Slayt 1 - İstanbul Tıp Fakültesi

X-ışını Tarihsel Süreç
• Kristal yapı analizi
•
X-Işınlarının keşfi
•
1895 Wilhelm Conrad Röntgen
•
Nobel fizik ödülü 1901 Nature 53, 274 (1896)
• X-Işınlarının difraksiyonu (kırınımı)
•
1912 Max Theodor Felix von Laue
•
Nobel fizik ödülü 1914
•
Sitzungsber. Bayer. Akad. Wiss. Munchen p. 303 (1912)
• Yapı belirlenmesi
•
1913 William Henry Bragg & William Lawrence Bragg
•
Nobel fizik ödülü (1915) Proc. Roy. Soc. A89, 248 (1913)
X-ışını kristalografisi biyolojik uygulamaları
• 1950 yılında DNA’nın çift sarmal yapısının X-ışınlarıyla Watson ve
Crick tarafından aydınlatılması, replikasyonunun anlaşılması ile
ilgili çalışmalara büyük katkı sağladı.
• 1960 yılında Kendrew ve Perutz miyoglobin ve hemoglobinin 3D
yapılarını çözerek, ilk kez proteinlerin mimari yapılarındaki
karmaşıklığı ortaya koydular, orak hücreli anemisinin moleküler
temeline de ışık tutarak büyük bir başarı elde ettiler.
• Proteinler, enzimler, DNA kompleksleri ve virüsler gibi çok büyük
biyolojik moleküllerin yapısı X-ışını kırınımı (XRD) yöntemi
kullanılarak aydınlatıldı.
Teknoloji ve makromolekül yapı analizleri
• Son dönemde kristalografik yapı hesabının etkinliğini dramatik
olarak artması, sinkrotron radyasyon kaynaklarının gelişimi,
alan detektörlü veri toplama cihazları, krayo- kristalografinin
gelişimi (80-120 K de veri toplama), kristal yükleme ve veri
toplamada robotik sistemlerin kullanılması faz belirlemede yeni
yaklaşımlar veri işleme, yapı çözümü ve arıtımında kullanılan
ilgisayar yazılımlarının geliştirilmesi ile mümkün olmuştur. Son
yıllarda, çeşitli protein-ligant, enzim-inhibitör komplekslerini de
içeren farklı yapılar atomaltı çözünürlükte (0.85Å) çalışılmıştır.
Bu çalışmalar, ko-faktör tanımlama ve inhibitör bağlama gibi
enzimatik etkinliğin tanımlanmasında yapısal özelliklerin
içyüzünün aydınlatılmasında yeni katkılar sağlamıştır.
3D analizleri
•
•
•
•
Kristaloğrafi
Kistaloğrafi büyük proteinler
çalışılabilir
Kırıstal yapı gerekli
Fazla protein (~10 mg)
gerekli
Sıvı ortamda, hareketli
proteinler çalışılmaz
•
•
•
•
NMR
Daha küçük proteinler (~30
kDa) çalışılır
Büyük proteinler parça
parça rekombinant üretilir
Sıvı içersinde hareketli
proteinler çalışılabilir
Daha az proteinle
çalışılabilir
Proteinlerin veri bankaları
• Protein veri bankasında (PDB) yaklaşık 70.000
kristal yapı depolanmıştır. Protein veri
bankasındaki üç boyutlu makromoleküler
yapılara ait verilerin çoğunluğu üç yöntemle
elde edilmiştir.
• X-ışınları kristalografisi (∼%86)
• Nükleer manyetik rezonans (∼ %13)
• Elektron mikroskobu (∼%0.4)
ribozom
tRNA
filament
mRNA
Yaşam olaylarını moleküler düzeyde
inceleyeceğiz.
Yaşam nedir?
Denge
Yaşam ortamı: Su, proteinler, lipidler, karbonhidratlar ve nükleik
asitleri
ve bunlar arasındaki madde & enerji
alışverişini öğrendiniz.
Bu ilişkiler bilgi varlığında yönlenirse YAŞAM.
Düzen  Canlı hücre organizedir.
BESLENME + ÇOĞALMA + KORUNMA(GÜVENLİK)
Enerji
DNA sentezi
Destek ortam ve immünite
Biyolojik sistemler yaşamlarını sürdürebilmek için kendilerine özgü yapıları oluşturmak,
yenilemek ve bunlar için gerekli enerjiyi depolayıp gereğinde kullanmak ve türünün devamını
sağlamak için çoğalmak zorundadır.
Gerekli olan bilgiye KALITSAL BİLGİ denir.
ds DNA’nın Özellikleri:
-İplikler anti paralel.
normal
patolojik
-Bir biri etrafına sarılıp çift heliks oluşturur (B-heliz  Z helix)
-Bazlar içte (hidrofobi)
-A=T , G≡C non polar iç kısımda stabil.
-İnsanda 14-73 mm/hücre, E.colide 1.6mm/hücre total uzunlukta
-Her baz çifti 0,34 nm ve her dönü 3,4 nm (10bp), her bp için 36oC
(hem EUK hem PRO’da aynı &süper helix oluşturmalı)
-Çap 2 nm
-2 oyuk tipi içerir 2,2 ve 1,2 nm’lik major ve minor oyuklar bp’lerin dışa açılan pencereleridir.
-Melting Point (çözülme noktası) 85 oC’dır. GlC içeriği ile artar
-Bouyant yoğunluğu (yüzme yağ)=1,66 ±0,098 (G+C rich için)
-Ağırlığı her bp için ~618 D. (anyon formda)
Replikasyon
Transkripsiyon
Translasyon
DNA RNA Protein
Moleküler Biyolojinin
SANTRAL DOGMA’sı
DNA
Genm
KAYIT
TERCÜME
İnsan genomundaki 3 milyar harf
24 000 gen’i ile milyonlarca
protein’i şifreliyor
b
Gend
Genz
Genx
DNA Çeşitleri:
EUKaryot
-Bakteri DNA’sının 102-105 katı
-Proteinlerle örtülü (Paketlenmiş)
interfazda DNA-Protein komp.
=KROMATİN
Eukromatin aktif (az yoğun)
Heterokromatin inaktif (yoğun)
PROkaryot
-DNA’sı ufak (Ecoli=3.103.D)
-Bir yerden membrana bağlı
-Histon benzeri proteinlerle kaplı (+yüklü AMİNler değil)
-Ekstra kromozal nitelikte DNA’lara sahip
PLASMİD Antibiyotik
EPİZOM Cinsiyet Faktörü
COL.FAKT. Diğer bakteri türlerini yok eden
-Ünik diziler halinde
(Her genden tek kopya)
-IVS içermez
REPLİKASYON ÇATALLARI
5’ 3’
Ana DNA
Replikasyon orjinleri
Pol
3’ 5’
5’ 3’
DNA Topoizomerazlar: Sadece dönü sayıları farklı DNA’lar “Tapolojik olarak
izomer”dirler yada “TOPOİZOMER” dirler. Bu DNA’lar bir yada her iki ipliğinde bir kesik
(çentik) oluşturularak yek diğerine çevrilebilirler. Bu çentiğin yapılıp tekrar onarılmasını
gerçekleyen enzimlere TOPOİZOMERAZ’lar denir.
Topoizomerazlar DNA’nın 2. yapısını (konformasyonunu-topolojisini) düzenliyorlar ve
DNA ile ilgili her reaksiyonda rol alıyorlar: Replikasyon, transkripsiyon, paketleme. v.b..
RNA Çeşitleri:
rRNA  Rib Protein sentezi
%80
tRNA  AA ile aktive  Protein sentezi
%15
mRNA  DNA’dan bilgiyi  Protein sentezi
%5
sn RNA RNA’nın kırpılması ( SPLICING) U1 6  Viruslar
Primer RNA
DNA replikasyonunda
ATP
Enerji Akçesi (Yüksek E ↑ bağ)
Coenzim A
Metabolik Yolun Anahtar enzimi
75 RNA
Prot.Salgılama Kompleksi bileşeni
M RNA
RNase P’nin katalitik birimi
Telomeraz RNA Telomer Sentezinin kalıbı
Acaba yaşam RNA DÜNYASINDA’mı başladı?
mRNA
•
•
•
•
•
•
Hücre RNA’sının %5’i dir.
Prokaryot mRNA ya göre ökaryot mRNA daha uzun ömürlüdür.
Tek sistronlu
Ribonukleoprotein yapılarını oluşturur.
3’ poly-A taşır.(Histonlar hariç)
Ökaryot mRNA çekirdek içerisinde heterojen RNA olarak
sentezlenir.(hnRNA)
• hnRNA kırpılır, proteinlerle etkileşerek sitoplazmaya geçer. Bu
aşamada poli-A’nın rolü vardır.
mRNA
• Ökaryot mRNA’ların 5’ ucunda genellikle 7-metil guanizin
grubunun 5’- 5’ pirofosfat bağlantısıyla ikinci bir metillenmiş
purin nükleotidine bağlanması. Kapsül (şapka) yapısı ortaya
çıkar.
• Kapsül mRNA’yı nükleaz enzimlerine karşı korur.
• Protein sentezinin başlamasında ve yönlendirilmesinde rol alır.
• Ökaryotarda kapsül yapısı ile başlangıç kodonu AUG arasındaki
uzaklık değişkendir.
• Kapsül çıkarıldığında protein sentezi durur ve mRNA yıkılır.
Bilinen ökaryotik RNA’lara yenileri eklendi.
• Primer transkript (ribozim): RNA kırpılmasından önce mRNA, rRNA
veya tRNA öncülü görevi yapar.
• Küçük nüklear RNA (snRNA): Splaysozomlarda (pre-mRNA’nın
kesilmesinde rol alan protein-RNA kompleksi) yapısal ve katalitik
görev alır.
• SRP RNA: Sinyal tanıma partikülünün (SRP) bir bileşenidir.
• Küçük nükleolar RNA (snoRNA): Nükleolusta ribozom alt birimi
sentezi için pre- rRNA transkriptlerinin işlenmesinde görevli.
• Küçük interferans RNA (siRNA): Genlerin ifade olmasının
(ekspresyonun) düzenlenmesi.
• Mikro RNA (miRNA): Genlerin ifade olmasının (ekspresyonun)
düzenlenmesi.
RNA Polimerazın tanıdığı
Varsayılan diziler
DNA kalıp
(Kodlayan) ipliği
DNA kalıp
(Kodlayan) ipliği
X= herhangi bir
nükleotit
PROTEİN SENTEZİ
Başlama kodonu, AUG
Küçük
ribozomal
alt eleman
Büyük
ribozomal
alt eleman
Protein Sentezi (Translasyon) 4 Fazda Gerçekleşir:
I) AA aktivasyonu: Peptid bağı oluşumu ΔG =+3 kcal/mol (enerji gerektirir.)
AA-COO¯ ile tRNA 3´OH arasındaki oster bağı için ΔG = -7 kcal/mol.dır.
AA’lar tRNA’larına yüklenerek daha üst enerji durumuna getirilir.
II) Prot.Sent.Başlangıcı : Daima AUG (Met) ile başlar.
(Pro’da) N. Formyl - Met tRNA. (EUK’da)
Başlangıç tRNA Met “GTΨGC” yok. Prot zinciri NH2 COOH’a büyür.
III) Prot.Sent.Uzaması
: Rib. mRNA üzerinde 5
3´ kayar.
IV) Prot.Sent.Sonlanması: UAA,UGA,UAG’ye AA ve tRNA yok. Prot. ayrılır.
Met.hidroliz olur.
Bakteri Kromozomu
• İnsan kromozomu ile kıyaslandığında:
–
–
–
–
–
–
Tek sayıda,
Çift iplikli, sirküler DNA yapısındadır.
Haploid özellik gösterir.
Hücre içinde nükleoid şeklinde bulunur.
Sitoplazmadan nukleus membranı ile ayrılmaz.
Türler arası kromozom büyüklüğü değişir.
• En küçük M. genitalium (0,58 x 106 bp)
• En büyük E. coli (5 x 106 bp)
• Genomda birbiri ile ilişkili yapısal genler bir araya
gelerek (operonlar) bir düzen içinde yerleşir.
• Kromozom yapısı histonlar ile değil poliaminler (spermin,
spermidin) ile oluşturulur.
• Semi-konservatif şekilde replike olur.
– Kromozom üzerindeki spesifik OriC baz dizisinden başlar.
– Aşamalarında pek çok enzim görev yapar:
• Helikaz: çift sarmal DNA yapısını tek sarmala çevirir.
• Primaz: başlangıç için gerekli olan primeri (RNA molekülü)
sentezler.
• DNA bağımlı DNA polimerazlar: 5’
3’ DNA sentezini sağlar.
• Sentez sırasında her iki DNA dizisi kalıp olarak görev
yapar.
• İki zincirin zıt önde paralel yapıda olması nedeniyle replikasyon
aynı anda iki yönlü olarak gerçekleşemez.
– 5’ 3’ yönünde sentezlenen zincir kesintisiz (önden giden),
– 3’ 5’ yönünde sentezlenen zincir ise kesintili kısa parçalar
(okazaki segmentleri) halinde (arkadan gelen) sentezlenir.
– Kısa parçalar DNA ligaz ile bağlanır.
• Sentez sonrasında kromozom üç boyutlu yapısı topoizomeraz
(giraz) enzimi ile sağlanır.
PLAZMİTLER
•
•
•
•
•
•
Vazgeçilmez olmayan özellikleri kodlayan genleri taşır.
Bu genler selektif avantaj sağlayabilir.
Otonom olarak çoğalırlar.
Sirküler, çift zincirli DNA molekülüdür.
Genellikle 1500-500 x 103 bp büyüklüktedir.
Aynı hücrede birden fazla kopya ya da, birbirinden farklı olarak
bulunabilirler.
• Kromozoma integre olmaz. (epizom!!-F plazmit)
Klonlanma vektörlerin en önemli
öğesi olup, bakteri
stoplazmalarında bulunan ve
bakteri DNA’sından bağımsız olarak
kendini eşleyebilme, çoğaltabilme
özelliği taşıyan küçük dairesel çift
iplikli DNA molekülleridir.
