HEPATOSELLÜLER KARSİNOMALI HASTALARDA p53 KODON72

T.C
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
HEPATOSELLÜLER KARSİNOMALI HASTALARDA
p53 KODON72 VE MDM2 SNP309 GEN
POLİMORFİZİMLERİNİN SIKLIĞI VE TÜMÖRE AİT
KARAKTERİSTİKLERLE KARŞILAŞTIRILMASI
Dr. Ahmet Taner SÜMBÜL
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. Hikmet AKKIZ
ADANA–2008
T.C
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI
HEPATOSELLÜLER KARSİNOMALI HASTALARDA
p53 KODON72 VE MDM2 SNP309 GEN
POLİMORFİZİMLERİNİN SIKLIĞI VE TÜMÖRE AİT
KARAKTERİSTİKLERLE KARŞILAŞTIRILMASI
Dr. Ahmet Taner SÜMBÜL
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Prof. Dr. Hikmet AKKIZ
TF2007LTP16
ADANA–2008
TEŞEKKÜR
İç Hastalıkları ABD’da göreve başladığım ilk günden itibaren benimle
çalışmaktan mutlu olduğunu söyleyerek sürekli beni motive eden, desteğini
esirgemeyen ve vizyonuyla ufkumuzu açmaya çalışan değerli tez hocam Prof. Dr.
Hikmet Akkız’a,
Tez sürecinde her basamakta bana yardım eden Dahiliye Gastroenteroloji
Laboratuvarından değerli çalışma arkadaşlarım Arş. Gör. Süleyman Bayram, Sağlık
Teknikeri Aynur Bekar ve Kimyager Ersin Akgöllü’ye,
İç Hastalıkları Uzmanlığı eğitim sürecince emeği geçen tüm hocalarıma ve
mesai arkadaşlarıma,
Eğitim
hayatım
boyunca
hedeflerime ulaşmamda
yardımcı olan tüm
eğitmenlerime,
Hayata gözlerimi açtığım ilk andan itibaren desteklerini esirgemeyen,
hedeflerimi hedefleri olarak kabul eden anne ve babama,
Hayatımı paylaşarak yükümü hafifleten, bana katlanan eşime sonsuz teşekkürü
bir borç bilirim.
Dr. Ahmet Taner SÜMBÜL
ADANA 2008
I
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
TEŞEKKÜR ................................................................................................................. I
İÇİNDEKİLER ............................................................................................................II
TABLO LİSTESİ.................................................................................................. ….IV
ŞEKİL LİSTESİ.......................................................................................................... V
KISALTMALAR LİSTESİ ........................................................................................ VI
ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER.......................................................................VIII
ABSTRACT-KEYWORDS ....................................................................................... IX
1. GİRİŞ ve AMAÇ ..................................................................................................... 1
2. GENEL BİLGİLER.................................................................................................. 3
2.1. Hepatosellüler Karsinomanın Epidemiyolojisi ................................................. 3
2.1.1. Global İnsidans .................................................................................... 3
2.1.2. Irk ve Etnisite....................................................................................... 4
2.1.3. Cinsiyet................................................................................................ 5
2.1.4. Yaş ..................................................................................................... 5
2.2. Risk Faktörlerinin Dağılımı ............................................................................ .6
2.2.1. Hepatosellüler Kanser için Risk Faktörleri………..……………………6
2.2.1.1. Hepatit B Virüs Enfeksiyonu ……………………………...……7
2.2.1.2. Hepatit C Virüs Enfeksiyonu………………………… ……… 12
2.2.1.3. Alkol………….. …………………..………..…………………..14
2.2.1.4. Toksik Maddelere Maruziyet …….……………………………..15
2.2.1.5. Non Alkolik Yağlı Karaciğer Hastalığı ………………………. 15
2.2.1.6. Obezite…..…………………………… …..………………..... .16
2.2.1.7. Diyabetes Mellitus…………..………………..…………………16
2.2.1.8. Sigara……………………………………………… …………...17
2.2.1.9. Oral Kontraseptifler…..…………………………………………17
2.2.1.10 Hemokromatozis……………………………………………… 18
2.2.1.11.Diyet……………………….................................. ……………19
2.3. Hepatosellüler Kanser’de Tanı………… .................................... …………..20
2.3.1. Çapı 2 cm’den Büyük Lezyonlar …………………………………... . 20
2.3.2. Çapı 2 cm’den Küçük Lezyonlar…………………...............................20
2.3.3. Karaciğer Biyopsisinin Rolü ............................................................. 20
2.3.4. Serum Markerlarının Rolü ……………………………………… ..….21
2.4. Hepatosellüler Karsinomada tarama……….………… …………………...22
2.5. Doğal Seyir ve Prognoz……………………………………………………...23
2.6. Hepatosellüler Kanser’de Yönetim………………………………………….26
2.6.1. Cerrahi Tedavi………………………………………………………..26
2.6.1.1.Rezeksiyon………………………………………………………26
2.6.1.2.Karaciğer Nakli………………………………………………….27
2.6.2. Cerrahi Dışı Tedavi Modaliteleri……………………………………..27
II
2.6.2.1.Lokal Ablasyon………………………………………………….28
2.6.2.2.Transarteryel Tedavi………………………………………….....28
2.6.2.3.Kombinasyon Tedavisi………………………………………….28
2.6.2.4.Sistemik Tedavi…………………………………………………29
2.7. Hepatosellüler Karsinogenez………………………………………………...30
2.7.1.Retinoblastoma Yolağı………………………………………………...31
2.7.2.Wnt Yolağı…………………………………………………………….31
2.7.3.p53 Yolağı……………………………………………………………..32
2.8. Tek Nükleotid Polimorfizimleri ve Klinik Önemleri……….……………….33
2.8.1. p53’ün Fonksiyonu ve Kodon 72 Arjinin/Prolin Polimorfizminin
Önemi…………………………………………………………………….…..34
2.8.2. MDM2 SNP 309 Gen Polimorfizminin Önemi………………………36
3. GEREÇ ve YÖNTEM ............................................................................................ 38
3.1. Hasta Şeçimi……………………...…………................................................. 38
3.2. Çalışma Dışı Bırakma Kriterleri..................................................................... 39
3.3. Biyokimyasal Ölçümler ................................................................................. 39
3.4. Çalışmada kullanılan araç gereçler………………………………………….... 40
3.5. Çalışmada kullanılan araç gereçler ……………………………………………41
3.6. Çalışmada kullanılan stok solusyonlarının hazırlanması …………………...…41
3.7. DNA izolasyon yöntemi ………………………………………………………44
3.8. P53 ve MDM2 genlerinin PCR ile çoğaltılması ………………………………45
3.8.1. P53 kodon 72 Arginin/Prolin Polimorfizminin genetik analizi ………...45
3.8.2. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin genetik analizi …………………47
3.9. Çoğaltılmış DNA’ların Elektroforezde Değerlendirilmesi ……………………49
3.10. PCR Ürünlerinin Restriksiyon Enzimleri ile Kesimi ………………………..50
3.10.1. P53 Geninin Kodon 72 Arg/Pro Polimorfizminin genotiplendirilmesi 50
3.10.2. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin genotiplendirilmesi…………..54
3.11. İstatistiksel Analiz……………………………..………................................ 56
4. BULGULAR.......................................................................................................... 57
5. TARTIŞMA........................................................................................................... 89
6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER ................................................................................. 98
KAYNAKLAR ....................................................................................................... 99
ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………… ............................. 112
III
TABLO LİSTESİ
Sayfa No
Tablo No
1. Kompanse Sirozu olan Hastalarda HSK İnsidansı …………………………….. ….7
2. Hepatosellüler Kanser Tanısı …………………………………………………….…21
3. Hepatosellüler Kanser Yönünden Taranması Gereken Yüksek Riskli gruplar….23
4. HSK için Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) evreleme sistemi ……..............25
5. Okuda Evreleme Sistemi……………………………………………………………...25
6. Child Pugh Skorlama Sistemi ………………………………………………………..26
7. Altta Yatan Sirozu olan HSK’lı Hastalarda Kadavradan Karaciğer Transplantı
için Ulusal Organ Paylaşım Kriterleri (UNOS)……………………………….……...29
Tablo 8. P53Kodon72 Arginin Prolin Polimorfizminin Optimum Amplifikasyonun
Gerçekleştirildigi PCR Reaksiyonu Karışımı ………………………….…………... 44
Tablo 9. P53 Kodon 72 Arginin Prolin Polimorfizmini için PCR Sıcaklıkları………………44
Tablo 10. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin Optimum Amplifikasyonun
Gerçekleştirildigi PCR Reaksiyonu Karışımı ………………….………………….48
Tablo 11. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin için PCR Sıcaklıkları………………………48
Tablo 12. Hasta ve Kontrol Grubunun Demografik Özellikleri……........................................57
Tablo 13. Hastalara ait Klinik Özellikler.....................................................................................58
Tablo 14. Hastalara ait Laboratuar Değişkenleri ……………………………………………...60
Tablo 15. HSK ve Kontrol Grubu arasında MDM2 ve P53 Genotip Oranlarının
Karşılaştırılması ………………………………………………………………….. 61
Tablo 16. MDM2 genotip allelerine ve baskın ve resesif genotiplere göre Lojistik regresyon
analizi.............................................................................................................................64
Tablo 17. P53 genotip allelerine ve baskın ve resesif genotiplere göre Lojistik regresyon
analizi…………………………………………………………………………..…….. 66
Tablo 18. MDM2 ve p53 Genotip Kombinasyonlarına Göre HSK Riskleri ……………..…..67
Tablo 19. MDM2 ve p53 Genotipleriyle Hastaya ve Tümöre Ait Karakteristiklerin
Karşılaştırılması…………………………..………………………………………..68
Tablo 20. MDM2 ve P53 Genotipleri ve Sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh
Klasifikasyonu arasındaki İlişki………………..……………………………………77
Tablo 21. MDM2 ve p53 Genotipleriyle HSK Evresi Arasındaki İlişki…………………..….80
Tablo 22. MDM2 ve p53 Genotipleriyle Tümör Nodülaritesi Arasındaki İlişki …………..…83
Tablo 23. MDM2 ve p53 Genotipleri ve Tümörün Vasküler İnvazyonu Arasındaki İlişki.....86
Tablo
Tablo
Tablo
Tablo
Tablo
Tablo
Tablo
IV
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No:
Sayfa No:
Şekil 1. HSK’nın Dünya Genelinde Görülme Sıklıkları………………………………………. ... 4
Şekil 2. HCV İnfeksiyonu Doğal Seyri…………………………………………………………..... 13
Şekil 3. Sirozlu hastalarda HSK yönünden takip algoritması…………………………………... 24
Şekil 4. HSK’lı hastada yönetim algoritması……………………………………………………... 30
Şekil 5. p53 geni Kodon 72 Arg/Pro Polimorfizminin tespiti için Polimeraz Zincir
Reaksiyonu sonucunun %2’lik agaroz jeldeki
görüntüsü………………………………………………….……………….……………... 49
Şekil 6. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin Tespiti için Yapılan Polimeraz Zincir
Reaksiyonu sonucunun %2’lik agaroz jeldeki görüntüsü…………………………….. 50
Şekil 7. PCR Tabanlı RFLP yöntemi ile MSPA1I (New England Biolabs, Beverly, MA)
Restriksiyon Enzimi Kullanılarak p53 Genin analizi ………………….………….........53
Şekil 8. PCR Tabanlı RFLP yöntemi ile MSPA1I Restriksiyon Enzimi KullanılarakMMD2
SNP 309 T/G Polimorfizminin analizi….……………………………………..................56
Şekil 9. HSK’lı grupla Kontrol Grubunda MDM2 Genotip Sıklıkları .………………………....62
Şekil 10. HSK’lı grupla Kontrol Grubunda p53 Genotip Sıklıkları ………..……………...........63
Şekil 11. MDM2 Genotip HSK’ya yakalanma yaşı arasındaki ilişki …………………………....69
Şekil 12. p53 Genotipleriyle HSK’ya Yakalanma Yaşı Arasındaki İlişki………………………………….70
Şekil 13. MDM2 genotipleri ve yaşam süresi arasındaki ilişki …………………………………..71
Şekil 14. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalarda Yaşam Süresi Arasındaki İlişki……………....72
Şekil 15. MDM2 Genotipi ve Tümör Boyutu Arasındaki İlişki…………………………………..73
Şekil 16. p53 Genotipleri ve HSK’lı Hastalardaki Tümör Boyutu Arasındaki İlişki…………...74
Şekil 17. MDM2 Genotipleriyle Serum Alfafetoprotein Düzeyi Arasındaki İlişki………………75
Şekil 18. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalarda Serum Alfafetoprotein Düzeyi Arasındaki
İlişki………………………………………………………………………………………....76
Şekil 19. MDM2 Genotipleri ve Sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh Klasifikasyonu
arasındaki İlişki…………………………………………………………………………….78
Şekil 20. p53 Genotipleri ve Sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh Klasifikasyonu
arasındaki ilişki…………………………………………………………………………….79
Şekil 21. MDM2 genotipi ve HSK Evresi Arasındaki İlişki……………………………………….81
Şekil 22. p53 Genotipi ve HSK Evresi Arasındaki İlişki…………………………………………..82
Şekil 23. MDM2 Genotipleri ve Tümör Nodülaritesi Arasındaki İlişki………………………….84
Şekil 24. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalardaki Tümör Nodülaritesi Arasındaki İlişki……...85
Şekil 25. MDM2 Genotipleri ve Tümörün Vasküler İnvazyonu Arasındaki İlişki……………....87
Şekil 26. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalarda Tümörün Vasküler İnvazyonu Arasındaki
İlişki……………………………………………………………………………………...…..88
V
KISALTMA LİSTESİ
AFB1
: Aflatoksin B-1
AFP
: Alfafetoprotein
ALT
: Alanin amino transferaz
ASPP
: Apopitozisi stimüle edici proteinler ailesi
AST
: Aspartat amino transferaz
BCLC
: Barselona klinik kanser evreleme sistemi (Barcelona Clinical Cancer
Staging System )
CBC
: Tam kan sayımı
Cr
: Kreatin
CRP
: C-Reaktif Protein
Ç.Ü.T.F.
: Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
DM
: Diyabetes Mellitus
HBsAG
: Hepatit B yüzey antijeni
HBeAG
: Hepatit B e antijeni
HBV
: Hepatit B virüs
HCV
: Hepatit C virüs
HDV
: Hepatit D virüs
HNPPC
: Herediter non polipozis koli
HSK
: Hepatosellüler Karsinoma
INR
: Uluslar arası normalleştirme oranı (International Normalized Ratio)
IL-6
: İnterlökin-6
LOH
: Allel Kaybı (Loss of Heterozigoty)
MDM2
: Murine Double Munite-2
MELD
: Son dönem karaciğer hastalığı için model skoru (Model for End Stage
Liver Disease)
NASH
: Non Alkolik Steatohepatit
NAYKH
: Non Alkolik Yağlı Karaciğer Hastalığı
VI
OKS
: Oral Kontraseptif
PCR
: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
PTZ
: Protrombin zamanı
Rb
: Retinoblastoma
RE
: Restriksiyon enzimi
RFLP
: Restriksiyon fragman uzunluk polimorfizmi
SNP
: Tek nükleotid polimorfizmi (Single Nucletide Polymorphism)
Sp-1
: Stimülatör protein-1
TNF
: Tümör Nekrotizan Faktör
VII
Özet
Hepatosellüler Karsinomada p53 Kodon72 ve MDM2 SNP309 Polimorfizimlerinin
Sıklığı ve Bu Polimorfizmlerin Tümöre Ait Karakteristiklerle Karşılaştırılması
Amaç: p53 tümör süpressör yolağı kanser gelişiminde önemli rol oynar. Murine double
minute 2 (MDM2) geni p53 tümör süpressör yolağının düzenlenmesinde kritik bir role
sahiptir. MDM2 geninin intronik promoter’ında bulanan tek nükleotid polimorfizmi,
SNP309 T>G’nin hem kalıtsal hemde spdoradik kanserlele ilişkisi olduğu gösterilmiştir.
Bununla birlikte wild-tip p53 geninde ekzon 4 kodon 72’de arjinin aminoasitinin prolin
aminoasitine dönüşümüne (Arg72Pro) neden olan tek nükleotid polimorfizminin
insanda değişik tip kanserlele ilişkisinin olduğu gösterilmiştir. Biz bu çalışmada
hepatosellüler karsinomalı hastalarda MDM2 SNP309 ve p53 Arg72Pro
polimorfizmlerinin sıklıklarının ve bu polimorfizmlerin tümöre ait karakteristiklerle
ilişkisinin araştırılmasını amaçladık.
Gereç ve Yöntem: Çalışmamıza 128 hepatosellüler karsinomalı (HSK) ve 128 kontrol
vaka alındı. MDM2 SNP309 ve p53 kodon72 Arg/Pro polimorfizmlerinin bulunduğu
bölgeler polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılarak genotiplendirilme
restiriksiyon endonükleaz parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemiyle yapıldı. Bu
gen polimorfizimleri ile hepatosellüler karsinoma riski ve tümöre ait karakteristikler
arasındaki ilişki SPSS 15.0 (USA) istatistik programı kullanılarak analiz edildi.
Bulgular: MDM2 G/G ve p53 Pro/Pro genotipleri HSK’lı grupta kontrol grubuna göre
daha sık olarak saptandı (sırasıyla, p: 0,009 ve p: 0,037). Lojistik regresyon analizi
sonucunda MDM2 GG genotipi HSK riskini TT genotipine göre 2,76 kat artırırken (p:
0,036), p53 kodon 72 Pro/Pro genotipi Arg/Arg genotipine göre HSK riskini 3,04 kat
artırdığı saptanmıştır (p: 0,016). MDM2 G/G ve p53 Pro/Pro kombinasyonun HSK
riskini 11,7 kat artırıken bu kombinasyonun HSK riski üzerinde sinerjitik bir etkisinin
olduğu görülmüştür (p: 0,027).
Sonuç: Elde etmiş olduğumuz bulgular p53 kodon 72 Pro/Pro genotipi ve MDM2
SNP309 G allelinin sirozlu ve kronik hepatitli hastalarda potansiyel olarak
hepatosellüler karsinoma için genetik risk faktörü olduğunu göstermektedir. Ayrıca p53
kodon 72 Pro/Pro genotipi ve MDM2 SNP309 G alleli sirozlu ve kronik hepatitli
hastalarda hepatosellüler karsinoma riskinin belirlernmesinde önemli bir genetik marker
olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Anahtar Sözcükler: Hepatosellüler karsinoma, MDM2 SNP309, p53 kodon72
Arg/Pro, Tek Nükleotid Polimorfizmi.
VIII
Abstract
p53 Codon72 and MDM2 SNP309 Polymorphisms in Hepatocellular Carcinoma
and Comparison of them with Tumor Characteristics
Background and aims: The p53 tumor suppressor pathway plays an important role in
cancer development. Murine double minute 2 (MDM2) gene is playing critical role in
regulating tumor suppressor function of this pathway. A single nucleotide
polymorphism (SNP) in the MDM2 in the intronic promoter, SNP309 was shown to be
associated with both hereditary and sporadic cancers in humans. In addition, the wildtype p53 gene exhibits a polymorphism at codon 72 in exon 4, that causes a substitution
of proline for arginine (Arg72Pro) and this substitution was shown to be related with
different types of cancers in humans. In this study, we aim to determine the frequency
and the association of MDM2 SNP309 and p53 Arg72Pro polymorphism in patients
with hepatocellular carcinoma.
Material and Methods: We conducted 128 control and 128 patients with hepatocellular
carcinoma in our study. The MDM2 and p53 gene promoter region was amplified by
polymerase chain reaction (PCR) and the SNP309 and Arg72Pro genotype determined
by restriction enzyme digestion of the amplified DNA fragment. SPSS 15.0 (USA)
statistic programme was used to determine the association between genotypes and
hepatocellular carcinoma risk and charecteristics of tumors.
Results: The MDM2 G/G and p53 Pro/Pro genotypes were more frequent in HCC group
than in non-HCC group (p: 0.009 and p: 0.037, respectively). Logistic regrssion for the
presence of HCC revealed that the odds ratio (OR) for MDM2 G/G over T/T was 2.76
(p: 0.036), and that of p53 Pro/Pro over Arg/Arg was 3.04 (p: 0.016). Combined,
MDM2 G/G and p53 Pro/Pro had a synergistic effect on HCC risk, with an OR of 11.7
(p: 0.027).
Conclusion: Our findings suggest that P53 codon72 Pro/Pro genotype and having G
allel in MDM2 SNP309 position are potentially genetic risk factors for hepatocellular
carcinoma in patients with chronic hepatitis and cirhosis. p53 codon72 Pro/Pro
genotype and the G allele of MDM2 SNP309 could serve as an important genetic
marker to identify a higher risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic
hepatitis and cirhosis.
Keywords: Hepatocellular carcinoma, MDM2 SNP309, p53 Kodon72 Arg/Pro , Single
nucleotide polymorphism.
