 4’er kare belirlenmiştir. Bu karelerin iki tanesinden ATP swabı ile alınan numunenin ATP ölçümleri yapılırken hemen yanında belirlenmiş olan iki kareden swap çubukları ile alınan numune transport besiyerinde muhafaza edilerek soğuk zincirde laboratuvara ulaştırılmıştır. Laboratuvara ulaştırılan swap numunelerinin en kısa sürede madde 3.2.8.’e göre mikrobiyolojik ekimleri yapılmıştır. 3.2.10. İstatistiksel Analizler Araştırma kapsamında klasik yöntemle sayılan log10 kob ve RLU değerleri arasındaki ilişkiler Spearman Corelasyon yöntemi ile, kanatlı işletmesinden elde edilen sonuçlar arasındaki ilişkiler ise Pearson metoduna göre hesaplanmıştır. Korelasyon analizleri SPSS 13.0 programı kullanılarak yapılmıştır. Tüm veri seti için log kob’u veren regresyon denklemini geliştirmek amacıyla Minitap programında linear regresyon prosedürü izlenmiştir. 3.2.11. RLU Değerlerinin Yorumlanması Cihaz üreticisinin (SystemSURE Plus, INS0047) kullanım rehberine göre gıda ile direkt temas eden paslanmaz çelik yüzeyler için <10 RLU çıkan değerler temiz, 1129 arasında çıkan değerler şüpheli, >30 RLU çıkan değerler ise kirli olarak belirtilmektedir (Whitehead ve ark. 2008). Çalışmamızda RLU değerlerinin yorumlanması bu sınıflama dikkate alınarak yapılmıştır. 26 4. BULGULAR 4.1. Temiz Yüzeylerin Mikroorganizma Yükünün Kontrolü Çalışmada paslanmaz çelik yüzeylere uygulanan dezenfeksiyonun ardından yüzeyin temizliğinin kontrolü için steril bir swap ile yüzeylerden alınan örneklerin PCA agara sürme plak yöntemiyle ekimleri yapılmış ve 37ºC’de 24 sa. inkubasyona bırakılmıştır. Yapılan incelemeler sonunda yüzeylerde herhangi bir üreme gözlenmemiştir. 4.2. Model Çalışma Yüzeylerinde Salmonella Bulguları Çalışmada yüzeylerin Salmonella koloni sayıları, her bir kontaminasyon seviyesinde ortalama olarak yüksek, orta ve düşük seviyeler için sırasıyla log10 tabanında 6,11 kob/cm2, 4,53 kob/cm2, 2,29 kob/cm2 olarak tespit edilmiştir. Bu yüzeyler için ATP cihazı ile yapılan ölçüm sonuçları ise ortalama olarak sırasıyla 189, 31 ve 0 RLU olarak tespit edilmiştir (Tablo 4-2). Tablo 4-2: Model Çalışma Yüzeylerinde Salmonella bulguları Log10 kob/cm2 Kontaminasyon seviyesi Yüksek Orta Düşük Tekrar no 1 2 3 ortalama 1 2 3 ortalama 1 2 3 ortalama Swap metoduna göre Log10 kob/cm² 6.16 6.12 6.05 6.11 4.80 4.44 4.36 4.53 3.40 1.81 1.65 2.29 ATP metoduna göre RLU 119 119 328 189 3 88 1 31 0 0 0 0 ATP metoduna göre Temiz/Kirli Kirli Kirli Kirli Kirli Temiz Kirli Temiz Kirli Temiz Temiz Temiz Temiz 27 4.3. Model Çalışma Yüzeylerinde E. coli Bulguları Çalışmada yüzeylerin E. coli koloni sayıları, her bir kontaminasyon seviyesinde ortalama olarak yüksek, orta ve düşük seviyeler için sırasıyla log10 tabanında 5,57 kob/cm2, 3,25 kob/cm2, 1,51 kob/cm2 olarak tespit edilmiştir. Bu yüzeyler için ATP cihazı ile yapılan ölçüm sonuçları ise ortalama olarak sırasıyla 265, 8, ve 1 RLU olarak tespit edilmiştir (Tablo 4-3). Tablo 4-3: Model Çalışma Yüzeylerinde E. coli bulguları Log10 kob/cm2 Kontaminasyon seviyesi Yüksek Orta Tekrar no Swap metoduna göre Log10 kob/cm² ATP metoduna göre RLU ATP metoduna göre Temiz/Kirli 1 6.54 788 Kirli 2 5.05 3 Temiz 3 5.13 3 Temiz ortalama 5.57 265 Kirli 1 3.26 18 Şüpheli 2 3.4 7 Temiz 3 3.1 0 Temiz ortalama 3.25 8 Temiz 1 2.35 0 Temiz 2 1.18 0 Temiz 3 1.0 2 Temiz ortalama 1.51 1 Temiz Düşük 28 4.4. Model Çalışma Yüzeylerinde S. aureus Bulguları Çalışmada yüzeylerin S. aureus koloni sayıları, her bir kontaminasyon seviyesinde ortalama olarak yüksek, orta ve düşük seviyeler için sırasıyla log10 tabanında 5,55 kob/cm2, 4,46 kob/cm2, 2,95 kob/cm2 olarak tespit edilmiştir. Bu yüzeyler için ATP cihazı ile yapılan ölçüm sonuçları ise ortalama olarak sırasıyla 136, 19 ve 1,6 RLU tespit edilmiştir (Tablo 4-4). Tablo 4-4: Model Çalışma Yüzeylerinde S. aureus bulguları Log10 kob/cm2 Kontaminasyon seviyesi Tekrar no Swap metoduna göre Log10 kob/cm² ATP metoduna göre RLU ATP metoduna göre Temiz/Kirli 1 6.09 34 Kirli 2 5.93 26 Şüpheli 3 4.65 349 Kirli ortalama 5.55 136 Kirli 1 4.6 17 Şüpheli 2 4.45 37 Kirli 3 4.34 4 Temiz ortalama 4.46 19 Şüpheli 1 3.53 0 Temiz 2 2.74 0 Temiz 3 2.57 5 Temiz ortalama 2.95 1.6 Temiz Yüksek Orta Düşük 29 4.5. Model Çalışma Yüzeylerinde S. cerevisiae Bulguları Çalışmada yüzeylerin S. cerevisiae koloni sayıları, her bir kontaminasyon seviyesinde ortalama olarak yüksek, orta ve düşük seviyeler için sırasıyla log10 tabanında 6,14 kob/cm2, 2,76 kob/cm2, 1,32 kob/cm2 olarak tespit edilmiştir. Bu yüzeyler için ATP cihazı ile yapılan ölçüm sonuçları ise ortalama olarak sırasıyla 135, 0 ve 3 RLU tespit edilmiştir (Tablo 4-5). Tablo 4-5: Model Çalışma Yüzeylerinde S. cerevisiae bulguları Log10 kob/cm2 Kontaminasyon seviyesi Yüksek Orta Düşük Swap ATP ATP metoduna göre metoduna göre metoduna göre Log10 kob/cm² RLU Temiz/Kirli 1 6.98 153 Kirli 2 5.74 222 Kirli 3 5.70 31 Kirli ortalama 6.14 135 Kirli 1 2.9 0 Temiz 2 2.7 0 Temiz 3 2.7 0 Temiz ortalama 2.76 0 Temiz 1 1.78 0 Temiz 2 1.18 0 Temiz 3 1.0 9 Temiz ortalama 1.32 3 Temiz Tekrar no 30 ATP Metodu İle Klasik Külterel Metot Arasındaki Korelasyon Değerleri 4.6. Her iki metodun sonuçları arasındaki korelasyonun belirlenmesi için Spearman korelasyon testi kullanılarak hesaplamalar yapılmış ve sonuçlar Tablo 4-7’da verilmiştir. Tablo 4-6: ATP metodu ile klasik kültürel metot arasındaki korelasyon değerleri. Mikroorganizma n r p r² Salmonella 9 0.911 p=0.001 0.83 E. coli 9 0.724 p=0.028 0.524 S. aureus 9 0.644 p=0.061 0.415 S. cerevisiae 9 0.623 p=0.073 0.388 Toplam 36 0.761 p=0.001 0.579 n: Deney numune sayısı r: Korelasyon katsayısı