NKUBAP.00.24.AR.12.10 - Namık Kemal Üniversitesi

SIĞIR, KOYUN, KEÇĠ, MANDADAN ELDE EDĠLEN FARKLI
TĠPTEKĠ HÜCRELERĠN SĠNKRONĠZASYONUNDA SERUM
AÇLIĞI VE KONTAK ĠNHĠBĠSYONUN ETKĠLERĠNĠN
ARAġTIRILMASI
Proje No:NKUBAP.00.24.AR.12.10
Proje Yürütücüsü:
Prof.Dr. Sezen ARAT
AraĢtırmacı:
Prof.Dr.Metin TUNA
HAZĠRAN 2014
TEKĠRDAĞ
ÖNSÖZ
Gelecekte daha tehlikeli boyutlara ulaĢacak olan ve günümüzün en önemli
sorunlarından biri olan küresel ısınma dünya iklimini ve coğrafyasını değiĢtirmekte bunun
sonucu olarak ortaya çıkacak kuraklık ve yaĢam alanlarının daralması önümüzdeki yıllarda
canlı hayatını ve buna bağlı olarak insan hayatını tehlike altına sokmaktadır. Bu sorunların
çözümü için diğer birçok araĢtırma alanında olduğu gibi hayvancılık alanında da yeni ve ileri
modern üretim teknolojileri geliĢtirilmektedir. Bunlardan biri son yıllarda hızlı bir tırmanıĢa
geçen nükleer transfer teknolojisi ile genetik yapısı aynı olan hayvanlar oluĢturmaktır.
TÜBĠTAK Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji AraĢtırma Enstitüsü (GMBAE), 1999
yılında ülke için öncelikli araĢtırma alanları ve buna bağlı teknolojileri belirlemek üzere bir
çalıĢma yapmıĢ ve bunun sonucunda nükleer transfer teknolojisinin transfer edilmesinin ülke
çıkarına olacağına karar vermiĢtir. Bu bağlamda bu projenin yürütücüsü Prof.Dr.Sezen Arat,
Amerika BirleĢik Devletleri, Georgia Üniversitersi, Hayvan Bilimleri Bölümü’nde iki yıl süreyle
çalıĢmak üzere görevlendirilmiĢtir. Projenin yürütücüsü bu süre zarfında sığır ve domuzların
klonlanması üzerine çalıĢmıĢtır.
Yürütücü teknolojiyi ülkeye tranfer etmek üzere 2003
yılından bu yana ülkesinde klonlama çalıĢmalarına baĢlamıĢ ve 2009 yılında bir erkek ve
2010 yılında 4 diĢi boz klon buzağı üretmiĢtir. Dünya’nın ilk boz klonları olan bu buzağılar
halen sağlıklı olarak yaĢamlarını sürdürmektedir. Ayrıca üç diĢi ve bir erkek klonun sağlılık
yavruları da teknolojinin baĢarı ile uygulandığı göstermiĢtir.
Bu stratejik teknolojinin sürdürülebilir hayvansal üretim için geleceğin sigortaları
olarak görülen
yerli
hayvanların koruma programlarında önemli
bir
yer
tutacağı
öngörülmektedir. Bu bağlamda teknolojinin geliĢtirilmesi için bu teknolojiye sahip ülkeler
çalıĢmalarına devam etmektedirler. Bu proje teknolojinin temel materyallerinden biri olan
vücut hücrenin doğru olarak geriye programlanmasında önemli bir basamak olan hücre
sinkronizasyonu için uygun yöntemi belirlemek ve böylece
teknolojinin geliĢimine katkı
sağlamak üzere planlanmıĢtır. Proje Namık Kemal Üniversitesi’nin değiĢik birimlerinden
özellikle hücre kültürleri ve hücre analizleri konusunda uzman araĢtırmacılar tarafından
yürütülmüĢ ve Namık Kemal Üniversitesi AraĢtırma Projeleri Destekleme Programı
NKUBAP.00.24.AR.12.10 proje numarı ile desteklenmiĢtir.
Prof.Dr.Sezen ARAT
Proje Yürütücüsü
Haziran 2014
(Bu proje raporu Proje Yürütücüsü Prof.Dr. Sezen Arat tarafından yazılmıĢtır)
i
ÖZET
Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması yani genetik kopyasının
oluĢturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en ileri noktası ve yardımcı üreme
tekniklerinin en geliĢmiĢidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli
bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi aynı zamanda sayıları gittikçe azalan
lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması içinde kullanılabilecektir. Ancak ilk klonun
üretilmesinden bu yana birçok çalıĢma yapılarak teknoloji iyileĢtirilmeye çalıĢılmıĢ olsa da
baĢarı yüzdesi halen istenilen seviyede değildir. Klon embriyosu ölümlerinin vücut
hücrelerinin yetersiz geri proglamlanmasının sonucu olan dengesiz gen ekspresyonlari
sebebiyle meydana geldiği yaygın bir kanıdır. Donör nükleusun yeniden programlanmasında
gerçekleĢen bazı hataların klonlamadaki baĢarısızlıkların temel sebebi olduğu düĢünülür.
Hücre programlamasının ve dolayısıyla klonlama baĢarısının anahtar faktörlerinden biri
hücre ile oositin arasındaki uyumdur. Bu nedenle NT’de en önemli basamak klonlanması
istenen canlının hücresinin istenilen siklus dönemine getirilmesidir. Projenin amacı farklı tür
(sığır, koyun, keçi, manda) çiftlik hayvanından elde edilen farklı tipteki hücrelerin (deri
fibroblastı, kas hücresi, kıkırdak hücresi, granulosa hücresi) değiĢik yöntemler kullanılarak
(farklı sürelerde serum açlığı ve kontak inhibisyon) hücre siklusunun istenilen dönemine
getirilmesini sağlamak, yöntemlerin hücre üzerinde meydana getirebileceği muhtemel zararlı
etkileri belirlemek, en iyi sonuç veren ve en zararsız yöntemi tespit etmektir. Sinkronizasyon
deneyleri sonucunda hücreler flow sitometre ile canlılık, apoptozis, nekrozis ve hücre siklusu
için analiz edilmiĢtir. Bu çalıĢma sonucunda dört hayvan türünde klonlama çalıĢmalarında en
az bir kez kullanılmıĢ ve canlı doğum ile sonuçlanmıĢ dört farklı hücre tipi için en yüksek
G1/G0 oranı veren ve hücrelere en az zararlı olan bir veya birkaç hücre sinkronizasyon
seçeneği belirlenmiĢtir. Bu çalıĢma Ģimdiye kadar bu kadar farklı hücre tipinde farklı
sinkronizasyon yöntemlerinin denendiği ve aynı zamanda bu yöntemlerin hücre üzerindeki
zararının analiz edildiği ilk çalıĢmadır. Ayrıca genetik kaynakların koruma programları
kapsamına alınan dondurulmuĢ hücre bankalarında saklanacak hücrelerde düĢünülerek tüm
uygulamalar hem taze hemde donmuĢ hücre kültürlerinde karĢılaĢtırmalı olarak yapılmıĢtır.
Anahtar Kelimeler: Hücre kültürü, hücre siklusu, hücre sinkronizasyonu, geri programlama,
nukleer transfer, flow sitometri
ii
ABSTRACT
Cloning of organisms with nuclear transfer (NT), namely production of genetic copy of
organisms, is the most advanced point of today’s modern biotechnology and assisted
reproductive technique. This technology can be used to increase the number of organisms
with high genetic structure or disease-resistant individuals as well as to save dwindling
number of local breeds from the border of extinction. Although many studies have been done
since the first production of the clone to improve this technology, success rate is still not at
the desired level. The common belief for clone embryo deaths is the inadequate
reprogramming of somatic cells which causes unbalanced gene expression. Some failures
that occur during reprogramming of the donor nucleus are considered as the main reason for
unsuccessful cloning. The one of the key factors for cell programming, and thus success of
cloning, is harmony between the cell and the oocyte. Therefore, the most important step of
NT is to synchronize the cells of desired animal at desired cell cycle stage for cloning. The
aim of the project is to synchronize different type of cells (such as; skin fibroblast, muscle
cells, cartilage cells and granulosa cells) obtained from various species (such as; cattle,
sheep, goat and buffalo) at a particular cell cycle stage using a variety of methods (serum
starvation, contact inhibition for different duration), to determine the potential harmful effects
of methods on these cells, and to determine the less hazardous and the best method. After
synchronization experiments, cells were analysed by flow cytometry for cell viability,
apoptosis, necrosis and cell cycle stage. As a result of this study,
one or a few cell
synchronization options giving highest rate of G1/G0 and having lowest harmful effect on
cells were identified for four different cell types used at least on time for nuclear transfer
studies and resulted live birth. This is the first study in which several synchronization
methods were tested on different cell types and harmful effect of those methods on cell were
analysed. In addition, thinking of cells stored in frozen cell banks in the scope of genetic
resouces conservation program, all methods were applied on both fresh and frozen cells in
comparison.
Keywords: cell culture, cell cycle, cell synchronization, reprogramming, nuclear transfer,
flow cytometry
iii
ĠÇĠNDEKĠLER
ÖNSÖZ .......................................................................................................................... i
ÖZET ............................................................................................................................. ii
ABSTRACT ................................................................................................................... iii
ĠÇĠNDEKĠLER .............................................................................................................. iv, v
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ .......................................................................................................... vi
RESĠMLER DĠZĠNĠ......................................................................................................... vi
TABLOLAR DĠZĠNĠ .................................................................................................. vii, viii,ix,x
1. GĠRĠġ.............................................................................................................................1
2.GENEL BĠLGĠLER ...................................................................................................... 2
3.GEREÇ ve YÖNTEM.............................................................................................…… 6
3.1. Dokuların Alınması.....................................................................................................6
3.2. Primer Kültür..............................................................................................................6
3.3. Hücre Kültürü.............................................................................................................7
3.4. Hücrelerin dondurulması............................................................................................7
3.5. Sinkronizasyon Deney Grupları.................................................................................7
3.6. Analiz Yöntemleri......................................................................................................8
3.6.1. Hücre Siklusu Analizi............................................................................................8
3.6.2. Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi.................................................................9
4.BULGULAR................................................................................................................11
4.1. Primer kültür............................................................................................................11
4.2.Hücre siklus analizi ................................................................................................13
4.2.1. Hücre sayısı optimizasyonu......................................................................13
4.2.2. PI Boyama optimizasyonu.......................................................................14
iv
4.2.3.Analiz sonuçları .....................................................................................17
4.3.Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi.......................................................51
4.3.1. RNase optimizasyon ……………………………………………………………..51
4.3.2.Analiz sonuçları ......................................................................................53
5. TARTIġMA VE SONUÇ...............................................................................91
6. KAYNAKLAR.............................................................................................104
v
ġEKĠLLER DĠZĠNĠ
Sayfa No
ġekil 3.1. Flow sitometri FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit analiz sonucu örneği...10
ġekil 4.1. 50µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu...........................14
ġekil 4.2. 30µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu...........................15
ġekil 4.3. 20µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu..........................16
ġekil 4.4. Hücre siklus analizi programı kullanılarak fazların yüzdelerinin belirlenmesi......17
ġekil 4.5. Bölünen normal fibroblast hücre grubu................................................................18
ġekil 4.6. Fibroblast hücrelerinde geç konfluent grubu.......................................................18
ġekil 4.7. RNase eklenmeyen boyama sonucu ………………………………………………..51
ġekil 4.8. RNase eklenen boyama sonucu……………………………………………………..52
ġekil 4.9. Canlılık analiz sonuçlarının değerlendirilmesinin gösterimi..................................53
ġekil 4.10. Bölünen normal fibroblast hücre grubu...............................................................54
ġekil 4.11. Fibroblast hücrelerinde erken konfluent grubu....................................................54
RESĠMLER DĠZĠNĠ
Resim 4.1. Primer kültürde üreme gösteren kıkırdak hücreleri.............................................11
Resim 4.2. Primer kültürde üreme gösteren kas hücreleri....................................................11
Resim 4.3. Ovaryumdan elde edilen granüloza hücreleri......................................................11
Resim 4.4. Primer kültürde üreme gösteren fibroblast hücreleri............................................11
Resim 4.5. Primer kültürdeki kas hücrelerinin üremesi. (yaklaĢık 30 günlük kültür).............12
Resim 4.6. Primer kültürdeki kıkırdak hücrelerinin üremesi. (yaklaĢık 10 günlük kültür).......12
Resim 4.7. Primer kültürdeki fibroblast hücrelerinin üremesi. (yaklaĢık 10 günlük kültür).....12
Resim 4.8. Ekimden 1 gün sonra hücrelerin mikroskoptaki görüntüsü. (4×105 hücre)..........13
Resim 4.9. Ekimden 3 gün sonra hücrelerin mikroskoptaki görüntüsü. (%50 konfluent)......13
Resim 4.10. Ekimin 6-7. günü hücrelerin mikroskoptaki görüntüsü. (%100 konfluent)..........13
vi
TABLO DĠZĠNĠ
Tablo 4.1. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………...19
Tablo 4.2. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……. ..19
Tablo 4.3. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………………….20
Tablo 4.4. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………..20
Tablo 4.5. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………….21
Tablo 4.6. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………..21
Tablo 4.7. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………...22
Tablo 4.8. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………22
Tablo 4.9. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………………….23
Tablo 4.10. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………...23
Tablo 4.11. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………..24
Tablo 4.12. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………25
Tablo 4.13. DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………...25
Tablo 4.14. DiĢi sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….26
Tablo 4.15. Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları………...26
Tablo 4.16. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………......27
Tablo 4.17. Erkek koyun taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………….....28
Tablo 4.18. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…….28
Tablo 4.19. Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………….29
Tablo 4.20. Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……...30
Tablo 4.21. DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………..30
Tablo 4.22. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………31
Tablo 4.23. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………………....32
Tablo 4.24. DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……………..32
Tablo 4.25. DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları………….....33
Tablo 4.26. DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………..33
Tablo 4.27. DiĢi koyun taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………….34
vii
Tablo 4.28. DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……..34
Tablo 4.29. Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………......35
Tablo 4.30. Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……....35
Tablo 4.31. Erkek keçi taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………………....36
Tablo 4.32. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………….36
Tablo 4.33. Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………37
Tablo 4.34. Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….38
Tablo 4.35. DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………….38
Tablo 4.36. DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...39
Tablo 4.37. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………………40
Tablo 4.38. DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………….40
Tablo 4.39. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………………41
Tablo 4.40. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………….41
Tablo 4.41. DiĢi keçi taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………42
Tablo 4.42. DiĢi keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……….42
Tablo 4.43. Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……....43
Tablo 4.44. Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …..44
Tablo 4.45. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……………...44
Tablo 4.46. Erkek manda donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları …………45
Tablo 4.47. Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………...45
Tablo 4.48. Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……..46
Tablo 4.49. DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………..47
Tablo 4.50. DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……..47
Tablo 4.51. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları……………48
Tablo 4.52. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ………49
Tablo 4.53. DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları…………49
Tablo 4.54. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları ……50
Tablo 4.55. AnexinV boyama protokolünde RNase kullanımının etkisi……………………….52
viii
Tablo 4.56. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………..55
Tablo 4.57. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ……55
Tablo 4.58. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………………56
Tablo 4.59. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları …………..57
Tablo 4.60. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………..57
Tablo 4.61. Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………58
Tablo 4.62. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ……………………59
Tablo 4.63. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….59
Tablo 4.64. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………………………...60
Tablo 4.65. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……………..61
Tablo 4.66. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……………………….61
Tablo 4.67. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….62
Tablo 4.68. DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….63
Tablo 4.69. DiĢi sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..63
Tablo 4.70. Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………64
Tablo 4.71. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları….65
Tablo 4.72. Erkek koyun taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……………..65
Tablo 4.73. Erkek koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları ………..66
Tablo 4.74. Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………..67
Tablo 4.75. Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……67
Tablo 4.76. DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………68
Tablo 4.77. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…….69
Tablo 4.78. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……………….69
Tablo 4.79. DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………..70
Tablo 4.80. DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….71
Tablo 4.81. DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……...71
Tablo 4.82. DiĢi koyun taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…..……72
Tablo 4.83. DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları.......73
ix
Tablo 4.84. Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….73
Tablo 4.85. Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……74
Tablo 4.86. Erkek keçi taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………………75
Tablo 4.87. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………..…75
Tablo 4.88. Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….76
Tablo 4.89. Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..77
Tablo 4.90. DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………..77
Tablo 4.91. DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……...78
Tablo 4.92. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………………79
Tablo 4.93. DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………….79
Tablo 4.94. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……………80
Tablo 4.95. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……….81
Tablo 4.96. DiĢi keçi taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…………81
Tablo 4.97. DiĢi keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..82
Tablo 4.98. Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……..83
Tablo 4.99. Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…84
Tablo 4.100. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….84
Tablo 4.101. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………….85
Tablo 4.102. Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…….85
Tablo 4.103. Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları...86
Tablo 4.104. DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………87
Tablo 4.105. DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları…..88
Tablo 4.106. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………...88
Tablo 4.107. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları……89
Tablo 4.108. DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları………90
Tablo 4.109. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları….90
x
1.GĠRĠġ
Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması yani genetik kopyasının
oluĢturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en uç noktası ve yardımcı üreme
tekniklerinin en geliĢmiĢidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli
bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi aynı zamanda sayıları gittikçe azalan
lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması içinde kullanılabilecektir. Bu yüzden Dünya
Gıda ve Tarım Organizasyonu (FAO) gen kaynaklarının korunması için ülkeleri belli
zamanlarda bir araya getirmekte ve bu toplantılarda gelecekte yok olacak türleri geriye
getirmek için hücre bankalarının kurulmasının gerekliliğini tartıĢmaktadır. Kurulacak hücre
bankalarının etkin bir Ģekilde kullanılabilmesi, teknolojinin sorunlarının çözülmesine bağlıdır.
Bu nedenle hala bu teknolojiyi kullanabilen ülkeler yoğun olarak araĢtırmalarına devam
etmektedirler. Bu projenin de amacı teknolojideki en önemli ve temel basamaklardan biri
olan hücre programlamasına katkı sağlıyacak çalıĢmaları içermektedir. Klonlanması istenen
canlının hücresi geriye programlanması için çekirdeği alınan oosit (yumurta hücresi) içine
bırakılır. Oositin farklılaĢmıĢ bir hücreyi nasıl geriye programlayabildiği hala tartıĢma
konusudur ve tam olarak anlaĢılamamıĢtır. Ancak yapılan çalıĢmalar bu bu mekanizmanın
düzgün iĢleyebilmesi için oosit içine nakledilen hücrenin G1-G0 fazında olması gerektiğini
göstermektedir. Ġn vitro kültür ortamında hücrelerin her biri farklı siklus fazındadır ve bunları
aynı faza getirmek için birtakım uygulamalar yapılması gerekir. Ancak bu uygulamalar her tür
için ve her hücre tipi için aynı etkiye sahip olmayabilir. Sınırlı sayıda çalıĢma yapılarak
belirlenmiĢ ancak her tür ve hücre tipinde birbirinden farklı baĢarı yüzdesi ile rapor edilen en
yaygın iki sinkronizasyon yönteminin farklı türlerin farklı hücre tiplerinde daha ayrıntılı ve eĢ
zamanlı analizinin yapılması gereklidir. Sunulan projede sığır, koyun, keçi, mandadan elde
edilen primer deri, kas, kıkırdak ve granusa hücre hatlarında hücrelerin G1-G0 fazına
getirilmesi için
değiĢik sürelerde serum açlığı ve kontak inhibisyon uygulanması olarak
bilinen sinkronizasyon yöntemleri incelenecek, bu yöntemlerin farklı türlere ait farklı tipteki
hücreler üzerindeki etkileri analiz edilecektir. Bu çalıĢma sonucunda hangi türün hangi hücre
tipinde hangi yöntemin en yüksek oranda sinkronizasyonu sağladığı tespit edilmeye aynı
zamanda uygulamanın sınırları hücre canlılığının ve apotozisin analizi ile belirlenmeye
çalıĢılmıĢ, böylece hücreye en az zarar veren yöntemin belirlenmesi hedeflenmiĢtir.
1
2. GENEL BĠLGĠLER
Nükleer transfer (NT) sonucu bir canlının klonlanması yani genetik kopyasının
oluĢturulması modern biyoteknolojinin günümüzdeki en uç noktası ve yardımcı üreme
tekniklerinin en geliĢmiĢidir. Bu teknoloji üstün genetik yapıya sahip veya hastalıklara dirençli
bireylerin sayısını artırmak için kullanılabileceği gibi aynı zamanda sayıları gittikçe azalan
lokal ırkların yok olma sınırından kurtarılması içinde kullanılabilecektir. Bu yüzden Dünya
Gıda ve Tarım Organizasyonu (FAO) gen kaynaklarının korunması için ülkeleri belli
zamanlarda bir araya getirmekte ve bu toplantılarda gelecekte yok olacak türleri geriye
getirmek için hücre bankalarının kurulmasının gerekliliğini tartıĢmaktadır. Kurulacak hücre
bankalarının etkin bir Ģekilde kullanılabilmesĠ, teknolojinin sorunlarının çözülmesine bağlıdır.
Bu nedenle hala bu teknolojiyi kullanabilen ülkeler yoğun olarak araĢtırmalarına devam
etmektedirler.
EriĢkin bir canlının baĢarı ile klonlanması sonucu doğan ilk klon koyun “Dolly” nin
(Wilmut ve ark 1997) ardından sığır, keçi, at, domuz, tavĢan, manda, katır, fare tavĢan ve
deve gibi birçok memeli türü aynı yöntem ile klonlanmıĢtır (Arat ve ark 2011). Ġlk klonun
üretilmesinden bu yana birçok çalıĢma yapılarak teknoloji iyileĢtirilmeye çalıĢılmıĢ olsa da
baĢarı yüzdesi halen istenilen seviyede değildir. Bazı çalıĢmalarda %12.5 gibi daha yüksek
sonuçlar alınmasına karĢın (Arat ve ark 2011) sığır da dahil olmak üzere çoğu türde NT’in
baĢarı ortalaması %0.5 ila 5 arasında değiĢmektedir (Smith ve ark 2000, Solter ve ark 2000,
Shi ve ark 2007, Wani ve ark 2010).In vitro fertilizasyon (IVF) ile
karĢılaĢtırıldığında
embriyonal kayıplar çok fazladır ve embriyoların çoğu hamileliğin 35 ila 60. günleri arasında
%50-100 kayıpla sonuçlanmaktadır (Edwards ve ark 2003). Bu kayıplar tek bir anomaliden
çok, geliĢim bozukluğu ve geriliğinden, muhtemel kromozom anomalilerinden, yenidoğanın
artan ağırlığından, akciğerdeki anormalliklere, solunum problemlerinden metabolik hasarlara
kadar değiĢen komplikasyonlara bağlıdır. NT plasentaları genelde büyük ama az sayıda
plasentom, edema ve hidroallantois içerir (Bertolini ve ark 2007, Constant ve ark 2006, Farin
ve ark 2006, Hill ve ark 1999). Yavrunun normalden büyük olması ile karakterize büyük yavru
sendromu sık görülen bir geliĢme bozukluğudur (Cibelli ve ark 1998,Constant ve ark 2006).
NT etkinliğini arttırmak için birçok çalıĢma yapılmıĢ, genotip (Heyman ve ark 2002), donör
hücre çeĢidi (Kato ve ark 2000) ve evresine (Renard ve ark 2002) bağlı olarak küçük
değiĢiklikler gözlemlenmiĢ ancak çok büyük bir baĢarı elde edilememiĢtir.
DöllenmemiĢ yumurta hücresi yetiĢkin vücut hücresine özgü gen ekspresyon
motiflerinin silinip embriyonal geliĢimin yeniden baĢlatılması için gerekli gen ekspresyonu
2
motiflerini oluĢturabilme potansiyeline sahiptir. Bu olgu yeniden programlama olarak
adlandırılır. Yeniden programlanma vücut hücresi çekirdeğinin epigenetik olarak tekrar
ayarlanması ile oluĢturulur ancak yeniden programlama mekanizması tam olarak
bilinmemektedir. Birçok klon embriyo anormal büyük plasentaya sahiptir ve embriyogenesisin
değiĢik geliĢim evresinde veya doğum öncesi dönemde ölürler (Ogura ve ark 2002). Klon
embriyosu ölümlerinin vücut hücrelerinin yetersiz yeniden proglamlanmasinin sonucu olan
dengesiz gen ekspresyonlari sebebiyle meydana geldiği yaygın bir kanıdır. NT iĢlemi
esnasında oosit (yumurta hücresi), donör (vücut hücresi) nukleusu orijinal halinden zigotik
nukleusa dönüĢtürür. Donör nükleusun yeniden programlanmasında gerçekleĢen bazı
hataların
klonlamadaki
baĢarısızlıkların
temel
sebebi
olduğu
düĢünülür.
Hücre
programlamasının ve dolayısıyla klonlama baĢarısının anahtar fakörlerinden biri hücre ile
oositin arasındaki uyumdur (Campbell ve ark 1996). Bu nedenle NT’de en önemli basamak
hücrenin istenilen siklus dönemine getirilmesidir.
Hücre siklusu dört fazdan oluĢur. Mitozu takiben iki kardeĢ hücre G1 fazına girer. Bu
dönemdeki hücre büyür ve hücre dıĢı büyüme faktörlerine cevap verir. Yine bu dönemde
kromozom yoğunlaĢması kaybolur ve tekrar çekirdek zarfı oluĢur. Bunu takip eden S fazında
ise DNA replikasyonu meydana gelir. G2 fazında ise yeniden kromozomlar yoğunlaĢır ve
hücre mitoza girer. Mitoz esnasında kromozomlar yoğunlaĢmıĢ olarak kalır. Nükleer transfer
çalıĢmalarında çoğunlukla G1/GO fazındaki hücreler seçilir. Bu dönemdeki hücrelerin geriye
programlanmaya daha uygun ve daha yüksek oranda normal embriyo geliĢimi ile
sonuçlandığı bildirilmiĢtir (Wilmut ve ark 1997, Baguisi ve ark 1999, Kubota ve ark 2000,
Polejaeva ve ark 2000, Arat ve ark 2001a, Gibbons ve ark 2002). Buna karĢın diğer hücre
siklus dönemlerindeki hücrelerin örneğin S fazında olanların kullanıldığı durumda erken
kromozom yoğunlaĢması sonucu kromozomal anomali, G2/M fazında olanların kullanıldığı
durumda ise aneploidi sonucu düĢük embryo geliĢimi görüldüğü bildirilmiĢtir(Campbell ve ark
1996).
Hücreler G1/GO fazına değiĢik Ģekillede getirilebilirler. Kumulus hücreleri elde
edildikleri anda bu dönemdedirler ve hemen NT için kullanılabilirler. Eğer hücreler kültüre
ediliyorsa bölünen hücre populasyonunda çok değiĢik dönemlerde hücre vardır. Bu hücreleri
istenen döneme getirmek için serum starvasyonu (düĢük serum varlığında kültür)
uygulanabilir ve böylece hücreler yeteri kadar beslenemedikleri için dinlenme fazına yani G0
fazına geçerler. Ġlk baĢarılı NT çalıĢmasında bu yöntem kullanılmıĢtır (Wilmut ve 1997). Diğer
yöntemde hücreler kültür kaplarını kapladıklarında birbirleri ile temas ettikleri için (kontak
inhibisyon) S fazına geçemezler ve G1’de kalırlar. Bazı NT çalıĢmalarında bu yöntem
3
kullanılmıĢtır (Cibelli ve ark 1998, Arat ve ark 2001b, Arat ve ark 2002, Gerger ve ark 2010,
Arat ve ark
2011).
