HPV-HL

KULLANICI KILAVUZU
Ampliquality
HPV-HL
Kod 03-31A
Kod 03-31R
Yüksek ve düşük onkojenik risk-ilişkili
genotiplerin tanımlanması için Human
Papillomavirus tiplendirme kiti
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
1. ÜRÜN BİLGİSİ ........................................................................................... 3
2. KİT İÇERİĞİ ............................................................................................... 4
3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI..................................................... 5
4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER .................................................................... 6
5. GÜVENLİK KURALLARI............................................................................ 7
5.1. Genel güvenlik kuralları........................................................................ 7
5.2. Kit hakkında güvenlik kuralları ............................................................. 8
6. KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER ......................... 9
6.1. Reaktifler .............................................................................................. 9
6.2. Cihazlar ................................................................................................ 9
6.3. Materyaller ........................................................................................... 9
7. REAKTİF HAZIRLAMA ............................................................................ 10
8. GİRİŞ ....................................................................................................... 11
9. TEST PRENSİBİ ...................................................................................... 12
10.
ÜRÜN TANIMI.................................................................................... 13
11.
ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ ........... 14
11.1. Sitolojik örnekler................................................................................. 14
11.2. Histolojik örnekler............................................................................... 14
12.
PROTOKOL ....................................................................................... 15
12.1. DNA ekstraksiyonu............................................................................. 15
12.2. DNA amplifikasyonu........................................................................... 15
12.2.1. TST gen amplifikasyonu ............................................................. 15
12.2.2. yüksek ve düşük risk HPV amplifikasyonu................................. 15
Page 1
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi.......................................... 17
12.3.1. Agaroz jel elektroforezi ............................................................... 17
12.3.2. Örnek yükleme............................................................................ 17
12.3.3. Sonuçların yorumlanması: TST ve HPV DNA amplifikasyonu.... 18
13.
SORUN GİDERME ............................................................................ 20
14.
TEST LİMİTLERİ................................................................................ 22
15.
TEST PERFORMANSI....................................................................... 22
15.1. Özgünlük ............................................................................................ 22
15.2. Duyarlılık ............................................................................................ 22
16.
REFERANSLAR................................................................................. 23
17.
İLGİLİ ÜRÜNLER ............................................................................... 24
Page 2
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
1. ÜRÜN BİLGİSİ
Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir:
HPV-HL (kod 03-31A)
Yüksek ve düşük risk onkojenik risk ile ilişkili Human Papillomavirus
genotiplerinin belirlenmesi için kit.
Amplifikasyon ve agaroz jelde görüntüleme için tüm reaktifleri içerir.
Kod
03-31A-25
03-31A-50
Ürün
HPV-HL
HPV-HL
Pkg
25 test
50 test
HPV-HL - amplifikasyon reaktifleri (Kod 03-31R)
Yüksek ve düşük risk onkojenik risk ile ilişkili Human Papillomavirus
genotiplerinin belirlenmesi için reaktifler.
Amplifikasyon için reaktifleri içerir.
Kod
03-31R-25
03-31R-50
Ürün
HPV-HL amplifikasyon reaktifleri
HPV-HL amplifikasyon reaktifleri
Pkg
25 test
50 test
Page 3
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
2. KİT İÇERİĞİ
DİKKAT! Farklı içerikler farklı kitler ile ilişkilidir.
(kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent)
KUTU P
kod
03-31A
kod
03-31R
– 20°C DE SAKLANIR
AÇIKLAMA
ETİKET
TÜP (T)
RENGİ
YA DA
KAPAK
25 test
50 test
8 test
X
X
Tek-doz premiks tüpleri
Yüksek risk 1
Kırmızı
(T)
25
50
8
X
X
Tek-doz premiks tüpleri
Yüksek risk 2
Sarı (T)
25
50
8
X
X
Tek-doz premiks tüpleri
Düşük risk
Yeşil (T)
25
50
8
X
X
Tek-doz premiks tüpleri
TST (thiosulfate
sulfurtranferase -rhodanese)
Mavi (T)
25
50
8
X
X
Thermostabil Taq DNA
polimerase
Kırmızı
100 μL
150 μL
30 μL
AB Taq
5 U/μL
KÜÇÜK ÇANTA
– 20°C DE SAKLANIR
25 test
50 test
8 test
X
HPV 16 genom parçası
İçeren plazmid DNA
Pozitif kontrol
YÜKSEK RİSK
1
HPV 16
Mavi
1X 60μL
1X 100μL
1X 20μL
X
X
HPV 18 genom parçası
İçeren plazmid DNA
Pozitif kontrol
YÜKSEK RİSK
2
HPV 18
Mavi
1X 60μL
1X 100μL
1X 20μL
X
X
HPV 6 genom parçası
İçeren plazmid DNA
Pozitif kontrol
DÜŞÜK RİSK
HPV 6
Mavi
1X 60μL
1X 100μL
1X 20μL
kod
03-31A
kod
03-31R
ETİKET
TÜP (T)
RENGİ
YA DA
KAPAK
X
AÇIKLAMA
Page 4
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
KUTU F
kod
03-31A
kod
03-31R
+2°/ +8°C DE SAKLANIR
X
0
X
0
X
0
AÇIKLAMA
Elektroforez için yükleme
buffer
Ethidium Bromide
solusyonu
(2,5 mg/mL)
DNA Moleküler Ağırlık
Markır
ETİKET
TÜP (T)
RENGİ
YA DA
KAPAK
25 test
50 test
8 test
6X Blue
Mavi
1X 300 μL
1X 600 μL
1X 100 μL
toksik
R23, 68
S 36/37 45
Kırmızı
1X 220 μL
1X 400 μL
1X 100 μL
MW Markır
Sarı
1X 250 μL
1X 500 μL
1X 90 μL
Ethidium
Bromide
KUTU A
kod
03-31A
kod
03-31R
+15°/ +25°C DE SAKLANIR
AÇIKLAMA
ETİKET
TÜP (T)
RENGİ
YA DA
KAPAK
25 test
50 test
8 test
X
0
Moleküler biyoloji için agaroz
AGAROZ
1X 27g
1X 54 g
1X 10 g
X
0
Elektroforez buffer
TRIS-Acetate-EDTA pH: 8,00
50X TAE
1X 90 mL
1X 180
mL
1X 30 mL
3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI
Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore
saklanmalıdır.
Özellikle:
KUTU P
Küçük çanta
KUTU F
KUTU A
-20°C de saklanır
-20°C de saklanır
+2°/ +8°C DE SAKLANIR
+15°/ +25°C DE
SAKLANIR
Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine
kadar stabil kalır.
Page 5
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER
•
Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve
tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır;
•
Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve
tamamen okuyun;
•
Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun;
•
Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın;
•
Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili
herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile
bağlantı kurun: [email protected];
Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri
almalıdır:
•
Filtreli uç kullanın;
•
Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve
tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde
saklanmalıdır.
•
PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında
materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın.
•
Sık sık eldiven değiştirin.
•
Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin.
•
Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA
polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA
purifiye edin.
Page 6
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
5. GÜVENLİK KURALLARI
5.1. Genel Güvenlik Kuralları
•
Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın
ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın.
•
Ağızla pipetleme yapmayın.
•
Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti
etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul
edip o şekilde kullanmak gerekir;
•
Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu
ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin
kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile
temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel
konteynerlere atılmalıdır.
•
Klinik örnekler, materyaller ve kontamine
dekontaminasyondan sonra atılmalıdır:
ürünler
aşağıdaki
30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit
solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna
batırılmalı
YA DA
en az 2 saat 121°C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren
solusyonları otoklavlamayın !!)
Page 7
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları
Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir:
Tehlikeli Komponentler:
•
ETHIDIUM BROMIDE (03-31A kit içinde bulunur)
3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2%
Risk tanımı:
T (Toksik)
RİSK İBARESİ VE S İBARESİ
R 23 ve R 68
S 36/37 45
İnhalasyon için toksik.
Geri dönülmez etkiler riski.
Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın.
Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve
paket etiketini gösterin.
R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir.
Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar.
Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin
kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar
giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin.
Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım
için yasal kuralları takip edin.
Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile
temizleyin.
İstenildiğinde ürünlerin Materyal Güvenlik Data Sheetleri gönderilebilir.
Page 8
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
6. KİT
İÇERİĞİNDE
MATERYALLER
BULUNMAYAN
GEREKLİ
6.1. Reaktifler
•
•
•
•
DNA ekstraksiyonu için reaktifler;
Steril DNase ve RNase free su;
Distile su;
Agaroz jelde elektroforez ile DNA görüntülemesi için reaktifler (03-26R kiti
gerektirir).