p: Korelasyon değeri r²: Belirleme derecesi 31 Bir Kanatlı Kesimhanesinden Alınan Numunelerle Yapılan Çalışma 4.7. Sonuçları Gıda işletmelerinde kullanılan materyalleri temsil edecek nitelikteki yüzeylerin kirletilmesi suretiyle yapılan bu çalışmaya ek olarak doğal kontamine yüzeylerdeki etkinin görülmesi için bir kanatlı işletmesinden alınan numune sonuçları iki metoda göre karşılaştırılarak gösterilmiştir (Tablo 4-8). Tablo 4-7: Bir kanatlı kesimhanesinden alınan numunelerle sonuçları yapılan çalışma sonuçları Numune Salmonella Swap metoduna göre ATP ATP Log10 kob/cm² metoduna metoduna göre göre E.coli S.aureus S.cerevisiae TAB RLU Temiz/Kirli 9 3107 Kirli 1 0 5.60 0 5 2 0 4.35 0 3.75 6.95 975 Kirli 3 0 2.65 0 2.95 4.65 756 Kirli 4 0 0 0 0 8.3 636 Kirli 5 0 4.35 0 3.4 5.95 581 Kirli 6 0 5.6 0 4.7 9.9 422 Kirli 1: Parçalama masası, 2: Personel eli, 3: Göğüs fleto bandı 4: Transfer bandı I, 5: Kesme tahtası, 6: Transfer bandı II Bu sonuçlara göre hesaplanan korelasyon katsayısı (r) ise 0,386’dır. 32 5. TARTIŞMA Günümüzde gıda üretimi ve dağıtımı yapan işletmelerin gıda zinciri boyunca güvenilirlik ve hijyen sağlaması, gıda kaynaklı zehirlenmelerin önlenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu güvenilirliğin sağlanabilmesi için uygulanan tüm önlem amaçlı sistemlerde sürekli uygunluğun gözden geçirilmesi için hızlı ve güvenilir hijyen doğrulama metotlarına gereksinim vardır. Bu noktada, doğrulama metotları kullanılarak hijyen sağlamaya yönelik uygulamaların etkinliğinin ölçülmesi amaçlanmaktadır (Dalgıç ve Belibağlı 2006; TSE 2006; Topalakçı 2007). Bu tez çalışmasında hijyen uygulamalarının doğrulanması için üretim tesislerinde kullanılan ATP biyoluminesans hijyen görüntüleme metodunun performansının ve uygulanabilirliğinin klasik metot ile karşılaştırılmak suretiyle incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla yapay olarak farklı mikroorganizmalarla kirletilmiş deneysel ortamların kontaminasyon seviyesi her iki metot kullanılarak karşılaştırılmıştır. ATP biyoluminesans hijyen görüntüleme metodunun gıda işletmelerindeki kullanım olanaklarının değerlendirilmesi amacıyla bir kanatlı kesimhanesinin doğal kontamine üretim alanlarından alınan numuneler yine her iki metot karşılaştırılarak incelenmiştir. Çalışmamızda ilk olarak paslanmaz çelik yüzeylere uygulanan dezenfeksiyonun ardından yüzeylerde yeterli dezenfeksiyonun sağlandığının incelenmesi amacıyla steril swap ile yüzeylerden alınan örneklerin PCA agara sürme plak yöntemiyle ekimleri yapılmış ve 37˚C’de 24 saat inkubasyona bırakılmış ve incelemeler sonunda yüzeylerde herhangi bir üreme gözlenmemiştir. Benzer olarak, Ayçiçek ve ark. (2006) da bir hastane mutfağında gıda ile temas eden yüzeylerde yapmış oldukları çalışmada temizlik tespit limitini <10 kob/cm2 olarak belirlemişlerdir. Buna göre çalışmamızda deneysel yüzeylere uygulanan dezenfeksiyon metodunun etkin olduğu ve sayımı yapılan mikroorganizmaların deneysel kirletme faaliyetinden kaynaklandığı kesinleştirilmiştir. Çalışmamızda, dezenfeksiyon işlemini takiben, kanatlı işletmelerinde rastlanılması muhtemel olan hijyen indikatörü ve bazı patojen mikroorganizmalarla 3 farklı (düşük, orta ve yüksek) seviyede kirletilmiş ve bu yüzeylerden iki paralel numune alınarak bir paraleli klasik kültürel metot ve bir paraleli de ATP biyoluminesans metodu 33 ile analize tabi tutulmuştur. Bu yüzeyler içerisinde, Salmonella ile kirletilen yüzeylerden elde edilen sonuçlara göre; ortalama 6,11 log10 kob/cm2 bakteri ile kirletilen ve yüksek seviyede kontamine olarak değerlendirilen yüzeyde ATP ölçüm sonucu 189 iken orta (4,53 log10 kob/cm2) ve düşük (2,29 log10 kob/cm2) seviyede kirletilen yüzeyler için sırasıyla 31 ve 0 olmuştur (Tablo 4-2). E.coli ile kirletilen yüzeylerde bu oranlar yüksek (5,57 log10kob/cm2), orta (3,25 log10kob/cm2) ve düşük (1,51 log10 kob/cm2) için sırasıyla 265, 8 ve 1 olarak belirlenmiştir (Tablo 4-3). S.aureus sonuçlarına göre ise, yüksek (5,55 log10 kob/cm2), orta (4,46 log10 kob/cm2) ve düşük kontaminasyonlar (2,95 log10 kob/cm2) için sırasıyla 136, 19 ve 1,6 (Tablo 4-4), S. cerevisiae için, yüksek (6,14 log10 kob/cm2) orta (2,76 log10 kob/cm2) ve düşük (1,32 log10 kob/cm2) için sırasıyla 135, 0 ve 3’tür (Tablo 4-5). Bu sonuçlar doğrultusunda ATP cihazı yüksek seviyede mikroorganizma yüküne sahip yüzeylerde, ki bu seviye 5-6 log10 kob/cm2’ye tekabül etmektedir, kirli olarak sonuç vermiştir. Orta seviyede (3-4 log10 kob/cm2) bakteri ile kirletilmiş yüzeylerde ise elde edilen ATP ölçüm sonuçları değişken bulgu vermiş olup Salmonella ve S.aureus için kirli olarak tespit ederken E.coli için temiz olarak sonuç vermiştir. Maya ile kirletilen yüzeyde kirletme seviyesi 2 log10 kob/cm2 olup bu alanda da temiz olarak sonuç bildirmiştir. Düşük sayıda mikroorganizma ile kontamine edilen (1-2 log10 kob/cm2) yüzeylerde ise ATP cihazı ile tespit yapmak mümkün olamamış ya da çok düşük seviyelerde kalmıştır (Tablo 4-2, 43, 4-4, 4-5). Benzer olarak Chen ve Godwin (2006) de gerçekleştirdikleri çalışmalarında 3 log10/kob’un altında toplam bakteri yüküne sahip mikroorganizma taşıyan yüzeylerde 20 RLU’dan daha düşük değerler tespit edildiğini ifade etmişlerdir. Nitekim başka bazı araştırmacılar da ATP metodunun tespit limitini 3-4 log10 kob/cm2 olarak bildirmişlerdir (Siragusa ve ark. 1995; Davidson ve ark. 1999; Corbitt ve ark. 2000; Larson ve ark. 2003; Leon ve Albrech 2007; Sala ve ark. 2008; Jasson ve ark. 2010; Carroscosa ve ark. 2012). İstatistik analizler sonucunda elde edilen p değeri (probability; olasılık değeri) iki değişken