Bir baĢka yöntem ise siklin kinaz inhibitörü gibi (roskovitin, dimetil
sulfoksit, siklohekzimid) bazı kimyasallar kullanılarak hücrelerin G1 fazında bloklanmasıdır ve
bazı NT çalıĢmalarında da bu yöntem kullanılmıĢtır (Arat ve ark 2001b, Gibbons ve ark 2002,
Goissis ve ark 2007, Hashem ve ark 2006). Bu sinkronizasyon ajanlarının kullanımı hücre
siklusunu düzenlemede etkili olmakla birlikte DNA hasarına sebep olarak hücre hasarı veya
ölümü ile sonuçlanabilen toksik etkileri beraberinde getirebilir (Koo ve ark, 2009). Benzer bir
durumunda serum starvasyonu sonucu görüldüğüne dikkat çeken ve gerek embriyonal
dönemde gerekse doğum sonrası ölümlerin bu yöntemin sebep olduğu DNA hasarlarına
veya apostozise bağlı olabileceğini iddia eden çalıĢmalar da vardır (Kato ve ark 1998, Wells
ve ark 1998a, Hill ve ark 1999, Gibbons ve ark 2002).
Ancak hücre kültüründe serum
starvasyonunun apoptozise sebep olduğunu gösteren çalıĢmalar oldukça sınırlıdır ve eriĢkin
hücre (Peng ve ark 1998, Dalman ve ark 2010) ile yapılmıĢ birkaç çalıĢma dıĢında çoğu
fetal hücrelerde yapılmıĢtır (Peura ve ark 2001, Kues ve ark 2002, Cho ve ark 2005). Buna
karĢın serum strarvasyonunun herhangi bir olumsuz etkisine rastlanmadığını rapor eden bir
çalıĢmada mevcuttur (Lima-Neto ve ark 2010). Bunun yanı sıra sinkronizasyonda kullanılan
kimyasal ajanlar farklı tip hücrelerde farklı reaksiyonlara sebep olabilir. Bununla ilgili ise
ayrıntılı bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bugüne kadar; fibroblastlar, meme bezi hücresi,
kumulus hücresi, ovidukt hücresi, lokositler, granulosa hücresi, üreme hücresi, kas hücresi,
karaciger hücresi gibi çok değiĢik eriĢkin hücre tipleri klonlama çalıĢmalarında kullanılmıĢ
farklı baĢarı oranları ile sonuçlanmıĢtır (Brem ve ark 2002). Daha sonra klonlamada
kullanılabileceği gösterilen hücre tiplerine böbrek hücresi (Adams ve ark 2004) ve kıkırdak
hücresi (Arat ve ark 2011) gibi yenileri eklenmiĢtir. Ancak bu çalıĢmaların hiçbirinde
uygulanan sinkronizasyon yöntemlerinin hücre üzerinde nasıl etki yaptığı incelenmemiĢtir.
Birçok türün klonlanmasından sonra nükleer transfer teknolojisi özellikle nesli tehlike
altındaki türlerin korunma programlarında ele alınmaya baĢlanmıĢtır. Yıllar önce teknolojinin
nesli tehlike altındaki türlerin korunmasına nasıl fayda sağlıyacağı ile ilgili bir rapor
yayınlanmıĢtır (Wells ve ark 1998b). Bu nedenle gen bankalarında artık sadece dondurulmuĢ
sperma ve embriyo saklamak yerine aynı zamanda dondurulmuĢ hücrelerin saklanması da
önerilmektedir (Ryder ve ark 2002, Andrabi ve ark 2007, Leon-Quinto ve ark 2009).
Ülkemizde ve dünyada ilk kez gen bankasında saklanan hücreler ile sayıları azalan bir yerli
ırkımız klonlanmıĢ ve yukarıda bahsedilen varsayım ve öneriler somut veriler ile
kanıtlanmıĢtır (Arat ve ark 2011).
Literatür bilgilerinden anlaĢıldığı üzere çoğunlukla tek, bazen iki hücre tipi kullanılarak
4
sınırlı sayıda yapılan denemelerle geliĢtirilen hücre sinkronizasyon yöntemlerinin farklı
türlerde ve farklı tipteki hücrelerde uygulandığı çeĢitli NT çalıĢmalarında standart sonuçların
alınamaması ve baĢarı oranlarının çok değiĢken seyretmesi bu yöntemlerin farklı türlerde ve
farklı tip hücrelerde daha ayrıntılı incelenmesi gerektiğini ortaya koymaktadır. Ayrıca
yöntemlerin hücre üzerindeki toksik etkilerinin de varsayımdan öte in vitro çalıĢmalar ile
ortaya çıkarılmaya ihtiyacı vardır. Yöntemlerin hücreye zararı ile ilgili çeliĢkili raporlarda
konunun yeterince aydınlatılmadığını göstermekte, daha fazla türde ve çeĢitli hücre tiplerinde
aynı anda yapılacak çalıĢmalara ihtiyaç olduğunu iĢaret etmektedir. Ayrıca gelecekte
kaybolan tür veya ırkların geriye getirilmesinde kullanılacak hücrelerin hücre bankalarında
dondurulmuĢ olarak saklanmıĢ olacağı düĢünülürse bu donmuĢ hücrelere uygulanacak her
türlü sinkronizasyon yönteminin de verimliliğini ve hücreye verebileceği zararı belirlemek
önemlidir.
Sunulan projede sığır, koyun, keçi, mandadan elde edilen primer deri, kas, kıkırdak ve
granulosa hücre hatlarında hücrelerin G1-G0 fazına getirilmesi için değiĢik sürelerde serum
açlığı ve kontak inhibisyon uygulanması olarak bilinen sinkronizasyon yöntemleri
incelenerek, bu yöntemlerin farklı türlere ait farklı tipteki taze ve dondurulmuĢ hücreler
üzerindeki etkileri analiz edilmiĢtir. Bu çalıĢma sonucunda hangi türün hangi hücre tipinde
hangi yöntemin en yüksek oranda sinkronizasyonu sağladığı tespit edilmeye çalıĢılmıĢ, aynı
zamanda uygulamanın hücre canlılığı üzerindeki etkileri de incelenerek hücreye en az zarar
veren yöntem belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. Tüm calıĢma hem taze hem dondurulmuĢ
hücrelerde karĢılaĢtırmalı yapılarak özellikle dondurulmuĢ hücrelerde sonuçlarda fark olup
olmadığı incelenmiĢtir. DondurulmuĢ hücrelerin sonuçları özellikle hücre bankalarında
saklanan hücrelerle yapılacak çalıĢmalar için ayrı bir önem taĢımaktadır.
5
3.GEREÇ ve YÖNTEM
3.1. Dokuların Alınması
ÇalıĢma materyalini mezbada kesinlen sığır, koyun, keçi, manda gibi hayvanlardan
elde edilen farklı dokular oluĢturmuĢtur. Her bir türden bir erkek bir diĢi hayvana (toplam 8
hayvan) ait doku parçaları alınmıĢtır. Bu dokular erkek için kas, kulaktan alınan kıkırdak ve
deri fibroblast dokusu iken, diĢi için bu dokuların yanında ovaryumdan elde edilen granülosa
hücreleridir.
Dokular temiz bistüri uçları ile alındıktan sonra % 5 Antibiyotik-antimikotik (Gibco-15240-062)
içeren tuzlu fosfat tampon (PBS) çözeltisi içerisinde ve soğuk ortamda muhafaza edilerek en
geç 2 saat içerisinde laboratuvara getirilmiĢtir. Ekim iĢlemine kadar +4 °C’de saklanmıĢtır.
3.2. Primer Kültür
Henüz kesilmiĢ hayvanın (tek hayvan) kulak dokusu, bacak kası doku parçası, ve
ovaryumları %5 Antibiyotik-antimikotik (Gibco-15240-062) içeren DPBS (Sigma- D5652)
içerisinde laboratuara getirilmiĢtir. Hücre izolasyonu ve kültürü daha önce açıklandığı gibi
yapılmıĢtır (Arat 2011). Özetle; laboratuvara getirilen ve +4 °C’de saklanan dokular %5
antibiyotik-antimikotik içeren DPBS (Sigma- D5652)
ile yıkandıktan sonra steril bistüri ucu
3
ile küçük parçalara (1mm ) ayrılarak 35mm kültür petrilerine ekilmiĢtir. Doku parçalarının
yapıĢmasının ardından tüm dokuların yüzeyini kaplayacak Ģekilde % 15 fetal buzağı serumu
(FBS), %1 antibiyotik (Biochrom-A2213) içeren hücre kültür medyumu (DMEM/F12) (Gibco32500-035) ile kaplanmıĢtır. Ekim yapılan doku petrileri 37°C ve %5 CO2 içeren inkübatöre
yerleĢtirilmiĢtir. Kültür baĢlangıcından 10-12 gün sonra doku parçalarından hücre üremeleri
incelenerek kültür ortamının medyumu değiĢtirilmiĢtir. Kültür kabını kaplayan hücreler büyük
doku parçaları uzaklaĢtırıldıktan sonra %0.25 tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu ile
kaldırılıp 60 mm'lik kültür petrilerine transfer edilmiĢtir(Arat ve ark 2011).
Ovaryumların follikülerinden aspire edilen garanulosa hücreleri de 35 mm’lik kültür
kaplarına ekildikten sonra aynı kültür ortamında kültür kaplarını kaplayana kadar kültüre
edilmiĢ, ardından tripsinlerenek kaldırılmıĢ ve 60 mm 'lik kültür petrilerine transfer
edilmiĢtir(Arat ve ark 2011).
6
3.3. Hücre Kültürü
Primer kültür sonrası konfluent olan petrilerden doku parçaları aspirasyon yöntemi ile
alınmıĢtır. Petrilerdeki besiyeri çekildikten sonra DPBS (Sigma- D5652) ile yıkanmıĢ, %0.25
tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu eklenerek 5 dakika boyunca 37°C ve %5 CO2
içeren inkübatöre kaldırılmıĢtır. Ardından konulan tripsinin inaktive olması için tripsin
miktarının 2 katı kadar %10 FBS (Sigma- F9665),, %1 antibiyotik (Biochrom-A2213) içeren
DMEM F12 (Gibco- 32500-035) eklenerek hücreler pipetlenerek tek hücre süspansiyonu
haline getirilmiĢtir. Hücreler 15 ml’lik santrifüj tüplerine aktarılarak 6 dk 1000 rpmde santrifüj
edilmiĢ, ardından hücreler %10 FBS (Sigma- F9665), %1 antibiyotik (Biochrom-A2213)
içeren DMEM/F12 (Gibco- 32500-035) ile sulandırılarak 60 mm’lik kültür petrilerine ekilmiĢtir.
Aynı zamanda bir kısım hücreler dondurularak saklanmıĢtır (Arat ve ark 2011).
3.4. Hücrelerin dondurulması
Doku eksplantlarından üreyen hücreler tripsinlenerek (Gibco-25200-056) 60 mm 'lik
kültür petrilerine transfer edilmiĢtir. Kültür kaplarını kaplayan hücreler tekrar tripsinlenmiĢ bir
kısmı sinkronizasyon çalıĢması yapmak için tekrar ekilirken bir kısmı ise dondurulmuĢtur.
Dondurma sıvısı olarak %80 FBS(Sigma- F9665) ve %20 DMSO ( Sigma-Aldrich-D5879)
içeren ve +4 °C’de saklanan dondurma medyumu ve DMEM/F12 (Gibco- 32500-035) içinde
süspanse olarak bulunan hücreler 1:1 oranın karıĢtırılarak dondurma tüplerine konmuĢtur.
Hücreleri içeren dondurma tüplerdeki final konsantrasyon %40 FBS (Sigma- F9665), , %10
DMSO (Sigma- D5879) ve %50 DMEM/F12 olmuĢtur (Gibco- 32500-035) . Tüpler ısıyı 1
o
C/dk düĢüren dondurma kaplarındaki gözlere yerleĢtilmiĢ ve dondurma kabı -80 °C derin
dondurucuya konmuĢtur (Arat ve ark 2011).
Yapılan tüm analizlerde kullanılan hücrelerin pasaj sayısı 2 ile 6 arasındadır.
3.5. Sinkronizasyon Deney Grupları
1. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda kültüre
edilmiĢ, konfluent olmadan yani kültür kabını kaplamadan tripsin ile kaldırılmıĢ ve
analiz için hazırlanmıĢtır (bölünen normal hücre grubu).
2. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda kültüre
edilerek konfluent olmaları yani kültür kabını tamamen kaplaması sağlanmıĢtır
(Kontak Ġnhibisyon). Ertesi gün hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır
(erken konfluent grubu).
3.
Hücreler konfluent olmasının ardından 72 saat boyunca %10 FBS içeren medyumda
7
kültüre edilmeye devam edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak
analiz için hazırlanmıĢtır (geç konfluent grubu).
4.
Hücreler konfluent olmasının ardından 72 saat boyunca %5 FBS içeren medyumda
kültüre edilmeye devam edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak
analiz için hazırlanmıĢtır (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup).
5. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda 24 saat
kültüre edilmiĢ, ve konfluent olmadan medyum % 0.5 FBS içeren DMEM/F12
medyumuyla değiĢtirilmiĢtir. Bu düĢük serumlu ortamda hücreler 72 saat kültüre
edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır (72
saat serum açlığı grubu).
6. Hücreler kültür kabına ekilerek %10 FBS içeren DMEM/F12 medyumunda 24 saat
kültüre edilmiĢ, ve konfluent olmadan medyum % 0.5 FBS içeren DMEM/F12
medyumuyla değiĢtirilmiĢtir. Bu düĢük serumlu ortamda hücreler 120 saat kültüre
edilmiĢ, sürenin sonunda hücreler tripsin ile kaldırılarak analiz için hazırlanmıĢtır(120
saat serum açlığı grubu).
Bu deney grupları 4 farklı türden (sığır, koyun, keçi, manda) elde edilen tüm hücre tiplerine
(fibroblast, kas, kıkırdak, granüloza) ve aynı dokulardan elde edilen dondurulup çözülen
hücrelere uygulanmıĢtır.
3.6. Analiz Yöntemleri
3.6.1. Hücre Siklusu Analizi
Analiz edilecek hücreler %0.25 Tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu ile kültür
kabından kaldırılmıĢ ve, santrifüj edilmiĢtir. Hücreler DPBS (Sigma- D5652) ile yıkandıktan
sonra tekrar santrifüj edilmiĢ ve 1 ml DPBS (Sigma- D5652) ile sulandırılmıĢ, ardından 3 ml
soğuk etanol (%70) ilavesi ile 4oC de 20 dk bekletilerek fiske edilmiĢtir. Fikse edilen hücreler
DPBS (Sigma- D5652) ile tekrar yıkandıktan sonra hücre peleti 500 µl DPBS içerisinde 20
µg/ml propidium iodide (PI) (Sigma-P4864), 100 µg/ml RNase A ( AppliChem A3832,0050),
%0,1 Triton X 100 (CAS 9002-93-1) içeren boyama solüsyonu ile 37º C yarım saat
bekletildikten sonra flow sitometri cihazı (Partec-CyFlow Space) ile analizler yapılmıĢtır.
G0/G1, S, G2/M fazlarındaki hücrelerin oranı hesaplanmıĢtır (Gibbons ve 2002, Dalman ve
2010).
8
3.6.2. Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi
Analiz edilecek hücreler %0.25 Tripsin-EDTA (Gibco-25200-056) solusyonu ile kültür
kabından kaldırılmiĢ, santrifüj tüplerine aktarılarak santrifüj edilmiĢtir. Santrifuj sonrası
sulandırılan hücreler hemostometre kullanılarak sayılmıĢtır. Hücre peleti soğuk PBS ile iki
kez yıkandıktan sonra kit içerisinde bulunan Binding Buffer (1Х)’ dan
200 µl eklenerek
5
hücreler (hücre yoğunluğu 2-5 Х 10 /ml olacak Ģekilde) süspansiyon haline getirilmiĢtir. Bu
hücre süspansiyonunun 195 µl’sine 5 µl Annexin V FITC (eBioscience- BMS500FI/300CE)
eklenmiĢ ve 10 dk oda sıcaklığında, karanlık ortamda inkübe edilmiĢtir. Hücreler 200µl
Binding Buffer (1Х) ile yıkanmıĢ ve 190 µl Binding Buffer (1Х) ile tekrar süspansiyon haline
getirilmiĢtir. Bu süspansiyona 10 µl Propidium Iodide (20µg/ml) ve 100 µg/ml RNaseA
eklenmiĢ ve 10 dk oda sıcaklığında, karanlık ortamda inkübe edilmiĢtir. Hücreler soğuk
DPBS (Sigma- D5652)
ile yıkandıktan sonra her tüpe 500 µl DPBS (Sigma- D5652)
eklenerek BD FACS Calibur Flow Cytometer cihazında analizi yapılmıĢtır.
Analiz sonucu aĢağıdaki Ģekilde değerlendirilmiĢtir:
Nekrotik Hücreler: PI pozitif, Annexin V negatif
Canlı Hücreler: PI negatif, Annexin V negatif
Geç Apoptotik Hücreler: PI pozitif Annexin V pozitif
Erken Apoptotik Hücreler: PI negatif Annexin V pozitif
9
ġekil 3.1. Flow sitometri FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit analiz sonucu örneği
Ġstatistiksel Analizler
ÇalıĢmada her grup üç kez tekrar edilmiĢ hem siklus hemde hücre canlılık analizlerinin üçer
tekrarı istatistiksel analizde kullanılmıĢtır. Hücrelerin canlılık ve siklus analizleri yapıldıktan
sonra SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) programı kullanılarak istatistiksel
analiz yapılmıĢtır. SPSS programında One-Way ANOVA (tek yönlü varyans analizi) testi
kullanılarak deney grupları arasındaki fark Duncan önemlilik testine göre değerlendirilmiĢtir.
(P<0.05)
10
4.BULGULAR
4.1. Primer kültür
Her bir türden (sığır, koyun, keçi, manda) alınan çeĢitli dokulardan (kulak, kas, ovaryum)
primer kültür yapılarak hücreler elde edilmiĢtir. Alınan kulak dokusundan deri fibroblastı ve
kulak kıkırdak hücreleri, kas dokusundan kas hücreleri elde edilirken ovaryum foliküllerinin
aspirasyonu ile granüloza hücreleri elde edilmiĢtir. Primer kültür oluĢturulduktan sonra her
gün periyodik olarak kontaminasyon olup olmadığı kontrol edilmiĢtir.
Sığırdan ve koyundan alınan dokularla oluĢturulan primer kültürlerde ekimin 7. günü
fibroblast, kıkırdak ve kas hücrelerinde üreme olduğu gözlemlenmiĢtir. (Resim 4.1,Resim 4.2,
Resim 4.4) Hücre tiplerinin üremeleri karĢılaĢtırıldığında her iki tür için de
hücrelerinin üremesinin kıkırdak ve kas hücrelerine
fibroblast
oranla daha hızlı olduğu, en yavaĢ
üreyen hücre tipinin ise kas hücreleri olduğu görülmüĢtür. Granulosa hücrelerinin ise ekimin
ertesi günü üremeye baĢladığı tespit edilmiĢtir. (Resim 4.3)
11
Keçiden alınan dokularla oluĢturulan primer kültürlerde ekimin 20. günü fibroblast ve
kıkırdak hücrelerinde üreme gözlenirken, 22.günü kas hücrelerinde üreme olduğu
gözlemlenmiĢtir. Hücre tiplerinin üremeleri karĢılaĢtırıldığında her iki tür için de fibroblast
hücrelerinin üremesinin kıkırdak ve kas hücrelerine
oranla daha hızlı olduğu, en yavaĢ
üreyen hücre tipinin ise kas hücreleri olduğu görülmüĢtür. Granulosa hücrelerinin ise ekimin
ertesi günü üremeye baĢladığı tespit edilmiĢtir.
Mandadan alınan dokularla oluĢturulan primer kültürlerde ekimin 10. günü üreme olup
olmadığı kontrol edilmiĢ, üreme gözlenememiĢtir. Ekimin 20. günü tekrar kontrol edilen
kültürlerde üremenin olmadığı gözlemlenmiĢ, ardından yapılan araĢtırmalar sonucu manda
türü ile yapılan bazı çalıĢmalarda yüksek glikoz içeren besiyerinin kullanıldığı görülmüĢ,
bunun üzerine kültüre yüksek glikozlu besiyeri (12800-017) ile devam edilmiĢtir. Besiyerinin
değiĢtilmesinin ardından ekimin 27. günü erkek mandanın fibroblast ve kıkırdak hücrelerinde,
35. günü diĢi mandanın fibroblast ve kıkırdak hücrelerinde, 45. gün erkek mandanın kas
hücrelerinde üreme olduğu gözlemlenmiĢtir. DiĢi mandanın kas dokusundan oluĢturulan
primer kültürde ise 50 gün geçmesine rağmen üreme gözlenememiĢtir. Manda ırkının
soyunun tükeniyor olması ve kesiminin belirli illerde, belirli sayıda yapılması nedeniyle diĢi
mandanın kas dokusu tekrar alınamamıĢ, deneyden çıkartılmasına karar verilmiĢtir.
Granulosa hücrelerinin ise ekimin ertesi günü üremeye baĢladığı tespit edilmiĢtir.
12
4.2.Hücre siklus analizi
4.2.1. Hücre sayısı optimizasyonu
Analiz gruplarını oluĢturmadan önce bir optimizasyon çalıĢması yapılmıĢtır. Hücreler
60 mm kültür kabına 4×105 olarak ekilmiĢ (Resim 4.8), kültür kabını tamamen kapladıkları
yani %100 konfluent olduklarında hücreler sayılmıĢ ve sayının 35-36 ×105
olduğu
bulunmuĢtur. (Resim 4.10) Aynı sayıda ekilen hücreler 3. gün sonra 16×105 hücreye ulaĢmıĢ
ve %50 konfluent kabul edilmiĢtir. (Resim 4.9).
13
4.2.2. PI Boyama optimizasyonu
Literatür taraması sonucu bulunan protokellerde boya solüsyonunda PI (SigmaP4864) konsantrasyonunun 20µg/ml ile 50µg/ml arasında değiĢtiği görülmüĢtür. Miktarın
sonuçları ne ölçüde etkilediği üzerinde bir çalıĢma yapılarak uygulanacak PI (Sigma-P4864)
konsantrasyonu belirlenmiĢtir. Fibroblast ve kıkırdak hücreleri konfluent olduktan sonra fikse
edilip aĢağıda belirtildiği Ģekilde protokole uygun olarak boyama iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir.
Fibroblast hücreleri (1 milyon hc/500µl)
50µg/ml PI ile boyandı.
Fibroblast hücreleri (1 milyon hc/500µl)
30µg/ml PI ile boyandı.
Fibroblast hücreleri (1 milyon hc/500µl)
20 µg/ml PI ile boyandı.
Kıkırdak hücreleri (1 milyon hc/500µl)
50µg/ml PI ile boyandı.
Kıkırdak hücreleri (1 milyon hc/500µl)
30µg/ml PI ile boyandı.
Kıkırdak hücreleri (1 milyon hc/500µl)
20 µg/ml PI ile boyandı.
ġekil 4.1. 50µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu.
14
ġekil 4.2. 30µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu.
15
ġekil 4.3. 20µg/ml PI ile boyanan kıkırdak hücrelerine ait analiz sonucu.
Grafiklerde: M1
G0/G1 fazını
M2
S fazını
M3
G2/M fazını göstermektedir.
Yapılan optimizasyon çalıĢmaları sonucunda denenen boya miktarlarının sonucu
etkilemediği 20µg/ml PI’ın (Sigma-P4864) yeterli olduğu tespit edilmiĢtir.
16
4.2.2.Analiz sonuçları
PI (Sigma-P4864) boya ile boyanan hücreler Partec Flow Sitometri cihazında okutularak
hücre siklus analizleri yapılmıĢtır. Partec Flow Sitometri cihazının hücre siklusu analizi için
oluĢturulan program kullanılarak piklerin hangi fazda olduğu ve bu fazların yüzdeleri
hesaplanmıĢtır.
Fazlara göre
hücrelerin
yüzdeleri
G0/ G1 fazındaki
hücreler
S fazındaki hücreler
G2/ M fazındaki
hücreler
ġekil 4.4. Hücre siklus analizi programı kullanılarak fazların yüzdelerinin belirlenmesi
17
Yapılan hücre siklus analizlerinden iki tanesi örnek olarak aĢağıda verilmiĢtir.
ġekil 4.5. Bölünen normal fibroblast hücre grubu
ġekil 4.6. Fibroblast hücrelerinde geç konfluent grubu
18
Sığır hücrelerinde siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
SIĞIR
ERKEK
1
FĠB
54,32±3,54e
23,13±4,34a
23,65±3,64a
SIĞIR
ERKEK
2
FIB
78,10±0,10b
7,15±0,17c
7,15±0,17c
SIĞIR
3 FĠB
80,77±1,41a 4,98±0,87c,d 4,98±0,87d
ERKEK
SIĞIR
4 FĠB
79,75±0,47b 7,26±0,36c
7,26±0,36b
ERKEK
SIĞIR
5 FĠB
69,53±0,24d 14,79±0,45a 14,79±0,45b,c
ERKEK
SIĞIR
6 FĠB
81,37±1,01a 4,30±0,43d
4,30±0,43b,c,d
ERKEK
Tablo 4.1. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
SIĞIR
ERKEK
1
FĠB
51,56±0,86f
31,42±0,69a
28,32±0,14b
SIĞIR
ERKEK
2
FIB
69,67±0,29e
11,58±0,31b
18,76±0,35b
SIĞIR
3 FĠB
82,30±0,24b 7,49±0,22e
10,29±0,08e
ERKEK
SIĞIR
4 FĠB
77,31±0,09d 10,23±0,94c 12,31±0,38c
ERKEK
SIĞIR
5 FĠB
79,54±0,31c 8,47±0,11d
11,56±0,32d
ERKEK
SIĞIR
6 FĠB
87,55±0,27a 2,12±0,05f
10,44±0,41e
ERKEK
Tablo 4.2. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) ve grup 6(120 gün serum açlığı) da elde
edilmiĢtir. (Tablo 4.1)
Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranı grup 6(120 gün serum açlığı) da elde edilmiĢtir. (Tablo 4.2)
19
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
SIĞIR
ERKEK
1
KAS
51,48±0,15g
29,63±0,23a
19,43±0,10c
SIĞIR
ERKEK
2
KAS
67,43±0,40d
12,59±0,22c
20,72±0,30b
SIĞIR
3 KAS
77,68±0,20a 9,59±0,31e
12,62±0,20e
ERKEK
SIĞIR
4 KAS
78,17±0,20a 6,54±0,34e
15,46±0,33c
ERKEK
SIĞIR
5 KAS
75,05±0,21c 10,71±0,50c 14,61±0,36d
ERKEK
SIĞIR
6 KAS
76,49±0,36b 2,61±0,14f
20,33±0,17a
ERKEK
Tablo 4.3. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
SIĞIR
ERKEK
1
KAS
67,47±0,42f
23,48±0,37a
9,48±0,10c
SIĞIR
ERKEK
2
KAS
78,78±0,16e
11,10±0,08b
10,22±0,10b
SIĞIR
3 KAS
82,46±0,34d 5,69±0,28d
11,84±0,10a
ERKEK
SIĞIR
4 KAS
83,41±0,37c 5,77±0,11d
11,52±0,29a
ERKEK
SIĞIR
5 KAS
87,22±0,24b 6,32±0,11c
6,55±0,25e
ERKEK
SIĞIR
6 KAS
90,26±0,13a 2,52±0,40e
7,18±0,18d
ERKEK
Tablo 4.4. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek sığır taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranı
(P<0.05) grup 3 ve 4 (geç konfluent ve geç konfluent ve serum oranı düĢük ) de elde
edilmiĢtir. (Tablo 4.3.)
Erkek sığır taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranı
(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı grubu) da elde edilmiĢtir. (Tablo 4.4.)