6.2. Cihazlar
• Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon
premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA
eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir);
• Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µL; 0,5-10 µL; 2-20 µL);
• Thermalcycler;
• Tartı;
• Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm);
• Vorteks;
• Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga;
• Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir);
• Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi;
• Güç kaynağı (50-150 V);
• UV Transilluminator;
• Foto kamera ya da imaj analizör.
6.3. Materyaller
•
•
•
•
•
Tek kullanımlık eldivenler;
Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µL; 0,5-10 µL; 2-20 µL);
TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L);
Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker;
Parafilm.
Page 9
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
7. REAKTİF HAZIRLAMA
1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için:
20 mL 50X TAE (03-31A kitinde bulunur) ile 980 mL distile su karıştırın.
Page 10
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
8. GİRİŞ
Human Papillomavirus (HPV) özellikle bölge-spesifiktir: Host hücrelerinin
farklılaşmasının derecesi ile ilişkili aktiviteye sahip geçirgen hücreler içinde
viral partiküllerin sentezi ve üretimine neden olan çok katmanlı skuamoz
epitelyumi enfekte eder.
HPV partikülleri sirküler, çift-iplikli DNA ve farklı HPV tiplerinde farklı olabilen
yapısal proteinler içerir: En çok görülen protein L1 (kapsid yapısal protein)
dir. Ayrıca, virus replikasyon siklusunun ilk fazında eksprese olan E (erken
ve prekosiyöz) isimli proteinler vardır.
E1 ve E2 proteinleri viral replikasyonun başlangıcında çalışır ve viral
genomun transkripsiyonunu düzenlerken, E5, E6 ve E7 gibi diğer proteinler
enfekte hücrelerin proliferasyon ve neoplastik transformasyonuna neden
olarak HPV onkojenik gücünden sorumludurlar (Stoler M.H., 1997).
Şimdiye kadar 100 farklı HPV tipi tanımlanmıştır; bunların arasından 35 den
fazlası ano-genital bölgeyi (kondilomlar) enfekte eder ve yaklışık 20 si
genital karsinoma ile ilişkilidir.
HPV dizisi varlığı skuamoz hücreli invaziv servikal karsinomaların %90 dan
fazlasında, kondilomlarda ve sıklıkla intraepitelyum servikal karsinomalarda
tanımlanmıştır (Broker TR ve ark., 1986).
Patoloji temelinde (selim ya da malignan) en sık ilişkili olduğu HPV tipleri
düşük, orta ve yüksek malignan riskte ayırt edilebilir. HPV 6, 11, 34, 40, 42,
43, 44, 53, 54, 70 ve 74 onkojenik düşük risk, genotip 16, 18, 31, 35, 39, 45,
51, 52, 56, 58, 59, 66 ve 68 onkojenik yüksek risk olarak tanımlanır (Zur
Hausen H., 1996). Avrupada servikal kanser HPV tip 16 ile %50 den fazla,
HPV tip 18 ile %10-15, HPV tip 31 ile %7-8 ile ilişkili iken, kalan %20 si daha
az genel tipler ile ilişkilidir.
Servikal kanserin erken tanısı için temel metod, daima HPV tiplendirmesine
de izin veren sito-histolojik tanının duyarlılık ve özgünlüğünü artırmaya
yardımcı moleküler biyolojik testler ile ilişkili olan Pap Testtir.
Dahası, devamlı ASCUSlu (Atipik Skuamoz Hücre Belirsiz Anlam) ya da
düşük derece lezyonlu hastalarda direk moleküler biyoloji testleri ile viral
DNA varlığının belirlenmesi gereklidir. Bu bayanlarda yüksek onkojenik risk
ile bir viral alttipin varlığı ya da yokluğunun tanımlanma olasılığı ya olası
hastalık ya da spontane duraksamanın belirtisi olabilir.
HPV in vitro kültür için iyi bir teknik olmadığından (Beutner KR, 1997) HPV
enfeksiyonu için tanı DNA amplifikasyonu ile viral dizilerin araştırılmasına
dayanır.
Page 11
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
9. TEST PRENSİBİ
PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu
metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase
ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon
reaksiyonu olarak tanımlanabilir.
Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli
DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid “primerler” kalıp DNA
ya spesifik olarak dizayn edilmiştir.
DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine
başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin
(dNTPler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile
aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra,
hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir.
Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar.
Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin
yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye
edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir.
Page 12
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
10. ÜRÜN TANIMI
HPV genotipleri ile ilişkili farklı onkojenik özellikler, yüksek duyarlı virus varlığı
ile HPV tiplerini belirleyebilen ve yüksek ve düşük risk HPV tanımlayabilen
diagnostik test gerektirir. Bu kitte kullanılan metod viral genomun E6 ve E7
bölgelerinin amplifikasyonu için üç eş zamanlı PCR reaksiyonunu içerir. 10
HPV yüksek-risk genotipi (HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58) ve iki
HPV düşük risk tipini (HPV 6 ve 11) tanımlar.
Bu metod, sitolojik örneklerden (servikal swablar, ağızdan hücreler) ve doku
örneklerinden (taze, donmuş ya da formalin-fikse ve parafine-gömülü
biyopsiler) ekstrakte DNA kullanabilir.
Metod, bölge 22q13.1 de (amplifikasyon kontrol) TST (thiosulfate
sulfurtransferase rhodanese) geni amplifikasyonu ile ekstrakte DNA nın
uygunluğunu değerlendirebilir. TST gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç
ya ekstrakte DNAda amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görüldüğünü
ya da DNAnın oldukça yıkıldığını işaret eder.
Bu metod olası yanlış negatif sonuçların tanımlanmasını sağlar ve ekstra
zaman gerektirmez çünkü TST gen amplifikasyonu HPV ilk amplifikasyonu ile
aynı dönemde uygulanır.
Kit, amplifikasyon ve HPV DNA 18, 16 ve 6 tiplendirmesi için pozitif kontroller
içerir. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir çünkü viral genomun bir
parçasını içeren plazmidik DNA dır.
Pozitif kontrolün başarılı amplifikasyonu reaksiyonun doğru çalıştığını garanti
eder.
Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve
Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test
tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı
ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar
tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format
kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur.
Bu nedenle, daima uygun amplifikasyon kontrollerini kullanmayı önerir.
Page 13
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
11. ÖRNEK TOPLAMA,
MUAMELESİ
11.1.
MANİPULASYON
VE
ÖN-
Sitolojik örnekler
Sitolojik örnekler servikal vajinal sıvı, oral hücreler vs. dir. Örnekler kazıcı ya
da steril sito-fırça kullanılarak elde edilir. Toplanan hücreler uygun transport
medyumlarında seyreltilir (1XPBS, fizyolojik solusyon ya da diğer
medyumlar).
Örnek +2 / +8°C de maksimum 48 saat için saklanabilir; sonra nukleik asit
ekstraksiyonu ile kullanmak için daha iyidir.
Kısa bir zaman içinde örneklerin ekstraksiyonunun yapılması mümkün
değilse, örnekler -20°C de saklanmalıdır.
AB ANALITICA, sitolojik örnek toplama için HPV-SCK kit (kod. 03.33) önerir.
11.2.
Histolojik örnekler
Histolojik örnekler taze, donmuş, formalin fikse ve parafine gömülü deri
biyopsileridir.
Taze biyopsiler toplamadan birkaç dakika içinde çalışılmalı veya likit nitrojen
ile hızlıca dondurulmalıdır ve sonra enzimatik sindirimi takiben steril kesici
kullanarak mekanik kesilmeye kadar -80°C de saklanmalıdır, Proteinaz K ile
sindirim ile takip etmelidir.
Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve
potasyum tuzları ile pH 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer
olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan
formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun
değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana
getirirler.
Page 14
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
12. PROTOKOL
12.1.
DNA ekstraksiyonu
DNA ekstraksiyonu tam ve saf DNA elde edebilen herhangi bir metod ile
yapılabilir.
TST ve yüksek-düşük risk HPVamplifikasyonu (20 μL) için paragraph 12.2 de
belirtilen ekstrakte DNA miktarı AB ANALITICA metodu ile elde edilen
ekstrakte miktar için referanstır. Alternatif ekstraksiyon metodları
kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı 20 μL den
düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır.
12.2.
DNA AMPLİFİKASYONU
12.2.1.
TST gen amplifikasyonu
Her bir örnek için, aşağıdaki gibi premiks tüplerine AB Taq ve DNA ekleyin:
Komponent
Mavi tüp
AB Taq
DNA
12.2.2.