IX
1.GİRİŞ ve AMAÇ
Hepatosellüler karsinoma (HSK) dünya genelinde en sık görülen beşinci
tümördür ve yılda 500.000 den fazla ölüme yol açar.1,2 HSK insidansı dünya üzerinde
benzer değildir ve altta yatan karaciğer hastalığının prevelansına göre farklılıklar
gösterir.3 HSK gelişiminde bilinen en önemli risk faktörü sirozdur.4 Hepatit B virüsü
(HBV) ve hepatit C virüsüyle (HCV) olan kronik infeksiyonlar dünya genelinde sirozun
en önemli nedenleridir. Asya’da kronik HBV infeksiyonu HSK etyolojisinde en önemli
nedenken gelişmiş ülkelerde bunun yerini alkolik siroz ve kronik HCV enfeksiyonuna
ikincil gelişmiş siroz alır.5,6 HBV’nin genotipi, viral yük ve bazal core promoter ve
precore bölgesindeki mutasyonlar HSK gelişimiyle ilişkilidir.5,7−9 Ayrıca yaş, cinsiyet,
alkol kullanımı, eşlik eden hastalıklar gibi ek faktörlerde HSK gelişiminde katkıda
bulunurlar.10
MDM2 p53’ün önemli bir negatif regülatör proteinidir ve N-terminal
transaktivasyon bölgesine bağlanarak p53’ün transkripsiyonel etkisini inhibe eder.11 Son
zamanlarda saptanan MDM2 geninin birinci intronu içerisinde ve p53’e yanıt veren
bölgede lokalize olan 309 T>G tek nükleotid polimorfizmi (SNP309, rs2279744),
Situmulatör protein-1 (Sp1) transkripsiyon faktörünün bağlanma bölgesini ve bunu
takiben MDM2 protein düzeyini artırdığı gözlemlenmiştir.12 MDM2’deki bu artış
p53’ün transkripsiyonel aktivitesinin direkt inhibisyonuna ve bununla birlikte hasara
uğramış hücrelerin hücre döngüsü kontrol noktalarından kaçışına ve karsinojenik hale
gelmesine neden olmaktadır.13 MDM2 309 T>G tek nükleotid polimorfizmi bazı
malignensilerin erken gelişimiyle ilişkilidir ve bu durum bu polimorfizmin insanlarda
tümör gelişiminde güçlü bir etkisinin olduğunu göstermektedir.14 Bundan başka, Dharel
ve arkadaşları kronik HCV infeksiyonlu hastalarda MDM2 SNP 309’un HSK ile ilişkili
olduğunu göstermişlerdir.15
p53 tümör süpressör geninin fonksiyon kaybı hepatokarsinogenezisin çoklu
basamağındaki kritik bir role sahiptir bundan dolayı, p53 geni HSK gelişme riskinin
modülasyonunda iyi bir adaydır.16 p53 geni içerisinde de bir çok genetik polimorfizmler
mevcuttur ve bunlardan kodon 72 içerisindeki ve 215. nükleotid pozisyonundaki G>C
polimorfizmi (rs1042522) fonksiyonel olarak önemlidir ve 72 kodondaki arjinin
1
aminoasitinin prolin aminoasitine dönüşümüne neden olmaktadır.17 Dumont ve
arkadaşları Arg72 varyantının Pro72 varyantına göre apoptozisi daha efektif olarak
uyardığını ve bu durumunda kanser riskini azaldığını göstermişlerdir.18 Pro72
varyantının bir çok çalışmada bazı malignensiler için önemli bir risk faktörü olduğu
bildirilmiştir.19, 20, 21 Zhang ve arkadaşları akciğer kanserinde MDM2 SNP 309 ve p53
Arg72Pro’nin çift gen etkileşimini incelemişler ve bu iki polimorfizmin akciğer kanseri
riskini birbirlerinin etkisini artıracak şekilde artırdıklarını göstermişleridir.13 Bu iki
polimorfizmin kombine etkisi herediter non polipozis koli kolorektal kanserdede
(HNPCC) test edilmiş ve sonuç olarak MDM2 SNP309 un tek başına veya p53
Arg72Pro ile birlikte HNPCC’nin tanı anındaki hasta yaşını etkilemediği bulunmuştur.
2005–2008 yılları arasında, ÇÜTF Balcalı Hastanesi Dahiliye Gastroenteroloji,
Dahiliye Yoğun Bakım ve Genel Cerrahi kliniklerinde, klinik, laboratuar, radyolojik ve
patolojik bulgularla Hepatosellüler Karsinoma (HSK) tanısı konulan hastalar ve benzer
yaşlarda kontrol grubu hastalarda MDM2 ve P53 Gen Polimorfizimlerinin sıklığının
araştırılması amaçlandı.
Bu amaçla çalışmaya dahil edilen hastalardan toplam 5 cc kan örneği alındı ve
tüm hastaların klinik, biyokimyasal ve radyolojik bulguları kaydedildi. Bu kan
örneklerinden genomik DNA izolasyonu yapıldı ardından polimeraz zincir reaksiyonu
(PCR) yöntemiyle MDM2 SNP309 ve p53 kodon 72 polimorfizimlerinin bulunduğu
bölgeler amplifiye edildi. Amplifikasyon ürünleri restriksiyon fragman uzunluk
polimorfizmi (RFLP) yöntemiyle genotiplendirildi.
Bu vaka kontrollü prospektif çalışmada, HSK’lı hastalarda MDM2 ve P53 Gen
Polimorfizimlerinin sıklığı ve bunun tümöre ait klinik, biyokimyasal ve radyolojik
bulgularla olan ilişkisinin araştırılması planlandı. Ayrıca bütün bu bulguların hastaların
yaşam süresiyle olan ilişkisinin bulunması amaçlandı.
2
1. GENEL BİLGİLER
2.1.Hepatosellüler Karsinomanın Epidemiyolojisi
Primer karaciğer kanseri olan hepatosellüler karsinoma primer karaciğer
kanserlerinin % 85-90’nını oluşturur.22 Dünya genelinde beşinci sıklıkta görülen
kanserdir ve kanser nedeniyle ölümde üçüncü sırayı alarak, yılda 500.000’den fazla
kişinin bu nedenle ölümüne yol açar. HSK coğrafik bölgeler, etnik gruplar ve cinsiyetler
arasında farklılık gösterir.
2.1.1. Global İnsidans
HSK dünya genelinde eşit sıklıkta görülmez (Şekil 1.). HSK vakalarının
çoğunluğu Sub-Saharan Afrika ve Doğu Asya’da (% 80) görülürken, Kuzey Avrupa ve
ABD düşük insidans bölgelerini oluşturur. Çin’den bildirilen vakalar dünya genelinde
görülen vakaların % 50’sinden fazlasını oluşturur (yaşa göre standartize edilmiş
insidans oranı: erkeklerde, 35,2/100.000; kadınlarda 13,3/100.000). Diğer yüksek
oranda bildirilen bölgeler arasında (>20/100.000) Senegal (erkeklerde; 28,47/100.000,
kadınlarda;
12.2/100.000),
Gambia
(erkeklerde;
39,67/100.000,
kadınlarda;
14,6/100.000), ve Güney Kore (erkeklerde; 48,8/100.000, kadınlarda; 11,6/100.000) yer
alır.
Kuzey ve Güney Amerika, Kuzey Avrupa ve Okyanusya’da düşük oranlarda
görülür (<5,0/100.000). Tipik olarak insidans oranları Kanada (erkeklerde; 3,2/100.000,
kadınlarda;
2.0/100,000),
1,1/100.000),
İngiltere
Kolombiya
(erkeklerde;
(erkeklerde;
2,2/100.000,
2,2/100.000,
kadınlarda;
kadınlarda;1,1/100.000),
ve
Avustralya’da (erkeklerde, 3,6/100.000; kadınlarda,1,0/100.000) civarındadır.
Güney Avrupa ülkelerinde orta sıklıkta görülür (5,0-20,0/100.000).23 İspanya
(erkeklerde; 7,5/100.000, kadınlarda; 2,4/100.000), İtalya (erkeklerde; 13,5/100.000,
kadınlarda; 4,6/100.000), ve Yunanistan’da (erkeklerde; 12,1/100.000, kadınlarda;
4,6/100.000).
Bununla birlikte HSK insidansı değişik bölgelerde giderek düşmektedir.25 1978
ile 1997 arasında Hong Kong ve Şangay’daki Çinli populasyon arasında ve Singapur’
da insidans belirgin olarak düşüş göstermiştir.23
3
Şekil 1. HSK’nın Dünya Genelinde Görülme Sıklıkları (100.000 kişide)
1- Yüksek insidans bölgesi: Sub Saharan Afrika (Yıllık insidans >20/100.000) Güney
Afrika, Çin, Tayvan, Singapur
2- Ara insidans bölgesi: Japonya (Yıllık insidans 10-20/100.000) Yunanistan, İtalya,
Güney Pasifik Adaları, Türkiye
3- Düşük insidans bölgesi: Kuzey Avrupa (Yıllık insidans 5/100.000), ABD
Bu bölgelere ek olarak Japonya’da da 1993 ile 1997 arasında HSK insidansında
azalma bildirilmiştir. Bu duruma yol açan nedenlerden birisi HSK’nın yüksek oranda
görüldüğü Asya ülkelerinde tüm yenidoğanların HBV’ye karşı aşılanmasıdır.26 Ayrıca
1980’lerden sonra Çin hükümetinin diyetle ilgili yaptığı düzenlemeler çeşitli bölgelerde
hepatokarsinojen aflatoksin B1’le karşılaşma oranlarını azaltmış ve bununla birlikte
HSK insidansında da düşüş görülmüştür.27
Buna karşılık düşük oranda görüldüğü bölgelerde insidansta artış, bu bölgelerde
HCV prevelansının ve alkol kullanımının yüksekliğine bağlı artmış siroz görülme
oranlarıyla ilişkili olabilir.
2.1.2. Irk ve Etnisite
HSK insidansı aynı bölgede yaşayan değişik populasyonlarda değişiklikler
gösterebilir. Örneğin Singapur’da yaşayan Hint’li, Çin’li, Malay populasyonları
4
arasında yaşa göre ayarlanmış insidans oranları 1993 ile 1997 arasında Çin’li erkeklerde
21,21/100.000, Hint’li erkeklerde 7,86/100.000 oranında saptanırken, aynı bölgede
Çin’li kadınlarda 5,13/100.000
saptanmıştır.
23
ve Hint’li
kadınlarda 1,77/100.000
oranında
ABD’de zencilerde beyazlardan 2 kat fazla Asya’lılarda zencilerden 2
kat fazla oranda görülür. Etnik gruplar arasındaki farklılık karaciğer hastalığı ve HSK
için major risk faktörlerinin prevelansı ve maruz kalma süresindeki farklılıktan
kaynaklanır.
2.1.3. Cinsiyet
Hemen hemen tüm populasyonlarda, erkeklerde kanser oranları kadınlardan
daha yüksektir, erkek/kadın oranları 2/1 ve 4/1 arasında değişir. Şimdilerde bu oran
arasındaki en büyük farklılık HSK yönünden orta riskli olan Avrupa ülkelerinde
görülmektedir (>4:1). Erkeklerde kanserin daha sık görülmesinin sebebi cinsiyet ilişkili
farklılıklara bağlı risk faktörlerine daha fazla maruz kalmalarına bağlı olabilir.
Erkeklerin daha fazla HBV ve HCV ile enfekte olma eğiliminde olmaları, daha fazla
alkol, sigara kullanmaları ve daha fazla demir depolarına sahip olmaları bu durumun bir
açıklaması olabilir. Bununla birlikte deneylerde erkek farelerde 2-8 kat daha fazla HSK
gelişiminin görülmesi, cinsiyet spesifik risk faktörlerine maruz kalma dışında
androjenlerinde bu olaya katkıda bulunan bir faktör olduğunu düşündürmektedir.28
Erkeklerde riski artıran çevresel olmayan risk faktörleri arasında daha yüksek vucut
kitle indeksi ve daha yüksek androjenik hormon seviyeleri sayılabilir. Tayvan’dan
yapılan bu konuyla ilgili çalışmalarda, HBV ile enfekte erkeklerde artmış testosteron
seviyeleriyle HSK arasında pozitif ilişki saptandığı bildirilmiştir.29,30
2.1.4. Yaş
HSK’da global yaş dağılımı bölgesel, insidans oranları, cinsiyet ve muhtemelen
etyolojiye bağlı olarak değişkenlik gösterir.23 Nerdeyse tüm bölgelerde kadınlardaki yaş
piki erkeklerden 5 yaş daha fazladır. Düşük riskli populasyonlarda (ABD, Kanada ve
İngiltere gibi) 75 yaş ve üzeri gibi daha ileri yaşlarda görülürken, benzer patern yüksek
riskli birçok Asya populasyonlarındada görülür (örn, Hong Kong ve Şangay gibi). Buna
karşılık, yüksek riskli Afrika populasyonlarında (örn, Gambia, Mali) erkeklerde 60-65’
li yaşlarda pik yaparken, kadınlarda 65-70 yaş arası pik yaparak düşüşe geçer. Bu yaş
5
gruplarındaki değişiklik sıklıkla populasyondaki dominant olan hepatit virüsün
varlığına, viral enfeksiyona yakalanma yaşına ve diğer risk faktörlerinin varlığına
bağlıdır. Bilhassa, HCV taşıyıcıları yetişkinken bu virüsü alırken, HBV taşıyıcılarının
çoğunluğu virüsle çok genç yaşlarda karşılaşırlar.
2.2. Risk Faktörlerin Dağılımı
HSK için major risk faktörleri bölgesel olarak değişkenlik gösterir. Birçok
yüksek riskli bölgede kronik HBV infeksiyonu dominant risk faktörüdür. Asyada HBV
infeksiyonu çoğunlukla maternal geçişli iken Afrikada genç yaşlarda kardeşler arası
geçiş daha sık görülür. Aflatoksin-B1’le (AFB1) kontamine gıdaların tüketimide HSK’
nın yüksek oranda görüldüğü bölgelerde major risk faktörlerinden birisidir.
Diğer Asya populasyonlarının aksine, Japonya’daki dominant hepatit virüsü
HCV’dir. HCV Japonya’da ikinci dünya savaşından hemen sonra artış gösterirken, HSK
oranları 1970’lerden sonra hızlı bir artış göstermeye başlamış ve 2015 civarı HCV
ilişkili HSK’nın pik yapması beklenmektedir.31 HSK gelişiminde sirozun major risk
faktörü olması nedeniyle HSK’nın düşük oranda görüldüğü bölgelerde, siroz tanısıyla
yaşayan hastaların giderek artması HSK’nın insidansınında giderek artmasının bir
açıklaması olabilir. 1960-1970’lerde intravenöz uyuşturucu kulanımına bağlı HCV’nin
Kuzey Amerika, Güney ve Santral Avrupa’da büyük sayıda genç yetişkinleri infekte
etmeye başladığı tahmin edilmektedir.32 Virüs daha sonra kan bankalarına sıçramış ve
1990’larda tarama testi bulununcaya kadar birçok kişinin enfekte olmasına yol açmıştır.
Daha sonra yeni infeksiyon oranları dramatik olarak azalmıştır. Şimdilerde HSK’nın
düşük oranda görüldüğü ülkelerde HCV ilişkili HSK oranlarının 2010 yılı civarında pik
yapacağı düşünülmektedir.33
2.2.1. Hepatosellüler Karsinoma için Risk Faktörleri
HSK sıklıkla kronik karaciğer hastalığı veya siroz zemininde gelişir. (tespit
edilen tüm HSK vakalarının yaklaşık % 70–90’nını oluşturur) (Tablo 1.)
6
Tablo 1. Kompanse Sirozu olan Hastalarda HSK İnsidansı
Çalışma A
Çalışma B
Çalışma C
Hasta Sayısı
384
112
103
Takip süresi, yıl
5,0
4,5
3,3
Dekompansasyon % yıl
3,9
4,4
5,0
HSK % yıl
1,4
2,3
3,3
Not: 3 ülkede yapılan 3 adet kohort çaışmasının sonuçları (Çalışma A: İtalya, Çalışma
B: ABD, Çalışma C: Fransa). Çalışma A Fattovich ve arkadaşları182, Çalışma B Hu ve
Tong 183, Çalışma C Serfaty ve arkadaşları33
HSK’sı olan hastalarda sirozun major nedenleri arasında hepatit B, hepatit C,
alkolik karaciğer hastalığı, ve muhtemelen nonalkolik steatohepatit yer alır. Nadir
nedenler
arasında
herediter
hemokromatozis,
alfa-1
antitripsin
eksikliği
otoimmünhepatit ve bazı porfiryalar yer alır.
2.2.1.1 Hepatit B Virüs Enfeksiyonu
Global olarak, HBV HSK’nın en sık nedenidir, dünya genelinde yaklaşık 400
milyon kişinin bu virüsle enfekte olduğu düşünülmektedir. Vaka kontrol çalışmaları
kronik HBV taşıyıcılarınıda HSK riskinin genel populasyona göre 5-15 kat daha fazla
olduğunu göstermiştir. HBV ilişkili HSK’nın büyük çoğunluğu (yaklaşık % 70-90’nı)
sirozlu hastalarda gelişir. Bununla birlikte HBV diğer nedenlerden farklı olarak siroz
gelişmeden de HSK’ya yol açabilir. HBV infeksiyonuyla artmış HSK riski özellikle
HBV’nin endemik olduğu bölgelerde belirgindir. Bu bölgelerde sıklıkla anneden
yenidoğana geçer (vertikal geçiş) ve bu şekilde enfekte olan bireylerin neredeyse
% 90’nı kronik seyir gösterir. Bu patern HSK insidansının düşük olduğu bölgelerde
farklıdır, bu bölgelerde HSK yetişkin dönemde seksüel veya parenteral yolla (horizontal
geçiş) alınır ve vakaların % 90’da akut enfeksiyon spontan olarak geriler, kronikleşme
% 5-10 civarındadır. Asya’lı kronik HBV taşıyıcılarında yıllık HSK insidansı % 0,4-0,6
civarındayken, bu oran Alaska yerlilerinde daha düşüktür (% 0,26/yıl). En düşük oran
Kafkas HBV taşıyıcılarında görülür.34 HBV taşıyıcılarında HSK riskini artıran bir çok
faktör bildirilmiştir, bunlar arasında; erkek cinsiyet, ileri yaş (veya uzun süreli
7
infeksiyon), Asya veya Afrika kökenli olma, siroz, HSK için aile öyküsü, aflatoksine
maruz kalma, alkol, sigara, HCV veya hepatit D virüs (HDV) ile koinfeksiyon yer alır.
Ayrıca HBV DNA düzeyi ve hepatit B e antijeniyle (HBeAg) belirtilen HBV
replikasyonu yüksek olan bireylerde de HSK riski artmıştır. Ek olarak Asya’dan yapılan
çalışmalarda genotip C ile enfekte kişilerde genotip B ile enfekte olan kişilere göre daha
ciddi enfeksiyonu olduğu bildirilmiştir.35 HBV infeksiyonunun doğal seyrinde hepatit B
yüzey antijeni (HBsAg) ve HBeAg ye karşı tedaviyle veya spontan olarak antikor
geliştirenlerde daha iyi klinik sonlanım görülür. 1187 hastanın katıldığı 12 çalışmanın
metaanalizinde interferon alan 522 ve tedavisiz izlenen 665 hasta 5 yıl boyunca takip
edilmiş. Tedavi alan grupta tedavi almayan gruba göre daha düşük HSK insidansı
görülmüştür (sırasıyla % 1,9 ve % 3,2). Bununla birlikte bu farklılık istatiksel olarak
anlamlı bulunmamıştır.36
HBV’ye karşı immünizasyon gelişmiş bireyde HSK riski büyük ölçüde
azalmıştır. Birçok çalışmada akut HBV infeksiyonunun serolojik olarak düzeldiği
(HBsAg negatif) birçok bireyde HBV DNA’nın sensitif amplifikasyon tayinleriyle gizli
HBV enfeksiyonunun dekatlar boyunca devam ettiği gösterilmiştir. Gizli HBV
enfeksiyonu antiHBc ve/veya antiHBs pozitifliğiyle ilişkilidir.37 Çok uluslu bir
çalışmada karaciğer dokusunda gizli HBV prevelansı İtalya’da % 11, Hong Kong’da
% 5-9 ve İngiltere’de % 0 olarak saptanmıştır. HSK gelişen HCV’li hastlarda yapılan
bir çalışmada karaciğerde neoplastik dokuda ve neoplastik olmayan dokularda HBV
DNA ve proteinleri saptanmıştır. Akut HBV infeksiyonu geçiren hastaların iyileşmeden
yaklaşık 10 yıl sonra karaciğerlerinde hafif hepatit ve fibrozis saptanmıştır.38 Bununla
birlikte bazı çalışmalar kronik HCV’si olanlarda HSK gelişimiyle gizli HBV
infeksiyonunuyla ilişkili bulurken, örneğin Beasley’in çalışması gibi yeni ufuklar açan
çalışmalarda bu ilişki gösterilememiştir.39 İmmunize hastalarda taşıyıcılara göre HSK
insidansı belirgin olarak düşük saptanmıştır (100.000 kişide 5’e karşı 495 kişi/yıl).39
Hepatitis B aşısı HBV infeksiyonundan korunmada en efektif yöntem olarak
kabul edilmektedir. Ayrıca HBV ilişkili komplikasyonlara bağlı mortalitede azalmaya
yol açar. Örneğin Tayvan’lı çocuklarda bu konuyla ilgili ilk kanıt görülmüş ve HSK’nın
efektif aşılamayla önlenebilir olduğu görülmüştür.40 İmmünizasyon programının
başlatılmasından 10 yıl sonra 6-14 yaşlarındaki Tayvan’lı çocuklarda HSK insidansı
dramatik olarak azalmıştır. 1982-1986 arasında ortalama HSK insidansı 100000 çocukta
8
0,7 iken bu oran 1990-1994 arasında 0,36 ya gerilemiştir. Benzer şekilde HSK ilişkili
mortalitedede düşüş gözlenmiştir. Bir çalışmada, 2000 yılında dünya genelinde 620.000
hastanın HBV ilişkili nedenlerden öldüğü (% 94’nü yani 580.000’ni kronik infeksiyon
ilişkili siroz ve HSK nedeniyle), eğer rutin aşılama olmasaydı matematiksel tahminle
64,8 milyon kişinin HBV ile enfekte olacağını ve 1,4 milyon kişinin HBV ilişkili
hastalıklarla öleceği hesaplanmıştır.41 İlk dozun doğumda uygulandığı rutin infant
aşılaması % 90’lık kapsama ve % 84’lük korumayla HBV ilişkili ölümden
korumaktadır.
