kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve cisplatin uygulamasının
advertisement
KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman POLAT Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Tez Danışmanı Doç. Dr. Adem KARA Yüksek Lisans Tezi - 2015 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman POLAT Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Tezi Tez Danışmanı Doç. Dr. Adem KARA ERZURUM 2015 T.C. ATATÜRK ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIP HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KOLOREKTAL KANSER HÜCRELERİNDE MELATONİN VE CİSPLATİN UYGULAMASININ OTOFAJİ VE APOPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI Süleyman POLAT Tez Savunma Tarihi : 06.11.2015 Tez Danışmanı : Doç. Dr. Adem KARA Jüri Üyesi : Prof.Dr.Bünyamin ÜNAL Jüri Üyesi : Yrd. Doç. Dr. İsmail CAN Onay Bu çalışma yukarıdaki jüri tarafından Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Yavuz Selim SAĞLAM Enstitüsü Müdürü Yüksek Lisans Tezi ERZURUM 2015 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR .................................................................................................................. IV ÖZET .............................................................................................................................. V ABSTRACT ................................................................................................................... VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ............................................................. VII ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................VIII TABLOLAR DİZİNİ ..................................................................................................... X 1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER .................................................................................................... 3 2.1. Kanser ........................................................................................................................ 3 2.2. Kanser Patogenezisi ................................................................................................... 4 2.3. Hücre Siklusu ve Karsinogenez ................................................................................. 5 2.4. Kolon Kanseri ............................................................................................................ 9 2.4.1. Kolon Kanseri Patogenezi ...................................................................................... 9 2.4.2. Kolorektal Kanser Etiyolojisi ............................................................................... 10 2.5. Kanserogenezde Tedavi Seçenekleri ....................................................................... 15 2.6. Hücre ölümü ............................................................................................................ 16 2.6.1. Apoptozis .............................................................................................................. 17 2.6.2. Otofaji ................................................................................................................... 20 2.7. Cisplatin Etki Mekanizması ..................................................................................... 25 2.7.1. Cisplatinin doz sınırlayıcı etkileri; ........................................................................ 27 2.8. Kanser Tedavisinde Antioksidanların Rolü ............................................................. 27 2.9. Melatonin ................................................................................................................. 28 2.9.1. Melatonin Hormonunun Biyosentezi ve Salgılanması ......................................... 29 2.9.3. Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi ............................................. 30 3. MATERYAL VE METOT ....................................................................................... 32 3.1. Hücre Kültürü .......................................................................................................... 32 3.1.1. Hücre Kültür Medyumunun Hazırlanışı ............................................................... 32 3.1.2. Hücre İnkübasyon Koşulları ................................................................................. 32 I 3.1.3. Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing) ............................................................... 32 3.1.4. Hücre Dondurma ve Saklanması .......................................................................... 33 3.1.5. Hücre Sayılarının Hesaplanması ........................................................................... 33 3.2. Hücre Canlılığı Analizi ............................................................................................ 34 3.2.1. MTT Yöntemi ....................................................................................................... 34 3.2.2. Yapılış Yöntemi .................................................................................................... 34 3.3. Tunel Boyama Metodu ............................................................................................ 35 3.3.1. Hücrelerin lamda üretilmesi.................................................................................. 35 3.3.2. Fiksasyon .............................................................................................................. 36 3.3.3. Tunel Boyama ....................................................................................................... 36 3.3.4. Tunel Pozitif Hücre Değerlendirmesi ................................................................... 37 3.4. Kantitatif Real Time PCR (qRT-PCR) Analizleri ................................................... 38 3.4.1. RNA İzolasyonu ................................................................................................... 38 3.4.2. cDNA Sentezi ....................................................................................................... 39 3.4.3. Real Time PCR Cihazına Yükleme Aşaması ....................................................... 39 3.4.5. RT-PCR (Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA Ekspresyonlarının Ölçülmesi .... 41 3.4.6. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA Ekspresyon Tayininde Roche Lightcycler 480 Real-Time PCR Cihazı ......................... 41 3.5. İstatistiksel Analiz.................................................................................................... 42 4. BULGULAR .............................................................................................................. 43 4.1. MTT Sitoksisite Sonuçları ....................................................................................... 43 4.2. Tunel Analizi Sonuçları ........................................................................................... 44 4.3. mRNA ekspresyonu Değerleri Sonuçları ................................................................ 50 4.3.1. TP53 mRNA ekspresyonu değerleri ..................................................................... 50 4.3.2. MDM2 mRNA ekspresyon değerleri .................................................................... 52 4.3.3. CDKN1A (P21) mRNA ekspresyonu değerleri.................................................... 54 4.3.4. CDKN1B (P27) mRNA ekspresyonu değerleri .................................................... 56 4.3.5. BECLİN1 mRNA ekspresyonu değerleri ............................................................. 58 4.3.6. ATG-4 mRNA ekspresyonu değerleri .................................................................. 60 4.3.7. LC3 mRNA ekspresyonu değerleri....................................................................... 62 5. TARTIŞMA ............................................................................................................... 64 6. SONUÇ VE ÖNERİLER.......................................................................................... 70 II KAYNAKLAR .............................................................................................................. 71 EKLER .......................................................................................................................... 82 EK 1. ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 82 EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU ....................................................................... 83 III TEŞEKKÜR Yüksek lisans tezi olarak sunduğum bu çalışmanın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen yapıcı, yönlendirici değerli bilgi, tecrübe ve katkılarıyla bana daima yol gösteren öğrencisi olmaktan mutluluk duyduğum danışman hocam Doç. Dr. Adem KARA ‘ ya sonsuz teşekkür ederim. Tez çalışmam süresince yardım ve birikimlerinden yararlandığım Prof. Dr. Bünyamin Ünal’a ve Histoloji ve Embriyoloji Anabilim dalı öğretim üyeleri ile eğitim öğretimim sırasında ilgi ve desteklerini esirgemeyen Atatürk Üniversitesi Acil Biyokimya çalışma arkadaşlarıma, rahmetle andığım dostum Recep TEPE’ye, yoğun eğitim dönemim boyunca sabırla beni destekleyen eşime ve evlatlarım Mustafa Göktuğ Tuğsem Yüsra’ ya dualarını esirgemeyen anneme, babama ve büyüklerime, bana selam veren ve alan insanlara, varlığıma şahit olan doğada bulunan bütün varlıklara teşekkür ederim. Süleyman POLAT IV ÖZET Kolorektal Kanser Hücrelerinde Melatonin ve Cisplatin Uygulamasının Otofaji ve Apoptoz Üzerine Etkilerinin Araştırılması Amaç: Melatonin vücutta salgılanan ve güçlü bir antioksidan madde olup günümüzde anti-kanser etkileri önemle çalışılmaktadır. Cisplatin ise birçok kanser türü tedavisinde kullanılan ve vücuda önemli toksik bir etki bırakan platin grubu kemoterapotik ajandır. Çalışmada HT-29 insan kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının otofajik ve apoptotik etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot: Tüm uygulamalar in vitro şartlarda insan kolon kanseri hücrelerinde (HT-29) gerçekleştirildi. Melatonin 5 ve 10 nM ve cisplatin 50 µM dozlarda uygulanarak 24 ve 48 saat süre ile inkübe edilen gruplarda sitotoksisite değerlendirmesi için MTT analizi kullanıldı. Tunel analizi ile apoptotik hücreler belirlendi. Ayrıca BECLİN1, ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3 genleri mRNA ekspresyonu seviyeleri kantitatif Real-Time PCR yöntemiyle belirlendi. Bulgular: Çalışma MTT sonuçlarında 24-sa inkübasyon gruplarında en yüksek toksik etkinin cisplatin uygulamasıyla olduğu görülürken, melatonin grupları önemli oranda sitotoksik olmamışlarıdır. Kırk-sekiz saatlik gruplardaysa melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının sitotoksik olduğu belirlendi. Ayrıca, tunel analizlerinde ciplatin ve/veya melatonin gruplarında pozitif hücre yoğunluklarının hem 24-saat hemde 48-saat inkübasyon gruplarında kontrol grubuna göre artmış olduğu görüldü. apoptotik ve otofajik genlerdeki mRNA ekspresyon seviyelerinin melatonin ve/veya cisplatin uygulaması ile değiştiği tespit edildi. Sonuç: Bu çalışmanın sonuçları apoptotik ve otofajik etkinliğin melatonin ve cisplatinmelatonin kombine uygulamaları ile anlamlı düzeyde etkilendiğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Apoptoz, , cisplatin, kolon kanseri, melatonin, otofaji V ABSTRACT Investigation the Effects of Melatonin and Cisplatin Treatment on Autophagy and Apoptosis in Colorectal Cancer Cells Aim: Melatonin is a powerful antioxidant agent and produced in the body what anticancer effects has been investigated. Also, cisplatin is a platinum group chemotherapeutic agent, which has used for treatment of many cancer types and it has severe toxic effect on body. In the present study, it was aimed to investigate the apoptotic and autophagic effects of melatonin and/or cisplatin treatment on HT-29 human colorectal cancer cells. Material and Method: All experiments were performed in human colon cancer cells (HT-29). Doses of Melatonin 5 and 10 nM and cisplatin 50 µM were treated with colon cancer cells for 24 and 48 hours incubation groups and MTT analysis was used for evaluation of cytotoxicity. Quantitative Real time PCR was used to determine the mRNA expression levels of TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 and LC3 genes. Results: In the analysis of MTT, while it was seen that cisplatin showed the highest cytotoxicity in 24 hours period, melatonin groups has showed no severe cytotoxicity in 24 hours period. In addition, 48 hours incubation groups, there were cytotoxic effect in the groups of cisplatin and/or melatonin. As well as in the Tunel analysis, there were increased positive cell densities in the groups of cisplatin and/or melatonin for 24 and 48-hours incubation periods. Changed levels of expression of mRNA apoptotic and autophagic genes in cisplatin and/or melatonin groups. Conclusion: The results of current study revealed that melatonin and combined of melatonin and cisplatin treatments significantly effected apoptotic and autophagic activities. Key words: Apoptosis, autophagy, cisplatin, colon cancer, melatonin VI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ APC : Adenomatous Polyposis Coli ATG : Autophagy-related proteins (Otofaji ilişkil proteinler) CAMKK2 : Kalmodulin bağımlı protein kinaz 2 CDDP : Cis-dimminedichloroplatinum II CDKs : Siklin-bağımlı kinazlar DCC : Deleted in colorectal carcinoma (Silinmiş kolorektal karsinoma) DMSO : Dimetilsülfoksit DNA : Deoksiribonükleik asit ER : Endoplazmik retikulum FAP : Familial adenomatous polyposis (Ailesel Adenomatöz polipozis) G0 : Gap 0 G1 : Gap 1 G2 : Gap 2 GTP : Guanozin trifosfat IAP : İnhibitors of apoptosis (Apoptoz baskılayıcılar) MMR : Mismatch repair gen, yanlış onarılmış gen mTOR : Mammalian target of rapamycin (Memeli rapamisin hedefi) NPCC : Hereditary non-polyposis colorectal carcinoma (Herediter non-polipoz kolorektal karsinoma) PBS : Fostat tampon solüsyonu pRb : Retinoblastoma proteini qRT-PCR : Kantitatif rReal time polimeraz zincir reaksiyonu RNA : Ribonükleik asit ROS : Reaktik oksijen türleri S : Sentez fazı TNF : Tümör nekroz edici faktör TOR : Target of rapamycin (Rapamisin hedefi) TP53 : Tümör protein 53 VII ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil No Şekil 2.1 Sayfa No Hücre siklusu, siklinler ve CDKs ilişkisi ( mitoza G2 fazının geçişini artırır) komplekslerinin aktivitesini artırır ......................................... Şekil 2.2. 7 Hücre siklusunun düzenlenmesinde siklinler, CDK ve CDK inhibitörlerinin rolü ............................................................................. 9 Şekil 2.3. Cisplatin moleküler yapısı .................................................................. 26 Şekil 2.4. Cisplatine karşı gelişen direnç mekanizması ...................................... 27 Şekil 2.5. Melatonin salgılanmasının fizyolojisi ................................................. 30 Şekil 3.1. Stereolojik “Optik Fractionator Frame” metodu ile tunel pozitifliğinin değerlendirilmesi ........................................................... 38 Şekil 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçları .............................................................................................................. 43 Şekil 4.2. Kontrol grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.3. Mel-5µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.4. 48 Mel-10µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.10. 47 Mel-5µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.9. 47 Kontrol grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.8. 46 Mel-10µM- Cis grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ..................................... Şekil 4.7. 46 Cisplatin grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.6. 45 Mel-10µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... Şekil 4.5. 45 48 Cisplatin grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ............................................... 49 VIII Şekil 4.11. Mel-10µM- Cis grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü ...................................... 49 Şekil 4.12. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri ............................................................................ 51 Şekil 4.13. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri ............................................................................ 