20
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
SIĞIR
ERKEK
1
KIK
51,05±0,41g
22,17±0,15a
27,70±0,21a
SIĞIR
ERKEK
2
KIK
67,32±0,11d
9,55±0,33d
25,13±0,59b
SIĞIR
3 KIK
77,49±0,39a 9,56±0,33d
12,51±0,33f
ERKEK
SIĞIR
4 KIK
72,96±0,13d 13,06±0,13b 15,42±0,31d
ERKEK
SIĞIR
5 KIK
74,69±0,46c 11,89±0,37c 13,58±0,43e
ERKEK
SIĞIR
6 KIK
76,22±0,19b 7,39±0,40e
16,30±0,07c
ERKEK
Tablo 4.5. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE
% G0/G1
% S
%G2/M
SIĞIR
ERKEK
1 KIK
53,37±0,24g
23,16±0,66a
SIĞIR
ERKEK
2 KIK
79,91±0,04d
7,00±0,20000b 13,03±0,03a
21,76±0,31f
SIĞIR
3 KIK
82,85±0,66c 4,66±0,33645d 12,45±0,34b
ERKEK
SIĞIR
4 KIK
83,28±0,17c 5,53±0,35791c 13,61±0,37a
ERKEK
SIĞIR
5 KIK
86,18±0,18a 1,55±0,21e
13,55±0,34a
ERKEK
SIĞIR
6 KIK
85,12±0,01b 1,55±0,22e
13,47±0,31a
ERKEK
Tablo 4.6. Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent ) den elde edilmiĢtir.( (Tablo 4.5.)
Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) 5 (72 saat serum açlığı )den elde edilmiĢtir.(Tablo 4.6.)
21
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1
FĠB
65,20±0,17e
23,46±0,35a
11,49±0,19d
SIĞIR
DĠġĠ
2
FIB
69,76±0,28d
9,41±0,17c
20,48±0,08a
SIĞIR
DĠġĠ
3
FĠB
73,61±0,37c
12,98±0,06b
13,63±0,20c
SIĞIR
DĠġĠ
4
FĠB
74,00±0,09c
7,44±0,34e
18,35±0,12b
SIĞIR
DĠġĠ
5
FĠB
81,65±0,33b
8,53±0,32d
9,94±0,03e
SIĞIR
DĠġĠ
6
FĠB
84,43±0,45a
5,42±0,33f
9,51±0,07f
Tablo 4.7. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE
%G0/G1
% S
% G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1 FĠB
62,34±0,15f
21,92±0,07a
15,4667±0,33c
SIĞIR
DĠġĠ
2 FIB
69,55±0,27e
14,29±0,24b
16,2167±0,02b
SIĞIR
DĠġĠ
3 FĠB
71,19±0,22d
10,69±0,29c
18,03±0,06a
SIĞIR
DĠġĠ
4 FĠB
80,92±0,01a
7,65±0,25e
11,53±0,35e
SIĞIR
DĠġĠ
5 FĠB
75,57±0,19c
9,91±0,05d
14,50±0,38d
SIĞIR
DĠġĠ
6 FĠB
79,38±0,22b
6,53±0,25f
14,48±0,40d
Tablo 4.8. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.7.) DiĢi
sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük ) den elde edilmiĢtir.
(Tablo 4.8.)
22
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%
S
% G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1
KAS
68,42±0,44f
13,70±0,24a
17,53±0,34a
SIĞIR
DĠġĠ
2
KAS
83,93±1,25e
5,44±0,38b
11,69±0,31b
SIĞIR
DĠġĠ
3
KAS
86,25±0,11d
2,99±0,19d
10,71±0,30c
SIĞIR
DĠġĠ
4
KAS
88,56±0,36c
4,33±0,19c
6,83±0,22d
SIĞIR
DĠġĠ
5
KAS
92,29±0,30b
1,52±0,27e
6,83±0,09d
SIĞIR
DĠġĠ
6
KAS
94,90±0,05a
1,95±0,01e
3,33±0,43e
Tablo 4.9. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE
% G0/G1
% S
%
G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1 KAS
76,59±0,31d
10,18±0,15a
12,80±0,29b
SIĞIR
DĠġĠ
2 KAS
82,47±0,53c
5,65±0,24c
11,81±0,12c
SIĞIR
DĠġĠ
3 KAS
84,42±0,37b
8,55±0,36b
15,47±0,17a
SIĞIR
DĠġĠ
4 KAS
89,08±0,04a
3,02±0,01c
7,79±0,18f
SIĞIR
DĠġĠ
5 KAS
84,15±0,13b
3,12±0,07c
9,76±0,25d
SIĞIR
DĠġĠ
6 KAS
89,63±0,31a
2,50±0,33d
8,20±0,31e
Tablo 4.10. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi sığır taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05)grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.9.)
DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
23
(P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup) ve grup 6 (120 saat serum açlığı)
den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.10.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
%G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1
KIK
52,96±0,12f
23,50±0,34a
23,45±0,27a
SIĞIR
DĠġĠ
2
KIK
64,10±0,20e
16,26±0,09b
19,08±0,10b
SIĞIR
DĠġĠ
3
KIK
79,22±0,05a
7,61±0,32f
13,04±0,03f
SIĞIR
DĠġĠ
4
KIK
71,28±0,09b
13,05±0,23d
15,16±0,11e
SIĞIR
DĠġĠ
5
KIK
68,21±0,09d
15,30±0,07c
16,42±0,27d
SIĞIR
DĠġĠ
6
KIK
70,35±0,17c
12,47±0,34e
16,95±0,04c
Tablo 4.11. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.11.)
DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.12.)
24
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
%G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1
KIK
53,55±0,38f
20,25±0,12b
25,68±0,19a
SIĞIR
DĠġĠ
2
KIK
71,31±0,13b
13,60±0,37d
15,31±0,04c
SIĞIR
DĠġĠ
3
KIK
74,37±0,17a
11,50±0,28f
14,55±0,24d
SIĞIR
DĠġĠ
4
KIK
68,00±0,08d
12,23±0,20e
15,84±0,09b
SIĞIR
DĠġĠ
5
KIK
62,38±0,14e
22,27±0,17a
14,67±0,30d
SIĞIR
DĠġĠ
6
KIK
70,14±0,16c
14,36±0,20c
15,41±0,37c
Tablo 4.12. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
%G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1
GC
65,03±0,14e
8,89±0,40b
25,36±0,17a
SIĞIR
DĠġĠ
2
GC
79,34±0,14a
7,52±0,37c
13,54±0,32d
SIĞIR
DĠġĠ
3
GC
79,39±0,14a
11,56±0,32a
9,31±0,15e
SIĞIR
DĠġĠ
4
GC
78,39±0,15b
4,48±0,37d
17,58±0,28c
SIĞIR
DĠġĠ
5
GC
70,20±0,11d
8,37±0,22b
20,35±0,16d
SIĞIR
DĠġĠ
6
GC
72,63±0,26c
4,64±0,33d
22,39±0,49b
Tablo 4.13. DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Sığır taze granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 2 ve 3 (erken ve geç konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.13.)
25
Sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.14.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
SIĞIR
DĠġĠ
1
GC
59,25±0,20e
21,59±0,13a
19,41±0,16c
SIĞIR
DĠġĠ
2
GC
72,52±0,15d
4,18±0,01e
23,28±0,18a
SIĞIR
DĠġĠ
3
GC
76,28±0,08b
5,33±0,15c
18,49±0,40d
SIĞIR
DĠġĠ
4
GC
77,22±0,15a
5,20±0,01c
17,28±0,16e
SIĞIR
DĠġĠ
5
GC
72,22±0,77d,e 4,79±0,19d
22,33±0,17b
SIĞIR
DĠġĠ
6
GC
73,59±0,26c
19,38±0,01c
7,48±0,20b
Tablo 4.14. DiĢi sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Koyun türüne ait sonuçlar:
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
KOYUN
ERKEK
1
FĠB
60,55±1,18d
5,61±0,28c
33,40±0,29a
KOYUN
ERKEK
2
FIB
60,13±0,26d
11,49±0,39b
28,33±0,43b
KOYUN
ERKEK
3
FĠB
80,02±0,07a
2,35±0,20d
17,36±0,14f
KOYUN
ERKEK
4
FĠB
76,16±0,15b
2,75±0,24d
20,47±0,06e
KOYUN
ERKEK
5
FĠB
60,29±0,60d
12,30±0,19a
27,41±0,10c
KOYUN
ERKEK
6
FĠB
71,82±0,58c
1,60±0,33e
26,52±0,38d
Tablo 4.15. Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
26
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
KOYUN
ERKEK
1
FĠB
62,55±0,43e
16,49±0,37b
20,78±0,10c
KOYUN
ERKEK
2
FIB
67,23±0,09d
17,76±0,18a
16,62±0,22e
KOYUN
ERKEK
3
FĠB
68,40±1,30c
12,89±0,10c
19,20±0,26d
KOYUN
ERKEK
4
FĠB
62,58±0,40e
12,55±0,30c
24,66±0,23a
KOYUN
ERKEK
5
FĠB
70,00±0,05b
5,73±0,26d
24,24±0,26b
KOYUN
ERKEK
6
FĠB
75,51±0,43a
3,87±0,15e
20,61±0,16c
Tablo 4.16. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 2 (erken konfluent) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.15.)
Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde grup 4(geç konfluent ve serum oranı düĢük
grup) hariç diğer tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları kontrol grubuna
göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları (P<0.05) grup,
grup 6 ( 120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.16.)
27
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
%G2/M
KOYUN
ERKEK
1
KAS
54,35±0,59f
22,72±0,29a
23,52±0,32a
KOYUN
ERKEK
2
KAS
84,48±0,39c
7,31±0,11b
7,65±0,41d
KOYUN
ERKEK
3
KAS
74,75±0,22e
6,60±0,36c
14,49±0,38b
KOYUN
ERKEK
4
KAS
79,60±0,28d
6,50±0,14c
12,51±0,12c
KOYUN
ERKEK
5
KAS
88,60±0,29b
5,37±0,26d
5,69±0,28f
KOYUN
ERKEK
6
KAS
91,38±0,31a
3,04±0,11e
6,27±0,11e
Tablo 4.17. Erkek koyun taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
KOYUN
ERKEK
1
KAS
63,59±0,43e
17,30±0,22b
19,20±0,19a
KOYUN
ERKEK
2
KAS
75,10±0,11d
18,65±0,10a
7,27±0,06d
KOYUN
ERKEK
3
KAS
79,62±0,15c
8,62±0,32c
11,55±0,21b
KOYUN
ERKEK
4
KAS
88,11±0,06b
3,49±0,18d
8,37±0,11c
KOYUN
ERKEK
5
KAS
88,43±0,40b
3,55±0,31f
8,64±0,33e
KOYUN
ERKEK
6
KAS
92,56±0,07a
3,78±0,16f
4,32±0,18g
Tablo 4.18. Erkek koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
28
Erkek koyun taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05)grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.17.)
Erkek koyun donmuĢ kas
hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.18.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
%G2/M
KOYUN
ERKEK
1
KIK
52,25±0,27e
19,53±0,46a
14,84±0,15c
KOYUN
ERKEK
2
KIK
69,39±0,24c
2,23±0,55c
12,53±0,46e
KOYUN
ERKEK
3
KIK
69,67±0,18c
5,38±0,23b
16,38±0,31b
KOYUN
ERKEK
4
KIK
73,48±0,33b
2,59±0,22c
19,25±0,17a
KOYUN
ERKEK
5
KIK
59,51±0,21d
5,38±0,10b
13,55±0,38d
KOYUN
ERKEK
6
KIK
84,52±0,16a
2,00±0,10c
13,24±0,09d
Tablo 4.19. Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.19.)
Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.20.)
29
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
KOYUN
ERKEK
1
KIK
68,75±0,27e
19,51±0,17a
11,02±0,03d
KOYUN
ERKEK
2
KIK
77,54±0,10d
5,93±0,04c
15,77±0,28a
KOYUN
ERKEK
3
KIK
79,48±0,20c
4,33±0,27d
15,73±0,15a
KOYUN
ERKEK
4
KIK
80,50±0,45b
5,77±0,26c
13,37±0,22b
KOYUN
ERKEK
5
KIK
80,13±0,08b,c 4,09±0,02d
15,90±0,02a
KOYUN
ERKEK
6
KIK
81,92±0,92a
12,54±0,17c
6,34±0,22b
Tablo 4.20. Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
FĠB
50,30±0,66c
27,29±0,21a
22,54±0,38a
KOYUN
DĠġĠ
2
FIB
84,62±0,08a
7,23±0,11c
8,27±0,16e
KOYUN
DĠġĠ
3
FĠB
82,63±0,15a
7,11±0,05c
8,27±0,16e
KOYUN
DĠġĠ
4
FĠB
77,57±2,13b
9,20±0,21b
13,18±0,14b
KOYUN
DĠġĠ
5
FĠB
82,79±0,27a
6,78±0,25d
10,65±0,10d
KOYUN
DĠġĠ
6
FĠB
82,71±2,18a
6,11±0,04e
11,68±0,20c
Tablo 4.21. DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent), grup 5,6 (72 ve 120 saat serum açlığı) dan
elde edilmiĢtir. (Tablo 4.21.)
30
DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları grup 5 (72 saat serum açlığı) den elde edilmiĢtir (Tablo 4.22)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
FĠB
65,37±0,27f
13,77±0,21a
20,83±0,12a
KOYUN
DĠġĠ
2
FIB
90,45±0,19c
2,65±0,09d
6,76±0,19e
KOYUN
DĠġĠ
3
FĠB
81,56±0,22e
6,52±0,39b
12,74±0,11b
KOYUN
DĠġĠ
4
FĠB
87,58±0,19d
3,48±0,22c
9,76±0,27c
KOYUN
DĠġĠ
5
FĠB
96,38±0,26a
1,29±0,21e
2,48±0,05f
KOYUN
DĠġĠ
6
FĠB
92,29±0,26b
0,55±0,20f
7,15±0,03d
Tablo 4.22. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi koyun taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.23.)
DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.24.)
DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup) dan elde
edilmiĢtir. (Tablo 4.25.)
DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
31
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 5 ve6 (72 ve 120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo
4.26.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
KAS
62,06±1,32f
18,66±0,17a
19,45±1,05a
KOYUN
DĠġĠ
2
KAS
93,73±0,15b
0,44±0,38d
5,59±0,22b
KOYUN
DĠġĠ
3
KAS
90,63±0,16e
2,62±0,24c
6,90±0,06a
KOYUN
DĠġĠ
4
KAS
91,60±0,13d
3,56±0,26b
6,66±0,11a
KOYUN
DĠġĠ
5
KAS
93,31±0,22c
0,39±0,22d
6,54±0,37c
KOYUN
DĠġĠ
6
KAS
95,40±0,21a
0,46±0,06d
4,11±0,06e
Tablo 4.23. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
%G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
KAS
49,79±1,96g
17,37±0,27c
32,65±1,73a
KOYUN
DĠġĠ
2
KAS
76,85±0,05d
15,71±0,19b
8,40±0,21c
KOYUN
DĠġĠ
3
KAS
75,20±0,09e
15,93±0,06b
10,02±0,03b
KOYUN
DĠġĠ
4
KAS
88,37±0,41c
4,02±0,79c
7,64±0,04d
KOYUN
DĠġĠ
5
KAS
92,72±0,12b
3,80±0,14c
3,73±0,26e
KOYUN
DĠġĠ
6
KAS
94,68±0,37a
2,44±0,28d
3,13±0,09f
Tablo 4.24. DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Koyun taze granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 2 (erken konfluent grubu) den elde edilmiĢtir. (Tablo 4.27.)
32
Koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup) ve 6 (120 saat
serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.28.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
% G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
KIK
60,41±1,01c
20,65±0,70a
19,03±1,12a
KOYUN
DĠġĠ
2
KIK
76,98±0,70d
9,63±0,13b
15,59±0,26a
KOYUN
DĠġĠ
3
KIK
83,49±0,07b
3,44±0,23e
12,86±0,28d
KOYUN
DĠġĠ
4
KIK
84,60±0,51a
1,59±0,14f
13,60±0,26c
KOYUN
DĠġĠ
5
KIK
81,34±0,75c
5,86±0,16d
14,41±0,29b
KOYUN
DĠġĠ
6
KIK
80,70±0,13c
8,63±0,12c
11,73±0,16e
Tablo 4.25. DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
KIK
69,72±0,26d
23,32±0,57a
7,48±0,22c
KOYUN
DĠġĠ
2
KIK
87,63±0,22b
3,85±0,22c
9,37±0,22a
KOYUN
DĠġĠ
3
KIK
85,73±0,23c
5,21±0,10b
9,48±0,14a
KOYUN
DĠġĠ
4
KIK
87,46±0,22b
5,29±0,21b
7,29±0,21c
KOYUN
DĠġĠ
5
KIK
89,32±0,29a
1,18±0,09e
9,66±0,11a
KOYUN
DĠġĠ
6
KIK
89,26±0,20a
2,52±0,37d
8,66±0,22b
Tablo 4.26. DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
33
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%
S
% G2/M
KOYUN
DĠġĠ
1
GC
56,84±3,41a
22,38±2,64a
20,07±0,88b
KOYUN
DĠġĠ
2
GC
87,58±0,28a
4,63±0,31e
8,25±0,14d
KOYUN
DĠġĠ
3
GC
78,58±0,15e
5,50±0,18d
15,40±0,32a
KOYUN
DĠġĠ
4
GC
82,41±0,19d
6,38±0,23c
10,62±0,07c
KOYUN
DĠġĠ
5
GC
85,45±0,28b
6,55±0,23c
7,64±0,29e
KOYUN
DĠġĠ
6
GC
84,67±0,35c
7,27±0,23b
7,95±0,03d,e
Tablo 4.27. DiĢi koyun taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
%G2/M
20,25±0,36a
19,51±0,37a
KOYUN
DĠġĠ
1
GC
60,60±0,22d
KOYUN
DĠġĠ
2
GC
83,29±0,24b,c 3,84±0,16d
13,51±0,21b
KOYUN
DĠġĠ
3
GC
84,11±1,51b
5,52±0,12c
9,65±0,28e
KOYUN
DĠġĠ
4
GC
86,60±0,34a
3,94±0,04d
9,80±0,21e
KOYUN
DĠġĠ
5
GC
82,66±0,11c
6,33±0,21c
11,38±0,34d
KOYUN
DĠġĠ
6
GC
85,66±0,31a
2,33±0,32g
12,48±0,31c
Tablo 4.28. DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
34
Keçi türüne ait sonuçlar:
HAYVAN
HÜCRE
GRUP
%G0/G1
%S
KEÇĠ
ERKEK
1
FĠB
60,24±3,44
e
21,09±0,40
KEÇĠ
ERKEK
2
FIB
74,11±3,39
b
4,24±0,14
KEÇĠ
ERKEK
3
FĠB
74,33±0,16
b
8,48±0,16
KEÇĠ
ERKEK
4
FĠB
68,77±0,80
c
6,59±0,39
KEÇĠ
ERKEK
5
FĠB
79,08±1,21
a
1,81±0,22
KEÇĠ
ERKEK
6
FĠB
81,57±2,50
a
4,49±0,18
a
%G2/M
18,57±0,16
d
d
22,53±0,35
b
b
18,11±0,13
d
c
23,47±0,51
a
e
19,01±0,48
c
d
14,65±0,37
e
Tablo 4.29. Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo
4.29.)
HAYVAN
HÜCRE
GRUP
% G0/G1
%S
KEÇĠ
ERKEK
1
FĠB
63,66±1,15
c
16,00±1,00
KEÇĠ
ERKEK
2
FIB
74,11±3,39
c,d
8,73±0,23
KEÇĠ
ERKEK
3
FĠB
74,00±0,61
c,d
3,08±0,04
KEÇĠ
ERKEK
4
FĠB
75,79±0,18
b,c
3,15±0,03
KEÇĠ
ERKEK
5
FĠB
79,08±1,21
a,b
4,15±0,04
KEÇĠ
ERKEK
6
FĠB
81,77±2,41
a
0,98±0,22
a
%G2/M
19,66±0,57
d
b
17,29±0,31
c
d
22,22±0,15
a
d
20,64±0,30
b
c
16,70±0,28
d
e
16,98±0,32
c,d
Tablo 4.30. Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
35
Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir, ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo
4.30.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
ERKEK
1 KAS
57,34±1,07e
23,61±2,17a
19,08±1,02a
KEÇĠ
ERKEK
2 KAS
83,36±1,13b,c
5,88±0,02c
11,11±0,09b
KEÇĠ
ERKEK
3 KAS
86,53±0,23b
5,44±0,22d
8,33±0,09c
KEÇĠ
ERKEK
4 KAS
82,47±0,67c
6,32±0,10b
11,62±0,34b
KEÇĠ
ERKEK
5 KAS
75,12±0,89d
4,16±0,05e
5,05±0,07d
KEÇĠ
ERKEK
6 KAS
91,48±3,92a
3,27±0,20f
4,53±0,35e
Tablo 4.31. Erkek keçi taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
KEÇĠ
ERKEK
1
KAS
72,77±1,29d
13,16±0,09a
13,84±0,14e
KEÇĠ
ERKEK
2
KAS
75,22±0,28c
4,38±0,47d
20,46±0,04a
KEÇĠ
ERKEK
3
KAS
76,58±0,47c
5,24±0,18c
18,22±0,11b
KEÇĠ
ERKEK
4
KAS
75,73±0,39c
6,24±0,14b
17,33±0,10c
KEÇĠ
ERKEK
5
KAS
82,29±1,14b
3,06±0,07e
14,43±0,34d
KEÇĠ
ERKEK
6
KAS
84,95±0,37a
2,87±0,08e
12,14±0,13f
Tablo 4.32. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
36
Erkek keçi taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.31.)
Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.32.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
ERKEK
1
KIK
64,00±4,66a
14,72±0,63a
21,00±1,21c
KEÇĠ
ERKEK
2
KIK
62,10±1,46a
12,61±0,68b
24,41±0,46b
KEÇĠ
ERKEK
3
KIK
65,33±3,20a
8,20±0,26e
26,21±0,24a
KEÇĠ
ERKEK
4
KIK
58,77±1,30b
13,18±0,19b
20,24±0,20c
KEÇĠ
ERKEK
5
KIK
66,94±1,55a
9,42±0,11d
24,10±0,10b
KEÇĠ
ERKEK
6
KIK
66,62±1,39a
10,50±0,34c
15,47±0,44d
Tablo 4.33. Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçlar
Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde (P<0.05) hiçbir grup
sinkronizasyon uygulaması
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmemiĢtir. (Tablo 4.33.)
Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo
4.34.)
37
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
ERKEK
1
KIK
47,36±1,20e
21,72±2,16a
30,91±1,00a
KEÇĠ
ERKEK
2
KIK
65,98±0,32d
7,55±0,06d
22,53±0,18c
KEÇĠ
ERKEK
3
KIK
67,43±2,87c,d 7,36±0,07d
21,86±0,10d
KEÇĠ
ERKEK
4
KIK
65,89±1,89d
3,73±0,14e
28,46±0,03b
KEÇĠ
ERKEK
5
KIK
73,56±0,65a,b 9,86±0,08c
16,88±0,08e
KEÇĠ
ERKEK
6
KIK
75,16±0,25a
12,23±0,15f
12,65±0,19b
Tablo 4.34. Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
%G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
FĠB
70,46±1,21e
15,26±0,09a
15,26±0,71c
KEÇĠ
DĠġĠ
2
FIB
82,24±0,66d
8,39±0,16c
9,40±0,05a
KEÇĠ
DĠġĠ
3
FĠB
83,41±0,37c,d 6,34±0,12e
9,66±0,25a
KEÇĠ
DĠġĠ
4
FĠB
83,62±0,63c
9,51±0,17b
6,70±0,27c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
FĠB
85,84±0,66b
7,22±0,15d
6,20±0,16d
KEÇĠ
DĠġĠ
6
FĠB
88,68±1,33a
6,29±0,30e
4,30±0,17e
Tablo 4.35. DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
38
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
FĠB
72,70±0,35e
15,25±0,05a
11,79±0,34c
KEÇĠ
DĠġĠ
2
FIB
84,23±0,30c
3,55±0,37d
12,63±0,25b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
FĠB
85,62±2,30c
6,52±0,32c
14,37±0,18a
KEÇĠ
DĠġĠ
4
FĠB
79,79±0,78d
8,33±0,20b
12,68±0,18b
KEÇĠ
DĠġĠ
5
FĠB
94,04±0,16b
2,89±0,09e
3,43±0,46d
KEÇĠ
DĠġĠ
6
FĠB
96,01±0,83a
3,22±0,19d,e
1,10±0,37e
Tablo 4.36. DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢtir ancak en yüksek
G0/G1 oranları(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.35.)
DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranları grup (P<0.05) 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.36.)
DiĢi keçi taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.37.)
DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.38.)
39
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
12,43±0,11a
16,54±0,30b
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KAS
71,19±0,78e
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KAS
78,88±1,78c,d 4,27±0,20d
13,25±0,28d
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KAS
82,32±0,82b,c 6,27±0,23b
14,10±0,09c
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KAS
76,17±0,23d
5,32±0,19c
17,34±0,07a
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KAS
85,67±5,68a,b 3,21±0,24e
11,93±0,09e
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KAS
88,10±0,30a
7,31±0,12f
4,18±0,05d
Tablo 4.37. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
% G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KAS
72,18±0,24e
12,24±0,17a
15,49±0,30a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KAS
78,88±2,32d
10,26±0,20b
11,02±0,07d
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KAS
82,15±3,14c
7,43±0,48c
9,54±0,06e
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KAS
77,73±0,23d
10,39±0,04b
11,85±0,10c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KAS
85,31±1,02b
6,22±0,09d
14,55±0,27b
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KAS
92,69±1,15a
2,27±0,28e
5,14±0,09f
Tablo 4.38. DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
40
DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek G0/G1 oranları
(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.39.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KIK
72,04±0,73f
5,64±0,30d
22,67±0,27a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KIK
75,34±0,35d
7,18±0,01c
18,04±0,02b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KIK
78,14±0,42c
8,21±0,15b
14,28±0,12e
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KIK
74,09±0,53e
9,19±0,12a
16,33±0,17d
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KIK
80,13±0,17b
2,24±0,13e
17,45±0,15c
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KIK
85,57±0,38a
8,17±0,05b
6,25±0,17f
Tablo 4.39. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KIK
53,37±0,41f
23,40±0,39a
23,64±0,17a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KIK
72,69±0,80d
8,27±0,16c
18,31±0,16d
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KIK
74,13±0,34c
6,59±0,31e
19,45±0,14c
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KIK
66,09±0,60e
12,64±0,19b
21,53±0,23b
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KIK
75,17±0,45b
7,31±0,10d
17,39±0,14e
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KIK
77,15±0,12a
5,16±0,10f
17,18±0,14e
Tablo 4.40. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
41
DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde deney tüm gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.40.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
GC
79,08±0,72e
3,98±0,76b
16,93±0,03a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
GC
85,54±0,33d
3,32±0,19c
11,13±0,14b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
GC
88,18±0,23b
2,24±0,10d
9,57±0,16d
KEÇĠ
DĠġĠ
4
GC
85,30±0,12d
5,27±0,06a
9,42±0,10d
KEÇĠ
DĠġĠ
5
GC
86,46±0,13c
3,15±0,02c
10,39±0,15c
KEÇĠ
DĠġĠ
6
GC
91,29±0,06a
2,08±0,04d
6,62±0,08e
Tablo 4.41. DiĢi keçi taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
% G2/M
KEÇĠ
DĠġĠ
1
GC
76,28±0,14e
5,30±0,20a
18,41±0,06a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
GC
79,73±0,28d
4,40±0,16c
15,86±0,24b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
GC
85,29±0,15b
3,24±0,22e
11,46±0,35d
KEÇĠ
DĠġĠ
4
GC
79,66±0,29d
4,83±0,16b
15,50±0,39b,c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
GC
81,30±0,17c
3,62±0,05d
15,07±0,21c
KEÇĠ
DĠġĠ
6
GC
87,92±0,54a
2,66±0,24f
9,41±0,31e
42
Tablo 4.42. DiĢi keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Keçi taze granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon uygulamaları
kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek G0/G1 oranı
(P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.41.)
Keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.42.)