Kronik HBV infeksiyonu karaciğerde 4 temel olaya neden olmaktadır; Karaciğer
hücre nekrozu, inflamasyon, sitokin sentezi ve fibrosis. Hepatosit nekrozu komşu
hücrede proliferasyonu tetikleyebilir. Ayrıca, inflamatuvar yanıt
mononükleer
hücrelerde ve/veya makrofajlardan tümör nekrotizan faktör (TNF) ve interlökin-6 (IL-6)
gibi hücre proliferasyonunu uyaran sitokinlerin sentezini indüklemektedir. Normal
karaciğerde hepatositlerin tamamına yakını G0 fazındadır. Ancak, mutasyon varlığında
hepatosit hücre döngüsüne zorlanabilir ve DNA onarım mekanizmaları sonlanabilir. Bu
durumda, kalıcı DNA mutasyonları ve kromozomal instabilite kaçınılmazdır. Bu olaylar
hücre transformasyonunda temel belirleyicilerdir. Ayrıca, yaygın fibrosis normal
lobüler yapıyı bozar ve bu durumda hücre-hücre ve hücre-ekstrasellüler matriks
ilişkisini değiştirir. Böylece hücreye büyüme avantajı sağlanır. Bu durumda hücre eğer
apoptozis veya immün klirensten kaçabilirse tamamen transforme olacaktır. Karaciğer
hücresini G0 fazından hücre döngüsüne zorlayan her uyarı HSK için risk faktörüdür.
Siroz kronik inflamasyonun ve yoğun fibrozisin histolojik sonucudur. Normal
karaciğere göre sirotik karaciğerde DNA sentezi artmıştır. Sirotik nodüllerin klonal
analizlerinde monoklonal hücre ekspansiyonu gösterilmiştir.42 Bununla birlikte,
hepatokarsinogenesizte temel faktör kronik aktif hepatitin bizzat kendisidir. Gerçekten,
aktif sirozlu hastalarda HSK riski daha yüksektir. Wild tip HBV ile infekte dağ
sıçanlarında HSK nonsirotik evrede kronik aktif hepatit döneminde gelişmektedir.43 Bu
konuda transjenik farelerde yapılan önemli çalışmalar bildirilmektedir. HBV infekte
transjenik farelerde direkt mutajenik bir ajanın olmaması durumunda karaciğer hücre
rejenerasyonunun hepatosit nekrozuna ikincil olduğu, HBV çeper proteinlerinin
(preS1/S2/S) immün yanıttan bağımsız olarak hepatosit üzerinde toksik etkisinin olduğu
ve sürekli hücre proliferasyonu, displazi ve 18 aylık bir dönemde de HSK’nın geliştiği
9
gösterilmiştir.44 Ayrıca, transjenik farelerde viral proteinleri eksprese eden hepatositlere
karşı immün yanıt hücre rejenerasyonunu tetikleyebilir ve HSK riskini arttırabilir.
Yaygın oksidatif DNA hasarıda bilidirilmektedir. Karaciğer hücre proliferasyonunun
tetiklenmesinin yanısıra viral proteinlerin hepatosit içinde birikmesi, özellikle
HBsAg’nin birikip buzlu cam hepatositlere neden olması sitokrom p450 gibi
detoksifikasyon yolağını değiştirerek kimyasal karsinojenlerin
metabolizmasını
arttırabilir.
HBV’nin HSK’nın gelişmesinde direkt etkileride olabilir. HBV genomik
organizasyonu bakımından oldukça kompakt bir virüstür. Replikasyonunda ters
transkripsiyon mekanizmasını kullanmaktadır. Replikasyonu için viral DNA ile hücre
DNA entegrasyonu gerekmemektedir. Viral DNA insersiyonu hepatosit proliferasyonu
sırasında olmaktadır. HSK’da % 90 oranında viral DNA sekanslarının hücre genomunda
entegre olduğu bulunmuştur.45 Bazı hastalarda kanser hücresinde HBV DNA dedekte
edilemez. Bu durum transforme fenotipin devamında entegrasyon gerekmediğini
göstermektedir. Entegrasyon tümör gelişmeden önce ve birkaç noktada olmaktadır.
Entegrasyon sadece kanser hücresine sınırlı değildir. Genomik entegrasyon akut ve
kronik hepatit döneminde de belirlenebilir.
HBV’nin entegrasyonu konak hücrenin gen ekspresyonunu direkt veya indirekt
olarak modifiye edebilir. Entegrasyon kromozomal instabilite, inkomplet viral
proteinlerin sentezi, HBx proteininin sentezinin artması, hücresel gen ve protoonkogenlerde
değişiklikler
ve
insersiyonal
mutagenesis
(Cis-aktivasyonu)
ile
sonuçlanabilir. Kromozomal instabilite, kromozom 4q, 16q, 11p ve 17p’de
belirlenebilir. Allel kayıpları (LOH) sıktır. Genellikle 15 kromozomdan daha çok
kromozomda LOH gözlenmektedir. Olguların yarısından çoğunda allel kaybı
kromozomun her iki kolunda da bulunmaktadır. Entegrasyon hücresel DNA’da küçük
delesyonlara
neden
translokasyonlar
olabilir.
LOH’nın
bilidirilmektedir.
HSK
dışında
kromozom
hücrelerinde
HBV
17p
ve
genleri
18q’de
eksprese
edilmektedir. Bu proteinlerin direkt etkileri bilinmemekle birlikte tümör gelişmesinde
rol oynayabilirler. HBx proteininin sentezi artmıştır. preS2/preS proteinleri ise düşük
konsantrasyonda ve kısa olarak sentezlenmektedir. İnsersiyonel mutagenezis ise
oldukça düşük oranlarda bildirilmiştir.46
10
HBV ve HSK ilişkisini araştıran çalışmalar
HBx proteini üzerinde
yoğunlaşmaktadır. HBVx geni oldukça iyi korunur, akut ve kronik infeksiyon sırasında
düşük
konsantrasyonda
küçük
bir
polipeptid
kodlamaktadır.
HBx
proteini
multifonksiyonel bir proteindir. HBx proteininin virüsün yaşam döngüsündeki rolü çok
açık değildir. Hücre büyümesini kontrol eden genleri transaktive edebilir ve hepatosit
transformasyonunda rol oynayabilir. Go fibroblastlarda proliferasyonu indükleyebilir ve
hücre döngüsünün kontrol noktalarının regülasyonunu bozabilir. İn vitro çalışmalarda
hücre proliferasyonu HBx proteininin aşırı sentezi ile birlikte bulunmuştur. Ayrıca, HBx
transjenik farelerde HSK’ya neden olmaktadır. Bununla birlikte, HBx transjenik
farelerde c-myc’le uyarılmış HSK gelişmesini hızlandırmaktadır. Bu veriler HBx
proteininin
hepatik
karsinogenesizte bir
tümör
promoter’ı gibi davrandığını
göstermektedir.47
HBx proteininin transaktivasyon fonksiyonu ve onkogenesizle ilgisi çok açık
olmamakla birlikte oldukça önemli olduğuna inanılmaktadır. Bu protein hücre
büyümesinde ve apoptoziste rol oynamaktadır. HBV enhancer’larını, HIV longterminal repeat’larını, class II ve class III promoter’ları, c-jun, c-fos ve c-myc
onkogenleri aktive etmektedir. Ayrıca sitokin kodlayan genleri ( TNF-alfa ve TGF-B)
transaktive etmektedir. HBx direkt DNA’ya bağlanmaz. Transaktivatör etkisini
sitoplazmada mitojenik sinyal yolağını veya nükleusta pXbZip sınıfı transkripsiyon
faktörleri ile direkt olarak etkilemektedir. HBx proteini ayrıca, DNA onarım faktörlerini
de etkilemektedir. HBx proteinin diğer biyolojik aktiviteleri arasında NF-kB’i
fosforlayarak nükleer translokasyonuna neden olması vardır. HBx direkt olarak IkB’i
bağlamaktadır. Bu mekanizma TNF tarafından tetiklenebilir. Bazı proteazlar HBx
proteininin potansiyel hedefleridir.
HBx proteininin hücre döngüsü ve yaşayabilirliği üzerindeki etkisi tartışmalıdır.
HBx ekspresyonu hücre proliferasyonunu ve yaşayabilirliğini düzenleyebilir. HBx
proteini apoptozisi inhibe edebilir veya provoke edebilir. Bazı çalışmalarda hücre
döngüsünün durmasında, transformasyonda inhibisyon ve apotozisin indüklenmesi
bildirilirken, diğer çalışmalarda p53 bağımlı apoptozisi inhibe ettiği bildirilmektedir.
Ayrıca, HBx proteini fas ligandını regüle edebilir, E-kaspas 3 aktivitesini inhibe
edebilir. HBx’in biyolojik aktivitelerinin değişmesi wild tip veya mutasyonun varlığı ile
ilgili olabilir. Wild tip HBx, apoptozisi indükleyerek hücre döngüsünü inhibe
11
etmektedir. Mutant HBx’in ise apoptotik etkisi yoktur ve hücre döngüsünü inhibe
etmemektedir. Transjenik farelerde HBx proteininin hücre canlılığı üzerinde ikili etkisi
gösterilmiştir.48 Akut infeksiyonda yüksek seviyede HBx proteini apoptosizle
birliktedir. Kronik infeksiyonda ise düşük seviyede HBx proteini hücre proliferasyonu
ile birliktedir.
Daha önce söz edildiği gibi viral DNA’nın hepatosit genomu ile entegrasyonu
HSK gelişmeden önce olmaktadır. HSK geliştikten sonra tümör hücreleri viral DNA’nın
replikasyonuna izin vermezler. Hastaların yaklaşık % 20’sinde HBsAg pozitif
bulunmasına rağmen HbcAg eksprese edilmemektedir. HBx proteinin biyolojik
aktiviteleri oldukça komplekstir. Birkaç sitoplazmik ve nükleer transdüksiyon kaskadını
aktive etmesinin yanısıra p53 ve Retinablastoma (Rb) tümör süpressör genlerini
bağlamakta ve inaktive etmektedir. P53 inaktivasyonu ya mutasyon ya da viral ve
onkoproteinlerin bağlanması sonucu olmaktadır. HBx proteini gerek in vivo gerekse in
vitro olarak bağlamaktadır. HBx’in p53’ü fonksiyonel etkilemesi de bildirilmektedir.
Örneğin, HBx p53 ilişkili apoptosizi inaktive etmektedir, p53 bağımlı veya bağımsız
nükleotid eksizyon onarımını inhibe etmektedir. Tüm bu etkilerin sonucu olarak HBV
altta yatan bir kronik karaciğer hastalığı olmaksızın da HSK’ya neden olabilmektedir.
2.2.1.2 Hepatit C Virüs Enfeksiyonu
Kronik HCV infeksiyonu HSK gelişimi için major risk faktörüdür. HSK’lı
hastalarda HCV değişik oranlarda bulunur; HSK’lı hastaların İtalya’da % 44-66,
Fransa’da % 27-58, İspanya’da % 60-70 ve Japonya’da ise % 80-90 HCV(+) olarak
saptanır.31,49,50 Ayrıca daha yüksek ancak tanımlanmamış oranda antiHCV(-) HSK’lı
hastanın serumunda veya karaciğer dokusunda polimeraz zincir reaksiyonuyla HCV
tespit edilebilir. AntiHCV için ikinci nesil enzim immuntayin testinin kullanıldığı 21
vaka kontrol çalışmasının metaanalizinde HCV ile infekte hastalarda HCV ile infekte
olmayanlara göre HSK riskinin 17 kat arttığı saptanmıştır (% 95 GA,14–22).51 HCV ile
infekte olan hastalarda HSK gelişiminin tespiti uzun dönemli kohort çalışmalarının
yetersiz olması nedeniyle zordur, bununla birlikte bir tahmin yapmak gerekirse 30 yılın
sonunda bu oran % 1-3 arasında değişir. (Şekil 2.) HCV HSK riskini fibrozise sonuçta
siroza neden olarak artırır.
12
HSK
(%1-3)
Siroz
% 15
(%10-30)
% 90
Kronik Hepatit
25-30 yıl
%1
(%60-95)
HCV İnfeksiyonu
% 100
Şekil 2. HCV İnfeksiyonunun Doğal Seyri
HCV ilişkili siroz tanısı konulduktan sonra, yıllık olarak HSK gelişme oranı
% 1-4 arasındadır bu oran Japonya’da % 7’lere kadar çıkar. İnfeksiyondan 25-30 yıl
sonra siroz oranları % 15-35 arasında değişir.52 Siroz ve HSK insidansı HCV ile
kontamine kan ve kan ürünleri alan bireylerde siroz ve HSK için sırasıyla 14 ve 1 iken
(her 1000 kişi yıl için) ve hemofililerde sırasıyla 5 ve 0,7’dir (her 1000 kişi yıl için). En
düşük oranlar 1 defaya mahsus kontamine anti-D immünglobulin tedavisi alan
kadınlarda görülmüştür (sırasıyla 1 ve 0 her 1000 kişi yıl için).
HCV ile infekte hastalarda, siroza progresyonda kişiye ve çevreye ait faktörler
viral faktörlerden daha önemli gibi görünmektedir. Bu faktörler arasında ileri yaş,
virüsle karşılaşma esnasında ileri yaş, erkek cinsiyet, ağır alkol alımı (>50gr/gün),
diyabet, obezite, ve HBV veya HIV ile koinfeksiyon sayılabilir.53 HCV’nin genotip,
viral yük, alt türleri gibi viral faktörleriyle siroza veya HSK’ya progresyon arasındaki
ilişkiyi gösteren güçlü kanıtlar yoktur. HCV ilişkili sirozu olan interferonla başarılı
olarak tedavi edilen hastalarda antiviral tedavi HSK riskini ılımlı olarak azaltır.49,50,52-59
Fakat kanıtların çoğunlukla gözlemsel ve non randomize klinik çalışmalardan
gelmesiden dolayı kanıt düzeyi zayıftır. Bu çalışmaların çoğundaki randomizasyon
eksikliğinden dolayı sağlıklı kişiler ileri düzeyde karaciğer hastalığı (daha fazla HSK
geliştirme eğilimindedirler) olanlara göre daha fazla tedavi edilmekte ve bu da tedavi
yararlarının abartılmasına yol açmaktadır.
13
2.2.1.3. Alkol
Ağır alkol alımı günde 50-70 gr/gün’den daha fazla ve uzun süre boyunca alkol
alımı olarak tanımlanır ve HSK’nın bilinen bir risk faktörüdür. Düşük veya orta
düzeyde alkol alanlarda HSK riskinin belirgin olarak artıp artmadığı açık değildir. Her
ne kadar ağır alkol alımı siroz gelişimiyle güçlü olarak ilişkili olarak görülse de, alkolün
direkt karsinojenik etkisiyle ilgili çok az kanıt mevcuttur. Ağır alkol alımıyla HCV ve
HBV infeksiyon birlikteliğinin sinerjistik etkisini gösteren kanıtlar mevcuttur.
Çoğunlukla bu faktörler HSK riskini siroz gelişimini hızlandırarak artırırlar. Örneğin
Donato ve arkadaşları günde 60 gr’dan fazla alkol alanlarda HSK riskinin lineer olarak
arttığını bildirmişlerdir.51 Bununla birlikte HCV birlikteliğinde yalnız alkol alanlara
göre HSK riskinin ek olarak 2 kat arttığı saptanmıştır (pozitif sinerjistik etki).
2.2.1.4. Toksik Maddelere Maruziyet
Aflatoxin-B1
(AFB1)
Aspergillus
sınıfı
mantarlar
tarafından
üretilen
mikotoksindir. Bu mantarlar sıcak nemli koşullarda saklanan mısır ve fıstık gibi gıda
maddeleri
üzerinde
kolaylıkla
ürer.
Hayvan
deneyleri
AFB1’in
güçlü
bir
hepatokarsinojen olduğunu göstermiştir ve Uluslararası Kanser Araştırma Derneği
tarafından karsinojenik olarak kabul edilir.60
AFB1 oral olarak alındığında, aktif ara molekül olan AFB1 ekso8, 9epokside
metabolize olur, bu molekülde DNA’ya bağlanır ve hasara yol açar, bunlar arasında p53
tümör süpresör genin karakteristik mutasyonuda yer alır (p53249 ser).61 Bu mutasyon
aflatoksinin endemik olduğu bölgelerdeki HSK’ların % 30-60’da gözlenir.62,63 Şangay’
da (Çin) yapılan kısa dönemli prospektif çalışmalarda AFB1 ile kronik HBV
infeksiyonu arasında etkileşimde bildirilmiştir. Aflatoksin metabolitlerinin idrar yoluyla
atılması HSK riskinde 4 kat artışla ilişkiliyken, HBV infeksiyonu riski 7 kat artırır.
Hem AFB1 metabolitlerini atan hemde HBV taşıyan bireylerde HSK riski dramatik
olarak 60 kat artar.64 AFB1’e maruziyetin problem olduğu bölgelerde, kronik HBV
infeksiyonununda prevalansı yüksektir. HBV’ye karşı aşılama major koruyucu taktik
olmakla
birlikte,
kronik
olarak
enfekte
olan
bireyler
AFB1
maruziyetinin
azaltılmasındanda yarar görebilir. Çin ve Afrika’da bu durumu uygulama yönünde
girişimler yapılmaktadır.27,63
14
Fabrika işçilerinde vinil kloride maruziyetle karaciğerin angiosarkomu arasında
ilişki saptanırken, karaciğer tümörlerinin diğer histolojik formlarıyla arasında ilişki
saptanmamıştır. Boffetta ve arkadaşlarının yaptığı bir metaanalizde kanser ilişkili
mortaliteyle mesleksel olarak vinil kloride maruz kalma arasında ilişki saptanmıştır.65
2.2.1.5. Nonalkolik Yağlı Karaciğer Hastalığı
Birçok HSK ve kriptojenik sirozun altında non alkolik yağlı karaciğer
hastalığının (NAYKH) ileri formları yer alır, bu durum nonalkolik steotohepatit olarak
da adlandırılır (NASH). Kronik karaciğer hastalığı ve HSK için risk faktörlerini
değerlendiren bir çok çalışma hastaların çoğunluğunda HBV, HCV veya ağır alkol
alımını saptamamıştır (% 30-40). Bir kez siroz veya HSK tanısı koyulduğunda
NASH’ın patolojik özelliklerini saptamak zordur. Birçok klinik zeminli vaka kontrol
çalışmasında kriptojenik sirozu olan HSK’lı hastalarda yaş ve cinsiyet uyumlu kesin
tanımlanmış viral ve alkolik etyolojisi olan hastalarla karşılaştırıldığında daha fazla
NASH’ı düşündüren klinik ve demografik bulgular (kadınların hakimiyeti, diyabet ve
obezite) saptanmıştır.67-69 Örneğin, Regimbeau ve arkadaşları HSK nedeniyle
rezeksiyon yapılmış 210 hastayı incelemişler ve 18’inde (% 8,6) kronik karaciğer
hastalığı için tanımlanabilir bir neden bulunulamamış, ve alkolik ve viral hepatiti
olanlarla karşılaştırıldığında sırasıyla daha yüksek obezite (% 50, >% 17, % 14) ve
diyabet (% 56, % 17, % 11) prevelansı saptanmıştır.69,70 NAYKH’den HSK’ya
progresyonu gösteren çok az prospektif çalışma kanıtı mevcuttur. NASH tanısından
yıllar sonra HSK gelişimini tanımlayan çok az vaka takdimleri ve küçük vaka serileri
mevcuttur.71-73 Toplum zeminli retrospektif bir kohort çalışmasında, Olmsted Kasabası
Minnesota’da NAYKH tanısı alan 420 hasta ortalama süre olarak 7,6 yıl boyunca takip
edilmiş ve bu çalışmada karaciğer hastalığı ölüme üçüncü sıklıkta neden olarak (13.
önde gelen neden olarak genel Minnesota populasyonuyla karşılaştırıldığında)
vakaların 7’sinde (% 1,7) görülmüştür. 21 hastaya (% 5) siroz tanısı koyulmuştur ve
bunların 2 tanesinde HSK gelişmiştir.74 Bununla birlikte HSK ve NASH ilişkisi için en
zorlayıcı kanıt HSK’nın, aslında NASH’la güçlü olarak ilişkili 2 durum olan obezite ve
diyabetle karşılaştırılmasından indirekt olarak gelmektedir.
15
2.2.1.6. Obezite
ABD’de 900.000’den fazla bireyin 16 yıl boyunca takip edildiği prospektif bir
kohortta normal vucut kitle indeksi olan erkeklerle karşılaştırıldığında yüksek vucut
kitle indeksi olan erkeklerde (35-40 arası değişen) karaciğer kanseri ilişkili mortalitede
5 kat artış saptanmıştır.75 Aynı çalışmada, kadınlarda karaciğer kanseri riski artmamış
olarak saptanmıştır (rölatif risk 1,68).75 İsveç ve Danimarka’dan iki ayrı populasyon
zeminli kohort çalışması normal vucut kitle indeksi olanlarla karşılaştırıldığında obez
erkek ve kadınlarda artmış HSK riski saptamıştır (artmış rolatif risk 2-3 kat).65,76
Obeziteyle, özellikle abdominal obeziteyle ilişkili olan insülin direnci hepatik steatoza
belirgin olarak katkıda bulunur.77,78 Giderek artan oranda steatozun gelişimi daha ciddi
nekroinflamatuar aktiviteyle ve fibrozisle ilişkilidir.70,79-85 Belirgin steatozun varlığında
fibrozise progresyon oranlarıda yüksektir ve bazı çalışmalar steatozdaki artışın fibrozise
progresyonun bir göstergesi olduğunu bildirmişlerdir.80,86 Sonuç olarak, ciddi metabolik
bozuklukları olanlarda karaciğer hastalıkları daha sık oluşur.87
2.2.1.7. Diyabetes Mellitus
Diyabet NAYKH ve NASH gelişimi üzerinden hem kronik karaciğer hastalığı
hemde HSK gelişimi için ileri sürülen bir risk faktörüdür. ABD, Yunanistan, İtalya,
Tayvan ve Japonya’dan birçok vaka kontrollü çalışma diyabetle (sıklıkla tip II DM ile)
HSK arasındaki ilişkiyi araştırmıştır. En az 8 çalışma diyabetle HSK arasında pozitif
ilişki saptarken, 2 çalışma anlamlı olmayan pozitif ilişki ve 1 çalışmada negatif ilişki
saptamıştır. Bu konudaki kesitsel ve vaka kontrol çalışmalarının potansiyel hatası maruz
kalınan faktörle (diyabet) sonlanım arasındaki (HSK) geçici ilişkileri sezmedeki
güçlüğüdür. Bu problem HSK’nın risk faktörlerini gözden geçirirken önemlidir çünkü
sirozu olan hastaların % 10-20’si diyabetiktir ve daha geniş sayıda hastadada bozulmuş
glukoz toleransı mevcuttur. Bundan dolayı bu hastalarda diyabet sirozun bir sonucu
olabilir. Son dönemde yapılan bir kohortta HSK insidansına bakılmış (173.643
diyabetik ve 650.620 diyabeti olmayan hastada) ve bu çalışmada diyabeti olanlarda
HSK insidansının iki kat arttığı ve bu oranın uzun dönemli takip edilenlerde daha
yüksek olduğu saptanmıştır.88
Her ne kadar birçok çalışma HSK’nın düşük oranda görüldüğü bölgelerde
yapılmış olsa da diyabet Japonya gibi HSK insidansının yüksek olduğu bölgelerdede
belirgin bir risk faktörü olarak bulunmuştur. Ancak bu konuda diyabetin süresi ve tedavi
16
altında olup olmaması ve muhtemel karıştırıcı faktörler olan diyet ve obeziteyide
inceleyecek ek araştırmaların yapılması gerekmektedir.