53 Şekil 4.14. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri ............................................................................ 55 Şekil 4.15. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri ............................................................................ 57 Şekil 4.16. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri ............................................................................ 59 Şekil 4.17. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... Şekil 4.18. 61 Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 63 IX TABLOLAR DİZİNİ Tablo No Sayfa No Tablo 3.1 cDNA sentezi reaksiyon karışımı ...................................................... 39 Tablo 3.2. cDNA sentezi için PCR sıcaklık ve süre basamakları ....................... 39 Tablo 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçlar .. Tablo 4.2. 43 Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait 1000 µm2 alandaki Tunel pozitif hücre yoğunlukları ........................................................ Tablo 4.3. 44 Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 51 Tablo 4.4. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 53 Tablo 4.5. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 55 Tablo 4.6. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 57 Tablo 4.7. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 59 Tablo 4.8. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 61 Tablo 4.9. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri ........................................................................... 63 X 1. GİRİŞ Kanser hem çevresel hem de kalıtsal faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan mortalitesi yüksek bir hastalıktır. Kanser genellikle deoksiribonükleik asit (DNA) hasarına bağlı olarak normal hücrelerden orijinlenmektedir. Bununla birlikte bazı kanserlerin anne babanın DNA’larındaki hasara bağlı olarak ta kalıtımsal olarak meydana geldiği belirtilmektedir. Kanserde ölüm oranlarının yüksek olması da bu hastalığın insan sağlığı açısından önemini daha da artırmaktadır.1 Kolon kanseri genetik ve epigenetik değişimlere bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Kolon kanserinin meydana gelmesinde beslenme tarzının çok önemli olduğu belirtilmektedir. Yağ ve protein oranı yüksek fakat fiber oranı düşük meyve ve sebzelerle beslenmenin bu hastalığın oluşumunu artırdığı belirtilmektedir.2,3 Hücre ölümünün düzenlenmesi embriyolojik gelişim ve doku hemostazisi için önemli bir aşamadır. Son yıllarda hücre ölümünü kontrol eden birçok yolak hücre ve dokuda tarif edilmiştir. Hücre ölümü sırasında oluşan morfolojik değişikliklerin, apoptoz ile mi yoksa tip II programlı hücre ölümü olarak bilinen otofaji sonucunda mı oluştuğunun tanımlanabilmesi zordur.4 Bununla birlikte, otofajik ve apoptotik hücre ölümü arasında biyokimyasal ve morfolojik farklar bulunmaktadır. Otofajide, kaspaz uyarımı ve DNA parçalanması ortaya çıkmaz. Otofaji hücresel organellerdeen olan mitokondri, golgi gibi sitoplazmik organelleri ve sitoplâzma parçalayan inta sitoplazmik keselerin ortaya çıkmasıyla tanımlanır. İnta sitoplazmik keselerin ortaya çıkmasında etkili olan hücrenin yoğunluğu, oksijen miktarının konsantrasyonu, ısı, hormonların etkisi ve besin miktarı gibi durumların otofaji mekanizmasında önemi bulunmaktadır. Apoptozda, hücre iskelet proteinlerinde erken yıkım olayı ortaya çıkarken organeller geç aşamaya kadar varlıkları sürdürürler. Otofaji de ise bu durum farklıdır, organeller erken yıkıma uğrar ve geç döneme kadar hücre iskelet elementleri parçalanmaz. 1 Cisplatin uygulaması ile kanser hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyon artışının uyarılması sonucunda kemoresistans gelişimi bildirilmiştir.6 Bu direnci ortadan kaldırmak için cisplatinin yüksek dozlarda uygulanması gerekmektedir ancak yüksek dozlarda cisplatinin nefrotoksisite ve hepatotoksisite gibi toksik etkileri ortaya çıkarmaktadır.7, 8 Dolayısıyla, bu kemoterapötiklerden birkaçının kombine kullanımı ya da antioksidan bir madde ile kombine kullanımı son yıllarda birçok kanser tedavisinde başvurulan seçeneklerden birisi olmaktadır. Böyle kombine kullanımın sonucu olarak kanser tedavisinde daha etkin bir sonuç ve daha düşük toksisitenin oluşması sağlanabilmektedir.9 Diğer taraftan melatoninin kanser hastalarında biyolojik regülasyonu düzenleyerek yeni tümör oluşumlarını engellediği ve kanser hastalarının yaşam kalitesini iyileştirdiği görülmüştür.10 Bu amaçla, bu çalışmada, melatonin ve/veya cisplatin kullanımının kolorektal kanser hücreleri üzerindeki sitotoksik, apoptotik ve otofajik etkinliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kanser Kanser, yüzyıllar öncesinen günümüze kadar gelinen süreçte etkisini sürdürmekte ve insanları geçmişte olduğundan daha fazla tehdit eden ölümcül bir hastalık olmaktadır. Kanser terimini ilk olarak, Yunan fizikçi Hippocrates (MÖ 460-370) tarafından tanımlanmaya çalılşılmıştır. Yunan fizikçi Hippocrates “carcinos ve carcinoma” terimlerini ülser oluşumuna sebep olan ve ülser oluşturmayan tümörler için kullanmıştır. Bununla birlikte hastalığın ilk keşfi Hippocrates tarafından olmamıştır. Kanserin varlığına yönelik olarak daha eski bilgilere mısırdaki mumyalarda ve yazıtlarda rastlanmıştır.11 Kanserin ilk tanımlandığı günden bugüne asırlar geçmesine rağmen bazı kanser tiplerinin tedavisinin çok kısıtlı ya da mümkün olmadığı, bazı kanser türlerinin ise büyük oranda tedavi edilebileceği bildirilmektedir.12 Hücrelerin kontrolsüz çoğalmasına bağlı olarak ortaya çıkan kanser, sadece bulunduğu dokuda değil aynı zamanda uzaklardaki doku ve organlarda da işlev kaybına sebep olmaktadır. Kanserde ölüm oranlarının yüksek olması da bu hastalığın insan sağlığı açısından önemini daha da artırmaktadır.1 Kanserogenez, hücrelerin kontrolsüz ve aşırı çoğalmalarının yanı sıra, immün sistemin gözetiminden kaçarak daha uzaktaki dokulara sıçrayarak o dokuları işgal eden, metabolik ve davranışsal değişikliklere sebep olan çok basamaklı bir süreçtir.13 Kanserli vaka sayısı yıllar içinde artış göstermiş ve 2025 yılına kadar kanser vakalarının dünya çapında görülme olasılığı yirmi beş milyonu aşacağı öngörülmektedir. Bu nedenle kanserogenez süreci ve tedavisi bugünkü araştırmacılar tarafından en çok araştırılan konular arasında olup ve kanserin ortaya çıkma nedenleri ve tedavisi üzerine yapılan çalışmalar her geçen gün artmakta, daha etkili ve en az yan etkiye sahip tedavi süreci arayışları sürmektedir.14 3 Tümör hücrelerinin tiplendirilmelerinde çevre dokulara yayılış özellikleri isimlendirmede önemli bir kriter olup, yayılış özelliğine göre iyi huylu (benign) ve kötü huylu (malign) tümörler olarak adlandırılır. Benign tümörler büyümezler, çevre dokulara metastaz yapmaz ve cerrahi yolla uzaklaştırılabilmektedirler. Dolayısıyla da yaşamı tehdit edici unsurlar değildirler. Oysa malign tümörler, vücudun çeşitli organ ve dokularına yayılabilir ve sürekli çoğalabilir, Malign tümörler kendilerini apoptozdan koruyabilirler. Tümör hücrelerinin tiplendirilmesinde, bulundukları hücre, doku ya da organ çeşitleri de dikkate alınmaktadır. Bu kanser tipleri adlandırılırken köken aldığı yer ve nerede büyümeye başladığı gibi faktörler göz önünde bulundurulmaktadır. Lökositlerin kanseri (beyaz kan hücreleri) lösemi, bağdokuda özelleşmiş lenfositlerin tümörü lenfoma, derinin melanosit denilen pigment hücrelerinden köken alan kanserler melanoma, mide, akciğer gibi boşluklu organların epitelinden köken alan tipleri karsinoma, bağdoku ve kas dokudaki kanserler de sarcomas olarak adlandırılır.12 Terminolojik olarak spesifik tip kanserler; meme, kolon, akciğer ve prostat kanserleri gibi organ adlarıyla da isimlendirilirler.12 2.2. Kanser Patogenezisi Kanser hem çevresel hem de kalıtsal faktörlere bağlı olarak ortaya çıkan mortalitesi yüksek bir hastalıktır. Kanser genellikle DNA hasarına bağlı olarak normal hücrelerden orijinlenmektedir. Bununla birlikte bazı kanserlerin anne babanın DNA’larındaki hasara bağlı olarak ta kalıtımsal olarak meydana geldiği belirtilmektedir. Kanserde diyet, çevresel faktörler, kalıtılan mutasyonlar ve somatik mutasyonlar gibi birçok durum kanser nedeni olabilmektedir. Normal vücut hücrelerin kanser hücrelerine dönüşmesi DNA’nın hasara görmesiyle ya da mutasyonlar ile ortaya çıkar. DNA’daki bu hasar, DNA replikasyonunda bağlı ya da metabolik bir ürün olan serbest radikallerin organellere ya da DNA’da hasat oluşturmasına bağlı olarak görülmektedir. DNA iyonize radyasyon, 4 ultraviyole radyasyon ve kimyasal karsinojen gibi maddeler ile de hasarlanabilir. Bu şekilde DNA hasar görür ve sonraki nesillere mutant DNA’lar aktarılır.15, 16 Diğer taraftan DNA’nın kendi kendini tamir mekanizması vardır. Fakat DNA onarım mekanizması bazen yetersiz kalır ve mutasyon adı verilen DNA dizisindeki daimi değişiklikler oluşur. Normal hücrelerdeki DNA hasarı çoğu zaman tamir edilmektedir. Tam tersine kanser hücrelerindeki DNA hasarı ise tamir edilememektedir.11 Yapılan araştırmalarda çevresel ve kalıtsal faktörlerin yanı sıra virüslerin de çeşitli kanserlere sebep olabileceği bildirilmiştir. Örneğin, Hepatit B veya C virüsünün gelişimi karaciğer kanserine, Epstein-Barr virüsünün non-Hodgkin lenfomaya ve nazofaringeal kansere, insan papilloma virüsünün servix, vulva ve penis kanserine yine HIV virüsünün non-Hodgkin lenfomaya sebep olduğu belirtilmektedir.11 Hücre siklusunda iki tip gen grubu rol oynar. Bunlar onkogenler plan Myc, Ras genleri ve tümör baskılayıcı genler olan P53, Rb geni gibi genlerdir. Onkogenler, kanserin ortaya çıkmasında dolaylı olarak etkin olan genler olup tümör oluşumunu tetiklerler. Tümör baskılayıcı genler ise kanser gelişimini engelleyen genlerdir. Hücre siklusunu baskılayan bu genlerde değişim olursa ve tamir edilmezse bu gen hücre bölünme kontrolünü sağlayamaz ve kanser oluşur. Normal hücrelerde DNA hasarı oluştuğu durumda hücre siklusu inhibitör siklinler aracılığı ile G evresi sırasında inhibe edebilmekte ve hücreye tamir için zaman kazandırmaktadır. DNA hasarı tamir edilemeyecek boyutta ise hücre apoptozise gider.14 2.3. Hücre Siklusu ve Karsinogenez Normal hücre siklusunda unipotent kök hücrelerden yeni hücrelerin oluşumu esnasındaki bölünme (mitoz) ve hazırlık (interfaz) dönemleri halindedir. Hücre bölünme aşamaları; 5 İnterfaz dönemi: Hücrenin dinlendiği ve mitoz bölünme için bir hazırlık dönemdir. Genelde memeli hücrelerinde 12- 24 saat sürer. Bu dönemde hücre içerisinde ribonükleik asit (RNA) sentezi, protein üretimi ve hücre boyutunda artış görülür. İnterfaz aşaması 4 alt döneme ayrılır. Bunlar; Gap 0 (G0), Gap 1 (G1), Sentez dönemi (S), ve Gap2 (G2) dir. G0: Hücre bölünme olmadan dinlendiği süreçtir. Bu süreç nöral hücrelerde olduğu çol uzunca bir süre olabilir. G1: Hücre hacmini arttırır ve RNA üretimi ve protein sentezi görülür. DNA sentezi için hazırladık yapılır ve hücre kontrolü mekanizması aktiftir. Sentez dönemi (S): DNA replikasyonu olur ve DNA iki katına çıkar. G2: Bu dönem de DNA sentezi biter ve hücre büyümesine devam eder. Daha sonra protein sentezi olur. Bu aşama sonrasında G2/M kontrol noktası hücrenin mitoz ve bölünmeye ilerleyişini belirler. Mitoz veya M dönemi: Bu dönemde hücrede protein sentezi durur ve hücre iki eşit hücreye bölünür. Mitoz bölünme aşamalarında olan metafazda kontrol noktası (metafaz kontrol noktası) bulunur. Bu kontrol noktası hücrenin eşit bölünmesini sağlar. Mitoz sonrası yeni hücreler G0 ya da G1 dönemine geçerler.17 Hücrede bölünme işlemi hücresel mekanizma ile kontrol edilmektedir. Bu mekanizma hücrenin metabolik fonksiyonlarını bölünmesini kontrol eder. Hücre içerisinde mitoz bölünme aşamalarını kontrol eden siklin-bağımlı kinazlardan (CDKs) bulunmaktadır. Bu siklinler hücrede bir dizi protein ailesi tarafından kontrol edilmektedir. Bu siklinlerin görevini tamamlamasından sonra, başka bir grup protein ailesi etkinleşir. Hücre döngüsünün özel evrelerinde aktifleşen bu siklinler, tutundukları bu aktif olmayan CDK moleküllerini etkinleştirirler. Bu Siklin -CDK molekülleri hücre içerisinde ardışık bir görev üstlenirler. Aktifleşen bu siklin molekülleri onkogenleri 6 etkinleştirir ve tümör baskılayıcılarının engellerler. Pek çok onkogen ve tümör baskılayıcılarının genlerin proteinleri S fazı öncesi G1 fazı başlangıcından sorumlu (hücrenin çeşidine göre değişen CDK4 veya CDK6 ile siklin D1-D3 kompleksleri) olan ve DNA’nın kendini eşlemesinden sonra (siklinE-CDK2) G1 fazına geçişini kontrol eden siklin bağımlı kinazların etki alanını arttırır. Hücrede bulunan proteinin yapısındaki herhangi bir değişiklikle veya proteini kodlayan segmentteki bir değişiklikle tamamlanabilen onkogene dönüşebilen gen ile tümör baskılayıcılar genler olan siklinACDK2 (DNA eşleşmesinden sorumlu) ve siklin-B-CDK1 (Mitoza G2 safhasında geçişini artırır) etkinliğinin artıtırlar.5 Şekil 2.1. Hücre siklusu, siklinler ve CDKs ilişkisi ( mitoza G2 fazının geçişini artırır) komplekslerinin aktivitesini artırır.18 Hücre siklusunun kontrolü siklinler proteinlerin bulunması ve siklinlerin, siklin bağımlı kinazalar (CDKs) ile tutunması ile sağlanır. Erken G1 fazında sentezlenmekte olan siklin D, CDK4 ve CDK6’ya bağlanmaktadır. Geç G1 fazında sentezlenmekte olan siklin E ve CDK2’ye bağlanmaktadır. 7 Bu üç bileşik, diğer aracılarla beraber hücrenin S evresine girmesine ve S evresinde ilerlemesini sağlamaktadır. CDK2 ve CDK1’e bağlanan Siklin A ile oluşan kompleksler, hücrenin S fazından çıkıp G2 fazına girmesini sağlar ve Siklin B’nin oluşumunu başlatır. İndüklenen Siklin B, CDK1’e bağlanır ve hücre G2 fazından ayrılıp M fazına geçişine müsaade eder. Vazifelerini yerine getiren siklinler, ubikuitin-proteazom yoluyla yıkımlanırlar.12 Proteinkinazların aktif hale gelmesi için ekstrasellüler mesajlaşmadan sorumlu moleküllerinin (mitogenler) kendi almaçlarına bağlanması gerekmektedir. Aktif hale gelen proteinkinazlar, sitoplazmada bulunan sinyal ileti moleküllerini (Ras ve Jak) ve transkripsiyon etkenlerini (Jun, Fos, NF-AT, NFκβ, Myc) fosforilleyen kinazları (proteinkinaz C ve ERK) tetiklerler. Transkripsiyonel düzenlemeyi etkili bir şekilde sağlayan E2F, pRb (retinoblastoma proteini) ile bağımlıdır ve pRb tarafından baskılanır. E2F, G1 evresinden çıkıp S evresine girmesini sağlayan kontrol noktasının geçilmesi için gerekmektedir. DNA’nın sentez evresine girmesi için G1 fazından S fazına geçişi sağlanmalıdır. Bunun için proteinkinazların uyarısıyla (Siklin D CDK4, Siklin D-CDK 6 bileşikleri ile) E2F bağlı Rb fosforilasyonu sonucu, E2F serbestlerin. DNA replikasyonu için zorunlu olan proteinler E2F transkripsiyon etkisinin aktif hale gelmesi sonucu, Deoksiribonükleotit ve bazı düzenleyici proteinlerden üretilirler (Şekil 2.2). 8 Şekil 2.2. Hücre siklusunun düzenlenmesinde siklinler, CDK ve CDK inhibitörlerinin rolü.19 2.4. Kolon Kanseri 2.4.1. Kolon Kanseri Patogenezi Kolorektal kanser Kuzey Amerika, Batı Avrupa, Yeni Zelanda, Avustralya gibi endüstriyel ülkeler başta olmak üzere çok geniş bir coğrafik alanda yayılış göstermektedir. Ayrıca, bu ülkeler içinde de görülme sıklığı açısından farklı bölgeler mevcuttur. Örneğin Amerika Birleşik Devletlerinde, endüstriyelin gelişmiş olduğu kuzeydoğuda oran çok fazla iken, endüstrinin gelişmediği kırsal alan güneydoğuda en azdır. Japonya, Polonya gibi düşük riskli bölgelerden yüksek riskli bölge olan Amerika Birleşik Devletleri, Avustralya gibi ülkelere göç edenlerde kolon kanser oranlarında hızlı bir yükselme görülmektedir. Kısaca, Amerika, Avusturalya, Yeni Zelanda, Kanada ve Avrupa’nın bazı kısımlarında kolon kanserinin görülme oranı fazla iken, Çin ve Hindistan’ın yanı sıra Afrika ve Güney Amerika kıtalarında görülme sıklığı oldukça azdır.17 Türkiye de kaba prevalans tahmini yaptığımızda kanser teşhis edilmiş ve hayatta olan 350-400 bin kişi olduğu bilinmektedir. 