Manda türüne ait sonuçlar
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
% G2/M
MANDA
ERKEK
1
FĠB
75,43±0,45d
12,25±0,59a
12,30±0,87a
MANDA
ERKEK
2
FIB
86,54±2,36c
3,15±01,27b
10,31±1,10b
MANDA
ERKEK
3
FĠB
92,51±0,13b
1,67±0,34c,d
5,81±0,39c
MANDA
ERKEK
4
FĠB
88,42±0,23c
1,64±0,14c,d
9,94±0,29b
MANDA
ERKEK
5
FĠB
87,57±1,08c
2,78±0,90b,c
9,61±0,40b
MANDA
ERKEK
6
FĠB
95,10±0,51a
1,13±0,03d
3,86±0,62d
Tablo 4.43. Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.43.)
Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
43
G0/G1 oranları (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) ve grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde
edilmiĢtir. (Tablo 4.44.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%S
% G2/M
MANDA
ERKEK
1
FĠB
75,85±0,94e
13,33±0,14a
14,80±7,49a
MANDA
ERKEK
2
FIB
89,08±1,23c
5,23±1,28c
5,68±0,31b
MANDA
ERKEK
3
FĠB
93,46±0,43a
3,27±0,52d
3,25±0,80b
MANDA
ERKEK
4
FĠB
79,42±0,67d
6,97±0,52b
13,60±0,29a
MANDA
ERKEK
5
FĠB
91,32±1,06b
2,55±0,49d,e
6,11±0,84b
MANDA
ERKEK
6
FĠB
93,20±0,28a
1,24±1,04e
5,55±0,83b
Tablo 4.44. Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
%G2/M
MANDA
ERKEK
1
KAS
53,96±0,81e
23,78±1,64a
22,25±2,22a
MANDA
ERKEK
2
KAS
74,14±0,14d
11,44±0,53b
14,41±0,40b
MANDA
ERKEK
3
KAS
79,50±0,26b
9,44±0,09c
11,05±0,32c
MANDA
ERKEK
4
KAS
75,48±0,56c
9,19±0,23c
15,32±0,63b
MANDA
ERKEK
5
KAS
78,62±0,72b
10,35±0,29b,c 11,02±1,01c
MANDA
ERKEK
6
KAS
83,99±0,54a
4,10±0,10d
11,90±0,55c
Tablo 4.45. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
44
Erkek manda taze kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.45.)
Erkek manda donmuĢ kas hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.46.)
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
% G2/M
MANDA
ERKEK
1
KAS
55,94±0,59
f
17,17±0,71
a
27,08±0,83
a
MANDA
ERKEK
2
KAS
75,18±0,66
e
11,31±0,85
b
13,50±0,48
c,d
MANDA
ERKEK
3
KAS
79,54±0,48
b
6,09±0,73
14,36±0,85
c
MANDA
ERKEK
4
KAS
76,23±0,07
d
12,03±0,43
11,66±0,56
e
MANDA
ERKEK
5
KAS
77,89±0,70
c
5,78±0,27
c
16,32±0,98
b
MANDA
ERKEK
6
KAS
82,92±0,56
a
4,41±0,39
d
12,66±0,36
d,e
c
b
Tablo 4.46. Erkek manda donmuĢ kas hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
MANDA
ERKEK
1
KIK
78,58±0,57
e
11,90±0,43
MANDA
ERKEK
2
KIK
90,30±0,20
c
2,45±0,23
MANDA
ERKEK
3
KIK
92,23±0,25
b
1,81±0,25
MANDA
ERKEK
4
KIK
83,28±0,86
d
4,81±0,92
MANDA
ERKEK
5
KIK
90,79±0,28
c
3,35±0,34
MANDA
ERKEK
6
KIK
94,81±0,70
a
1,19±0,06
a
% G2/M
9,51±0,24
b
d
7,24±0,21
c
d,e
5,95±0,49
d
b
11,90±0,53
c
5,85±0,63
d
e
3,98±0,66
e
a
Tablo 4.47. Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
45
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
%S
% G2/M
MANDA
ERKEK
1
KIK
59,24±0,51f
15,36±1,58a
25,40±1,25a
MANDA
ERKEK
2
KIK
76,16±0,18e
10,20±0,35b
13,62±0,51b
MANDA
ERKEK
3
KIK
83,80±0,19c
8,37±0,20c
7,81±0,27d
MANDA
ERKEK
4
KIK
80,47±0,89d
9,81±0,59b
9,71±0,90c
MANDA
ERKEK
5
KIK
84,80±0,37b
2,51±0,60d
12,67±0,22b
MANDA
ERKEK
6
KIK
90,08±0,50a
1,09±0,21e
8,82±0,69c,d
Tablo 4.48. Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.47.)
Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.48.)
DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde
edilmiĢtir. (Tablo 4.49.)
DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde
edilmiĢtir. (Tablo 4.50.)
46
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
% G2/M
MANDA
DĠġĠ
1
FĠB
77,54±1,23d
7,24±3,33a,b
15,20±3,31a
MANDA
DĠġĠ
2
FIB
80,22±1,36c
8,59±1,74a
11,18±0,59b
MANDA
DĠġĠ
3
FĠB
91,25±0,54a
4,78±0,11b,c
3,96±0,60c
MANDA
DĠġĠ
4
FĠB
86,88±0,72b
3,23±1,42c
9,88±0,69b
MANDA
DĠġĠ
5
FĠB
85,54±0,29b
4,33±0,22b,c
10,12±0,52b
MANDA
DĠġĠ
6
FĠB
92,14±0,18a
4,12±0,02b,c
3,73±0,19c
Tablo 4.49. DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE
%G0/G1
% S
% G2/M
12,06±0,20a
11,03±0,56b,c
MANDA
DĠġĠ
1 FĠB
76,90±0,37d
MANDA
DĠġĠ
2 FIB
81,35±1,36b,c 8,76±0,91b
9,88±0,64c
MANDA
DĠġĠ
3 FĠB
91,38±0,79a
2,93±0,62e
5,65±1,31d
MANDA
DĠġĠ
4 FĠB
80,80±0,62c
7,11±0,77c
12,08±1,17a,b
MANDA
DĠġĠ
5 FĠB
82,53±0,32b
4,84±0,35d
12,62±0,67a
MANDA
DĠġĠ
6 FĠB
92,34±0,17a
2,34±0,15e
5,31±0,31d
Tablo 4.50. DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
47
DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.51.)
DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.52.)
DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.53.)
DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde tüm deney gruplarında farklı sinkronizasyon
uygulamaları kontrol grubuna göre hücreleri G0/G1’a sinkronize etmiĢ, ancak en yüksek
G0/G1 oranı (P<0.05) grup 6 (120 saat serum açlığı) dan elde edilmiĢtir. (Tablo 4.54.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE
% G0/G1
%
S
% G2/M
MANDA
DĠġĠ
1 KIK
59,99±0,83e
19,25±1,22a
20,76±1,95a
MANDA
DĠġĠ
2 KIK
86,63±0,84c
4,15±0,15c
9,20±0,99c
MANDA
DĠġĠ
3 KIK
87,72±0,90c
3,80±1,34c,d
8,46±01,75c
MANDA
DĠġĠ
4 KIK
80,06±1,00d
7,33±1,22b
12,57±0,53b
MANDA
DĠġĠ
5 KIK
90,17±01,01b
2,39±0,26d
7,42±1,27c,d
MANDA
DĠġĠ
6 KIK
91,85±0,48a
2,54±0,14c,d
5,60±0,62d
Tablo 4.51. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
48
HÜCRE
HAYVAN GRUP
%G0/G1
% S
%G2/M
MANDA
DĠġĠ
1
KIK
69,58±1,15e
17,13±1,24a
13,29±1,57a
MANDA
DĠġĠ
2
KIK
79,28±0,58d
7,51±0,38c
13,20±0,24a
MANDA
DĠġĠ
3
KIK
81,38±1,16c
3,97±0,10d
14,64±1,15a
MANDA
DĠġĠ
4
KIK
84,15±1,77b
6,56±1,91c
9,29±0,30c
MANDA
DĠġĠ
5
KIK
78,21±0,22d
10,12±0,48b
11,65±0,58b
MANDA
DĠġĠ
6
KIK
86,99±0,35a
2,31±0,30d
10,70±0,25b,c
Tablo 4.52. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
% S
% G2/M
MANDA
DĠġĠ
1
GC
58,30±0,15d
19,94±0,79a
21,74±0,68a
MANDA
DĠġĠ
2
GC
74,18±1,46c
15,38±0,08b
10,43±1,54b,c,d
MANDA
DĠġĠ
3
GC
77,19±0,25b
13,54±0,39c
9,26±0,60c,d
MANDA
DĠġĠ
4
GC
75,40±0,27c
12,74±1,28c
11,85±1,16b
MANDA
DĠġĠ
5
GC
75,45±0,17c
13,65±0,22c
10,89±0,36b,c
MANDA
DĠġĠ
6
GC
81,22±0,87a
9,75±0,73d
9,02±0,29d
Tablo 4.53. DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
49
HÜCRE
HAYVAN GRUP
% G0/G1
%
S
% G2/M
MANDA
DĠġĠ
1
GC
59,20±0,27f
13,10±0,53a
27,69±0,28a
MANDA
DĠġĠ
2
GC
78,45±0,39d
6,75±0,48b
14,79±0,87b
MANDA
DĠġĠ
3
GC
82,68±0,21b
5,39±0,26c
11,92±0,11c
MANDA
DĠġĠ
4
GC
75,49±0,46e
12,49±0,01a
12,01±0,45c
MANDA
DĠġĠ
5
GC
80,31±0,70c
5,41±0,49c
14,27±0,38b
MANDA
DĠġĠ
6
GC
86,23±0,90a
3,62±0,34d
10,17±1,12d
Tablo 4.54. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre siklus analiz sonuçları
50
4.3.Hücrede Apoptozis ve Nekrozis Analizi
4.3.1. RNase optimizasyon
Yapılan literatür taraması sonucunda Annexin V/Propidium Iodide ile yapılan apoptosis analiz
çalıĢmalarında eklenen RNase’ın yanlıĢ pozitif sonuçları ortadan kaldırdığı görülmüĢ ve
bunun üzerine kendi hücre gruplarımızda RNase’ın etkisi araĢtırılmıĢtır.
ġekil 4.7. RNase eklenmeyen boyama sonucu
51
ġekil 4.8. RNase eklenen boyama sonucu
Hücre tipi
RNase A
Yok
Canlı
hücre(%)
96.21
Nekrotik
(%)
3.31
Geç
apoptotik(%)
0.34
Erken
Apoptotik (%)
0.14
Kıkırdak
Kıkırdak
Var
99.39
0.3
0.15
0.15
Fibroblast
Yok
96.56
2.82
0.45
0.17
Fibroblast
Var
98.32
1.29
0.24
0.15
Tablo 4.55. AnexinV boyama protokolünde RNase (AppliChem A3832,0050) kullanımının
etkisi
Tabloda da görüldüğü gibi RNase eklenen ve eklenmeyen
boyama iĢleminde hücre
canlılığında belirgin farklılıklar gözlenmiĢ, RNase kullanılması uygun görülmüĢtür.
52
4.3.2.Analiz sonuçları
Sonuçlar aĢağıdaki Ģekilde değerlendirilmiĢtir.
Hücrelerin boyut
ve
granüllülüğüne
göre gösterildiği
grafik
Propidium iodide ile
boyanan hücreler
Seçilen
hücreler
1
Annexin V FITCH
ile boyanan
hücreler
3
2
4
Grafikte numaralandırılan
alanlar istatistiklerde
aşağıdaki gibi
sıralanmaktadır.
ġekil 4.9. Canlılık analiz sonuçlarının değerlendirilmesinin gösterimi.
53
BD FACS Calibur cihazı kullanılarak yapılan hücre canlılık analizlerinden iki tanesi
örnek olarak aĢağıda verilmiĢtir.
ġekil 4.10. Bölünen normal fibroblast hücre grubu.
ġekil 4.11. Fibroblast hücrelerinde erken konfluent grubu
54
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
ERKEK
1
FĠB
96,37±0,22b
2,06±0,15 c
0,05±0,03d
1,06±0,10a,b,c
SIĞIR
ERKEK
2
FĠB
93,99±0,27d
2,39±0,05a,b
0,12±0,07b
2,42±0,37a
SIĞIR
ERKEK
3
FĠB
94,99±0,27c
2,39±0,05a, b
0,12±0,07a
2,42±0,37a
SIĞIR
ERKEK
4
FIB
92,08±0,40e
4,00±2,22a
0,07±0,04b
2,16±1,84a
SIĞIR
ERKEK
5
FĠB
98,11±0,21a
1,44±0,14c
0,04±0,02e
0,28±,03c
SIĞIR
ERKEK
6
FĠB
96,21±0,22b
1,75±0,12c
0,08±0,04c
1,04±0,12a,b,c
Tablo 4.56. Erkek sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
ERKEK
1
FĠB
95,45±0,83b
3,85±0,83a
0,02±,05b,c
0,40±0,08c
SIĞIR
ERKEK
2
FĠB
97,42±0,25a
2,24±0,22b
0,11±0,03c
0,21±0,03c
SIĞIR
ERKEK
3
FĠB
97,98±0,30a
1,31±0,09c
0,30±0,10b,c
0,41±0,26c
SIĞIR
ERKEK
4
0,94±0,21c
0,23±0,04b,c
FĠB
98,55±0,36a
0,27±0,11c
SIĞIR
ERKEK
5
FIB
92,04±1,34c
2,45±0,09b
2,47±0,85a
3,03±0,46a
SIĞIR
ERKEK
6
FĠB
95,12±0,68b
2,73±0,05b
0,85±0,29b
1,29±0,37b
Tablo 4.57. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
55
Erkek sığır fibroblast hücrelerinde kontrol grubu da dahil olmak üzere nekrotik hücre
sayısında sinkronizasyon grupları arasındaki tek fark 3.(geç konfluent) ve 4.grupta (geç
konfluent ve düĢük serum) olmuĢ diğerlerine göre nekrotik hücre oranı istatistiksel olarak
(P<0.05) yüksek çıkmıĢtır. Ayrıca grup 5 (72 saat serum açlığı) ve 6 (120 saat serum açlığı)
da erken apoptotik hücre oranı da kontrole göre yüksek bulunmuĢtur. Ġstatistiksel olarak
(P<0.05) hücre canlılık oranının en düĢük olduğu grup 5 (72 saat serum açlığı ) olarak
bulunmuĢtur. (Tablo 4.56.)
Aynı hücrelerin donmuĢ olanlarında ise istatistiksel olarak en yüksek geç ve erkek apoptotik
hücre oranı grup 5 (72 saat serum açtığı) de bulunurken aynı zamanda en düĢük canlı hücre
oranı (P<0.05) da yine aynı grupta görülmüĢtür. (Tablo 4.57.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
ERKEK
1
KAS
94,73±1,26b
2,43±1,16b
0,79±,19a
2,05±,14a
SIĞIR
ERKEK
2
KAS
97,03±1,27a
2,22±1,20b,c
0,29±0,15c
0,45±0,09c
SIĞIR
ERKEK
SIĞIR
ERKEK
SIĞIR
ERKEK
SIĞIR
ERKEK
3
KAS
94,90±0,57b
4,40±0,64a
0,34±0,05b,c
0,34±0,13c
4
KAS
97,01±0,92a
1,76±0,60b,c
0,50±0,17b,c
0,72±0,13b
5
KAS
97,09±0,17a
1,50±0,07b,c
0,82±0,07a
0,57±0,17b,c
6
KAS
98,08±0,09a
0,74±0,12c
0,58±0,00a,b
0,58±0,05b,c
Tablo 4.58. Erkek sığır taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek sığır taze kas hücrelerinde istatistiksel olarak en yüksek (P<0.05) nekrotik hücre
oranları sırasıyla grup 3 (geç konfluent grubu) de görülürken en düĢük hücre canlılık oranları
(P<0.05) yine aynı grupta tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.58.)
Erkek donmuĢ kas hücrelerinde ise sinkronizasyon grupları arasında en yüksek nekrotik
hücre oranı (P<0.05) grup 6 (72 saat serum açlığı), grup 7 (120 saat serum açlığı) de
bulunurken geç apoptotik hücre oranları grup 6 (120 saat serum açlığı) ve erken apoptotik
hücre oranları da grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de diğerlerinden yüksek
56
(P<0.05) olmuĢtur. DonmuĢ kas hücrelerinin kontrol grubunda da nekrotik hücre oranının
benzer Ģekilde
yüksek bulunması donmanın kas hücreleri üzerindeki genel bir olumsuz
etkisine iĢaret etmektedir. Deney grupları içinde en düĢük hücre canlılık oranları (P<0.05)
grup 5 (72 saat serum açlığı) de görülmüĢtür. (Tablo 4.59.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
ERKEK
1
KAS
94,12±0,65c
4,38±1,51a,b
0,44±0,02c
1,04±0,19b
SIĞIR
ERKEK
2
KAS
96,98±0,29b
1,42±0,12c
0,70±0,08c
0,89±0,43b
SIĞIR
3 KAS
99,65±0,05a 0,28±0,02c
0,04±0,03d
0,01±0,01d
ERKEK
SIĞIR
4 KAS
93,30±1,15c 3,51±0,71b
1,17±0,26b
2,01±0,31a
ERKEK
SIĞIR
5 KAS
91,87±0,73d 5,35±0,36a
1,29±0,11b
1,41±0,83a,b
ERKEK
SIĞIR
6 KAS
93,01±2,54c 5,30±1,19a
1,56±0,20a
1,45±0,15a,b
ERKEK
Tablo 4.59. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
ERKEK
1
KIK
97,80±0,18b
1,64±0,18b
0,30±0,04c
0,24±0,02d
SIĞIR
ERKEK
2
KIK
94,72±0,23c
2,84±0,14a
1,33±0,07b
1,09±0,07b
SIĞIR
3 KIK
92,88±0,26d 2,67±0,20a
3,84±0,17a
0,59±0,03c
ERKEK
SIĞIR
4 KIK
94,89±0,40c 2,66±0,29a
1,20±0,06b
1,23±0,09a
ERKEK
SIĞIR
5 KIK
99,25±0,03a 0,50±0,06c
0,08±0,03d
0,15±0,04d
ERKEK
SIĞIR
6 KIK
97,45±0,24b 1,69±0,16b
0,38±0,06c
0,48±0,09c
ERKEK
Tablo 4.60. Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
57
Erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 2,3,4
(erken konfluent, geç konfluent, geç konfluent ve serum oranı düĢük) de görülürken, en
yüksek (P<0.05) geç apoptotik hücre oranı grup 3’de en yüksek, erken apoptotik hücre oranı
ise grup 4 de görülmüĢtür. En düĢük hücre canlılık oranları (P<0.05) ise grup 3 (geç
konfluent) de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.60.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%) HÜCRE(%)
SIĞIR
ERKEK
1
KIK
96,03±0,25a
2,51±0,20c
0,52±0,10b
0,93±0,01b
SIĞIR
ERKEK
2
KIK
93,33±0,56c
6,50±0,56a
0,06±0,03d
0,10±0,02d
SIĞIR
3 KIK
96,22±1,16a 3,65±1,16b
0,04±0,02d
0,08±0,02d
ERKEK
SIĞIR
4 KIK
97,01±0,06a 2,17±0,03c
0,50±0,01c
0,31±0,09c
ERKEK
SIĞIR
5 KIK
93,98±0,04b,c 5,97±0,03a
0,02±0,01d
0,02±0,00e
ERKEK
SIĞIR
6 KIK
94,66±0,40b 2,76±0,36b,c 1,57±0,04a
1,01±0,01a
ERKEK
Tablo 4.61. Erkek sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Sığır erkek donmuĢ kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 2
(erken konfluent), grup 6 (120 saat serum açlığı); en düĢük canlı hücre oranları (P<0.05) ise
grup 2(erken konfluent) ve grup 5 (72 saat seum açlığı) de görülmüĢtür. DonmuĢ kıkırdak
hücrelerinin de uygulamalara tazelerden daha hassas olduğu dikkat çekmektedir ve serum
açlığından taze hücreler etkilenmezken donmuĢ hücreler olumsuz etkilenmiĢtir. (Tablo 4.61.)
DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük) de görülürken, en yüksek geç ve erken apoptotik hücre
oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) de tespit edilmiĢtir. Ancak bu hücre hattında tüm
gruplarda diğerlerine oranla düĢün canlılık oranı kültür koĢullarındaki veya hücre hattındaki
bir sorun olabileceği izlenimi vermiĢtir. (Tablo 4.62.)
58
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
FĠB
84,42±0,66c
11,56±0,57c
3,60±0,30b
0,41±0,03b
SIĞIR
DĠġĠ
2
FĠB
86,34±0,73b
12,76±0,94b
0,29±0,01e
0,61±0,57b
SIĞIR
DĠġĠ
3
FĠB
84,63±0,30c
8,06±0,17d
5,07±0,15a
2,24±0,15a
SIĞIR
DĠġĠ
4
FĠB
83,58±,087c
13,95±0,74a
1,33±0,24d
1,12±0,08a,b
SIĞIR
DĠġĠ
5
FĠB
82,25±0,96d
12,14±0,21b,c 3,60±0,15b
1,49±0,53a,b
SIĞIR
DĠġĠ
6
FĠB
89,25±0,42a
6,54±0,66e
1,35±1,23
2,85±0,14c
Tablo 4.62. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
FĠB
95,07±0,29c
2,29±0,14b,c
1,67±0,35b,c
0,96±0,40b
SIĞIR
DĠġĠ
2
FĠB
96,17±0,12b
1,44±0,11d
1,25±0,02c,d
1,13±0,15b
SIĞIR
DĠġĠ
3
FĠB
94,12±0,17d
3,34±0,62a
1,49±0,24b,c,d 1,05±0,67b
SIĞIR
DĠġĠ
4
FĠB
92,38±0,35e
2,77±0,21b
2,60±0,25a
2,24±0,66a
SIĞIR
DĠġĠ
5
FĠB
97,01±0,26a
1,21±0,15d
1,10±0,29d
0,67±0,13b
SIĞIR
DĠġĠ
6
FĠB
95,23±0,22c
2,07±0,05c
1,73±0,18b
0,96±0,34b
Tablo 4.63. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
59
Aynı hücre hattının dondurulmuĢ örneğinde yapılan çalıĢmada en yüksek nekrotik hücre
oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) de görülürken en yüksek (P<0.05) geç apoptotik hücre
oranı grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup) de tespit edilmiĢtir. En düĢük hücre
canlılığı (P<0.05) yine grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup) de belirlenmiĢtir.
Bu hattın taze örneğinin tüm gruplarındaki donmuĢ örneğe oranla düĢük olan hücre canlılığı
taze örneğin kültürü sırasında meydana gelen genel bir duruma bağlanmıĢtır. (Tablo 4.63.)
DiĢi sığır kas hücrelerinin deney gruplarında en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 5
ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı ) da görülmüĢ ancak bu oran kontrol grubunda daha
yüksek (P<0.05) bulunmuĢtur.
Bu açıdan bakıldığında hiçbir uygulamanın hücrelerin
canlılığında önemli bir düĢüĢe sebep olmadığı kanısı yaratmıĢtır. (Tablo 4.64.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
KAS
93,60±0,52e
4,91±0,29a
0,43±0,09b,c
1,05±0,15a,b
SIĞIR
DĠġĠ
2
KAS
96,86±0,72b
0,98±0,21d
0,56±0,09b
1,58±0,87a
SIĞIR
DĠġĠ
3
KAS
97,91±0,09a
1,10±0,13d
0,30±0,06c
0,67±0,11a,b
SIĞIR
DĠġĠ
4
KAS
95,23±0,45d
2,01±0,78c
1,16±0,12a
1,59±0,86a
SIĞIR
DĠġĠ
5
KAS
96,52±0,43b,c 2,76±0,59b,c
0,55±0,14b
0,16±0,02b
SIĞIR
DĠġĠ
6
KAS
95,86±0,62c,d 2,92±0,46b
0,51±0,04b
0,69±0,18a,b
Tablo 4.64. DiĢi sığır taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
60
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
HAYVAN GRUP
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
KAS
95,21±0,22a,b 2,57±0,28b,c
0,66±0,22b
1,40±0,04a
SIĞIR
DĠġĠ
2
KAS
94,23±1,49b,c 4,80±1,56a,b
0,55±0,10b,c
0,40±0,03b,c
SIĞIR
DĠġĠ
3
KAS
97,23±0,91a
2,17±0,87c
0,29±0,04c
0,29±0,04c
SIĞIR
DĠġĠ
4
KAS
92,61±2,55c
5,69±2,47a
1,17±0,20a
0,52±0,10b,c
SIĞIR
DĠġĠ
5
KAS
92,73±0,51c
4,70±0,49a,b
1,40±0,27a
1,15±0,41a
SIĞIR
DĠġĠ
6
KAS
97,08±0,53a
1,70±0,43c
0,52±0,05b,c
0,69±0,18b
Tablo 4.65. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinin sinkronizasyon gruplarında en yüksek nekrotik hücre oranı
(P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de, en yüksek erken apoptotik hücre
oranı (P<0.05) grup 5 (72 saat serum açlığı) de tespit ediĢmiĢtir. En düĢük canlılık oranı
(P<0.05) grup 2,4,5 de görülmüĢtür. (Tablo 4.65.)
HAYVAN
HÜCRE
GRUP
CANLI HÜCRE NEKROTĠK
HÜCRE(%)
(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
KIK
94,66±0,67
a
4,86±0,66
SIĞIR
DĠġĠ
2
KIK
92,10±0,64
b,c
7,00±0,55
SIĞIR
DĠġĠ
3
KIK
91,12±0,54
c
5,74±2,27
SIĞIR
DĠġĠ
4
KIK
91,32±1,14
c
SIĞIR
DĠġĠ
5
KIK
93,49±0,29
a,b
5,95±0,30
SIĞIR
DĠġĠ
6
KIK
91,71±1,76
b,c
1,30±0,20
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
b
0,25±0,05
b
0,23±0,00
c
a
0,65±0,11
b
0,24±0,03
c
a,b
1,69±0,57
a
1,77±1,07
b
c
1,78±0,06
a
5,51±0,70
a
a,b
0,34±0,06
b
0,21±0,02
c
c
1,41±0,35
a
5,57±1,27
a
1,30±0,24
Tablo 4.66. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
61
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
DiĢi sığır taze kıkırdak hücresinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 2 (erken
konfluent), 3 (geç konfluent), 5 (72 saat seum açlığı) de tespit edilmiĢ, en yüksek erken
apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) ve 6 (120 saat
serum açlığı) da görülmüĢtür. En düĢük canlılık oranları (P<0.05) grup 2,3,4,6’da
bulunmuĢtur. (Tablo 4.66.)
.
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
KIK
93,76±1,04c
5,30±1,37b
0,68±0,33b
0,25±0,09c
SIĞIR
DĠġĠ
2
KIK
92,33±1,23d
7,12±0,84a
0,25±0,09c
0,08±0,02c
SIĞIR
DĠġĠ
3
KIK
92,04±0,05d
4,93±0,33b
1,61±0,16a
1,41±0,14b
SIĞIR
DĠġĠ
4
KIK
92,36±0,56d
1,46±0,07c
1,56±0,31a
4,60±0,77a
SIĞIR
DĠġĠ
5
KIK
97,12±0,29a
1,96±0,22c
0,74±0,04b
0,17±0,05c
SIĞIR
DĠġĠ
6
KIK
95,80±0,44b
2,06±0,11c
0,50±0,12b,c
1,62±0,31b
Tablo 4.67. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinin sinkronizasyon gruplarında en yüksek nekrotik hücre
oranı (P<0.05) grup 2 (erken konfluent) de, en düĢük hücre canlılık oranları (P<0.05) grup
2,3 (erken ve geç konfluent), grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup ) de tespit
edilmiĢtir. (Tablo 4.67.)
DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde sinkronizasyon uygulamalarının hemen hepsi benzer
canlı hücre oranı (P<0.05) ile sonuçlanmıĢtır. En yüksek nekrotik hücre oranı ise grup 5 (72
saat serum açlığı ) de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.68.)
62
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
HAYVAN GRUP
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
GC
94,96±0,12a,b,,c 2,55±0,59c
0,63±0,13b,c
1,85±0,63a
SIĞIR
DĠġĠ
2
GC
94,77±0,21a,b,c 4,57±0,13b
0,35±0,02c,d
0,29±0,12b
SIĞIR
DĠġĠ
3
GC
96,74±0,60a
2,74±0,26c
0,23±0,07d
0,41±0,11b
SIĞIR
DĠġĠ
4
GC
95,97±0,08a,b
3,09±0,10b
b
0,52±0,07b,c,d 0,43±0,06
SIĞIR
DĠġĠ
5
GC
93,00±3,55c
4,91±2,51a
1,03±0,34a
1,05±0,75a,b
SIĞIR
DĠġĠ
6
GC
93,48±0,53c
4,20±0,34b
0,81±0,19a,b
1,50±0,07a
Tablo 4.68. DiĢi sığır taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
SIĞIR
DĠġĠ
1
GC
96,80±0,55b
2,05±0,85b,c
0,74±0,07a,b
0,40±0,35b,c
SIĞIR
DĠġĠ
2
GC
98,32±0,64a
1,08±0,52c,d
0,26±0,05d
0,33±0,10c
SIĞIR
DĠġĠ
3
GC
94,30±0,24c
0,63±0,21d
0,31±0,04c,d
0,75±0,05a,b
SIĞIR
DĠġĠ
4
GC
95,28±1,08c
3,94±1,15a
0,47±0,10b,c,d 0,30±0,09c
SIĞIR
DĠġĠ
5
GC
95,31±0,32c
3,10±0,09a,b
0,60±0,32a,b,c 0,98±0,28a
SIĞIR
DĠġĠ
6
GC
94,73±0,54c
3,76±0,58a
0,84±0,13a
0,66±0,23a,b,c
Tablo 4.69. DiĢi sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
63
Sığır donmuĢ granulosa hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük) ve grup 6 (120 saat serum açlığı) da, en düĢük canlılık
oranı (P<0.05) grup 3,4,5,6’ da tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.69.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
ERKEK
1
FĠB
95,81±0,22a
3,59±0,24c
0,44±0,06c
0,15±0,05c
KOYUN
ERKEK
2
FĠB
92,57±0,17d
5,69±0,55a
0,97±0,22b
0,75±0,17a
KOYUN
ERKEK
3
FĠB
92,31±0,11d
6,04±0,14a
1,32±0,10a
0,31±0,02b,c
KOYUN
ERKEK
4
FĠB
93,09±0,38c
6,33±0,45a
0,34±0,08c
0,22±0,00b,c
KOYUN
ERKEK
5
FĠB
94,89±0,45b
3,44±0,30c
1,00±0,17b
0,60±0,47a,b
KOYUN
ERKEK
6
FĠB
94,59±0,16b
4,46±0,14b
0,75±0,12b
0,19±0,04c
Tablo 4.70. Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek koyun taze fibroblast hücrelerinde nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 5
(72 saat
serum açlığı) hariç tüm sinkronizasyon gruplarında kontrole göre yüksek bulunmuĢtur. En
düĢük hücre canlılık oranı grup 2,3 (erken ve geç konfluent) de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.70.)
Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) 2.
grupta (erken konfluent) görülürken ve en düĢük canlılık oranı (P<0.05) yine aynı grupta
tespit edilmiĢtir. Fakat kontrol grubunda da canlılık oranı benzerdir, deney gruplarının
canlılığa olumsuz etkisi olmamıĢtır. (Tablo 4.71.)
64
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
ERKEK
1
FĠB
93,17±1,77d
5,66±1,96a
0,64±0,09b
0,51±0,22b
KOYUN
ERKEK
2
FĠB
94,17±0,67d
4,45±0,61a,b
0,57±0,10b
0,78±0,11a,b
KOYUN
ERKEK
3
FĠB
97,85±0,19a
1,87±0,15c,d
0,07±0,00c
0,20±0,04c
SIĞIR
DĠġĠ
4
FĠB
96,04±0,53b,c 3,16±0,26b,c
0,31±0,02b,c
0,14±0,01c
KOYUN
ERKEK
5
FĠB
97,56±0,41a,b 0,91±0,13d
0,61±0,14b
0,91±0,13a
KOYUN
ERKEK
6
FĠB
94,52±0,60c,d 2,78±0,14c
1,66±0,41a
1,02±0,27a
Tablo 4.71. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
ERKEK
1
KAS
96,18±0,07a
3,16±0,09c
0,37±0,06b,c
0,28±0,010c
KOYUN
ERKEK
2
KAS
95,92±1,20a
2,99±0,79c
0,25±0,13c
0,83±0,28a
KOYUN
ERKEK
3
KAS
93,07±0,62c
5,50±0,56a,b
0,56±0,04a
0,69±0,42a,b
KOYUN
ERKEK
4
KAS
95,87±0,08a
3,01±0,10c
0,32±0,04c
0,78±0,01a,b
KOYUN
ERKEK
5
KAS
93,18±0,67b,c 5,93±0,77a
0,50±0,06a,b
0,38±0,05b,c
KOYUN
ERKEK
6
KAS
94,24±0,07b
0,31±0,03c
0,61±0,12a,b,c
4,83±0,09b
Tablo 4.72. Erkek koyun taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
65
Erkek koyun taze kas hücrelerinde grup 2 (erken konfluent) hariç tüm sinkronizasyon
gruplarında nekrotik hücre oranı (P<0.05) kontrolden yüksek bulunmuĢ, yine grup 2 (erken
konfluent) ve 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) hariç tüm gruplarda canlılık oranının
(P<0.05) kotrolden düĢük olduğu tespit edilmiĢtir. Gruplar içinde en düĢük canlılık oranı grup
3 (geç konfluent) de görülmüĢtür. (Tablo 4.72.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
ERKEK
1
KAS
94,39±0,90b
4,95±0,77b
0,24±0,04c
0,40±0,08c
KOYUN
ERKEK
2
KAS
91,47±0,54c
7,21±0,60a
0,87±0,12b
0,42±0,10c
KOYUN
ERKEK
3
KAS
96,27±0,69a
3,54±0,64c
0,10±0,02c
0,07±0,02d
SIĞIR
DĠġĠ
4
KAS
94,44±0,32b
4,94±0,70b
0,07±0,00c
0,24±0,02c
KOYUN
ERKEK
5
KAS
94,71±0,59b
3,13±0,13c
1,26±0,30a
0,88±0,18a
KOYUN
ERKEK
6
KAS
93,70±0,68b
5,05±0,57b
0,61±0,16b
0,63±0,05b
Tablo 4.73. Erkek koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek koyun donmuĢ kas hücrelerinde canlılık oranları üzerinde sinkronizasyon gruplarının
önemli bir olumsuz etkisi olmadığı görülmüĢtür. En düĢük canlılık oranı 2. grupta (erken
konfluent) gözlenmiĢtir. (Tablo 4.73.)
Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 4
(geç konfluent ve serum oranı düĢük), en yüksek geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 2
(erken konfluent) de tespit edilmiĢtir. Hücre canlılık oranları (P<0.05) tüm sinkronizasyon
gruplarında kontrolden düĢük çıkmıĢ ancak en düĢük oranlar grup 4( geç konfluent ve serum
oranı düĢük) de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.74.)
66
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
ERKEK
1
KIK
96,97±0,11a
2,62±0,09c
0,26±0,01c
0,14±0,05d
KOYUN
ERKEK
2
KIK
93,93±0,17b
3,12±0,24c
1,32±0,26a
1,61±0,33a,b
KOYUN
ERKEK
3
KIK
93,01±1,59b,c 4,20±0,26b
1,09±0,61a,b
1,69±0,87a
KOYUN
ERKEK
4
KIK
91,90±0,05c
5,79±0,06a
1,42±0,04a
0,88±0,04b,c
KOYUN
ERKEK
5
KIK
94,16±0,51b
4,29±0,62b
0,43±0,12c
1,10±0,19a,b,c
KOYUN
ERKEK
6
KIK
95,94±0,05a
2,71±0,04c
0,67±0,06b,c
0,67±0,06c,d
Tablo 4.74. Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
ERKEK
1
KIK
94,32±0,14b
3,00±0,06b
1,23±0,09a
1,43±0,43 a
KOYUN
ERKEK
2
KIK
96,90±0,43a
2,47±0,34c
0,41±0,08c
0,20±0,01c
KOYUN
ERKEK
3
KIK
94,90±0,90b
2,89±0,17b
1,01±0,40a,b
1,18±0,49a
KOYUN
ERKEK
4
KIK
96,47±0,55a
2,78±0,24b,c
0,45±0,13c
0,29±0,21c
KOYUN
ERKEK
5
KIK
95,21±0,28b
3,33±0,10a
0,78±0,18b,c
0,68±0,19b
KOYUN
ERKEK
6
KIK
97,05±0,21a
1,90±0,21d
0,56±0,15c
0,48±0,31c
Tablo 4.75. Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
67
Erkek koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 5
(72 saat serum açlığı) de tespit edilmiĢ, canlılık oranları (P<0.05) ise tüm gruplarda
kontrolden yüksek yada kontrole yakın değerlerde çıkmıĢtır. (Tablo 4.75.)
DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı ve en düĢük canlı
hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢtir. (Tablo
4.76.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
FĠB
95,71±0,08b
2,60±0,16b
0,67±0,09c
1,01±0,11a
KOYUN
DĠġĠ
2
FĠB
95,29±0,04b
2,43±0,23b
1,07±0,19b
1,19±0,06a
KOYUN
DĠġĠ
3
FĠB
94,03±0,33c
3,35±0,16a
1,12±0,07b
1,48±0,09a
KOYUN
DĠġĠ
4
FĠB
93,43±0,25c
3,40±0,27a
1,85±0,13a
1,31±0,21a
KOYUN
DĠġĠ
5
FĠB
98,11±0,10a
1,54±0,09c
0,07±0,02e
0,27±0,02b
KOYUN
DĠġĠ
6
FĠB
95,71±0,93b
2,54±0,20b
0,44±0,08d
1,30±0,86a
Tablo 4.76. DiĢi koyun taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Koyun diĢi donmuĢ fibroblast hücrelerinde grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı )da
erken ve geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) diğerlerinden yüksek bulunurken, hücre canlılığı
üzerinde sinkronizasyon uygulamalarının kontrol ile karĢılaĢtırıldığında çok önemli bir
olumsuz etkisi tespit edilmemiĢtir. (Tablo 4.77.)
68
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
FĠB
93,10±0,75d
6,01±0,81a
0,36±0,04c
0,52±0,08b
KOYUN
DĠġĠ
2
FĠB
98,92±0,06a
0,72±0,03e
0,08±0,04d
0,26±0,01b
KOYUN
DĠġĠ
3
FĠB
97,69±0,18b
2,13±0,17c
0,02±0,020d
0,13±0,01b
KOYUN
DĠġĠ
4
FĠB
98,32±0,17a,b 1,14±0,10d,e
0,07±0,03d
0,45±0,05b
KOYUN
DĠġĠ
5
FĠB
95,78±0,40c
1,60±0,08c,d
0,68±0,14b
1,79±0,22a
KOYUN
DĠġĠ
6
FĠB
93,57±0,37d
3,52±0,28b
1,11±0,17a
1,78±0,50a
Tablo 4.77. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
KAS
98,29±0,25a
1,10±0,10c
0,26±0,10b,c
0,34±0,08b
KOYUN
DĠġĠ
2
KAS
96,06±0,16b
3,55±0,09b
0,23±0,06b,c
0,14±0,06b
KOYUN
DĠġĠ
3
KAS
95,71±0,08b
2,94±0,05b
0,51±0,08b
0,81±0,08a,b
KOYUN
DĠġĠ
4
KAS
97,81±0,30a
1,63±0,11c
0,17±0,11c
0,38±0,12b
KOYUN
DĠġĠ
5
KAS
91,24±0,31c
6,64±1,35a
0,84±0,32a
1,27±0,85a
KOYUN
DĠġĠ
6
KAS
97,79±0,81a
0,81±0,07c
0,45±0,15b,c
0,94±0,70a,b
Tablo 4.78. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
69
DiĢi koyun taze kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı ve en düĢük canlılık
(P<0.05) grup 5 (72 saat serum açlığı) de tespit edilmiĢ ancak tüm gruplarda canlılık
oranında (P<0.05) az da olsa kontrole göre düĢüĢ belirlenmiĢtir. (Tablo 4.78.)
DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı grup 2 (erken konfluent)
de tespit edilmilĢ, canlılık oranlarında ise gruplarda sinkronizasyonun olumsuz etkisi
görülmemiĢtir. (Tablo 4.79.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
KAS
97,86±0,45c
1,30±0,22b
0,26±0,03a
0,56±0,26a,b
KOYUN
DĠġĠ
2
KAS
97,87±0,37c
1,70±0,32a
0,18±0,02b
0,24±0,03c
KOYUN
DĠġĠ
3
KAS
99,21±0,12a
0,08±0,04c
0,10±0,02c
0,60±0,07a
KOYUN
DĠġĠ
4
KAS
98,43±0,27b
1,13±0,16b
0,10±0,03c
0,33±0,09a,b,c
KOYUN
DĠġĠ
5
KAS
99,27±0,12a
0,33±0,10c
0,06±0,03c,d
0,32±0,17 a,b,c
KOYUN
DĠġĠ
6
KAS
99,54±0,15a
0,12±0,02c
0,02±0,01d
0,30±0,12b,c
Tablo 4.79. DiĢi koyun donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde en yüksek erken apoptotik hücre oranı ve en düĢük
hücre canlılık oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢ,
bunu takiben grup 2,3 (erken ve geç konfluent) ve grup 6 (120 saat serum açlığı) da hücre
canlılık oranları (P<0.05) az da olsa kontrolden düĢük çıkmıĢtır. (Tablo 4.80.)
70
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
KIK
97,16±0,17b
2,05±0,28b,c
0,17±0,02d
0,60±0,09d
KOYUN
DĠġĠ
2
KIK
94,11±0,56d
1,74±0,60c
1,47±0,15a
2,34±0,65c
KOYUN
DĠġĠ
3
KIK
94,16±0,20d
1,98±0,15b,c
0,58±0,03b
3,26±0,12b
KOYUN
DĠġĠ
4
KIK
92,73±0,14e
2,35±0,03b
0,35±0,03c
4,55±0,13a
KOYUN
DĠġĠ
5
KIK
98,10±0,08a
1,08±0,08d
0,22±0,06d
0,59±0,04d
KOYUN
DĠġĠ
6
KIK
96,01±0,32c
2,97±0,33a
0,64±0,02b
0,38±0,13d
Tablo 4.80. DiĢi koyun taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
KIK
95,94±0,11b
3,40±0,11a
0,18±0,02b
0,46±0,02b,c,d
KOYUN
DĠġĠ
2
KIK
99,16±0,07a
0,54±0,08d
0,11±0,02b
0,18±0,02c,d
KOYUN
DĠġĠ
3
KIK
97,45±0,09a,b 2,39±0,14b
0,08±0,06b
0,06±0,00d
KOYUN
DĠġĠ
4
KIK
95,72±0,30b
3,34±0,44a
0,27±0,11b
0,65±0,48b
KOYUN
DĠġĠ
5
KIK
97,72±0,77a,b 1,39±0,48c
0,28±0,14b
0,60±0,27b,c
KOYUN
DĠġĠ
6
KIK
91,47±0,36c
4,23±0,28a
1,31±0,22a
2,85±0,25a,b
Tablo 4.81. DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
71
DiĢi koyun donmuĢ kıkırdak hücrelerinde grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de en
yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05), grup 6 (120 saat serum açlığı) de en yüksek
(P<0.05),geç apoptotik hücre oranı ve kontrole göre daha yüksek erken apoptotik hücre oranı
tespit edilmiĢ ve bu grupta hücre canlılık oranı en düĢük çıkmıĢtır. (Tablo 4.81.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KOYUN
DĠġĠ
1
GC
92,86±0,82b,c
4,51±0,82b
1,92±0,09a
0,69±0,10a,b
KOYUN
DĠġĠ
2
GC
94,45±0,96a
4,41±0,65b
0,70±0,17b
0,43±0,15b
KOYUN
DĠġĠ
3
GC
92,01±0,27c
6,51±0,22a
0,74±0,08b
0,73±0,28a
KOYUN
DĠġĠ
4
GC
94,10±0,10a,b
4,57±0,02b
0,77±0,06b
0,54±0,11a,b
KOYUN
DĠġĠ
5
GC
93,06±1,35a,b,c 5,66±1,23a,b
0,80±0,70b
0,48±0,05a,b
KOYUN
DĠġĠ
6
GC
92,58±0,35c
1,40±0,06a
0,50±0,05a,b
5,51±0,31a,b
Tablo 4.82. DiĢi koyun taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Koyun taze granulosa hücrelerinde en yüksek en yüksek erken apoptotik ve nekrotik hücre
oranı (P<0.05) grup 3 (geç konfluent) de tespit edilirken, en düĢük canlılık oranı grup 3(geç
konfluent) ve grup 6 (120 saat serum açlığı) da belirlenmiĢtir. (Tablo 4.82.)
DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3
(geç konfluent) de tespit edilirken diğer tüm gruplarda da oran (P<0.05) kontrole göre yüksek
çıkmıĢtır.
En yüksek erken apoptotik hücre oranı grup 5( 72 saat serum açlığı) de
bulunmuĢtur. En düĢük canlı hücre oranı (P<0.05) ise grup 3,4,5 de tespit edilmiĢtir. (Tablo
4.83.)
72
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
1,86±0,19e
0,50±0,25b,c
0,76±0,49b,c
KOYUN
DĠġĠ
1
GC
96,86±0,93a
KOYUN
DĠġĠ
2
GC
96,10±0,44a,b 2,58±0,19c,d
0,25±0,05c,d
1,06±0,21b
KOYUN
DĠġĠ
3
GC
91,84±0,09c
7,86±0,05a
0,14±0,04d
0,15±0,08c
KOYUN
DĠġĠ
4
GC
91,32±0,61c
6,39±0,36b
1,05±0,29a
1,22±0,38b
KOYUN
DĠġĠ
5
GC
91,42±0,40c
2,44±0,61d,e
1,29±0,23a
4,84±0,75a
KOYUN
DĠġĠ
6
GC
95,59±0,30b
3,17±0,33c
0,63±0,03b
0,59±0,12b,c
Tablo 4.83. DiĢi koyun donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
ERKEK
1
FĠB
96,32±0,75a
2,89±0,67c
0,37±0,04b
0,41±0,04b
KEÇĠ
ERKEK
2
FĠB
96,23±0,78a
3,24±0,78b,c
0,25±0,07c,d
0,27±0,08b
KEÇĠ
ERKEK
3
FĠB
95,41±0,19a
4,13±0,17b
0,21±0,06d
0,24±0,04b
KEÇĠ
ERKEK
4
FĠB
95,62±0,25a
3,85±0,25b,c
0,23±0,02c,d
0,29±0,08b
KEÇĠ
ERKEK
5
FĠB
90,87±0,52c
6,79±0,59a
0,33±0,06b,c
1,80±0,51a
KEÇĠ
ERKEK
6
FĠB
92,74±0,44b
5,91±0,41a
0,70±0,07a
0,63±0,07b
Tablo 4.84. Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
73
Erkek keçi taze fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 5
(72 saat serum açlığı grubu) de tespit edilmiĢ, yine en düĢük canlılık oranları da (P<0.05)
aynı grupta tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.84.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%) HÜCRE(%)
KEÇĠ
ERKEK
1
FĠB
96,26±0,23b
2,86±0,21c
0,34±0,01b,c
0,54±0,03c
KEÇĠ
ERKEK
2
FĠB
97,26±0,05a
2,40±0,05e
0,12±0,03b
0,20±0,02d
KEÇĠ
ERKEK
3
FĠB
93,30±0,23d
6,36±0,27a
0,10±0,03b
0,22±0,02d
KEÇĠ
ERKEK
4
FĠB
95,55±0,13c
3,30±0,08b
0,42±0,06b
0,72±0,08a
KEÇĠ
ERKEK
5
FĠB
96,05±0,31b
3,06±0,20b,c
0,26±0,07c
0,61±0,03b,c
KEÇĠ
ERKEK
6
FĠB
92,84±0,15e
5,96±0,38a
0,73±0,05a
0,69±0,06a,b
Tablo 4.85. Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3
(geç konfluent) de tespit edilirken, grup 6 (120 saat serum açlığı) de de nekrotik hücre oranı
(P<0.05) kontrolden yüksek bulunmuĢtur. En düĢük canlı hücre oranı (P<0.05) grup 6 (120
saat serum açlığı) da tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.85.)
Erkek keçi taze kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 2,3,4,(erken
konfluent, geç konfluent, geç konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilirken en düĢük
canlı hücre oranları (P<0.05) grup 2 ve 3 (erken ve geç konfluent) de bulunmuĢtur. (Tablo
4.86.)
74
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%) HÜCRE(%)
4,73±0,15308b 0,41±0,06b
KEÇĠ
ERKEK
1
KAS
93,89±0,16b
KEÇĠ
ERKEK
2
KAS
92,94±0,90c,d 6,34±1,02a
0,36±0,21b
0,34±0,03d
KEÇĠ
ERKEK
3
KAS
92,60±0,46d
0,43±0,06b
0,76±0,06b
KEÇĠ
ERKEK
4
KAS
93,69±0,35b,c 5,48±0,27a,b
0,31±0,08b
0,51±0,06c
KEÇĠ
ERKEK
5
KAS
95,97±0,09a
2,88±0,15d
0,71±0,04a
0,44±0,02c,d
KEÇĠ
ERKEK
6
KAS
94,50±0,17b
3,83±0,24c
0,79±0,17a
0,86±0,07a,b
6,20±0,53a
0,95±0,09a
Tablo 4.86. Erkek keçi taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
ERKEK
1
KAS
96,51±0,21a
1,69±0,10d
0,76±0,19b
1,02±0,15a
KEÇĠ
ERKEK
2
KAS
95,39±0,50b
3,61±0,37c
0,30±0,08c
0,68±0,06b
KEÇĠ
ERKEK
3
KAS
92,98±0,25d
6,06±0,24a
0,35±0,04c
0,60±0,01b,c
KEÇĠ
ERKEK
KEÇĠ
ERKEK
4
KAS
93,70±0,21c
5,21±0,37b
0,33±0,06c
0,74±0,22b
5
KAS
95,05±0,39b
3,86±0,27c
0,69±0,05b
0,39±0,10c
KEÇĠ
ERKEK
6
KAS
94,07±0,24c
4,03±0,11c
1,13±0,07a
0,76±0,12b
Tablo 4.87. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
75
Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3 (geç
konfluent) de tespit edilmiĢtir. Ancak diğer tüm sinkronizasyon gruplarında da nekrotik hücre
oranı (P<0.05) kontrolden yüksek çıkmıĢtır. En düĢük canlı hücre oranları (P<0.05) ise grup
3 (geç konfluent)de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.87.)
Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük) ve en yüksek erken apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 5
(72 saat serum açlığı) da tespit edilirken canlılık oranlarında (P<0.05) önemli bir farkın
olmadığı bulunmuĢtur. (Tablo 4.88.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
ERKEK
1
KIK
93,32±0,55b
5,14±0,49b
0,64±0,07a
0,56±0,09b
KEÇĠ
ERKEK
2
KIK
94,84±0,22a
4,53±0,26b
0,35±0,09b
0,26±0,06c
KEÇĠ
ERKEK
3
KIK
94,23±0,14a
4,60±0,31b
0,77±0,07a
0,39±0,12b,c
KEÇĠ
ERKEK
4
KIK
92,74±0,49b
6,70±0,36a
0,31±0,11b
0,24±0,06c
KEÇĠ
ERKEK
5
KIK
94,47±0,29a
3,03±0,47c
0,78±0,11a
1,71±0,23a
KEÇĠ
ERKEK
6
KIK
94,39±0,04a
4,67±0,21b
0,67±0,14a
0,26±0,11c
Tablo 4.88. Erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3
(geç konfluent) de tespit edilirken diğer tüm sinkronizasyon gruplarında da nekrotik hücre
oranları (P<0.05) kontrolden yüksek çıkmıĢtır. En yüksek erken apoptotik hücre oranı
(P<0.05) grup 5 (72 saat serum açlığı) de bulunmuĢ, en düĢük hücre canlılık oranları da
grup 3 ve 5’de tespit edilmiĢtir.
Ancak diğer tüm sinkronizasyon
canlılık oranları (P<0.05) kontrolden düĢük çıkmıĢtır. (Tablo 4.89.)
76
gruplarında da hücre
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KEÇĠ
ERKEK
1
KIK
97,39±0,13a
1,77±0,01d
0,34±0,04d,e
0,49±0,09c
KEÇĠ
ERKEK
2
KIK
96,68±0,08b
2,63±0,11c
0,22±0,06e
0,46±0,04c
KEÇĠ
ERKEK
3
KIK
94,51±0,33c
3,44±0,18b
0,93±0,07a
1,11±0,16b
KEÇĠ
ERKEK
4
KIK
96,62±0,03b
2,27±0,10c
0,49±0,10b,c
0,61±0,08c
KEÇĠ
ERKEK
5
KIK
94,20±0,49c
3,83±0,33a
0,59±0,06b
1,36±0,16a
KEÇĠ
ERKEK
6
KIK
96,54±0,31b
2,50±0,26c
0,39±0,03c,d
0,55±0,09c
Tablo 4.89. Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
FĠB
96,32±0,24a
1,60±0,26e
0,97±0,20a
1,09±0,09a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
FĠB
96,48±0,12a
2,91±0,12d
0,37±0,04c
0,23±0,04d
KEÇĠ
DĠġĠ
3
FĠB
93,43±1,78b
5,92±1,55b
0,36±0,15c
0,27±0,12c,d
KEÇĠ
DĠġĠ
4
FĠB
93,15±0,33b
6,14±0,28a
0,44±0,06b,c
0,25±0,04c,d
KEÇĠ
DĠġĠ
5
FĠB
94,33±0,55b
4,63±0,49c
0,59±0,09b
0,44±0,07b
KEÇĠ
DĠġĠ
6
FĠB
96,90±0,08a
2,33±0,05d
0,34±0,05c
0,41±0,11b,c
Tablo 4.90. DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
77
DiĢi keçi taze fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢ, en düĢük canlı hücre oranları (P<0.05) da
grup 3,4,5 de bulunmuĢtur. (Tablo 4.90.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
FĠB
93,65±1,74b,c
4,15±1,59a,b
0,99±0,34a
1,20±0,43a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
FĠB
93,48±0,23c
5,21±0,51a
0,53±0,04b
0,77±0,31b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
FĠB
95,37±0,24a
4,09±0,27a,b
0,27±0,03b,c
0,26±0,01c
KEÇĠ
DĠġĠ
4
FĠB
94,95±0,13a,b
4,65±0,19a,b
0,19±0,02c
0,20±0,05c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
FĠB
95,33±0,40a
3,84±0,20b
0,42±0,06b,c
0,39±0,13b,c
KEÇĠ
DĠġĠ
6
FĠB
94,24±0,10a,b,c 3,28±0,21b
1,24±0,13a
1,23±0,06a
Tablo 4.91. DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi keçi donmuĢ fibroblast hücrelerinde en yüksek geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup
2 (erken konfluent) de tespit edilirken yine en düĢük canlı hücre oranı (P<0.05) da aynı
grupta belirlenmiĢtir. Diğer gruplarda sinkronizasyon uygulamasının olumsuz etkisi
görülmemiĢtir. (Tablo 4.91.)