2.2.1.8. Sigara
HSK’nın hem düşük hemde yüksek insidansta görüldüğü bölgelerde sigaranın
HSK ile ilişkisi 50’den fazla çalışmada araştırılmıştır. Neredeyse tüm ülkelerde hem
pozitif ilişki hemde ilişkisinin olmadığı yönünde sonuçlar bildirilmiştir. Pozitif sonuç
bulunan çalışmaların çoğunluğunda etkiler HBV, HCV, genetik polimorfizm ve diğer
maruziyetlere göre belirlenmiş subgruplarla sınırlandırılmıştır. Sigara ve alkolün
birlikteliğinde alkol kullanımının güçlü etkisi tamamen dışlanamamıştır. Hep birlikte
değerlendirildiğinde sigaranın HSK gelişimi üzerine etkisi zayıf gibi durmaktadır ve
genel populasyonun belirli bir kesmiyle sınırlı gibi durmaktadır. Bununla birlikte yoğun
olarak kadınların bulunduğu gruplardan oluşan iki çalışmada pozitif ilişki saptanması
nedeniyle,
söylenebilir.
kadınlardaki
atfedilen
riskin
erkeklerden
daha
yüksek
olduğu
92,93
2.2.1.9. Oral Kontraseptifler
Karaciğer neoplazilerinde oral kontraseptiflerin (OKS) muhtemel rolüyle ilgili
deneysel bulgular mevcuttur. Hepatositlerde nükleer öströjen reseptörleri bulunur ve
HSK’da miktarı artar. Bu durum hepatik neoplastik dokudaki hormonal yanıtlılığı
gösterir. OKS’lerin östrojen ve progesteron komponentleri hayvanlarda karaciğer
tümörü gelişimini uyarırlar.94 Östrojenin proliferasyon oranlarını artırarak karaciğer
neoplazisine neden olduğu düşünülmektedir, böylelikle spontan mutasyon oranlarını
artırırlar.95 OKS kullanan kadınlarda yapılan birçok çalışma hepatik cell adenoma ve
fokal nodüler hiperplazi gibi benign karaciğer tümörlerinin gelişimi için artmış risk
saptamışlardır.96 Küçük vaka serilerinde OKS kullanımı HSK, miks hepatosellüler ve
duktal karsinoma, kolanjiokarsinoma ve hepatoblastoma gibi malign karaciğer
tümörleriyle ilişkili olarak bulunmuştur.97 OKS ile artmış HSK riski arasındaki ilişkiyi
gösteren epidemiyolojik kanıtlar yetersizdir. Genellikle vaka sayısının az olduğu
çalışmalarda, OKS ile HSK arasındaki muhtemel ilişki araştırılmıştır. Toplam 739 vaka
ve 5223 kontrolün katıldığı 12 vaka kontrol çalışmasının gözden geçirilmesinde OKS
kullanımıyla HSK riski arasındaki ilişki araştırılmıştır.98 12 çalışmanın tahmini
17
havuzlanmış risk oranı düzeyleri (sadece yaş ve cinsiyet uyumlu) 1,57 (% 95 GA,
0,96–2,54, p<0,07) olarak saptanmıştır. Bu çalışmaların sekiz tanesi ayarlanmış risk
bildirmişlerdir (yaş ve cinsiyete ek olarak); tahmini havuzlanmış oran 1,45 olarak
bulunmuştur. (% 95 GA, 0,93–2,27, p<0,11). 6 çalışma, uzun süreli (>5 yıl) OKS
kullanımıyla HSK riskinde 2-20 kat arasında belirgin artmış risk saptanmıştır. Ancak
OKS kullanımıyla HSK riski arasında ilişkiyi kurmak için kanıtlar yetersizdir. Ayrıca
yeni düşük doz OKS’lerle ilgili bu konuda yeterli bilgi yoktur.
2.2.1.10. Hemokromatozis
HFE mutasyonu yönünden homozigot olan bireylerde HSK riskini belirleyen
çok az populasyon tabanlı risk tayin metodu mevcutken, taşıyıcılarda riskle ilgili
herhangi bir veri yoktur (heterozigotlarda). Çok uluslu veri kaynaklarını kullanan İsveç’
te düzenlenen populasyon tabanlı bir çalışmada herediter hemokromatozisi (çoğunlukla
C282Y mutasyonu yönünden homozigot) olan 1800 hastada HSK insidansında 1,7
katlık bir artış saptanmıştır. Başka referans merkezlerdeki seçilmiş hemokromatozis
vakalarında daha yüksek HSK riskleri belirtilmiştir, bununla birlikte bu oranlar seçim
hatalarına bağlı şişirilmiş oranlar olarak kabul edilmiştir. HFE mutasyonu olan HSK’lı
hastaların oranı belli değildir ve homozigot mutasyonlar için düşük olması muhtemeldir
(referans merkez küçük vaka serilerinde % 3 ve 144 vakalık bir seride % 5 olarak
saptanmıştır).99,100 Her ne kadar siroz olmayan HSK’lı vakalarda HFE mutasyonlarının
prevelansı beklenenden daha yüksek olduğu gösterilsede halen bu durum belirsizliğini
korumaktadır.101 Benzer olarak, HFE mutasyonlarıyla viral hepatit arasında HSK riskini
artırmada pozitif etkileşimlerinin olduğunu gösteren sadece ön veriler mevcuttur ve
bunların daha büyük çalışmalarla doğrulanması gerekir.102 HFE yönünden heterozigot
olan HSK’lı vakaların oranları daha yüksek olsada kontrol grubundan anlamlı derecede
yüksek olup olmadığı belirli değildir. C282Y heterozigotların klinik vaka serilerindeki
oranları % 4 ile en yüksek % 11,8 ile 12,5 arasında değişmektedir.100,103,104 Kontrollerle
sirozlu vakaların (HSK’sı olmayan) karşılaştırmalarında çalışmalar istatiksel olarak
anlamlı ilişki görülmemekte veya riskte 3 kat artış gibi tartışmalı sonuçlar
sergilemişlerdir.103,104 HSK’lı vakalar kontrolle karşılaştırıdığında H63D mutasyonunun
artmış prevelansı yönünden herhangi bir bulguya rastlanmamıştır.104
18
2.2.1.11. Diyet
HSK etyolojisinde alkol kullanımı ve aflatoksin kontaminasyonu dışında diyetin
rolü açık değildir. Diyetteki antioksidanlar özellikle selenyum ve retinoik asitin
hayvanlardaki karaciğer tümörü gelişimini inhibe ettiği gösterilmiştir. Tayvanlı
erkeklerde yapılan bir kohort çalışmasında, düşük sebze tüketimi HSK riskinde
istatiksel olarak anlamlı artışla ilişkili olarak bulunmuştur ve bu etki kronik HBV kronik
taşıyıcıları ve sigara içenlerle sınırlandırılmıştır.105 Bu çalışmada kronik hepatit B
taşıyıcılarında serum retinol seviyelerinin bazal seviyeleri ileride gelişebilecek HSK
riskiyle ters orantılı olarak bulunmuştur. Aynı kohortta ayrıca düşük serum selenyum
seviyelerinin artmış HSK riskiyle ilişkili olduğu yönünde bildirilerde olmuştur.106
Hastane tabanlı yapılan bir vaka kontrol çalışmasında yüksek düzeyde süt, yoğurt,
beyaz et, yumurta ve meyve alımının HSK riski yönünden iyi yönde olan etkilerinden
bahsedilmiştir.107 Japonya’da atom bombası sonrası yaşayanlarda yapılan bir çalışmada
HBV ve HCV infeksiyonlarına göre ayarlama yapıldıktan sonra yüksek düzeyde
izoflavinden zengin miso çorbası ve tofu tüketenlerde HSK riskinde ortalama % 50
azalma bildirilmiştir.108 Diğer taraftan Atina’da yapılan küçük vaka kontrollü bir
çalışma HSK riskiyle spesifik gıda grupları ve beslenme elementleri arasında ilişki
saptamamıştır.
Birçok epidemiyolojik çalışma kahve içimini karaciğer enzimlerinde artış
riskinde ve siroz riskinde azalmayla ilişkili bulmuştur. Hayvan çalışmaları kahvenin
karaciğer karsiogenezini azalttığını göstermiştir. Dahası kahve içimi insulin
sevyelerinde ve tip 2 diyabet riskinde azalmayla ilişkilidir. Japonya’da ve Güney
Avrupa’da kahve alımıyla HSK arasındaki ilişkiyi inceleyen en az 9 çalışma
gerçekleştirilmiştir. En az 5 vaka kontrollü çalışmada kahve içiminin azalmış HSK
riskiyle ilişkili olduğu bildirilmiştir (günde 2-4 fincan kahve içimi hiç almamaya göre %
25-75 risk azalmasıyla ilişkili olarak bulunmuştur).109-113 Üç kohort çalışmada kahve
alımıyla gelecekte HSK riski arasında ilişki bildirilmiştir.114-116 Bu çalışmaların ikisinde
günde 1 fincan veya daha fazla kahve alımıyla HSK riskinde belirgin azalma
saptanırken, diğer çalışmada doz bağımlı bir ilişki gözlenmiştir (1-2 fincanla % 20
azalma ve >5 fincandan fazla alımda % 75 azalma ).115 Genel olarak, veriler kahve
içimiyle riskte ılımlı azalma olduğunu göstermektedir. Bu çalışmaların bir çoğu HSK ve
kronik karaciğer hastalığı için düşük riske sahip, uygun karşılaştırıcı olmayan genel
19
populasyon kontrollerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte karaciğer hastalarının
ikinci kontrol grubu olarak kullanıldığı çalışmalardada kahve tüketimiyle HSK
arasındaki ters ilişki sebat etmiştir.109,111,114-116
2.3. Hepatoselüler Karsinomada Tanı
Avrupa Karaciğer Hastalıkları Araştırma Grubu (EASL) klinisyenlere yadımcı
olacak ortak deklarasyonda bulunmuştur.117(Tablo 2.)
2.3.1. Çapı 2 cm’den Büyük Lezyonlar
Çapı 2
cm’den
büyük
lezyonlarda 2
tane görüntüleme
yönteminde
(ultrasonografi, bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans, veya hepatik arteriyografiyi
içeren) artmış vaskülaritenin gösterilmesi HSK tanısının koyulması için yeterliyken,
alternatif olarak bir görüntüleme yöntemi ve
400 ng/ml’den fazla alfa fetoprotein
düzeyi tanısaldır. Ancak noninvazif olan bu tanı yönteminin kullanılabilmesi için
zeminde siroz tanısının bulunması ve novaskülaritelerine bağlı hızlı sekans
görüntülemede güçlü kontrast tutmaları gerekmektedir. Radyolojik kriterler % 100
sensitivite ve % 98,8 spesifite gibi mükemmel bir tanısal doğruluğa sahiptir.118-121
Ortada radyolojik bulguları olan vakalarda, ince iğne aspirasyon biyopsisi önerilir.122,123
2.3.2. Çapı 2 cm’den Küçük Lezyonlar
Görüntüleme teknikleri çapı 2cm’den küçük lezyonlarda hepatosellüler kanseri
diğer durumlardan ayırmada yeterli tanısal doğruluğa sahip değildir. Alfa fetoprotein
sevyeleri normal veya hafif yükselmiş olabilir ve tanısal yarar sağlamayabilir. 1 cm’den
küçük hepatik lezyonların malign olma ihtimali % 50’den azdır ve bu tür lezyonlarda
seri ultrason takibi (her 3 ayda bir) önerilir.124 Diğer taraftan, boyutu 1-2 cm arasında
olan lezyonlarda ince iğne aspirasyon biyopsisi önerilir.
2.3.3. Karaciğer Biyopsisinin Rolü
HSK’da karaciğer biyopsisinin rolü önemli bir tartışma konusudur. Neredeyse
diğer kanser tiplerinin hemen hepsinde tanı koymada histopatolojik doğrulama
gereklidir. Bununla birlikte Tablo 2.’de gösterildiği gibi 2 cm’den büyük lezyonlarda
HSK tanısının koyulmasında hem EASL hemde Birleşik Organ Paylaşım Programının
20
kriterleri biyopsiyi gerektirmemektedir.125 Yüksek kaliteli görüntüleme yöntemleri ve
bu yöntemleri okumada yeterli uzmanların olmadığı yerlerde, 2 cm’den küçük
lezyonlarda biyopsi önerilir. İnvazif biyopsiyle küçük ama kesin olan seeding riski
mevcuttur. Seeding prevelansı % 0,003 ile % 5 arasında bildirilmektedir.122,126,127-129
Bununla birlikte, hastaların çoğunluğu subkutan tumör depositlerinin ekzisyonuyla
tedavi edildiğinden bu durumun metastatik hastalığa yol açıp açmadığı veya sürviyi
kötüleştirip kötüleştirmediği açık değildir. Ayrıca 2 cm’den küçük lezyonlarda yanlış
negatif biyopsi oranı yaklaşık % 30-40 arasındadır.126 Bundan dolayı negatif bir biyopsi
sonucu hepatosellüler kanser tanısını tamamen dışlamaz.
2.3.4. Serum Markerlarının Rolü
HSK tanısında en çok kullanılan 3 serum marker’ı; alfa fetoprotein, Lens
culinaris agglutinin-reaktiv alfa-fetoprotein (alfa-fetoprotein-L3), ve vitamin K
antagonisti-II ile uyarılan proteindir.130 HSK tanısında bu marker’ların sensitivitesi ve
spesifitesi kullanıldıkları eşik değerin düzeyine göre değişkenlik gösterir. 10-20 ng/ml
arasındaki alfa fetoprotein seviyeleri % 60 sensitivite ve % 90 spesifiteye sahiptir.
Sistematik bir derleme HSK tanısında total alfa fetoprotein düzeyinin tek başına zayıf
tanısal değeri olduğunu göstermiştir.131 Karaciğerde kitle varlığında
görüntüleme
kriterleriyle birlikte kullanıldığıda eşik değer olarak 400 ng/ml üzerindeki değerler daha
iyi bir tanısal araç olmasını sağlamaktadır.132,133 Alfa fetoprotein L3 seviyelerinin total
alfa fetoprotein düzeylerinin üzerine çıkması (>10) küçük hepatosellüler kanserler için
spesifiktir. HSK tanısında vitamin K antagonisti II ile uyarılan protein, total alfa
fetoproteine göre daha spesifiktir ancak bu test bir çok laboratuarda mevcut değildir.
Tablo 2. Hepatosellüler Kanser Tanısı
1. Histopatolojik kriter veya,
2. Noninvasif kriter (altta siroz zemini olan hastalarla sınırlıdır).
(i) Avrupa Karaciğer Hastalıkları Araştırma Grubunun Kriterleri:
(a) Radyolojik Kriter:
İki görüntüleme yönteminde 2 cm’den büyük arteriyel hipervaskülarizasyon gösteren
lezyonların saptanması.
(b) Kombine Kriter:
21
Bir görüntüleme yönteminde arteriyel hipervaskülarizasyon gösteren 2 cm’den büyük
lezyon ve 400 ng/ml’den fazla serum alfa fetoprotein sevyeleri.
(ii) Ulusal Organ Paylaşım Programı Kriterleri (transplant bekleyen hastaları listelemek
için kullanılır):
(a) Listeleme öncesi biyopsi gerekli değildir.
(b) Tümörü gösteren abdomene yönelik USG, BT veya MRI, ve metastatik hastalığı
dışlamak için Toraksa yönelik BT ile birlikte aşağıdakilerden herhangi biri:
•
Yukarıdaki görüntüleme yöntemleriyle tespit edilen alanda vasküler
belirginlik.
•
200 ng/ml’nin üzerinde alfa fetoprotein düzeyleri.
•
Tümörü onaylayan bir arteriyogram.
•
Lezyonun
kemoemolizasyon,
radyofrekans,
kryo
veya
kimyasal
ablasyonu öncesi HSK olduğunu onaylayan biyopsi.
2.4. Hepatosellüler Karsinoma’da Tarama
Her ne kadar HSK’da tarama yöntemlerinin surviyi iyileştirdiği yönünde kesin
kanıt olmasada, birçok hekim yüksek risk grubunda hastaları serum alfa fetoprotein
veya karaciğere yönelik USG ile tarar. Son dönemde Çin’de yapılan iki randomize
kontrollü çalışmada HSK yönünden taranan hastalarda HSK ilişkili mortalitede belirgin
azalma gösterilmiştir.134,135
Karaciğere yönelik USG tercih edilen tarama yöntemidir çünkü sensitivitesi
% 84 ve spesifitesi % 90’dan fazladır.136 USG ile alfa fetoproteinin kombinasyonu
sadece USG’ye göre sensitiviteyi % 5-10 artırır fakat aynı zamanda maliyet ve yanlış
pozitiflik oranlarında da artışa yol açar.137,138
The United States Preventive Services Task Force, National Comprehensive
Cancer Network, ve American Cancer Society’ nin HSK yönünden tarama için spesifik
kılavuzları yoktur. ABD Ulusal Kanser Enstitüsü survi yararı olmamasına rağmen rutin
taramayı önermektedir. American Association for the Study of Liver Diseases ve EASL
yüksek riskli hastalarda her 6 ayda bir USG önermektedir (Tablo 3. ve Şekil 3.).139
22
Tablo 3. Hepatosellüler Kanser Yönünden Taranması Gereken Yüksek Riskli Gruplar
1-Sirozlu Hastalar
•
Hepatit B
•
Hepatit C
•
Alkolik siroz
•
Herediter hemokromatozis
•
Primer biliyer siroz
•
Nonalkolik steatohepatit
•
Karaciğer transplantı için bekleme listesinde olan hastlar
2-Sirozlu olmayan hastalar
•
Kronik hepatit B taşıyıcıları (erkeklerde >40 kadınlarda >50 yaş üzeri ve
ailede HSK öyküsü olan kronik HBV’li hastalar).
3-Alfa1tripsin eksikliği, otoimmün hepatit ve Wilson hastalığına ikincil siroz düşük orta
riskli kabul edilir ve bu tür durumlarda tarama için öneri yoktur.
2.5. Doğal Seyir ve Prognoz
Prospektif çalışmalar birçok hepatosellüler kanserin sirotik karaciğerde
premalign nodüler lezyondan kanseröz lezyona doğru olan progresif bir süreçle
geliştiğini göstermektedir.140 HBV veya HCV ile infeksiyondan sonra siroza progresyon
ortalama yaklaşık 2-4 dekatı almaktadır. Bundan sonra HSK için yıllık risk HBV
ilişkili sirozda % 2-3, HCV ilişkili sirozda % 1-7 ve alkol ilişkili sirozda % 1’dir.141
Hepatosellüler kanser HBV infeksiyonu olan bireylerde siroz gelişmeden de yıllık
olarak % 0,26-0,6 oranlarında görülebilir.141 Son dönemde yapılan çalışmalar sirozu
olan HCV’li hastaların interferon monoterapisiyle tedavisinin HSK riskini azalttığını
göstermiştir ve pegileinterferon ve ribavirin kombinasyonunun bu riski daha da
azaltacağı beklenmektedir.142,143
HSK’da sürvinin tahmini altta yatan 2 hastalık olan tümör ve sirozun birlikte
olması nedeniyle zordur. Birçok çalışma prognozun direkt olarak kalan hepatik
fonksiyonun derecesiyle orantılı olduğunu göstermiştir, bu durum sonlanımda tümör
boyutundan ziyade sirozun ana belirleyici olduğunu göstermektedir. Yeni tanı konulup
tedavi edilmeyen HSK’lı hastalarda ortalama sürvi haftalar, aylarla ifade edilebilir.144
23
Kötü sonlanımla ilişkili birçok faktör mevcuttur: erkek cinsiyet, ileri yaş, etyolojik ajan
(HCV HBV’den daha kötü seyreder), birden fazla risk faktörünün varlığı, nodüllerin
sayısı ve ikilenme zamanı, vasküler invazyon ve uzak metastaz sayılabilir. HSK’nın
altta yatan nedene, epidemiyolojik zemine ve karaciğer disfonksiyonunun şiddetine
bağlı heterojen doğası, dünya genelinde kullanılan belirli bir evreleme siteminin ortaya
konmasına engel olmaktadır. Solid tümörler için yaygın olarak kullanılan TNM
klasifikasyonu, altta yatan sirozun derecesini içermediği için ciddi kısıtlamalar
içermektedir. Bu nedenden dolayı diğer evreleme sistemleri olan Barselona Kliniği
Karaciğer
Kanseri
geliştirilmiştir.