2009 kayıtlarına göre, Türkiye de de ölüm nedenleri arasında 2. sırada yerini almaktadır. Kanser hastalığı 2015 yılından itibaren tüm 9 dünyada ilk sıradaki ölüm nedeni olacağı öngörülmektedir. Kolekteral kanserin dünyada 100.000 de 20’lerde iken, Avrupa da 100.000 de 37, Türkiye’de ise 100.000 de 17’lerdedir. Dünyada, erkeklerde kanser görülme sıklığına bakıldığında ilk 3 sıra kanser türü olan prostat, akciğer ve kolon iken, Türkiye’de bu sıralama akciğer, prostat ve mesane kanseri şeklindedir. Ülkemizde görülme sıklığı açısından erkeler de 4. sırayı kolon kanseri almaktadır. Dünyada kadınlarda görülme sıklığına bakarsak ilk üç kanser türü meme, kolon ve akciğer kanseriyken Türkiye’de bu sıralama meme, tiroit ve kolorektal kanseri şeklindedir.20 Gelişmiş ülkelerde kolon kanseri üçüncü sırada görülen kanser türü olup görülen bütün kanser vakalarının yaklaşık %9’unu oluşturur. Dünya üzerinde kanser vakalarında 3. sıradadır. Bu kanser tipi ayrıca dünyadaki kanserler arasında ölüm sebepleri arasında 4. sırada yer almaktadır. Kanserin bu tipi genetik ve epigenetik değişimlerden dolayı ortaya çıkmaktadır. Kolon kanserinin meydana gelmesinde beslenme tarzının çok önemli olduğu belirtilmektedir. Yağ ve protein oranı yüksek fakat fiber oranı düşük meyve ve sebzelerle beslenmenin bu hastalığın oluşumunu artırdığı belirtilmektedir.2,3 Kolorektal karsinomların yeni vaka sayısı tahmini olarak her yıl için 150.000’dir. İnsanının yaşamı boyunca kolorektal karsinom gelişme riski yaklaşık %’6 dır. Kolon kanseri vakaları he erkek ve kadınlarda birbirine yakın olmakla birlikte erkeklerde kadınlara oranla biraz daha yüksektir.21 Bir bireyin hayatı boyunca kolektaral kanser gelişme riski %’6 iken, birinci derece akrabalarında kolon kanseri veya adenomatöz polip öyküsü olan bireylerde ise bu oran 2-3 kat daha fazla olarak rapor edilmektedir.22,23 2.4.2. Kolorektal Kanser Etiyolojisi Kolekteral kanser kolon veya rektumda meydana gelmektedir. Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %72’si kolonda, %28’i ise rektumda oluşmaktadır.24 Kolorektal kanser gelişiminde yaş, kolekteral adenom (senkron yada metakron) varlığı, 10 kalıtımsal faktörler, inflamatuar barsak hastalıkları ve çevresel faktörler (Diyet, sigara tüketimi, alkol) etkili olmaktadır. Yaş: Kanser gelişme riski 40 yasından sonra erkek ve kadınlar için artmaktadır. Kolon kanserlerinin %90’nından fazlası 50 yaş ve üzerindeki bireylerde görülmektedir. Kolekteral kanser olguların sadece %5’ine 40 yaşın altında rastlanmaktadır. Bununla birlikte kolon kanserinin genç insanlarda da meydana gelme olasılığı gün geçtikçe daha da artmaktadır.25,26,27 Kolekteral adenom (senkron yada metakron) varlığı: Kolorektal kanserlerin %90’nından daha fazlası daha önce gelişmiş adenom poliplerin varlığından kaynaklanmaktadır. Diğer bir ifade ile adenoma sahip olan bireylerin, adenoma sahip olmayanlara oranla kolekteral kansere yakalanma riskleri daha fazladır. Adenomlardan malignansi gelişmesi için yaklaşık olarak 5-10 sene gibi bir süreye ihtiyaç duyulmaktadır. Diğer bir ifade ile anormal olmayan bir kolon mukozasından adenom, adenomdan da displazi, insitu ve invazif kanser gelişiminin yaklaşık 10 sene aldığı bildirilmektedir. Adenomların malignanta dönüşmeden önce tespit edilmesi ve uzaklaştırılması kolon kanseri riskini azaltmaktadır.28, 29 Kolon kanseri riski, adenomların sayısı ve büyüklüğü ile de direkt olarak alakalıdır. Tubuler adenomlarda kanserleşme risk oranı %5 iken, bu oran tubulo-villöz adenomlarda oran %22, villöz adenomlarda ise oran %40 civarındadır. Polip boyutu 2 cm’den büyük olduğunda da, kanserleşme riski artmakta ve %35-50 düzeyine ulaşmaktadır.30 Kolorektal kanser oluşumunda rol alan bir takım faktörler vardır. Bunlar; a- Kalıtımsal Faktörler Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %5-10’nun kalıtımsal faktörlere bağlı olarak geliştiği belirtilmektedir.31 Kalıtımsal kolekteral kanserlerin en yaygın tipleri FAP (Familial Adenomatous Polyposis) ve HNPCC (Hereditary Non-polyposis Colorectal Carcinoma)’dir.FAP ve HNPCC fertler kalıtıma bağlı olarak mutant genlerle doğdukları 11 için, adenom oluşumu ve adenomdan da karsinoma dönüşüm süreci bu kişilerde daha hızlı olmaktadır. Lynch sendromu olaraktan bilinen HNPCC tipi DNA tamir mekanizmalarında görev alan genlerdeki (MLH1 ve MSH2) mutasyonlara bağlı olarak ortaya çıkar. Bu iki gendeki mutasyonların ayrıca uterus, mide, pankreas, böbrek ve uretra kanserlerinin ortaya çıkmasında da etkili olduğu da bildirilmektedir. HNPCC kolekteral kanserlerin %2-6’sını oluşturmaktadır. FAP ise tümör baskılayıcı genlerinden birisi olan APC genindeki mutasyonlara bağlı olarak meydana gelmektedir. FAP tipi kolekteral kanserlerin %1’ den daha azını oluşturmaktadır. HNPCC tipi kolekteral kanserde birkaç adenom gelişimi olurken, bunların tam aksine FAP’lı bireylerde yüzlerce adenom gelişebilmektedir. APC bağlantılı polipler otozomal dominant kalıtım göstermektedir.21 Kolon kanseri oluşumunda rol alan faktörler; tümör supressör genlerin etkin olmaması, ve DNA tamiriyle ilgili genlerdeki (MMR: mismatch repair gen) problemler, genetik değişiklikler (mutasyonlar) ve en önemlilerinden birisi olan proto-onkojenlerin aktivasyonudur. Proto-onkojenlerin aktivasyonları, hücre yüzeyinden nükleusa gelecek olan iletileri yanlış iletme, anormal hücre bölünmesine ve neticede tümöre sebep olur. Mutasyona uğrayan proto-onkojenler onkojen olarak adlandırılır ve baskın olarak fonksiyon gösterirler. Üzerinde en fazla çalışılan onkojen Ras genidir. İnsanlarda hücre içi uyarı sistemimin de iletiyi düzenleyen 3 Ras geni (K-Ras, N-Ras, H-Ras) bulunmaktadır. K-Ras geni mutasyona uğradı zaman, hücre içindeki guanozin trifosfat (GTP) hidrolizi yapılamadığı, G proteininin ise sürekli aktif formda kaldığı, sonuç olarak da hücrenin kontrolsüz bir şekilde bölünmesine neden olduğu öngörülmektedir. Kolekteral kanser vakalarının yaklaşık %65’inde, bir Ras geninde (genellikle K-Ras geni) nokta mutasyonu saplanmıştır. Fakat tümör gelişimi için K-Ras gen mutasyonu tek olarak yeterli değildir. Kolon kanserleri ve 100 mm’den büyük adenomların yarısından 12 fazlasında Ras mutasyonu rastlanırken, 100 mm’den küçük adenomlarda bu oran %10’a kadar inmektedir.30 Mutasyona uğradığı takdirde kolorektal kanser oluşumunda rol alan devamlı karşılaşılan tümör süpressör genleri; APC (Adenomatous Polyposis Coli), DCC (deleted in colorectal carcinoma) ve p53 genleridir. Tümör süpressör genler resesif özellik taşıdığından, tümör gelişiminin başlayabilmesi için her iki allelde de mutasyonun olması gerekmektedir. APC geninde bulunan bir eksiklik ya da kusurdan dolayı, ilk olarak FAP’lı bireyli vakalarda bu tanı konulmuştur. Mutasyonların meydana geldiği bu gende, FAP‘lı ve diğer sporadik kolon adenomlarının gelişiminde çok önemli başlangıç noktası olduğu tahmin edilmektedir.11,14 APC geni, 5. kromozomun uzun kolunda (q21) mevcuttur. FAP’lı hastalar, APC geninin bir allelinde ortaya çıkmış olan mutasyonla, mutasyonlu olarak hayatlarına başlarlar. İkinci allel, bireyin yaşamı sırasında meydana gelen çevresel etkenlerin de etkisinde kalarak mutasyona uğrarlar. Polip oluşumunun başlayabilmesi için, birinci ve ikinci APC geninin de mutasyon geçirmesi gerekmektedir. Ancak, polipin kanserleşmesi için ek genetik mutasyonların da eklenmesi olmazsa olmazıdır.30 p53 geni 17. kromozomun kısa kolunda (17p) yer almaktadır. p53 proteini, DNA onarım ve sentezi kontrolü ve programlanmış olan hücre ölümünde (apoptoz) rol alır. Apoptozu başlatmakta görevli olan bu gendeki mutasyon insanda çeşitli tümörlerin gelişimine neden olmaktadır. Bu gene ait mutasyon, kolekteral kanserlerin %75’inde görülmektedir. b- İnflamatuar Barsak Hastalıkları Ülseratif kolit ve Crohn hastalığı gibi barsak hastalığı olan kişilerde kolekteral kanser hastalığına yakalanma riskinin 4-20 kat daha fazla olduğu belirtilmektedir. 13 Dolayısıyla, bu hastalıkları taşıyan kişilerde yaşın kaç olduğuna bakılmaksızın erken kanser taraması yapılması tavsiye edilmektedir.33 c- Diyet Hayvansal yağlar başta olmak üzere, yüksek yağ oranına sahip besinler kolekteral kanserlerin önemli sebeplerinden birisi sayılmaktadır. Bu yüzden özellikle yağlı besinlerle beslenen batı ülkelerinde kolekteral kanser riski yüksek olmaktadır. Diyette yağ alımıyla karaciğer tarafından kolesterol ve safra asidi sentezi artar. Kolon bakterileri bu bileşikleri sekonder safra asitlerine, kolesterol metabolitlerine ve diğer toksik metabolik bileşiklere dönüştürür. Safra asitleri ve serbest yağ asitlerinin kolon mukozasında hasar yaptığı ve epitel hücrelerinin proliferatif aktivitesinde artışa yol açtığı gösterilmiştir. Balık ve tavuk eti yerine kırmızı et tüketiminin artması, kolon kanseri insidansında artmayla ilişkili bulunmuştur. Kırmızı et tüketimi ile kolekteral kanser arasındaki ilişki kırmızı etteki hem demirinin varlığı ile açıklanmaktadır. Ayrıca, yüksek sıcaklıklarda pişirilen etlerde heterosiklik aminlerin ve polisiklik hidrokarbonların meydana geldiği ve bu maddelerinde kolekteral kansere sebep olduğu belirtilmektedir.3437 Epidemiyolojik çalışmalarda sebze ve meyvenin bol tüketimi, kolon kanseri riskiyle ters orantılıdır. Diyetteki lif, dışkı hacmini ve buna bağlı transit hızını arttırarak intraluminal karsinojenlerin mukoza ile temasını azaltır. Ayrıca lifli gıdalar, bağırsaktaki karsinojen safra asitlerinin derişimini azaltırlar.34-37 d- Çevresel faktörler Kolekteral kanser riskini artıran çevresel faktörlerden en önemlilerinden birisi sigara tüketimidir. Sigara dumanı kolon ve rektuma karşı son derece zararlıdır. Kolekteral kanserlerin yaklaşık olarak %12’sinin sigara tüketimine bağlı olduğu belirtilmektedir. Sigara dumanının, kolekteral kanserlerin öncüsü olarak kabul edilen adenomo poliplerin oluşumunu ve büyümesini artırdığı belirtilmektedir. Büyük poliplerin varlığı ise uzun 14 süreli sigara içimi ile ilişkilendirilmektedir. Ayrıca, kadın ve erkeklerde sigara tüketimine bağlı olarak kolekteral kanserlerin daha erken yaşlarda ortaya çıktığında açıklanmaktadır.38-40 Bir diğer çevresel faktör olan alkol tüketiminin de yine kolekteral kanseri teşvik ettiği bildirilmektedir. Özellikle alkol tüketimine bağlı olarak kolekteral kanser oluşumunun çok daha erken yaşlarda başladığı bildirilmektedir. Sigara ile alkolün birlikte alımının çok daha tehlikeli olduğu da dile getirilmektedir. Bu durumun ise, sigara kullanımına bağlı olarak DNA mutasyonlarının alkol varlığında onarımında olasılıklarının çok daha düşük olması gösterilmektedir. Diğer taraftan, bir solvent olarak görev yapan alkolün diğer karsinojenik maddelerin hücreye girişini artırması gösterilmektedir. Ayrıca, alkolün hücrelerde serbest radikal oluşumuna, lipit peroksidayonuna ve prostoglandin üretimine bağlı olarak kolekteral kanser oluşumunu artırdığı belirtilmektedir.38, 39, 41 Kolorektal kanserin oluşumu sırasında yaş, beslenme şekli, genetik yatkınlık, önceki kanser öyküsü, polipler, virus (human papilloma virus),vücuda dışarıdan verilen hormonlar, alkol tüketimi, düşük selenyum ve çevresel etkenler sayılabilmektedir. Birçok epidemiyolojik çalışma kolorektal kanserde diyetin ve yaşam tarzının ne kadar önemli olduğunun altını çizmektedir. Yağ, kırmızı et, alkol alımı ve sigara tüketiminin pozitif korelasyon gösterdiği, sebze ve lifli gıdaların tüketiminin ise ters korelasyon gösterdiği raporlarla belirtilmektedir. Bunlara ek olarak yüksek fiziksel aktivite, bayanlarda menopaz öncesi hormon tedavisi, aspirin gibi anti-enflamatuarların düzenli olarak kullanımı gibi faktörlerin ise koruyucu etkisi olduğu bildirilmiştir.16 2.5. Kanserogenezde Tedavi Seçenekleri Kanser tedavisinde; cerrahi işlemler, lazer, radyoterapi, kemoterapi, immünoterapi, adjuvantlar ve hormon uygulamasına başvurulmaktadır. Kanser tedavisinde en çok kullanılan tedavi şekli; tümörün uzaklaştırılmasını sağlayan cerrahi yöntemleri içine alır. 15 Bu, diğer doku ve organlara yayılmayan ya da yayılamayan birçok kanser türü için etkili bir tedavi seçeneğidir. Eğer kanser ilerlemiş ya da çevre dokulara yayılmışsa; cerrahi müdahale, radyoterapi ve kemoterapi ikisi veya üç tedavi yöntemi birlikte uygulanabilir. Radyasyon tedavisinde kanser tedavisinin yapıldığı bölgeye X ışınları, gama ışınları ve protonlar kullanılmaktadır. Bu radyoaktif ışınlar; kanserli hücreyi tahrip ederek etkilemektedir. Örneğin, gamma ışınlarının beyin tümörlerinin uzaklaştırılmasında kullanıldığı belirtilmektedir. Ancak, yapılan çalışmalar radyasyon tedavisinin normal hücrelerin yanı sıra sağlıklı hücrelerde zarar verdiğini göstermektedir. İmmünoterapi yöntemi, BCG aşısı, interlökin ve interferonlar gibi biyolojik molekülleri kullanarak bağışıklık sisteminin aktif hale getirilerek uyarılmasıdır. Bu uyarı ise hücre büyümesini kontrol eden hücre sinyallerini etkilemek şeklinde olmaktadır. Adjuvant terapi ameliyattan sonra kemoterapi kullanılmasıdır. Hormon ile tedavisi yönteminde ise; hormon salım miktarı ve zamanına bağlı olarak gelişen meme ve prostat kanseri gibi vakalarda bazı özel hormonların kullanımıyla tatbik edilen tedavidir. Lazer tedavisi ise, cerrahi müdahalelerde yararlı olabilmektedir. Bundan dolayı, beyin tümörleri ve gırtlak kanserinde kullanılmaktadır. Kemoterapi ise, kanserin ilaçla tedavi edilmesi olarak tanımlanır. Kanser kemoterapisi çok kullanılan bir tedavi yöntemi şeklidir. Kemoterapi sırasında kullanılan ilaçlar, kanserli hücrelerin bölünüp sayılarının artmasını engellemek de durdurmakta ya da yok etmektedir. Ancak; kemoterapide kullanılan ilaçlar vücuttaki normal olan hücrelere de etki edebilmekte ve çok ciddi yan etkilere yol açabilmektedirler. 11 2.6. Hücre ölümü Hücre ölüm mekanizmasının düzenlenmesi embriyolojik gelişim ve doku hemostazisi için önemli bir aşamadır. Son yıllarda yapılan araştırmalarda hücre ölümünü kontrol eden birçok yolak hücre ve doku da izah edilmiştir. Hücre ölümü gerçekleşmeye 16 başlayan hücrede aynı anda değişik hücre ölüm yolakları paralel olarak tetiklenmiş olabileceğinden hücre ölüm mekanizmaları birbirlerini etkileyebilir ve tanımlanması her zaman kolay olmayabilir. Hücre ölümü gerçekleşmeye başladığı zaman oluşan morfolojik değişikliklerin, apoptoz ile mi yoksa otofaji sonucunda mı oluştuğunun tanımlanabilmesi zordur.4 Bununla birlikte, otofajik ve apoptotik hücre ölümü arasında biyokimyasal ve morfolojik farklar bulunmaktadır. Otofajik hücre ölümünde, kaspaz aktivasyonu ve DNA fragmentasyonu gözlenememektedir. Otofaji sitoplazmik organellerin; mitokondri, golgi aygıtı gibi ve sitoplâzmayı yutan sitoplazmik keseciklerin görülmesiyle tanımlanmaktadır. Otofajide, oluşan membran yapıları otofagozom veya otofajik vakuol olarak da adlandırılan iki veya ikiden daha fazla yapılar ortaya çıkar. Hayvan hücrelerinde otofagozomun dış membranı lizozomla, maya ve bitkilerde ise bu yapı vakuolle bütünleşir. Hücrelerde, DAPK1’in belirtilmesi ise otofajik keseciklerin meydana gelmesi ve zar balonlaşmasına neden olur. Otofajik veziküller ve bu veziküllerin içeriğinin yok edilmesi için aynı hücrenin lizozomal hidrolazları tarafından yararlanılır. Otofaji; hücrelerin hücre içi besine ve enerji üretimine gereksinim duyduğu zaman hızla up-regüle edilir. Otofajinin kontrolü için hücrenin yoğunluğu, oksijen konsantrasyon oranı, sıcaklık, hormonal etkenler ve besin miktarının durumu önemli etkilere sahiptirler.5 2.6.1. Apoptozis Hücrenin patolojik bir şekilde yok olması olan ve ATP miktarının azaldığı, hücre homeostazının çok hızla bir şekilde bozulduğu, yangı esnasında gelişen nekrozdan çok farklı olarak, apoptoz; yangı olmaksızın hücrelerin kendi kendilerini yok ettikleri, programlı hücre ölümü olup organizmada homeostazı koruyan bir durumdur.42 Günümüzde de bu terimin kullanımı doğru kabul edilmektedir ve fizyolojik etkenlerden kaynaklanan hücre ölümünü ifade eder. Hormonsal olarak aktif hale gelen çeşitli 17 maddeler, iyonize radyasyon ve kemoterapiyi içeren travmatik ajanlar aracılığıyla gerçekleşen hücresel hasarların ya da genetik faktörlerle başlatılan hücresel süreç apoptoza sebep olur. Vücutta fizyolojik bir durum olan apoptoz, anormal olmayan hücrelerin yok edilmesinden de sorumludur. Apoptotik hücre sayısı bireyin ya da organizmanın sağlıklı mı yoksa hasta olup olmadığını belirlediğinden, apoptozun fonksiyonel mekanizmaları hücrede denge unsurudur. Bunun da anlamı; apoptoz oranının azalması ile hücre sayısı artar tam tersi olarak apoptoz oranı artarsa hücre sayısı azalır ve istenmeyen doku bozuklukları ortaya çıkar43. Apoptoz tek hücreli organizmalarda hücrenin yaşamının sonlanmasının alternatifsiz tek yoludur. Bu durum çok hücreli organizmalarda ise genetik oluşumlu hücre hasarının durdurulması ya da hücrenin tamamen ortamdan kaldırılması apoptoz aracılığıyla olur. Bu şekilde hasarlı hücrenin yayılması ve tümör oluşumu gibi zararlı olasılıkların önüne geçilmiş olur. Apoptoz olayının başlamasından önce hücresel replikasyon işlemi durur (DNA onarımı) eğer bu esnada tahrip olan DNA’nın tamiri gerçekleşemezse apoptoz ile sonuçlanan olaylar zinciri