arasındaki bağımlılık yani korelasyonun anlamlılığı olarak tanımlanmaktadır. Hesaplanan p değerinin yorumlanmasına yönelik genel yaklaşım şu şekildedir: 0.01<=p<0.05 İstatistiksel anlamlılık 0.001<=p<0.01 Yüksek düzeyde istatistiksel anlamlılık p<0.001 Çok yüksek istatistiksel anlamlılık 0.05<=p<0.10 Anlamlılık eğilimi (sınırda anlamlılık) 34 p>0.10 Fark tesadüften ileri gelmiştir (istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmamıştır) Korelasyon katsayısı (r) ise istatistik analizi yapılacak değişkenler arasındaki ilişkinin derecesini açıklamaktadır. r değerinin karesi alınarak bulunan r2 değeri ise iki veriden birinin diğerini belirleme derecesini yorumlamak amacıyla kullanılmaktadır (Özdamar 1999, Kul 2014). Her iki metodun arasındaki korelasyon katsayısı (r) mikroorganizma türüne göre farklı olup, Salmonella, E. coli, S. aureus ve S. cerevisiae için sırasıyla 0,911, 0,724, 0,644 ve 0,623’tür. Çalışmamıza konu olan iki metodun mikroorganizma türünden bağımsız olarak toplam 36 testin sonuçları ile elde edilen korelasyon katsayısı ise r=0,761 olarak tespit edilmiş olup, p değerinin 0,001 olması bu korelasyonun yüksek düzeyde anlamlı olduğunu göstermiştir. Benzer şekilde, diğer bazı başka çalışmalarda da korelasyon değeri değişken olarak tespit edilmiş olup 0,68 ile 0,90 arasında bulunmuştur (Siragusa ve ark. 1995; Cutter ve ark., 1996; Chen ve Godwin 2006; Sala ve ark. 2008). Çalışmamızda korelasyonun yüzeyde mevcut bulunan mikroorganizmanın türüne göre hesaplanması halinde önemli derecede farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Korelasyon katsayısı en iyi Salmonella için (r=0,911) olarak bulunurken, en düşük S. cerevisciae (r=0,623) için bulunmuştur. E.coli için anlamlı bir korelasyon (r=0,724) elde edilirken S. aureus’a ait korelasyon katsayısı r=0,644 olarak tespit edilmiştir. S. cerevisciae ve S. aureus için hesaplanan korelasyonların p değerinin sırasıyla, p=0,073 ve p=0,061 yani >0,05 olması korelasyonun sınırda anlamlı olduğunu; Salmonella (p=0.001) ve E.coli (p=0.028) için elde edilen p değerlerinin ise sırasıyla yüksek düzeyde anlamlı ve anlamlı olduğunu göstermiştir. Benzer olarak, Chen ve Godwin (2006) de yaptıkları çalışmalarda toplam aerob mezofil bakteri ve psikrofilik bakteri yükleri için dahi bu hesaplamaların farklılık gösterdiğini en iyi sonuçların ortalamadan elde edildiğini açıklamıştır. Bu durum farklı çalışmalardan elde edilen, farklı korelasyon katsayılarının nedenini de açıkça göstermektedir. Nitekim Moore ve ark. (2010)’nın sonuçları S. aureus ile ilgili sonuçlarımızı desteklemekte olup, bu çalışmada da Londra’da ulusal bir temizlik standardı belirlemek amacıyla bir hastanenin yoğun bakım ünitelerinde uygulanan modifiye temizlik programının etkinliği ATP biyolüminesans metodu kullanılarak ölçülmüş ve bu metot ile temiz olarak tespit edilen yüzeylerde klasik metot ile S. aureus varlığı tespit edilmiştir. 35 Doğal kontamine yüzeylerde metodun performasınının incelenmesi amacıyla bir kanatlı işletmesinden seçilen kirli yüzeylerden yapılan paralel çalışmaların sonuçlarına göre ATP biyoluminesans metodu 4-10 log arasında değişen sayılarda toplam aerob mezofil bakteri ile kontamine bu yüzeylerin tümünü kirli olarak tespit etmiş ve RLU cinsinden 422 ile 3107 arasında ölçüm sonuçları vermiştir. Kirli yüzeylerden alınan bu örneklerde iki metot arasındaki korelasyon katsayısı r=0,386 olarak bulunmuştur. Bu korelasyon katsayısının deneysel kontamine olanlara göre düşük olmasının nedeni ATP biyoluminesans metodunun gıda kaynaklı ATP’yi bakteriyel ATP’den ayıramıyor olması olabilir (Davidson ve ark. 1999; Griffith ve ark. 2000; Larson ve ark. 2003; Ayçiçek ve ark. 2006; Chen ve Godwin 2006; Sala ve ark. 2008). Elde ettiğimiz sonuçlar, özellikle Salmonella ve E.coli için, yapılan bir çok çalışmaya oranla daha anlamlıdır. Bunun muhtemel nedeni yapılan çalışmaların çoğunun doğal kontamine yüzeylerden yapılmış olması ve yüzeyde yüksek miktarda organik kirliğinin de mevcut bulunması olabilir. Oysa ki çalışmamızda kirletilen yüzeylerde sadece saf mikroorganizmalar yer almakta ve organik kir bulunmamaktadır. Nitekim çalışmamızın bir aşamasında doğal kontamine yüzeylerden aldığımız örneklerde korelasyonun belirgin bir şekilde düşüş göstermesi bu bulguları desteklemektedir. Benzer doğal kontamine yüzeylerde yapılan bir çok diğer çalışmada da korelasyon katsayısı düşük bulunmuş ve bu sebeple gerek mikroorganizma tipine göre korelasyonu sağlıklı belirlemek gerekse gıda kirliğine bağlı ATP ölçümünün sonuçları etkilemesinin önüne geçmek açısından bu denemeler öncesi yüzeyde etkin bir dezenfeksiyonun sağlanması önerilmiştir (Siragusa ve ark. 1995; Ayçiçek ve ark. 2006; Costa ve ark. 2006; Sokolınska ve Pıkul 2008; Vilar ve ark. 2008; Boyce ve ark. 2009; Moore ve ark. 2010; Carroscosa ve ark. 2012). Ek olarak, Sokolınska ve Pıkul (2008) yüzey tipinin de ATP biyoluminesans ölçümleri üzerine etkili olabileceğini bildirmiş olup, sonuçlardaki değişkenlikler üzerine bu durumun da etki göstermiş olması muhtemeldir. Elde ettiğimiz sonuçlar ve diğer bir çok araştırmacının sonucu, ATP biyolüminesans metodunun kirli yüzeyde düşük korelasyon vermesi ve mikroorganizma türüne göre spesifik sonuç vermemesi ve performansının önemli derecede etkilenmesi sebebiyle, ancak dezenfeksiyon sonrası etkinlik belirlenmesi amacıyla kullanılabileceğini göstermiştir (Davidson ve ark. 1999; Griffith ve ark. 2000; Aytaç ve 36 ark. 2001; Ayçiçek ve ark. 2006; Chen ve Godwin 2006; Costa ve ark. 2006; Boyce ve ark. 2009; Jasson ve ark. 2010; Moore ve ark. 2010). Nitekim, Costa