Rekombinant DNA Teknolojisi :
Klonlama Tekniği)
(Gen
1) Gen İzolasyonu
a) - mRNA  cDNA
b) - GenomRest.Frag.Gen Kütüphanesi
2) Uygun Gen Taşıma Aracı (vektör)
a) - Plasmid’ler
b) - Virüs’lar ( DNA)
c) - Cosmid’ler (Plasmid +)
3) Genin Hücreye Sokulması
a) - Plasmid veya viruslarla
b) - Kimyasal Yönt. (DNA tuzaklama Ca-P)
c) - Fiziksel Yönt. (-injekt: 0.5 pipet)
d) - Füzyon (Lipozom,Eritrosit Hayaleti) ile
4) Geni İçeren Hücrenin Seçimi
a) - Antibiyotikler dirençlilik
b) - Bazı ilaçlar ( MTX ) dirençlilik
c) - Seçici ortamlar
Restriksiyon endonükleazları
Bakterilerde bulunur.
Bakterileri yabancı DNA’dan korur.
Çift zincir DNA’yı özgün 4-6 bazı tanıyarak kırar.
Polinduromik dizilerden yapışkan ve küt uçlar oluşturur.
Bakteri Yapay Kromozomu
(BAC) BAC vektörleri doğal olarak var olan büyük
bakteri plazmidi olan F-faktörü üzerine
kurulurlar. BAC vektörleri büyük DNA
firagmentlerini klonlamada ve özellikle büyük
genomların DNA dizilerinin eldesinde
kullanıhrlar.Farklı türlerden alınan 100,000 ila
200,000 baz büyüklüğünde DNA parçalarının
bakteride klonlanması ile olur. Klonlandığı
zaman hücre içinde birçok kopyası oluşur.
Maya Yapay Kromozomu (YAC)
• Bir kromozomun önemli öğeleri olan
telomerleri, sentromeri ve replikasyon
başlangıç noktasmı içerirler. Çok büyük DNA
(200-500 kb veya 12 Mb) fragmentlerini kabul
edebilir. Oldukça kararlıdır ve insan
genomunun haritalanmasmda, genomik
kütüphanelerin yapılmasında etkili bir şekilde
kullanılır.
Memeli Yapay Kromozomu (MAC)
• Memeli yapay kromozomları, kromozomların fonksiyonel
bölgelerini (sentromer, telomer, replikasyon orijini) taşıyan ve
hücreden bağımsız olarak çoğalabilen moleküllerdir.MAC
yüzlerce kb büyüklüğünde genomik DNA taşıyabilir. MAC
oluşumu en yakın örnek olan YAC'a göre çok daha zordur.
Çünkü memeli telomeri maya telomerinden 10-100 kat;
memeli sentromeri ise maya sentromerinden yaklaşık 1000
kat daha büyüktür. Memeli sentromer ve telomer dizilerinin
çok fazla sayıda tekrarlanması da memeli yapay kromozomu
oluşturulmasını zorlaştırır.
İnsan Yapay Kromozomu (HAC)
• HAC'lar, insan DNA dizileri, sentromer dizisi, telomer
dizisi ve DNA replikasyon noktasına sahip
olmalarından ve taşıma kapasitesinin diğer klonlama
vektörlerine nazaran daha yüksek olması nedeniyle,
gen tedavisi için avantajları olan bir vektördür. 6-10
megabaz büyüklüğündeki insan DNA'sini
taşıması;.nedeniyle, transferi, liposomlar veya
reseptörler aracılığı ile veya in vivo olarak
oluşturulabilir.
PCR&REAL TIME PCR
(POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU)
DNA nın kimyasal yapısı
1953
1866
.Bitkilerde kalıtımın
esasları
1957
1963
Kornberg: test tüpünde DNA.
Sanger :sekans prosüdürü.
1972
1966
Berg:ilk recombinat DNA molekülü.
Genetik kod
ilk konvansiyonel DNA bazlı deneyler
1980s
PCR
1990s
İlk gen tedavileri
Genetik gıda mühendisliği
‘Dolly’
2000
insan genomunun sekanslanması
PCR Reaksiyonu?
PCR reaksiyonunda üç temel basamak vardır ve
çoğaltılmış ürün miktarı, bu üç adımın
tekrarına bağlıdır.
1) Denatürasyon (90-95 °C)
2) Primer bağlanması (50-70 °C)
3) DNA sentezi (70-75 °C)
Bu üç adım bir PCR siklüsünü oluşturur
(Genetik Kavramlar S-515)
PCR da kullanılan malzemeler
1) Kalıp DNA
2) Reaction buffer (x 2,5 µl)
3) forward primer (x 0,5 µl)
4) reverse primer (x 0,5 µl)
5) dNTP (x 4 µl)
6) MgCl2 (x 2,5 µl)
7) Taq Polimraz (x 0,25 µl)
PCR’ın Sınırlamaları.
• Kısa ürünlerin elde edilmesi
• Kontaminasyona açık olma
• Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA
Polimerazin, yari ömrü 92.5°'de 130 dk; 95°C'de 40
dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olan
sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir.
• Ortamda Fenol kalıntılarının bulunması PCR ı inhibe
eder.
• Yüksek ısının mutasyon etkisi.
• Nükleotit ve primer azalması
• Şelat oluşumu.
Gerçek Zamanlı (Real-Time) PCR
Son yılllarda PCR reksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için
kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle
birleştirilmesi, real-time PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin
gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR’da ürünlerin analizi
reaksiyon
sırasında
yapılmaktadır.
Bu
nedenle,
agaroz
jel
elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi
gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR
ürünlerinin kalitatif ve kantitatif analizlerinde, diziye özgün olmayan
floresan
boyalardan
yararlanılmaktadır.
ya
da
diziye
özgün
problardan
Gerçek Zamanlı (Real-Time) PCR
Real-time PCR reaksiyon esnasında her bir PCR siklüsünde yeterli miktarda ürünün verdiği
floresans ışığa göre çalışıp reaksiyonu aşama aşama sonuna kadar oluşan ürünü kontrol
eden bir sistemdir. Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken izleme ve
miktar belirleme yöntemidir.
GERÇEK ZAMANLI PCR’da, PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler saptanmaya başladığı
anda değerlendirmeye alınır.
PCR’ın TEMEL FAZLARI
Exponential Faz
Linear Faz (yüksek farklılık)
Plateu Faz (End-point)
Floresan Prob Sistemleri
 Hidrolizasyon problar:TaqMan (PE Biosystem),
Beacons, Scorpions
 Hibridizasyon problar: Light Cycler (Roche)
 DNA’ya bağlanan boyalar: SYBR Green
SYBR Green
(çift zincirli DNA ya bağlanmakta)
Çift zincirli DNA ya bağlanmakta
 Çift zincirli DNA ya bağlandıkları sürece
floresan emisyonu olmakta
 Spesifik olmayan bağlanmalar
gerçekleşmekte
Yoğun optimizasyona ihtiyacı yok
TaqMan FRET (floresan rezonans enerji
transferi)
Fluorescent Resonant Energy Transfer
molecular beacons
real-time
A
Excitation
B
C
FRET
ANNEALING
Amplicon
Reporter
Non-fluorescent
Quencher
Yeni Prob Sistemleri
 Peptide nucleic acids (PNAs)
nükleikasit anologları (Tm 15)
Minor Groove Binding (MGB)
Locked Nucleic acid (LNA)
Oligonüklotid riboz anoloğları
“IN SITU” PCR
PCR ile, lam üzerine tespit edilen enfekte
hücrede bulunan mikroorganizmaya ait hedef
DNA’nın amplifikasyonu ve sonucun “in situ”
hibridizasyon ile gösterilmesidir.
Geri (“Revers”) Transkripsiyon PCR
• RNA-PCR olarak ta bilinen RT-PCR iki
aşamalı olup RNA’dan tamamlayıcı DNA
sentezi (geri transkripsiyon) ve
tamanlayıcı DNA (cDNA)’nın da
standart PCR yoluyla çoğaltılması
aşamalarını kapsar. RT-PCR tek aşamalı
bir reaksiyonla da gerçekleşebilir.
T.thermophilus DNA polimerazı gibi
bazı polimerazlar mangan varlığında
hem RNA hem de DNA kalıp ipliklerini
kullanabildiğinden tüm işlem aynı
tüpte tek aşamada yapılabilmektedir.
RT-PCR, mRNA veya viral RNA
miktarlarının belirlenmesi ile RNA
düzeyinde gen anlatımında oldukça
duyarlı bir yöntemdir.
PCR Kullanımı
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Onkogen araştırmaları
Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hasta tanısı
Prenantal tanı
Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması
Adli Tıp (DNA parmak izi, vb.)
Prob oluşturulması / klonlama / gen anlatımının araştırılması
Dizilemede
Bilinmeyen dizilerin tayininde
Geçmişten gelen DNA molekülünün incelenmesinde
RFLP analizinde (Restriction fragment lenght polymorphism)
Tüp bebek çalışmalarında
DNA-protein etkileşimlerinin araştırılmasında (footprinting)
• Bakterilere GEN AKTARMA
• Kalsiyum klorür ile muamele
• Ard arda dondurup çözdürme
• Kısa süre yüksek voltajda elektrik akımına maruz bırakma. Bu
yolla fonksiyonel insan genlerini taşıyan transgenik
bakteri, hayvan ve bitki üretilebilmektedir.
• Tıp alanında hastalıkların tedavisi ve aşı
çalışmalarında birçok insan ve virüs gen ürünü
bakterilere sentez ettirilebilir.
Escherichia coli
• Glukoz
Laktoz, maltoz…
• Amino asitler
Aminoasit sentezi
lac operonu
• lacZ
• lacY
• lacA
β-galaktozidaz
permeaz
transasetilaz
Retrovirus
• ssRNA genom
• RT
Retrovirüs Genomu
yapısal genleri
~10kb
Poliadenilasyon sinyali
Paketleme sinyali
Promoter
Gag - internal kapsid yapısal proteinleri
Pol - RTaz, integraz, proteaz
Env – zarf “envelope” proteinleri
Hedef Gen
Paketleme Sinyali
Seçici
Marker
RNA i
•
•
•
•
•
•
•
RNA i, çift sarmal RNA’nın eşleniği olan baz dizilişine sahip
genleri baskılaması veya tamamen aktivitesini engellemesidir.
RNA i teknolojisi ile bir hücredeki herhangi bir proteinin üretimi
spesifik olarak engellenebilmektedir.
Bu durum özellikle bu proteinden yoksun mutantların
üretilemediği durumlar için oldukça kullanışlı eşsiz bir
yöntemdir.
Protein kodlamayan genom bölgelerin (intronların) gereksiz
DNA parçaları olduğu düşünülüyordu. Artık bu tür DNA’nın
çoğunun RNA i elementlerini kodladığı anlaşılmıştır.
Her bir küçük RNA i dizisi sadece bir geni değil, dizi benzerliğine
sahip bir grup geni bile baskılayabilmektedir.
Bu küçük RNA’ların ekspresyonu her bir genin ekspresyonuna
göre bir hücrenin gelişimini sürdürmesinde çok daha önemli
roller oynayabilir.
Şu anda tüm bu sürecin nasıl işlediği aydınlatılmaya
çalışılmaktadır.
Anormal genlerden
dsRNA’ lar
Çoğalan virus’un
dsRNA’ ları
DİCER
GENOM’UN SANSÜRÜ
Hayvan ve bitki hücre_
lerinde yeni farkedilen
BİR GEN SUSTURMA
( RNAi ) Mekanizması.
Dicer
RNA’ yı
Kıyar
Düzenleyici
dsRNA’ lar
C
Lipid Vektörlerle sokulan
Yapay dsRNA’ lar
DİCER
siRNA veya
microRNA
RNAi GEN EXP.
Nasıl Baskılar
Tek iplikli
siRNA veya
microRNA
RNA’nı uyardıgı
Susturucu Kompleks
RISC
Herhangi bir tehditkar gen
ekspres edildiğinde hücre,
RNAi mekanızmasıyla,
diğer mesajlara hiç zarar
vermeden sadece kötü
amaçlı mRNA’ yı Tutuklu_
yor veya yok ediyor
Eğer iki RNA ipliği tam
Komplementer ise mRNA
parçalanır
RNA parçaları
PROTEİN
YAPILMAZ
Hücre
RNA iplik_
lerini Açar
mRNA
Uyumsuz RNA
İki iplik uyumsuz ise
RISC Ribozoma
Yapışık kalır
e
TERS TRANSKRİPSİYON
- İlk defa RNA Tümör virüslerinde gözlendi
Nükleoproteinden ibaret virion, glikoprıtein
Zar ile çevrili
- DNA sentez inhibitörleri (MTX, Act.D.) nin RSV infeksiyonunu durdurması
(DNA sent, virüs oluşumunu inhibe ederler.)
Baltimor Rtase izole etti
viruslarden & eş zamanlı olarak)
?(Provirus hipotezi)
- Reverse Transcriptase (ters transkriptaz) Rtase :
50-70 molekül/virus, Polimerleme & Rnase H (Hibrit RNA’yı parçalama)
aktivitesi,
Primer gerektirir. Polimerleme 5' 3', substratı dNTP’ler, MW  150
kDa,
2 alt birimli, işlevi  ( (RNA  DNA)
(hibrit (melez) RNA yıkımı (hidrolizi))  (DNADNA) )
Provirus Hipotezi:
RNA Tümör V. DNA pro V.  RNA Tümör V.
Bu hipotezi için bilgiyi RNA  DNA kaydeden enzim gerekli.
Rtase
Viral RNA
(+)
Rtase
(RNaseII)
RNA-DNA
Melezi
Rtase
ss DNA
ds DNA
(viral)(-)
(viral)(±)
Proteinlerin canlılık özelliği varmıdır?
DOĞAL
İyonlayıcı Radyasyon
,,δ,x ışınları
UV ışınları (T=T)
Viruslar
Tautomerik kaymalar
DENEYSEL
HNO2 (CU)
Hidroksilamin
Akridin Türevi Boya
Baz Analogları
İn vitro mutagenez
GENERİK
Sex hücrelerindeki
mut. sonraki
kuşaklar etkilenir
üro-genital bölge
korunmalı.
SOMATİK
Vücut
hücrelerindeki
mut. (örn.lenfosit)
sadece bireyin
yaşamı etkilenir.
OLUŞMA MEKANİZMASINA GÖRE
NOKTA MUT.
TEK BAZ
DEĞİŞİKLİĞİ
..UUUAAA..

..UUAAAA..
HbS, HbC
Hb Const.Spring
P21
SONUÇTAKİ SÖZCÜKLERİN ANLAMINA GÖRE
EKLEME veya
(KAYMA)
EŞ
ANLAMLI
YANLIŞ
ANLAMLI
ANLAMSIZ
.UUUAAA
EKLEME 
.UUUAUAA..