başlar. Bu sırada apoptozun başlayıp başlamaması bozulan yapının büyüklüğüne, hücrenin tipine ve hücrenin üretkenlik potansiyeli olan tümör geliştirme riskine bağlıdır.43 Apoptoz, hücrede, stoplazmik azalma ve çevre hücrelerle olan ilişkisinin kaybolması ile ortaya çıkar. Hücresel büzüşmenin sebebi olarak gösterilen, sodyum (Na), potasyum (K), klor (Cl) taşıyıcı sisteminin durmasından dolayı hücrenin içi ve dışı arasındaki sıvı hareketinin olmayışıdır. Apoptotik uyarım alan hücre hacmi azalır ve çevre hücreler ile bağlantısı kopar mikrovillusları kaybolur.42 Apoptoz, kanser gelişiminin engellenmesinde hücre tarafından başvurulan temel düzenleyicilerden biridir. Apoptozun bu düzenleyici mekanizmaları ise çok kompleks özellikler taşımaktadırlar. Tümör nekroz edici faktör (TNF), reaktik oksijen türleri 18 (ROS), kaspazın aktivasyonu, protein kinaz ve mitokondriyal yolak apoptozun önceliğini olustururmaktadır.44 Apoptozun düzenleyici mekanizmasında kullanılan başlıca yol kaspazların aktivasyonudur. Proapoptotik kaspazlar kalsiyum bağımsız hücre içi sistein proteazların atkin bir kısmını meydana getirirler. Bu kaspaz ailesi proteinler biyolojik fonksiyonlarına göre üç ana grupta incelenirler. Bunlar Sitokin aktivasyonu yapanlar, apoptozisi başlatanlar ve apoptozu yürütenler (efektör grup). Sitokin aktive eden grup kaspazlar (kaspaz-1, -4, -5, -11, -12, -13 ve -14) ve apoptozu uyaran kaspazlar (kaspaz2, -8, -9 ve -10) ve apoptozu devam ettiren kaspazlar (kaspaz -3, -6 ve -7) dır. Kaspaz -3’ ise programlı hücre ölümünde çok önemli bir rol- üstlenir.45 Apoptozisi başlatan kaspazlar apoptotik uyarıyla başlama alan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara iletirler. Sinyali alan efektör kaspazlar ise görevli olan proteinleri parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine sebep olurlar. Kaspazlar apoptozisi aktive eden sinyaller tarafından tetiklenip, apoptozisin her üç yolunda da (intrinsik yol, ekstrinsik yol ve endoplazmik retikulum aracılı yol) aktif olarak görev alırlar.45 Apoptozun genetik olarak düzenlenme mekanizması ilk olarak Caenorhabditis elegans isimli nematotta belirlenmiştir. Bu nematotta Ced-3, Ced-4 ve Ced-9 adı verilen 3 genin apoptoz sürecini kontrol ettiği tespit edilmiştir. Ced 3 ve Ced 4 hücrede apoptozise neden olmaktadır. Ced 9 ise Ced 3 ve Ced 4’ ün aktivasyonunu engelleyerek sağlıklı hücrelerde apaoptozisi engellemektedir. Ced-4 insanlarda apaf-1 ile homoloji göstermektedir. Ced-9'un insandaki homoloğu ise Bcl-2 proto-onkojen genidir.46,47 Bcl-2 mitokondri dış zarında yer alıp, kaspaz 3’ ün aktivasyonunu engellemektedir. Bu işlevi ise kazpaz 3’ ün aktivasyonu için kofaktör olarak işlev gören sitokrom C’nin mitokondriden salınımını engellemek suretiyle yerine getirmektedir.46 19 Apoptoz ve hücre proliferasyonu dengesi kansere yol açan ve onkogen olarak isimlendirilen genler tarafından bozulabilir. Onkogenler proliferasyon ve hücre ölümü gibi olayları denetleyip kontrol edebilen ve protoonkogen olarak bilinen anormal olmayan hücresel genlerin mutasyona uğramış formlarıdır. Büyümenin durdurulması, DNA tamiri ve apoptozise engel olunması kanserin başlaması ve gelişiminde kritik yolaklardır. Tümör baskılayıcı genlerde mutasyonlar yapısı bozulmuş hücrelerin hücre sikluslarının ilerlemesine ve tümör gelişimine sebep olur. Bilinen birçok tümör baskılayıcı gende etkinin görülebilmesi için her iki allelde de mutasyon olmalıdır ve kanserlerin çoğunda tümör baskılayıcı gen olarak bilinen ve tümör protein 53 olarak adlandırılan (TP53) geni mutasyona uğramıştır. TP53 geni hücre siklusunu kontrol eden düzenleyen bir transkripsiyon etkenidir ve yapılan birçok araştırmada organizmada kanseri inhibe eden çok önemli bir proteindir. Ayrıca p53 proteini DNA’da mutasyon olmasını engeller ve DNA’yı mutasyondan korur. Eğer DNA hasar görmüşse DNA tamir proteinlerini harekete geçirir ve DNA tamir edilemeyecek kadar zarar gördüğünde ise apoptozu başlatır.48, 14 Kanser hücrelerinin normal hücrelerden farkları: büyüme faktörlerine duyarsızlık, hücreler arası sinyallerle etkileşmeme, programlanmış hücre ölümünden (apoptoz) kaçabilme, kontrolsüz ve sınırsız bölünme potansiyelinde olma, genellikle daha büyük hücre çapına ve nukleusuna sahip olma, anjiogenezi devamlı olarak destekleyebilme, doku invazyonu ve metastaz yapabilme olarak belirtilmektedir. 49,50 2.6.2. Otofaji Otofaji, hücre içi makro moleküllerin ve organellerin bir membran içine alınarak lizozomal enzimler birleşerek burada yıkımlanması olayına verilen isimdir. Daha açık ifade edersek, bu tip hücre ölümünde en belirgin morfolojik değişiklik, sitoplazmada oluşan iki veya daha fazla katmanlı membranla çevrili, sitoplazma parçaları ya da 20 mitokondiri, endoplazmik retikulum (ER) gibi hücre içi organelleri içeren veziküllerin mevcudiyetidir. Bu vesiküller lizozoma birleşip, içerisinde taşıdıkları yüklerinin lizozomal enzimler tarafından parçalamasını sağlarlar. Ömürleri kısa olan proteinlerin ubikitin-proteozom sisteminde parçalananıyken, bunun aksine hücre içi organeller ve uzun ömürlü proteinler otofaji sistemi tarafından parçalanırlar ve hücre kullanımı için yeniden kazandırılan yapı taşları (örneğin amino asitler) oluşur. Otofaji kelime manası olarak kendi kendini anlamına gelir ve hücrenin besinsiz kaldığı durumlarda fizyolojik olarak besin elde etmek için hücre içindeki yapıları parçalandığını anlatmak için kullanılmıştır.4, 51 Otofaji 4 formda açıklanabilir; 1- Makrootofaji; İki zarla çevrili organellerin sitoplazma içinde parçalanması 2- Mikrootofaji; Membran invajinasyonu ile sitoplazmanın lizozom içine taşınarak parçalanması 3- Spesifik moleküllerin lizozom içerisine alınması olan şaperon bağımlı otojaji 4- Kanonikal olmayan- alternatif (Atg5/7 bağımsız) makrootofajidir. Bu dört otofaji formundan makrootofaji, birçok hücrede bazal seviyede meydana gelmekte, parçalanan protein ve yapısı bozulmuş olan organellerin parçalanmasında çok önemli bir fonksiyonu vardır. Genel olarak da hücrelerde makrootofaji denildiğinde otafaji kastedilmektedir.51 Yapılan araştırmalarda günümüzde 30’dan fazla Atg geni (Autophagy-related proteins) tanımlanmıştır. Atg proteinleri olarak ilk olarak mayalarda bulunmuştur. Atg proteinlerinin bir kısmı ve çeşitli protein kompleksleri “otofajik kesecik” ya da bir başka deyişle “izolasyon membranının” ve otofagozom oluşumunda rol almaktadır.51 Otofajiyle ya da otofagozom oluşumuyla ilgili proteinler 4 temel kategoride incelenmektedir. Bunlardan birincisi, Atg1/Unc-51-like kinase (ULK) kompleksi, 21 ikincisi ubiqutin-benzeri (Atg12 ve Atg8) konjugasyon sistemleri, üçüncüsü sınıf III fosfotidilinozitol 3-kinaz (PtdIns3K)/Vps34 kompleksi ve dördüncüsü iki transmembran proteinleri (Atg9 ve VMP1) dir.52 Hücredeki otofajik aktivitevi başlatan açlık, hipoksi ve çeşitli stres faktörleridir. Otofajik aktivitenin denetiminde rol oynayan, target of rapamycin (TOR) protein kompleksi önemlidir. TOR, ilk olarak mayada mantar tedavisi için geliştirilmiş bir ilaç olan Rapamisinin hedefi olarak ortaya çıkarılmıştır. TOR hücrede protein sentezini ve hücrenin büyümesinin kontrolünü sağlayan bir kinazdır. Bu proteinin baskılanması ile mayalarda ve memelilerde otofaji aktif olmuştur. Dolayısıyla, mammalian target of rapamycin (mTOR) yolağı otafajiden sorumlu bir oluşum olarak kabul edilmektedir.51 mTOR iki farklı kompleksin (mTORC1 ve mTORC2) katalitik alt ünitesi olarak işlev yapmaktadır. mTORC1, mTOR ve raptor birimlerinden oluşur. Raptor, mTOR’ un regulasyonundan sorumlu protein birimi olarak görev yapar. mTORC1 ULK1/2 (mayadaki Atg1’in homoloğu), mAtg13 ve FIP200 (mayadaki ATG17’ in insandaki homoloğu) ile bileşik yapar. mTORC1’ in mTOR kısmı ULK1 ve Atg13’yi fosforlar bu sayede de ULK1’ nin kinaz aktivitesinin devamını sağlar. Kısaca, besin varlığında mTOR proteini ULK1 ve Atg1 proteinleri üzerinde gerçekleştirdiği fosforilasyon sayesinde otofajiyi baskılar. Hücrelerde, mTORC1 aktivitesi inhibe olduğunda ise mTORC1 Atg13’ ü fosforlayamaz ve ULK1’ nin kinaz aktivitesi ortadan kalkar. Buna bağlı olarakta otofagozom oluşumu ve bunun takibinde otofaji meydana gelir. Dolaysıyla, besinin bol olduğu durumlarda mTOR proteini, otofaji proteinlerinden biri olan Atg13’u uyarmakta ve otofajiyi inhibe etmetkedir. Açlık durumunda ise mTOR etkinliğinin azalmasına ile Atg13 fosforile olmamakta ve otofaji inhibe edilmektedir.52 Hücrelerde mTOR aktivitesinin düzenlenmesinde ise PI3K-Akt-mTOR, LKB1AMPK-mTOR, P53, Beclin1 ve Bcl-2 yolakları görev almaktadır. PI3K-Akt-mTOR 22 yolağındaki Akt aktivasyonu mTOR’u inaktif ettiğinde otafaji inhibisyona uğramaktadır. PI3K sınıflarıda mTOR üzerindeki etkisini Akt aracılığıyla gerçekleştirmektedir. Sınıf I PI3K Akt’yi aktive ederek otafajiyi inhibe ederken, sınıf III PI3K Akt’yi inhibe ederek otofajiyi uyarmaktadır. Bir tümör supresör geni olan PTEN’de Akt aktivitesini inhibe ederek otofajiyi uyarmaktadır. Yine bir tümor baskılayıcı gen olan ARHI’ de PI3K-Akt yolunu inhibe ederek otofajiyi indüklemektedir.53 AMPK (Adenosine monophosphate-activated protein kinase) lipid, kolesterol, glikoz metabolizmalarının yanı sıra kanserlerde yakın ilişkili olan bir moleküldür. Enerji stresi koşullarında bu molekül mTOR’u baskılayarak otofajiyi başlatmaktadır. LKB1AMPK-mTOR yolağında, serine/threonine kinase LKB1 (ayrıca STK11 olarak bilinir) AMPK’yı aktive etmekte, AMPK’ da mTOR’u baskılamaktadır. Bu şekilde de LKB1AMPK-mTOR yolağıyla otofayi gerçekleştirilmektedir. Yapılan çalışmalar ayrıca, AMPK’nın kalsiyum ve kalmodulin bağımlı protein kinaz 2 (CAMKK2) tarafından da aktif edildiğini göstermiştir.54,55,56,57 Tümör baskılayıcı gen olarak bilinmesinin yanı sıra, P53 geni DNA hasarlarının tamirinde de görev almaktadır. Diğer taraftan, P53’ ün AMPK’yı aktive ettiği, mTOR’u inhibe ettiği ve bu şekilde de otafajiyi uyardığı bilinmektedir. Ayrıca, P53’ ün kanserli hücrelerde Sestrin2 ve Bax (Bcl-2 bağlantılı X proteini) gibi diğer yolakları da aktive ederek otofajiyi uyardığı da belirtilmektedir. P53’ ün aktivasyonuna besin eksikliği ve diğer stres faktörlerinin etken olduğu, aktifleşen p53’ ün ise bahsedilen yolaklar aracılığıyla otafajiyi uyardığı açıklanmaktadır.53 Beclin 1 (Atg6 olarak ta bilinir) insan dokularında ifade edilir ve endoplazmik retikulum, mitokondri ve perinukleer aralıkta bulunur. Beclin 1 otofajinin yanı sıra tümor gelişiminin baskılanmasında görev alır. Otofaji olayında otofaji için gerekli olan çift zarlı otofagozom oluşumunda görev alır. Beclin 1’in kaybı insanda meme, ovaryum ve prostat 23 kanserlerine sebep olmaktadır.58-60 Beclin 1, hücrede otofaji oluşumu ile ilgili yer alan Bcl-2, Vps34, p150, UVRAG, Bif1, Atg14L ve Rubicon gibi diğer proteinlerle bağlanarak büyük bir kompleks meydana getirir ve bu şekilde otafajide görev üstlenirler.53 Beclin 1’ in aksine, Beclin 2 familyasındaki proteinlerin ise genellikle apoptozis ve otafajiyi inhibe ettikleri belirlenmiştir.59 Örneğin, Bcl-2’nin knockdown edilmesiyle meme kanseri hücrelerinde otofajinin indüklendiği belirlenmiştir.61 Yine, antisens RNA kullanılmasıyla Bcl-2 susturulmuş kanser hücrelerinde otafajinin tekrar indüklendiği gösterilmiştir.62 Yapılan çalışmalar besin yetersizliğinin, hipoksi, oksidatif stres, patojen enfeksiyonu, radyasyon ve anti kanser ilaçlarının uygulanması durumunda otofajinin devreye girerek hücre homeostezisini sağladığını göstermektedir. Bununla birlikte aşırı veya düzensiz otafaji durumlarında sinirsel bozuklukların, yaşlanmanın ve hatta kanserin ortaya çıkabileceği belirtilmektedir.63 Özellikle, insan meme, prostat ve ovaryum kanserlerinin %40-70’ inde otafajiden sorumlu bir gen olan Beclin 1’de monoallelik kaybın olduğu tespit edilmiştir. Bu da tümör gelişiminin engellenmesinde otafajinin çok önemli bir süreç olduğunu ortaya çıkarmıştır.64 Otofaji tümör gelişiminin engellenmesinde her ne kadar gerekli bir süreç olduğu belirtilmiş olsa da, tümörlü hücrelerde stresle oluşturulan yapay otofajinin tümör hücrelerine tedaviye karşı direnç kazandırdığı ve tümör hücrelerini dormansiye soktuğu açıklanmaktadır. Nihayetinde de bu durumun tümörlerin yeniden büyümesini ve ilerlemesini sağladığı rapor edilmektedir. Bununla birlikte, tümör hücrelerindeki otofaji başlangıcının genetiksel yöntemlerle veya ilaç uygulamalarıyla engellenmesi sayesinde tümör hücrelerinin öldürülebileceği ve apoptotik hücre ölümünün başlatılabileceği bildirilmektedir. Dahası, kemoterapik ilaçlarla otofaji inhibitörlerinin birlikte 24 verilmesinin, tek başına kemoterapik ilaç verilmesine oranla in vivo ve in vitro koşullar altında tümör büyümesini çok daha fazla engellediği ve hücre ölümünü de çok daha fazla tetiklediği belirtilmiştir. Bu yüzdende ön otofajinin engellenmesi şeklinde gerçekleştirilen uygulamanın kanser tedavilerinde çok başarılı bir adım olabileceği ileri sürülmektedir.52 Normal hücrelerin aksine kanserli hücreler normal hücre ölüm sinyallerine cevap vermeyerek hayatta kalma başarısı göstermektedirler. Mevcut anti kanser ilaçları ise kanser hücrelerini apoptoz yolundaki ölüm sinyallerine cevap verecek şekilde etkilemektedirler. Bununla birlikte, bazı kanser türlerinin apaptotik yollarını tamamen kaybettiği ve bu yüzdende uygulanan tedavilerden veya antikanser ilaçlarından etkilenmediği belirlenmiştir. Böyle durumlar içinde, araştırmacılar diğer bir hücre ölüm mekanizması olan otafajiyi harekete geçirerek kanserli hücreleri yok eden antikanser ilaçlarına yönelmeye başlamışlardır.65 Bu doğrultuda da mTOR inhibitörleri ve dolayısıyla da otofaji indükleyici ajanlar olan rafamisin (sirolimus), rafamisin türevleri (everolimus, temsirolimus vb.), arsenik triokside ve temozolomide gibi maddeler apoptozis-dirençli kanserlerde ilaç olarak kullanılmaktadır.66 Yine yapılan bir başka çalışmada bazı anti-deprasantların (maprotiline ve fluoxetine) apoptozis-dirençli kanserli hücrelerde otafajiyi harekete geçirerek kanser gelişimini durdurduğu rapor edilmiştir.65 2.7. Cisplatin Etki Mekanizması Platin bileşikleri kemoterapi de çok kullanılan ilaçlardır. Bu grup içinde bugün için 3 molekül mevcuttur: cisplatin, kaboplatin ve oksaplatin. Bunlardan cisplatin en nefrotoksik olanıdır.67 Cisplatin (cis-dimminedichloroplatinum II, CDDP) inorganik divalent, suda çözülebilen platin bir bileşiktir. İki değerlikli bir merkez atomuna bağlı iki amonyum ve iki klor bağı içerir.68 25 Şekil 2.3. Cisplatin moleküler yapısı68 Birçok kanser türünde kullanılan bir kemoterapötik olan cisplatin yıllardır başarılı bir şekilde kullanılmaktadır.6, 7 DNA ve RNA gibi nükleofilik moleküllerle kolaylıkla etkileşime girme özelliğine sahip bir ilaçtır. Sitotoksisitesinin bu özelliğinden kaynaklandığı sanılmaktadır. Cisplatinin anti kanser özelliği, hücre döngüsüne girerek onu bloke etmesinden, DNA replikasyonunu ve RNA transkripsiyonunu engellemesinden ve apoptoza yol açmasından gelmektedir.6 Bütün kemoterapötikler gibi cisplatine karşı da bir direnç oluşmaktadır. Cisplatin uygulaması ile kanser hücrelerinde anti-apoptotik genlerin ekspresyon artışının uyarılması sonucunda kemoresistans gelişimi şekillenmektedir.6 Bu direnci ortadan kaldırmak için cisplatinin yüksek dozlarda uygulanması gerekmektedir ancak yüksek dozlarda cisplatinin nefrotoksisite ve hepatotoksisite gibi toksik etkileri ortaya çıkarmaktadır.7,8 Düşük dozlarda ise cisplatinin etki oranı azalmaktadır. Bu oran cisplatinin diğer kemoterapötiklerle kombine kullanılması ile arttırılabilir ve böylece toksik etkisi de düşürülebilir.7 Yapılan bir çalışmada gemcitabin ile cisplatinin kombine kullanımı yalnız gemcitabin kullanımına oranla daha iyi etki ve daha hafif toksisite gösterdiği rapor edilmektedir.69 Ayrıca bu kemoterapötiklerden birkaçının kombine kullanımı son yıllarda birçok kanser tedavisinde başvurulan seçeneklerden birisi olmaktadır. Böyle kombine kullanımın sonucu olarak kanser tedavisinde daha etkin bir sonuç ve daha düşük toksisitenin oluşması sağlanabilmektedir.9 26 Şekil 2.4. Cisplatin karşı gelişen direnç mekanizması70 2.7.1. Cisplatinin doz sınırlayıcı etkileri; Cisplatin farklı kanser gruplarında antineoplastik bir ajan olarak kullanılmaktadır. Ancak bu ilacın yüksek dozlarda alınmasının büyük oranda nefrotoksisiteye neden olmasının yanısıra hepatotoksisiteye de neden olduğu bilinmektedir.8 Cisplatinin toksisitesinde en büyük hedefi mitokondride meydana gelen oksidatif strestir. Bunun sonucu olarak mitokondrial protein-sülfidril kaybolmaya başlamakta ve mitokondrial