145
Klasifikasyonu
ve
Karaciğer
İtalya
Skorlaması
(Tablo 4.)
Sirotik hastalar:
6 ayda bir Ultrasound (USG)
Her 6 ayda bir USG
Nodül yok
Serum AFP düzeyi
artarsa CT
KC de Nodül
>2 cm
1-2 cm
AFP>400ng/ml ve bir
görüntüleme yönteminde
tipik vasküler patern veya
iki görüntüleme yönteminde
tipik vasküler patern
Evet
Kanseri
Hayır
<1 cm
İki görüntüleme
yönteminde tipik
vasküler patern
Hayır
Her 3-4 ayda
Bir USG
Evet
Karaciğer
Biyopsisi
HSK
HSK
Tanısal
Tanısal değil veya
Başka bir tanı
HSK
Her 3-4 ayda
Bir USG
Şekil 3. Sirozlu hastalarda HSK yönünden takip algoritması.
24
Boyutta artış
Nodülün boyutuna
göre hareket et
12-18 ay
Boyunca stabil
Her 6 ayda bir
USG
Tablo 4. HSK için Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) evreleme sistemi
Tümörün durumu
BCLC evresi
PST
Tümörün evresi
Okuda evresi
Evre A: erken HSK
0
0
0
0
0
Tek
Tek
Tek
3 Tümör<3cm
I
I
I
I-II
Portal HT yok normal bililirubin
Portal HT normal bililirubin
Portal HT anormal bililirubin
Child-Pugh A-B
Evre B: orta HSK
0
Geniş Multi nodüler
I-II
Child-Pugh A-B
Evre C: ileri HSK
1-2*
Vasküler invazyon
Ekstrahepatik yayılım*
I-II
Child-Pugh A-B
A1
A2
A3
A4
Evre D: son dönem HSK 3-4+
Herhangi biri
Kc fonksiyon durumu
Child-Pugh C
Evre A ve B: tüm kriterler sağlanmalıdır.
Evre C: en az bir kriter; *PST 1–2 veya vasküler invazyon/ ekstrahepatik yayılım.
Evre D: en az bir kriter; +PST 3–4 veya Okuda evre III/Child-Pugh C.
*Doğu Koperatif Onkoloji Grubunun performans skalası baz alınarak değerlendirildi
0: asemptomatik, 1: semptomatik ve tamamen ambulatuar, 2: semptomatik ve günün
<% 50’sinde yatağa bağımlı, 3: semptomatik ve günün >% 50’sinde yatağa bağımlı,
4: tamamen yatağa bağımlı.
Tablo 5. Okuda Evreleme Sistemi
Puan
0
Tümör boyutu
Kc in <%50 si
Asit
Yok
Albumin (g/dl)
>3
Bilirubin (mg/dl) , <3
1
Kc in >%50 si
Var
<3
>3
Okuda stage I: 0 puan, Okuda stage II: 1 veya 2 puan, Okuda stage III: 3
veya 4 puan.
25
Tablo 6. Child Pugh Skorlama Sistemi
Anormallikle birlikte artan puan
1
2
3
Ensefalopati(evre)
Yok
Asit
Yok
Albumin (gr/dl)
>3.5
Protrombin zamanında 1-4
uzama (sn)
Billüribin (mg/dl)
1-2
1-2
Hafif
2.8-3.5
4-6
2-3
3-4
Orta
<3.5
>6
>3
Sınıf A: 5-6 puan (iyi operatif risk), Sınıf B: 7-9 puan
(orta operatif risk), Sınıf C: 10-15 puan (kötü operatif risk)
2.6. HSK’da Yönetim
Hepatoselüler kanserde kesin tedavi karaciğer transplantasyonudur. Böylelikle
hem kanser hemde altta yatan kansere eğilimli siroz tedavi edilmiş olur (Şekil 4.).
2.6.1. Cerrahi Tedavi
2.6.1.1 Rezeksiyon
Tümörün rezeksiyonu hepatosellüler kanser için tedavi seçeneklerinden
birisidir.146,147 Rezeksiyon uygulamadan önce Child Pugh skoruyla yeterli karaciğer
rezervinin kalıp kalmadığını belirlemek gerekir (Tablo 6.). Genellikle, Child Pugh A
sınıfında olan hastalar güvenli bir şekilde rezeksiyona gidebilir. Bununla birlikte sınıf
A’daki hastaların hepsinin homojen karaciğer fonksiyonu olmamasından dolayı,
rezeksiyonun uygulanabilirliliği için portal hipertansiyonunda olup olmadığını tayin
etmek gereklidir. Bu kriterlerle birlikte 5 yıllık olarak yaklaşık % 60-70’lik bir survi
sağlanabilmiştir.148 Adjuvan kemoterapi ve kemoembolizasyonun henüz ek yararı
gösterilememiştir.149,150 I-131’le işaretlenmiş lipiodol, aktive lenfositlerle adoptif
immunoterapi,
ve
interferon
gibi
modaliteleri
içeren
diğer
adjuvan
tedavi
yaklaşımlarının ümit verici sonuçları olsada bu yaklaşımlarla ilgili ileri araştırmalar
gerekmektedir.151-154
26
2.6.1.2. Karaciğer Nakli
Tedavide primer yöntem olarak karaciğer transplantasyonunun kullanımı giderek
gelişmektedir. 1980’lerde hasta seçiminde yapılan yanlışlar kötü sonuçlara neden
olarak, 5 yıllık sürvinin % 40’ların altında olmasına yol açmıştır.155 1996’da yapılan bir
klinik çalışma bu konuda sınır taşı olmuştur ve karaciğer transplantı için uygun hasta
seçiminde Milan Kriterleri’nin belirlenmesine yol açmıştır. Burada araştırmacılar tek bir
lezyon olarak 5 cm veya 3 adet biri 3 cm’den küçük olan hastaları çalışmaya dahil
etmişler ve 5 yıllık sürvi % 70’i geçerken, rekürrens oranı %15’in altında
saptanmıştır.156 Gerçekten benzer sonuçlar diğer çalışmalardada saptanarak 5 yıllık
sürvi rezeksiyon veya ablasyon sonrasından belirgin olarak farklılık göstererek %75’i
geçmiştir.157 Karaciğer transplantı için öncelik skorunu belirlemede Son Dönem
Karaciğer Hastalığı İçin Model Skoru (MELD) kullanılır, bu skorlamada serum
kreatinin, total billüribin ve uluslar arası normalleştirme oranı (INR) kullanılır.
Hepatosellüler kanserli hastalar daha yüksek MELD skoruna sahiptir ve bu nedenle
hepatosellüler kanseri olmayan ve benzer karaciğer disfonksiyonu olanlara göre
transplant için daha önceliğe sahiptir. Bununla birlikte donör sayılarının azlığı, ölümler
ve kontrendikasyonların ortaya çıkışıyla beklenmeyen oranlarda transplant listelerinden
ayrılmaya ve sürvide % 50’nin altına düşüşlere yol açmaktadır.158
Kadavra karaciğerinin bulunmasındaki zorluklar cerrahi rezeksiyon, neoadjuvan
lokal ablasyon ve kemoembolizasyon gibi diğer umut verici sonuçları olan tedavi
modalitelerinin kullanılmasına yol açmıştır.159,160 Ayrıca ABD’de canlıdan karaciğer
transplantıda HSK’lı hastalarda giderek artan oranda kullanılmaya başlanmıştır ve
kadavradan transpant yapılan hastalarla benzer sonuçlar göstermektedir.161
2.6.2.Cerrahi Dışı Tedavi Modaliteleri
Hepatosellüler kanserli vakaların çoğunluğu tanı anında rezeksiyon sınırlarını
aşmıştır ve tranplant programına alınabilecek ölçülerdede değildir. Bu tür durumlarda
çeşitli tedavi modaliteleri mevcuttur.
27
2.6.2.1. Lokal Ablasyon
Lokal ablasyon görüntü eşliğinde kimyasal (etanol, asetik asit) ve termal
(radyofrekans, kryoablasyon) teknikler kullanır. Ablasyon rezeksiyon sınırlarını aşmış
hastalarda küratif amaçla kullanılır ve sürvi oranları rezeksiyona benzerdir. Perkütan
etanol injeksiyonu en sık uygulanan tekniktir ve cevap oranları % 70-100 arasında
değişmektedir.162,163 Bununla birlikte radyofrekans termal ablasyon şimdilerde en sık
kullanılan yöntemdir ve perkütan alkol injeksiyonu ile karşılaştırıldığında hastalığın
daha iyi kontrolünü sağlar ve sürvide iyileşmeye yol açar.164,165 Lokal ablasyonun major
kısıtlaması infiltratif lezyonlarda ve boyutu 4-5 cm’den büyük tümörlerde başarı
oranlarının düşük olmasıdır.
2.6.2.2. Transarteryel Tedavi
Transarteryel girişimler rezeksiyon veya perkütan tedaviler için uygun olmayan
geniş rezeke edilemeyen hepatosellüler kanserlerin tedavisi için kullanılırlar. Bu tür
tedaviler tümör yükünü azaltmak için palyatif amaçla kullanılırlar. En sık kullanılan
teknikler arasında transkateter arteryel kemoembolizasyon ve transarteriyel radyoaktif
iyod ve lipiodol kulanımı yer alır. Rezeke edilmesi mümkün olmayan hepatosellüler
kanseri olan vakaları içeren randomize çalışmaların sistematik derlemesinde kompanse
sirozu ve iyi fonksiyonel durumu olan vakalarda arteriyel embolizasyonun 2 yıllık
sürviyi
iyileştirdiği
gözlemlenmiştir.166
Abdominal
ağrı
ve
ateşle
ilişkili
postembolizasyon sendromu bazen gelişebilir ve bu durum asit ve hepatik ensefalopati
gelişimini uyarabilir. İleri karaciğer hastalığı olan (Child Pugh C) ve
portal ven
trombozu olan vakalarda akut karaciğer yetmezliğini tetikleyebileceği için bu tür
tedaviler uygulanmamalıdır.
2.6.2.3. Kombinasyon Tedavisi
5
cm’den
küçük
tümörlerde
transkateter
kemoembolizasyonu
takiben
radyofrekans termal ablasyonun kombine edilmesi iyi lokal cevaba yol açar.167 Bununla
birlikte bu işlemlerin yararlılığının daha geniş hasta gruplarında onaylanması
gerekmektedir.
28
2.6.2.4. Sistemik Tedavi
İlerlemiş HSK’sı olan hastalarda kemoterapi bir çok nedenden dolayı rutin
olarak kullanılmaz. Hepatosellüler kanser rölatif olarak kemoterapiye dirençli bir
tümördür. Bu durum p-glikoprotein, glutatyon-S-transferaz, ısı şok proteinlerini içeren
ilaca direnç genlerinin ekspresyonuna ve p53’de mutasyona bağlıdır. İlerlemiş HSK’sı
olan hastalarda kemoterapinin yararını ölçmek zordur çünkü survi sıklıkla tümörün
agresifliği veya sistemik tedavinin etkisinden ziyade karaciğer disfonksiyonunun
derecesiyle ilişkilidir. Sistemik kemoterapiyi altta ciddi karaciğer disfonksiyonu olan
hastalar tolere edemez. HSK ile ilgili klinik araştırmalar farklı hasta populasyonlarında
gerçekleştirilmiştir. Örneğin Asya’dan bildirilen çalışmalardaki hastalar daha genç
olmaya ve kronik hepatit B veya C hepatine bağlı kompanse sirozu olan hastalarken,
Kuzey Amerika veya Avrupa’dan bildirilen çalışmalardaki hastalar tipik olarak 60 yaş
üzeri, alkolik siroz ve komorbid hastalıklara sahiptir. Bu durum kemoterapi toleransı,
dozu, ve yan etki profilleriyle ilişkilidir. Ayrıca belirgin sirozu olan hastalarda
kemoterapinin etkinliği düşüktür. Doksorubisin, tamoksifen, megastrol, interferon alfa,
antiandrojenler ve sorafenibi içeren çeşitli kemoterapotik ilaçlar randomize kontrollü
çalışmalarda denenmiş veya karşılaştırılmıştır. Bu ajanların kullanımı sorafenib hariç
sürvi ve tam yanıtta fark edilebilir bir yarar göstermeksizin belirgin toksisiteye yol
açmıştır.168,169
Tablo 7. Altta Yatan Sirozu olan HSK’lı Hastalarda Kadavradan Karaciğer Transplantı için Ulusal
Organ Paylaşım Kriterleri (UNOS)
•
•
•
•
Hasta karaciğer rezeksiyonuna uygun olmayacak
<5 cm tek bir kitle veya en büyüğü <3 cm olan en fazla 3 tümör olacak
Makrovasküler tutulum olmayacak
Tümörün lenf nodları, akciğer, abdominal organlar veya kemik gibi ekstrahepatik
organlara yayılımı olmayacak
29
Hepatosellüler Kanser
NonMetastatik
Metastatik
En iyi destek tedavi veya
Deneysel çalışmalar
Child Pugh Skorunu, portal HT durumunu,
nodüllerin sayısı ve boyutunu ve vasküler invazyonu değerlendir
Rezeke edilemez
Rezeke edilebilir
Rezeksiyon +/Adjuvan tedavi
UNOS kriterini
taşıyor
Hayır
Evet
Tek lezyon <5cm veya
3 lezyon her biri <3cm
Ortotropik karaciğer
Transplantasyonu
Evet
Ara tedavileri veya
Yaşayan dönörden transplant
RFA/PEI
Hayır
TACE
Eğer boyut küçülürse UNOS kriterleriyle tx yönünden değerlendir
Şekil 4. HSK’lı hastada yönetim algoritması
2.7 Hepatosellüler Karsinogenez
Hemotolojik malignensilerin aksine solid tümörlerin gelişmesi esnasında çok
sayıda hücresel gende (onkogen ve tümör süpressör gen) mutasyon gelişmektedir.
Hepatosellüler karsinogensizte de birçok onkogen (B-katenin ve Siklinler gibi) ve tümör
süpressör gende (p53, p16INK4a, APC, Axin gibi) mutasyon bildirilmektedir. HSK’da
genetik değişikliklerin bu denli zengin olmasının 2 nedeni olabilir. İlki, klinik olarak
solid tümör tanısı konulmadan önce çok sayıda genetik değişikliğin birikmesi
gerekmektedir. Etyolojik faktörle ilk karşılaşma ile HSK gelişmesi arasındaki latent
periyod oldukça uzundur. Bu konuda en iyi örnek kronik HBV infeksiyonudur. İkincisi
ise değişik etiyolojik faktörler hepatosit içinde farklı genleri hedeflemekte ve
30
değiştirmektedir. Etyolojik olarak tanımlanan genetik heterojenite bu tümörlerin
fenotipik heterojenitesi ile sonuçlanmaktadır.
HSK’nın gelişmesi sırasında 3 iletişim yolağı aktif hale gelmektedir;
Retinoblastoma yolağı, p53 yolağı ve Wnt yolağı.
2.7.1 Retinoblastoma Yolağı
Retinoblastoma yolağı hücre döngüsünü düzenleyen en önemli iletişim
yolağıdır. Normal hepatositler gibi çoğalmayan hücrelerde retinoblastoma proteini
hipofosfarlanmış halde hücrelerde E2F transkripsiyon faktörlerini inaktif halde tutar.
Hücreye dışardan çoğalmayı uyaran “büyüme faktörü” uyarısı geldiği zaman, bu tür
faktörlerin hücre zarında bulunan reseptörleri uyarılır ve böylece oluşan sinyal hücre
çekirdeğine taşınarak siklin D gibi hücre döngüsünü başlatan genlerin ifadesi artar.
Bunun sonucu olarak siklin D molekülü genellikle CDK4 adlı siklin-bağımlı kinaza
bağlanır ve bu kinaz retinoblastoma proteinini fosforlayarak inaktif hale getirir. Bütün
bunların sonucu ise E2F faktörlerinin serbesleşerek hücrede DNA sentezini başlatacak
genlerin ifadesini arttırmaktır. Bu genler arasında siklin E geni önemli bir yer tutar. Bu
genin kodlandığı siklin E proteini CDK2’ye bağlanarak bu enzimi aktif hale getirir ve
bunun sonucu olarak da hücre G1 evresinden S evresine, yani DNA sentezi evresine
geçer. Bu gelişme daha sonra hücre bölünmesi ile sonuçlanır. Hücreler gerekli olduğu
takdirde (örneğin senesansa girdikleri zaman) bu çoğalma uyarısına p16INK4a ve
p21Cip1 genlerinden kodlanan ve siklin-bağımlı kinazları inhibe eden proteinler
aracılığı ile direnme özelliği taşırlar. HSK hücreleri retinoblastoma yolağında yer alan
siklin-D geninde amplifikasyon yolu ile veya özellikle p16INK4a, bazende
retinoblastoma genini inaktif hale getirerek hücre döngüsünü baskılayan sistemi devre
dışı bırakırlar.
2.7.2 Wnt Yolağı
Wnt yolağı normal hücrede aktif veya inaktif olabilir. Hücre eğer, wnt ligandı
aracılığı ile dışardan uyarılmıyorsa, frizzled ligandları inaktif haldedir. Bu durumda
APC proteinin aksin ve B-kateninle bağlanarak bir kompleks oluşturur. Glikojen
sentetaz kinaz 3B (GSK-3B) B-katenini fosforlar ve hücre içinde yıkıma uğratır. Hücre
wnt ile uyarıldığında bu kompleks dağılır ve B-kateninin fosforlanması durur. Bunun
31
sonucu olarak B-katenin sitoplazmada birikmeye başlar ve hücre çekirdeğine göç eder.
TCF faktörleri ile birleşerek onları aktif hale getirir. TCF faktörleri hücrede yüzlerce
genin ifadesini değiştirebilen proteinlerdir. Bu nedenle hücrenin kaderi tamamen
değişebilir. Örneğin, wnt ile aktiflenen hücreler farklılaşma yolunu terkederek kök
hücre haline dönüşebilirler. HSK’da wnt yolağı en az 3 mekanizma ile aktif hale
gelebilir. Bunlardan ilk ikisi B-katenin ve aksin genlerindeki mutasyonlardır. Bu
mutasyonlar sonucu B-katenin, wnt ligandından bağımsız olarak hücrelerde birikerek
TCF’leri aktif hale getirir. Bu durumun HSK hücrelerinde ne gibi gen ifade
değişikliğine yol açtığı bilinmemektedir. Ancak kolorektal kanser hücrelerinde Bkatenin aktivasyonu bu hücrelere kök hücre özelliği kazandırmaktadır. Kök hücreleri
sürekli çoğalabilen ve senesansa uğramayan hücreler olduklarından, kanserli bir
hücrenin kök hücre özelliğini kazanmasının sonuçlarını tahmin etmek güç değildir.
Ayrıca, B-katenin p53 geninin mutasyona uğraması sonucu da hücrelerde birikmektedir.
2.7.3 P53 Yolağı
p53 proteini normal hücrede aktif olarak sentezlenen ancak, hızla yıkılarak yok
edilen bir proteindir. Bu yıkım için p53 proteini MDM2 proteini ile bir kompleks
oluşturmak zorundadır. Hücrede herhangi bir nedenle stres oluştuğu zaman p53
proteininin yıkımı durdurulur. Bunun için p53 MDM2 kompleksinin oluşmasının
engellenmesi gerekmektedir. Bu DNA hasarı sonucu aktif hale gelen bazı enzimlerin
p53 proteinini fosforlamaları veya onkogenler tarafından aktif hale getirilen p14Arf
proteininin MDM2’ye bağlanması ile olur. Yıkımı durdurulan p53 proteini çekirdeğe
göç ederek bazı genlerin ifadesini arttırır. Bu genler arasında p21Cip-1 en önemlisidir.
P21Cip-1 geni CDK2 enzimini inhibe ederek hücre döngüsünü durdurma özelliğine
sahiptir. Böylece strese uğramış olan hücreler p53 sayesinde çoğalamaz hale gelirler.
Bunun özelilikle DNA hasarı taşıyan hücrelerin mutasyona uğramasını engelleyen
başlıca düzenek olduğu bilinmektedir. HSK hücreleri, genellikle p53 geninde, zaman
zamanda p14 arf geninde, inaktive edici mutasyonlar oluşturarak p53 yolağının
devreden çıkarırlar. Böylece, stres altında olsalarda, kanserli hücreler çoğalma özelliğini
koruyabilirler.
32
2.8 Tek Nükleotid Polimorfizmleri ve Klinik Önemleri
İnsan Genom Projesi’nin sonuçlanmasını izleyen yıllarda bilimsel ilgi daha çok
genetik varyasyonların haritalarının çıkarılması üzerine yoğunlaşmıştır. Bir genin belli
bir lokusta yer alan alternatif kopyalarından her birine allel adı verilir. Alleller genel
populasyonda % 1’den daha fazla sıklıkta bulunuyorsa, bu durum “genetik polimorfizm
(genetik çeşitlilik)” olarak adlandırılır. Aksine, alleller % 1’den daha az sıklıkta ise
“nadir değişimler’’ olarak isimlendirilir. Genetik hastalığa neden olan zararlı
mutasyonların bir çoğu nadir değişimlerdir. Genetik polimorfizm teriminden toplumda
yaygın olarak rastlanan ve genellikle hastalık etkeni olmayan genom değişiklikleri
anlaşılır. Genetik polimorfizm, kodlanan veya kodlanmayan DNA dizilerinde meydana
gelebilir. İntronlarda ve genler arasındaki DNA dizilerinde meydana gelen
değişikliklerin
genellikle
etkisi
yoktur.
Ancak
intron
bölgelerindeki
bazı
polimorfizmlerin gen ekspresyonunu etkileyerek fenotipik değişiklikler meydana
getirebileceği
belirtilmektedir.