 EKSİLME
UAUAA
Hb Wayne
Hb Tours
CGU
CGC
CGG
AGA
AGG
ARGINİN
ARG
GLİSİN
GLY
UGA
SON
YOL AÇTIKLARI DURUMA GÖRE
KAPALI
OLUMSUZ
ETKİLİ
ÖLÜMCÜL
EŞ ANLAMLI
VE YANLIŞ
ANLAMLI
(BENZEN)
YANLIŞ
ANLAMLI
(FARKLI A)
ANLAMSIZ
HbS
AGAAGG
HbC
AGAAAA
ARGLYS
EKLEME
EKSİLME
O2
Oksitlenmiş
Harf
Serb.Radikal
Hardal gazı
G---G Çaprazları
X, γ, pH
sigara
Zincir Kırıkları
UV
T—T dimerleri
NO2
DOĞAL DNA
Harf Değişikliği
HASARLI DNA
Lezyon
Baz kopması (Eksilme)
İplik koparılması
&
Baz değişikliği
Yanlış baz
C U, A HipoXant
Sebep
Isı & pH memelilerde 104 baz/gün
Iyonize Radyasyon & Alkileyici
Ajanlar (Nitrosoaminler vd.)
Spontan deaminasyon, Nitrit,
Nitrat vd.
Ekleme & Eksilme
İntercalat ajanlar (acridintürevi
boyalar vd.)
Cydobutan dimerler
(T=T, C=T vd.)
UV ışınlar
Kroslinkerler
çapraz bağlar
(G/G)
Kimyasallar (Hardal Gazı)
Bleomisin vd. Işıkla aktifleşen
psoralen türevleri
Kimya Endüstrisi : Hidrokarbonlar, toz
Metalurji Endüstrisi : HF, toz
Termik Santraller : SO2, duman (zifir)
Trafik
: SO2, CO, Pb, HC, Ozon (siyanürden 10x zehirli)
SERA ETKİSİ
ASİT YAĞMURLARI
(CO2, CO, CH4)
(Zehirli gazlar soğuk(H2O)
hava ile karşılaşınca
OZON SORUNU
10-250 nm normalde
dünyaya ulaşamaz
Klor flora Karbon spreyi
Sıcaklık artar
pH artar
Eksilme mutasyonu
Nokta mutasyonu
Eksilme mutasyonu
Uvc artar.
-Timin dimerleri
-Çekirdek (DNA) hasarı
-Protein hasarı
Mutasyon Analiz Yöntemleri
•Direk Mutasyon Analiz Yöntemleri
Mutasyon analizi, çeşitli doku ve hücrelerden elde edilen
DNA ve RNA molekülleri üzerinde, genlerin yapısı ve
genlere bağlı bozuklukların mutasyonlarla ilişkisini
anlamak amacıyla yapılan tüm moleküler uygulamaları
kapsar.
Mutasyon analizinin birinci aşaması olan DNA izolasyonu
için çok farklı teknikler geliştirilmiş olmakla birlikte
genelde ucuz ve toksik kimyasallar içermemesi nedeniyle
Miller'ün tuzla çöktürme yöntemi kullanılır. Mutasyon
tespitinde kullanılacak yöntemin seçiminde, hastalık ile
ilgili mutasyon / mutasyonlann bilinip bilinmemesi
önemli rol oynar.
Bilinen mutasyonlann araştırılmasında direkt analiz
yöntemleri kullanılır. Eğer hastalıkla ilgili gen biliniyor
ve aynı hastalığın ortaya çıkmasında değişik
mutasyonlar rol oynuyorsa, mutasyon tarama
yöntemleri kullanılır (Direkt mutasyon tespiti).
Hastalığa neden olan gen ve mutasyonlann kesin
olarak bilinmediği durumlarda ise, hastalığın
görüldüğü aile bireylerine ait DNA örneklerinde,
şüpheli aday gen içinde veya yakınında polimorfizm
gösteren referans noktası / noktalar analiz edilerek
hastalıktan sorumlu gen veya kromozom tespit
edilmeye çalışılır (İndirekt mutasyon tespiti).
Hibridasyon Yöntemleri
Amaca yönelik olarak seçilmiş olan herhangi bir DNA
fragmanının, kendisine komplementer olacak şekilde
hazırlanmış radyoaktif ve/veya floresans boyalarla
işaretli problar ile birleşmesine hibridizasyon denir.
Farklı amaçlara yönelik olarak hazırlanmış değişik
hibridizasyon yöntemleri bulunmakla birlikte, temel
olarak; Southern (DNA), Northern (RNA) ve Western
(protein) blot olarak tanımlanan hibridizasyon
teknikleri bulunur. Elektro blot, dot blot, slot blot gibi
isimler alan, protein ve DNA transfer teknikleride
vardır.
•Western Blot Tekniği
Western blot tekniği, santral doğma görüşüne göre; DNA'dan
proteine doğru gerçekleşen genetik bilgi akışının son durağı olan
proteinlerin tespit edilmesine dayanan bir tekniktir. Bu teknik
kapsamında en dikkat çekici basamak, proteinlerin güçlü antijenik
özellikleri dikkate alınarak söz konusu proteine karşı hazırlanan özgül
monoklonal veya poliklonal antikorların kullanılmasıdır. Tek bir
antijenik determinant'a (antikor ile etkileşen proteinin belli bir bölgesi
yada grubu) karşı bile hazırlanabilen monoklonal antikorlar, diğer
blotlama tekniklerinde kullanılan radyoaktif probların yerine
kullanılan moleküllerdir.
DİZİLEME
Dizileme İçin Gerekli Olan Teknikler
• Restriksiyon Enzimleri – DNA’yı parçalara ayırmada
• Klonlama – DNA’yı 2-200kb’lık bazlık diziler halinde
çoğaltma
• Dizileme – Kısa DNA dizisinin okunması.
– fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi kullanılarak.
• Dizilerin Birleştirilmesi – parçaların bir araya
getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı aşama.
Maxsam-Gilbert Tekniği
• Maxam-Gilbert kimyasal Yöntemi, DNA molekülünün belirli bazlara
özgü spesifik kimyasallar kullanılarak kırılması esasına dayanır.
• Bu teknikte, dizisi saptanacak DNA‘nın komplementer zincirleri
birbirlerinden ayrılır ve sadece zincirlerden birisi kullanılır. Dizisi
saptanacak zincir, 5' ucundan Polinükleotid kinaz enzimi kullanılarak
radyoaktif 32P ile işaretlenir.
• İkinci adımda; aynı havuza ait dört ayrı DNA örneği tüpüne, zinciri
belirli nükleotidlerden kıran dört ayrı kimyasal reaksiyon uygulanır.
Reaksiyon için belirli bir süre verilerek her tüpte farklı pozisyonlardaki
hedef nükleotidlerden kırılmış nükleotidler elde edilir. Sonuçta
kırıldığı noktaya göre hepsi 5' ucundan işaretli ancak boylan farklı bir
dizi parçacık elde edilir
• Pürin bazların kırılmasında Dimetilsulfoksid (DMSO)
kullanılmakla birlikte bu kimyasal, adenine göre guanini daha
etkin olarak metiller ve ısı uygulandığında zincir metillenmiş
kısımdan kırılır. Asit ortamda ise bunun tersine adenince
zengin zincir bölgesi kırılır.
• Pirimidinlerin kırılmasında ise Hidrazin etkindir. Hidrazin, DNA
yi hem sitozin hem de timin bölgesinden kırar ancak yüksek
tuz konsantrasyonlarında yalnız sitozin kırılır. Maxam-Gilbert
Dizi analiz tekniği; maliyet, hassasiyet ve işlem basamak
sayısının fazlalığı nedeniyle dizi analizinden ziyade DNA
footprinting olarak tanımlanan DNA ile assosiye protein
bölgelerinin DNA üzerindeki konumlarını belirlemek için
kullanılmaktadır
Sanger Tekniği
• Enzimatik DNA sentezine dayanan sanger DNA dizi analizi
yönteminde, dizisi saptanacak olan DNA zinciri, yeni
sentezlenecek DNAzinciri için kalıp olarak kullanılır ve sentez
reaksiyonu, DNAPol-I ile kataliz edilir.
• Yöntemde, kimyasal değişikliğe uğratılmış modifiye
dideoksinükleotit trifosfatlar kullanılarak sentezlenecek
bölgenin baz uzunluğu kadar sayıda ve farklı uzunluklarda dizi
fragmanları elde edilir. Dideoksi Nükleotid Trifosfatlar' da
(ddNTP) 3'OH grubu bulunmadığı için nükleotid ilavesi
yapılamaz ve zincir sentezi durur. Zincir sonlanması için farklı
floresans işaretli 4 farklı ddNTP ye ilaveten reaksiyon
tüplerinde;
ddATP, ddGTP
ddCTP, ddGTP
DNA
Dizilemesinde
Zincir
Sonlandırma
Metodu
Voet Fig. 3-23
Sequencing 2
Sanger'in zincir sonlandırma tekniği
esas alınarak otomatik DNA dizi
cihazları geliştirilmiştir.
DNA Dizilenmesinde Otomasyon
Yeni Dizileme Metotları
1. MALDI-TOF Mass Spektrometri ile Dizileme
2. Hibridizasyon ile Dizileme
3. Pirodizileme
4. Atomic-Force Mikroskopisi
5. Tek Molekül Fluoresans Mikroskopisi
6. Nanopor Dizileme
MALDI-TOF Mass Spektrometrisi Kullanılarak Dizileme
MW spectrum of 33-mer 5’-ACT AAT GGC AGT TCA
TTG CAT GAA TTT TAA AAG-3’
Hibridizasyon ile DNA Dizilemesi
Bu strateji, bilinmeyen etiketli DNA parçasının tüm kısa oligonükleotidlere bağlanmasını
(ör: 8-merlik 65,336 kombinasyon ) ve bilinmeyen dizinin bağlanma kalıbından görüntülenmesini
İçerir.
Prodizilemenin Temeli
Basamak 1
Bir dizileme primeri tek zincirli, PCR ile çoğaltılmış, DNA
kalıbına, hibridize edilir ve DNA polimeraz, ATP sulfurilaz,
lusiferaz ve apiraz, enzimleri, adenozin 5´ fosfosülfat (APS) ve
lusiferin substratları ile inkübasyona bırakılır.
Basamak 2
İlk önce dört adet deoksinükleotidtrifosfat (dNTP) reaksiyona
ilave edilir. DNA polimeraz deoksinükleotid trifosfatların, DNA
zincire katılmalarını kataliz eder. Yapıya katılan dNTP ile orantılı
olarak PPi (pirofosfat) açığa çıkmaktadır.
Basamak 4
Bir nükleotid parçalayıcı enzim apiraz, sürekli olarak; yapıya
girmeyen dNTPleri ve fazla ATP’yi parçalar. Parçalama bittiğinde,
diğer dNTP eklenir.
Basamak 5
Her bir işlem için dNTP’lerin eklenmesi bir kez gerçekleştirilir. Doğal
deoksiadenozin trifosfat (dATP) DNA polimeraz tarafından etkin bir
şekilde kullanılmasına rağmen, lusiferaz tarafından tanınmadığından
deoksiadenozin alfa-tiyo trifosfat (dATPaS) kullanılmaktadır. Süreç
devam ederken, kalıp DNA zinciri yapılır ve nükleotid dizisi
pirogramdaki piklerin oluşturduğu sinyaller ile belirlenir.
Pirodizilemenin Özeti
Pirodizileme, DNA’nın enzimatik DNA sentezi ile dizilenmesidir,
DNA dizisi sentezi sırasında açığa çıkan fotonların oluşturduğu
sinyallerin şiddetine göre belirlenir .
Adaptör taşıyan DNA fragmanlarının emülsyon bazlı PCR
ile klonal amplifikasyonu.
Prodizileme metodu.
Polinükleotidlerin Nanopor Dizilemesi
Bu yöntemde, tek zincirli polinükleotidlerin ince bir filmdeki nanopor
boyunca ilerlemelerini sağlayan elektrik alan sonucu oluşan iyonik akım
değişimi görüntülenmektedir.
DNA’nın bir yön değiştiren alanda dizilemesi
DNA

E
2nm

E  E cos( wt )iˆ  E sin( wt ) ˆ
j
Sonuçlar
Geleneksel Sanger metodu yavaş, pahalı, ve kesin değildir.
İnsan Genom Projesindeki dizileme 15 yıl almış tır.
Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir
yöntemdir. 100 milyon bazın dizilemesi yaklaşık bir gün
almaktadır, yüksek oranda kesinlik, örnek serilerinin çok
zamanlı incelenmeleri sonucunda sağlanmaktadır.
FISH (Floresns in Situ Hibridizasyon)
Problar, sadece Nükleik asit hibridizasyonunda (Southern ve
Northern blot) değil, aynı zamanda kromozom düzeyinde de
kullanılır.
FISH tekniğinde; lam üzerine fîkse edilmiş metafaz
kromozomlarında, kondens (yoğun) halde bulunan DNA molekülü,
burada denatüre edilir ve birbirinden açılan komplementer
zincirler hedef diziye göre hazırlanmış floresans işaretli probun bu
bölgeye girerek birleşmesine olanak sağlar.
Floresans işaretli prob, hibridize olduğu zaman, kromozomlar
floresans boyanın UV ışığı ile uyarılarak (eksitasyon) floresan
mikroskopta görüntülenir.
MİSMATEK (UYUMSUZLUK) ONARIMI :
Eşlemeden hemen sonra uyumsuz baz
varsa çok geniş bir proof-reading
mekn. Uygulanır (mutater genler Yeni iplikte kusur
yardımı ile Mut S ve Mutl) 1000
nükleotid çıkarılıp yeniden eşleme
Muts
yapılır. Çentigen yerine göre iplik
çıkaran (3’&5’) enzim değişir.
Mut L
Mut L çentik atar
İplik çıkarılır
Onarım
Kesip Çıkarma (EXCISION) Onarımı
Baz çıkarma
Nükleotid çıkarma
Tanıma
Endo Nükleaz
Çıkarma
Ekzo Nükleaz
Yama yapma
Polmeraz I
Birleştirme
Ligaz
Rekombinasyonel Onarım
Eşleme
ONARIM BOZUKLUĞUNDA
Xeroderma Pigmentosum (XP) : UV ışınlarına aşırı hassasiyet, T=T dimerleri onarılamıyor 
Deri kanseri %100, i/ 250.000 ,  30 Yaş
Ataxıa Telangiectasia (AT) : İlerleyen cerebellar ataksia  Göz altında damarlar
& el ayaklar X- ışınlarına duyarlılık  Lösemi  kromozom kırıkları, 1/40000  20 yaş
Fanconi Anemisi : Kemik iliği  kros-Linker’leri tamir edemiyor.