membran potansiyeli düşmektedir. Yapılan incelemelerde cisplatinin, ALT ve AST seviyelerinde yükselmeye ve nitrit oksit, kalsiyum ve albümin seviyelerinde de düşme etkeni olduğu belirtilmektedir.8 Schmid ve ark.’nın akciğer kanserli hastalar üzerinde yapmış olduğu bir çalışmada, cisplatinin sitotoksite ile hücreleri apoptoza uğrattığını bildirmektedir. p53 seviyelerinin artıp artmadığı konusunda ise net bir bilgi bulunmamaktadır.71 2.8. Kanser Tedavisinde Antioksidanların Rolü Kanser tedavisinde hücresel hasara neden olması için serbest radikallere ihtiyaç vardır. Yapılan bir çalışmada kemoterapi ile eşzamanlı olarak alınan antioksidanların, kemoterapinin etkinliğini düşürdüğünü göstermektedir. Buna rağmen insanlar üzerinde yapılan iki çalışmada, melatoninle kemoterapinin kombine kullanımının, yalnız 27 kemoterapi kullanımından daha etkili olduğunu gösterdiler.72 Bu çalışmaların biri, meme kanserinde tamoxifenin melatonin ile kombine kullanımıdır. Bu çalışmada tomoxifenin melatonin ile kombine kullanılması, tamoxifenin yalnız kullanılmasından daha etkili sonuç verdiği ve kanda tümör büyüme faktörlerinin seviyelerinin düştüğü görülmektedir.73 Bir başka çalışmada ise melatoninin MCF-7 hücrelerinde p53 ve p21 ekspresyonunu arttırdığı ve proliferasyonu düşürdüğü belirtilmektedir.74 2.9. Melatonin Melatonin hormonunun keşfi 1950’li yılların sonlarında yapılmıştır. Fakat bu tarihten tam üç yüz yıl önce ünlü Fransız Filozof Rene Descartes melatonin hormonunun salgılandığı yer olan pineal bezi ruhun sığınağı olarak tanımlamıştır. Günümüzde ise birçok makalede melatonin uyku, ruh hali, tümör büyümesi ve yaşlanmanın biyolojik düzenlenmesinde görevli olduğu bulgularına rastlanmaktadır. Yapılan birçok hayvan deneyi çalışmalarında melatoninin hormonunun asıl görevlerinden başka özelliklerinin keşfedilmeye başlanmasıyla birlikte bu hormon popular hale gelmiştir. Ancak melatoninin insan fizyolojisi ve patofizyolojisi üzerine etkileri hala tam olarak belirsizliğini korumaktadır.75,76 N-asetil 5-metoksi triptamin olarakta bilinen melatonin hormonu ilk olarak sığır pineal bez kaynaklı molekülün kurbağa derisinin rengini açması ve bu derinin pigment hücrelerindeki melatonin granüllerini aglutine etmesiyle tanımlanmıştır.75, 77 Melatonin hormonu memelilerde başlıca beynin serebral yarım küreleri arasında bulunan pineal bezden salgılanmakla birlikte ayrıca over, retina, harder bezi, lakrimal bez, eritrositler, trombositler ile gastrointestinal sistemden de sentezlenip salgılanan nöro transmitter bir hormondur. Bu hormon hem yağda hem de suda çözünebilir özelliğin de olduğu için nucleus dâhil hücrenin her organeline ulaşabilir.78,79 Melatoninin sentezi ve salınımı karanlıkla uyarılır ışıkla inhibe edilir. Gün ışığı boyunca, fotoreseptör hücreleri 28 hiperpolarizedir yani norepinefrin salınımı inhibe edilir. Sistem çok az miktarda melatonin salgılar. Karanlıkla birlikte fotoreseptörler norepinefrin salar ve böylece sistem aktif hale geçer. Aril alkilamin enziminin seviyesinin artmasıyla da melatonin sentezi ve salınımı artar. Melatonin sentezi arttıkça kan dolaşımına giren melatonin seviyesi de orantılı biçimde artmaktadır. İnsanlarda melatonin salgılanması karanlıkla birlikte artmaya başlar ve gece 2-4 saatleri arasında pik noktaya ulaşır ve sonrasında yavaş yavaş düşmeye başlar.80,81 2.9.1. Melatonin Hormonunun Biyosentezi ve Salgılanması Memelilerde pieal bez hormonu olan melatonin esansiyel bir amino asit olan triptofandan sentezlenmektedir. İlk basamakta triptofan hidroksilaz enzimi tarafından 5hidroksi triptofana daha sonrada bunun dekarboksile olmasıyla 5- hidroksitriptamine (seratonine) dönüşür. Seratonin arylalkylamine-N- asetilltransferaz enzimiyle N-asetilseratonin formuna dönüştürülür. Son olarak N-asetilserotonin hidroksiindole-O-metiltransferaz enzimi aracılığıyla N-asetyl- metoksitriptamine (melatonin) dönüşür. Sentezin düzenlenmesi pirimer olarak karanlığa bağlıdır. Sentezden sorumlu N-asetiltransferaz’ ın aktivitesi fotoperiyotik şartlar altında düzenlenmektedir. Işık altında retinada oluşan sinirsel impulslar hipotalamusta bulunan suprachiasmatic nukleus ve digger hipotalamusta bulunan yapılara aktarılır. Bu bölgelerin uyarılmasıyla beraber karanlığında etkisiyle postgangliyonik sempatik liflerden salıverilen nonadrenalin β1 reseptörlerine bağlanarak serotonin ve N-asetiltransferaz’ ın salıverilmesine neden olur. Nöronlarda ve pineal bezdeki biyokimyasal sinyallerin etkisiyle melatonin anabolizması hızlanır ve bu hormonun sirkadiyen ritme bağlı olarak sentez ve salıverilmesi gerçekleşir.19,82-84 29 Şekil 2.5. Melatonin salgılanmasının fizyolojisi 2.9.3. Melatoninin Apoptotik ve Anti-kanserojenik Etkisi Melatoninin ile ilgili yapılan birçok in vivo ve invitro çalışmalarda bu hormonun onkostatik etkiye sahip olduğu, birçok kanser türünde oluşan semptomları hafiflettiği, tümör anjiogenezisini, poliferasyonunu, metastaz oluşumunu yok edici etkiye sahip olduğu görülmektedir.85,86 Pinealektomi yapılan hayvanlarda tümör büyümesinin artırdığı ve daha sonra bu hayvanlara melatonin uygulaması yapıldıktan sonra tümör gelişiminin yavaşladığı bildirilmiştir.75, 87 Melatoninin etkileri, ileri derece kanserli bazı hastalarda çalışılmış ve olumlu sonuçlar alınmıştır. Örneğin, glioblastomalı hastaların bir kısmına yalnız radyoterapi verilirken diğer bir kısmına melatonin ile kombinasyon uygulanmıştır. Kombine kullanım yalnız radyoterapiye göre çok daha iyi sonuçlar alınmasını sağlamıştır.88 Melatoninin tümör gelişimindeki olumlu etkilerinin; 1- Kanser hücreleri tarafından yağ asidi büyüme faktörü alınımını kısıtlayarak, 2- Telomer uzunluğunu azaltılması yoluyla telomeraz aktivitesini kısıtlayarak kanser hücrelerinde apoptoza neden olarak, 3- Tümörlerde damar gelişmesini sebep olan anjionik bir faktör olan endotelin-1 sentezini baskılayarak, 30 4- Tümör baskılayıcı bir gen olan P53 geninin ekspresyonunu sağlayarak gerçekleştirmektedir.85 Son yıllarda yapılan çalışmalarda hastalarda tümör oluşumuyla birlikte uyku bozukluğunun da görüldüğü bildirilmiştir.89 Melatoninin kanser hastalarında biyolojik regülasyonu düzenleyerek yeni tümör oluşumlarını engellediği ve kanser hastalarının yaşam kalitesini iyileştirdiği görülmüştür.10 Hayvan deneyi çalışmaları ve klinik denemelerde melatonin hormonunun meme kanseri, prostat kanseri, akciğer kanseri, kolon kanseri ve diğer kanser türlerinin gelişmesini baskılayıcı özelliğinin olduğu görülmüştür.90,91 Ayrıca melatoninin kemoteröpotik ilaçlarla beraber kullanıldığında ilaçların yan etkilerini azalttığı bu sebepten dolayı da hastaların yaşam standartlarını iyileştirdiği görülmüştür.89 Shilian Hu ve ark., akciğer kanserli hastalarda yapmış oldukları bir çalışmada kemoterapi uygulanan hastaların serumlarında triptofan ve melatonin hormonunun düşük olduğunu, bu hastalara dışarıdan triptofan verilerek melatonin sentezini arttırmanın önemli olabileceğini bildirmişlerdir.91 Bizim çalışmamızda melatonin ve/veya cisplatin uygulamaları ile amaçlananlar; -Kolorektal kanser hücrelerinde melatonin apoptotik ve otojajik etkilerinin araştırılması -Kolorektal kanser hücrelerinde cisplatin uygulamasının apoptotik ve otojajik etkilerinin araştırılması -Kolorektal kanser hücrelerinde melatonin ve cisplatin uygulamalarının cisplatinin apoptotik ve otojajik etkinliklerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. 31 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Hücre Kültürü 3.1.1. Hücre Kültür Medyumunun Hazırlanışı 87 ml hazır DMEM hücre kültürü medyumu (Sigma Co., USA) 2 ml L-Glutamin (Gibco, USA) 1ml Penisilin+Streptomisin+Amfoterisin B (Sigma Co., USA) Maddeleri eklenerek100 ml kullanıma hazır hücre kültür medyumu elde edildi. 3.1.2. Hücre İnkübasyon Koşulları Parental HT-29 monolayer hücre kültürü medyumu içerisinde %5 CO2 37 oC’e sıcaklıktaki etüvde (Esco) 25 cm2’lik flasklarda steril şartlarda inkübe edilerek hücrelerin çoğalması sağlandı. 3.1.3. Hücrelerin Pasajlanması (Subculturing) Üremekte olan hücre pasajları %80-90 doygunluğa (confluent) ulaşınca hücreler yeniden pasajlandı.92 Bu amaçla üremekte olan hücreler istenen çoğunluğa ulaştığında; Üzerlerindeki besi yeri pipetle alınarak steril fostat tampon solüsyonu (PBS) (25 cm2 için 2 ml) ile yıkandı. PBS pipetle uzaklaştırıldıktan sonra hücrelerin kaldırılması için 3 ml tripsinEDTA solüsyonu ilave edilerek etüvde 10 dk. bekletildi. Tüm yüzeye yapışık hücrelerin kaldırılmasının ardından süspansiyon halindeki hücre tripsin-EDTA solüsyonu 15 ml hacimli bir tüp içerisine alınarak üzerine tripsinin inhibisyonu için tripsin hacminin 2 katı medyum eklendi. Tüpe alınan süspansiyon 1500 rpm de 10 dk. santrifüj edilerek tripsin-EDTA solüsyonu uzaklaştırıldı ve hücreler taze hücre medyumu ile süspanse edilerek 3 adet 25 cm2‘lik flaska bölünerek yeniden pasajlandı. Yeniden pasajlanan hücreler 37 oC’ de %5 CO2 ortamında inkübe edildi. 32 3.1.4. Hücre Dondurma ve Saklanması Tripsin-EDTA ile yüzeyden kaldırılan hücreler santrifüj edildi ve tripsin besi yerinden uzaklaştırıldı. Sonra hücre pelleti 1 ml besi yeri ile sulandırılarak sayıldı. Tripsin, hacminin en az iki katı serumlu besi yeriyle inhibe edildi. Hücreler pipetleyerek tek hücre süspansiyonu haline getirilip bir falkon tüpe aktarıldı. Üzerine 2-3 ml daha medyum ilave edildi. Hücre süspansiyonu santrifüjlenerek (1500 rpm’de 10 dk), süpernatant uzaklaştırıldı. Pelet 900 µl hücre medyumu ile sulandırılarak sayıldı. Dondurma tüpleri içerisine 100 µl dimetilsülfoksit (DMSO) ve 900 µl hücre medyumu ile süspanse edilen hücre solüsyonu eklendi. Tüpler dondurma kabına yerleştirilerek - 80 oC’de derin dondurucuda gerektiğinde analizlerin tekrarı için hücre hattı saklandı. 3.1.5. Hücre Sayılarının Hesaplanması 1 ml kültür medyumunda sulandırılan hücre süspansiyonundan 10 µl alınarak ependorf tüpe kondu ve üzerine 90 µl tripan blue boyası eklenerek karıştırıldı. Bu karışım Neubauer lamı üzerine konularak 5 bölmedeki hücreler sayıldı, daha sonar bulunan bu sayı sulandırma miktarı x50.000 sayısı ile çarpıldı. Sonuç olarak 1 ml medyumda kaç milyon hücre olduğu bulundu. Böylece ekim yapılacak sayı belirlenip hücrelerin petriye ekimleri yapıldı. 100 mm’lik kültür petrisine 5x106 hücre ve 96 kuyucuklu kültür plağının her kuyucuğuna 5000 hücre transfer edildi. 33 3.2. Hücre Canlılığı Analizi 3.2.1. MTT Yöntemi MTT analizi, formazon boyalarının ya da MTT azalmasına bağlı olarak enzim atik aktivitesinin kolorimetrik ölçümüne dayanan hücre çoğalma miktarının tespit edildiği yöntemdir. Bu yöntemle kullanılacak olan herhangi bir terapotik ajanın hücre üzerindeki sitotoksikya da proliferatif etkileri belirlenebilmektedir. Melatonin ve Cisplatinin, MCF-7 hücre hattı üzerindeki olası sitotoksik etkileri MTT kiti ile üretici firmanın (Sigma Co. Germany) kullanım talimatına göre uygulandı. Yöntem MTT ajanı ile inkübe edilen hücrelerde meydana gelen renk değişiminin kolorometrik olarak belirlenmesi prensibine dayanmaktadır. Oluşan renk değişikliği sarı ile renklendirilmiş formazon tuzlarının aktif hücre mitokondrilerinde tetrazolyum tuzu azalmasıyla oluşmaktadır. Bu bileşiklerin absorbans değeri metabolik olarak aktivitelerinin belirlenebilmesi açısından orantılıdır. 3.2.2. Yapılış Yöntemi MTT yönteminin uygulamasından 1 gün önce 96’lik plak içerisine sayımı yapılan 5000 hücre (5000/kuyu) ile 100 µl medium hazırlanarak kuyulara ekimi yapıldı. Mikroplak 24 saat 37°C ve %5 CO2 ayarlı inkübatörde bekletilerek hücrelerin yüzeye yapışmaları sağlandı. Bu yolla tripsin enziminin hücre membran proteinleri ve büyüme faktör reseptörleri üzerinde oluşturduğu zararlar ortadan kaldırılmış oldu. Bu protein ve faktörlerin yeniden sentezlenebilmesi için 24 saatlik bir süreye ihtiyaç duyulmaktadır.93Aynı zamanda bu yolla medium içerisindeki terapotik ajanların hücreyle muamelesinden önce hücrelerin metabolik aktivite kazanması sağlanır. 24 saatlik inkübasyondan sonar seri dilusyonlar halinde hazırlanan melatonin ve cisplatin maddeleri seriler halinde gruplara bölünen hücre hattı medyumuna ilave edildi (100 µl olan medium ve hücre karışımı üzerine 100 µl içerisinde dilusyonu yapılan ve 34 konsantrasyonu ayarlanan melatonin ve/veya cisplatin eklendi). A serinin birinci sütunu hücre kontrol ve A serisinin ikinci sütunu meydum kontrol olarak ayarlandı. Melatonin ve cisplatin uygulanan hücre hatlarına 24 ve 48 saat süreli inkübasyonlardan sonra MTT yöntemi uygulandı. MTT analizi; 1- Doksanaltılık plak kuyucuklarında bulunan 100 µl medium ve hücre karışımı üzerine, hazırlanmış tiazolil mavi tetrazolium bromid solüsyonundan 10 µl ilave edildi. Bu solüsyon ilavesini takiben 96’lık plak inkübatöre alınarak 3 saat beklenildi. 2- Üç saatlik inkübasyonun ardından hücrelerin yüzeyinde bulunan medium bir pipet ile alınarak MTT çözücü solüsyonundan 100 µl ilave edilip 20 dk. inkübatörde bekletildi. 3-İnkübasyonu yapılan hücrelerin, mikroplak okuyucu spektrofotometre (µQuant, BioTek Instruments, Winooski, Vermont, USA) ile 570 nm absorbans değerinde ölçümleri 3 tekrarlı olarak yapıldı. 3.3. Tunel Boyama Metodu 3.3.1. Hücrelerin lamda üretilmesi i. Poly-L-lysine kaplı lamlar (Thermo Fisher Scientific, USA) Lamlar, 10 cm çapındaki petri kutularına hücre ekimi yapılmadan önce yerleştirilerek class II tip biyogüvenlik kabini içerisinde 4 saat süreyle ultraviyole ışık altında sterilize edildi. ii. 25 cm2’lik flasklarda çoğaltılan hücrelerden, ultraviyole ışık altında steril edilen petrilere her bir petri içerisindeki lamların üst yüzeylerine eşit miktarda (100 µL mediumda suspense yaklaşık 5000) hücre gelecek şekilde ekim yapıldı. iii. Lam üzerine hücrelerin yapışmasını takiben (ortalama 24 saat sonra), petriler gruplara ayrıldı ve melatonin ve cisplatin uygulanacak olan grupların petrilerine çeşitli 35 konsantrasyonlarda melatonin ve cisplatin eklenirken, kontrol grubundakilere aynı miktarda besi yeri medyumu konuldu. v. İnkübasyon sürelerinin bitimini takiben (24 ve 48 saat sonra) petri içindeki medyum pipet yardımıyla uzaklaştırıldı ve fosfat tampon solüsyonu PBS eklenerek hücre yıkama işlemi yapıldı. 3.3.2. Fiksasyon 1.PBS ile yıkanan ve lam üzerinde yapışık bulunan hücreler petrilerden çıkarılarak-20 oC’de soğutulmuş metanol içerisinde10 dakika tespit edildi. 2. Tespit edilen lamlar PBS ile yıkandı kurutuldu ve boyama prosedürüne başlanıncaya kadar -20 oC’de saklandı. 3.3.3. Tunel Boyama Boyama işlemine alınacak lamlar derin dondurucudan çıkarılarak oda ısısına gelinceye kadar bir süre bekletildi ve takiben PBS ile yıkandı. Endojen peroksitlerin bloklanması için %3’lük H2O2 solüsyonuda 10 dk bekletildi. Daha sonra 5 dk süre ile 3 kez PBS solüsyonuyla yıkandı. Permeabilizasyon için (intrasellüler protein tespiti için oldukça önemlidir); lamlar %0.1Triton X-100-PBS solüsyonunda 10 dk. bekletildi. Lamlar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra %1 BSA – PBS (bloklama) solüsyonunda 30 dk bekletilerek non-spesifik bağlanmaların önüne geçildi. Daha sonra Tunel solüsyonu damlatılarak 60 dk. beklendi Sonra PBS solüsyonu ile her biri 5 dk. süreyle 3 kez yıkandı. Yıkama işleminden sonra Converted Pod solüsyonu damlatılarak 30 dk. beklendi. Sonra PBS solüsyonu ile her biri 5 dk. süreyle 3 kez yıkandı. 36 Çekirdek boyaması için Harris’in Hematoksilen solüsyonunda 2 dk. bekletildikten sonra dereceli alkol ve ksilol serilerinden geçirilip entellan (Merck, Germany) ile kapatıldı. 3.3.4. Tunel Pozitif Hücre Değerlendirmesi Tunel boyama sonuçlarının gruplar arası kıyaslamalarını yapabilmek için “Stereolojik Optic Fractionator Frame” metodu kullanıldı. Bu analizler stereoloji workstation sistemi (BioPrecision MAC 5000controller system) ve stereoloji software (Stereo Investigator version 9.0, Microbrightfield, Colchester, VT) ataçmanlı ışık mikroskop (Leica DM4000 B, Tokyo, Japan) altında yapıldı.94, 95 Çalışmamızda HT-29 hücre preparatları üzerinde tunel pozitifliği “Unbiased Counting Frame and Fractionator” metodu112, 113 kullanılarak tüm gruplara ait her bir preparattaki pozitif hücre yoğunluğu aşağıdaki formüle göre hesaplandı (Şekil4): PHY = PHS/(ÇA x ÇS), PHY; µm² alana düşen pozitif hücre yoğunluğu, PHS; pozitif hücre sayısı, ÇA; çerçeve alanı (µm²) ve ÇS; çerçeve sayısı. Elde edilen veriler her bir grup için iki tekrarlı ölçüme dayanmakta olup, her gruptan 4 paralel preparat boyandı. 37 Şekil 3.1. Stereolojik “Optik Fractionator Frame” metodu ile tunel pozitifliğinin değerlendirilmesi. 