ve ark. (2006) Brezilya’da bir süt işletmesindeki paslanmaz çelik yüzeylerden Pseuodomonas ve toplam aerob mezofil bakterilerin kob değerleri ile RLU değerlerini kıyasladıkları çalışmada ne temizlik öncesi ne de sonrasında iki metot arasında herhangi bir korelasyon ilişkisi saptamamış ancak ATP biyolüminesans metodunun hijyen ve temizlik kontrolünde kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Sonuç olarak elde ettiğimiz sonuçlar, ATP biyoluminesans metodunun sonuçları ile altın standart olarak kabul edeceğimiz klasik kültürel metot arasında anlamlı bir korelasyonun sağlanmasına etki eden birden çok faktörün olduğunu göstermiştir. Buna karşın genel tekrarlarda elde etmiş olduğumuz kabul edilebilir seviyedeki korelasyon katsayıları metodun genel anlamda hijyen kontrolü için uygulanabilir olduğunu göstermiştir. Ancak doğal kontamine yüzeylerde elde edilen korelasyonun anlamsız olması ve mikroorganizma yükünün performansa olan etkisi düşünüldüğünde bu metodun ancak dezenfeksiyon sonrası kullanımının uygun olacağını göstermiştir. Ek olarak özellikle Salmonella ile ilgili tespit etmiş olduğumuz anlamlı sonuçlar doğrultusunda metodun hız ve uygulama pratikliği avantajları göz önüne alındığında ATP biyoluminesans metodunun kanatlı endüstrisi için pratik bir alternatif olabileceği sonucuna varılmıştır. Yapılacak benzer çalışmalarla metodun farklı üretimlerde mevcut olabilecek yüzey yapıları ve mikroorganizma türleri için doğrulamalarının yapılması yararlı olacaktır. 37 KAYNAKLAR Ahmad, K.A. ve Stewart, G.S.A.B. (1991). The production of bioluminescent lactic acid bacteria suitable for the rapid assessment of starter culture activitiy in milk. Journal of Applied Bacteriology, 70, 113. Anonim, (2010). Veteriner Hizmetleri, Bitki Sağliği, Gida ve Yem Kanunu, Kanun Numarası 5996. 13.06.2010 tarih ve 27610 sayılı Resmi Gazete. Anonim, (2011). T.C. Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı’nın Gıda Hijyeni Yönetmeliği, 17.12.2011 tarih ve 28145 sayılı Resmi Gazete. Arda, Ş. ve Aydın, A. (2011). Hammadde Kalitesi ile Bazı Hijyen Parametrelerinin Yufkanın Mikrobiyolojik Kalitesi Arasındaki İlişki Üzerine Bir Araştırma. İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 37 (2), 135-147. Aras, Z. (2011). Mikrobiyolojide Hızlı Tanı Yöntemleri. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 68 (2), 97-104. Ayçiçek, H., Oğuz, U. ve Karcı, K. (2006). Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination of surface cleanliness at a hospital kitchen. International Journal of Hygiene and Enviromental Health, 209 (2), 203-206. Aytaç, S.A., Mercanoğlu, B. ve Özbaş, Y. (2001). Tampon Çözeltide İmmunomanyetik Ayırma ve Biyolüminesans Yöntemleri ile Escherichia coli 0157:H7 Sayımı. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 58 (2), 49-52. Benesh, D.L., Crowley, E.S. ve Bird, P.M. (2013). 3M™ Petrifilm™ Environmental Listeria Plate. Journal of AOAC International, 96 (2), 225-228. 38 Beuchat, L.R., F, Copeland, Curiale, M.S., Danisavich, T., Gangar, V., King, B.W., Lawlis, T.L., Likin, R.O., Okwusoa, J., Smith, C.F. ve Townsend, D.E. (1998). Comparison of the Simplate total plate count method with Petrifilm, Redigel and conventional pour-plate methods for enumarating aerobic microorganisms in foods. Journal of Food Protection, 61, 14-18. Bonaventura, G.D., Piccolomini, R., Paludi, D., D’Orio, V., Vergara, A., Conter, M. ve Ianieri, A. (2008). Influence of temperature on biofilm formation by Listeria monocytogenes on various food-contact surfaces: Relationship with motility and cell surface hydrophobicity. Journal of Applied Microbiology, 104, 1552–1561. Bostan, K., Aksu, H., Ersoy, E., Özgen, Ö. ve Uğur, M. (2001). The effect of prechilling with acetic and lactic acid on shelf-life of broiler carcasses. Pakistan Jornal of Biological Sciences, 4 (6), 753-756. Boyce, J.M., Havill, N.L., Dumigan, D.G., Golebiewski, M., Balogun, O., Rizvani, R. (2009). Monitoring The Effectiveness Of Hospital Cleaning Practices By Use Of An Adenosine Triphosphate Bioluminescense Assay. Infection Control and Hospital Epidemiology, 30 (7), 678-684. BRC (2015). Global Standard for food safety Version 7. British Retail Consortium, UK. Carroscosa, C., Saavedra, P., Millán, R., Jaber, J.R., Pérez, E., Grau, R. ve ark. (2012). Monitoring of cleanliness and disinfection in dairies: Comparison of traditional microbiological and ATP bioluminescence methods. Food Control, 28, 368-373. Centers for Disease Control (CDC) (2014). Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food — Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006–2013. Erişim 20.02.2015. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm6315a3.htm Cevizci, S. ve Önal, A.E. (2009). Halk Sağlığı Açısından Hijyen ve İyi Üretim Uygulamaları, Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 66 (2), 73-82. 39 Chen, F.C. ve Godwin, S.L. (2006). Comparison of a Rapid ATP Bioluminescence Assay and Standard Plate Count Methods for Assessing Microbial Contamination of Consumers Refrigerators, Journal of Food Protection, 69 (10), 2534-2538. Chollet, R., Kukuczka, M., Halter, N., Romıeux, M., Marc, H.M., Benguın, V. ve ark. (2008). Rapid Detection and Enumeration of Contaminants by ATP Bioluminescense Using the Milliflex Rapid Microbiology Detection and Enumeration System. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 16, 256-272. Chu, C.P., Lee, D.J., Chang, B.V. ve Liao, C.S. (2001). Using ATP Bioluminescence Technique for Monitoring Microbial Activitiy in Sludge. Biotechnology and Bioengineering, 75 (4), 469-474. Codex Alimantarius/WHO (2011). Guidelines For Risk Analysis Of Foodborne Antimicrobial Resistance. Erişim 28.02.2015 http://www.codexalimentarius.org/searchresults. Corbitt A.J., Bennion, N., Forsythe, S.J., (2000). Adenylate kinase amplification of ATP bioluminescence for hygiene monitoring in the food and beverage industry. Letters in Applied Microbiology, 30 (6), 443–447. Costa, P.D., Andrade, N.J., Brandao, S.C.C., Passos, F.J.V., Soares, N.F.F. (2006). ATP-Bioluminescence Assay as an Alternative for Hygiene-Monitoring Procedures of Stainless Steel Milk Contact Surfaces. Brazilian Journal of Microbiology, 37, 3. Cutter, C.N., Dorsa, W.J. ve Siragusa, G.R. (1996). A rapid microbial ATP bioluminescence assay for meat carcasses. Dairy Food Environment, 66, 726-736. Çaklı, Ş. ve Kışla, D. (2003). Su Ürünlerinde Mikrobiyel Kökenli Bozulmalar ve Önleme Yöntemleri. Ege Üniversitesi Su Ürünleri Dergisi, 20 (1-2), 239-245. 40 Çömlekoğlu, Ü., Mazmancı, B. ve Arpacı, A. (2000). Pestisidlerin kronik etkisine maruz kalan tarım işçilerinde eritrosit süperoksit dismutaz ve katalaz aktiviteleri. Türk Biyokimya Dergisi, 24, 483–488. Dalgıç, A.C. ve Belibağlı, K.B. (2006). Gıda Güvenligi ve Kalite Yönetim Sistemleri Entegrasyonu: ISO 22000:2005 Gıda Güvenligi Yönetim Sistemi ve ISO 9000:2000 Kalite Yönetim Sistemi Uygulamaları. Türkiye 9. Gıda Kongresi, Bolu Davidson, C.A., Griffith, C.J., Peters, A.C. ve Fielding, L.M. (1999). Evaluation of two methods for monitoring surface cleanliness - ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing. Luminescence, 14 (1), 33-38. Duncanson, P., Wareing, D.R.A. ve Jones, O. (2003). Application of an Automated İmmunomagnetic Separation-Enzyme İmmunoassay For Detection of Salmonella spp. During an Outbreak Associated With a Retail Premises. Letters in Applied Microbiology, 37 (2), 144-148. Dümen, E., Çetin, Ö. ve Sezgin, F.H. (2009). Unlu Mamül İşletmelerinde Temas Yüzeylerinin ve Aletlerin Mikrobiyolojik Kirliliğinin Araştırılması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, 39 (3-4), 108-114. Efe, M. ve Gümüşsoy, K.S. (2005). Ankara Garnizonu’nda tüketime sunulan tavuk etlerinin mikrobiyolojik analizi. Sağlık Bilimleri Dergisi, 14 (3), 151-157. Engez, S.T. ve Ergönül, B. (2009). Kurutulmuş Et Üretiminde HACCP Sisteminin Uygulanması. Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi, 4 (3), 12-19. Erkan, N., Alakavuk, D.Ü. ve Tosun, Y.Ş. (2008). Gıda Sanayinde Kullanılan Kalite Güvence Sistemleri. Journal of FisheriesSciences, 2 (1), 88-89. Erol, İ. (2007). Gıda Hijyeni ve Mikrobiyolojisi. Pozitif Matbaacılık, Ankara, 60-70. 41 Fach, P., Micheau, P., Mazuet, C., Perelle, S. ve Popoff, M. (2009). Development of realtime PCR tests for detecting botulinum neurotoxins A, B, E, F producing Clostridium botulinum, Clostridium baratii and Clostridium butyricum. Journal of Applied Microbiology, 107, 465-473. FDA. (2001a). Food and Drug Administration. Chapter 3. Aerobic Plate Count. Bacteriological Analytical Manual. Erişim 04.04.2012. http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnal yticalManualBAM/ucm063346.htm. FDA. (2001b). Food and Drug Administration. Chapter 12. Staphylococcus aureus. Bacteriological Analytical Manual. Erişim 04.04.2012. http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnal yticalManualBAM/ucm071429.htm. FDA. (2001c). Food and Drug Administration. Chapter 18. Yeast, Molds and Mycotoxins. Bacteriological Analytical Manual. Erişim 04.04.2012. http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnal yticalManualBAM/ucm071435.htm. FDA. (2003). Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate Chapter 1 Bacteriological Analytical Manual. Erişim 04.04.2012. http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063335.htm. FDA. (2007). Food and Drug Administration. Chapter 5. Salmonella Bacteriological Analytical Manual. Erişim 04.04.2012. http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalytic alManualBAM/ucm071429.htm. Fung, D.Y.C. (2002). Rapid Methods and Automation in Microbiology. Comprehensive Reviews In Food Science And Food Safety, 1, 3-22. 42 Giray, H. ve Soysal, A. (2007). Türkiye’de Gıda Güvenliği ve Mevzuatı. TSK Koruyucu Hekimlik Bülteni, 6 (6), 485-490. Gray, M.L. ve Killinger, A.H. (1966). “Listeria monocytogenes and Listeria Infections” Bacteriology Reviews, 30, 309-382. Griffith, M.W. (1993). Applications of bioluminescence in the dairy industry. Journal of Dairy Science, 76, 3118-3125. Griffith, J., Blucher, A., Fleri, J. ve Fielding, L. (1994). An evaluation of luminometry as a technique in food microbiology and comparison of six commercially available luminometers. Food Science Teknology, 8 (4), 209-216. Griffith, C.J., Davidson, C.A., Peters, A.C. ve Fielding, L.M. (1997). Towards a strategic cleaning assessment programme: hygiene monitoring and ATP luminometry, an options appraisal, Food Science and Technology, 11, 15–24. Griffith, C.J., Cooper, R.A., Gilmore, J., Davies, C. ve Lewis, M. (2000). An evaluation of hospital cleaning regimes and standards. Journal of Hospital Infection 45, 19–28. Guilbaud, M., Coppet, P., Bourion, F., Rachman, C., Prevost, H. ve Dousset, X. (2005). Quantitative Detection of Listeria monocytogenes in Biofilms by Real-Time PCR. Applied and Environmental Microbiology, 71 (4), 2190-2194. Güder, G. (2006). Avrupa Birliği gıda güvenliği politikası ve üyelik sürecinde Türkiye’ye yansımaları. Avrupa Birliği ile İlişkiler Genel Müdürlüğü, Uzmanlık Tezi, Ankara. Güler, Ç. ve Çobanoğlu, Z. (1994). Besin Kirliliği. Sağlık Bakanlığı Çevre Sağlığı Temel Kaynak Dizisi. Ankara, 12–17. Günel, T. ve Aydınlı, K. (2009). Real-Time PCR ve Uygulama Alanları. Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi, 2 (2), 43-45. 43 Hanna, S.E., Connor, C.J. ve Wang, H.H. (2005). Real-time polymerase chain reaction for the food microbiologist: technologies, applications, and limitations. Journal of Food Science. 70, 49-53. Harris, L.J. ve Griffiths, M.W. (1992). The detection of foodborne pathogens by the polymerase chain-reaction (PCR). Food Research International, 25, 457-469. Hawronskyj, J.M. ve Holah J. (1997). ATP: A universal hygiene monitor. Trends in Food Science and Technology, 8, 79-83. Hayes, P.R. (1992). Food Microbiology and Hygiene, Second Edition, Chapman & Hall, 34, 360-369. Holah, J.T., Betts, R.P. ve Thorpe, R.H. (1988). The Use of Direct Epiflourescent Microscopy (DEM) and the Epif-luorescent filter technique (DEFT) to Assess Microbial Populations of food contact surfaces. Journal of Applied Bacteriology, 65 (3), 215-221. IFS (2014). IFS Food Version 6, International Featured Standards, Germany. ISO (2001). Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive E. coli. Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide, 16649. International Standart Organisation, Geneva, Switzerland. ISO (2004). Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal methods for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs, ISO 18593. International Standart Organisation, Geneva, Switzerland. ISO (2009a). Quality management systems. ISO 9000:2005. International Standart Organisation, Geneva, Switzerland. 44 ISO (2009b). Prerequisite programmes on food safety. Part 1: Food manufacturing, ISO 22002-1. International Standart Organisation, Geneva, Switzerland. İşeri, Ö., Erol, İ. (2009). Hindi Etinden Kaynaklanan Başlıca İnfeksiyon ve İntoksikasyonlar, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 56, 47-54. Jasson, V., Jacxsens, L., Luning, P., Rajkovic, A. ve Uytendaele, M. (2010). Alternative microbial methods: An overview and selection criteria. Food Microbiology, 27, 710730. Karaman, D.A., Altuğ, T. ve Ova, G. (2011). Gıda İşletmelerinde Ön Gereksinim Programlarının Kurulması ve Uygulanması: Süt Sektörü Örneği. Adnan Menderes Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 8 (1), 9-21. Kartal, D.E. (2010). Gıda Kaynaklı İnfeksiyonlar, Osmangazi Üniversitesi Tıp Fakültesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji A.B.D. Food Safety. Erişim 17.03.2010 http://www.nuveforum.net/1598-hastaliklar/216977-gida-kaynakli-infeksiyonlar. Kastango, E. ve Faylor, K. (2000). Block SS, ed. AAMI steam sterilization assurance in health care facilities, In Disinfection, Sterilization and Preservation, 5, 22. Kawasaki, S., Fratamico, P.M., Horikoshi, N., Okada, Y., Takeshita, K., Sameshima ve T., Kawamoto, S. (2009). Evaluation of a multiplex PCR system for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in foods and in food subjected to freezing. Foodborne Pathogens and Disease, 6, 81-89. Kaymaz, Ş. (1987). Ankara’da tüketime sunulan hamburgerlerde halk sağlığı yönünden önemli bazı bakterilerin saptanması. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 34 (3), 377-393. Keeratipibul, S., Techaruwichit, P. ve Chaturongkasumrit, Y. (2009). Contamination sources of coliforms in two different types of frozen ready-to-eat shrimps. Food Control, 20, 289-93. 45 Koçak, N. (2007). ISO 22000: Gıda Güvenliği Yönetim Sistemleri Uygulama Sürecinde Temel Adımlar, Dokuz Eylül Üniversitesi Sosyal Bilimler Enstitüsü Dergisi, 9, 4. Kul, S. (2014). İstatistik sonuçlarının yorumu: p değeri ve güven aralığı nedir? Bulletin of Pleura/Plevra Bülteni, 8, 11-13. Kumar, R., Surendran, P.K. ve Thampuran, N. (2008). Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology, 46, 221-226. Kusumaningrum, H.D., Riboldi, G., Hazeleger, W.C. ve Beumer, R.R. (2003). Survival of foodborne pathogens on stainless steel surfaces. International Journal of Food Microbiology, 85, 227– 236. Larson, L.E., Ailello, A.E., Gomez-Duarte, C., Lin, S.X., Lee, L., Della-Latta, P. ve ark. (2003). Bioluminescense ATP Monitoring as a Surrogate Marker for Microbial Load on Hands and Surfaces in the Home. Food Microbiology, 20, 735-739. Lehto, M., Kuisma, R., Määttä, J., Kymäläinen, H.R., Mäki, M. (2011). Hygienic level and surface contamination in fresh-cut vegetable production plants. Food Control, 22, 469-475. Leon, M.B. ve Albrecht, J.A. (2007). Comparison of adenosine triphosphate (ATP) bioluminescence and aerobic plate counts (APC) on plastic cutting boards. Journal of Food Service, 18, 145-152. Lilja, L. ve Hanninen, M.L. (2001). Evaluation of a commercial automated ELISA and PCR-method for rapid detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry products. Food Microbiology, 18, 205-209. 