Genlerin
kodlanan
bölgelerindeki
(ekzon)
polimorfizmler ise protein fonksiyonuna etki edebilir. Promotor bölgede meydana gelen
polimorfizm ise transkripsiyon düzeyinde değişikliğe neden olabilir. Polimorfik
değişiklikler çok çeşitli tiplerde olabilir. SNP (single nucleotide polymorphism, tek
nükleotid polimorfizmi) insan genomundaki en basit ve en yaygın genetik polimorfizm
çeşitidir. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) genomda spesifik bir bölgedeki tek bir
bazda meydana gelen degişikliktir. Örneğin SNP, AAGGCTAA DNA dizisi
ATGGCTAA şeklinde değişebilir. Varyasyonun SNP olduğunun düşünülebilmesi için,
populasyonun en az % 1’inde bulunması gerekmektedir. SNP, 3-milyar bazlık insan
genomunda her 100-300 bazda bir meydana gelebilir. SNP’ler insan genetik
varyasyonlarının % 90’nını oluştururlar. Tek nükleotid değişim polimorfizminin (SNP)
bazı alt grupları vardır. SNP’leri; Aminoasit değişimine neden olmayan SNP’ler veya
aminoasit değişimine neden olan SNP’ler olarak ikiye ayırabiliriz. Aminoasit
değişimine neden olan SNP’ler, protein fonksiyonuna etki ederek fenotip üzerinde etki
meydana getirebilir. SNP’ler DNA dizisinde restriksiyon enzim (RE) kesim bölgesi
meydana getirebilir veya mevcut kesim bölgesini ortadan kaldırabilir. Bu değişiklikler
RE’lerince DNA'nın farklı uzunlukta kesilmesine yol açar. DNA bantlarının uzunluğu
ve sayısı kıyaslanarak elde edilen çeşitliliğe RFLP (restriction fragment length
polymorphism) denir. Bugüne kadar insan genomunda milyonlarca SNP bulunmuş
33
olması, hem doğal hem de hastalık fenotiplerine katkıda bulunan genetik faktörlerin
tanımlanması açısından çok önemlidir. Polimorfizmler insan genetik araştırmalarında
anahtar bir fonksiyon üstlenmistir. Bir genin farklı kalıtım kalıplarının öngörülebilmesi
veya genomun farklı segmentlerinin birbirinden ayırt edilebilmesi önemli bir konudur.
Bu açıdan şu anda DNA polimorfizm çalışmalarında ve bulunan polimorfizm sayısında
bir patlama yaşanmaktadır. Polimorfizm bu açıdan bir genetik marker gibi görev
yapmaktadır.
Polimorfizimler genin farklı kalıtsal formlarını veya genomun farklı bölgelerini
ayırt edebilmek için de kullanılmaktadır. Genetik belirleyiciler tıbbi genetikte kullanım
için pratiklik sunar. Bağlantı analiz yolu ile kromozomların belirli bölgelerindeki
genlerinin haritalanması, genetik hastalıkta doğum öncesi tanı, genetik hastalıklarda
heterozigot taşıyıcıların belirlenmesi, kroner kalp hastalığı, kanser ve diyabet gibi
yaygın
yetişkin
hastalıklarına
yatkın
kişilerin
yüksek
ve
düşük
risklerin
değerlendirilmesi adli tıpta ve babalık testinde kullanım ve organ transplantasyonu için
doku tiplenmesi tıbbı genetik kapsamı içindedir.
2.8.1 p53’ün Fonksiyonu ve Kodon 72 Arjinin/Prolin Polimorfizminin Önemi
Bir tümör süpresör gen olan p53 17. kromozomun kısa kolunda lokalizedir. 11
ekzonu ve 10 intronu vardır (17p13.1) ve p53 geninin ürünü olan p53 proteini (TP53)
393 aminoasitten oluşur ve 53 kDa’luk nüklear bir proteindir. TP53 gen transkripsiyon
kontrolü, DNA tamiri, hücre döngüsü kontrolü, genomik stabilite, kromozom
segregasyonu, hücresel yaşlanma, anjiyogenez, apopitoz ve tümör baskılanması gibi
hücresel süreçlerde kritik ve önemli işlevlere sahiptir. Tüm bu işlevleri ve özellikle
tümör gelişimini baskılayıcı rolleri ile “genomun gardiyanı” olarak tanımlanan p53
proteini DNA hasarı, hipoksi, nükleotid havuz deplesyonu, viral enfeksiyonlar ve
onkogen aktivasyonu gibi çeşitli genomik stres durumlarında aktive olmaktadır. p53
proteinin beş önemli bölgesi vardır. N-terminal bölge transkripsiyonel aktivasyon için
gereklidir. Prolince zengin olan bir bölgesi vardır. Merkezi kor bölgesi, spesifik DNA
bağlayıcı kısımlar içermektedir. Tetramerizasyon kısmı transaktivasyon ve spesifik
dizlere bağlanabilmesi için gereklidir. C terminal kısmı, bazı DNA lezyonlarını tanır,
helikazlarla etkileşime girerek DNA tamiri, DNA rekombinasyonu ve apoptozisle
ilgilidir. p53 proteini hücre içinde bir tetramer formunda bulunmaktadır. p53 proteini bir
34
transkripsiyon faktörüdür; p21, MDM2, DNA damage-inducible 45 gene (GADD45),
siklin G, (bcl2-iliskili X protein) Bax gibi bir çok hedef genin transkripsiyonel
aktivasyonunda yada baskılanmasında rol almaktadır. Transkripsiyonel etkisini
gösterebilmesi için spesifik DNA dizilerine baglanmaktadır. İşte proteinin DNA’ya
bağlanan bu bölgeleri genin 4-8. ekzonları tarafından kodlanmaktadır. Tümörlerde
görülen mutasyonlarda özellikle bu bölgede yoğunlaşmaktadır. Normal sartlarda p53
hücre içinde inaktif halde, düşük yoğunlukta ve kısa yarı ömürlü olarak bulunmaktadır.
Stabilizasyonunun düzenlenmesinde MDM2 adlı bir protein rol oynamaktadır: MDM2,
p53’ün amino ucuna bağlanarak hem onun transkripsiyonel etkinliğini baskılamakta,
hem de proteazom adlı komplekslere yönlendirerek burada degradasyonunu (proteoliz)
sağlamaktadır. İlginç olarak; p53, MDM2 genininde transkripsiyonunu aktive
etmektedir. Bir çok “stres” faktörleri p53’ün hücre içi yoğunluğunu arttırarak ve üç
boyutlu yapısını değiştirerek onu aktive etmektedir.
Wild tip p53 kodon 72’de iki yaygın polimorfik varyant tanımlanmıstır. Bu
polimorfizmler 72. aminoasit pozisyonunda ya prolin (p53 Pro) yada argininin (p53
Arg) yer değişimi ile sonuçlanan tek bir nükleotid değişimlerinden kaynaklanmaktadır.
Arginin (Arg, CGC) büyük polar ve prolin (CCC) küçük polar aminoasit rezidüsüdür.
Bu nonkonservatif aminoasit degisimi p53’ün prolince zengin kısmında bulunan PXXP
(P: prolin, X; herhangi bir amino asit) SH3-binding motiflerinden biriyle ilgilidir.
p53’ün biyokimyasal ve fonksiyonel özelliklerini etkiler. p53 Pro, güçlü bir
transkripsiyonel aktivatördür ama apoptosizi indükleyici özelligi p53 Arg’den daha
azdır. Arg 72 varyantlarının, Pro 72 varyantlarına göre 5 misli daha fazla apoptozisi
indüklemektedir. p53 Arjinin/Prolin polimorfizmi prolince zengin sekans içerisinde
bulunmaktadır. Arginin/Prolin polimorfizmi genin 4. ekzonu içerisinde ve kodon 72
pozisyonunda bulunmaktadır. p53 Arjinin/Prolin varyantları transkripsiyon aktivitesi,
apopitozun indüklenmesi ve hücre transformasyonunun baskılanmasıda farklı
fonksiyonel kapasiteye sahiptirler. TP53 Arjinin ve Prolin varyantları DNA’ya
bağlanma ve transkripsiyon aktivileri, apopitozis indüksiyonları ve hücre döngüsünün
durdurulmasında farklılık göstermektedirler. p53 Arjinin varyantı prolin varyantına
nazaran apopitozisi daha hızlı ve daha verimli bir şekilde indükler. Apopitozisin p53
Arjinin varyantı tarafından daha hızlı ve etkili bir şekilde indüklenmesinin nedeni
arjinin varyantının mitokondride daha fazla lokalize olması olabilir. Mitokondriye bu
35
lokalizasyon proapopitotik sitokrom-c’nin sitozole salınması ile birliktedir. p53’ün
apopitozu stimüle edici proteinler (ASPP) ailesi p53 kodon 72 arjinin/prolin
polimorfizminin apopitoz fonksiyonunu düzenler. p53 kodon 72 prolin varyantının
apopitoz fonksiyonu seçici bir şekilde p53’ün apopitozu stimüle edici proteini
inhibitörleri (iASPP) tarafından inhibe edilir. p53 kodon 72 arjinin varyantının çok fazla
apopitoz indükleme kapasitesine sahip olması arjinin varyantının iASPP inhisyonunda
kaçabilme kapasitesinden ve daha fazla mitokondride lokalize olma kapasitesinden
kaynaklanmaktadır.
2.8.2 MDM2 SNP 309 Gen Polimorfizminin Önemi
İnsan genomu sürekli olarak hücrenin onkojenik transformasyonuna ve
tümörogenezisine yol açan çeşitli formlarda endojen ve eksojen streslere maruz kalır.
Genomik yapının bütünlüğünü genotoksik saldırılardan korunabilmesi için çeşitli
kompleks sistemler gelişmiştir. TP53 (MIM 191170) tümör süpresör geni bu tür
saldırılara karşı DNA hasarına karşı oluşan uyarıların major olarak toplandığı yer olarak
ana koruyucu rol oynar. p53 proteini sinyal yolağında birçok protein tarafından
uyarılabilir veya aktive edilebilir. Örneğin fonksiyonel p53 proteini hücreleri malign
transformasyondan hücre döngüsünün kontrolü ve DNA tamirindeki görevli genleri
aktive ederek veya hücre çoğalmasını apopitozisi uyararak veya hücre döngüsünün G1
fazında durdurarak inhibe eder. Bundan dolayı p53 hücrelerin karsinojenlere karşı yanıtı
düzenler. Murine double minute 2 (MIM 164785), MDM2 veya (HDM2), p53
yolağında anahtar rol oynayan bir proteindir ve PTEN ve p53 tümör fonksiyonları
arasındaki bağlantıyı sağlayan ana yolaktır. TP53 ve MDM2 proteinleri otoregülatuar
feedback döngüsü oluştururlar, p53 MDM2 seviyelerini pozitif olarak regüle ederken,
MDM2 p53 seviyelerini ve aktivitesini negatif olarak regüle eder. MDM2 proteini p53
fonksiyonunu birçok bağımsız yolla etkiler. Birincisi, MDM2 p53’ün N-terminal
transkripsiyon aktivatörü bölgesine bağlanır ve onun transkripsiyonel aktivitesini inhibe
eder. İkinci olarak, MDM2 p53 için E2 ubiquitin ligaz olarak fonksiyon gösterir.
Dahası, onkogen olarak, MDM2 p53’ün hücre döngüsünün kontrolünde önemli rol
oynayan diğer tümör ilişkili genlerle etkileşiminde regülatuar rol oynar. Ayrıca MDM2
E2F ailesi transkripsiyon faktörleri, Rb büyüme regülatuar fonksiyonunun inhibisyonu
36
ve normal hücrelerin G0/G1-S fazına geçişini inhibe ederek karsinogeneze p53’den
bağımsız olarakda katkıda bulunur.
İnsan MDM2 geni kromozom 12q13-14’de lokalizedir. Genomik boyutu 34
kb’dir ve sabit ve p53’e yanıt veren intronik promoter’ı içeren iki promoter’ı vardır.
Her ne kadar MDM2’de nadiren mutasyon olsada, çoğunlukla polimorfiktir. Örneğin
MDM2 geninde en az 152 tek nükleotid polimorfizmi ve 18 insersiyon polimorfizmi
mevcuttur. Bunların 68 tanesi minör allel frekansına (MAF) sahipken >% 5, bunlardan
hiçbirisi aminoasit değişiklikliğine yol açmaz. Son dönemde Bond ve arkadaşları
MDM2 geninin intronik p53 cevabı oluşturan promoter’ında timin ile guaninin yer
değiştirmesi sonucu oluşan SNP309(c.-5+309G>T), olarak bilinen doğal olarak oluşan
fonksiyonel SNP’yi tanımlamışlardır (National Center for Biotechnology Information
Single Nucleotide Polymorphism Identification Number: dbSNP ID: rs2279744)197.
SNP MDM2 promoter’ında intron1’in 309 base pair (bp) aşağı yönünde lokalizedir.
SNP309’un transkripsiyonel aktivatör stimülatör protein (Sp) 1’in affinitesini artırdığı
ve bunun MDM2 RNA ve proteini düzeylerini artırarak sonuçta p53 yolağını etkilediği
gösterilmiştir197. MDM2 düzeylerindeki bu artış p53 transkripsiyonel aktivitesinin
direkt inhibisyonuyla, bu durumda hasarlanmış hücrenin hücre siklüsü kontrol
noktasından kaçarak karsinojenik hal almasıyla sonuçlanır.
37
3. GEREÇ ve YÖNTEM
3.1. Hasta Seçimi
Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi, Dahiliye Gastroenteroloji ve
Genel Cerrahi Ana Bilim Dalı’na Mayıs 2005–Haziran 2008 tarihleri arasında, klinik,
laboratuvar, radyolojik ve patolojik bulguları ile hepatosellüler karsinoma tanısı konan
hastaların alındığı prospektif bir çalışmadır. Hastalara Barcelona Kriterleri’ne göre
sirozu olan vakalarda iki radyolojik veya bir radyolojik birde biyokimyasal parametre
(alfafetoprotein düzeyi) baz alınarak veya sirozu olmayan vakalarda patoloji sonucuna
göre HSK tanısı koyuldu. Tüm hastalarda karaciğere metastaz yapabilecek diğer
malignensiler klinik, biyokimyasal ve radyolojik bulgularla dışlandı. Daha önceden
D. Gastroenteroloji Polikliniğince siroz nedeniyle takip edilen hastaların klinik bilgileri
ayrıca tüm hastaların yaşları, cinsiyetleri, yaşadıkları il, telefon numaraları, tanı
tarihleri, sigara, alkol kullanım öyküsü ve eşlik eden hastalıkları (Diyabetes Mellitus ve
Malignensiler) kaydedildi. Tüm hastalarda tam fiziki muayene yapıldı. Tüm hastalardan
hepatit markerları (HBsAG, antiHBs, antiHBcIgG, antiHCV), serum alfafetoprotein
düzeyleri (AFP), tam kan sayımı (CBC), protrombin zamanı (PTZ), uluslararası
normalleştirme oranı (INR), ferritin, c-reaktif protein (CRP), kreatinin (Cr), aspartat
amino transferaz (AST), alanin amino transferaz (ALT), albümin, direkt bilirubin, total
kalsiyum düzeyleri çalışıldı. HBsAg(+) vakaların serumundan HbeAg, antiHbe,
antidelta ve HBVDNA düzeylerine bakıldı. AntiHCV(+) vakaların ise HVC RNA
düzeylerine bakıldı. Radyolojik olarak tüm hastaların Karaciğer yönelik Üst Abdomen
Ultrasonografisi, Portosplenik Renkli Doppler Ultrasonografisi, Karaciğere yönelik Üç
Fazlı Bilgisayarlı Tomografisi ve bazı vakalarda Üst Abdomen Manyetik Rezonans
görüntülemesi yapıldı. Bunların sonucuna göre tümörün boyutu, nodülaritesi ve çevre
dokulara ve vasküler yapılara invazyon gösterip göstermediği belirlendi. Daha önceden
siroz tanısı almış olan hastaların Child-Pugh skorları ve tüm hastaların MELD skoru,
Okuda ve BCLC evresi hesaplanarak hepatosellüler karsinoma evreleri erken, orta, ileri
ve son dönem olarak belirlendi. Hastaların tamamından EDTA içeren vakumlu tüplere 5
ml tam kan alındı. Kan örnekleri hastaların kendilerinin ve birinci derece yakınlarının
38
rızası ile alındı. Alınan kanlar +4 oC’de saklanarak en geç 20 gün içerisinde DNA
izolasyonu yapıldı. DNA izolasyonu standart yöntem “fenol-kloroform” ile yapıldı.1,2
P53 geni kodon 72 arjinin/prolin ve MDM2 309 timin/guanin tek nükleotid
polimorfizmleri polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temelli restriksiyon analizleri ile
araştırılmıştır.3,4
Çalışma için Çukurova Üniversitesi Etik Kurul onayı alındı. Araştırılacak
hastalar çalışma konusunda bilgilendirilerek onayları ile birlikte rıza formları alındı.
3.2. Çalışma Dışı Bırakma Kriterleri
Hastalarda anamnez, fizik muayene, biyokimyasal, radyolojik ve patolojik
bulgularıyla karaciğerdeki kitlesi için Hepatosellüler Karsinoma dışında başka bir
primer malignensi şüphesi olan vakalar çalışma dışı bırakıldı.
3.3. Biyokimyasal ve Serolojik Ölçümler
Tüm hastalardan biyokimyasal tetkikler için venöz kan örnekleri alındı. Alınan
kan örneklerinde biyokimyasal parametrelere bakıldı. Aynı anda çalışılamayan tetkikler
+4 derecede muhafaza edilerek diğer gün çalışıldı. Çalışmaya dahil edilen tüm
olgularda alfafetoprotein, albümin, tam kan sayımı (lökosit, hemoglobin, hematokrit,
trombosit), fibrinojen, crp, ptz, inr, ferritin, cr, ast, alt, direkt billirubin, total kalsiyum,
düzeyleri çalışıldı. Serolojik olarak HBsAg, antiHBs, antiHBc, HbeAg, antiHbe,
antiHCV bakıldı. PCR ile HBVDNA ve HCV RNA düzeyleri ölçüldü.
(1). C-reaktif protein düzeyi (CRP)
Serumda Dade Behring BN II seroloji cihazında nefelometrik yöntemle çalışıldı.
(2). Alfafetoprotein düzeyi;
Clauss yöntemi ile çalışan, Dade Behring koagülometrisinde tespit edildi.
(3). AST, ALT
Serumda modüler cihazda enzimatik kolorimetrik yöntem ile tespit edildi.
(4). Kalsiyum
Cresolphthalein Complexane yöntemi ve Modüler DPP cihazı ile çalışılmıştır.
39
(5). Albumin
BCG yöntemi ve Roche Modüler DPP cihazı ile çalışılmıştır.
(6). Total Biluribin
Kolorimetric assay yöntemi ve Roche Modüler DPP cihazı ile çalışılmıştır.
(7). Ferritin
Electroceleminesense (sandvic prensibi) yöntemi ve Roche Modüler DPP cihazı ile
çalışılmıştır.
(8). Tam kan sayımı (CBC)
Coulter method yöntemi ve Bechman Coulter cihazı ile çalışılmıştır.
(9). PTZ
Microagulation yöntemi ve AMAX 200 cihazı ile çalışılmıştır.
(10). İNR
Calculation (Hasta PTZ/normal ortalama PTZ) hesaplandı.
3.4 Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler
•
Thermal Döngü Cihazı
•
Soğutmalı Santrifüj
•
Mikrosantrifüj
•
Yatay elektroforez sistemi
•
Elektroforez güç kaynağı
•
Elektronik Hasas Terazi
•
Hız ayarlı Vorteks
•
Otomatik pipetler
•
pH metre
•
Enjektörler
•
UV transillumunator
•
UV görüntü analiz sistemi
•
Steril 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml eppendorf santrifüj tüpleri
•
Isıtıcı manyetik karıştırıcı
•
İnkübasyon cihazı
40
3.5 Çalışmada Kullanılan Araç ve Gereçler
•
Agaroz (Sigma)
•
Tris-Base (Sigma)
•
EDTA, sodyum tuzu (Sigma)
•
SDS, Sodyumdodesildülfat (Sigma)
•
Etil Alkol (Merck)
•
Borik Asit (Sigma)
•
Etidyum bromür (Sigma)
•
Proteinaz K (Sigma)
•
Taq DNA polimeraz enzimi (Promega)
•
Restriksiyon enzimleri (Promega ve Fermentas)
•
10 X PCR buffer (Promega)
•
Deoksiribonükleotid trifosfatlar (dNTPs, Promega)
•
Brom fenol blue (Sigma B-6896)
•
Mineral yağ (Sigma M-5904)
•
Potasyum bikarbonat (Merck C754962)
•
Sodyum klorür (Merck)
•
Xylene cyanol (Sigma X-4126)
•
Fenol (Sigma)
•
Kloroform (Merck9)
•
DNA size marker (100 bp DNA ladder, Puc 19 DNA/Msp1 Marker)
(Promega)
•
MgCI2 (Promega)
3.6 Çalışmada Kullanılan Stok Solüsyonların Hazırlanması
•
0,5 M EDTA pH 8,0
- 18,61 g disodyum EDTA
- 80 ml bidistile H2O içinde çözülür.
- Solüsyona 2 g NaOH tableti atılarak eritilir.
41
- pH 8’e ulaştığında bidistile H2O ile 100 ml tamamlanır.
- Otoklavda steril edilir.
•
1 M Tris Tamponu (Stok)
- 121,1 g Tris base tartılarak bir behere alındı. Üzerine 42
mikrolitre HCI ile yaklaşık 800 ml ddH2O eklenerek manyetik
karıştırıcı yardımıyla iyice çözündürüldü. Daha sonra balon
jöjeye aktarıldı ve 1 litreye tamamlandı. 120 oC’de 15 dakika
otoklavlanarak sterilize edildi.
•
10 X TBE (Stok Solüsyonu)
- 108 g Tris-base (0,9M)
- 55 g Borik asit (0,9M)
- 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 (20mM)
- Tris-base ve borik asit 700 ml bidistile H2O içinde çözülür
- EDTA eklenir.
- Bidistile H2O ile 1000 ml’ye tamamlanır.
- Oda sıcaklığında saklanır.