DiĢi keçi taze kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 6 (120 saat
serum açlığı), en yüksek erken ve geç apoptotik hücre oranları (P<0.05) grup 5 (72 saat
serum açlığı) de edilmiĢtir. En düĢük canlı hücre oranı (P<0.05) grup 7 de tespit edilirken
grup 6 (120 saat serum açlığı) da belirlenmiĢtir. (Tablo 4.92.)
78
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KAS
95,14±0,86a
3,30±0,93b
0,62±0,22b,c
0,93±0,24b
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KAS
95,35±0,19a
3,58±0,28b
0,50±0,07c,d
0,57±0,06c
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KAS
93,04±0,80b
6,03±0,86a
0,35±0,05d
0,56±0,01c
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KAS
92,64±1,07b
6,24±1,20a
0,51±0,04c,d
0,60±0,09c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KAS
92,86±0,64b
3,97±0,19b
1,31±0,06a
1,67±0,12a
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KAS
91,80±0,31c
6,25±0,36a
0,81±0,08b
1,12±0,13b
Tablo 4.92. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KAS
95,58±0,50a
2,96±0,35d
0,61±0,06c
0,83±0,15c
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KAS
95,06±0,78a
3,45±0,74c,d
0,61±0,07c
0,87±0,05c
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KAS
94,06±0,45b
4,05±0,22b,c
0,69±0,05c
1,19±0,28b
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KAS
91,80±0,32d
7,19±0,23a
0,36±0,02d
0,65±0,13c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KAS
93,87±0,27b
3,05±0,08d
1,27±0,08b
1,80±0,13a
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KAS
92,94±0,13c
4,27±0,07b
1,41±0,12a
1,36±0,05b
Tablo 4.93. DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
79
DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük), en yüksek geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 6 (120
saat serum açlığı) da tespit edilmiĢtir. En yüksek erken apoptotik hücre oranları (P<0.05) ise
grup 5 (72 saat serum açlığı) de bulunmuĢtur. En düĢük hücre canlılık oranları (P<0.05) grup
4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.93.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KIK
97,26±0,19a
2,48±0,14c
0,12±0,03c,d
0,12±0,02c
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KIK
93,63±0,38c
5,51±0,41a
0,59±0,10a
0,25±0,12c
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KIK
94,29±0,98c
5,35±0,77a
0,15±0,08c,d
0,20±0,12c
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KIK
95,75±0,15b
3,93±0,14b
0,09±0,02d
0,21±0,05c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KIK
94,21±0,17c
3,74±0,02b
0,40±0,02b
1,64±0,17a
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KIK
94,09±0,15c
5,14±0,16a
0,22±0,01c
0,53±0,04b
Tablo 4.94. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 2 (erken
konfluent),3 (geç konfluent), 6 (120 saat serum açlığı) da tespit edilirken tüm sinkronizasyon
gruplarında hücre canlılık oranları (P<0.05) kontrolden düĢük bulunmuĢtur. (Tablo 4.94.)
Keçi donmuĢ kıkırdak hücresinde en yüksek nekrotik hücre oranı ve en düĢük canlı hücre
oranı (P<0.05) grup 5 (72 saat serum açlığı) de tespit edilmiĢ diğer gruplar sinkronizasyon
uygulaması olumsuz etki oluĢturmamıĢtır. (Tablo 4.95.)
80
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
KIK
94,92±0,76c
3,57±0,28b
0,49±0,15a
0,67±0,06a
KEÇĠ
DĠġĠ
2
KIK
95,86±0,18b
3,73±0,22b
0,26±0,04b
0,14±0,06c
KEÇĠ
DĠġĠ
3
KIK
95,67±0,19b
3,70±0,59b
0,19±0,04b
0,09±0,05c
KEÇĠ
DĠġĠ
4
KIK
96,82±0,52a
2,79±0,53c
0,20±0,02b
0,17±0,01c
KEÇĠ
DĠġĠ
5
KIK
94,08±0,14d
5,08±0,14a
0,44±0,06a
0,39±0,02b
KEÇĠ
DĠġĠ
6
KIK
95,94±0,25b
3,46±0,13b
0,46±0,10a
0,14±0,06c
Tablo 4.95. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
GC
96,29±0,09a
2,11±0,01b
0,35±0,06d
1,24±0,14b
KEÇĠ
DĠġĠ
2
GC
95,33±0,02b
2,11±0,01b
1,09±0,11b
1,46±0,09a,b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
GC
94,21±0,09d
2,37±0,04a,b
1,33±0,10a
1,68±0,29 a,b
KEÇĠ
DĠġĠ
4
GC
94,62±0,35c
2,68±0,50a
1,02±0,18b
1,48±0,36 a,b
KEÇĠ
DĠġĠ
5
GC
95,23±0,05b
2,11±0,06b
0,75±0,18c
1,81±0,07a
KEÇĠ
DĠġĠ
6
GC
95,11±0,01b
2,36±0,17a,b
0,93±0,05b,c
1,58±0,23 a,b
Tablo 4.96. DiĢi keçi taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları.
81
Keçi taze granulosa hücrelerinde grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük)de, geç
apoptotik hücre oranları (P<0.05), grup 3 (geç konfluent) de,grup 5 (72 saat serum açlığı) de
erken apoptotik hücre oranları (P<0.05) kontrolden yüksek bulunmuĢtur.
Tüm gruplarda
hücre canlılık oranları kontrolden düĢük olarak tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.96.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
KEÇĠ
DĠġĠ
1
GC
95,69±0,62a
2,24±0,34b
0,83±0,12a
1,01±0,57b
KEÇĠ
DĠġĠ
2
GC
95,21±0,08a
2,36±0,21b
0,66±0,15a
1,46±0,31a,b
KEÇĠ
DĠġĠ
3
GC
94,19±0,05b
2,85±0,01a
0,89±0,05a
1,35±0,01a,b
KEÇĠ
DĠġĠ
4
GC
94,17±0,04b
2,92±0,07a
0,80±0,21a
1,37±0,04a,b
KEÇĠ
DĠġĠ
5
GC
95,19±0,03a
2,34±0,42b
0,63±0,06a
1,68±0,37a
KEÇĠ
DĠġĠ
6
GC
94,13±0,20b
2,94±0,04a
0,93±0,32a
1,50±0,20a,b
Tablo 4.97. DiĢi keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Keçi donmuĢ granulosa hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3 (geç
konfluent),4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) ,6 (120 saat serum açlığı) da tespit
edilirken, grup2 ve 5 hariç tüm sinkronizasyon gruplarında canlılık oranı (P<0.05) kontrolden
düĢük bulunmuĢtur. (Tablo 4.97.)
82
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
MANDA
ERKEK
1
FĠB
96,44±0,22a
1,75±0,62c
0,68±0,10b,c
1,11±0,63a
MANDA
ERKEK
2
FĠB
95,11±0,25c
4,38±0,20a
0,39±0,08c
0,11±0,04b
MANDA
ERKEK
3
FĠB
95,82±0,02b
3,09±0,09b
0,50±0,07b,c
0,58±0,10a,b
MANDA
ERKEK
4
FĠB
94,71±0,13c
2,88±0,67b
1,26±0,04a
1,13±0,08a
MANDA
ERKEK
5
FĠB
96,18±0,20a,b 28,35±0,18b,c 0,84±0,05b
0,62±0,27a,b
MANDA
ERKEK
6
FĠB
96,04±0,55a,b 2,52±0,34b,c
0,72±0,58a,b
0,76±0,15b,c
Tablo 4.98. Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek manda taze fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 2
(erken konfluent) de tespit edilmiĢ, grup 3,4 (geç konfluent, geç konfluent ve serum oranı
düĢük) de nekrotik hücre oranı (P<0.05) kontrolden yüksek çıkmıĢtır.
En düĢük canlılık
oranları (P<0.05) ise grup 2(erken konfluent) ve 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de
tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.98.)
Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05)
grup 6 (120 saat serum açlığı) da bulunmuĢ, yine en düĢük canlılık oranları (P<0.05) da bu
gruplarda tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.99.)
Erkek manda taze kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilirken en düĢük canlılık oranı (P<0.05) yine aynı
grupta belirlenmiĢtir. Diğer gruplarında canlılık oranları (P<0.05) kontrolden düĢük
bulunmuĢtur. (Tablo 4.100.)
83
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
MANDA
ERKEK
1
FĠB
97,29±0,21a
2,58±0,18d
0,78±0,10a
0,66±0,25a
MANDA
ERKEK
2
FĠB
95,77±0,13c
3,37±0,09b,c
0,60±0,07a
0,25±0,08b,c
MANDA
ERKEK
3
FĠB
96,64±0,08b
2,92±0,10c,d
0,18±0,03b
0,25±0,04b,c
MANDA
ERKEK
4
FĠB
95,54±0,11c
3,90±0,04b
0,47±0,08a,b
0,08±0,03c
MANDA
ERKEK
5
FĠB
96,39±0,20b
2,72±0,10d
0,58±0,07a
0,29±0,03b,c
MANDA
ERKEK
6
FĠB
93,94±0,56d
4,69±0,78a
0,80±0,41a
0,56±0,38a,b
Tablo 4.99. Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
MANDA
ERKEK
1
KAS
97,33±0,22a
2,36±0,21b,c
0,84±0,05c
0,54±0,41b,c
MANDA
ERKEK
2
KAS
96,60±0,22b
2,09±0,07c
0,94±0,04b
0,36±0,19c
MANDA
ERKEK
3
KAS
95,42±0,25c
2,56±0,08b
1,14±0,02a
0,94±0,05a,b
MANDA
ERKEK
4
KAS
94,43±0,32d
3,30±0,18a
1,17±0,03a
1,09±0,30a
MANDA
ERKEK
5
KAS
96,72±0,15b
2,15±0,02c
0,84±0,05c
0,28±0,15c
MANDA
ERKEK
6
KAS
96,31±0,12b
2,24±0,17c
0,92±0,06b,c
0,53±0,08b,c
Tablo 4.100. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
84
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
MANDA
ERKEK
1
KAS
97,22±0,30a
2,44±0,32c
0,43±0,24d
0,33±0,24b
MANDA
ERKEK
2
KAS
96,47±0,27b
2,54±0,35c
0,83±0,01c
0,41±0,01a,b
MANDA
ERKEK
3
KAS
95,53±0,22d
3,10±0,04b
1,04±0,04a,b,c 0,32±0,19b
MANDA
ERKEK
4
KAS
94,51±0,22e
3,61±0,04a
1,15±0,01a
0,71±0,17a
MANDA
ERKEK
5
KAS
96,90±0,04a
1,92±0,05d
0,93±0,03b,c
0,24±0,02b
MANDA
ERKEK
6
KAS
95,95±0,04c
2,65±0,43b,c
1,09±0,10a,b
0,36±0,33a,b
Tablo 4.101. Erkek manda taze kas hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
MANDA
ERKEK
1
KIK
98,36±0,20a
1,38±0,21f
0,40±0,14c
0,15±0,05b
MANDA
ERKEK
2
KIK
97,10±0,20b
2,32±0,14d
0,43±0,10c
0,14±0,01b
MANDA
ERKEK
3
KIK
96,12±0,29d
3,47±0,18b
0,28±0,07c
0,11±0,05b
MANDA
ERKEK
4
KIK
93,23±0,11e
5,96±0,19a
0,71±0,10b
0,08±0,05b
MANDA
ERKEK
5
KIK
97,14±0,01b
1,89±0,29e
1,02±0,11a
0,27±0,19b
MANDA
ERKEK
6
KIK
96,58±0,14c
2,86±0,02c
1,16±0,00a
0,61±0,12a
Tablo 4.102. Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
85
Erkek manda donmuĢ kas hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı ve geç apoptotik
hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢtir. En
yüksek erken apoptotik hücre oranı (P<0.05) ve en düĢük hücre canlılık oranı (P<0.05) yine
grup 4 de bulunmuĢtur. (Tablo 4.101.)
Erkek manda taze kıkırdak hücrelerinde en yüksek geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 5
(72 saat serum açlığı) de tespit edilmiĢ ve en düĢük canlı hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç
konfluent ve serum oranı düĢük) de görülmüĢtür. (Tablo 4.102.)
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%) HÜCRE(%)
MANDA
ERKEK
1
KIK
98,99±0,20a
0,61±0,11e
0,02±,075c
0,10±0,07b
MANDA
ERKEK
2
KIK
98,36±0,11a
1,09±0,06d,e
0,26±0,05c
0,28±0,06a,b
MANDA
ERKEK
3
KIK
94,48±0,69e
5,18±0,66a
0,22±0,03c
0,11±0,01b
MANDA
ERKEK
4
KIK
95,86±0,76d
3,41±0,25b
1,15±0,00a
0,43±0,50a,b
MANDA
ERKEK
5
KIK
97,00±0,20b,c
1,97±0,23c
0,55±0,02b
0,47±0,07a,b
MANDA
ERKEK
6
KIK
96,41±0,14c,d
3,01±0,48b
1,16±0,02a
0,65±0,48a
Tablo 4.103. Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
Erkek manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup
3 (geç konfluent) de ve en yüksek geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent
ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢtir. En düĢük hücre canlılık oranı(P<0.05) grup 5 de
görülmüĢtür. (Tablo 4.103.)
86
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
MANDA
DĠġĠ
1
FĠB
98,45±0,07b
1,13±0,04d
0,25±0,01c
0,16±0,07c
MANDA
DĠġĠ
2
FĠB
96,45±0,27d
2,86±0,25a
0,40±0,06b
0,27±0,01b
MANDA
DĠġĠ
3
FĠB
97,56±0,34c
2,04±0,15b
0,21±0,03c
0,05±0,02c
MANDA
DĠġĠ
4
FĠB
98,00±0,20b,c
1,51±0,15c
0,38±0,03b
0,09±0,03c
MANDA
DĠġĠ
5
FĠB
98,74±0,03a
0,91±0,02d
0,26±0,03c
0,08±0,02c
MANDA
DĠġĠ
6
FĠB
98,36±0,35b
0,52±0,30e
0,60±0,12a
0,51±0,10a
Tablo 4.104. DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi manda taze fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 2
(erken konfluent) de bulunmuĢ, yine aynı grupta canlı hücre oranı (P<0.05) diğer gruplardan
düĢük çıkmıĢtır. (Tablo 4.104.)
DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3
(geç konfluent) ve 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de tespit edilmiĢ, bu gruplarda
canlı hücre oranı (P<0.05) kontrolden düĢük bulunmuĢtur. (Tablo 4.105.)
DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve
serum oranı düĢük)de grup 3 (geç konfluent) grup 5 (72 saat serum açlığı) de kontrolden
yüksek bulunmuĢ, en düĢük hücre canlılık oranı (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum
oranı düĢük) de tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.106.)
87
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%) HÜCRE(%)
MANDA
DĠġĠ
1
FĠB
97,09±0,08a
1,70±0,26c
0,65±0,08b
0,55±0,11a,b
MANDA
DĠġĠ
2
FĠB
97,41±0,20a
1,91±0,19b,c
0,48±0,04b
0,19±0,06c,d
MANDA
DĠġĠ
3
FĠB
95,58±0,20b
3,32±0,21a
1,01±0,04a
0,08±0,00d
MANDA
DĠġĠ
4
FĠB
95,47±0,28b
3,27±0,19a
0,49±0,03b
0,76±0,33a
MANDA
DĠġĠ
5
FĠB
96,94±0,34a
1,66±0,17c
0,97±0,22a
0,41±0,04b,c
MANDA
DĠġĠ
6
FĠB
96,95±0,34a
2,32±0,49b
0,61±0,17b
0,12±0,07d
Tablo 4.105. DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
MANDA
DĠġĠ
1
KIK
97,17±0,17b
2,61±0,21d
0,17±0,04c,d
0,04±0,01c
MANDA
DĠġĠ
2
KIK
97,42±0,09b
2,36±0,06d
0,16±0,03c,d
0,05±0,02c
MANDA
DĠġĠ
3
KIK
95,62±0,22d
3,91±0,18b
0,15±0,00d
0,31±0,05a
MANDA
DĠġĠ
4
KIK
94,78±0,27e
4,92±0,24a
0,22±0,05b,c
0,06±0,01c
MANDA
DĠġĠ
5
KIK
96,46±0,13c
3,19±0,13c
0,25±0,02b
0,08±0,02c
MANDA
DĠġĠ
6
KIK
98,45±0,12a
0,92±0,06e
0,40±0,01a
0,21±0,07b
Tablo 4.106. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
88
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
MANDA
DĠġĠ
1
KIK
98,32±0,20b
0,80±0,19d
0,45±0,05a
0,43±0,08a
MANDA
DĠġĠ
2
KIK
98,80±0,29a
0,79±0,14d
0,26±0,11b
0,14±0,05b
MANDA
DĠġĠ
3
KIK
96,36±0,10d
3,46±0,13b
0,09±0,02c
0,07±0,02b
MANDA
DĠġĠ
4
KIK
94,14±0,15e
5,33±0,12a
0,39±0,04a
0,13±0,03b
MANDA
DĠġĠ
5
KIK
96,45±0,17d
3,25±0,19b
0,23±0,05b
0,08±0,04b
MANDA
DĠġĠ
6
KIK
97,15±0,09c
2,55±0,26c
0,16±0,01b,c
0,21±0,16b
Tablo 4.107. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde nekrotik hücre oranları (P<0.05) grup 3 (geç
konfluent), grup 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük grup), 5,6 (72 ve 120 saat serum
açlığı) de kontrolden yüksek bulunmuĢ, grup 2 (erken konfluent) hariç diğer gruplarda hücre
canlılık oranları (P<0.05) kontrolden düĢük bulunmuĢtur. (Tablo 4.107.)
Manda taze granulosa hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup 3(geç
konfluent) ve 4 (geç konfluent ve serum oranı düĢük) de bulunurken diğer gruplarında
nekrotik hücre oranları kontrolden yüksek çıkmıĢtır. En düĢük hücre canlılık oranı yine aynı
gruplarda grup 3 ve 4’de bulunmuĢtur. (Tablo 4.108.)
Manda donmuĢ granulosa hücrelerinde en yüksek nekrotik hücre oranı (P<0.05) grup3 (geç
konfluent), 4(geç konfluent ve serum oranı düĢük), 6 (120 saat serum açlığı) de tespit
edilmiĢ, en yüksek geç apoptotik hücre oranı (P<0.05) grup 6 da (120 saat serum açlığı) da
bulunmuĢtur. En düĢük hücre canlılık oranları (P<0.05) grup 4 (geç konfluent ve serum oranı
düĢük) tespit edilmiĢtir. (Tablo 4.109.)
89
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
ERKEN
APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
0,41±0,22b
MANDA
DĠġĠ
1
GC
98,23±0,08a
1,49±0,52c
0,31±0,06d
MANDA
DĠġĠ
2
GC
96,57±0,58c
2,69±0,35b
0,44±0,17b,c,d 0,40±0,25b
MANDA
DĠġĠ
3
GC
94,54±0,37d
3,40±0,18a
0,61±0,17b
1,44±0,04a
MANDA
DĠġĠ
4
GC
94,84±0,57d
3,06±0,62a,b
0,85±0,07a
1,24±0,66a
MANDA
DĠġĠ
5
GC
97,31±0,21b
2,41±0,23b
0,58±0,14b,c
0,32±0,26b
MANDA
DĠġĠ
6
GC
97,02±0,09b,c 2,41±0,20b
0,36±0,01c,d
0,22±0,26b
Tablo 4.108. DiĢi manda taze granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
HAYVAN GRUP
HÜCRE CANLI
HÜCRE(%)
NEKROTĠK
HÜCRE(%)
GEÇ
ERKEN
APOPTOTĠK APOPTOTĠK
HÜCRE(%)
HÜCRE(%)
MANDA
DĠġĠ
1
GC
97,52±0,40a
2,42±0,30b
0,46±0,07d
0,43±0,37a
MANDA
DĠġĠ
2
GC
96,66±0,22b
2,49±0,16b
0,66±0,15d
0,31±0,11a
MANDA
DĠġĠ
3
GC
95,89±0,73b,c
3,19±0,19a
0,91±0,03c
0,42±0,23a
MANDA
DĠġĠ
4
GC
94,78±0,21d
3,39±0,20a
1,15±0,01a,b
0,46±0,35a
MANDA
DĠġĠ
5
GC
96,59±0,23b
2,53±0,34b
1,01±0,15b,c
0,21±0,14a
MANDA
DĠġĠ
6
GC
95,59±0,40c
3,10±0,36a
1,24±0,14a
0,43±0,35a
Tablo 4.109. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde hücre canlılık analiz sonuçları
90
5. TARTIġMA VE SONUÇ
Nukleer transferi takiben oluĢan embriyonun gerek in vitro gerekse in vivo geliĢimi
üzerine etki eden birçok faktör vardır. Bunların içerisinde en önemlisi hücre nükleusu ile oosit
sitoplazması
arasındaki
sinkronizasyondur.Verici
nükleusun
baĢarı
ile
geriye
programlanması için maturasyonu uyaran faktörü en yüksek oranda taĢıyan metafaz II oosit
içine transfer edildiğinde G0 veya G1 fazında olması gerekir. Bu hassas sinkronizasyon
doğru kromozom yoğunlaĢması sağlar ve doğru ploidiye sahip embriyoların geliĢmesini
güçlendirir. Ġlk baĢarılı nükleer transfer giriĢimi olarak tarihi geçen Wilmut ve ark (1997) nın
eriĢkin vücut hücresinden bir kuzu elde etmesi nükleer transfer için verici hücrenin hücre
siklus döneminin anahtar rol oynadığını göstermiĢtir. Böylece bu çalıĢmada kullanılan G0
fazının nükleer transferin baĢarısının sorumlusu olduğu kabul edildi (Wilmut ve ark 1997,
Kato ve ark 1998, Wells ve ark, 1999, Kato ve ark 2000). Ancak kısa süre sonra yapılan
çalıĢmalar
G0 fazının Ģart olmadığını ve G1 fazındaki hücrelerinde kullanılabileceğini
göstermiĢtir (Cibelli ve ark 1998, Kasinathan ve ark 2001, Urakawa ve ark 2004, Vignon ve
ark 1998). Sonrasında birçok laboratuarlarda yapılan çalıĢmalarda her iki hücre fazdaki
hücreler kullanılarak çeĢitli türlerde baĢarılı sonuçlar alınmıĢtır (Bosch ve ark 2004).
Bu hücreleri istenen döneme getirmek için uygulanan serum starvasyonu ile (düĢük
serum varlığında kültür) hücreler yeteri kadar beslenemedikleri için dinlenme fazına yani G0
fazına geçerler. Ġlk baĢarılı NT çalıĢmasında bu yöntem kullanılmıĢtır (Wilmut ve ark 1997).
BaĢarılı sonuçlar veren G1 hücre fazı için hücreler kültür kaplarını kapladıklarında birbirleri ile
temas ettikleri için (kontak inhibisyon) S fazına geçemezler ve G1’de kalırlar. Bu yöntem ile
sinkronize edilen hücrelerin kullanıldığı çeĢitli NT çalıĢmalarında baĢarılı sonuçlar alınmıĢtır
( Arat ve ark 2001b, Arat ve ark 2002, Cibelli ve ark 1998,Gerger ve ark, 2010, Hayes ve ark
2005). Bir baĢka yöntem ise roskovitin, dimetil sulfoksit, siklohekzimid gibi çeĢitli kimyasallar
kullanılarak hücrelerin G1 fazında bloklanmasıdır ve bazı NT çalıĢmalarında da bu yöntem
kullanılmıĢtır (Arat ve ark 2001b, Gibbons ve ark 2002, Goissis ve ark 2007, Hashem ve ark
2006). Bu sinkronizasyon ajanlarının kullanımı hücre siklusunu düzenlemede etkili olmakla
birlikte DNA hasarına sebep olarak hücre hasarı veya ölümü ile sonuçlanabilen toksik etkileri
beraberinde getirebilir (Koo ve ark , 2009). Benzer bir durumunda serum starvasyonu sonucu
görüldüğüne dikkat çeken ve gerek embriyonal dönemde gerekse doğum sonrası ölümlerin
bu yöntemin sebep olduğu DNA hasarlarına veya apostozise bağlı olabileceğini iddia eden
çalıĢmalar da vardır (Kato ve ark 1998, Wells ve ark 1998a, Hill ve ark 1999, Gibbons ve ark
2002). Ancak hücre kültüründe serum starvasyonunun apoptozise sebep olduğunu gösteren
çalıĢmalar oldukça sınırlıdır ve eriĢkin hücre (Peng ve ark 1998, Dalman ve ark 2010) ile
91
yapılmıĢ birkaç çalıĢma dıĢında çoğu fetal hücrelerde yapılmıĢtır (Peura ve ark 2001, Kues
ve ark 2002, Cho ve ark 2005). Buna karĢın serum starvasyonunun herhangi bir olumsuz
etkisine rastlanmadığını rapor eden çalıĢmalarda mevcuttur (Lima-Neto ve ark 2010).
Hücre bölünmesine gitmeden önce prolifere olan hücreler değiĢik fazlardan geçerler
G1 fazında hücreler RNA ve protein sentez ederler. S fazının baĢında diploid bir hücre her
kromozomdan iki kopya içerir. Bu DNA içeriği 2N diye ifade edilir. S fazında DNA sentezi
yapılır ve bu fazın sonunda hücresel DNA miktarı iki katına çıkar. G2 fazı S fazından sonra
oluĢur ve hücre bölünmesinden önceki RNA ve protein sentez fazıdır. M fazı o kadar kısadır
ki bu fazda hürceler DNA içeriği bazında G2 fazındakilerden ayırt edilemez. Her iki fazda da
DNA miktarı 4 N dir. Hücre bölünmesinden sonra oluĢan yeni hücreler diploiddir. Bu hücreler,
yeni bölünmeler için hücre siklusuna devam edebilir ancak bazen de G0 olarak da bilinen
istirahat fazına girerler. G0 ve G1 fazındaki hücreler 2N DNA içeriğine sahip olduğundan
DNA bazında birbirinden ayrılamazlar. Böylece flow sitometri cihazı DNA yı boyayan PI’ ın
farklı miktarda DNA miktarına sahip hücrelerde yaydığı ıĢığın yoğunluğuna göre örnekdeki
hücre populasyonunun siklus fazlarına göre iki pik vererek ayrılmasını sağlar (Schippers et
al. 2011). Nükleer transfere baĢlamadan önce verici nukleusun sinkronizasyonunu sağlamak
için yapılan çalıĢmalarda hücrelerin hücre siklus karakteristiğini belirlemek için flow sitometri
kullanılmaktadır (Gibbons ve ark 2002, Katska ve ark 2002, Cho ve ark 2005, Hayes ve
ark,2005, Shi ve ark 2007, Selokar ve ark 2012).
Ayrıca apoptozis esnasında plazma membranındaki fosfolipidlerin yapılarında
meydana gelen değiĢiklikler antikoagülan protein olan annexin V kullanılarak flow sitometride
apoptozis miktarı ve yüzdesi belirlenebilir (Shynkar et al. 2007). Nekrotik hücrelerin
yüzeylerinde de Anneksin-V bağlanması görülebildiği için ikinci boya olarak PI eklenmektedir.
Annexin V-FITC ve non-vital boya olan PI birlikte hücre boyanmasında kullanıldığında, canlı
hücreler, erken apoptotik hücreler ve geç apoptotik veya nekrotik hücrelerin birbirinden ayırt
edilmesine izin verir (Rieger ve ark 2011; Overbeeke ve ark.1998). Mevcut çalıĢmada hem
hücre siklusu hemde hücre canlılığı flow sitometri cihazı ile analiz edilmiĢtir. Son araĢtırmalar
Annexin V/PI protokolünde PI’ın sitoplazma içinde RNA’yı da boyayarak %40’lara varan
hatalı pozitif sinyaller verdiği gösterilmiĢ ve bu durumun düzeltilmesi için RNase
kullanıldığında
canlı hücre oranının %70,9’dan %84,9’a çıktığı nekrotik hücre oranının
%18,8 den %3,3’e düĢtüğü görülmüĢtür (Rieger ve ark 2010 ve 2011). Mevcut çalıĢmada da
bir seri ön deneme yapılmıĢ ve benzer Ģekilde RNase kullanımına bağlı olarak canlı hücre
oranı kıkırdak hücrelerinden %96,21’den %99,39’a fibroblast hücrelerinde %96,56’dan
%98,32’ye çıkmıĢtır. Bu sonuç üzerine Annexin V/PI protokolüne RNase ilave edilmiĢtir.