Orta Avrupa’da 1/70000 iskelet anomalileri, kanama.
Progeria : Erken yaşlanma Ölüm. Zihin faaliyetleri normal.
Bloom Sendromu : Kromozom anomalileri, IgA & IgM  , UV’ye duyarlık  kanser
Retina Blastoma : Retina kanseri, iyonlayıcı ışınlara duyarlı, krom.13’ün uzun kolu eksik
bulunmuş. 2 gözde de varsa kalıtım tek gözde varsa mutasyon. 1/25000
Bu hastalıklar otozomal resesiftir. Sadece homozigotlarda görülüyor. Heterozigotlar
taşıyıcı
KANSER OLASILIĞI %100
Proteom Analizi
• İnsanda 24.000 gen vardır.
• İnsan genom projesinin en şaşırtıcı sonucu yüzlerce genin uzun
bir süreç sonunda bakteri genlerinin insan genomuna
karışması.
• Spermlerde mutasyon sayısı yumurtanın iki katı kadardır.
• Evrim daha çok erkek üzerinden ilerlemektedir.
• Genomla proteom karşılaştırıldığında proteom 1000 kat fazla
bilgi vermektedir.
• Karaciğer hücresi ile beyin hücreleri aynı genetik bilgiyi
içermesine rağmen protein içerikleri farklıdır
• Sumo güreşçisi ile Paris Hilton %99.95
benzerlik.
Genom-Proteom
Proteom, hücrenin, organın veya organizmanın protein içeriğini
tanımlar.
Tüm izoformlarını ve post-translasyonal varyantlarını içerir. Zamana ve
hücreye spesifiktir.
Proteom kavramı, genom kavramından esas itibarıyla farklıdır: genom
statiktir, bir organizma için çok iyi tanımlanabilirken, proteom iç ve dış
uyaranlara yanıt olarak sürekli değişim halindedir.
Proteomiks, proteomun identifikasyon prosesidir ve kıyaslamalı
proteomiks iki durum arasındaki ( normal ve hastalık, yaşlı ve genç)
ekspresyondaki farklılıkları tanımlar.
Genomiks ile kıyaslandığında proteomiks çok daha kompleksdir.
Amplifikasyon stratejisi yoktur ( yani genomiksteki PCR gibi ) bu
yüzden proteomiksteki tek mücadele analitik tekniklerin duyarlılığını
artırmaktır.
Ayrıca, protein düzeylerinin kantitasyonu çok zor bir iştir ve mevcut
yöntemler istediğimiz kadar güvenilir değil.
Genomiksin arkasında mikroarray ve PCR gibi standart teknikler var.
Proteomiksin arkasında benzer bir standart teknoloji yoktur.
Bir proteomu doğru bir şekilde analiz etmek için kompleks ve
geliştirilecek bir teknolojinin birleştirilmesine gereksinim vardır.
Niçin proteomiks çalışılır?
• mRNA ekspresyon düzeyleri, protein ekspresyon
düzeyleri ile iyi korele edilemez,
• mRNA düzeyleri, kodlanmış proteinin aktivitesini
yansıtmaz,
• mRNA düzeyinde proteinlerin post-translasyonal
modifikasyonları ile ilgili bilgi sağlanamaz.
• Genom ve Proteom = komplementer veri sağlar.
Kıyaslamalı proteomiks çalışmalarının amacı:
• Normal biyolojik süreçlerin ve hastalıkların altında yatan
mekanizmaların tanımlanması (inflamasyon, erken renal veya
hepatik yetersizlik, beslenme bozuklukları ve toksikoloji),
• Vücut sıvılarında, hücrelerde veya doku biyopsilerinde
diyagnostik ve prognostik hastalık markerlerinin tanımlanması,
• Hastalık progresyonunun izlenmesi ve sub-klasifikasyonunu,
• Yeni tedavi stratejilerinin belirlenmesi,
• Vücut sıvı örneklerinin veya doku biyopsilerinin orijinlerinin
belirlenmesi,
• Sıvı, hücre veya dokularda protein fenotiplerinin ve posttranslasyonal mod. belirlenmesi (Apolip.A ve J, haptoglobin),
• İmmünoglobulin klonlannın araştırılması (genetik otoimmün,
enfeksiyonel veya neoplastik hast. Örn; MS, hemolitik anemi,
Lyme has.,B-hepatit, limfoproliferatif hastahklar).
Proteom Analizinde Kullamlan Genel Strateji:
• Örnek Hazırlığı: Ekstraksiyon, solübilizasyon, fraksiyonlama, DNA’nın
uzaklaştırılması, yaygın bulun ana proteinlerin uzaklaştinlması.
• Protein ve/veya Peptitlerin Tanımlanması (identifikasyonu):
Elektroforeze dayah tekniklerin kullanımı;lD-Elektroforezi, IEF ve 2DElektroforezi, kütle spektrofotometresi (MES/MALDI-TOF), ELISA
(enzim linked immunosorbent assay ), WB ve kromotografik metodlar
gibi.
• Biyoinformatik: Jel analizi software ve protein veri tabanlannın
kullanımı, veri tabanlanmn geliştirilmesi ve standardizasyonu,
karşılaştırmalı veri analizi. Protein-protein ve protein-ligand
etkileşimleri ve etkileşim bölgeleri. Baglantı arayüzlerin ortaya
çıkarılması ve modellemeler.
PROTEİN VE/VEYA PEPTİTLERİN TANIMLANMASI (İDENTİFİKASYONU):
Elektoforetik metotlar
Elektroforez; çözeltideki iyonlann elektrik akıminın tesiri ile meydana
gelen hareketlerini tanımlamak için kullanılan bir terimdir. Elektriksel
alan içerisindeki göc; elektrik akımının şiddetine, net yüke, molekülün
şekline, solüsyonun iyonik gücüne, viskozitesine ve sıcaklığına bağlıdır.
Göc hızı, protein molekülü üzerindeki yükün büyüklüğü ile doğru
orantılıdır. İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektroforezin temelini
oluşturur. Zıt yükteki elektrotlara doğru farklı hızlarda hareket eden
değişik yükteki iyonlar elektriksel alanda birbirinden ayrılırlar.
Elektroforez, ayrılması istenen iyonlan ihtiva eden bir çözelti ile kağıt,
nişasta agar, selüloz asetat ve poliakrilamit gibi inert bir taşıyıcı
materyalin teşkil ettiği bir sistemde de yapılabilir.
Protein üzerindeki yüklerin birbirini dengelediği pH’ya o proteinin
izoelektrik noktası (pI) adı verilir. Bu pH’da proteinler hem anod, hem
katottan aynı kuvvetle çekildikleri için proteinlerin bu pH’daki hareketleri
sıfır olur.
Elektroforez çeşitleri
• Kullanılan ayırma ortamının cinsine göre çeşitli
elektroforez teknikleri kullanılmaktadır.
• Kağıt elektroforezi,
• Selüloz asetat elektroforezi,
• Agar jel elektroforezi, nişasta jel elektroforezi,
• Poliakrilamid elektroforezi (Native ve SDS’li),
• İzoelektrik odaklama (IEF) ve 2D-Elektroforez bunlar
arasında sayılmaktadır.
İzoelektrik Odaklama (IEF):
İzoelektrik odaklama, bir pH gradiyetinde yapılan elektroforezdir. Bunun
için makromoleküller (+) ve (-) yüklere sahip olduklan müddetçe
gradient boyunca izoelektrik noktalanna (pI) rastlayan pH’ya kadar göç
ederler. İzoelektrik noktada net elektriksel yük sıfırdır. pH gradienti
düüşük molekül agırlıklı amfoterik maddelerin (amfolitler) yardımıyla
oluşturulur. Eğer elektroforezde kullanılan tampon sistemi yerine anotta
kuvvetli bir asit, katotta da kuvvetli bir baz kullanılır ve aradaki jel
ortamına da gerektiği kadar amfolit solusyonu katılırsa amfolitlerin
anoda yakın kısmında (+) katoda yakın kısımda (-) net yükleri olur.
Bundan dolayı elektrik verildiginde bunlar anot ve katot tarafma itilerek
merkeze doğru hareket ederler. Bu hareketleri sırasinda çevresel
ortamın pH’ının kendi izoelektrik noktalanna eşit oldugu bölgelerde
hareketsiz kahrlar. Bundan dolayı, en asidik amfolitler katoda yakın
olacak sekilde izoelektrik noktalarına göre sıralanırlar. Bunun sonucu jel
içinde anottan katoda doğru azalan bir pH gradienti oluşur. Örnek
yürütüldüğünde proteinler izoelektrik pH’sına geldiği anda net olarak
yüksüzleşir. Hareket etmez ve o noktada odaklanır.
YAŞLANMA SÜRECİ
•
•
•
•
•
Moleküler yaşlanma
Hücre yaşlanması
Doku ve organ yaşlanması
Bireysel yaşlanma
Toplumsal yaşlanma
HÜCRE YAŞLANMASI (SENESCENCE)
Genetik saat teorisi
Telomer-telomeraz teorisi
Yıkıcı hatalar ve hasarlar teorisi
•
•
•
•
•
DNA hasarı ve onarımı
Telomerlerin kısalması
Oksidatif hasar
Mitokondriyal hasar
Lizozomlarda olan değişiklikler
Genetik Saat Teorisi
• Yaşlanma genetik olarak kodlanmıştır.
• Genetik saat replikasyon, bölünme sayısına
bağlıdır.
Destekleyici Bilgi
Farklı hücrelerin ve türlerin yaşam
sürelerinin farklı oluşu.
Kanserleşme, yaşlanmanın durması ve
replikasyonun devam etmesi.
Farklı Yaşam Sürelerinin Nedeni
• Genetik faktörler
• Beslenme alışkanlıkları ve enerji tüketimi
• Dokular arası farklılık
• Çevre faktörleri
• Farklı replikasyon aktiviteleri
Memeli hücrelerinin çoğalma kapasiteleri
sınırlıdır. 40-60 bölünme geçirebilirler.
Normal hücreler ölümlü.
Kanser hücreleri ölümsüz.
Kültür Ortamında;
• İnsan fibroblastları 50±10
• Fare fibroblastaları 15±5
• Down Sendromlu kişinin fibroblastları 40 ±15
kez bölünebilir.
Metabolik ve genetik hastalıklarda replikasyon
sayısı düşüktür.
Yıkıcı hatalar ve hasarlar teorisi
1) Serbest radikal hasarları
2) Bilgi aktarım hataları
3) Genlerde ve yazılımlarında değişiklikler
Doğal Koruyucular
(Antioksidanlar)
Endojen
Süperoksit dismutaz
Katalaz
Glutatyon
Peroksidaz
Eksojen
Beta karoten
E vitamini
Selenyum
Askorbik asit (C vitamini)
Antioksidan azalmasıyla
Lipofuksin pigment artışı ve yaşlanma
Bilgi aktarımında hatalar
• DNA sentezinde hatalar; Polimeraz aktivitesinde
yavaşlama ve hatalar, genç MRC-5 hücrelerinde
replikasyon hızlı, yaşlılarda yavaş.
• Mutasyonlar
• DNA onarımında yavaşlama ve hatalar
• RNA sentezinde hatalar
• Ribozomal hatalar
• Protein sentezinde hatalar
Gen yapısı ve ifadesinde değişimler
• Nukleus DNA’sında değişim
•
•
•
•
•
•
Kaybolma (delesyon)
Çeviri hataları
Çoğalma hataları
Rekombinasyon hataları
Metillenme hataları
Translasyon hataları
• Mitokondri DNA’sında değişim ve enerji
metabolizması
Yaşlı hücre morfolojisi
Sitoplazma;
 Lipofuksin pigment granülleri
 Mitokondrilerde
dejenerasyon
 Metabolizma
Nükleus; son ürünleri
 Membran düzensizliği
 Binüklear hücrelerde artış
 Neden yaşlanıyoruz?
Uzun yaşam olabilirmi?
Bu soruların yanıtları bazı yeni araştırmalara göre
kromozom uçlarındadır.
Telomer
Telomer ökaryotik hücrelerde kromozom uçlarında yer alır
ve çok sayıda “TTAGGG” dizi tekrarı içeren
heterokromatin yapılardır. İnsan telomerleri yaşa ve hücre
tipine göre ~6-12 kb uzunluğundadır. Her replikasyon
sırasında telomer bölgeleri 50-100 baz çiftini kaybeder.
Telomerlerin fonksiyonları
• Hücrelerin biyolojik saatleridir.
• Genetik bilgi taşımazlar.
• Hücre içerisinde kromozom dolaşmasını
ve yapışmasını önlerler.
Hücre bölünmesi sonrası TELOMER kaybı
saatli bomba
Genetik
Telomerlerin boyunu uzatarak sürekli gençlik ve
yaşam sağlanabilir mi?
İnsan telomerazı;
• RNA,
• Ters transkriptaz
(RT),
• Protein molkülleri
içerir.
Telomeraz ve senesens
Telomeraz yaşlanmaya gidişi geri döndürecek mi?
Bunu zaman gösterecek…
Telomer-telomeraz
5’……TTAGGG……3’ kromozom uçlarında
tekrarlanan dizi TELOMER.
Telomer ne işe yarar?
1) DNA’daki tek zincirli uçları korumak, uzun
yaşamak ve ölümsüzlük
2) Kromozomları yeni düzenlemeden korumak
3) Kırık kromozomların yapışmasını önlemek
TELOMER
• Doğumda 1000-2000 kez tekrarlanan
TTAGGG dizisi
• Her hücre bölünmesinde bir miktar kısalır.
Kısalma belli bir noktaya ulaşınca bölünme
durur.
İnsan hücrelerinde yaklaşık 100 hücre
döngüsünden sonra telomer uzunluğu kritik
noktaya ulaşır ve bölünme durur. Hücresel
yaşlanma ve ölüm olur.
Telomeraz
•
•
•
•
Kısalan telomerleri uzatan enzim
Ribonükleoprotein (RNA + protein) molekülünden oluşur.
159 nükleotid RNA içerir.
Bu RNA dizisi telomer ucundaki tekrarlanan diziye
komplementerdir.
CAAUCCCAA (telomeraz)
..……TTAGGG………..
• Ters transkriptaza (RT) benzerdir.