•
1 X TBE (Çalışma Solüsyonu)
- 100 ml 10 X TBE stoktan
- 900 ml bidistile H2O eklenir.
•
Edityum bromür solüsyonu (10 mg/ml)
- 1 g Etidyum bromür
- 10 ml bidistile H2O içinde çözülür.
- Işık almayan bir şişe içinde +4 oC’de saklanır.
- Stok solüsyondan, çalışma solüsyonu 0,5 mg/ml olacak şekilde
hazırlanır.
•
Proteinaz K (Sigma) Solüsyonu
42
- 10 ml 500 mM’lık Tris (pH 8) solüsyonu içine 100 mM'lık
CaCI2’den 0,1 ml ilave edilir ve 100 mg poteinaz K solüsyona
eklenir. Bu şekilde 10 mg/ml proteinaz K solüsyonları hazırlanır.
•
% 10’luk SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) (Merck)
- 10 g sodyum dodesi sülfat tartıldı. SDS tozlarını kaldırmamaya
dikkate ederek beher içine alındı ve üzerine 80 mililitre ddH2O
eklendi. Manyetik karıştırıcı yardımıyla çözündürüldü ve pH'sı
7,2’ye ayarlandı. 0,22 mikronluk filtreden geçirilerek sterilize
edildi ve oda ısısında saklandı.
•
4 M Sodyum Klorür (NaCI)
- 233,6 gram Sodyum klorür tartılarak erlene alındı. Üzerine 800
ml ddH2O ilave edildi ve manyetik karıştırıcı ile iyice
çözündürüldü. Balon jöjeye aktarılarak 1 litreye tamamlandı. 120
o
C’de 15 dakika otoklavlanarak sterilize edildi.
•
Agaroz Jel Yükleme Tamponu (5X)
- 20 g Ficoll 400, 1 g SDS, 0,2 ml 0,5 M EDTA, 1 ml 1 M’lık Tris
(pH 8), 200 mg Brom fenol blue, 200 mg Xylen cyanol tartılarak
steril ddH2O ile 100 ml’ye tamamlandı. Oda sıcaklığında
saklandı.
•
Eritrosit Parçalama Tamponu (Lysis Buffer)
- 8,74 g Amonyum klorür, 1 g Potasyum bikarbonat, 200 μl 0,5
M’lık EDTA’nın tartımları yapılarak erlen içine alındı. 900 ml
ddH2O eklendi ve çözeltinin pH'sı 1 N NaOH ile 7,4’e ayarlandı.
Daha sonra balon jöje içine alınarak 1 litreye tamamlandı. Çözelti
ısıya dayanıklı şişelere aktarılarak 120
o
C’de 15 dakika
otoklavlandı ve +4 oC’de saklandı.
•
Lökositleri Parçalama Tamponu (White Blood Cell Buffer-WBL)
43
- 25 ml 4 M NaCI ve 50 ml 0,5 M EDTA direk balon jöjeye
aktarılarak 1 litreye tamamlandı. 120
o
C’de 15 dakika
otoklavlanarak sterilize edildi.
3.7 DNA İzolasyon Yöntemi
- 5 ml EDTA’lı tüm kan 50 ml’lik polipropilen tüpe alınır.
- Kan örneğinin üç katı hacminde (15 ml) eritrosit lizis tamponu
konulup. Kapak kapatılıp kısaca çalkalanır.
- 2000 rpm’de +4 oC’de 15 dakika santrifüj yapılır. Üstteki süpernatant
pastör pipeti ile atılır.
- Eritrosit lizis tamponu ile yıkama işlemi iki kez daha yapılıp üstteki
süpernatant atılarak aynı devir ve soğutmalı santrifüjde santrifüj
edilir. Bu işlemelökosit pelleti beyazlaşıncaya kadar devam edildi.
- Lökosit pelleti beyazlaşınca süpernatant dökülür. Lökosit pelleti
üzerine 600 μl lökosit parçalama solüsyonu
(White Cell-Lysis
Buffer) 0,5 ml %10 SDS ve 10 µl proteinaz K konulup köpürtmeden
iyice pipetlenir. 55 oC’de 1 gece inkübasyona bırakılır.
- 1 gece sonunda her tüpe hacminin 2 katı olacak şekilde fenolkloroform (1:1) çözeltisinden eklenir. +4 oC’de 30 dakika beklenir.
- 30 dakikanın sonunda +4 oC’de 15 dakika 15000 devirde santrifüj
edildi.
Santrifüj
sonunda
süpernatant
temiz
tüpe
alınarak
süpernatantın hacminin 2 katı kadar tekrar feno-kloroform çözeltisi
eklendi ve +4 oC’de 30 dakika beklenir.
- 30 dakikanın sonunda +4 oC’de 15 dakika 15000 devirde santrifüj
edildi.
Santrifüj
sonunda
süpernatant
temiz
tüpe
alınarak
süpernatantın hacmini kadar kloroform ilave edildi. Ve +4 oC’de 15
dakika 15000 devirde santrifüj edildi.
- 15 dakikanın ardından süpernatant temiz bir tüpe alınarak üzerine -20
o
C tutulan %100’lük etil alkol eklendi. Bu aşamadan sonra örnekler -
20 oC’de 1 gece tutulur.
- 1 gecenin sonunda -20 oC’den çıkarılan örnekler +4 oC’de 15 dakika
15000 devirde santrifüj edildi.
44
- Santrifüj sonrasında süpernatant döküldü. Eppendorf tüpleri DNA
konsantratörde 3 dakika vakum altında kurutuldu. Daha sonra DNA
örnekleri steril ddH2O ile çözündü. Bu aşamadan sonra çözünmüş
DNA’lar -20 oC’de polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilinceye
kadar saklandı.
3.8 P53 ve MDM-2 Genlerinin PCR ile Çoğaltılması
3.8.1 P53 Kodon 72 Arginin/Prolin Polimorfizminin Genetik Analizi
P53 geninin kodon 72 Arg/Pro (rs1042522) polimorfizmi içerisinde bulunduran
199 bç’lik hedef bölgesinin DNA dizisi ve çoğaltılmasında kullanılan primer çifti
aşağıdaki gibidir.5,6 NCBI Nükleotid veri tabanından alınan AY838896 rapor numaralı
insan genomik sekansı kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online
Primer3 Output programından yararlanılmıştır.
PRİMER
Uzunuk (bç) TM
LEFT PRİMER
23
72,52 52,17 5′-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3′
RIGHT PRİMER
23
63,97 52,17 5′-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3′
GC% DNA sekansı
P53 geninin kodon 72 Arg/Pro (rs1042522) polimorfizmi içerisine alan DNA
dizisi aşağıdaki gibidir altı çizili nükleotid polimorfik olan nükleotidtir.
1 aaggacaagggttgggctggggacctggagggctggggacctggagggctggggggctgg
61 ggggctgaggacctggtcctctgactgctcttttcacccatctacagtcccccttgccgt
>>>>>>>
121 cccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaag
>>>>>>>>>>>>>>>>
181 acccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcac
241 cagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctg
<<<<<<<<<<<
301 tcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctg
<<<<<<<<<<<<
361 ggacagccaagtctgtgacttgcacggtcagttgccctgaggggctggcttccatgagac
45
Belirlenmiş primer çifti için; PCR tüpünde son hacim 50 μL olup içeriği şu
şekildedir. Her iki primer çiftinden (50pmol) 0,5 μL, MgCI2 (25mM) 4 μL, dNTP
(10mM) 2 μL, PCR tamponu 5 μL, Taq DNA polimeraz (5U/μL) 0,3 μL, DNA 5 μL
(250ng) ve son hacim 50 μL olacak şekilde ddH2O oluşur. (Tablo 8.)
Tablo 8. P53 Kodon 72 Arginin Prolin
Gerçekleştirildigi PCR Reaksiyonu Karışımı
Polimorfizminin Optimum
Amplifikasyonun
Reaksiyon karısımı
Miktar
Final konsantrasyon
10XPCR tamponu
5
1X
Magnezyum klorür (25Mm) 4
2,5 Mm
Forward primer(50 pmol)
0,5
25 pmol
Reverse primer(50 pmol)
0,5
25 pmol
DeoksiNTP mix (10Mm)
0,2
0,2 mM
0,2
1U
DNA
1
200-500 ng
Steril bidistile su
16,6
Tag
DNA
polimeraz
(5U/µl)
.
PCR işlemini gerçekleştirmek için, otomatik ısı döngü cihazını aşağıda belirtilen
sıcaklık ve sürelere göre ayarlandı. (Tablo 9.)
Tablo 9. P53 Kodon 72 Arginin Prolin Polimorfizmini için PCR Sıcaklıkları
Reaksiyon Asaması
SıcaklıkºC
Süre
Döngü sayısı
İlk denatürasyon
95
10 dk
1
Denatürasyon
95
1dk
Annealing(primer baglanması)
55
1dk
Extension(Zincir uzaması)
72
1dk
Final extension
72
10dk
33
1
PCR için kullanılan karışım 0,2 ml’lik tüplere dağıtıldı ve üzerine saflaştırılan
genomik DNA eklendi. Tüm işlemler tepkimenin doğru gerçekleşmesi için buz üstünde
yapıldı. Bu şekilde elde edilen tepkime karışımı otomatik ısı döngü cihazına
yerleştirilerek tepkime gerçekleştirildi. Tüm PCR’larda negatif kontrol olarak DNA
içermeyen steril su kullanıldı.
46
3.8.2 MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin Genetik Analizi
MDM2 geninin SNP309 T/G polimorfizmini içerisinde bulunduran 158 bç’lik hedef
bölgesinin DNA dizisi ve çoğaltılmasında kullanılan primer çifti aşağıdaki gibidir.
NCBI Nükleotid veri tabanından alınan AF527840 rapor numaralı insan genomik
sekansı kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online Primer3 Output
programından yararlanılmıştır.
Uzunuk
PRİMER
(bç)
TM
GC% DNA sekansı
LEFT PRİMER
20
64,12 60,00 5′-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3′
RIGHT PRİMER
20
61,88 60,00 5′-CTGAGTCAACCTGCCCACTG-3′
MDM2 geninin SNP309 T/G polimorfizmini alan DNA dizisi aşağıdaki gibidir
altı çizili nükleotid polimorfik olan nükleotidtir.
2461 cgccagggaggagggcgggatttcggacggctctcgcggcggtgggggtgggggtggttc
2521 ggaggtctccgcgggagttcagggtaaaggtcacgggggccgggggctgcggggccgctt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
2581 cggcgcgggaggtccggatgatcgcaggtgcctgtcgggtcactagtgtgaacgctgcgc
2641 gtagtctgggcgggattgggccggttcagtgggcaggttgactcagcttttcctcttgag
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<
2701 ctggtcaagttcagacacgttccgaaactgcagtaaaaggagttaagtcctgacttgtct
Belirlenmiş primer çifti için; PCR tüpünde son hacim 50 μL olup içeriği şu
şekildedir. Her iki primer çiftinden (50pmol) 0,5 μL, MgCI2 (25mM) 4 μL, dNTP
(10mM) 2 μL, PCR tamponu 5 μL, Taq DNA polimeraz (5U/μL) 0,3 μL, DNA 5 μL
(250ng) ve son hacim 50 μL olacak şekilde ddH2O oluşur.
47
Tablo 10. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildigi PCR
Reaksiyonu Karışımı
Reaksiyon karısımı
Miktar
Final konsantrasyon
10XPCR tamponu
5
1X
Magnezyum klorür (25Mm) 4
2,5 mM
Forward primer(50 pmol)
0,5
25 pmol
Reverse primer(50 pmol)
0,5
25 pmol
DeoksiNTP mix (10mM)
2
0,2 mM
0,2
1U
DNA
1
200-500 ng
Steril bidistile su
16,6
Tag
DNA
polimeraz
(5U/µl)
PCR işlemini gerçekleştirmek için, otomatik ısı döngü cihazını aşağıda belirtilen
sıcaklık ve sürelere göre ayarlandı. (Tablo 11.)
Tablo 11. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin için PCR Sıcaklıkları
Reaksiyon Asaması
SıcaklıkºC
Süre
Döngü sayısı
İlk denatürasyon
95
10 dk
1
Denatürasyon
95
1dk
Annealing(primer baglanması)
59
1dk
Extension(Zincir uzaması)
72
1dk
Final extension
72
10dk
35
1
Belirlenmiş primer çifti için; PCR tüpünde son hacim 50 μL olup içeriği şu
şekildedir. Her iki primer çiftinden (50pmol) 0,5 μL, MgCI2 (25mM) 2 μL, dNTP
(10mM) 2 μL, PCR tamponu 5 μL, Taq DNA polimeraz (5U/μL) 0,3 μL, DNA 5 μL
(250ng) ve son hacim 50 μL olacak şekilde ddH2O oluşur.
PCR işlemini gerçekleştirmek için, otomatik ısı döngü cihazını aşağıda belirtilen
sıcaklık ve sürelere göre ayarlandı.
PCR için kullanılan karışım 0,2 ml’lik tüplere dağıtıldı ve üzerine saflaştırılan
genomik DNA eklendi. Tüm işlemler tepkimenin doğru gerçekleşmesi için buz üstünde
yapıldı. Bu şekilde elde edilen tepkime karışımı otomatik ısı döngü cihazına
48
yerleştirilerek tepkime gerçekleştirildi. Tüm PCR’larda negatif kontrol olarak DNA
içermeyen steril su kullanıldı.
3.9. Çoğaltılmış DNA’ların Elektroforezde Değerlendirilmesi
PCR sonucu oluşan DNA’ları yürütmek için %2’lik agaroz jel hazırlandı. 5 μl PCR
ürünü 1 μl yükleme tamponuyla karıştırılarak kuyucuklara yüklendi. Jel 90 voltta 90
dakika elektroforeze tabi tutuldu. Ultraviyole lamba altında PCR’da kullanılan primer
çiftlerine göre oluşan DNA bantları incelendi. P53 geninin kodon 72 Arg/Pro
(rs1042522) polimorfizmi için 199 bç’lik 1 adet bant gözlendi. (Şekil 5.) MDM2
geninin SNP309 T/G polimorfizmini için 158 bç’lik 1 adet band gözlendi. (Şekil 6.)
500 bp
400 bp
300 bp
199 bp
200bp
100 bp
Şekil 5. p53 geni Kodon 72 Arg/Pro Polimorfizminin tespiti için Polimeraz Zincir Reaksiyonu
sonucunun %2’lik agaroz jeldeki görüntüsü.
49
500 bp
400 bp
300 bp
200bp
157 bp
100 bp
Şekil 6. MDM2 SNP309 T/G Polimorfizminin Tespiti için Yapılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu
sonucunun %2’lik agaroz jeldeki görüntüsü
3.10. PCR Ürünlerinin Restriksiyon Enzimleri ile Kesimi
3.10.1 P53 geninin kodon 72 Arg/Pro Polimorfizminin Genotiplendirilmesi
Polimeraz Zincir Reaksiyonu sonucunda oluşan 199 bç’lik DNA fragmentleri
agoroz jel elektroforezi ile belirlendikten sonra p53 geni Kodon 72 Arg/Pro
Polimorfizmi PCR tabanlı RFLP yöntemi ile belirlenmiştir. Bu işlem BstUI’nın (New
England Biolabs, MA) restriksiyon etkisi kullanılarak yapılmıştır.
BstUI (New England Biolabs, Beverly, MA) Restriksiyon Enzimi
New England Biolabs tarafından üretilen BstUI endonükleazı Bacillus
stearothermophilus’tan elde edilmiştir. Bu enzim restriksiyon etkisini küt uç oluşturarak
gösterir.
50
BstUI Restriksiyon Enzimi Tanımlama Bölgesi
▼
5′……CGCG……3′
3′……GCGC……5′
▲
BstUI Restriksiyon Enzimin Niteliği
NEBufferların içinde aktiviteleri
NEBuffer 1: %100
NEBuffer 2: %100
NEBuffer 3: %50
NEBuffer 4: %100
Methilasyon Duyarlılığı
dam methilasyon:
Duyarsız
dcm methilsayon:
Duyarsız
CpG methilsayon:
Bloklar
37 oC aktivite:
%20
Saklama sıcaklığı:
-20 oC
İzoşizomeri:
FnDII
Sıcaklıkla inaktivasyonu:
Yok
51
Kullanılan Buffer
:1X NEBuffer2
İnkübasyon sıcaklığı
:
60 oC
1X NEBuffer 2:
10 mM Tris-HCl
50 mM NaCl
10 mM MgCl2
1 mM Dithiothreitol
Ünite Tanımlılığı:
1 µg λ DNA’sının enzim tarafından sindirilebilmesi için
60 oC’de 50µl tampon içinde 1 ünite enzim gereklidir.
Konsantrasyon:
10,000 units/ml
1 µg substrat DNA’nın kesimi için gerekli olan minimum enzim miktarı 16
saatte 0,13 ünitedir.
Deneyin Yapılışı:
0,5 ml’lik ependorf tüpünün içine 16 μl ddH2O, 5 μl PCR ürünü, 2 μl BstUI
endonükleaz tamponu, 5 ünite BstUI restriksiyon enzimi, 0,2 μl bovin serum albumin
eklendi. Karışım enzimin optimum çalıştığı sıcaklık olan 50 oC’de ısıtıcı içinde 1 gece
boyunca inkübe edildi. İnkübasyon sonrası tüplerden alınan kesim ürünü 3 μl
Bromfenol mavisi ile karıştırılarak % 3’lük agaroz jele yüklendi. % 3’lük agaroz jelde
PBR322 moleküler ağırlık belirteci ve enzim kesimi yapılmamış PCR ürünü eşliğinde
90 dakika 90 volt sabit akımda yürütülüp ultraviyole lamba altında incelenip fotoğrafı
çekildi.
199 bp’lik PCR ürünü uygun şartlar altında BstUI restriksiyon enzimi ile
muamele edilir ve çoğaltılan DNA fragmentinde BstUI restriksiyon enziminin tanıma
bölgesi olan “CGCG” bölgesi yer alırsa DNA fragmenti restriksiyon enzimi tarafından
sindirilir. Şekil.7’de görüldüğü üzere restriksiyon enzimi tarafından sindirilmiş 199
bp’lik DNA fragmenti 113 bp’lik ve 86 bp’lik iki alt üniteye dönüşmüştür.171
52
p53 kodon 72 sırasıyla 199 bp, 113 bp ve 86 bp’lik fragmentlere göre analiz
edilmiştir. Buna göre 199 bp’lik tek bir fragmentin üzerinde BstUI enzimsel bir tanıma
bölgesi ve restriksiyona tabii olmadığından Prolin olarak değerlendirilmiştir. 113 bp ve
86 bp iki ayrı fragment ise BstUI enzimsel bir tanıma bölgesine sahip olan ve
restriksiyona tabii olan Arjinin olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca allelerden birinin
Prolin diğerinin Arjinin olmasıyla ortaya 3 farklı uzunlukta 199 bp, 113 bp ve 86 bp’lik
üç
farklı
uzunlukta
fragment
oluşmuştur.
Bunlarda
heterezigot
olarak
değerlendirilmiştir. (Şekil 7.)
Prolin
Prolin
Prolin/
Arjinin Arjinin
Prolin/
Arjinin
Arjinin
Arjinin
500 bp
400 bp
300 bp
200bp
199 bp
100 bp
113 bp
86 bp
Şekil 7. PCR Tabanlı RFLP yöntemi ile MSPA1I
Restriksiyon Enzimi Kullanılarak p53 Genin analizi
53
(New England Biolabs, Beverly, MA)
3.10.2 MMD2 SNP 309 T/G Polimorfizminin Genotiplendirilmesi
MMD2 geni SNP 309 T/G Polimorfizminin tanımlamak için özgül primerler
kullanılarak çoğaltılan 158 bç’lik hedef gen bölgesi MSPA1I (New England Biolabs,
Beverly, MA) restriksiyon enzimi ile kesildi. MSPA1I restriksiyon enziminin tanıma
bölgesi şu şekildedir.
MSPA1I Restriksiyon Enzimi Tanımlama Bölgesi
▼
5′……CMGCKG……3′
3′……GKCGMC……5′
▲
MSPA1IRestriksiyon Enzimin Niteliği
NEBufferların içinde aktiviteleri
NEBuffer 1: % 50
NEBuffer 2: % 100
NEBuffer 3: % 50
NEBuffer 4: % 100
Methilasyon Duyarlılığı
dam methilasyon:
Duyarsız
dcm methilsayon:
Duyarsız
CpG methilsayon:
Bloklar veya overlap yapar
Saklama sıcaklığı:
-20 oC
54
Sıcaklıkla inaktivasyonu:
65 oC’de 20 dak.
Reaksiyon ve Saklama Koşulları
Kullanılan Buffer
:1X NEBuffer 4
İnkübasyon sıcaklığı
: 37 oC
1X NEBuffer 4:
20 mM Tris-asetat
50 mM Potasyum asetat
10 mM Magnezyum asetat
1 mM Dithiothreitol
Ünite Tanımlılığı:
1 µg of λ DNA’sının 1 saat içinde 37 oC’de 1 ünite enzim
tarafından toplam hacmin 50µl olduğu bir reaksiyonda kestiği
tanımlanmıştır.
Konsantrasyon:
10,000 units/ml
1 µg substrat DNA’nın kesimi için gerekli olan minumum enzim miktarı16
saatte 0,25 ünitedir.
Deneyin Yapılışı:
0,5 ml’lik ependorf tüpünün içine 16 μl ddH2O, 5 μl PCR ürünü, 2 μl MSPA1I
endonükleaz tamponu ve 5 ünite MSPA1I restriksiyon enzimi eklendi. Karışım enzimin
optimum çalıştığı sıcaklık olan 37 oC’de ısıtıcı içinde 1 gece boyunca inkübe edildi.
İnkübasyon sonrası tüplerden alınan kesim ürünü 3 μl Bromfenol mavisi ile
karıştırılarak % 3’lük agaroz jele yüklendi. % 3’lük agaroz jelde PBR322 moleküler
ağırlık belirteci ve enzim kesimi yapılmamış PCR ürünü eşliğinde 90 dakika 90 volt
sabit akımda yürütülüp ultraviyole lamba altında incelenip fotoğrafı çekildi.