3.4. Kantitatif Real Time PCR (qRT-PCR) Analizleri 3.4.1. RNA İzolasyonu Hücre kültürü̈ ortamından total RNA izolasyonu ticari kit kullanılarak üretici firmanın önerileri dikkate alındı (Qiagen RNA Mini Kit, USA). İzolasyon kiti spin kolon metoduna dayalı olup özetle, - mRNA’nın spin kolon membranına bağlanması, - mRNA dışındaki kirliliklerin uzaklaştırılması ve - Kolon membranından RNA’nın çözülerek steril toplama tüpü̈ içerisine elüsyonu aşamalarından oluşmaktaydı. İzole edilen total RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik yöntemle miktarı belirlendi. Bu amaçla DNA/RNA ölçümleri için dizayn edilmiş̧ mikro hacimde ölçüm yapabilen Nanodrop cihazı kullanıldı (u-Biotek, USA) ve 260/280 nm değerlerine 38 göre RNA konsantrasyonu ve saflığı cihaz üzerindeki yazılımla otomatik olarak hesaplandı ve sonuçlar ng/μl olarak belirlendi. 3.4.2. cDNA Sentezi Total RNA’dan cDNA sentezi QuantiTect Reverse Transcription Kiti (Cat No: 205313, Qiagen, USA) kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir örnek için ters transkriptaz (reverse transkriptase) reaksiyon karışımı Tablo 3.1’de belirtildiği gibi hazırlandı. cDNA sentezi, 200 µl’lik steril tüplerde Thermal Cycler PCR cihazı (Applied Bioscience, USA) kullanılarak Tablo 3.2’de belirtilen sıcaklık ve süre şartlarında gerçekleştirildi. Tablo 3.1. cDNA sentezi reaksiyon karışımı İçerik Reverse-transcription master mix Quantiscript Reverse Transcriptase (RNase inhibitörü içerir) Quantiscript RT Buffer Hacim (μl) 1 μl 4 μl 1 μl RT Primer Mix Template RNA 14 μl 20 μl Total hacim Tablo 3.2. cDNA sentezi için PCR sıcaklık ve süre basamakları Basamak 1 Sıcaklık (°C) Süre Basamak 2 Basamak 3 Sıcaklık (°C) 42 Sıcaklık (°C) 42 Sıcaklık (°C) 95 Süre 2 dk Süre 15 dk Süre 3 dk Basamak 3 Sıcaklık (°C) 4 ∞ Elde edilen cDNA’ların konsantrasyonları spektrofotometrik yöntemle (μ-Biotek Nanodrop, USA) ölçülerek kaydedildi ve cDNA’lar qRT-PCR (Roche, German) ile rölatif kantitasyon analizleri yapılana kadar -20 ̊C’de saklandı. 3.4.3. Real Time PCR Cihazına Yükleme Aşaması Öncelikle karışım hazırlanacaktır. Her bir örnek için; 39 - 8 μl distile su - 5 μl probe master mix - 2 μl her bir primer için TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 primerlerinden) - 5 μl cDNA Standartlar İçin Hazırlanacak Mix; - 8 μl distile su - 5 μl probe master mix - 2 μl G6PD primer standartı - Farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış standartlardan 5 μl cDNA Standartların Hazırlanışı; - Standart 1: hiç sulandırma yapılmaz. Con:10000 - Standart 2: standart1 den alınan 5 μl cDNA üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde edilen Con :1000 - Standart3: standart2 den alınan 5 μl cDNA üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde edilen Con :100 - Standart4: standart2 den alınan 5 μl cDNA üzerine 45 μl distile su eklenir ve elde edilen Con :10 - Real Time PCR da Costom Assay PCR programı seçilir. Preinkibasyon - 1 cycles Analiz modu None. - 95 te 10dk Ramprate 4.4 Cooling - 1 Cycles Analis Mode None - 40 te 30 sn None Ramp Rate: 2.2 40 Absolite Quantificationda değer elde edebilmemiz için 4 adet standart kullanılır. Hazırlanan karışımlar plak üzerindeki her bir kuyucuğa uygun şekilde total hacim 20 μl olacak şekilde yüklenecek ardından plaktaki yükleme cihazına tanıtıp program başlatılacaktır. Real Time PCR programı tamamladıktan sonra Absolite Quantificatinda analiz yapılıacak ve standartları baz alarak cihazın örneklere verdiği değerler not edilecektir. 3.4.5. RT-PCR (Real Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu) TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA Ekspresyonlarının Ölçülmesi Her bir örneğe ait cDNA’lar kullanılarak genlerinın ekspresyonları (BECLİN1, ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3) Roche LightCycler 480 Real-Time PCR cihazında çalışılacaktır. Cihazın 96 kuyucuklu PCR plağı vardır. PCR işlemleri olurken, her bir kuyucuktaki amplifkasyon miktarını kantitatif olarak eş zamanlı verme özelliğine sahiptir. Bir plağa her bir örnek 7 kuyu kullanılacak şekilde yükleme yapılacaktır. Çalışmada 4 gen (TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3) ve farklı konsantrasyonlarda hazırlanmış standart G6PD kullanılacaktır. Her bir örnek için kullanılan 5μl cDNA, 8 μl ddH2O, 5 μl Probe Master mix 2 μl TP53, 2 μl MDM2, 2 μl CDKN1A 2 μl, CDKN1B, 2 μl BECLİN1, 2 μl ATG4 ve 2 μl LC3 primerleri aktarılacaktır. 3.4.6. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 Genleri mRNA Ekspresyon Tayininde Roche Lightcycler 480 Real-Time PCR Cihazı Real Time PCR da Costom Assay PCR programı seçilir. Absolite Quantificationda değer elde edebilmemiz için 4 adet standart kullanılır. Hazırlanan karışımlar plak üzerindeki her bir kuyucuğa uygun şekilde total hacim 20 μl olacak şekilde yüklenecektir. 41 Ardından plaktaki yükleme cihaza tanıtıp program başlatılır. Real Time PCR programı tamamladıktan sonra Absolite Quantificatinda analiz yapılarak standartları baz alarak cihazın örneklere TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 verdiği değerler not edilecektir. 3.5. İstatistiksel Analiz MTT sonuçlarının analizi için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) sonrası Duncan Post hoc testi kullanıldı. Önemlilik değeri (P) 0.05 olarak kabul edildi. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 gen ekspresyon seviyelerinin belirlenmesinde referans (Housekeeping) gen olarak G6DP kullanıldı. TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B, BECLİN1, ATG4 ve LC3 için hedef Gen/referans gen oranı alınarak normalize edildi. 42 4. BULGULAR 4.1. MTT Sitoksisite Sonuçları MTT analizleri sonuçlarının değerlendirmesinde, 24 saat inkübasyonu sağlanan gruplarda cisplatin uygulamasının sitotoksik etkisinin önemli oranda fazla olduğu belirlenirken, 48 saat inkübasyon gruplarında cisplatin ve melatonin (5µM) ile cisplatin uygulanan gruplarda da cisplatine yakın bir sitotoksik etki görülürken, yüksek dozda melatonin uygulamasının sitotoksik etkisinin çok az olduğu (Tablo 4.1 ve Şekil 4.1). Tablo 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçlar Gruplar 24h 48h Kontrol 0.854±0.08a 0.751±0.11a Mel-5µM 0.839±0.13a 0.696±0.23b Mel-10µM 0.863±0.21a 0.728±0.19a Cisplatin 0.728±0.14b 0.622±0.12b Mel-5µM-Cis 0.847±0.17a 0.649±0.15b Harflendirmeler gruplar arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir. 48h 24h Kontrol Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Şekil 4.1. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait sitotoksite sonuçları 43 4.2. Tunel Analizi Sonuçları Tunel pozitif hücrelerin değerlendirmesinde, Kontrol, Mel-5µM ve Mel-10µMCis uygulanan 24 saat inkübe edilen HT-29 hücreleri tünel pozitif hücre yoğunlukları arasında önemli bir farklılığın olmadığı görülürken (P>0.05), sadece cisplatin uygulanan HT-29 hücrelerinde önemli tünel pozitif hücre yoğunluğunda önemli oranda artışın olduğu belirlendi (P<0.05), (Tablo 4.2). Ayrıca, 48 saat süreli inkübasyon grubunda Cisplatin ve Mel-5µM- Cis grupları tünel pozitif hücre yoğunluğunun diğer gruplara göre önemli oranda yüksek olduğu görülürken (P<0.05), Mel-5µM ve Mel-10µM grupları tünel pozitif hücre yoğunluğunun kontrol grubu ile aralarında anlamlı bir farklılığın olmadığı belirlendi (P>0.05), (Tablo 4.2). Tablo 4.2. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait 1000 µm2 alandaki Tunel pozitif hücre yoğunlukları Gruplar 24h 48h Control 0.101±0.04a 0.151±0.02a Mel-5µM 0.115±0.02a 0.167±0.03a Mel-105µM 0.146±0.03a 0.203±0.04a Cisplatin 0.235±0.04b 0.426±0.07b Mel-5µM-Cis 0.165±0.07a 0.278±0.06c Harflendirmeler gruplar arasındaki istatistiksel farkı göstermektedir. 44 Şekil 4.2. Kontrol grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.3. Mel-5µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 45 Şekil 4.4. Mel-10µM grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.5. Cisplatin grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 46 Şekil 4.6. Mel-10µM- Cis grubu 24 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.7. Kontrol grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 47 Şekil 4.8. Mel-5µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.9. Mel-10µM grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 48 Şekil 4.10. Cisplatin grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü Şekil 4.11. Mel-10µM- Cis grubu 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait tunel boyaması görüntüsü 49 4.3. mRNA ekspresyonu Değerleri Sonuçları 4.3.1. TP53 mRNA ekspresyonu değerleri TP53 mRNA ekpsresyonu analizinde, 24 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücrelerinde Cisplatin ve Mel-5µM gruplarının ekspresyonu seviyelerinin Kontrol grubuna göre yüksek olduğu tespit edilirken edilen, Mel-10µM ve Mel-10µM- Cisplatin gruplarının ekpresyonlarının Kontrol grubuna yakın olduğu belirlendi (Tablo 4.3 ve Şekil 4.12). 50 Tablo 4.3. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Control Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis TP53 Geni 26.83 27.37 28.23 27.49 25.65 27.80 26.23 25.78 25.79 26.62 G6PD Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 TP53/G6PD 0.184 0.472 0.241 0.412 0.159 0.175 0.160 0.232 0.402 0.300 Şekil 4.12. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait TP53 gen ekspresyon değerleri. 51 4.3.2. MDM2 mRNA ekspresyon değerleri MDM2 mRNA ekspresyonu değerlendirmesinde, özellikle Mel-5µM ve Cisplatin grupları ekspresyonunun 24 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücrelerinde yüksek olduğu belirlenirken, Mel-10µM grubunda ekspresyonun kontrol grubuna göre yüksek olduğu fakat Mel-5µM-Cis grubunda ise düştüğü belirlendi. Kırk sekiz saat inkübasyonlu grupta ise en yüksek mRNA ekspresyonunun Mel-5µM-Cis grubunda olduğu görülürken, diğer gruplardaki nRNA ekspresyonu seviyelerinin düştüğü belirlendi (Tablo 4.4 ve Şekil 4.13). 52 Tablo 4.4. Farklı dozlarda melatonin ve cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Control Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Control Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis MDM2 Geni 26.67 24.56 24.74 24.10 22.76 24.35 23.95 23.16 23.71 23.40 G6PD Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 MDM2/G6PD 1.636 3.317 2.694 4.313 1.184 1.924 0.777 1.427 1.699 2.797 Şekil 4.13. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait MDM2 gen ekspresyon değerleri. 53 4.3.3. CDKN1A (P21) mRNA ekspresyonu değerleri Yirmi dört saat süreli inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücreleri CDKN1A mRNA ekspresyonu analizinde, en yüksek ekpresyonun Cisplatin grubunda olduğu görülürken Mel-5µM grubunda önemli bir artış görülürken diğer gruplardaki artışın kontrol grubu değerine yakın olduğu belirlendi. Kırk sekiz saat inkübasyon grubunda ise en yüksek değerlerin Cisplatin ve Mel-5µM-Cis gruplarında olduğu belirlendi. Diğer gruplardaki artışın Kontrol grubu değerine yakın olduğu görüldü (Tablo 4.5 ve Şekil 4.14). 54 Tablo 4.5. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis CDKN1A Geni 27.08 26.70 27.50 24.77 25.19 26.80 26.96 25.93 24.29 24.58 G6PD Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 CDKN1A/ G6PD 0.154 0.748 0.398 2.720 0.220 0.350 0.096 0.210 1.139 1.234 Şekil 4.14. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1A gen ekspresyon değerleri. 55 4.3.4. CDKN1B (P27) mRNA ekspresyonu değerleri CDKN1B mRNA analizinde 24 saat süreli inkübasyonlu grupta Mel-5µM grubunda ekspresyon seviyesinde yükseliş görülürken diğer grupların ekpresyon değişiminin Kontrol grubuna yakın oldukları belirlendi. Kırk sekiz saat süreli inkübasyonlu tüm grupların CDKN1B mRNA seviyelerinin Kontrol grubuna göre azaldığı tespit edildi (Tablo 4.6 ve Şekil 4.15). 56 Tablo 4.6. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis CDKN1B Geni 26.79 27.63 28.58 28.81 26.21 26.74 25.34 25.37 26.04 27.05 G6DP Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 CDKN1B/ G6PD 0.189 0.399 0.188 0.164 0.108 0.365 0.295 0.308 0.337 0.222 Şekil 4.15. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait CDKN1B gen ekspresyon değerleri. 57 4.3.5. BECLİN1 mRNA ekspresyonu değerleri BECLİN1 mRNA ekspresyonu analizi BECLIN1/G6PD sonucuna bakıldığında, 24 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücreleri en yüksek ekspresyon değerinin Mel5µM, Mel-10µM ve Cis gruplarında olduğu görülürken, Kontrol ve Mel-5µM-Cis gruplarında ekspresyonun azaldığı belirlendi. Diğer taraftan 48 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücrelerinde, Kontrol, Cisplatin ve Mel-5µM-Cis gruplarında BECLİN1 mRNA ekspresyonunun arttığı belirlenirken, Mel-5µM ve Mel-10µM gruplarının ekspresyon değerinin kontrole göre düşük olduğu belirlendi (Tablo 4.7. ve Şekil 4.16). 58 Tablo 4.7. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Kontrol Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Kontrol Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis BECLIN1 Geni 25.90 26.85 27.04 27.11 25.19 26.37 25.34 25.12 25.28 25.93 G6PD Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 BECLIN1 /G6PD 0.349 0.678 0.548 0.537 0.220 0.473 0.295 0.368 0.570 0.483 Şekil 4.16. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait BECLIN1 gen ekspresyon değerleri. 59 4.3.6. ATG-4 mRNA ekspresyonu değerleri ATG-4 mRNA ekspresyonu analizinde ATG-4/G6PD seviyelerinde, 24 saat süreli kolon kanseri hücreleri 24 saat inkübe edilen ve Cisplatin ve Mel-10µM gruplarının ATG-4 mRNA seviyelerinin Kontrol ve diğer 24 saat inkübasyonlu gruplara göre yüksek olduğu ve belirlenirken, en düşük değerin ise Mel-10µM-Cis grubunda olduğu belirlendi. mRNA ekspresyonu 48 saat inkübasyonlu HT-29 kolon kanseri hücrelerinin ATG-4 seviyelerinde ise en yüksek ekspresyonun Cisplatin ve Mel-10µM-Cis gruplarında olduğu görülürken, en düşük değerin Mel-5µM grubunda olduğu tespit edildi (Tablo 4.8 ve Şekil 4.17). 60 Tablo 4.8. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Control Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis ATG-4 Geni 27.78 28.59 29.18 29.06 27.32 28.12 27.36 26.90 26.77 27.25 G6PD Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 ATG4/G6PD 0.095 0.202 0.124 0.139 0.051 0.140 0.074 0.107 0.203 0.193 Şekil 4.17. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait ATG-4 gen ekspresyon değerleri. 61 4.3.7. LC3 mRNA ekspresyonu değerleri LC3 mRNA ekspresyon seviyelerine bakıldığında 24 saat süreli inkübasyon grubunda Mel-10µM ve Cisplatin gruplarında ekspresyonun önemli oranda arttığı belirlenirken, diğer gruplardaki değerler Kontrol grubuna yakındılar. Kırk sekiz saat inkübasyonu yapılan grupta ise Cisplatin ve Mel-5µM-Cis gruplarında önemli bir artış belirlendi. Mel-5µM ve Mel-10µM gruplarında ise Kontrol grubuna göre ekspresyonlarında azalış belirlendi (Tablo 4.8 ve Şekil 4.18). 62 Tablo 4.9. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri. 48 Sa 24 Sa Süre Gruplar Control Mel-5µM Mel-10µM Cisplatin Mel-5µM-Cis Control Mel-5µM Mel-105µM Cisplatin Mel-5µM-Cis LC3 Geni 30.67 31.24 30.11 30.23 29.57 30.04 29.34 29.31 27.09 27.72 G6PD Geni 24.38 26.29 26.17 26.21 23.00 25.29 23.59 23.68 24.48 24.88 LC3/G6PD 0.013 0.032 0.065 0.061 0.011 0.037 0.019 0.021 0.163 0.140 Şekil 4.18. Farklı dozlarda melatonin ve Cisplatin uygulamasıyla 24 ve 48 saat inkübe edilen HT-29 kolon kanseri hücre hatlarına ait LC3 gen ekspresyon değerleri. 