• Telomeri yaklaşık 10000 nükleotit çifti kadar uzatır.
• Telomer boyu ve telomeraz aktivitesi hücrenin bölünme
sayısını etkiler.
• Bir çeşit moleküler saat olarak iş görür.
• Doğumda 15000 bç olan telomer her bölünmede 25-200 bç
kısalır.
Telomeraz aktivitesi
• Embriyonik hücrelerde,
• Üreme hücrelerinde,
• Sürekli çoğalan hücrelerde (hematopoetik kök
hücreleri, aktif lenfositler, intestinal hücreler),
• Kanser hücrelerinde görülür
*Somatik hücrelerde aktivite yoktur.
Klonlama ve telomer uzunluğu
Dolly doğduğunda telomeri kısaydı ve yaşlı
doğmuştu.
Telomer kaybı yaşlanma ile ilişkilidir.
Progeria (hızlı yaşlanma) hastalığında ciddi
telomer kısalması söz konusudur.
Oksidatif hasar
Hücrelerde enerji ihtiyacını karşılamak için oksijen kullanılması sırasında
(oksidasyon) serbest radikaller oluşur.
Serbest radikaller
• Membran lipitlerine
• Proteinlere
• DNA’ya
• Karbohidratlara
etki ederler.
Hücrede reaktif oksijen türlerinin (ROS) artışı hücre
hasarına neden olur.
Serbest radikallerin hücredeki etkileri
DNA hasarları
Hücrenin enerji üretim merkezi
MİTOKONDRİ
UZUN YAŞAM GENİ SİRTUİN
Sir2 NAD’yi kofaktör olarak kullanarak
proteini deasetile eder.
Geç ve genç ölüm
Metabolizmayı hızlandıran büyüme hormonları ve IGF
Ömrü kısaltır
ÖMÜR UZATAN FORMÜL
•
•
•
•
•
•
Düzenli egzersiz
Aşırıya kaçmayan tehlike (az adrenalin)
Temiz çevre ve hava
Doğru beslenme
Kalori kısıtlaması
Sağlam genetik miras
BİYOSENSÖR
• Biyosensörler biyolojik tepkimelerde hedef
analitleri denetlemek için kullanılan küçük
algılayıcı cihazlardır. Birbiri içine geçmiş biri
biyokimyasal diğeri elektrokimyasal özellikteki iki
çeviriciden oluşmaktadır.Biyokimyasal kısmın
görevi analizlenecek maddeyle etkileşerek onu
tanımaktır. Bu tanıma olayının sonucunda bir
biyokimyasal ürün de oluşabilmektedir.
Biyosensörün ikinci kısmı olan elektrokimyasal
kısım ise bu tanıma olayını okunabilir (ölçülebilir)
bir sayısal değere çevirmekle görevlidir.
DNA BİYOSENSÖRLERİ
• Biyosensör tasarımında kullanılan dizi tanıma yüzeyleri, bilinen
elektrokimyasal biyosensörlere yeni boyutlar kazandıracak ve
gelecekte hasta başında veya doktor gözetimindeki analizlerde
önemli bir rol oynayacaktır.
• Tanıma yüzeyi olarak DNA’nın kullanıldığı biyosensörlere DNA
biyosensörleri adı verilir. DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli
hibridizasyon olaylarının izlenmesinde veya bu yüzey ile etkileşime
giren analizlenecek maddelerin (karsinojen madeler, ilaçlar, vb.)
tayininde kullanılabilir.
DNA Biyosensörleriyle DNA Dizi Algılama
Yöntemleri
• Herhangi bir hastalığı, kalıtsal bir davranışı ya da bakteri ve
virüslerinin patojenitesini simgeleyen bir prob DNA dizisinin, bu
diziye karşılık gelen hedef diziyle oluşturduğu çift sarmalın
biyokimyasal yapısı tanınma olayını mümkün kılmaktadır.
• Elektrokimyasal DNA biyosensörleri
• Çevre analizlerinde
• DNA-ilaç etkileşim tayinlerinde
• Bulaşıcı ve kalıtsal hastalıkların tanısında kullanılabilir.
• Hibridizasyon tayinlerinde kullanılan çeşitli immünokimyasal ve
voltametrik metodlar karşılaştırıldığında birkaç örneğin çalışıldığı
durumda voltametrik yöntemlerin daha hızlı yanıt verdiği gözlenir,
ancak büyük miktarda bir seri benzer örnek analizlenecekse, iyi bir
otomasyona sahip immünokimyasal tekniklerin kullanılması daha
uygundur.
• Diziye özgün DNA biyosensörü, DNA bazlarının hibridizasyonuna
dayanan çevirim sistem ve DNA probundan oluşmmaktadır.
• Elektrokimyasal DNA biyosensörleri, aranan hedef dizisinin
komplementeri 20-40 baz uzunluğunda sentetik tek sarmal DNA
(ssDNA) oligomerin (veya “PROB“ olarak isimlendirilir), elektrot
yüzeyine bağlanmasına dayanmaktadır. Hedefi içeren bir örnek
çözeltisine sensörün uygulanması, ile elektrot yüzeyinde hibrit
oluşur.
Oluşan hibritin saptanması
• Elektroaktif indikatör aracılığıyla (örneğin bir redoks-aktif katyonik
metal kompleksi) yapılan tayindir. Bu yöntemde yüzeyinde hibrit
oluşan elektrot indikatörü içeren çözeltiye daldırılır ve indikatörün
hibrite bağlanma düzeyi belirlenir. (İndikatöre dayalı DNA dizi
algılanması, ya DNA’ya interkale olabilen (metal kompleksleri,
antibiyotikler) veya DNA dizisindeki bazlarla özgün olarak
etkileşen (MB, Ru(bpy)33+, vb.) elektroaktif maddeler (indikatör)
ile tayin edilebilmektedir).
• DNA bazlarından elektroaktif olan Guanin bazının 1.0 V’ da verdiği
yükseltgenme sinyalinden saptanabilir (Elektrot yüzeyinde oluşan
hibrit ile etkileşen indikatörün neden olduğu artan veya azalan
elektrokimyasal yanıt hibridizasyonun tayinine yönelik bir sinyal
olarak kullanılır).
DNA Dizi Algılama Yöntemlerinin Kullanım
Alanları
• Kalıtsal ve Bulaşıcı hastalıkların Tanısında
• Kan, serum, doku, hücre vb. gibi biyolojik materyallerden bakteri,
virüs, parazit ve mantar kökenli hastalıklar ve pek çok kalıtsal
hastalıklara neden olan mutasyonların saptanmasında kullanılmaya
başlanmıştır.
• Elektrokimyasal DNA biyosensörleri, kalıtsal ve infeksiyon
hastalıkların tanısında bilinen rutin analiz yöntemlerine göre
alternatif olarak daha hızlı, ucuz ve kolay bir yöntemdir.
• Son yıllarda Çip Üzerinde Laboratuar Teknolojisi (Laboratory on a
Chip) olarak adlandırılan teknik üzerinde önemli çalışmalar
yapılmaktadır. Bu yeni teknolojinin amacı; tek bir çipte tüm
genomun izlenmesini ve binlerce gen arasındaki etkileşmenin aynı
zamanda belirlenmesini sağlayabilmektir. Bu teknolojinin esası
biyosensörlere dayanmaktadır ve bu çipler küçültülmüş DNA
biyosensörleridir.
• Çevre Sağlığını Tehdit Eden Çeşitli Mikroorganizmaların
Tayininde
• Çevre sağlığını tehdit eden özellikle doğal su kaynaklarında vs
çeşitli bulaşıcı hastalıklara yol açan mikroorganizmaların
tanınması için geliştirilen biyosensörlerinin tasarımı nükleik asit
hibridizasyonuna dayalıdır. Mikroorganizmaya ait bilinen bir DNA
dizisinin, karşılık gelen hedef diziyle bilinmeyen bir DNA örneği
içersinde oluşturduğu baz çiftinin biyokimyasal yapısı bu olayı
mümkün kılmaktadır. Fiziksel sinyal çeviricilerin yüksek duyarlılığı
ve DNA hibridizasyonunun yüksek seçiciliği, elektrokimyasal
biyosensörleri çevre analizlerinin vazgeçilmez bir parçası
kılmaktadır.
• Biyolojik ve Kimyasal Silahların Tayininde
• DNA’nın bazı kimyasal maddelerle ve tepkimelerle (ilaç, çevresel
atıklar, radyasyon vs..) etkileşmesi ve geliştirilen yeni yöntemlerle
bunun incelenmesi ; yeni ilaç tasarımı, çevresel atık analizleri, çeşitli
kimyasal ve biyolojik silahların tayinine yönelik yeni yöntem
geliştirme açısından önemlidir.
• Son yıllarda biyolojik silah amaçlı kullanılan, genetik modifikasyona
uğramış mikroorganizmalar, elektrot yüzeyine tutturulan prob dizi
ile hibridizasyon sonucu, sinyal farklılaşmasından yola çıkılarak tespit
edilebilmektedir.
• Günümüzde kimyasal silah amaçlı kullanılan özellikle organofosfat
bileşimine sahip pek çok maddenin, DNA’ya verdiği hasardan yola
çıkarak ya da direkt enzim teknolojisi yöntemleriyle saptamak
mümkündür.
BİYOSENSÖR
Tüm canlılar yaşadıkları ortamdaki
değişimleri derhal algılayıp yaşamlarını
sürdürebilmek için değişimlere uymaya
çalışırlar. İşte bu algılama mekanizması
biyosensörlerin in vitro kullanımı için
temel oluşturmuştur.
1996 yılında hazırlayıp yayınladığı biyosensör
tanımı biyomikrochiplerin gelişimi ile daha
şimdiden geçerliliğini yitirmiştir.Biyosensörlerin
gelişiminde,mikroelektronikten bildiğimiz daima
daha küçük,daha doğru ve daha ucuz aletlere
eğilim saptanmaktadır.
 İşitme, koklama, tad
alma, dokunma gibi
algılama mekanizmaları
mükemmel biyosensörik
sistemler olarak
düşünüldükleri için
biyosensör
çalışmalarına güzel
örnekler
oluşturmaktadırlar.
Biyosensörlerin tarihi 50’li yılların ortalarında
L.C.Clark’ın Cincinnati Hastanesi’nde (Ohio, ABD)
ameliyat sırasında kanın O2 miktarını bir elektrod ile
izlemesiyle başlar.1962 yılında Clark ve Lyons
Glukozoksidaz (GOD) enzimini O2 elektrodu ile
kombine ederek kanın glukoz düzeyini ölçmeyi
başardılar.
Bu sistem bir yandan biyolojik sistemin yüksek
spesifisikliğini (enzim) diğer taraftan ise fiziksel
sistemin(elektrod)tayin duyarlılığını birleştirmiş ve geniş
spektrumlu bir uygulama olanağı bulmuştur.
Klasik elektrokimya ile sadece anyon ve
katyonları belirleyen sensörler
hazırlanabilirken sisteme biyomateryalin de
katılması ile diğer birçok maddenin tayini
mümkün olmaktadır. Böylece hazırlanan
analiz sistemlerine biyosensorler adı verilir.
Biyosensörlerin Temel Bileşenleri
Biyosensörler, genel olarak
analizlenecek madde ile
seçimli bir şekilde
etkileşime giren biyoaktif
bir bileşenin, bu etkileşim
sonucu ortaya çıkan
sinyali ileten bir iletici
sistemle birleştirilmesi ve
bunların bir ölçüm
sistemiyle
kombinasyonuyla
oluşturulurlar.
Biyoelektrik ve mikroanalitik sistemler
Nükleik asit sensörleri ve DNA yonganları
Organizma ve tam hücre sensörleri
Biyosensörler için doğal ve sentetik
reseptörler
Enzim tabanlı sensörler
İmmunosensörler
Bİyosensörlerİn YapIsI ve ÇalIşma Prensİbİ
BİYOSENSÖRLER
•ENZİMLER
•DOKU KESİTLERİ
•ORGANELLER
NUMUNE
•TUTUCU AJANLAR
•NÜKLEİK ASİTLER
•MİKROORGANİZMALAR
•RESEPTÖR MOLEKÜLLERİ
Elektrokimyasallar
•Potansitometrik
•Amperometrik
•Konduktometrik
•Transistorler
Optik
•Fotometri
•Florimetri
•Luminesans
Kütle Değişimi
•Piezoelektrik
Isı Değişimi
•Termistörler
ELEKTRONİK
*Biyoaffinite Esaslı Biyosensörler:
(örneğin; iletici sistem üzerinde antikor
immobilizasyonuyla antijenlerin tayini)
*Transmembran Esaslı Biyosensörler
(örneğin; çeşitli moleküllere spesifik reseptör veya farklı
membran proteinlerini içeren hücre membranlarının
iletici sistem üzerinde immobilizasyonuyla söz konusu
moleküllerin seçimli bir şekilde tayinleri.)
BIYORESEPTOR MOLEKULLERI
Enzimler:
Biyoreseptör moleküllerinin en çok bilineni
enzimlerdir. Enzimlerin substratlarına karşı
oldukça yüksek bir özgünlüğü, afinitesi
mevcuttur. Binlerce kimyasalarasından ilgili
oldukları substratı seçer ve reaksiyonu
katalizlerler. Tabi tüm diğer reaksiyonlarda
olduğu gibi enzimatik reaksiyonlarda da
ortamın sıcaklığı, pH’sı, iyonik kudreti ve diğer
çevre şartları önemli rol oynar.
Antikorlar:
Antikorlar bir glikoproteindir. Kandaki proteinlerin
%20’sini oluşturular. Y şeklinde olup iki adet antijen
tanıma bölgesi ihtiva ederler. Bağışıklık sisteminde
antikorlar tarafından tanınan ve immün cevap
oluşumuna sebep olan yabancı moleküllere antijen adı
verilir. Antikorları genelde birbirlerinden ayıran farklılık
antijen tanıma bölgeleridir. Her farklı antikor kendine
özgün olan antijeni tanır ve ona geçici olarak bağlanır
Aptamerler:
Genel olarak aptemerler rastgele sentezlenmiş tek zincirli
oligonükleotidlerdir. Önce oligonükleotid sentezleyicisine zincir
dizim sekansı bakımından rastgelelik gösteren trilyon adet
farklı sentetik oligonükleotid ürettirilir. Ürünler ise biyosensör
teknolojisinde biyoreseptör olarak kullanılır.