92
Sığır deri fibroblast hücreleri ile yapılan bir çalıĢmada 72 saat ve 120 saat serum açlığı
uygulamasında G1/G0 oranının benzer olduğu ve bu oranın aynı zamanda 4 gün konfluensi
(geç konfluent) uygulanan grup ile de benzer olduğu rapor edilmiĢtir (%82,39, %89,56,
%88,22). Bu çalıĢmada canlılık oranı incelenmemiĢtir (Hayes ve ark 2005). Deri fibroblastının
kullanıldığı baĢka bir çalıĢmada serum açlığı uygulamasının G1/G0 hücre oranını %64,9’dan
%84,5’e çıkardığı rapor edilmiĢtir (Kubota ve ark 1999). Bu sonuçlar mevcut çalıĢmada en
yüksek G1/G0 oranı ile sonuçlanan grup 3 (geç konfluent) ve 6 (120 saat serum açlığı) ile
benzerdir. Ayrıca bir baĢka çalıĢmada mevcut çalıĢmaya benzer olarak 3 ve 5 gün
konfluensi ve serum açlığı, 1 ve 2 gün roskovitin uygulamasından daha yüksek G1/G0 oranı
ile sonuçlanmıĢtır (Sun ve ark, 2008). Fetal sığır fibroblastının serum açlığı,roskovitin ve
konfluensi ile tedavi edildiği bir çalıĢmada en yüksek G1/G0 oranı (sırasıyla %82,9, %82,8,
%86,9) konfluensi grubundan elde edilmiĢtir (Cho ve ark 2005). Ayrıca bu çalıĢmada canlılık
oranları sırasıyla %70,5, %74,6,ve %76,6 ile mevcut çalıĢmadan oldukça düĢük
bulunmuĢtur. Bu durum kültür koĢullarının farklılığına, veya hücre hattına bağlı olabilir veya
fetal hücrelerin eriĢkinlerden daha hassas olmasından kaynaklanabilir. EriĢkin deri fibroblastı
ile yapılan baĢka bir çalıĢmada G1/G0 oranı serum açlığında % 93,3 ve konfluenside %90,3
bulunmuĢtur (Cheong ve ark 2003). Mevcut çalıĢmada ise erkek sığır taze fibroblast
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 3’de
(geç konfluent) %80,77 G1/G0 oranına karĢılık hücre canlılık oranı %92,08, grup 6’da (120
saat serum açlığı) %81,37 G1/G0 oranına karĢılık hücre canlılık oranı %96,21 olarak grup
3’den istatistiksel olarak yüksek bulunmuĢtur. Erkek sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da %87,55 G1/G0
oranına karĢılık hücre canlılık oranı %95,12 ile kontrol grubu ile aynı değerde bulunmuĢtur.
Bu deneyde ikinci olarak yüksek (%82,30) G1/G0 hücre oranı veren grup 3’de canlılık oranı
%97,98 ile grup 6’dan istatistiksel olarak yüksektir. DiĢi sığır taze fibroblast hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat
serum açlığı) hem G1/G0 oranı (%84,43) hem de hücre canlılık oranı (%89,25) tüm deney
gruplarından istatistiksel olarak yüksektir. DiĢi sığır donmuĢ fibroblast hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat
serum açlığı) G1/G0 oranı (%79,38) diğer gruplardan yüksek bulunurken bu grubun hücre
canlılık oranı (%95,23) kontrol grubu ile istatistiksel olarak farksız bulunmuĢtur.
Sığır granulosa hücreleri ile yapılan bir çalıĢmada 4 günlük konfluent grup ile 72 saat
ve 120 saat serum açlığı gruplarından benzer G1/G0 oranları (sırasıyla %85,65, %91,34,
%89,37) alındığı bildirilmiĢtir (Hayes ve ark 2005). Kumulus hücreleri ile yapılan bir
93
çalıĢmada bu oranlar serum açlığında %91,2 konfluenside %92,6 olarak bildirilmiĢtir (Cheong
ve ark 2003). Mevcut çalıĢmada ise en yüksek oranlar konfluent ve konfluent, serum açlığı
uygulanan gruplardan elde edilmiĢtir. Bu çalıĢmada sığır taze granulosa hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 2 ve 3’de (erken ve
geç konfluent) G1/G0 oranı (sırasıyla %79,34, %79,39) istatistiksel olarak en yüksek, hücre
canlılık oranları (sırasıyla %94,77, %94,74) kontrolden (%94,96) farksız bulunmuĢtur. Sığır
donmuĢ
granulosa
hücrelerinde
sinkronizasyon
sonuçları
hücre
canlılık
oranı
ile
karĢılaĢtırıldığında grup 4’de (geç konfluent ve serum açlığı) G1/G0 oranı (%77,22)
istatistiksel olarak en yüksek, ancak hücre canlılık oranı (%95,28) kontrolden (%96,80)
istatistiksel olarak düĢük bulunmuĢtur. Bu deneyde ikinci olarak yüksek (%76,28) G1/G0
hücre oranı veren grup 3’de (geç konflent) canlılık oranı (%94,30) yine kontrol grubundan
düĢük bulunurken, üçüncü olarak yüksek (%73,59) G1/G0 hücre oranı veren grup 6’da (120
saat serum açlığı) canlılık oranı (%94,73) kontrolden düĢük bulunmuĢtur.
Sığırlarda nükleer transfer için kas hücrelerinin kullanıldığı sadece birkaç çalıĢma vardır
(Vignon ve ark 1998, Shiga ve ark 1999).
Sığır eriĢkin kas hücreleri ile yapılan bir
sinkronizasyon çalıĢmasında serum açlığı %89,5 ve konfluensi %89,3 G1/G0 oranı ile
sonuçlanmıĢtır(Cheong ve ark 2003). Mevcut çalıĢmada erkek sığır taze kas hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 4’de (geç konfluent
ve serum açlığı) %78,17 G1/G0 oranına karĢılık hücre canlılık oranı %97,01 ile kontrol
grubundan yüksek bulunmuĢtur. Bu deneyde ikinci olarak yüksek (%77,68) G1/G0 hücre
oranı veren grup 3’de (geç konfluent) canlılık oranı %94,90 ile grup 4’den istatistiksel olarak
düĢüktür. Erkek sığır donmuĢ kas hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı
ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat serum açlığı) %90,26 G1/G0 oranına karĢılık hücre
canlılık oranı %93,01 ile kontrol grubu ile aynı değerde bulunmuĢtur. Bu deneyde üçüncü
olarak yüksek (%82,46) G1/G0 hücre oranı veren grup 3’de (geç konfluent) canlılık oranı
%99,65 ile tüm deney gruplarından istatistiksel olarak yüksektir. DiĢi sığır taze kas
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da
(120 saat serum açlığı) G1/G0 oranı (%94,90) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık
oranı (%95,86) kontrolden yüksek çıkmıĢtır. Bu deneyde üçüncü olarak yüksek (%86,25)
G1/G0 hücre oranı veren grup 3’de (geç konflent) canlılık oranı (%97,91) tüm deney
gruplarından istatistiksel olarak yüksek bulunmuĢtur. DiĢi sığır donmuĢ kas hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat
serum açlığı) G1/G0 oranı (%89,63) istatistiksel olarak en yüksek, canlılık oranı ise (%97,08)
kontrol grubuna (%95,21) yakın bulunmuĢtur.
94
Sığır kıkırdak hücreleri nükleer transfer amacıyla ilk defa bir çalıĢmada kullanılmıĢ ve
hücreler G1/G0 fazına kontak inhibisyon ile getirilmeye çalıĢılmıĢtır. Bu çalıĢmada kıkırdak
hücrelerinden sağlıklı bir diĢi klon buzağı üretilmiĢtir (Arat ve ark 2011). Kıkırdak hücrelerinin
ne sinkronizasyonu ne de nükleer transferde kullanımı ile ilgili baĢka bir çalıĢmaya
rastlanmamıĢtır. Mevcut çalıĢmada erkek sığır taze kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon
sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 3’de (geç konfluent) %77,49 G1/G0
oranına karĢılık hücre canlılık oranı (%92,88) ile kontrol grubundan düĢük bulunmuĢtur. Bu
deneyde ikinci olarak yüksek (%76,22) G1/G0 hücre oranı veren grup 6’da (120 saat serum
açlığı) canlılık oranı (%97,45) ile grup 3’den istatistiksel olarak yüksektir. Erkek sığır donmuĢ
kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 5’de (72 saat serum açlığı) (%86,18) G1/G0 oranına karĢılık hücre canlılık oranı
(%93,98) ve grup 6’da (%85,12) G1/G0 oranına karĢılık hücre canlılık oranı (%94,66) ile
kontrol grubundan düĢük bulunmuĢtur. Bu deneyde üçüncü olarak yüksek (%83,28) G1/G0
hücre oranı veren grup 4’de (geç konflent ve düĢük serum) canlılık oranı (% 91,32 ) ile grup 5
ve 6’dan istatistiksel olarak düĢüktür. DiĢi sığır taze kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon
sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 3’de (geç konfluent) G1/G0 oranı
(%79,22) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%91,12) kontrolden istatistiksel
olarak düĢük çıkmıĢtır. Bu deney grubunda %60’ın üzerinde G1/G0 hücre oranı veren tüm
gruplarda canlılık oranı kontrolden düĢük olmuĢtur. DiĢi sığır donmuĢ kıkırdak hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 3’de (geç konfluent)
G1/G0 oranı (%74,37) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%92,04) kontrolden
istatistiksel olarak düĢük çıkmıĢtır. Bu deney grubunda en yüksek canlılık oranları grup 5 ve
6 (sırasıyla %97,12, %95,80) de tespit edilmiĢ ancak bu deney gruplarında sinkronizasyon
oranları (%62,38, %70,14) grup 3’den düĢük olmuĢtur.
DiĢi manda fetal fibroblast hücrelerinin serum açlığı ve konfluensi ile sinkronize edildiği
bir çalıĢmada G1/G0 oranı serum açlığında (%77,9) konfluensiden (%66) yüksek bulunmuĢ
ve bu çalıĢmada hücre canlılık oranı incelenmemiĢtir (Shi ve ark 2007). Bu sinkronizasyon
oranı mevcut çalıĢmaya göre daha düĢüktür. Bunun sebebi bu çalıĢmada fetal hücrelerin
kullanılmıĢ olması ve gerek serum açlığı ve gerekse konfluensi süresinin 72 saat olması
olabilir. Bir baĢka çalıĢmada manda fibroblast hücrelerinde serum açlığı, konfluensi ve
roskovitin ile sinkronizasyon yapılmıĢ, G1/G0 oranı serum açlığında %76,80 ve konfluenside
% 85,99 bulunmuĢtur (Selokar ve ark 2012). Bu sonuçlar mevcut çalıĢmadan düĢüktür ve bu
fark serum açlığı süresinin 24 ve konfluensi süresinin ise 72 saat olması olabilir. Mevcut
çalıĢmada ise erkek manda taze fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre
95
canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranları
(%95,10) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%96,04) kontrol (%96,44) ile
benzer bulunmuĢtur. Deney grupları içerisinde ikinci en yüksek G0/G1 oranına (%92,51)
sahip grup 3 (geç konfluent) de canlılık oranları (%95,82) kontrol ile benzer bulunmuĢtur.
Erkek manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile
karĢılaĢtırıldığında grup 3 (geç konfluent) ve grup 6 (120 saat serum açlığı) de G1/G0
oranları (sırasıyla %93,46, %93,20) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları
(sırasıyla %96,64, %93,94) kontrolden (%97,29) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının
hücre canlılık oranlarının kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir. DiĢi
manda taze fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile
karĢılaĢtırıldığında grup 3 (geç konfluent) grup 6 (120 saat serum açlığı)de G1/G0 oranları
(sırasıyla %91,25, %92,14) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları grup 3’de
(%97,56) kontrolden (%98,48) düĢük grup 6’da (%98,36) kontrol ile benzer bulunmuĢtur.
DiĢi manda donmuĢ fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile
karĢılaĢtırıldığında grup 3 (geç konfluent) ve grup 6 (120 saat serum açlığı)de G1/G0 oranları
(sırasıyla %91,38, %92,34) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları grup 3’de
(%95,58) kontrolden (%97,09) düĢük, grup 6’da (%96,95) kontrol ile benzer bulunmuĢtur.
Manda granulosa hücrelerinin serum açlığı ve konfluensi ile sinkronize edildiği bir
çalıĢmada G1/G0 oranı serum açlığında (%76,6) konfluensiden (%63.2) yüksek bulunmuĢ
ve bu çalıĢmada hücre canlılık oranı incelenmemiĢtir (Shi ve ark 2007). Bu sinkronizasyon
oranı mevcut çalıĢmaya göre daha düĢüktür. Bunun sebebi gerek serum açlığı ve gerekse
konfluensi süresinin 72 saat olması olabilir. Mevcut çalıĢmada diĢi manda taze granulosa
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120
saat serum açlığı)de G1/G0 oranı (%81,22) istatistiksel olarak gruplar içerisinde en yüksek,
hücre canlılık oranı (% 97,02) kontrolden (%98,23) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney
gruplarının
hücre
canlılık
oranlarının
kontrolden
istatistiksel
olarak
düĢük
olduğu
belirlenmiĢtir. DiĢi manda donmuĢ granulosa hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre
canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı)de G1/G0 oranı (%86,23)
istatistiksel olarak gruplar içerisinde en yüksek, hücre canlılık oranı (% 95,59) kontrolden
(%97,52) düĢük bulunmuĢtur. Ancak tüm deney gruplarının hücre canlılık oranlarının
kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir.
Manda hücrelerinin sinkronizasyonu ve nükleer transferi ile ilgili çalıĢma çok azdır ve
hiçbirinde ne kas ve ne de kıkırdak hücreleri ile çalıĢılmamıĢtır. Mevcut çalıĢmada erkek
manda
taze
kas
hücrelerinde
sinkronizasyon
96
sonuçları
hücre
canlılık
oranı
ile
karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (%83,99) istatistiksel
olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%96,72) kontrolden (%97,33) düĢük bulunmuĢtur.
Tüm deney gruplarının hücre canlılık oranlarının kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu
belirlenmiĢtir. Erkek manda donmuĢ kas hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık
oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (%82,92)
istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%95,95)
kontrolden (%97,22) düĢük
bulunmuĢtur. Hücre canlılık oranı (%96,90) kontrol ile benzer olan grup 5 (72 saat serum
açlığı) da G1/G0 oranı (%77,89) olarak bulunmuĢtur.
Erkek manda taze kıkırdak
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120
saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (%94,81) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık
oranı (%96,58)
kontrolden (%98,36) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının hücre
canlılık oranlarının kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir. Erkek manda
donmuĢ
kıkırdak
hücrelerinde
sinkronizasyon
sonuçları
hücre
canlılık
oranı
ile
karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranları (%90,08) istatistiksel
olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%96,41) kontrolden (%98,99) düĢük bulunmuĢtur.
Hücre canlılık oranı (%98,36) kontrol ile benzer olan grup 2 (erken konfluent) de G1/G0 oranı
(%76,16) olarak bulunmuĢtur. DiĢi manda taze kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon
sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı)da hem
G1/G0 oranı (%91,85) hemde hücre canlılık oranı (% 98,45) istatistiksel olarak gruplar
içerisinde en yüksek bulunmuĢtur. DiĢi manda donmuĢ kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon
sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı)da G1/G0
oranı (%86,99) istatistiksel olarak gruplar içerisinde en yüksek, hücre canlılık oranı (% 97,15)
kontrolden (%98,32) düĢük bulunmuĢtur. Hücre canlılık oranı (%98,80) kontrol ile benzer
olan grup 2 (erken konfluent) de G1/G0 oranı (%79,28) olarak bulunmuĢtur.
Koyunlarda nükleer transfer çalıĢmalarında çoğunlukla kullanılan hücreler fibroblast
hücreleridir (Xue ve ark 2011). Ancak bir çalıĢmada farklı cinsiyette ve tipte hücreler
kullanılarak ve hepsinde hücre sinkronizasyonu için serum açlığı yöntemi uygulanarak
yapılan bir çalıĢmada kumulus, erkek ve diĢi fibroblast hücrelerinden geliĢen blastosist
oranları arasında bir fark olmadığı gösterilmiĢtir (Hosseini ve ark 2008). Koyun fetal fibroblast
hücrelerinin kullanıldığı ve sinkronizasyon içinde serum açlığı ve konfluensi uygulandığı bir
baĢka çalıĢmada her iki gruptanda canlı kuzu elde edildiği, ancak sayının serum açlığı
grubunda daha yüksek olduğu bildirilmiĢtir (Melican ve ark 2005). Bu sonuç her iki
sinkronizasyonunda benzer etkisi olduğunu göstermektedir. Bu çalıĢmaların hiçbirinde
sinkronizasyon sonuçları flow sitemetri ile analiz
97
edilmemiĢtir. Mevcut çalıĢmada erkek
koyun taze fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile
karĢılaĢtırıldığında grup 3’de (geç konfluent) G1/G0 oranı (%80,02) istatistiksel olarak en
yüksek, hücre canlılık oranı ise (%92,31) kontrolden (%95,81) istatistiksel olarak düĢük
çıkmıĢtır. Bu deney grubunda ikinci yüksek canlılık oranı grup 4 (geç konfluent ve serum
açlığı) (%76,16) de tespit edilmiĢ ve bu grubun hücre canlılık oranı (%94,59) grup 3’den
istatistiksel olarak yüksek bulunmuĢtur. Erkek koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat
serum açlığı) G1/G0 oranı (%75,51) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı ise
(%94,52) kontrol ile benzer çıkmıĢtır.
Bu deney grubunda ikinci yüksek G1/G0 oranı
(%70,00) oranı grup 5 (72 saat serum açlığı) de tespit edilmiĢ ve bu grubun hücre canlılık
oranı (%97,56) grup 6’den istatistiksel olarak yüksek bulunmuĢtur. DiĢi koyun taze fibroblast
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 3
(erken konfluent), grup 4 (geç konfluent ve düĢük serum) grup 5,6 (72 ve 120 saat serum
açlığı) da G1/G0 oranları (sırasıyla %84,62, %82,63,%82,79, %82,71) istatistiksel olarak en
yüksek, hücre canlılık oranları ise grup 2’de (%95,29) kontrol (%94,39) ile benzer, grup 5’de
(%98,11) en yüksek,grup 4’de (93,43) ile kontrolden düĢük ve grup 6’da (%95,71) kontrol ile
benzer bulunmuĢtur. DiĢi koyun donmuĢ fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları
hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 5’de (72 saat serum açlığı) G1/G0 oranı
(%96,38) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı ise (%95,78) kontrolden (%93,10)
yüksek çıkmıĢtır. G1/G0 oranı oranı %90,45 olan grup 2’de (erken konfluent) hücre canlılık
oranı (%98,92) gruplar içinde en yüksek bulunmuĢtur.
Koyunlarda kas ve kıkırdak hücrelerinin kullanıldığı bir nükleer transfer çalıĢmasına
rastlanmamıĢtır. Mevcut çalıĢmada erkek koyun taze kas hücrelerinde sinkronizasyon
sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat serum açlığı) G1/G0
oranı (%91,38) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı ise (%94,24) kontrolden
(%96,18) istatistiksel olarak düĢük çıkmıĢtır. Bu deney grupları içinde en yüksek canlılık
oranı grup 2’de (%95,92) tespit edilirken bu deney grubunun G1/G0 oranı (%74,75) grup
6’dan oldukça düĢük olmuĢtur.
Erkek koyun donmuĢ kas hücrelerinde sinkronizasyon
sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat serum açlığı) G1/G0
oranı (%92,56) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı ise (%93,70) kontrol
(%94,39) ile benzer bulunmuĢtur. DiĢi koyun taze kas hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları
hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat serum açlığı) G1/G0 oranı
(%95,40) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı ise (%97,79) diğer tüm deney
gruplarından yüksek ancak kontrolden (%98,29) düĢük çıkmıĢtır. DiĢi koyun donmuĢ kas
98
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da
(120 saat serum açlığı) G1/G0 oranı (%94,68) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık
oranı ise (%99,54) kontrolden (%97,86) istatistiksel olarak yüksek çıkmıĢtır.
Erkek koyun taze kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı
ile karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat serum açlığı) G1/G0 oranı (%84,52) istatistiksel
olarak en yüksek, hücre canlılık oranı ise (%95,94) kontrol (%96,97) grubundan istatistiksel
olarak düĢük çıkmıĢtır. Bu hücre grubunda tüm sinkronizasyon uygulamalarının hücre canlılık
oranında kontrole göre istatistiksel olarak düĢüklüğe sebep olduğu görülmüĢtür. Erkek koyun
donmuĢ
kıkırdak
hücrelerinde
sinkronizasyon
sonuçları
hücre
canlılık
oranı
ile
karĢılaĢtırıldığında grup 6’da (120 saat serum açlığı) hem G1/G0 oranı (%81,92) hem de
hücre canlılık oranı (%97,05) kontrolden istatistiksel olarak yüksek çıkmıĢtır. DiĢi koyun taze
kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 4’de (geç konfluent ve düĢük serum) G1/G0 oranı (%84,60) ile istatistiksel olarak en
yüksek, hücre canlılık oranı ise (%92,73) kontrolden düĢük bulunmuĢtur. DiĢi koyun donmuĢ
kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranları (sırasıyla %89,32, %89,26)
istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları ise grup 5’da (%97,72)
kontrolden
(%95,94) yüksek grup 6’da (%91,47) kontrolden düĢük bulunmuĢtur. Deney grupları
içerisinde ikinci en yüksek G0/G1 oranına (%87,63) sahip grup 2’nin (erken konfluent)
canlılık oranı (%99,16) istatistiksel olarak diğer tüm gruplardan yüksek bulunmuĢtur.
Koyunlarda serum açlığı uygulanan ve uygulanmayan granulosa hücreleri nükleer
transferde kullanılmıĢ bunun neticesinde ne in vitro ne de in vivo embriyo geliĢiminde bir fark
tespit edilmiĢtir. Hücre sinkronizasyonunun analiz edilmediği bu çalıĢmada serum
uygulamasının ne negatif ne de pozitif etkisinin bulunmadığı ileri sürülmüĢtür (Peura ve ark
2003). Mevcut çalıĢmada koyun taze granulosa hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre
canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 2 (erken konfluent) grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat
serum açlığı) de G1/G0 oranları (sırasıyla %87,58, %85,45,%84,67) istatistiksel olarak en
yüksek, hücre canlılık oranları ise grup 2’de (%94,45) tüm gruplardan yüksek, grup 5 ve
6’da (sırasıyla %93,06, %92,58) kontrol (%92,86) ile benzer çıkmıĢtır. Koyun donmuĢ
granulosa hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 4 (geç konfluent ve düĢük serum) de G1/G0 oranları (%86,60) istatistiksel olarak en
yüksek, hücre canlılık oranı (%91,32) kontrol (%96,86) den düĢük çıkmıĢtır.
99
Keçi fibroblast hücreleri ile yapılan bir çalıĢmada 3 gün serum açlığının G1/G0 hücre
oranını %66,23’den %82,91’e çıkardığı rapor edilirken (Zhou ve ark 2013) benzer baĢka bir
çalıĢmada (Dalman ve ark 2010) 3 gün serum açlığı, erken konfluensi ve geç konfluensi
gruplarında bu oran %90,1, %80,26 ve %91,53 olarak bildirilmiĢtir. Bu çalıĢmada canlı
hücre oranı serum açlığında %91,90 erken ve geç konfluenside sırasıyla %95,61, %95,12
olarak bulunmuĢtur. Bu sonuçlar mevcut çalıĢmanın sonuçlarına benzerdir. Fetal fibroblast
hücreleri ile yapılan bir çalıĢmada hücreler roskovitin, serum açlığı ve konfluensi uygulaması
ile sinkronize edilerek nükleer transferde kullanılmıĢ ve blastosist geliĢiminin roskovitin ve
konfluenside benzer olduğu ancak serum açlığı uygulanan hücrelerden düĢük oranda
blastosist elde edildiği bildilmiĢtir (Akshey ve ark 2011). Serum açlığının bu çalıĢmadaki
düĢük oranı fetal hücrelerin uygulamaya daha hassas olmasından kaynaklanabilir.
Bu
çalıĢmada G1/G0 oranı analiz edilmemiĢtir. Yine baĢka bir çalıĢmada deri fibroblast
hücrelerinde 3 ve 5 gün serum açlığı %70,2 ve %83,4, konfluensi ise %77,6 G1/G0 oranı ile
sonuçlanmıĢtır. Apoptotik hücre oranı da 5 günlük serum açlığında %11 ile deney grupları
arasında en yüksek bulunmuĢtur (Yu ve ark 2003). Mevcut çalıĢmada erkek keçi taze
fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (sırasıyla %79,08, %81,57)
istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları (sırasıyla %90,87,%92,74) kontrolden
(%96,32) düĢük çıkmıĢtır. Deney grupları içerisinde ikinci en yüksek G0/G1 oranlarına
(sırasıyla %74,11, %74,33) sahip grup 2 ve 3 (erken konfluent ve geç konfluent) de canlılık
oranları (sırasıyla %96,23, %95,41) kontrol ile benzer bulunmuĢtur. Erkek keçi donmuĢ
fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (sırasıyla %79,08, %81,77)
istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları grup 5’de (%96,05) kontrol (%96,26) ile
benzer, grup 6’da (%92,84) kontrolden istatistiksel olarak düĢük çıkmıĢtır. Deney grupları
içerisinde ikinci en yüksek G0/G1 oranına (%75,79) sahip grup 4 (geç konfluent ve düĢük
serum ) de canlılık oranı (%95,62) ile kontrole (96,32) benzer bulunmuĢtur. DiĢi keçi taze
fibroblast hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında
grup 6 (120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranı (%88,84) istatistiksel olarak en yüksek, hücre
canlılık oranı (%96,90) kontrol ile (%96,32) benzer bulunmuĢtur. Hücre canlılık oranı kontrol
ile benzer olan grup 2 (%96,48) de G1/G0 oranı (%82,24) olarak bulunmuĢtur. DiĢi keçi
donmuĢ
fibroblast
hücrelerinde
sinkronizasyon
sonuçları
hücre
canlılık
oranı
ile
karĢılaĢtırıldığında grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranı (sırasıyla
%94,04, %96,01) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları (sırasıyla %95,33,
%94,24) kontrol (%93,65) ile benzer ve kontrolden yüksek bulunmuĢtur. Deney grupları
100
içerisinde ikinci en yüksek G0/G1 oranına (sırasıyla %84,23, %84,62) sahip grup 2 ve 3
(erken ve geç konfluent) de canlılık oranları (sırasıyla %93,48, %95,37) kontrol ile benzer ve
kontrolden yüksek bulunmuĢtur.
Keçilerde kas hücrelerinin kullanıldığı bir yayına rastlanmıĢtır ve bu çalıĢmada sağlıklı
doğum ile sonuçlanan en uygun hücre tiplerinden biri olarak rapor edilmiĢtir (Ren ve ark
2014).Ancak bu çalıĢmada hücre sinkronizyon analizi yapılmamıĢtır. Mevcut çalıĢmada erkek
keçi
taze
kas
hücrelerinde
sinkronizasyon
sonuçları
hücre
canlılık
oranı
ile
karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranları (%91,48) istatistiksel
olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%95,50) kontrolden (%93,89) yüksek bulunmuĢtur.