63 5. TARTIŞMA Bu tez çalışmasında in vitro şartlarda, insan kolon kanseri hücre hattında (HT-29) melatonin ve/veya cisplatin uygulamalarının hücre sitotoksitesi, apoptotik hücre ölümü ve otofaji ile ilgili gen bölgelerinin ekspresyon seviyeleri üzerine etkilerinin araştırılması amaçlandı. Bu amaçla kolon kanser hücrelerine 5-nM ve 10-nM konsantrasyonlarında melatonin ile 50-M konsantrasyonda cisplatin uygulayarak 24 ve 48 saat süre ile inkübe edilerek tünel yöntemi ile apoptotik hücre yoğunluğu belirlenirken, kantitatif real-time PCR yöntemiyle BECLİN1, ATG4, TP53, MDM2, CDKN1A, CDKN1B ve LC3 genleri ekspresyonu seviyeleri analiz edildi. Çalışmada uygulanan melatonin ve cisplatin dozları daha önce yayınlanan çalışmalara göre belirlenmiştir.96 Kolorektal kanseri kanser türleri arasında en çok görülen dördüncü kanser türü olup, mortalite yönünden ise akciğer kanserlerinden sonra ikinci sıradadır. Kolon kanseri 100.000 kadında 37.5 insidans ile ve 14.1 mortalite oranıyla seyrederken, erkeklerde bu oran 100.000’de 52.2 insidans ve 20.5 mortalite ile görülmektedir.97 Kolon kanseri tedavisinde kemoterapi süresince, hastaların tedaviye cevap vermemesi veya tedavi sonrası kanserin tekrarlaması sıklıkla görülen bir durumdur.98 Diğer taraftan meme kanseri tedavisinde klinikte sıkça kullanılan ilaçların direnç geliştirme özelliklerinin olduğu, bu yolla meme kanseri tedavisinde bir takım başarısızlıkların yaşandığı bilinmektedir. Yapılan araştırmalar, yeni terapotik yöntemlerin geliştirilmesine olan ihtiyacı ortaya koymaktadır. Bu sebeple, kanser öncesi ve sonrası doğal antioksidan ve anti-kanserojen maddelerin kullanımı ile hücre ölümlerinin indüklenmesi günümüzde kanser tedavisi için sıklıkla araştırılmaktadır. Kanser hücresi apoptotik yolaklarında bulunan, tümör mikro çevresinde rol alan, büyüme faktörlerini ve reseptörlerini kodlayan ve hücre siklusunda rol olan bazı genlerin ekspresyon düzeylerindeki değişimlerin 64 malignant süreçte ya da dirençli hücreler üzerinde artan bölünme özelliğine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. In vitro hücre kültürü çalışmaları ile üretilen hücreler kontrollü bir şekilde çeşitli uygulamaların yapılabilmesine olanak sağlarken, direkt olarak uygulanacak madde ile hücrenin direk teması sağlanır. Böylece uygulamaların hücreler üzerine olan etkilerinin analizi yapılabilmektedir. Hücre kültürü̈ elde etme teknikleri, özellikle 1950 ve 1960'lı yıllarda virüslerin memeli hücrelerinde üretilmesi ile bu yöntem gelişme göstermiştir. Son yıllarda deneysel kanser araştırmaları ve kök hücre konusunun bilimsel olarak öneminin ortaya çıkması da bu yöntemi popüler yapmıştır.92 Bizim çalışmamızda HT-29 kolon kanseri hücrelerine hatlarını kullanarak melatonin, cisplatin ve melatonin-cisplatin kombine uygulamalarının apoptoz ve otofaji ile ilişkili bazı genler üzerine olan muhtemel etkilerini araştırdık. Çalışma MTT analizinde güçlü bir antioksidan olan melatonin ile yüksek toksik etkiye sahip cisplatinin kombine uygulanmaları ile bu maddelerin toksik etki düzeyinin 24 saat süreli inkübasyon peryotlarında cisplatinin toksik etkisinin önemli oranda azaldığı belirlenirken, 48 saat süreli inkübasyon kombine uygulamanın cisplatin toksisitesini istatistiksel olarak önemsiz oranda azalttığı belirlendi. Yapılan çalışmalarda melatonin uygulamasının nöroblastoma kanser hücrelerine uygulanan cisplatinin toksik etkisini azalttığı rapor edilmiştir.96 Diğer taraftan yapılan birçok çalışmada cisplatinin birçok organ üzerine toksik etkilerinin olduğu rapor edilirken,99, 100 melatoninin antioksidan etkisi birçok çalışmada belirtilmiştir.101, 102 Bizim çalışmamızda kolon kanseri hücrelerine uygulanan melatoninin antioksidan özellikleri ile hücrede redoks dengesini değiştirdiği ve bazı hücre içi enzimleri aktive ederek hücrede ölüm mekanizmalarını uyarabileceği belirlendi. 65 Melatonin birçok tür kanser üzerinde büyümeyi baskılayıcı bir etki göstermiştir.103-105 Melatoninin bu etkisinin antioksidan etkisi ile hücrede bazı enzimlerin aktivitesini sağlayarak hasarlı hücrenin ortadan kaldırılması özelliğine dayandırılmaktadır.103 Kanser hücrelerinde ölüm mekanizmalarında meydana gelen defektler neoplastik patogenezde çalışılmaktadır.106 Çalışmada melatonin ve cisplatin ile kombine uygulanmıştır. Doz ve zamana bağlı olarak apoptotik aktivasyonu üzerine etkileri araştırıldığı çalışmada melatonin uygulamasının özellikle 24 saat inkübasyon grubunda ve cisplatin ile kombine uygulanan 24 ve 48 saat inkübasyonlu gruplarda apoptotik aktivitenin kontrol grubuna göre yüksek olduğu belirlendi. Diğer taraftan apoptotik aktivitede rol alan TP53 geni ekspresyonunun 24 saatlik inkübasyon grubunda melatonin ve cisplatin uygulanan gruplarda 48 saat inkübasyonlu özellikle melatonin ve cisplatin kombine ve cisplatin grubunda arttığı belirlendi. TP53 inhibitorü olarak bilinen MDM2 gen seviyelerine bakıldığında ise 24 saat süreli melatonin ve cisplatin grubunda 48 saat süreli melatonin ve cisplatin kombine grupta ekspresyonun arttığı tespit edildi. p53 geni mutasyonları birçok kanser türünde sık görülen bir durumdur.107 Bu gen, sitotoksik ajanlara karşı tümör hücrelerinin duyarlılığının önemli bir belirteci ve DNA hasarında hücresel cevabın oluşmasını temin etmektedir. p53 gen bölgesinin sentezlediği p53 proteini, hücrede kısa süreli sentezlendiği için normal hücrelerde çok fazla birikememektedir. Fakat tümör hücrelerinde mutant p53 miktarı, DNA hasarına bağlı olarak çok miktarda sentezlenmektedir.108 Rapor edilen birçok çalışmada kanser hücrelerinde p53 mutasyonları aracılı apoptoz mekanizmasının devre dışı kaldığını bildirilmiştir.107 Kaabinejadian ve ark. MCF-7 hücre hattına adriamisin uygulaması ile p53 miktarının azaldığını belirlerken,109 Singh ve ark. resveratrol ve siklofosfamit uygulaması ile p53 ekspresyonunun arttığını rapor etmişlerdir.110 Ayrıca resveratrol uygulaması ile meme kanseri hücrelerinde p53 ekspresyonunun arttığı ve bu yolla 66 tümöral hücrelerde apoptozisin uyarıldığı rapor edilmiştir.12 Çalışma sonucunda melatonin ve cisplatin-melatonin kombine uygulamalarının TP53 geni mRNA ekspresyonunu arttırdığı belirlenirken melatonin ve cisplatin uygulamasının 48 saat süreli inkübasyonda kombine uygulamasının etkili olduğu belirlendi. P53 geni tarafından sentezi kontrol ettiği p21 (CDKN1A) geni, hücre döngüsünü kontrol eden CDK’ların sentezini sağlamaktadır. Bu sebeple p53 gen bölgesinde mutasyon geçirmiş hücreler üzerinde kontrolsüz bir hücre artışı meydana gelir.111 Ayrıca p32 geni tümör büyümesinin baskılanması ve proliferasyonun kontrolü gibi farklı hücresel süreçlerin regülasyonu için anahtar bir proteindir.112 Bizim çalışmamızda CDKN1A (p21) geni mRNA ekspresyonunun 24 saat süreli inkübe edilen melatonin 5nM ve cisplatin grubu ile 48 saat inkübasyonlu cisplatin ve kombine melatonin-cisplatin gruplarında seviyenin önemli oranda attığı belirlendi. Chen ve ark., çalışmalarında ultraviyole ile uyarılan keratonosit hücrelerinde p21 geninin seviyesinin arttığını ve p21 geni baskılanan (knockout gen) hücrelerde ise seviyenin azaldığını belirlemişlerdir.113 Han ve ark., ise çalışmalarında Camptothecin uygulamasının p53 geni üzerinden p21 geni ekspresyonunu arttırdığını rapor etmiştir.114 Çalışma bulgularımızın literatüre ile benzerlik gösterdiği ve 24 saat süreli inkübasyonda melatonin ve cisplatin uygulamalarının, 48 saat süreli inkübasyonda ise cisplatin ve kombine melatonin ve cisplatin uygulamalarının CDKN1A (p21) ekspresyon seviyesi üzerine arttırıcı bir etki gösterdiği belirlenmiştir. Siklinler hücrede bölünme kontrollerini sağlayan inhibitörlerdir. Siklin ailesi türü olan CDKN1B (p27) siklusun G2/M geçişini kontrol ederken transforming growth factor (TGF)-beta’nında baskılayıcısıdır.115 İnsan kanser türlerinde p27 seviyesinde genel bir düşüşün olduğu rapor edilmesine rğmen, çoğ epitel dokuda (meme dokusu epiteli, akciğer epiteli, ovaryum epiteli gibi) p27 ekpresyonunun yüksek olduğu bildirilmektedir.115 67 Ayrıca Palmqvist ve ark., p27 ekspresyonu seviyesinin gastrointestinal sistem malignant prognoz için önemli bir marker olabileceğini rapor etmiştir.116 Bizim bulgularımızda ise özellikle 24 saat inkübasyonlu 5nM melatonin konsantrasyon grubunun p27 seviyesini arttırdığı görülmüştür. Kanser hücrelerinde otofaji genetiksel yöntemlerle veya ilaç uygulamalarıyla engellenmesi sayesinde tümör hücrelerinin öldürülebileceği ve apoptotik hücre ölümünün başlatılabileceği bildirilmektedir. Bu çalışmada melatonin ve cisplatinin kombine ve yalnız otofajik etkinlikleri ortaya konmaya çalışılmıştır. Melatonin ve ciplatin uygulamalarının 24 saat süreli inkübasyonda ve 48 saat süreli uygulamalımızda ise cisplatin uygulamasının BECLİN1 mRNA ekspresyonunu arttırdığı belirlendi. Atg-4 ve LC-3 mRNA seviyelerine bakıldığında ise 24 saat süreli melatonin ve cisplatin grupları ile 48 saat uygulamalı cisplatin ve melatonin-Cisplatin kombine uygulamalarının artışa sebep olduğu tespit edildi. Bu otofajik gen bölgelerindeki artış ile uyarılan otofajik hücre ölümü kanser gelişimini durdurduğu bir çok çalışmada rapor edilmiştir. Yapılan bir başka çalışmada bazı anti-deprasantların (maprotiline ve fluoxetine) apoptozis-dirençli kanserli hücrelerde otafajiyi harekete geçirerek kanser gelişimini durdurduğu bildirilmiştir.65 BECLİN1 geninin otofajik etkisi ve tümör süpresör özelliği bildirilmiştir. Diğer taraftan BECLİN1 seviyesindeki düşüşün insanda meme, ovaryum ve prostat kanserlerine neden olmaktadır.58-60 Sasaki ve ark., çalışmalarında Chloroquine ve 5-fluorouracil uyguladıkları kolon kanserlerinde LC-3 protein miktarının arttığını belirlemişlerdir.117 Diğer taraftan laboratuvarımızda bortezomib uyguladığımız kolon kanserlerinde de benzer olarak LC-3 protein miktarının arttığı tespit edildi (yayınlanmamış bilgi). Diğer taraftan Atg-4 geni ekspresyonunun otofaji aktivitesi için gerekli olduğu rapor edilmiştir.118 Bizim bulgularımızdan 24 saatlik melatonin ve cisplatin uygulanan gruplar 68 ile 48 saat süreli cisplatin ve kombine cisplatin-melatonin uygulanan gruplarda otofajik etkinliğin arttığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, kolon kanser hücrelerinin çeşitli dozlarda ve sürelerde uygulanan melatonin ve/veya cisplatin uygulamaları hücrede oluşan cisplatin toksititesini azalttığı belirlenirken, apoptotik hücre ölümünü arttırdığı ve otofajik gen ekspresyonlarında artışa sebep oluğu real time-PCR analizleri sonucunda tespit edilmiştir. Melatonin ve cisplatin kombine uygulamalarının ve melatonin kolon kanseri tedavisinde koruyucu ve tedavi amaçlı olarak kullanılabilecek bir ajan olabileceği sonucuna varılabilmektedir. 69 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Çalışma bulguları doğrultusunda 5 ve 10 nM dozlarda melatonin, 50 M dozda cisplatin ile melatonin-Cisplatin kombine uygulamalarının HT-29 kolon kanseri üzerine apoptotik ve otofajik etkilerin değerlendirilmesinde; - Uygulanan maddelerden cisplatinin kolon kanseri üzerine sitotoksik olduğu belirlenirken, melatonin uygulaması ile toksik etkinin 24 ve 48 saat uygulama periyotlarında azaltıldığı belirlendi. - Cisplatin 24 ve 48 saat uygulama periyotlarının her ikisinde de apoptotik ve otofajik aktiviteleri arttırdığı tespite edildi. - Melatonin uygulamasının tek başına özellikle 24 saatlik inkübasyon periyodunda apoptotik ve otofajik gen bölgelerini etkileyerek aktiviteyi arttırdığı belirlendi. - Melatonin ile cisplatin uygulamasının hem sitotoksik etkisi az bulunurken, aynı zamanda apoptotik ve otofajik etkiyi arttırıcı olduğu belirlendi. 70 KAYNAKLAR 1. Kutluk T, Kars A. Kanser Konusunda Genel Bilgiler. Baskı. Türk Kanser Araştırma ve Savaş Kurumu Yayınları, 1994. 2. Wiencke JK, Zheng S, Lafuente A, Lafuente MJ, Grudzen L, Wrensch MR, Miike R, Ballesta A, Trias M. Aberrant methylation of p16INK4a in anatomicand gender-specific subtypes of sporadic colorectalcancer. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 1999, 8: 501-506. 3. Lee M, Han WS, Kim OK, Sung SH, Cho MS, Lee SN. Prognostic value of p16INK4a and p14ARF gen hypermethylation in human colon cancer. Pathology, Research and Practice, 2006, 202: 415-424. 4. Şimşek F, Vatansever HS. Apoptotik ve Otofajik Ölümlerde Hücre İçi Organizasyon. Yeni Tıp Dergisi, 2014, 31: 6-11. 5. Çelik S. Kronik myeloid hastalarda DAP kinaz geninin metilasyon analizi. Biyoteknoloji Enstitüsü. Ankara: Ankara Üniversitesi, 2007. 6. Stordal B, Davey M. Understanding cisplatin resistance using cellular models. IUBMB Life, 2007, 59: 696-699. 7. Apostolou P, Toloudi M, Chatziioannou M, Ioannou E, Knocke DR, Nester J, Komiotis D, Papasotiriou I. AnvirzelTM in combination with cisplatin in breast, colon, lung, prostate, melanoma and pancreatic cancer cell lines. BMC Pharmacol Toxicol, 2013, 14: 18. 8. Mansour HH, Hafez HF, Fahmy NM. Silymarin modulates Cisplatin-induced oxidative stress and hepatotoxicity in rats. Journal of biochemistry and molecular biology, 2006, 39: 656-661. 9. Kozuch P, Grossbard ML, Barzdins A, Araneo M, Robin A, Frager D, Homel P, Marino J, DeGregorio P, Bruckner HW. Irinotecan combined with gemcitabine, 5-fluorouracil, leucovorin, and cisplatin (G-FLIP) is an effective and noncrossresistant treatment for chemotherapy refractory metastatic pancreatic cancer. Oncologist, 2001, 6: 488-495. 10. Carlson LE, Campbell TS, Garland SN, Grossman P. Associations among salivary cortisol, melatonin, catecholamines, sleep quality and stress in women with breast cancer and healthy controls. J Behav Med, 2007, 30: 45-58. 11. Sudhakar A. History of Cancer, Ancient and Modern Treatment Methods. Journal Cancer Sci Ther., 2009 December 1, 1: 1–4. 71 12. Kara A. Resveratrolün meme kanseri hücre kültüründeki p53 aracılı apoptoz aktivasyonunun ve sitotoksisitesinin polimeraz zincir reaksiyonu (pcr), immunsitokimya ve mtt yöntemleriyle araştırılmas Sağlık bilimleri enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı. Doktora, Erzurum: Atatürk Üniversitesi, 2012. 13. Merlo LM, Pepper JW, Reid BJ, Maley CC. Cancer as an evolutionary and ecological process. Nature Reviews Cancer, 2006, 6: 924-935. 14. Çevik Ö, Aydın U, Gürsoy RN. Kanser Tedavisinde Lenfatik Hedeflendirme. Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi, 2012, 32: 67-90. 15. Bayram S. CHEK2 Genindeki Mutasyonlar ile Hepatoselüler Kanser ve Kolorektal Kanser Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Fen Bilimleri Enstitüsü. Adana: Çukurova Üniversitesi, 2010. 16. Düngül DÇ. Sporadik kolorektal kanser vakalarında genom ebadında tek nükleotit polimorfizm profilinin belirlenmesi ile yeni genetik yatkınlık genlerinin ve kanserin gelişmesinde etken olan genlerin belirlenmesi. Biyoteknoloji Enstitüsü. Ankara: Ankara Üniversitesi, 2011. 17. Gürbüzel M. Kolorektal Karsinomlarda P16 Ekspresyonu ve Prognostik Parametrelerle Karşılaştırılması. Patoloji Bölümü. Uzmanlık, İstanbul: T.C. Sağlık Bakanlığı Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi, 2008. 18. Yokus B, DÜ. Ü. Kanser Biyokimyası Dicle Üniv Vet Fak Dergisi, 2012, 1: 7-18. 19. Öner P. Kanser Biyokimyası. İçinde:Gürdöl F, Ademoğlu E (editörler). Biyokimya, Gözden Geçirilmiş 2 Baskı. İstanbul, Nobel Tıp Kitabevleri, 2013: 653-674. 20. http://www.kanser.gov.tr/daire-faaliyetleri/kanser-kayitciligi/108t%C3%BCrkiyede-kanser-kayitcigi.html; Sağlık istatistikleri yıllığı, 2012. Sağlık Bakanlığı. Sağlık Araştırmaları Genel Müdürlüğü. 12.12.2014. 21. Haggar FA, Boushey RP. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clinics in Colon and Rectal Surgery, 2009, 22: 191-197. 22. Rudy DR, MJ. Z. Update on colorectal cancer. AM Fam Phy, 2000, 61: 1759– 1769. 23. Garcea G, A., Sharma RA, Dennison A, Steward WP, Gescher A, Berry DP. Molecular biomarkers of colorectal carcinogenesis and their role in surveillance and early intervention. European Journal of Cancer, 2003, 39(8): 1041-1052. 72 24. Society AC. Colorectal Cancer Facts & Figures 2011-2013. 2011. 25. O’Connell JB, Maggard MA, Liu JH, Etzioni DA. Rates of colon and rectal cancers are increasing in young adults. The American Surgeon, 2003 69: 866–872. 26. Howlader N, Noone AM, Krapcho M, Garshell J, Miller D, Altekruse SF, Kosary CL, Yu M, Ruhl J, Tatalovich Z, Mariotto A, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ, Cronin KAe. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2012. Baskı. Bethesda, National Cancer Institute, 2008. 27. Bethesda M, PH. G. Malignant Neoplasms of the Colon. . In: Gordon PH, Nivatvongs S (Eds.) Principles and Practice of Surgery for the Colon, Rectum, and Anus. rd Ed. , Informa Healthcare USA Inc, 2007, 3: 489- 643. 28. De Jong AE, Morreau H, Nagengast FM, Mathus-Vliegen EMH, Kleibeuker JH, Griffioen G, Cats A, Vasen HFA. Prevalence of adenomas among young individuals at average risk for colorectal cancer. The American journal of gastroenterology, 2005, 100(1): 139-143. 29. Davies RJ, Miller R, Coleman N. Colorectal cancer screening: prospects for molecular stool analysis. Nature Reviews Cancer, 2005, 5: 199–209. 30. Baykan A, Zoroğlu A, Geçim E, Terzi C. Kolon ve rektum kanserleri. Türk Kolon ve Rektum Cerrahisi Derneği, 2010: 15-30. 31. Jackson-Thompson J, Ahmed F, German RR, Lai SM, Friedman C. Descriptive epidemiology of colorectal cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2006, 107: 1103–1111. 32. Baker SK , Fearon ER , Nigro JM , Hamilton SR , Preisinger AC , Jessup JM , . e. Chromosome 17 deletions and p53 gene mutationsin colorectal carcinoma. Science, 1989, 244: 217-221. 