Reseptör proteinler:
Reseptör proteinler biyolojik aktif bileşikler için yüksek ama
özgün bağlanma gücüne sahiptirler. Yani, herbir farklı
reseptör protein yalnızca kendine has bileşiğe bağlanabilir. Bu
özelliklerinden dolayı biyoreseptör olarak biyosensör
teknolojisinde kullanılmaktadırlar.
Diğer Adaylar:
Dünyamızda, biyosensörlerde biyoreseptör olarak
kullanılmaya aday bir çok biyolojik materyal
bulunmaktadır. Bakteriler, hücreler, organeller,
membran tabakaları bunlardan bazılarıdır.
Herhangi bir biyomateryalin biyoreseptör amaçlı
kullanımı için tek koşul, materyalin istenilen
analiti bir şekilde özgün olarak tanıma
kapasitesine sahip olmasıdır.
BIYOSENSORLERIN UYGULAMA
ALANLARI
Biyosensörlerin, klinik, teşhis, tıbbi
uygulamalar, süreç denetleme, biyoreaktörler,
kalite kontrol,tarım ve veterinerlik,bakteriyel ve
viral teşhis, ilaç üretimi, endüstriyel atık su
denetimi, madencilik, askeri savunma sanayi gibi
alanlarda yaygın olarak kullanımı söz konusudur.
Bu “tibbi telesensör yonga”
vücut sicakligini ölçerek,
bu bilgiyi iletebilme özelligine sahip
BIYOSENSOR GRUBU
KAPSADIGI ANALIZ ALANI
Enzim sensorleri
Kuçuk molekullu organik ve anorganik maddeler(
ilaclar, gida maddeleri, vitaminler, antibiyotikler..)
Mikrobiyal sensorler
Enzim sensörlerin kapsadigi alanlar +BOD, Toksisite,
Mutajenite
DNA – Sensorleri
Virusler, patojen mikroorganizmalar
Immuno Sensorler
Virusler, patojen mikroorganizmalar +
ksenobiyotikler
Biyolojik silahlar ve biyosensörler
Bakterilerin bir kısmı görünmeyen
dostlarımızdır; bazıları sindirim
sistemimize yardım ederken, bazıları
vücudumuzdaki zehirleri yok ederler. Kimi
bakteriler ise bizleri hasta eder.
Vücudumuzun içinde veya dışında
yaşayan bu ilginç mahlukçuklar
vücudumuzun ayrılmaz parçalarıdır her
halukarda.
Ancak birde katil bakteriler var ki, zalim
insanların ellerine geçtiklerinde biyolojik silah
olarak kullanılailirler.
Biyolojik silahlar ; insanları hayvanları veya
tarımsal ürünleri öldürücü veya ağır derecede
hasta için olan mikroorganizmalar ile, bunlardan
üretilen zehirli maddelerdir.
Biyolojik silah tehlikesine karşı yapılması
gerekenler:
• Biyosensörler ile
tehlikelerin tespit
edilmesi tanımlanması
• Mikrobiyal zehirlere
karşı antidotların
hazrılanması
• Antibiyotik ve aşı
geliştirilmesi
Aynı zamanda biyolojik
mekanizmaların, proteinler
arası ilişkilerin
anlaşılmasında ve insan
genom projesinin devamı
olan proteomik
çalışmalarında da
biyosensörlerin büyük önemi
vardır. İnsan genom projesi
ve patojenik bakteri ve
mikroorganizmaların genetik
kodların ilaç geliştirme
çabaları için belirlenmesi,
bazı kötü niyetli ilaçların ilaç
yerine zehir yapmasına da
yardım etmektedir.
En korkunç biyolojik silah: Şarbon
Biyolojik silah yapımında en çok kullanılan
bakterilerden biri olan Şarbon, solunum yolundan
alındığında hızla ölüme yol açıyor. Vücudun kendi
savunma sistemi şarbon karşısında fazla etkili
olamıyor.
Biyolojik silahlardan korunma
Biyolojik silahlardan korunma beş aşamadan
oluşmaktadır;
1.Önleme:Biyolojik silahların kullanılmasını
engellemek için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır .
2.Korunma:Biyolojik ajanlara karşı korunma
yöntemleri sınırlıdır. Koruyucu elbiseler, maskeler
kısa süreli koruma sağlayabilirler Pişirilecek
yemeklere yeterli ısısal işlem uygulanmalı,
özellikle yüz dereceye varan ısı uygulanmalı
3.Belirleme:biyolojik silahların
belirlenmesinde biyosensörler kullanılır.
4.Tedavi:tedaviyi kişi kendi yapamaz ancak
hekim tarafından yapılabilir. Toksinlere karşı
uygun antiserumlar varsa kullanılır, yoksa
destek tedavisi uygulanır
5. Dekontaminasyon-temizleme:Zamanla
dağılarak etkilerini kaybeden kimyasal
silahların tersine biyolojik silahlar zaman
geçtikçe etkilerini artırıp çoğalabilirler
ORDU
biyoteknoloji ile
tanışınca…
Evrim sadece canlılara özgü değil,ordu da
evrimleşiyor. Hem teknolojinin gelişmesi hem de
saldırı şekillerinin çeşitlenmesi bu evrimi zorunlu
kılıyor.Son yıllarda biyoteknolojide meydana gelen
baş döndürücü gelişmelerin ütopik mükemmel
askeri yaratıp yaratamayacağı bilinmez ama
günümüz aslerlerinin çok daha donanımlı olduğu
kesin.
Biyolojik ve kimyasal silahlar sahneye çıkmış
durumda. Artık olası bir savaşta ordunun karşı
koyması gereken görünür düşmanlarının yanı
sıra bir de görünmeyen sessiz düşmanları
mevcut.
DNA Microchip’ler
• 1x1 cm bir yüzeye sahip (matrix) 100 bin-1
milyon DNA probunun bağlanmasından
oluşmuş micrp labrotuvar.
– Microchip
– Gene Chip
•
•
•
•
Biochip=Genel kavram
Microchip=Micro array gene chip
Oligonükleotid=kısa baz çiftleri
Nanoteknoloji=Nanometrelerde ölçülebilcek
düzeyde materyalleri işleyen teknoloji
• Chip=Yanga dizilim
• Tek zincirli nükleik asit komplementerlerine
özgün bağlanırlar
• Gelişen nanoteknoloji ile gelişen moleküllerin
yerleşebileceği sert zeminler (silika matrix)
hazırlanabilir.
• Bio özelliklerinden faydalanılarak binlerce
oligonükleotidin sert bir zemine bağlanması ile
“matriks hibridizasyon sistemi” geliştirilebilir.
• Silikon “chip”ler üzerine baz dizisi bilinen
oligoükleotidler belirli bir düzenle binlerce
yerleştirilebilir.
• İstenilen baz dizisine sahip bu “chip”ler
sensör (algılayıcı) olarak kullanılır ve
bilgisayara iletilir.
• Araştırılacak nükleik asitler florasan bir boya
ile konjuge edilir.
• Konjuge nükleik asitler hazırlanan matrikse
(microchip) eklenir.
• Örnekte komplementer DNA varsa
hibridizasyon gerçekleşir.
• Chip üzerinde oluşan hibritlerdeki floresan
şiddet konfokal mikroskopta tespit edilir.
• Bilgisayar destekli otomatize mikroskop
sayesinde matriks yüzeyi taranarak yüzeyin
imajı alınır.
• Florasan imaj özel programla incelenir.
• Sinyal yoğunluğu ile bağlanan prob miktarı
hakkında bilgi edinilir.
DNA Chip Üretimi
1) Fotolitografi
2) İnkjet
3) Robot spotlama
MICROARRAY TEKNOLOJİSİ
Bilgisayar teknolojisinin moleküler biyolojiye paralel olarak hızla
gelişmesi, iki disiplini birbirine yaklaştırmıştır. Böylece,
biyoteknolojinin kavramsal olarak ulaşabileceği son noktalardan
biri olan gen çip (microarray) ortaya çıkmıştır. Microarray
tekniğinin ilk girişimleri Shalon ve Schena tarafından
gerçekleştirilmiştir.
Gen fonksiyonlarının “bütün resmini” görmek geleneksel
yöntemlerle zordur. Gen çip teknolojisinin büyük bir ilgi ile
karşılanmasının sebebi, bütün genomun basit bir çip üzerinde
görüntülenmesini vaat etmesi ve bu sayede araştırıcıların aynı
anda binlerce genin birbirleriyle olan etkileşimlerini görmesine
olanak tanımasıdır.
DNA microarray’i cam, plastik veya silikon çip gibi katı bir yüzeye
tutturularak sıralı bir şekilde (array) oluşturulmuş mikroskobik
DNA spotlarıdır. Bir microarray’de bu spotlardan onbinlerce
bulunabilir. Yüzeye tutturulan bu DNA parçaları (genellikle 20-100
nükleotid uzunluğunda ) prob olarak tanımlanmıştır.
Microarray teknolojisi, “Southern Blotting” tekniğinden
türetilmiştir. Bu yeni teknikte membran yerine camın kullanılması,
radyoaktivitenin yerini fluoresan işaretlerin alması ve bağlanmayı
sağlayacak yöntemlerin özgünlüğünün artırılması, elde edilen
bilgilerin miktarını artırmıştır.
Microarray’ler nasıl üretilir ve nasıl çalışır?
Microarray’lerin üretiminde çeşitli yöntemler kullanılabilir: cam lamlar
üzerine ince uçlu iğnelerle baskı, önceden hazırlanmış maskelerle
fotolitografi, dinamik mikroayna cihazlarıyla fotolitografi , ink-jet baskı ,
mikroelektrod array’lerinde elektrokimya gibi...
Temel olarak çiplerin hazırlanması iki şekilde yapılabilir:
• Çip üzerinde oligonükleotid sentezi (On-chip oligonucleotide synthesis):
DNA ya da gen parçaları direkt olarak cam maddenin üzerinde sentez edilir.
Genellikle fotolitografi yöntemi kullanılır.
• DNA’nın direkt olarak yüzeye bırakılması (Direct DNA deposition): Bu
teknikte genomik DNA’nın parçaları fiziksel olarak cam yüzeydeki yerlerine
bırakılır.Yöntem Stanford Üniversitesi’nden Pat Brown’un laboratuvarında
tasarlanmıştır.
Fotolitografi yönteminde, probun yüzeyini normal şartlar altında ışığı
geçirmeyen bir madde (maske) kaplar. Hibridizasyondan sonra UV ışığı
altında hibridize olan bölgeler bu maddeyi delerek kendilerini belli
ederler, hibridize olmayan bölgeler ise karanlıkta kalır.
Fotolitografi yöntemiyle çip üzerinde oligonükleotid sentezi.
Stanford çiplerinin DNA fragmentleri; genlerin PCR
amplifikasyonuyla elde edilip, cam film üzerine
robotic spotting yöntemiyle kusursuz bir şekilde
yerleştirilmesiyle elde edilir. PCR ürünleri cam film
üzerine yaklaşık 2 cm alana noktacıklar halinde
yerleştirilir. Her bir PCR ürününün yerleştirildiği
bölge ve içerdiği DNA dizisi kesin olarak bellidir.
Daha sonra slayt üzerindeki DNA’ lar kurutulur
(100º C de 2 sn ), sabitlenir (UV cross-linking), ve
denatüre edilerek tek zincirli hale getirilir (95ºC de
2 dk ). Hazırlanan çipler, işaretlenmiş cDNA
fragmentleriyle bağlanmak üzere kullanılırlar.
Gen array deneyleri tipik olarak farklı doku ya da koşullardaki ya da bir
uygulamadan sonraki gen ekspresyon düzeyini tayin etme amacıyla kullanılır.
Bu amaçla öncelikle çalışılan konuya göre farklı dokular, koşullar ya da
zamanlar baz alınarak RNA izolasyonu yapılır. Bu RNA örnekleri seyraltilerek
her bir örneğin eşit yoğunlukta olması sağlanır. Kural olarak, asıl RNA
populasyonundaki her mRNA molekülü için bu molecule komplementer olan
tek iplikli işaretlenmiş bir cDNA hazırlanır. Belli bir mRNA’nın yoğunluğu
arttıkça cDNA miktarı da artar. Problar , genellikle, işaretli nükleotidlerin
varlığında mRNA’nın tek iplikli cDNA’ya reverse transkripsiypnu ile üretilir. Bu
nedenle, işaretli prob, aslında mRNA populasyonunu temsil eden bir cDNA
molekülleri populasyonudur. Tek iplikli bir prob oluşturmak için RNA,
mRNA’daki polyA ucuna komplementer olan oligo dT primerleri, reverse
transkriptaz ve işaretlenmiş nükleotidler içeren bir reaksiyon karışımına konur.
Genellikle işaretlenmiş nükleotidler Cy3 (yeşil) ve Cy5 (kırmızı) gibi fluoresan
işaretlerle ya da kimyasal luminescent saptama ile saptanabilen digoksijenin
(DIG) ile etiketlenmiştir. Ele alınan bir klondaki hibridizasyon miktarı, ilgili gen
için bulunan mRNA miktarına karşılık gelir.
Gen array’i deneyleri bazen “revers northerns” olarak da adlandırılır.
Northern blot‘da, RNA bir filtre üzerine bir prob yardımıyla blot edilir ve
burada amaç belli bir mRNA türünü ayrı bir bant ya da spot olarak tespit
etmektir. Gen array hibridizasyonunda ise cDNA’lar bir filtre ya da lam
üzerine spotlanır ve bir mRNA populasyonundan elde edilen bir prob
yardımıyla hibridize edlir.
Array’lerde yaklaşık 500.000 kadar spot bulunabilmektedir. Her geçen gün
çalışılan konulara özgü array formatları dizayn edilmektedir.
Genellikle, denenecek her bir prob için birer kopya filtre ya da microarray
hazırlanır. Problar her array ile ayrı ayrı hibridize edilir. Filtre array’ler prob
ile inkube edilir ve Southern ya da northern emdirmedeki gibi yıkanır. Cam
microarray’ler için hibridizasyon bir coverslip altında yapılır ve lamlar
yıkama solusyonuna batırılarak yıkanır. Ticari array’ler hibridizasyon, yıkama
ve tespitin yapılmış olduğu kasetler içerisinde satılır.
Hibridize edilmiş prob DIG işaretleme için kimyasl
luminesens, microarray’ler için de doğrudan UV fluoresans
ile tespit edilir. Her spotun sıra yoğunluğu bir CCD kamera
ile ölçülür ve veri bir TIF görüntüsü olarak elde edilir.