46 Mafu, A.A., Pitre, M. ve Sirois, S. (2009). Real-Time PCR as a Tool for Detection of Pathogenic Bacteria on Contaminated Food Contact Surfaces by Using a Single Enrichment Medium. Journal of Food Protection, 5, 1156-1354. McEIroy, W.D. (1947). The Energy Source for Bioluminescence in an Isolated System. Zoology, 33, 342-345. McEIroy, W.D. ve Strehler, B.L. (1949). Factors Influencing the Response of the Bioluminescent Reaction to ATP. Archives of Biochemistry and Biophysics, 22, 420433. Moore, G. ve Griffith, C. (2002). Acomparison of surface sampling methods for detecting coliforms on food contact surfaces. Food Microbiology, 19, 65-73. Moore, G., Smyth, D., Singleton, J. ve Wilson, P. (2010). The Use of Adenosine Triphosphate Bioluminescense to Assess the Efficacy of a Modified Cleaning Program İmplemented Within an Intensive Care Setting. American Journal of Infection Control, London, 38, 617-622. Mullis, K.B. ve Faloona, F.A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155, 335-350. Nero, L.A., Rodrigues, L.D., Vicosa, G.N. ve Ortolani, M.B.T. (2008). Performance of petrifilm aerobic count plates on enumeration of lactic acid bacteria in fermented milks. J. Rapid Methods Automatic Microbiology, 16, 132-139. Noble, R.T. ve Weisberg, S.B. (2005). A review of technologies for rapid detection of bacteria in recreationalwaters. Journal of Water and Health, 3(4), 381–392. Nyachuba, G.D. ve Donnelly, W.C. (2007). Comparison of 3M™ Petrifilm™ Environmental Listeria Plates against Standard Enrichment Methods for the Detection of Listeria monocytogenes of Epidemiological Significance from Environmental Surfaces. Journal of Food Science, 72 (9), 346-354. 47 Ögüt, S. ve Polat, M. (2009). Bazı Beş Yıldızlı Otellerde Hazırlanan Gıdaların Mikrobiyolojik Açıdan Değerlendirilmesi, Süleyman Demirel Üniversitesi Yaşam Dergisi, 1 (2), 12-16. Özcan, N. ve İkincioğulları, D. (2009). Ulusal Zehir Danışma Merkezi 2008 Yılı Çalışma Raporu Özeti. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 66 (3), 29-58. Özdamar, K. (1999). SPSS ile Biyoistatistik. Kaan Kitabevi, Eskişehir. Özkaya, D.F. ve Cömert, M. (2008). Gıda Zehirlenmelerinde Etken Faktörler. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 65 (3), 149-158. Pettipher, G.L., Watts, Y.B., Langford, S.A. ve Kroll, R.G. (1992). Preliminary evaluation of cobra, an automated DEFT instrument, for the rapid enumeration of microorganisms in cultures, raw-milk, meat and fish. Letters in Applied Microbiology, 14, 206-209. Rosmini, M.R., Signorini, M.L., Schneider, R., Bonazza, J.C., (2004). Evaluation of two alternative techniques for counting mesophilic aerobic bacteria in raw milk. Food Control, 15, 39-44. Sala, C., Mılovan, G.H., Morar, A. ve Nıchıta, I. (2008). Establishing the Microbial Contamination of Surtaces from the Food Industry by Alternative Methods Using ATP Bioluminescense. Lucrărı Stıınłıfıce Medıcınă Veterınară, 41, 841-846. Salo, S., ve Laine, A. (2000). Validation of The Microbiological Methods Hygicult Dipslide, Contact Plate, and Swabbing in Surface Hygiene Control. Journal of AOAC Internatıonal, 83 (6), 1357-1366. Schmelder, J.L., Kalinowski, R.M. ve Bodnaruk, P.W. (2000). Evaluation of the petrifilm (TM) and redigel (TM) as rapid methods to the standard plate count method 48 for the enumeration of processed meats and environmental samples. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, 8, 65-70. Serpen, A. (2007). AB Sürecinde Türkiye’de Gıda Güvenliğinin Dünü, Bugünü ve Yaşanmakta olan Kargaşanın Değerlendirilmesi. Hayvancılıkta Performans Dergisi, 108-109. Settanni, L., ve Corsetti, A. (2007). The use of multiplex PCR to detect and differentiate food- and beverage-associated microorganisms: a review. Journal of Microbiological Methods, 69, 1-22. Sierra, M.L., Sheridan, J.J. ve McGuire, L. (1997). Microbial quality of lamb carcasses during processing and the acridine orange direct count technique (a modified DEFT) for rapid enumeration of total viable counts. International Journal of Food Microbiology, 36, 61-67. Silva, B.O., Caraviello, D.Z., Rodrigues, A.C. ve Ruegg, P.L. (2005). Evaluation of petrifilm for the isolation of Staphylococcus aureus from milk samples. Journal of Dairy Science, 88, 3000-3008. Siragusa, G.R., Cutter, C.N., Dorsa, W.J. ve Koohmaraie, M. (1995). Use of a Rapid Microbial ATP Bioluminescence Assay to Detect Contamination on Beef and Pork Carcasses. Journal of Food Protection, 58 (7), 770-775. Slade, P.J. (1992). Monitoring Listeria in the food production environment. I. Dectection of Listeria in processing plants and isolation methodology. Food Research International, 25 (1), 45-56. Sokolınkska, C.D. ve Pikul, J., (2008). Evalution of Steel Surface Cleanliness Level in Dairies Using the Bioluminescense Method. Bull Vet Inst Pulawy, 52, 625-629. Stanley, P.E. (1992). A survey more than 90 commercially available luminometeres and imaging devices for low light measurements of chemiluminescence and 49 bioluminescence, including instruments for manual, automatic and specialised operation, for HPLC, LC, GLC and microtitre plates. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 7, 77-108. Szabo, I., Scherer, K., Roesler, U., Appel, B., Nockler, K. ve Hensel, A. (2008). Comparative examination and validation of ELISA test systems for Salmonella typhimurium diagnosis of slaughtering pigs. International Journal of Food Microbiology, 124, 65-69. Şener, A. ve Temiz, A. (2004). Tavuk Kesimhane ve İşletmelerinde Kullanılan Ticari Dezenfektanlar ve Etkinlikleri. Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi, 2 (10), 1-28. Taban, B.M. ve Aytaç, S.A. (2008). Tavuk etlerinden Salmonella spp. belirlenmesine yönelik hızlı bir yöntem. Gıda Dergisi, 33, 205-211. Thacker, J.D., Casale, E.S. ve Tucker, C.M. (1996). Immunoassays (ELISA) for rapid, quantitative analysis in the food-processing industry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 2680-2685. Topalakçı, B.H. (2007). Özel Ankara Güven Hastanesi Menülerinde Yer Alan Menülere Ait Standart Yemek Tariflerinin HACCP Sistemine Göre Düzenlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Ankara TSE (2003). Tehlike Analizi ve Kritik Kontrol Noktalarına (HACCP) Göre Gıda Güvenligi Yönetimi-Gıda Üreten Kuruluşlar ve Tedarikçiler İçin Yönetim Sistemine İlişkin Kurallar. TS 13001. Türk Standartları Enstitüsü, Ankara. TSE (2006). Gıda Güvenliği Yönetim Sistemleri – Gıda Zincirindeki Tüm Kuruluşlar İçin Şartlar. TS EN ISO 22000. Türk Standartları Enstitüsü, Ankara. Uğur, M., Nazlı, B. ve Bostan, K. (2001). Gıda Hijyeni. Teknik Yayınevi, İstanbul, 5758. 