Miktar
29.5μL
0,5 μL
20 μL
Yüksek ve düşük risk HPV amplifikasyonu
Her bir örnek için, aşağıdaki gibi 3 farklı premiks tüpüne AB Taq ve DNA
ekleyin:
YÜKSEK RİSK 1
Komponent
Kırmızı tüp
AB Taq
DNA
Miktar
29,75 μL
0,25 μL
20 μL
Page 15
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
YÜKSEK RİSK 2
Komponent
Sarı tüp
AB Taq
DNA
Miktar
29,75 μL
0,25 μL
20 μL
Komponent
Yeşil tüp
AB Taq
DNA
Miktar
29,75 μL
0,25 μL
20 μL
DÜŞÜK RİSK
Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA
yerine su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (20 µL herbir pozitif control kit içinde
bulunur) amplifiye edilmelidir.
Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini (TST ve HPV) aşağıdaki
programda thermalcyclera koyun:
1 cycle
35 cycles
1 cycle
95°C
5 min
94°C
1 min
55°C
1 min
72°C
1 min
72°C
5 min
Amplifikasyon fragman uzunluğu:
TST:
HPV YÜKSEK RİSK 1:
HPV YÜKSEK RİSK 2:
HPV DÜŞÜK RİSK:
202 bp
230-270 bp
230-270 bp
230-270 bp
Page 16
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
12.3.
Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi:
12.3.1.
Agaroz jel elektroforezi
%3 agaroz jel hazırlayın: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 mL 1X TAE içine dökün.
Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine
bırakın. Jelin soğumasına izin verin (3-5 dakika), sonra 10 μL 2.5 mg/mL
Ethidium Bromide solusyonu ekleyin.
NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven
kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen
kimyasal güvenlik kabini altında çalışın.
Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında
soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun.
Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye
dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak
şekilde (jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) uygun miktarda 1X TAE buffer dökün.
12.3.2.
Örnek yükleme
Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın:
2 µL 6X Blue*
10 µL PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markır)*
Miksi jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı 80-100 V a
ayarlayın. Çalışma sonunda, jeli UVtransilluminatore koyun ve amplifikasyon
ürünlerinin boyutunu referans DNA Moleküler Ağırlık Markır ile karşılaştırarak
sonuçları analiz edin.
* = 6X Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markır 03-31A kit içinde bulunur; Başka bir yükleme
buffer ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır kullanıldığında sağlayıcı bilgilerini takip edin.
*DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW):
501-489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp.
%3 agaroz jelde 501-489 bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir
bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %3 agaroz jelde bazen görünmek
için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı).
Page 17
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima
eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün
koruyucu ekranını kullanın.
12.3.3.
Sonuçların yorumlanması: TST ve HPV DNA amplifikasyonu
Agaroz jel elektroforezinden
göstermelidir:
sonra,
KONTROL
Pozitif kontrol
SONUÇ
pozitif
Negatif kontrol
negatif
kontroller
aşağıdaki
sonuçları
YORUM
Amplifikasyon
doğru
çalışmıştır
Kontaminasyon yokluğu
Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin:
DNA bandı
TST band
SONUÇ
yok
YORUM
Örnek amplifikasyon için
uygun değildir
(DNA ekstraksiyonunu tekrar
edin)
TST band
var
HPV yüksek risk 1 band
ve/veya
HPV yüksek risk 2 band
var
Amplifiye olabilir örnek
ve aşağıdaki HPV
genotiplerinden biri için
pozitif: 16, 18, 31, 33, 39,
45, 51, 52, 56 ya da 58.
TST band
HPV düşük risk band
var
var
TST band
Üç
amplifikasyonunda
band
Amplifiye olabilir örnek
ve HPV genotip 6 ya da 11
İçin pozitif
var
HPV yok
HPV
Amplifiye olabilir örnek ve
HPV genotip testi için negatif
örnek.
Page 18
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
1
2
3
4
5
Fig. 2:
Dört amplifikasyon reaksiyonunun pozitif
kontrollerin %3 agaroz jel elektroforezi
İle görüntülenmesi.
1. DNA Moleküler Ağırlık Markır
2. Amplifikasyon kontrol TST
3. YÜKSEK RİSK 1 amplifikasyon için pozitif kontrol: HPV 16
4. YÜKSEK RİSK 2 amplifikasyon için pozitif kontrol: HPV 18
5. DÜŞÜK RİSK amplifikasyon için pozitif kontrol: HPV 6
Page 19
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
13. SORUN GİDERME
Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa
• TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir
- -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μL);
- -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu
basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde
çözülür;
- Alternative olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel
olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin.