Microarray tipleri
1. Oligonükleotid microarray’leri
Oligonükleotid microarray’lerinde problar dizisi (sekansı) bilinen ya da
tahmin edilen mRNA’lara uygun olacak şekilde dizayn edilir. Affymetrix,
GE Healthcare gibi firmalar.
Array’deki her bir geni temsil etmek üzere genellikle 25-70 nükleotid
uzunluğunda oligonükleotidler kullanılır.
2. Spotlu microarray’ler
Spotlu microarray’lerde problar oligonükleotid, cDNA veya
mRNA’lara karşılık gelen PCR ürünlerinin küçük parçaları olabilir. Bu
tip array’lerde genellikle iki farklı boya ile işaretlenmiş,
karşılaştırılacak iki örnekten (örneğin hasta ve kontrol) gelen cDNA
ile hibridize edilmiştir. Örnekler karıştırılıp tek bir microarray’e
hibridize edilebilir; lazer ile taranması Sonucunda açık ve kapalı
(up-regulated ve down-regulated) genler bir seferde görülebilir.
Dezavantajı gen ifadesi düzeyinin kesin olarak gözlenememesidir ;
ama bu yöntemle deneyin maliyeti azalır.
5. Spotlu microarray
Tipik bir microarray çalışmasına örnek olarak Stanford üniversitesi’nden
P.Brown’un çalışması gösterilebilir: Bu çalışmada cDNA probları galaktozlu ve
glukozlu ortamlarda yetiştirilen maya hücrelerinden elde edilmiştir. Farklı
problardan gelen sinyalleri birbirinden ayırmak için farklı fluoresans özellikteki
etiketlerle (Cy3 ve Cy5) işaretlenmişlerdir. Array biri Cy3 diğeri Cy5 olmak
üzere iki kez lazerle taranmış; böylece iki boyanın oranının ve dolayısıyla iki
farklı yetişme ortamındaki transcript oranının saptanabileceği iki parçadan
oluşan bir görüntü elde edilmiştir. Pseudocolor görüntülerinde, array’de
galaktoz varlığında daha güçlü ifade edilen genleri temsil eden spotlar yeşil,
glukoz varlığında daha güçlü şekilde ifade edilen genleri temsil eden spotlar
ise kırmızı , her iki koşulda da ifade edilen genler ise sarı renk ile gösterilmiştir.
3. Genotip microarray’leri
DNA microarray’leri aynı zamanda belli bir pozisyondaki bir genom dizisini
okumada da kullanılabilir. Genetik çeşitlilikten ve genetik hastalıklara
yatkınlıktan sorumlu olduğu düşünülen tek nükleotid polimorfizmlerini ( single
nucleotide polymorphisms –SNP) belirlemede kısa nükleotid array’leri
kullanılabilmektedir.
-Genel olarak genotip belirleme
-Adli tıp çalışmalarında
-Hastalıklara genetic yatkınlıkğın saptanması
-DNA temelli ilaç adaylarının tanımlanmasında
-SNP microarray’leri ayrıca kansere neden olan somatic mutasyonlar
-DNA bölgelerinin artan ya da kaybedilen (delesyon) profillerinin
belirlenmesinde de kullanılmaktadır..
Microarray’lerin kullanım alanları
1. Gen ifade profillerinin çıkarılması
2. Polimorfizm analizleri
3. Mutasyon analizleri
4. DNA dizi analizi
5. Evrimsel çalışmalar
6. Potansiyel terapotik ajanların bulunması,
geliştirilmesi, optimizasyonu ve klinik
değerlendirmesi
Microarray tekniğinin en göze çarpan kullanım alanı gen ifadesindeki
farklılıkların ölçülmesidir.
Genomik DNA’dan transkripsiyona uğrayan genlerin tamamına
transkriptom veya gen ekspresyon profili adı verilmektedir.
Bir hücrenin fenotipi ve fonksiyonu transkriptomu tarafından belirlenir.
Genom hücreden hücreye sabit olmasına karşın gen ekspresyon profili
hücrenin içinde bulunduğu koşullara göre hızla değişebilen bir
yapıdadır.
Çeşitli koşullarda genlerin ekspresyon düzeylerindeki değişimler takip
edilerek bu genlerin kodladığı proteinlerin fonksiyonları hakkında
önemli ip uçları elde edilebilir. Mikroarrayler çeşitli fizyolojik veya
patolojik süreçlerde gen ekspresyon paternlerindeki değişimi izlemek
için kullanılmaktadır.
DNA mikroarray kanser hücrelerindeki gen ekspresyon farklılaşmasının
karakterize edilmesinde oldukça kapsamlı bir şekilde kullanılır.
Örneğin, insan akciğer epitel hücreleri tarafından ekspresyonu yapılan
yaklaşık
5500
gen,
akciğer
kanserli
doku
genleri
ile
karşılaştırılabilmektedir.
Böylece kanserleşme sürecinde rol oynayan gen takımları hakkında bilgi
edinmek mümkündür.
Kanser tedavisindeki bir diğer önemli rolü, gen ekspresyon durumlarına
göre kanserleşen hücrelerin sınıflandırılabilmesidir. Örneğin; önceden
tespit edilemeyen malignant melanoma hücrelerinin alt tipleri, anlatım
paternleri ile belirlenebilmektedir.
Bu alt tipleri önceden belirleyebilmek diğer yöntemlerle mümkün
değildir. Benzer bir analiz akciğer kanser hücrelerinin gen ekspresyon
karşılaştırması ile yapılmaktadır.
Microarray teknolojisinin avantajları
Gen ifadesi modellerinin genel bir görüntüsünü elde etmeyi mümkün kılar.
Belli bir hücre türünün belirli bir ortam için gen ifadesi profili belirlenip, bu
profil farklı hücre tipleri ve farklı çevre koşullarındaki gen ifadesi
profilleriyle bu yöntemle karşılaştırılabilir. Kısa sürede ve oldukça pratik
olarak birkaç bin genin analizini yapmak mümkündür. Otomasyona dayalı
bir sistem olduğu için insan kaynaklı hataların ortaya çıkma ihtimali oldukça
düşüktür
Microarray teknolojisinin dezavantajları
Microarray’lerin bilimin hizmetine sunulması büyük bir heyecan yaratmış
olmasına rağmen bazı problemleri de beraberinde getirmiştir.
Tüm deney düzeneği nükleik asit hibridizasyon yöntemine bağlıdır ve yüksek
oranda benzerlik gösteren DNA dizileri problem yaratabilir.
Bu nedenle mikroarray’den elde edilen veriler klasik gen ekspresyon analiz
yöntemleriyle doğrulanmalıdır.
Ayrıca tüm microarray deneylerinin aynı hassasiyette olmayışı, ifadedeki
küçük değişikliklerin analizde fark edilemeyecek boyutta olması, birbirinden
farklı çipler kullanılarak yapılan deneylerin birbiriyle karşılaştırılmasında
yaşanan zorluklar, optimizasyon ve standardizasyon sorunları ve herhangi bir
deneyden elde edilen sonuçları her yönüyle değerlendirebilecek
biyoinformatik programların henüz geliştirilememiş olması karşılaşılan
sorunlardan birkaçıdır.
Kaynaklar
1. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. (1995). Quantitative monitoring of gene
expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. Oct 20; 270 (5235): 46770.
2. http://www.gene-chips.com/
3. http://www.affymetrix.com/
4. http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html
5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/microarrays.html
6. http://genome-www5.stanford.edu/
7. http://www.microarraystation.com/
Gen Tedavisi
Bir kişinin hastalığını tedavi etmek yada durumunu
iyileştirmek amacı ile hücrelerinin genetik modifikasyona
uğratılması işlemi.
1.Gen Artış Tedavisi
 Fonksiyon kaybının olduğu durumlarda
 Kanser tedavisinde
2. Hedeflenmiş Gen Mutasyonunun Düzeltilmesi
3. Hedeflenmiş Gen Ekspresyonunun Baskılanması




Özellikle infeksiyon hastalıklarının tedavisinde
Kanserde aktive olmuş onkogenlerin baskılanmasında
Otoimmün hastalıklarda
Kalıtımsal hastalıklarda fonksiyonu artan mutant allelin
baskılanmasında
Somatik Gen Tedavi Stratejileri
Ex vivo gen tedavisi
In vivo gen tedavisi
Hedef hücrelere başarılı terapötik genetik materyal
aktarımı
(gen transferi)
Ex vivo Gen Tedavisi
 Hastanın kendi hücreleri
kullanılır (otolog)
 immun reaksiyon oluşmaz.
 pahalıdır
 Transfeksiyon mümkün
olduğu kadar verimli olmalı
 Transgenin devamlı
ekpresyonuna sağlanmalıdır.
In vivo Gen Tedavisi
 Hastanın vücudundaki hücrelere
genetik manipulasyon yapılır.
 Sağlam gen nasıl aktarılır.
 Retroviral vektörlerle
İnsert’ün büyüklüğü.
Güvenlik.
Hedef hücrelerin aktif olarak
çoğalmaları sağlanmalı.
 Diğer seçenekler
Çıplak DNA’nın enjeksiyonu
Lipozomlar
Partikül bombardımanı
İnsektler
İn vivo Gen Transferi
Viral olmayan sistemler
-Plasmidler
-Oligonukleotitler
-Liposomlar
Viral Vektörler
• Adenoviral vektörler
• AAV (adeno ilişkili) vektörler
• Retroviral vektörler
Gen Transferinde
• Etkinlik
• Özgünlük
• Ekspresyon (anlatım) süresi
• Bağışık yanıt
• Toksisite
1. Transfer vektörü
2. gag/pol
293T
3. Rev
Replike olamayan
(Non-replikatif)
Lentivirus
4. Zarf (VSV-G)
Transfeksiyon
1
Üst sıvıyı topla
2
Hedef hücre infeksiyonu
108-109 IU/ml
3
Yeşil floresan protein (GFP) ve
Transgen ekspresyonu
4
24-48. saatler
GFP
FACS (floresan işaretli hücre seçimi)
Floresan ve ya konfocal mikroskop
Yan Etkiler
• Vektöre immün yanıt
• Toksisite
• İnsersional mutasyonlar (A. Fisher deneyimi) ?
• Yeni gen ürününe karşı immün yanıt
• Virüslerin genel toksik özellikleri
• İyi imalat uygulama (GMP-Good Manufacturing Practice)
problemleri
Terapötik Transgenlerin Aktarımında Kullanılan
Vektörler
 Viral vektörler




Retrovirüsler
Adenovirüsler
Adeno-ilişkili virüsler
Diğer virüsler
 Herpes Simpleks Virüs
 Nonviral Yöntemler. (Taşıma kapasitesi sonsuza yakındır.
İnfeksiyon yapma ve mutajenik özellikleri yoktur).
 Lipozom aracılıklı gen transferi
 Moleküler konjugatlar
 Çıplak DNA
 Doku içine DNA enjeksiyonu
 Partikül bombardımanı
Çıplak DNA
 Direkt hücre içine plazmid DNA olarak enjeksiyonu
 Altın partiküllerine takılarak doku içine verilmesi
 İn vivo düşük seviyede ekspresyon olması etkinliğini
azaltmaktadır.
 Yöntemin basitliği DNA aşılarının geliştirilmesine imkan
verebilir.
 Kullanım sahaları;
 Kanser immünoterapide
 Pankreatik insülin fonksiyonun tamiri
 Damar duvarı gelişiminin stimülasyonu
Lipozomlar
 Çift lipid tabakası mevcuttur.
 Katyonik lipizomların dış yüzeyinde DNA, spontan olarak ilişki
kurmaktadır.
 Anyonik lipidler yardımıyla DNA, iç yüzeye inkorpore olmakta ve
enzimatik degredasyondan korunmaktadır.
 Hücre membranı ile etkileşmektedir.
 In vitro olarak bazı hücre serilerinde %90 transfeksiyon
yapılabilmektedir.
 Lipozomlar, hücre içine endozom olarak alınırken gerekli
proteinler; Anti-MHC antikoru, transferrin, Sendai virüs veya onun Fproteini
 Nükleusa giren plazmid DNA’nın DNA bağlama proteinleri ile
transkripsiyonu sağlanır.
 Ayrıca, plazmid içindeki Epstein-Barr virüs Ori p ve EBNA1 genleri
sayesinde epizomal elementler olarak kalabilirler.
Moleküler Konjugatlar
 DNA, sentetik ligantlar veya proteinlere bağlanmaktadır.
 Hedeflenen proteinler;
 Asialoglikoprotein, transferrin, polimerik IgA, adenovirüs
 Transgen ekspresyonu geçicidir ve endozom/lizozomal
degredasyonu olmaktadır.
Modified from O'Connor, T.P. & Crystal, R.G. Nat. Rev. Genet.
Nature Biotechnology 29, 121–128 (2011)
www.eurotimes.org
MİKROBİYOM
• Belli bir ortamdaki mikropların, onların genetik
elemanlarının (genom) ve çevre ile
etkileşimlerinin bütünüdür.
• “Mikrobiyom” sözcüğü, insan fizyolojisi
üzerindeki etkileri nedeniyle insan vücudunda
yaşayan mikroorganizmaların insan genomunun
bir parçası olarak sayılması gerektiğini öne süren
Joshua Lederberg tarafından türetilmiştir
• Mikrobiyom terimi, insanla yaşayan mikroorganizmalar
ve insan vücudunun bir kompleks interaktif sistem
“süperorganizma” olarak ele alınması görüşünden
doğmuştur. Bu terim, ABD’li Nobel Ödüllü moleküler
biyolog Joshua Lederberg (1925-2008) tarafından 2001
yılında icat edilmiştir(18).
• Om (Ome, Ω), “bir şeyin bütünü” anlamı veren bir ektir.
Mikrobiyom vücudumuzu tam olarak paylaştığımız
ancak sağlık ve hastalık belirleyicileri olarak göz ardı
ettiğimiz kommensal, simbiyotik ve patojen
mikroorganizmalar ekolojik topluluğudur.
• Mikrobiyomun tümü sadece 200- 1000 gram
ağırlığında olmasına rağmen, insan vücudu
insan hücresinden 10 kat fazla mikrobiyal
hücre içerir.
• Mikrobiyomlar bundan başka toprak, deniz
suyu ve tatlı su sistemleri de dahil olmak üzere
bir çok ortamda tanımlanmıştır.