50 USDA (2013). Foodborne Illness: What Consumers Need to Know. Erişim 28.02.2015. http://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/food-safety. Ünlütürk, A. ve Turantaş, F. (1999). Gıda Mikrobiyolojisi. Mengi Tan Basımevi, İzmir. Valat, C., Champiat, D., N’Guyen, T.T.T., Loiseau, G., Raimbault, M. ve Montet, D. (2003). Use of ATP bioluminescense to determine the bacterial sensitivity threshold to a bacteriocin. Luminescense, 18, 254-258. Vilar, M.J., Rodríguez-Otero, J.L., Diéguez, F.J., Sanjuán, M.L. ve Yus, E. (2008). Application of ATP bioluminescence for evaluation of surface cleanliness of milking equipment. International Journal of Food Microbiology, 125 (3), 357-361. Whitehead, K.A., Smith, L.A. ve Verran, J. (2008). The detection of food soils and cells on stainless steel using industrial methods: UV illumination and ATP bioluminescence. International Journal of Food Microbiology, 127, 121–128. WHO (2013). Botulism. Erişim 28.02.2015. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs270/en/. Yang, Z., Li, Y.,ve Slavık, M. (1998). Use of antimicrobial spray applied with an inside – outside birdwasher to reduce bacterial contamination on prechilled chicken carcasses. Journal of Food Protection, 61(7), 829–832. Yılmaz, A., Güven, F.M.K., Korkmaz, İ. ve Karabulut, S. (2006). Acil Serviste Akut Zehirlenmelerin Retrospektif Analizi. Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 1 (28), 21-26. Yücel, P.K. ve Halkman, H.B.D. (2006). DEFT yöntemi ile gıdalarda mikroorganizma yükünün belirlenmesi. Gıda Dergisi, 31 (2), 123-129. 51 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Pınar Adı Soyadı ÖZ DoğumYeri Karataş/Adana DoğumTarihi 1984 Uyruğu T.C. TC Kim No Email [email protected] Tel 19291121714 05305696939 Eğitim Düzeyi Mezun Olduğu Kurumun Adı Mez. Yılı Doktora Yük.Lis. İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi 2015 Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Lisans Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi 2007 Lise Seyhan ÇEAŞ Anadolu Lisesi 2001 İş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın) Görevi Kırklareli 1. Veteriner Hekim 2. Süre (Yıl - Yıl) Kurum İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü Akredite Veteriner Hekim Adana İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü Hizmetleri 3. 2010 – Halen 2008 - 2010 - Yabancı Okuduğunu Dilleri Anlama* İngilizce Çok İyi Almanca Orta Konuşma* Yazma* KPDS/ÜD İ.Ü. Sağ. Bil. Enst. S Yabancı Dil Sınavı Puanı Çok İyi Çok İyi Orta Orta Puanı 73 52 *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin ALES Puanı Sayısal Eşit Ağırlık Sözel 70.408 70.128 78.285 (16.11.2008) (16.11.2008) (27.11.2011) (Diğer) Puanı Bilgisayar Bilgisi Program Kullanma becerisi Microsoft Office, Word, Exel, Powerpoint İyi Moviemaker İyi Yayınları/Tebligleri Sertifikaları/Ödülleri Öz, P. ve İzmirli, S. (2005). Son sınıf öğrencilerin alan seçimi üzerine bir tutum araştırması. 7. Uluslararası Veteriner Öğrenci Kongresi. 12-14 Mayıs, 2005, İstanbul. Özet Kitapçığı, 51-52. Sertifikalar 06-10 Nisan 2015 Diksiyon ve Etkili Konuşma Eğitim Programı, Uluslararası Tarımsal Eğitim Merkezi, Ankara 23-24 Şubat 2015 Kurumsal İletişim, Nitelikli Yönetim, Etkin ve Sonuç Odaklı Çalışan Eğitimi Sertifikası. Kırklareli İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü, Kırklareli 17-18 Şubat 2015 Sulu Tarım Alanlarında Sürdürülebilirlik Çalıştayı. Kırklareli İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü, Kırklareli 26 Ocak-06 Şubat 2015 Tarımsal Proje Hazırlama, Değerlendirme ve İzleme Eğitim Programı. Uluslararası Tarımsal Eğitim Merkezi, Ankara 03-14 Kasım 2014 Sunum Teknikleri ve Eğitim Araçları Kullanımı Kurs Bitirme Sertifikası. Adana Zirai Üretim İşletmesi Tarımsal Yayım ve Hizmetiçi Eğitim Merkezi, Adana 17-19 Nisan 2014 4. Geleneksel Gıdalar Sempozyumu. Çukurova Üniversitesi, Adana 53 07-18 Nisan 2014 Proje Hazırlama ve Proje Döngüsü Yönetimi Kursu. Adana Zirai Üretim İşletmesi Tarımsal Yayım ve Hizmetiçi Eğitim Merkezi, Adana 09-13 Eylül 2013 HACCP Tetkik Eğitimi. Bursa İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü, Bursa 13-17 Mayıs 2013 Temel HACCP Eğitimi. Konya İl Gıda Tarım ve Hayvancılık Müdürlüğü, Konya 19-23 Kasım 2012 Organik Tarım. Eğitim Yayım ve Yayınlar Dairesi Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı, Antalya 10-12 Eylül 2012 Proje Döngüsü Yönetimi (PCM) Eğitimi Sertifikası. Trakya Kalkınma Ajansı, Kırklareli 10-21 Ocak 2011 Bilgisayar Temel Eğitimi (Windows XP Pro, Ms Office 2003 WordExcel-Powerpoint, İnternet), Uluslararası Tarımsal Eğitim Merkezi, Ankara 03-06 Haziran 2010 1. Uluslararası Katılımlı Veteriner Hekimliği Kongresi. İstanbul Harbiye Askeri Müze Kültür Sitesi, İstanbul 19-20 Temmuz 2008 ISO 9001:2000 Kalite Yönetim Sistemi Kuruluş İçi Kalite Tetkikçi Eğitimi Sertifikası. Analiz Yönetim Danışmanlığı, Adana 07-09 Temmuz 2007 Akredite Veteriner Hekim Sertifikası. Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Konya 12-14 Mayıs 2005 7. Uluslararası Veteriner Öğrenci Kongresi Katılım Sertifikası. İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi, İstanbul Özel İlgi Alanları (Hobileri): Yüzme, Nesir Yazma, Fotoğrafçılık, Resim Yapma