Deney grupları içerisinde ikinci en yüksek G0/G1 oranına (sırasıyla %83,36, %86,53) sahip
grup 2 ve 3 (erken ve geç konfluent) de canlılık oranları (%92,94, %92,60) kontrolden düĢük
bulunmuĢtur. Erkek keçi donmuĢ kas hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık
oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranları (%84,95)
istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%94,07)
kontrolden (%96,51) düĢük
bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının hücre canlılık oranlarının kontrolden istatistiksel olarak
düĢük olduğu belirlenmiĢtir. DiĢi keçi taze kas hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre
canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 5 ve 6 (72 ve 120 saat serum açlığı) da G1/G0
oranı (sırasıyla %85,67, %88,10) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranları
(sırasıyla %92,86, %91,80) kontrolden (%95,14) düĢük bulunmuĢtur. Hücre canlılık oranı (
% 95,35)
kontrol ile benzer olan grup 3 (erken konfluent) de G1/G0 oranı (%78,88) olarak
bulunmuĢtur.
DiĢi keçi donmuĢ kas hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık
oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranı (%92,69)
istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%92,94)
kontrolden (%95,58) düĢük
bulunmuĢtur. Hücre canlılık oranı (% 95,06) kontrol ile benzer olan grup 2 (erken konfluent)
de G1/G0 oranı (%78,88) olarak bulunmuĢtur.
Keçilerde kıkırdak hücreleri ile ne sinkronizasyon ne de nükleer transfer ile ilgili bir
çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Mevcut çalıĢmada erkek keçi taze kıkırdak hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 5 ve 6 (120 saat
serum açlığı) de G1/G0 oranları (sırasıyla %66,94, %66,62) istatistiksel olarak en yüksek,
hücre canlılık oranı (sırasıyla %94,47, %94,39) kontrolden (%93,32) yüksek bulunmuĢtur.
Erkek keçi donmuĢ kıkırdak hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile
karĢılaĢtırıldığında grup 5 ve 6 (120 saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (sırasıyla %73,56,
%75,16) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (sırasıyla %94,20, %96,54)
kontrolden (%97,39) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının hücre canlılık oranlarının
101
kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir. DiĢi keçi taze kıkırdak hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum
açlığı) de G1/G0 oranı (%85,57) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı (%94,09)
kontrolden (%97,26) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının hücre canlılık oranlarının
kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir. DiĢi keçi donmuĢ kıkırdak
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 5 ve 6
(72 ve 120 saat serum açlığı) da G1/G0 oranları (sırasıyla %75,17, %77,15) istatistiksel
olarak en yüksek, hücre canlılık oranları grup 6’da (%95,94) kontrolden (%94,92) yüksek ve
grup 5’de (%94,08) kontrolden ve diğer deney gruplarından düĢük bulunmuĢtur.
Keçilerde granulosa ve kumulus hücrelerinin nükleer transferi ile canlı doğumlar elde
edilmiĢtir ve genelde hücrelerde serum açlığı ve konfluensi ile sinkronizasyon yapılmıĢtır
Keefer ve ark 2002, Lan ve ark 2006). Mevcut çalıĢmada keçi taze granulosa hücrelerinde
sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120 saat serum
açlığı) de G1/G0 oranları (%91,29) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık oranı
(%95,11) kontrolden (%96,29) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının hücre canlılık
oranlarının kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir. Keçi donmuĢ granulosa
hücrelerinde sinkronizasyon sonuçları hücre canlılık oranı ile karĢılaĢtırıldığında grup 6 (120
saat serum açlığı) de G1/G0 oranları (%87,92) istatistiksel olarak en yüksek, hücre canlılık
oranı (%94,13)
kontrolden (%95,69) düĢük bulunmuĢtur. Tüm deney gruplarının hücre
canlılık oranlarının kontrolden istatistiksel olarak düĢük olduğu belirlenmiĢtir.
Bir çalıĢmada farklı hücre tiplerinde uygulanan serum açlığı ve konfluensi yöntemleri
flow sitometre ile analiz edilmiĢ hücreleri sinkronize edilmesinde önerilen her uygulamanın
farklı hücre tiplerinde farklı sonuçlar verebileceği bazı hücre tiplerinde bu uygulamaların
G1/GO oranını çok fazla etkilemediği, bölünen hücrelerin zaten %60 dan fazlasının G1/G0
da olduğu hatta bazı tip hücrelerde serum açlığının tam tersi etki gösterdiği ve
konfluensininde G1/G0 oranını yükseltmede hiçbir etkiye sahip olmadığı iddia edilmiĢtir. Bu
nedenlede her hücre tipi için en uygun stratejinin belirlenmesi gerektiği vurgulanmıĢtır
(Katska ve ark 2002). Nükleer tranfer baĢarısının çok belirgin bir Ģekilde, hücre tipi, hücre
kaynağı ve hatta hücrenin cinsiyetinden etkilendiğini gösteren çalıĢmalar (Lagutina et al.
2005)
bu
hücrelerin
sinkronizasyon
uygulamalarına
farklı
yanıtlar
vermesinden
kaynaklanabilir.
SONUÇ: Sonuç olarak bizim çalıĢmamızda da farklı hücre tiplerinin kültürde farklı
davranıĢlar sergilediği, bölünen ve hiçbir uygulama yapılmayan hücrelerde G1/G0 oranının
102
%47-79 arasında değiĢtiği, bu oranların hem hücre tipleri hemde hayvan türleri arasında
değiĢtiği görülmektedir. Bu nedenle farklı hücre tiplerinde aynı Ģekilde uygulanan farklı
sinkronizasyon yöntemlerinin etkilerinin hücre düzeyinde incelendiği bu çalıĢma çok yararlı
bilgiler sunmaktadır. Genel olarak bakıldığın da benzer hücre tipleri ile yapılan çalıĢmalar ile
uyumlu sonuçlar alınmıĢtır. Bazı yöntemlerdeki sonuçların farklılığı mevcut çalıĢmadaki kültür
koĢullarından ve sinkronizasyon yöntemlerinin uygulandığı hücrelerin baĢlangıç sayısından
kaynaklanmıĢ olabilir. Birçok çalıĢmada serum açlığı uygulaması hücreler %60-95 konfluent
olduktan sonra uygulanmaya baĢlamıĢtır. Mevcut çalıĢmada ise tüm gruplarda uygulamalar
%50 konfluent kültürlerde baĢlamıĢtır.
Grupların büyük bölümünde uygulamaların hücre
canlılığı üzerinde benzer etkiler oluĢturduğu ve sadece birkaç grupta erken ve geç apoptotik
hücrenin toplam oranının %7’nin biraz üstünde olduğu görülmektedir. Apototik hücre oranının
genelde düĢük olması hücre canlılık oranındaki düĢüĢün apoptozize sebep olan DNA
hasarından ziyade kültürdeki manipulasyonlardan dolayı (tripsinleme, pasajlama, ısı, ph,
hücre dondurma çözme, pipetleme vb) hücre membranında meydana gelen hasara bağlı
nekrotik hücre oluĢumu olduğu izlenimini vermektedir. ÇalıĢma sonunda her hücre tipi için
G1/G0 ve hücre canlılık oranı göz önüne alınarak bir veya birkaç alternatif sinkronizasyon
yöntemi seçilebilir. Bundan sonraki aĢamada seçilen yöntemlerle sinkronize edilen hücrelerin
nükleer transferde kullanılarak in vitro ve in vivo embriyo geliĢiminin izlenmesi faydalı
olacaktır.
103
6.KAYNAKLAR
Adams,A.M., Pratt, S.L., Gibbons, J.R., Arat, S., Respess, D.S, Stice, S.L. 2004. “ Production
Of A Cloned Calf Using Kidney Cells Obtained From A 48-Hour Cooled Carcass”, Reprod
Fertility Dev., 16(1,2),133.
Akshey, Y.S. , Malakar,D., Kumar De,A., Kumar Jena,M., Kumar Pawar,S, Dutta,R., Sahu,
S. 2011. “Effect Of Roscovitine Treated Donor Cells And Different Activationmethods On
Development Of Handmade Cloned Goat
(Capra Hircus) Embryos”,
Theriogenology,
75,1516–1524.
Andrabi, S. M. H., Maxwell, W. M. C. 2007. “ A Review Of Reproductive Biotechnologies For
Conservation Of Endangered Mammalian Species” Anim. Reprod. Sci., 99, 223–243.
Arat, S., Caputcu, A., Akkoc, T., Pabuccuoglu, S., Sagirkaya, H., Cirit, U., Nak, Y., Koban, E.,
Bagis, H., Demir, K., Nak, D., Senunver, A., Kilicaslan, R., Tuna, B., Cetinkaya, G., Denizci,
M., Aslan, O. 2011. “Using Cell Banks As A Tool Ġn Conservation Programs Of Native
Domestic Breeds: The Production Of The First Cloned Anatolian Grey Cattle Reprod”
Fertil.Develop, 23(8), 1012-1023.
Arat, S., Gibbons, J., Rzucidlo, S.J., Respess, D.S., Tumlin, M., Stice, S.L. 2002. “ In Vitro
Development Of Bovine Nuclear Transfer Embryos From Transgenic Clonal Lines Of Adult
And Fetal Fibroblast Cells Of The Same Genotype”, Biol Reprod, 66, 1768-1774 .
Arat, S., Gibbons, J., Rzucidlo, S.J., Miyoshi, K., Venable, A., Waltenburg, R., Stice, Sl.
2001a. " Bovine Cloning Using Adult Donor Cells Treated With Roscovitine”, Biol. Reprod,
64(1), 173.
Arat, S., Rzucidlo, S.J., Gibbons, J., Miyoshi, K.,
Stice, S.L. 2001b. " Production Of
Transgenic Bovine Embryos By Transfer Of Transfected Granulose Cells Into Enucleated
Oocytes ”, Mol. Reprod. Dev., 60, 20-26.
Baguisi, A., Behboodi, E., Melican, D.T., Pollock, J.S., Desrempes, M.M., Cammuso, C.,
Williams, J.L., Nims,S.D., Porter, C.A., Midura, P., Palacios, M.J., Ayres, S.L., Denniston,
R.S., Hayes, M.L., Ziomek, C.A., Meade, H.M., Godke, R.A., Gavin, W.G., Overstrom, E.W.,
Echelard, Y. 1999. "Production Of Goats By Somatic Cell Nuclear Transfer”, Nat Biotechnol,
17, 456-461.
104
Bertolini, M., Bertolini, L.R., Gerger, R.P.C., Batchelder, C.A., Et Al. 2007. “ Developmental
Problems During Pregnancy After İn Vitro Embryo Manipulations”, Rev. Bras. Reprod.
Anim.,31, 391-405.
Bosch, P., Hodges, C.A., Stice, S.L. 2004. " Generation Of Transgenic Livestock By Somatic
Cell Nuclear Transfer”, Biotecnolog´Ia Aplicada, 21, 122–136.
Brem, G., Kuhholzer, B. 2002. “The Recent History Of Somatic Cloning Ġn Mammals”,
Cloning Stem Cells, 4, 57–63.
Campbell, K.H., Loi, P., Otaegui, P.J., Wilmut, I. 1996. “ Cell Cycle Co-Ordination Ġn Embryo
Cloning By Nuclear Transfer”, Rev. Reprod., 1, 40-46.
Cheong, H.T, Park,T.M, Ikeda, K., Takahashi, Y. 2003. “ Cell Cycle Analysis Of Bovine
Cultured Somatic Cells By Flow Cytometry ” Lpn. L. Vet. Res., 51 ( 2), 95-103.
Cho, S.R., Ock, S.A., Yoo, J.G., Mohana Kumar, B., Choe, S.Y., Rho, G.J. 2005. “Effect Of
Confluent, Roscovitine Treatment And Serum Starvation On The Cell-Cycle Synchronization
Of Bovine Foetal Fibroblasts” Reprod Domest Anim, 40, 171–176.
Cibelli, J.B., Stice, S.L., Golueke, P.J., Kane, J.J., Jerry, J., Blackwell, C., De Leon, F.A.P.,
Robl, J.M. 1998. “Cloned Transgenic Calves Produced From Non-Quiescent Fetal
Fibroblasts” Science, 280, 1256-1258.
Constant, F., Guillomot, M., Heyman, Y., Vignon, X., Et Al. 2006. “Large Offspring Or Large
Placenta Syndrome? Morphometric Analysis Of Late Gestation Bovine Placentomes From
Somatic Nuclear Transfer Pregnancies Complicated By Hydrallantois” Biol. Reprod., 75, 122130.
Dalman, A., Eftekhari-Yazdi, P., Valojerdi, M.R., Shahverdi, A., Gourabi, H., Janzamin, E.,
Fakheri, R., Sadeghian, F., Hasani, F. 2010. “Synchronizing Cell Cycle Of Goat Fibroblasts
By Serum Starvation Causes Apoptosis” Reprod Dom Anim, 45, E46–E53.
Edwards, J.L., Schrick, F.N., Mccracken, M.D., Et. Al. 2003. “Cloning Adult Farm Animals:A
Review Of The Possibilities And Problems Associated With Somatic Cell Nuclear Transfer”
Am J Reprod Immunol., 50, 113-123.
105
Farin, P.W., Piedrahita, J.A., Farin, C.E. 2006. “Errors Ġn Development Of Fetuses And
Placentas From İn Vitro-Produced Bovine Embryos” Theriogenology, 65, 178-191.
Gerger, R.P.C. , Ribeiro, E.S., Forell, F., Bertolini, L.R., Rodrigues, J.L., Ambrósio, C.E.,
Miglino, M.A., Mezzalira A., Bertolini, M. 2010. " In Vitro Development Of Cloned Bovine
Embryos Produced By Handmade Cloning Using Somatic Cells From Distinct Levels Of Cell
Culture Confluence”, Genetics And Molecular Research 9 (1), 295-302.
Gibbons,J., Arat, S., Rzucidlo, J., Miyoshi, K., Waltenburg, R., Respess, D., Venable, A.,
Stice, S.L.. 2002. "Enhanced Survivability Of Cloned Calves Derived From RoscovitineTreated Adult Somatic Cells”, Biol. Reprod., 66,895-900.
Goissis, M.D., Caetano, H.V., Marques, M.G., De Barros, F.R, Et Al. 2007. “Effects Of Serum
Deprivation And Cycloheximide On Cell Cycle Of Low And High Passage Porcine Fetal
Fibroblasts” Reprod. Domest. Anim., 42, 660-663.
Hayes, O., Ramos, B., Rodrıguez, L.L., Aguilar, A., Badıa, T., Castro, F.O. 2005. "Cell
Confluency Ġs As Efficient As Serum Starvation For Ġnducing Arrest Ġn The G0/G1 Phase Of
The Cell Cycle Ġn Granulosa And Fibroblast Cells Of Cattle”, Animal Reproduction Science,
87, 181–192.
Hashem MA, Bhandari DP, Kang SK, Lee BC, et al. 2006. “Cell cycle analysis of in vitro
cultured goral (Naemorhedus caudatus) adult skin fibroblasts”. Cell Biol. Int. 30: 698-703.
Heyman, Y., Chavatte-Palmer, P., Lebourhis, D., Camous, S., Vignon, X., Renard, J.P. 2002.
“Frequency And Occurrence Of Late-Gestation Losses From Cattle Cloned Embryos” Biol
Reprod, 66, 6-13.
Hill, J.R., Roussel, A.J., Cibelli, J.B., Edwards, J.F., Hooper, N.L., Miller, M.W., Thompson,
J.A., Looney, C.R., Westhusin, M.E., Robl, J.M., Stice, S.L .1999. “Clinical And Pathologic
Features Of Cloned Transgenic Calves And Fetuses (13 Case Studies)” Theriogenology, 51,
1451–1465.
Hosseini, S.M., Moulavi F., Foruzanfar, M., Hajian,M., Abedi, P.,Rezazade-Valojerdi, M.,
Parivar, K., Shahverdi, A.H., . Nasr-Esfahani, M.H. 2008. “ Effect Of Donor Cell Type And
Gender On The Efficiency Of Ġn Vitro Sheep Somatic Cell Cloning ”, Small Ruminant
Research, 78,162–168.
106
Kasinathan, P., Knott, J.G., Wang, Z., Jerry, D.J., Robl, J.M. 2001. "Production Of Calves
From G1 Fibroblasts”, Nat Biotechnol, 19, 1176–1178.
Kato, Y., Tani, T., Sotomaru, Y., Kurokawa, K., Kato, J., Doguchi, H., Yasue, H., Tsunoda, Y.
1998. "Eight Calves Cloned From Somatic Cells Of As Single Adult”, Science, 282, 2095–
2098.
Kato, Y., Tani, T., Tsunoda, Y. 2000. " Cloning Of Calves From Various Somatic Cell Types
Of Male And Female Adult, Newborn And Fetal Cows”, J Reprod Fertil, 120, 231–237.
Katska, L., Bochenek, M., Kania, G., Rynska, B., Smorag, Z. 2002. "Flow Cytometric Cell
Cycle Analysis Of Somatic Cells Primary Cultures Established For Bovine Cloning”,
Theriogenology, 58, 1733-1744.
Keefer, C.L., Keyston, R., Lazaris, A., Bhatia, B., Begin, I., Bilodeau, A.S., Zhou,F.J., Kafidi,
N., Wang, B., Baldassarre, H., Karatzas, C.N. 2002. “Production Of Cloned Goats After
Nuclear Transfer Using Adult Somatic Cells ”, Biol. Reprod, 66, 199–203.
Koo, O.J., Hossein, M.S., Hong, S.G., Martinez-Conejero, J.A., Et Al. 2009. “Cell Cycle
Synchronization Of Canine Ear Fibroblasts For Somatic Cell Nuclear Transfer”, Zygote, 17,
37-43.
Kubota, C., Yamakuchi, H., Todoroki, J., Mizoshita, K., Tabara, N., Barber, M., Yang, X.
2000. "Six Cloned Calves Produced From Adult Fibroblast Cells After Long-Term Culture”,
Pnas 97, 990-995.
Kues, W.A., Carnwath, J.W., Paul, D., Niemann, H. 2002. “Cell Cycle Synchronization Of
Porcine Fetal Fibroblasts By Serum Deprivation Ġnitiates A Nonconventional Form Of
Apoptosis”, Cloning Stem Cells, 4, 231–243.
Lagutina, I., Lazzari, G., Duchı, R., Colleoni, S., Ponderato, N., Turini, P., Crotti, G., Galli, C.
2005. "Somatic Cell Nuclear Transfer Ġn Horses: Effect Of Oocyte Morphology, Embryo
Reconstruction Method And Donor Cell Type ”, Reproduction, 130 (4), 559-567.
Lan, G.C., Chang, Z.L., Luo., M.J., Jiang, Y.L., Han, D., Wu, Y.G. 2006. “Production Of
Cloned Goats By Nuclear Transfer Of Cumulus Cells And Long-Term Cultured Fetal
Fibroblast Cells Ġnto Abattoir-Derived Oocytes”, Mol. Reprod. Dev, 73, 834–840.
107
Leon-Quinto, T., Simon,M.A., Cadenas,R., Jones, J.,Martinez-Hernanez,M., Moreno, J. M.,
Vargas, A., Martinez, F., And Soria, B. 2009. “Developing Biological Resource Banks As A
Supporting Tool For Wildlife Reproduction And Conservation: The Iberian Lynx Bank As A
Model For Other Endangered Species ”, Anim. Reprod. Sci., 112(3–4), 347–361.
Lima-Neto J. F., Fernandes C. B., Alvarenga M. A., Golim M. A., Landim-Alvarenga F. C.
2010. Viability and cell cycle analysis of equine fibroblasts cultured in vitro. Cell Tissue Bank
11:261–268
Melican, D., Butler, R., Hawkins, N., Chen, L.H., Hayden, E., Destrempes,M., Williams, J.,
Lewis, T., Behboodi, E., Ziomek,C., Meade,H., Echelard,Y., Gavin. W.2005. “ Effect Of
Serum Concentration, Method Of Trypsinization And Fusion/Activation Utilizing Transfected
Fetal Cells To Generate Transgenic Dairy Goats By Somatic Cell Nuclear Transfer ” ,
Theriogenology, 63,1549–1563.
Ogura, A., Inoue, K., Ogonuki, N., Lee, J., Kohda, T., Ishio, F. 2002. “Phenotypic Effect Of
Somatic Cell Cloning Ġn The Mouse ”, Cloning Stem Cell, 4, 397-407.
Overbeeke, R., Steffens-Nakken, H., Vermes, I., Reutelingsperger, C., Hanen, C. 1998.
"Early Features Of Apoptosis Detected By Four Different Flow Cytometry Assays”,
Apoptosis, 3, 115.
Peng, X., Maruo, T., Matsuo, H., Takekida, S., Deguchi, J. 1998. “ Serum DeprivationĠnduced Apoptosis Ġn Cultured Porcine Granulosa Cells Ġs Characterized By Ġncreased
Expression Of P53 Protein, Fas Antigen And Fas Ligand And By Decreased Expression Of
Pcna”, Endocrinology, 45, 247–253.
Peura, T.T. 2001. “Serum Starvation Can Cause Excessive Dna Damage In Sheep Fetal
Fibroblasts” In: Program Of The 27th Annual Meeting Of The International Embryo Transfer
Society;; Omaha,. Abstract 285.
Peura, T.T., Hartwich, K.M., Hamilton, H.M., Walker, S.K. 2003. “No Differences Ġn Sheep
Somatic Cell Nuclear Transfer Outcomes Using Serum-Starved Or Actively Growing Donor
Granulosa Cells”, Reprod Fertil Dev.,15(3), 157-65.
108
Polejaeva, I.A., Campbell, K.H. 2000. "New Advances Ġn Somatic Cell Nuclear
Transfer:Application Ġn Transgenesis”, Theriogenology, 53,117-126.
Ren Y., Wu, H., Ma,Y., Yuan,J., Liang,H., Liu,D. 2014. “ Potential Of Adipose-Derived
Mesenchymal Stem Cells And Skeletal Muscle-Derived Satellite Cells For Somatic Cell
Nuclear Transfer Mediated Transgenesis Ġn Arbas Cashmere Goats”, Plos One, 9(4)
E93583.
Renard, J.P., Zhou, Q., Lebourhis, D., Chavatte-Palmer, P., Hue, I., Heyman, Y., Vignon, X.
2002. “ Nuclear Transfer Technologies: Between Successes And Doubts”, Theriogenology,
57, 203–222.
Rieger, A.M., Hall, B.E., Luong, L.T., Schang, L.M., Barreda, D.R. 2010. "Conventional
Apoptosis Assays Using Propidium Ġodide Generate A Significant Number Of False Positives
That Prevent Accurate Assessment Of Cell Death " J Immunol Methods, 358, 81-92.
Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. 2011. " Modified Annexin
V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment Of Cell Death ”, Journal Of
Visualized Experiments, 50, 2597, doi: 10.3791/2597..
Ryder, O. A. 2002. “ Cloning Advances And Challenges For Conservation” Trends
Biotechnol. 20, 231–232.
Schippers, K.J., Martens, D.E., Pomponi, S.A., Wijffels, H.R. 2011." Cell Cycle Analysis Of
Primary Sponge Cell Cultures” In Vitro Cell.Dev.Biol Animal, 47, 302–311.
Selokar, N.L., Saini, M., Muzaffer, M., Krishnakanth, G.,Saha, A.P., Chauhan, M.S., Manik,
R., Palta, P., Madan, P., Singla, S.K.2012. " Roscovitine Treatment Improves
Synchronization Of Donor Cell Cycle Ġn G0/G1 Stage And In Vitro Development Of
Handmade Cloned Buffalo (Bubalus Bubalis) Embryos”, Cellular Reprogrammıng, 14 (2),
146-154.
109
Shi, D., Lu, F., Wei, Y., Cui, K., Yang, S., Wei, J., Liu, Q. 2007. " Buffalos (Bubalus Bubalis)
Cloned By Nuclear Transfer Of Somatic Cells. ”, Bıology Of Reproductıon 77, 285–291.
Shiga, K., Fujita, T., Hirose, K., Sasae, Y., Nagai, T. 1999. “Production Of Calves By
Transfer Of Nuclei From Cultured Somatic Cells Obtained From Japanese Black Bulls”,
Theriogenology, 52,527–535.
Shynkar, V.V., Klymchenko, A.S., Kunzelmann, C., Duportail, G., Muller, C.D., Demchenko,
A.P., Freyssinet, J.M., Mely, Y. 2007. " Fluorescent Biomembrane Probe For Ratiometric
Detection Of Apoptosis” , J Am Chem Soc., 129 (7), 2187-2193.
Smith, L. C., Bordignon, V., Babkine, M., Fecteau, G., And Keefer, C. 2000. “Benefits And
Problems With Cloning Animals”, Can. Vet. J., 4, 919–924.
Solter, D. 2000. “Mammalian Cloning:Advances And Limitations”, Nat Rev Genet, 1,199-207.
Sun, X.Z, Wang ,S.H., Zhang , Y.H, Wang, H.P, Wang, L.L., Ying , L., Li, R., Li, N. 2008."
Cell-Cycle Synchronization Of Fibroblasts Derived From Transgenic Cloned Cattle Ear Skin:
Effects Of Serum Starvation, Roscovitine And Contact Ġnhibition”, Zygote 16, 111–116.
Urakawa, M., Ideta, A., Sawada, T., Aoyagi, Y. 2004. " Examination Of Modified Cell
Synchronization Method And Bovine Nuclear Transfer Using Synchronized Early G1 Phase
Fibroblastcells”, Theriogenology, 62, 714–728.
Vignon, X., Chesne, P., Le Bourhis, D., Flechon, J.E., Heyman, Y., Renard, J.P. 1998.
"Developmental Potential Of Bovine Embryos Reconstructed From Enucleated Matured
Oocytes Fused With Cultured Somatic Cells”, C.R. Acad. Sci. Iıı, 321(9), 735–745.
Wani, N. A., Wernery, U., Hassan, F. A. H., Wernery, R., And Skidmore, J. A. 2010.
“Production Of The First Cloned Camel By Somatic Cell Nuclear Transfer” , Biol. Reprod.,
82, 373–379.
Wells, D.N., Misica, P.M., Mcmillan, W.H., Tervit, H.R. 1998a. “ Production Of Cloned Bovine
Fetuses Following Nuclear Transfer With Cells From A Fetal Fibroblast Cell Line”,
Theriogenology, 49,330.
110
Wells, D. N. A., Misica, P. M., Tervit, H. R., And Vivanco, W. H. 1998b. “ Adult Somatic Cell
Nt Ġn Used To Preserve The Last Surviving Cow Of Enderby Island Cattle Breed”, Reprod.
Fertil. Dev. 10, 369–378.
Wells, D.N.,
Misica, P.M, Tervit, H.R. 1999. "
Production Of Cloned Calves Following
Nuclear Transfer With Cultured Adult Mural Granulosa Cells”, Bıology Of Reproductıon 60,
996–1005.
Wilmut, I., Schnieke, A.E., Mcwhir, J., Kind, A.J., Campbell, K.H .1997. “ Viable Offspring
Derived From Fetal And Adult Mammalian Cells” Nature, 385, 810–813.
Xue L, Cheng L, Su G, Kang F, Wu X, Bai C, Zhang L, Li G-P 2011. “ Nuclear Transfer
Procedures Ġn The Ovine Can Ġnduce Early Embryo Fragmentation And Compromise
Cloned Embryo Development”, Animal Reproduction Science, 126,179– 186.
Yu,Y.S, Sun,X.S, Jiang, H.N, Han, Y., Zhao, C.B., Tan,J.H. 2003. “Studies Of The Cell Cycle
Of Ġn Vitro Cultured Skin Fibroblast Ġn Goat:Work Ġn Progress” , Theriogenology,1277-1289.
Zhou, Z.R., Zhong, B.S, Jia, Y.J., Wan Y.J., Zhang,Y.L., Fan,Y.X., Wang,L.Z., You,J.H.,
Wang,Z.Y., Wang,F. 2013. “Production Of Myostatin-Targeted Goat By Nuclear Transfer
From Cultured Adult Somatic Cells ” , Theriogenology, 79(2), 225-233
111