33. FA H, RP B. Colorectal cancer epidemiology:incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin Colon RectalSurg, 2009, 22: 191-197. 34. Sinha R. An epidemiologic approach to studying heterocyclic amines. Mutation Research, 2002, 506–507: 197–204. 35. Kabat GC, Miller AB, Jain M, Rohan TE. A cohort study of dietary iron and heme iron intake and risk of colorectal cancer in women. British Journal of Cancer, 2007, 97: 118-122. 73 36. Santarelli RL, Pierre F, Corpet DE. Processed meat and colorectal cancer: a review of epidemiologic and experimental evidence. Nutrition and Cancer, 2008, 60: 131–144. 37. Yıldız MK. Evre I-Iıı Kolon Kanserinde Prognostik Faktörlerin Araştırılması. İç Hastalıkları Anabilim Dalı. Edirne: T.C. Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi, 2008. 38. Zisman AL, Nickolov A, Brand RE, Gorchow A, Roy HK. Associations between the age at diagnosis and location of colorectal cancer and the use of alcohol and tobacco: implications for screening. Archives of Internal Medicine, 2006, 166: 629-634. 39. Tsong WH, Koh WP, Yuan JM, Wang R, Sun CL, Yu MC. Cigarettes and alcohol in relation to colorectal cancer: The singapore chinese health study. British Journal of Canser, 2007, 96: 821–827 40. Botteri E, Iodice S, Raimondi S, Maisonneuve P, Lowenfels AB. Cigarette smoking and adenomatous polyps: a meta-analysis. Gastroenterology, 2008, 134: 388–395. 41. Poschl G, Seitz HK. Alcohol and cancer. Alcohol and alcoholism, 2004, 39: 155– 165. 42. Tomatır AG. Apoptoz: Programlı Hücre Ölümü. Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 2003, 23: 499-508. 43. Altunkaynak BZ, Özbek E. Programlanmış Hücre Ölümü: Apoptoz Nedir? Tıp Araştırmaları Dergisi, 2008, 6: 93-104. 44. Sanmartín C, Plano D, Palop JA. Selenium compounds and apoptotic modulation: a new perspective in cancer therapy. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2008, 8: 1020-1031. 45. Kosova F, Arı Z. Prostat kanseri ve apoptozis ilişkisi. Klinik ve Deneysel Arastırmalar Dergisi, 2011, 2: 124-131. 46. Zou H, Henzel W, Liu X, Lutschg A, Wang X. Apaf-1, a Human Protein Homologous to C. elegans CED-4, Participates in Cytochrome c–Dependent Activation of Caspase-3. Cell, 1997, 90: 405-413. 47. Pourkarimi E, Greiss S, Gartner A. Evidence that CED-9/Bcl2 and CED-4/Apaf1 localization is not consistent with the current model for C. elegans apoptosis induction. Cell Death and Differentiation, 2012, 19: 406-415. 74 48. Cadabak H. Hücre Siklusu ve Kanser. ADÜ Tıp Fakültesi Dergisi, 2008, 9: 5161. 49. Gatenby RA, Gillies RJ. Why do cancers have high aerobic glycolysis?. . Nature Reviews Cancer, 2004, 4: 891-899. 50. Olah E. Basic Concepts of Cancer: Genomic Determination. The Journal of The International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2005, 16. 51. Arslan DÖ, Korkmaz G, Gözüaçık D. Otofaji: Bir Hücresel Stres Yanıtı ve Ölüm Mekanizması. Acıbadem Universitesi Sağlık Bilimleri Dergisi, 2011, 2: 184-194. 52. Yang ZJ, Chee CE, Huang S, Sinicrope FA. The role of autophagy in cancer: Therapeutic implications. . Moleculer Canser Therauticus, 2011, 10: 1533-1541. 53. Chen S, Rehman SK, Zhang W, Wen A, Yao L, Zhang J. Autophagy is a therapeutic target in anticancer drug resistance. Biochimica et Biophysica Acta, 2010, 1806: 220-229. 54. Woods A, Johnstone SR, Dickerson K, Leiper FC, Fryer LG, Neumann D, Schlattner U, Wallimann T, Carlson M, Carling D. LKB1 is the upstream kinase in the AMP-activated protein kinase cascade. Current biology, 2003, 13: 20042008. 55. Shaw RJ, Kosmatka M, Bardeesy N, Hurley RL, Witters LA, De Pinho RA, Cantley LC. The tumor suppressor LKB1 kinase directly activates AMP-activated kinase and regulates apoptosis in response to energy stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101: 33293335. 56. Luo Z, Saha AK, Xiang X, Ruderman NB. AMPK, the metabolic syndrome and cancer. Trends in Pharmacological Sciences, 2005, 26: 29-76. 57. Anderson KA, Ribar TJ, Lin F, Noeldner PK, Green MF, Muehlbauer MJ, Witters LA, Kemp BE, Means AR. Hypothalamic CaMKK2 contributes to the regulation of energy balance. Cell Metabolism, 2008, 7: 377-388. 58. Aita VM, Liang XH, Murty VV, Pincus DL, Yu W, Cayanis E, Kalachikov S, Gilliam TC, Levine B. Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21. Genomics, 1999, 59: 59-65. 59. Levine B, Sinha S, Kroemer G. Bcl-2 family members: dual regulators of apoptosis and autophagy. Autophagy, 2008, 4: 600-606. 75 60. Carew JS, Kelly KR, Nawrocki ST. Autophagy as a target for cancer therapy: new developments. Cancer Management and Research, 2012, 4: 357-365. 61. Akar U, Chaves A, Reyez A, Barria M, Tari A, Sanguino A, Kondo Y, Kondo S, Arun B, Lopez G, Berestein G, Ozpolat B. Silencing of Bcl-2 expression by small interfering RNA induces autophagic cell death in MCF-7 breast cancer cells. Autophagy, 2008, 4: 669-679. 62. Saeki K, Yuo A, Okuma E, Yazaki Y, Susin SA, Kroemer G, Takaku F. Bcl-2 down-regulation causes autophagy in a caspase-independent manner in human leukemic HL60 cells. Cell Death & Differentiation, 2000, 7: 1263-1269. 63. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature, 2008, 451: 1069-1075. 64. Qu X, Yu J, Bhagat G, Furuya N, Hibshoosh H, Troxel A, Rosen J, Eskelinen EL, Mizushima N, Ohsumi Y, Cattoretti G, Levine B. Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the belcin1 autophagy gene. Journal of Clinical Investigation, 2003, 112: 1809-1820. 65. Cloonan SM, Williams DC. The antidepressants maprotiline and fluoxetine induce Type II autophagic cell death in drug-resistant Burkitt's lymphoma. International Journal of Cancer, 2010, 128: 1712-1723. 66. Lefranc F, Facchini V, Kiss R. Proautophagic drugs: a novel means to combat apoptosis-resistant cancers, with a special emphasis on glioblastomas. Oncologist, 2007, 12: 1395-1403. 67. Savranlar Y. Cı̇ splatin ile Oluşturulan Nefrotoksı̇ sı̇ te Üzerı̇ ne Amı̇ fostı̇ n Etkı̇ sı̇ nin Hı̇ stokı̇ myasal Olarak Değerlendı̇ rı̇ lmesi. Ercı̇ ye Ünı̇ versı̇ te Tip Fakültesi Hı̇ stoloji ve Embrı̇ yoloji Anabilim Dalı. Karyseri: 2011. 68. Takahara PM, Rosenzweig AC, Frederick CA, Lippard SJ. Crystal structure of double-stranded DNA containing the major adduct of the anticancer drug cisplatin. Nature, 1995, 19: 649-652. 69. Heinemann V, Wilke H, Mergenthaler HG, Clemens M, Konig H, Illiger HJ, Arning M, Schalhorn A, Possinger K, Fink U. Gemcitabine and cisplatin in the treatment of advanced or metastatic pancreatic cancer. Annals of Oncology, 2000, 11: 1399-1403. 76 70. Stordal B, Davey M. Understanding cisplatin resistance using cellular models. International Union of Biochesmistry and Moleculer Biology Life, 2007, 59: 696699. 71. Schmid JO, Dong M, Haubeiss S, Friedel G, Bode S, Grabner A, Ott G, Murdter TE, Oren M, Aulitzky WE, Van der Kuip H. Cancer cells cue the p53 response of cancer-associated fibroblasts to cisplatin. Cancer Res, 2012, 72: 5824-5832. 72. Lamson DW, Brignall MS. Antioxidants in cancer therapy; their actions and interactions with oncologic therapies. Alternative Medicine Review, 1999, 4: 304329. 73. Lissoni P, Barni S, Meregalli S, Fossati V, Cazzaniga M, Esposti D, Tancini G. Modulation of cancer endocrine therapy by melatonin: a phase II study of tamoxifen plus melatonin in metastatic breast cancer patients progressing under tamoxifen alone. British Journal of Cancer, 1995, 71: 854-856. 74. Cos S, Mediavilla MD, Fernandez R, Gonzalez-Lamuno D, Sanchez-Barcelo EJ. Does melatonin induce apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells in vitro? Journal of Pineal Research, 2002, 32: 90-96. 75. Brzezinski A. Melatonin in humans. The New England Journal of Medicine, 1997, 336: 186-195. 76. Özçelik F, Erdem M, Bolu A, Gülsün M. Melatonin: Genel özellikleri ve psikiyatrik bozukluklardaki rolü. Psikiyatride Güncel Yaklaşımlar, 2013, 5: 179203. 77. Lerner AB. Hormones and skin color. Scientific American, 1961, 205: 98-108. 78. Reiter RJ, Melchiorri D, Sewerynek E, Poeggeler B, Barlow-Walden L, Chuang J, Ortiz GG, Acuna-Castroviejo D. A review of the evidence supporting melatonin's role as an antioxidant. J Pineal Res, 1995, 18: 1-11. 79. Pandi-Perumal SR, Srinivasan V, Maestroni GJ, Cardinali DP, Poeggeler B, Hardeland R. Melatonin: Nature's most versatile biological signal? Federation of European Biochemical Societies, 2006, 273: 2813-2838. 80. Fung BK. Transducin: structure, function, and role in phototransduction. İçinde:Osborne NN, Chader GJ (editörler). Progress in retinal research Vol. 6, Oxford, England, Pergamon Press, 1987: 151-177. 81. Espino J, Pariente JA, Rodriguez AB. Oxidative stress and immunosenescence: therapeutic effects of melatonin. Oxid Med Cell Longev, 2012, 2012: 670294. 77 82. Reiter RJ. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions. Endocrine Reviews, 1991, 12: 151-180. 83. Reiter RJ. Neuroendocrine effects of light. International Journal of Biometeorology, 1991, 35: 169-175. 84. Axelrod J, Weissbach H. Enzymatic O-methylation of N-acetylserotonin to melatonin. Science, 1960, 131: 1312. 85. Ravindra T, Lakshmi NK, Ahuja YR. Melatonin in pathogenesis and therapy of cancer. Indian Journal of Medical Sciences, 2006, 60: 523-535. 86. Lissoni P, Rovelli F, Malugani F, Bucovec R, Conti A, Maestroni GJ. Antiangiogenic activity of melatonin in advanced cancer patients. Neuro endocrinology letters, 2001, 22: 45-47. 87. Tamarkin L, Cohen M, Roselle D, Reichert C, Lippman M, Chabner B. Melatonin inhibition and pinealectomy enhancement of 7,12-dimethylbenz(a)anthraceneinduced mammary tumors in the rat. Cancer research, 1981, 41: 4432-4436. 88. Lissoni P, Meregalli S, Nosetto L, Barni S, Tancini G, Fossati V, Maestroni G. Increased survival time in brain glioblastomas by a radioneuroendocrine strategy with radiotherapy plus melatonin compared to radiotherapy alone. Oncology, 1996, 53: 43-46. 89. Bartsch C, Bartsch H. The anti-tumor activity of pineal melatonin and cancer enhancing life styles in industrialized societies. Cancer Causes Control, 2006, 17: 559-571. 90. Jung B, Ahmad N. Melatonin in cancer management: progress and promise. Cancer research, 2006, 66: 9789-9793. 91. Hu S, Shen G, Yin S, Xu W, Hu B. Melatonin and tryptophan circadian profiles in patients with advanced non-small cell lung cancer. Advance in Therapy, 2009, 26: 886-892. 92. Freshney RI. Culture of animal cells, a manual of basic technique. 93. Huang HL, Hsing HW, Lai TC, Chen YW, Lee TR, Chan HT, Lyu PC, Wu CL, Lu YC, Lin ST, Lin CW, Lai CH, Chang HT, Chou HC, Chan HL. Trypsininduced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science, 2010, 17: 36. 94. Kalkan Y, Kapakin KAT, Kara A, Atabay T, Karadeniz A, Simsek N, Karakus E, Can I, Yildirim S, Ozkanlar S. Protective effect of Panax ginseng against serum 78 biochemical changes and apoptosis in kidney of rats treated with gentamicin sulphate. Journal of Molecular Histology, 2012: 1-11. 95. Akman S, Canakci V, Kara A, Tozoglu U, Arabaci T, Dagsuyu İM. Therapeutic Effects of Alpha-lipoic Acid and Vitamin C on Alveolar Bone Resorption After Experimental Periodontitis in Rats. A Biochemical, Histochemical and Stereologic Study. Journal of Periodontology, 2012: 1-10. 96. Kara A, Yücel A, Yücel N, Özcan H, Selli J, Ünal D. Evaluation of the combined treatment with cisplatin and melatonin on neuroblastoma cell viability and antioxidant capacity. Journal of Experimental & Clinical Medicine, 2014, 31. 97. Menteş B, Leventoğlu S. Kolorektal Kanserlerin Klinik Özellikleri. Turkiye Klinikleri Journal of Surgery, 2004, 9: 36-38. 98. Özmen V. Türkiye'de Meme Kanseri: Klinik ve Histopatolojik Özellikler (13.240 Olgunun Analizi). Meme Sagligi Dergisi/Journal of Breast Health, 2014, 10. 99. Karadeniz A, Simsek N, Karakus E, Yildirim S, Kara A, Can I, Kisa F, Emre H, Turkeli M. Royal jelly modulates oxidative stress and apoptosis in liver and kidneys of rats treated with cisplatin. Oxidative Medicine And Cellular Longevity, 2011, 2011. 100. Karakus E, Karadeniz A, Simsek N, Can I, Kara A, Yildirim S, Kalkan Y, Kisa F. Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and apoptosis in liver of rats treated with carbon tetrachloride (CCl 4). Journal of hazardous materials, 2011, 195: 208-213. 101. Kara A, Akman S, Ozkanlar S, Tozoglu U, Kalkan Y, Canakci CF, Tozoglu S. Immune modulatory and antioxidant effects of melatonin in experimental periodontitis in rats. Free Radical Biology and Medicine, 2013, 55: 21-26. 102. Simsek N, Kaya M, Kara A, Can I, Karadeniz A, Kalkan Y. Effects of melatonin on islet neogenesis and beta cell apoptosis in streptozotocin-induced diabetic rats: an immunohistochemical study. Domestic animal endocrinology, 2012, 43: 4757. 103. Hrushesky WJ. Melatonin cancer therapy. İçinde:The Pineal Gland and Cancer, Springer, 2001: 476-508. 104. Hill SM, Blask DE. Effects of the pineal hormone melatonin on the proliferation and morphological characteristics of human breast cancer cells (MCF-7) in culture. Cancer research, 1988, 48: 6121-6126. 79 105. Blask DE, Hill SM. Effects of melatonin on cancer: studies on MCF-7 human breast cancer cells in culture. Journal of neural transmission. Supplementum, 1985, 21: 433-449. 106. She Q-B, Bode AM, Ma W-Y, Chen N-Y, Dong Z. Resveratrol-induced activation of p53 and apoptosis is mediated by extracellular-signal-regulated protein kinases and p38 kinase. Cancer research, 2001, 61: 1604-1610. 107. Cetin-Atalay R, Ozturk M. p53 mutations as fingerprints of environmental carcinogens. Pure and applied chemistry, 2000, 72: 995-999. 108. D'Autréaux B, Toledano MB. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature reviews Molecular cell biology, 2007, 8: 813-824. 109. Kaabinejadian S, Sh F, Ramezani M, Azizi E. p53 expression in MCF7, T47D and MDA-MB 468 breast cancer cell lines treated with adriamycin using RT-PCR and immunocytochemistry. Journal of Biological Sciences, 2008. 110. Singh N, Nigam M, Ranjan V, Zaidi D, Garg VK, Sharma S, Chaturvedi R, Shankar R, Kumar S, Sharma R. Resveratrol as an adjunct therapy in cyclophosphamide‐ treated MCF‐ 7 cells and breast tumor explants. Cancer science, 2011, 102: 1059-1067. 111. Fridman JS, Lowe SW. Control of apoptosis by p53. Oncogene, 2003, 22: 90309040. 112. Wang C, Chen Z, Ge Q, Hu J, Li F, Hu J, Xu H, Ye Z, Li L-C. Up-regulation of p21 WAF1/CIP1 by miRNAs and its implications in bladder cancer cells. FEBS letters, 2014, 588: 4654-4664. 113. Chen A, Huang X, Xue Z, Cao D, Huang K, Chen J, Pan Y, Gao Y. The Role of p21 in Apoptosis, Proliferation, Cell Cycle Arrest, and Antioxidant Activity in UVB-Irradiated Human HaCaT Keratinocytes. Medical science monitor basic research, 2015, 21: 86. 114. Han Z, Wei W, Dunaway S, Darnowski JW, Calabresi P, Sedivy J, Hendrickson EA, Balan KV, Pantazis P, Wyche JH. Role of p21 in apoptosis and senescence of human colon cancer cells treated with camptothecin. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277: 17154-17160. 115. Slingerland J, Pagano M. Regulation of the Cdk inhibitor p 27 and its deregulation in cancer. Journal of cellular physiology, 2000, 183: 10-17. 80 116. Palmqvist R, Stenling R, Öberg Å, Landberg G. Prognostic significance of p27Kip1 expression in colorectal cancer: a clinico‐ pathological characterization. The Journal of Pathology, 1999, 188: 18-23. 117. Sasaki K, Tsuno NH, Sunami E, Tsurita G, Kawai K, Okaji Y, Nishikawa T, Shuno Y, Hongo K, Hiyoshi M. Chloroquine potentiates the anti-cancer effect of 5-fluorouracil on colon cancer cells. BMC cancer, 2010, 10: 370. 118. Mariño G, Salvador-Montoliu N, Fueyo A, Knecht E, Mizushima N, López-Otín C. Tissue-specific autophagy alterations and increased tumorigenesis in mice deficient in Atg4C/autophagin-3. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282: 18573-18583. 81 EKLER EK 1. ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Adı Soyadı: Süleyman POLAT Doğum tarihi : Doğum yeri: 05.08.1980 Erzurum Medeni hali: Evli Uyruğu: T.C. Adres: Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Eruzum Cep Tel: 90 536 520 08 49 Fax: E-mail: [email protected] Eğitim Bilgileri Lise: Lisans: Yüksek lisans: Doktora: Atatürk Endüstri Meslek Lisesi Atatürk Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü Atatürk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, 2015 - Yabancı Dil Bilgileri İngilizce: Orta derecede Üye Olunan Mesleki Kuruşlar Yok İlgi alanları ve Hobiler Biyokimya 82 EK 2. ETİK KURUL ONAY FORMU 83 84
