IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: [email protected] Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008 Amaç • Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma • Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma • Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme Sunu Akışı • Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet Sunu Akışı • Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet İn Vitro Araştırma Laboratuarı • • • • Nasıl kurulur? Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK Profesyonel destek Personel; biyolog, teknisyen, asistan İn vitro yöntemler nerede kullanılır? • İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi; – Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs. – Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL – Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu • İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi – Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs – Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır? • Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs • Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite • Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue • Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot • Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR • Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya • Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’) Sunu Akışı • Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA) (Substrat) (‘enzime bağlı secondary ab’) (‘detecting ab’) (Nümune) (‘capture ab’) ELİSA ImmunoSito/Histokimya Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi ‘Blotting’ (leke) • Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans) • Western blot; protein antibody ile • Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile • Southwestern blot: DNA bağlı protein • Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot Western Blot (Immunoblot) •Doku homojenatı/ekstraktı, hücre •Spesifik proteini, düzeyini belirlemek Polymerase Chain Reaction (PCR) Microarray (Mikrodizi) • DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays • Protein mikroarray • Tissue mikroarray • Transfection mikroarray (hücre microarray) • Kimyasal bileşik mikroarray • Antibody mikroarray • Gene Chip Analizleri DNA Mikroarray •Gen/genom chip, DNA chip, gen array •Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu •Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı kullanırlar. Genomic •Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması •Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans) tespitine dayalı çalışmalar Proteomic •‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır • Genel olarak protein çalışmaları (yapı ve fonksiyonları) • ‘Proteome’; ‘protein’ ve ‘genome’ dan oluşur. •Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler Small Interfering RNA (siRNA) •‘short interfering RNA’ veya ‘silencing RNA’ • Spesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur. • siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down) kullanılabilir Flow Cytometry • DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs) • Apopitozis çalışmalarında • Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları) • Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs) • Kromozom analiz ve tespitinde • RNA çalışmalarında • Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/ support/training/online/ITF/index.shtml Akım Sitometri (Flow Cytometry) •Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir •Çevredeki detektörler ışığın kırılma yönü, yaydığı floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır Hücre Siklüs Ölçümü Sunu Akışı • Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet Hücre Kültürleri • İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları • Uygun çalışma modeli • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, β2agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs Hücre Dizileri (‘Cell line’) • Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40); – BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri) – 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri) • Kanserleşmiş hücreler kullanılır – A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri) NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection • DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine • Tek katman (‘monolayer’) oluşturur A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri) (Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400) Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4μm) Hücre Canlılığı - MTT SF FCS %10 5 10 50 100 200 400 Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml) 24 saat 2.0 Optik Dansite DEP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi ***p<0.0001 - 0μg/ml DEP 1.5 * * 1.0 * 0.5 * 48 saat * * 1.5 * * * 1.0 0.5 (%10) 72 saat 1.5 * 1.0 * * 0.5 (%10) 50 10 0 20 0 40 0 10 00 20 00 5 10 0 50 10 0 20 0 40 0 10 00 20 00 10 0 5 Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml) FC S 0.0 0.0 FC S Optik Dansite * Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) 2.0 Optik Dansite 2.0 50 10 0 20 0 40 0 10 00 20 00 (%10) 5 10 0 FC S 0.0 Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) DEP (10-1000μg/ml) ile 72s İnkübasyonun A549’dan Sitokin Salınımına Etkisi 15 5000 3000 2000 1000 * 10 5 Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) 10 00 40 0 20 0 10 0 50 10 0 Se ru m 40 0 20 0 10 0 50 10 0 0 0 Se ru m IL-8 (pg/ml) GM-CSF (pg/ml) * 4000 Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi 100 Serum Free 800 600 Number 400 *** DEP (10μg/ml) FCS (10%) SF 200 75 ** 50 0 Percent of cells 1000 G0G1 G2M S-Phase 0 50 100 150 200 Channels (FL2-H) *** *** 25 250 ** * 0 G0/1 S G2/M Cell cycle compartments Bayram H et al, Eur Respir J 2006 DEP (10μg/ml)’nin A549 hücre apoptozisine etkisi Hücrelerin %'si 100 * SF ** 70 FCS(10%) SF DEP (10μg/ml) 40 30 20 * * *P<0.05 and **P<0.005 vs SF 10 0 LL(A-/P-) LR(A+/P-) UR(A+/P+) UL(A-/P+) Kuadrantlar Bayram H et al, Eur Respir J 2006 DEP’nin A549 hücre p21CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi p21 (% of βactin) 150 DEP (μg/ml) 0 100 1 10 10% FCS p21CIP1/WAF1 β-actin * 50 ** 0 10% FCS 0 1 10 *P<0.05 and **P<0.01 vs 0μg/ml DEP p21 mRNA (% GAPDH) DEP (10μg/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi 400 *P<0.05 vs SF 300 * 200 100 0 0 1 DEP(μg/ml) 10 Sunu Akışı • Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet Primer Hücreler-Avantajlar • İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler Primer Hücre Kültürü- Dezavantajlar • Elde edilmeleri daha zor • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar • Etik sorunlar Doku - Hücre Kaynağı • Cerrahi eksplant – Pnömonektomi, Lobektomi – Transplant akciğeri • • • • • Biyopsi Fırçalama (epitel hücreler) Enzimatik digestion, Disseksiyon Hazır, ticari olarak Akciğerin Primer Hücre Kültürleri • • • • Düz kas hücreleri Fibroblast kültürleri Alveolar epitel hücreleri Bronş epitel hücreleri Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri • Fırçalama, • Enzimatik digestion, • Disseksiyon Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu Kültür Vasatı • ‘Medium 199’ – – – – – – – Foetal bovine serum (2.5ml) 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 μg/ml) 1ml human transferrin (2.5 μg/ml) 1ml epidermal growth factor (20μg/ml) 1ml hydrocortisone (0.36 μg/ml) 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon • 100ml tamamlanır ve 0.2μm por çap filtreden geçirilir Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon ‘Primaria®’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45μm por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı 24-Kuyucuklu Plate 1. Hafta 3. Hafta (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300) Hücrelerin DEP ile İnkübasyon Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998. Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/μg selüler protein 1000 (log.) Non-ast. p<0.05 100 Ast. p<0.003 p<0.002 10 1 0,1 0,01 YK IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998. İn vitro Ozon –NO2 Maruziyet Düzeneği %5 CO2 İn Air NO2 Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği Ozon ve NO2’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronş epitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002. Sunu Akışı • Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? • Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet Özet • Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı • İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda kullanılabilirler • Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri yapılabilir • Solunum yolu hücrelerinin – Fizyolojik – Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi – Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında kullanılabilir Yorum • Bütün dünyada yaygın olarak kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız Sabrınız İçin Teşekkür Ederim