•
Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır
- Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki
sıcaklık profilini kontrol edin.
•
Kit uygun şekilde çalışmaz
- Premiks, enzimler ve referans DNAyı -20°C de saklayın;
- -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının.
Test edilen örneklerde ya TST ya da HPV için amplifikasyon bandı
yoktur, fakat Pozitif kontrol için iyi bir band vardır
• Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler:
-
Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru
şekilde takip ettiğinizden emin olun;
- Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun;
- Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın.
•
Amplifikasyon inhibe olmuştur
- Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin;
- Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin;
- Ekstraksiyon protokolünün doğru yapıldığından emin olun (yukarıdaki
durumları referans alın) ve yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrar edin;
Page 20
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik
ürün ya da ekstraband görülmesi
• Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın
-
Thermalcycler değişikliklerini uygulayın.
• Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman
alır.
-
Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın;
Buz üzerinde çalışın.
• Ekstrakte ürünler saflaşmamıştır
-
Örnekleri iyi saflaştıran bir ekstraksiyon sistemi kullanın.
• Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir
-
Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak
tekrarlayın;
- Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun.
Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin.
[email protected], faks (+39) 049-8709510, ya da tel. (+39) 049761698.
Page 21
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
14. TEST LİMİTLERİ
Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır:
Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış histolojik
örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın).
Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan
ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz.
15. TEST PERFORMANSI
15.1.
Özgünlük
Yüksek ve düşük onkojenik risk HPV amplifikasyonu için bu kitte kullanılan
primerler, belli HPV genotiplerinin tanımlanması için klinikörneklerde valide
edilmiş spesifik konsensus primerlerdir.
Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile
çapraz reaksiyon görülmemiştir.
15.2.
Duyarlılık
Kitin analitik duyarlılığı, HPV negatif hastalardan alınan insan servikal
swablardan ekstrakte genomik DNA da seyreltilmiş HPV 16 genomunun bir
kısmını içeren plazmid DNA nın farklı konsantrasyonlarını kullanarak
değerlendirilmiştir.
Test, 10 hücrede viral DNA nın 1 kopyasını tanımlamayı sağlayan metodu
içerir.
Page 22
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
16. REFERANSLAR
Beutner KR, Amer J Med, 102,9-15, 1997
Broker TR, Botcham M, DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, pp.17-36, 1985
Karlsen F, Kalantari M, Jenkins A, et al., J Clin Microb, 34, 2095-2100, 1996
Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim,
Science 230, 1350-1354, 1985
Stoler M H, Pathology Case Reviews 2:1, 8-16, 1997
Zur Hausen H, Biochim Biophys Acta, 1288: F55-F78, 1996
Consensus Guidelines, Bethesda 2001
Congresso Nazionale Associazione Microbiologi Italiani, Bari 12-15 giugno
2001, ABSTRACT G066
Page 23
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
17. İLGİLİ ÜRÜNLER
HPV-HS Bio:
L1 proteini için gen bölgesinin DNA amplifikasyonu ile Human Papillomavirus
yüksek-duyarlı taraması ve tiplendirmesi için kit.
Metod yaklaşık 30 HPV genotipinin (viral genomun 10 kopyasına kadar)
varlığını belirleyebilir.
Biotinli nested PCR ürünleri striplerde reverse hibridizasyon ile tiplendirme
için kullanılır (HPV-STRIP, kod 03-24R-20).
Kod
03-23A
03-23R
Ürün
HPV-HS BIO
HPV-HS
Bio
reaktifleri
Pkg
25 / 50 test.
amplifikasyon 25 / 50 test.
HPV-STRIP:
Striplerde alel spesifik reverse hibridizasyon ile Human Papillomavirus için
tiplendirme sistemi.
İt, HPV-HS-Bio kiti (kod 03-23) ile elde edilen PCR ürünleri ile kullanılır.
Kod
Ürün
03-24R-20 HPV-STRIP
Pkg
20 test
HPV-SCK:
Human Papillomavirus belirlemek için örnek toplama kiti.
Kod
Ürün
03-33R-10 HPV-SCK
Pkg
100 test
Page 24
03-31A-25_8033622780526_TR.doc
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: [email protected]