• Protistalardan insanlara kadar tüm bitki ve
hayvanlar, mikrobiyal organizmalar ile yakın
ilişki içinde yaşamaktadır. Ancak yakın zamana
kadar, bitkiler ve insanlar ile mikrobiyal dünya
arasındaki karşılıklı etkileşim büyük oranda
hastalık durumları ve nispeten az sayıda
simbiyotik vaka çalışmalarında tanımlanmıştır.
Canlı varlıklar izole halde yaşamazlar, ancak
kompleks topluluklar bağlamında
evrimleşmişlerdir.
• Mikropların nadir simbiyotik vaka çalışmasının
çok ötesinde, bir organizmanın fenotipinin
önemli bir parçası olduğu gittikçe artarak
anlaşılmaktadır.
• Bir organizmanın tüm yerleşik mikroplarına
“unutulmuş bir organ” denmektedir
• İnsan mikrobiyomu yaklaşık 100 trilyon mikrop
hücresi içermekte olup, her 10 hücreye karşı 1
insan hücresi denk gelmektedir .
• Bu nedenle insan fizyolojisini belirgin olarak
etkileyebilmektedir.
• Örneğin, sağlıklı bireylerde mikrobiyota
insanda olmayan geniş çapta metabolik
fonksiyonları sağlar.
• İnsan mikrobiyomunun büyük kısmı başta
gastrointestinal sistem(GİS) olmak üzere deri,
genitoüriner sistem ve solunum sisteminde
kolonize olmuştur. GİS yaklaşık 200 m2 gibi geniş
bir yüzey alanına sahip olması ve
mikroorganizmalar için zengin besin öğeleri
içermesi nedeniyle kolonizasyon için en uygun
ortamı sunmaktadır. İşte bu bölgelerde bulunan
binlerce tür mikroorganizma yeni nesil
sekanslama teknolojileri kullanılarak
tanımlanabilir hale gelmiştir.
Dünya Mikrobiyom Projesi
•
Doğal örnekleri toplamak ve dünyadaki
mikrobiyal toplulukları analiz etmek için
başlamıştır.
• Farklı biomlarda 200,000 kadar örnek toplama
hedefini gütmektedir, böylece mikrobiyal
kompozisyon ve etkileşim tarafından ekosistemler
ve çevreleri karakterize etmek için dünya
üzerindeki mikropların tam bir veritabanını
meydana getirecektir.
Bu verileri kullanarak, yeni ekolojik ve evrimsel
teoriler öne sürülebilir ve test edilebilir.
İnsan Mikrobiyom Projesi
• 2007 yılında İnsan Genom Projesinin (Human
Genome Project, HGP) bir devamı olarak İnsan
Mikrobiyom Projesi (Human Microbiome
Project, HMP) başlatıldı. ABD Ulusal Sağlık
Enstitüsü (NIH) girişimi olan bu proje ile hem
sağlıklı hem de hasta insanlarla (onların
mikrobiyal florası) ilişkili olduğu düşünülen
mikroorganizmaların tespit edilmesi ve
özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.
• İnsan Mikrobiyom Projesi, başlangıçta 300
sağlıklı insanın 15-18 vücut bölgesi ile ilişkili
mikrop topluluklarını belirlemeyi vaat etmiştir.
• Hem kültür edilen hem edilmeyen
bakterilerden 300’ü ağız boşluğundan olmak
üzere 1000 referans genoma kadar
sekanslanmıştır.
• İnsan Mikrobiyom Projesi, hızlı veri bildirme sözünü de
tutarak Data Analysis and Coordinating Center (DACC) /
Veri Analizi ve Koordinasyon Merkezi kurulmuştur. Web
sitesi http://www.hmpdacc. org tüm verilerin merkezi
deposudur. İşlenmemiş tüm 16S, WGS (Whole-Genome
Shotgun) ve referans genom sekans bilgileri,
Biyoteknoloji Bilgi Ulusal Merkezi’nde (National Center
for Biotechnology Information, NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/43021)
depolanmaktadır.
• DNA sekanslama teknolojilerinin hızla ilerlemesi,
gittikçe daha çok DNA sekansının daha düşük
maliyetle oluşturulmasını sağlamaktadır.
• Mikrobiyom örneklerinden izole edilen genomik
DNA sekanslarının Gbp (gigabase / 1,000,000,000
bp) miktarlarında elde edilmesi sıradan bir iş
olmuştur. Gelecek on yılda bu sınırın önemli
ölçüde genişleyeceği düşünülmektedir.
Amaç;
• İnsan sağlığı ya da hastalığı ile ilgili olarak insan
mikrobiyomunun nasıl değiştiğini test edip
sağlıkla olan ilişkisini belirlemektir. Başlangıçta
toplamda 115 milyon dolarlık bir bütçe ve beş
yıllık bir proje olarak planlansa da elde edilen
verilerle proje kapsamı genişletilmiştir.
• Günümüzde ABD yanında Avrupa ve Asya’nın
dahil olduğu dünya çapında, birden fazla
projeden oluşan disiplinler arası bir çalışma
haline gelmiştir.
• Amerika’nın önde gelen Harvard, Cambridge, Massachusetts,
Maryland, Michigan Üniversiteleri’nin iş biriliğiyle, İnsan
Mikrobiyom Projesi’nin aldığı yol ve önündeki hedefler
üzerine 29 Kasım 2012 tarihinde yayınlanan raporda;
• Projenin yeni yol haritasında,insan bünyesinde bulunan tüm
mikroorganizmaların;
-gen ve proteinlerinin veri bankalarına depolanması,
- bu proteinlerin görevlerinin,
-aralarındaki ilişkilerin,
-yer aldıkları metabolik reaksiyonların belirlenip –
-listelenmesi ve tüm bu veriler arasında geçiş
imkânının oluşturulması var.
• Bu kadar çok veriyi akademisyen ve medikalcilerin kolayca
ulaşıp kullanabileceği hale getirmek;
• Pek çok laboratuarın ortak katılımı ve hızlı çalışması sayesinde
en yakın zamanda tüm bilgilere erişim sağlanması;
• Böylece her türlü enfeksiyon, kabızlık gibi mikrobik nedenli
olabilecek anormallikler ve metabolik rahatsızlıkların oluşma
mekanizmaları hızlı ve verimli bir şekilde çözülebilecek olması,
• Bu örneklerden elde edilen bilginin işlenmesine ve insanların
rahatça ulaşabileceği şekilde depolanması=biyoenformatik.
Gevers D, Pop M, Schloss PD, Huttenhower C (2012) Bioinformatics for the Human Microbiome
Project. PLoS Comput Biol 8(11): e1002779
Mikroorganizmalar;
•
•
•
•
•
•
Deri,
Oral kavite mukozası,
Üst solunum yolu,
Üriner sistem
Genital sistem
en yoğun bulunduğu yer GİS dir.
• En önemli noktalardan biri mikrobiyal suşların
popülasyon boyutu kavramıdır.
• Bakteri popülasyonu,sayısını 20-30 dakikada iki
katına çıkartma yeteneğine sahiptir; bu nedenle
bakteri subdominant durumdan (104/g. barsak
içeriği) dominant duruma (10 milyar) kısa sürede
geçer ve hastalık oluşturabilir
• Fetus /Yenidoğan: GİS steril
• Mikroflora bir/iki saat içinde oluşmaya başlar
• 48 saatte kolonda; Enterobacter,
Staphylococci,
Streptococci
• 2. ile 5.gün;
Bifidobacterium
• Ek gıda;
E.Coli
Bacteroides spp.
Clostridium spp.
• Mide florası;
1.0-3.0 x 10 3-4 cfu/gr
Lactobasil’ler, H.pylori
• İnce barsakların florası;
3.0-5.0 x 10 5-9 cfu/gr
Bifidobacter’ler, Streptokoklar
Lactobasil’ler, Bacteroides’ler
• Kalın barsakların florası;
1-2 x 10 9-10 cfu/gr
Anaeroblar, Enterobacter’ler
Mikrofloranın Metabolik Fonksiyonları
• Antibiyotik ile ilişkili ishal
–C. difficile etkenlerden biridir; % 20-30
• Antibiyotiğe bağlı kolit
–C.difficile önemli bir etken; % 50-75
• Psödomembranöz enterokolit (PMEK)
–Hemen tamamen C.difficile’ye özel bir tablo,
endoskopide psödomembranlar mevcut
•
•
•
•
•
•
Antibiyotik tedavisi
Kolon mikrofloranın değişikliğe uğraması
C. difficile'ye maruz kalma ve kolonizasyon
Toksin A ve toksin B'nin salınması
Kolon mukozası hasarı (hemoraji, nekroz)
İnflamasyon
Antibiyotik İlişkili İshal: Diğer Nedenler
•
•
•
•
•
Candida albicans
Salmonella spp
Clostridium perfringens tip A
Staphylococcus aureus
Noninfeksiyöz sebepler
Alternatif Tedavi Seçenekleri
• İmmünolojik yaklaşımlar
• Konsantre anti-C.difficile sığır IgG’ nin C.difficile
toksininin sitotoksik ve enterotoksik etkisini
azalttığı bildirilmiştir.
• Oral uygulamayı takiben insan dışkısının
nötralizan aktivite içerdiği gösterilmiştir.
• Çalışmalar sürmekte ve ümit vaat etmektedir.
• Biyoterapi: Komensal barsak florasını yeniden
düzenlemeyi, böylece C.difficile’ ye karşı
kolonizasyon direncini sağlamayı amaçlar
• Lactobacillus acidophilus
• Lactobacillus GG
• Enterococcus faecium SF 68
• Non-toksinojenik C.difficile
• Yoğurt
• Bira mayası
• Saccharomyces boulardii
AB tarafından finanse edilen proje,
• 2013 yılının Aralık ayında başlayan 5 yıllık bir projedir.
• MyNewGut 4 ana alanda mikrobiyomun insan sağlığı üzerindeki rol ve etkisine dair
soruları ele alacaktır:
1-Bağırsak mikrobiyomunun rolünün, besin maddesi metabolizmasının belirli bileşenlerinin
ve enerji dengesinin araştırılması.
2-Hamilelik ve bebeğin gelişimi sırasında, çevresel faktörlerin bağırsak mikrobiyomu
üzerindeki etkisinin ve bunun beyin, bağışıklık sistemi ile metabolik sağlık üzerindeki
tesirinin anlaşılması.
3-Spesifik bağırsak mikrobiyomu bileşenleri ve bunlarla ilişkili metabolik bozukluklar ile
yemek yeme bozukluklarının belirlenmesi.
4-AB gıda sektörüyle işbirliği içinde, metabolik ve beyinle ilgili bozukluk riskinin azaltılması
amacıyla, bağırsak ekosistemini hedefleyen yeni gıda bileşenleri ile gıda prototiplerinin
geliştirilmesi( www.mynewgut.eu)
• MyNewGut projesi, sıkı bir şekilde kontrol edilen
epidemiyolojik (popülasyondaki vakaya, dağılıma ve hastalığın
kontrolüne bakan) ve insan müdahaleli araştırmalar (belirli bir
tedavi veya önleyici yöntemin test edilmesi) aracılığıyla
amaçlarına ulaşması planlanmıştır.
• Bağırsak mikrobiyomunun diyetle ne kadar değişebileceğine
dair anlayışımızı geliştireceği öngörülmekte,
• Büyük ölçekli teknolojiler ve sayısal teknikler kullanılması
planlanmaktadır.
• MyNewGut projesi, beynin, bağırsağın ve bunlarla ilişkili dokuların gelişimi ile işlevinde
bağırsak mikrobiyomunun rolüne dair güçlü bilimsel kanıtlar sağlamaya odaklanmıştır.
• MyNewGut, tüketilen yiyeceklerin metabolizmasını ve enerji dengesini düzenleyen
bağırsak mikrobiyomunun metabolitleri (normal metabolizmanın ürünleri olan) ile
bileşenleri tanımlayarak bilimsel bilgiyi arttırmayı planlamaktadır.
• Proje ayrıca stres gibi rahatsızlık riskleri üzerinde etkili olan bağırsak mikrobiyomu,
insan vücudu ve yaşam tarzı faktörleri arasındaki etkileşimleri de araştıracaktır.
• Çocukluk ve yetişkinlik gelişiminde bağırsak ile beyin etkileşimlerinin etkisi de ayrıca
incelenecektir.
• Bu sağlam bilimsel kanıt ve bilgi halk sağlığıyla ilgili önerileri iyileştirecektir.
• Ayrıca, projeden elde edilen bilgiler, tüketicilerin sağlığına potansiyel faydaları olan yeni
gıda ürünlerinin üretilmesinde kullanılabilir. Bilimsel verilerin üretilmesi, sektörel
inovasyona destek olarak sağlık beyanı onaylarına katkıda bulunacaktır.
Barsak florası; kompozisyonda değişim:
• Enfeksiyonlara duyarlılık
• Bağışıklık sistemi kaynaklı hastalıklar
• Kilo alma
• İnsulin direnci =DM
Barsak florası ve Obezite
• Lipid üretimi
• Yağ hücresi
İnsan Florası ve Obezite
“Doktor, yemiyorum”
Belki de doğrudur!
Fare
Gordon J, et al. PNAS 2007;104
Transplantasyon Deneyleri
Bebek Beslenmesi ve Flora
Anne sütü ile beslenme:
•
•
•
•
•
•
•
Obezite
Tip 1,2 DM
Otit media,
Gastroenterit,
Atopik dermatit,
Astım,
Lösemi(çocukluk)
Christopher G. Owen et al. Pediatrics 2005;115
• Kişiselleşen diş hekimliğinde her hastanın kendine özgü
biyolojik, klinik ve psiko-sosyal özelliklerinin klinik karar
verme sürecinin içine girildiği ve,
• İnsan genomu, mikrobiyomu ve proteomu üzerindeki
çalışmalar ile diş çürüğü geliştirme riski taşıyan
bireyleri erkenden saptama ve diş çürüğü yönetiminde
kişisel yaklaşımlar geliştirilebileceği sağlayabileceği
belirtmektedir.
Puerto Rico Üniversitesi/Prof.Dr. Evangelia Morou-Bermudez
• Deri bakterileri zaman içinde çok fazla
değişim geçirmeseler de kişiden kişiye değişir.
• Tek yumurta ikizleri bile bakteriyel konuk sayısı ve
türü açısından farklılıklar gösteriyor.
• Son yapılan bir çalışmaya göre bizlere özgü
bakteriyel parmak izi, dokunduğumuz bilgisayar
klavyesi veya mouse gibi nesneler aracılığı ile
transfer olur ve yeni yerinde iki hafta kadar
kalabiliyor.
Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 107, p
.
6477
Teşekkürler…