157 bç’lik PCR ürünü uygun şartlar altında MSPA1I restriksiyon enzimi ile
muamele edildi. MSPA1I restriksiyon enzimi MDM2 geni SNP309 noktasında Guanin
nükleotidi bulunan PCR ürünü DNA fragmentlerini sindirerek 110 bç’lik ve 47 bç’lik
iki ayrı DNA fragmenti oluşturdu. Buna göre bant dizileri arasında, 157 bç’lik tek bir
DNA fragmenti TT homozigot, 110 ve 47 bç’lik iki DNA fragmenti GG homozigot ve
157, 110 ve 47 bç’lik üç DNA fragmenti T/G heterozigot olarak kabul edildi.172
(Şekil 8.)
55
500 bp
400 bp
300 bp
200bp
157 bp
110 bp
100 bp
47 bp
Şekil 8. PCR Tabanlı RFLP yöntemi ile MSPA1I (New England Biolabs, Beverly, MA)
Restriksiyon Enzimi KullanılarakMMD2 SNP 309 T/G Polimorfizminin analizi
3.11. İstatistiksel Analizler
Sayısal değişkenlerin ortalamalarının karşılaştırılmasında Student-t testi kullanılmıştır.
Vaka ve kontrol grupları arasındaki MDM2 ve P53 genotip dağılımlarındaki farklılıklar
Ki-Kare (X2) testi ile yapıldı. Lojistik regresyon yöntemiyle ile MDM2 ve P53
polimorfizmi arasındaki ilişki araştırılmıştır. P değerinin 0,05 küçük olması istatistiksel
olarak anlamlı kabul edildi. Bütün istatistiksel yöntemler, “SPSS (Statistical Packages
of Social Sciences, SPSS for Windows, Version 15,0 Chicago, IC, USA)” istatistiksel
paket programı kullanılarak yapıldı.
56
4.BULGULAR
Çalışmaya 128 hepatosellüler karsinomlu ve bilinen her hangi bir kanser veya
viral hepatit öyküsü olmayan kontrol grubu olarak 128 birey alındı. Hasta grubu ve
kontrol grubunun yaş, cinsiyet, sigara ve alkol öyküleri benzer olarak şeçildi. Hasta ve
kontrol grubunun demografik verileri Tablo 12.’de gösterilmektedir.
Tablo 12. Hasta ve Kontrol Grubunun Demografik Özellikleri
Karakteristikler
Kontrol (n=128), n (%)
Hasta (n=128), n (%)
Cinsiyet
1,00
Erkek
105 (82)
105 (82)
Kadın
23 (18)
23 (18)
58,3 (10,89)
58,26 (10,93)
Yaş Ortalama (yıl±SD)
p
Sigara (%)
0,98
1,00
Kullanan
59 (46,1)
59 (46,1)
Kullanmayan
69 (53,9)
69 (53,9)
Alkol
1,00
Kullanan
37 (28,9)
37 (28,9)
Kullanmayan
91 (71,1)
91 (71,1)
57
Hastalara ait klinik özellikler ise Tablo 13.’de gösterilmiştir.
Tablo 13. Hastalara ait Klinik Özellikler
Değişken
n (%)
Viral Enfeksiyon
HBsAg (+)
HBeAg (+)
10 (% 7,8)
HBeAg (-)
57 (% 44,5)
E antijeni bilinmeyen
7 (% 5,5)
Total
74 (% 57,8)
Anti-HCV (+)
29 (% 22,7)
HBsAg (+) + Anti-HCV (+)
2 (% 1,6)
HBsAg (+) + Anti-Delta (+)
2 (% 1,6)
Hepatit Marker’ları (-)
21 (% 16,5)
Olan
101 (% 78,9)
Olmayan
27 (% 21,1)
Siroz
Child Pugh Skoru
A
14 (% 10,9)
B
31 (% 24,2)
C
52 (% 40,6)
Bilinmeyen
31 (% 24,2)
Tümörün Boyutu (cm)
<2
4 (% 3,1)
2-5
49 (% 38,3)
>5
60 (% 46,9)
Bilinmeyen
15 (% 11,7)
Nodül Sayısı
Tek Nodül
41 (% 32)
Multi Nodül
80 (% 62,5)
Bilinmeyen
7 (% 5,5)
58
Portal İnvazyon
Olan
47 (% 36,7)
Olmayan
68 (% 53,1)
Bilinmeyen
13 (% 10,2)
Alfafeto protein düzeyi (ng/ml)
<100
56 (% 43,8)
100-400
19 (% 14,8)
>400
48 (% 37,5)
Bilinmeyen
5 (% 3,9)
Okuda Evre
Evre I
7 (% 5,5)
Evre II
57 (% 44,5)
Evre III
52 (% 40,6)
Bilinmeyen
12 (% 9,4)
BCLC Evreleme
A1
4 (% 3,1)
A2
3 (% 2,3)
A3
4 (% 3,1)
A4
14 (% 10,9)
B
24 (% 18,8)
C
23 (% 18)
D
52 (% 40,6)
Bilinmeyen
4 (% 3,1)
HSK Evre
Erken
25 (% 19,5)
Orta
24 (% 18,8)
İleri
22 (% 17,2)
Son dönem
53 (% 41,4)
Bilinmeyen
4 (% 3,1)
59
Kemoterapi
Alan
5 (% 3,9)
Almayan
123 (% 96,1)
Kemoembolizasyon
Yapılan
28 (% 21,9)
Yapılamayan
100 (% 78,1)
Tablo 14. Hastalara ait Laboratuar Değişkenleri
Değişken
Ortalama±SD (min-max)
ALT (IU/ml)
75,1±6,58 (10-444)
AST (IU/ml)
135±15,4 (14-1592)
Ferritin (ng/ml)
633±111 (6,4-6627)
Albumin (g/dl)
2,96±0,7 (1,9-5,1)
CRP (mg/l)
41,3±4,6 (2,98-256)
PTZ (sn)
17,2±0,44 (11,4-39)
INR
1,38±0,37 (0,88-2,9)
Total Bilirubin (mg/dl)
4,01±0,46 (0,20-32)
Kalsiyum (mg/dl)
8,8±1,02 (7,41-13,9)
Hematokrit (%)
34,2± 5,09 (25-46)
Platelet (mm3)
159.300±9300 (27.000-536.000)
Alfafetoprotein (ng/ml)
12.667±4282 (1,3-325.725)
HBV DNA (IU/ml)
4,4x106±2,2x106 (0-11x107)
HCV RNA (IU/ml)
4,9x105±1,3x105 (0-2.460.000)
60
Tablo 15. HSK ve Kontrol Grubu arasında MDM2 ve P53 Genotip Oranlarının Karşılaştırılması
Değişken
Kontrol (%)
Hasta (%)
MDM2 SNP309 T>G
P
0,009
TT
48 (% 40,7)
27 (% 22,9)
TG
50(% 42,4)
59(% 50)
GG
20(% 16,9)
32(%27,1)
p53 Kodon72 Arg/Pro
0,037
Arg/Arg
49(% 41,2)
48(% 40,3)
Arg/Pro
63(% 52,9)
52(% 43,7)
Pro/Pro
7(% 5,9)
19(% 16)
MDM2 genotiplerine göre HSK’lı grupla kontrol grubu karşılaştırıldığında GG,
TG ve TT genotipleri HSK’lı grupta sırasıyla 32 (% 27,1), 59 (% 50) ve 27 (% 22,9)
vakada saptanırken, Kontrol grubunda sırasıyla 20 (% 16,9), 50 (% 42,4) ve 48 (%
40,7) vakada saptandı. Her iki grup arasında MDM2 GG genotipi yönünden tek yönlü
varyans analiziyle bakıldığında istatiksel olarak anlamlı farklılık mevcuttu. (p: 0,009)
(Tablo 15.) (Şekil 9.)
61
MDM2
GG
60
TG
TT
Vaka Sayısı
50
40
30
59
50
48
20
32
27
10
20
0
KONTROL
HASTA
Şekil 9. HSK’lı grupla Kontrol grubunda MDM2 Genotip Sıklıkları
P53 genotiplerine göre HSK’lı grupla Kontrol grubu karşılaştırıldığında Pro/Pro,
Arg/Pro ve Arg/Arg genotipleri HSK’lı grupta sırasıyla 19 (% 16,0), 52 (% 43,7) ve 48
(% 40,3) vakada saptanırken, Kontrol grubunda sırasıyla 7 (% 5,9), 63 (% 52,9) ve 49
(% 41,2) vakada saptandı. Her iki grup arasında p53 Pro/Pro genotipi yönünden
istatiksel olarak anlamlı farklılık mevcuttu. (p: 0,037) (Tablo 15. ) (Şekil 10.)
62
P53
pro/pro
arg/pro
arg/arg
Vaka Sayısı
60
40
63
52
49
48
20
19
0
7
KONTROL
HASTA
Şekil 10. HSK’lı grupla Kontrol grubunda p53 Genotip Sıklıkları
MDM2 genotip allelerinin Kontrol ve HSK grubunda sıklıklarına bakıldığında T
alleli sırasıyla toplam 146 (% 61,9) ve 113 (% 48) olarak saptanırken, G alleli sırasıyla
toplam 90 (% 38,1) ve 123 (% 52) olarak saptandı. Her iki grup arasında G alleli taşıma
yönünden farklılık istatiksel olarak anlamlıydı (p: 0,002). G alleli taşıyan bireylerin T
alleli referans alındığında 1,77 (% 95 GA 1,23-2,54) kat daha fazla HSK’ya yakalanma
riski olduğu saptandı.
Baskın genotip olarak GG ve TG alındığında sıklıkları Kontrol ve HSK
Grubunda sırasıyla 70 (% 59,3) ve 91 (% 77,1) olarak saptanırken, TT genotipi sırasıyla
48 (% 40,7) ve 27 (% 22,9) olarak saptandı. Her iki grup arasındaki farklılık istatiksel
olarak anlamlıydı (p: 0,004). TT genotipi referans olarak alındığında GG ve TG
63
genotipine sahip olan bireylerin 2,31 (% 95 GA 1,31-4,10) kat daha fazla HSK riski
olduğu saptandı.
Çekinik genotip olarak TT ve TG alındığında Kontrol ve HSK grubunda
sırasıyla 98 (% 83,1) ve 86 (% 72,9) olarak saptanırken, GG genotipi sırasıyla 20 (%
16,9) ve 32 (% 27,1) olarak saptandı. Her iki grup arasındaki farklılık istatiksel olarak
anlamlı olarak saptanmasada (p: 0,06), TT ve TG genotipleri referans olarak alındığında
GG genotipine sahip olan bireylerin 1,82 (% 95 GA 0,97-3,42) kat daha fazla HSK’ya
yakalanma riski olduğu saptandı. (Tablo 16.)
Tablo 16. MDM2 genotip allelerine ve baskın ve resesif genotiplere göre Lojistik regresyon analizi
Kontrol (%), Hasta (%), n P
OR (%95 GA)
n = 118
= 118
T
146 (61,9)
113 (48)
G
90 (38,1)
123 (52)
TT
48 (40,7)
27 (22,9)
TG
50 (42,4)
59 (50)
0,016
2,10 (1,15-3,84)
GG
20 (16,9)
32 (27,1)
0,005
2,84 (1,4-5,9)
TT
48 (40,7)
27 (22,9)
GG + TG
70 (59,3)
91 (77,1)
TT + TG
98 (83,1)
86 (72,9)
GG
20 (16,9)
32 (27,1)
Allele sıklığı
1,00 (Referans)
0,002
1,77 (1,23-2,54)
Genel genotip
1,00 (Referans)
Baskın genotip
1,00 (Referans)
0,004
2,31 (1,31-4,10)
Çekinik genotip
64
1,00 (Referans)
0,06
1,82 (0,97-3,42)
P53 genotip allelerinin Kontrol ve HSK grubunda sıklıklarına bakıldığında Arg
alleli sırasıyla toplam 161 (% 67,6) ve 148 (% 62,2) olarak saptanırken, Pro alleli
sırasıyla toplam 77 (% 32,4) ve 90 (% 37,8) olarak saptandı. Her iki grup arasında Pro
alleli taşıma yönünden farklılık mevcuttu ama bu fark istatiksel olarak anlamlı değildi
(p: 0,2). Pro alleli taşıyan bireylerin Arg alleli referans alındığında 1,27 (% 95 GA 0,871,85) kat daha fazla HSK’ya yakalanma riski olduğu saptandı.
Baskın genotip olarak Pro/Pro ve Arg/Pro alındığında sıklıkları Kontrol ve HSK
grubunda sırasıyla 70 (% 58,8) ve 71 (% 59,7) olarak saptanırken, Arg/Arg genotipi
sırasıyla 49 (% 41,2) ve 48 (% 40,3) olarak saptandı. Her iki grup arasındaki farklılık
istatiksel olarak anlamlı değildi (p: 0,89).
Çekinik genotip olarak Arg/Arg ve Arg/Pro alındığında Kontrol ve HSK
grubunda sırasıyla 112 (% 94,1) ve 100 (% 84) olarak saptanırken, Pro/Pro genotipi
sırasıyla 7 (% 5,9) ve 19 (% 16) olarak saptandı. Her iki grup arasındaki farklılık
istatiksel olarak anlamlıydı (p: 0,016), Arg/Arg ve Arg/Pro genotipleri referans olarak
alındığında Pro/Pro genotipine sahip olan bireylerin 3,04 (% 95 GA 1,23-7,52) kat daha
fazla HSK’ya yakalanma riski olduğu saptandı. (Tablo 17.)
65
Tablo 17. P53 genotip allelerine ve baskın ve resesif genotiplere göre Lojistik regresyon analizi
Kontrol (%), Hasta (%), P
OR (95% CI)
n = 119
n = 119
Arg
161 (67,6)
148 (62,2)
Pro
77 (32,4)
90 (37,8)
Arg/Arg
49 (41,2)
48 (40,3)
Arg/Pro
63 (52,9)
52 (43,7)
0,535
0,84 (0,5-1,50)
Pro/Pro
7 (5,9)
19 (16)
0,036
2,76 (1,06-7,2)
Arg/Arg
49 (41,2)
48 (40,3)
Pro/Pro+Arg/Pro
70 (58,8)
71 (59,7)
Arg/Arg+Arg/Pro
112 (94,1)
100 (84)
Pro/Pro
7 (5,9)
19 (16)
Allele sıklığı
1,00 (Referans)
0,2
1,27 (0,87-1,85)
Genel genotip
1,00 (Referans)
Baskın genotip
1,00 (Referans)
0,89
1,04 (0,62-1,74)
Çekinik genotip
66
1,00 (Referans)
0,016
3,04 (1,23-7,52)
Tablo 18. MDM2 ve p53 Genotip Kombinasyonlarına Göre HSK Riskleri
MDM2
p53
HSK
Kontrol
SNP309
Arg72Pro
n (%)
N (%)
RO (%95
p değeri
GA)
T/T
Arg/Arg
15 (%13.6)
22 (% 19,8)
1,00
0,02
T/T
Arg/Pro
4 (%3.6)
19 (% 17,1)
0,31
0,06
T/T
Pro/pro
2 (%1.8)
4 (% 3.6)
0,73
0,73
T/G
Arg/Arg
15 (% 13.6)
17 (%53.1)
1,3
0,59
T/G
Arg/Pro
33 (% 30)
26 (% 23,4)
1,8
0,16
T/G
Pro/pro
9 (% 8,2)
3 (% 2,7)
4,4
0,047
G/G
Arg/Arg
9 (% 8,2)
7 (% 6,3)
1,89
0,29
G/G
Arg/Pro
15 (% 13,6)
12 (% 10,8)
1,83
0,23
G/G
Pro/pro
8 (%
1 (% 0,9)
11,7
0,027
MDM2 ve p53 genotip kombinasyonlarına göre HSK riskide incelendi. Buna
göre TT Arg/Arg genotipi taşıyan bireyler referans olarak alındığında TG Pro/Pro
genotipi taşıyan bireylerde riskin 4,4 kat (p: 0,047), GG Pro/Pro genotipi taşıyan
bireylerde ise 11,7 kat (p: 0,027) arttığı saptandı. (Tablo 18.)
67
Tablo 19. MDM2 ve p53 Genotipleriyle Hastaya ve Tümöre Ait Karakteristiklerin Karşılaştırılması
MDM2 SNP309 T>G
Değişken
P53 Kodon 72 Arg/Pro
Arg/Arg
Arg/Pro
p
TG
GG
56,8±10,9
59,1±11,4
56,6±9,7
0,505
60,1±11,3
57,7±11,5
56,6±8,3
0,380
Yaşam Süresi
3,6±2,0
10,3±9,8
11,1±7,7
0,003
8,4±9,3
8,6±9,7
13,5±3,2
0,006
Tümör Boyutu
76,1±39,3
54,7±35,6
68,0±34,9
0,048
72,0±38,1
57,6±34,7
50,6±35,2
0,078
Alfafetoprotein
5421,28±
13.169,65±
2741,4±
0,354
11423±
9842±
2342±
0,68
Düzeyi (ng/ml)
11.559,3
47.549,6
8293,8
38.604
42.544
5662
Hastalığa Yakalanma
TT
P
Pro/Pro
Yaşı
68
MDM2 Genotipleriyle HSK’ya yakalanma yaşı arasındaki ilişkiye bakıldığında her üç
genotip arasında istatiksel olarak anlamlı bir farklılık yoktu. (p: 0,505) (Tablo 19.)
(Şekil 11.)
59,5
Yaşın Ortalama Değeri
59,0
58,5
58,0
57,5
57,0
56,5
GG
TG
MDM2 Genotipler
Şekil 11. MDM2 Genotip HSK’ya yakalanma yaşı arasındaki ilişki
69
TT
P53 genotipleriyle HSK’ya yakalanma yaşı arasındaki ilişkiye bakıldığında her üç
genotip arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık yoktu. Ancak Arg/Arg alleli taşıyan
bireylerin diğer genotipleri taşıyan bireylere göre HSK’ya yakalanma yaşının rölatif
olarak daha geç olduğu gözlendi. (Tablo 19.) (Şekil 12.)
61
Yaş Ortalaması
60
59
58
57
56
pro/pro
arg/pro
arg/arg
p53 Genotipleri
Şekil 12. p53 Genotipleriyle HSK’ya Yakalanma Yaşı Arasındaki İlişki
70
MDM2 genotipiyle HSK’lı hastalarda yaşam süresi arasındaki ilişkiye bakıldığında GG
genotipi taşıyan bireylerin ortalama 11,1±7,7 ay TG genotipi taşıyan bireylerin 10,3±9,8
ay ve TT genotipi taşıyan bireylerin 3,6±2,0 ay yaşadıkları saptandı. Her üç genotip
arasındakı farklılık istatiksel olarak anlamlıydı (p: 0,003). TT genotipi taşıyan bireylerin
diğer bireylere göre daha az olarak yaşadıkları saptandı. (Tablo 19.) (Şekil 13.)
Ortalama Yaşam Süresi
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
GG
TG
MDM2 Genotipleri
Şekil 13. MDM2 genotipleri ve yaşam süresi arasındaki ilişki
71
TT
P53 genotipleriyle HSK’lı hastalardaki yaşam süresi arasındaki ilişkiye bakıldı. Pro/Pro,
Arg/Arg ve Arg/Arg alellerini taşıyan bireylerin sırasıyla ortalama 13,5±3,2 ay, 8,6±.9,7
ay, 8,4±9,3 ay yaşadıkları saptandı. Her üç genotip arasındaki farklılık istatiksel olarak
anlamlıydı (p: 0,006). Arg/Arg genotipini taşıyan bireylerin diğer genotipleri taşıyan
bireylere göre daha az yaşadığı saptandı. (Tablo 19.) (Şekil 14.)
25,00
Ortalama Yaşam Süresi
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
pro/pro
arg/pro
arg/arg
p53 Genotipleri
Şekil 14. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalarda Yaşam Süresi Arasındaki İlişki
72
MDM2 genotipleriyle HSK’lı hastalaraki tümör boyutu arasındaki ilişkide incelendi.
Buna göre GG, TG, TT genotipi olan bireylerdeki tümör boyutlarının sırasıyla ortalama
68.0±34,9 mm, 54.7±35,6 mm ve 76.1±39,3 mm oldukları saptandı. Genotipler
arasındaki farklılık istatiksel olarak anlamlıydı(p: 0,048). TT genotipine sahip olan
bireyler diğer genotiplere sahip bireylere göre daha büyük kitle boyutuna sahip
oldukları saptandı. (Tablo 19.) (Şekil 15.)
160,00
150,00
140,00
130,00
120,00
Tümör Boyutu
110,00
100,00
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
GG
TG
MDM2 Genotipleri
Şekil 15. MDM2 Genotipi ve Tümör Boyutu Arasındaki İlişki
73
TT
P53 genotipleriyle HSK’lı hastalardaki tümör boyutları arasındaki ilişkide incelendi.
Buna göre Pro/Pro, Arg/Pro, Arg/Arg genotiplerini taşıyan bireylerdeki ortalama
tümör boyutları 50,6±6,0 mm, 57,6±5,7 mm, 72,04±5,95 mm olarak saptandı. Her
üç genotip arasındaki farklılık istatiksel olarak anlamlıydı (p: 0,078). Buna göre
Arg/Arg genotipini taşıyan bireylerdeki tümör boyutları diğer genotipleri taşıyan
bireylere göre daha büyüktü. (Tablo 19.) (Şekil 16.)
170,00
160,00
150,00
140,00
Tümör Boyutları mm
130,00
120,00
110,00
100,00
90,00
80,00
70,00
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
pro/pro
arg/pro
arg/arg
P53 Genotipleri
Şekil 16. p53 Genotipleri ve HSK’lı Hastalardaki Tümör Boyutu Arasındaki İlişki
74
MDM2 genotipleriyle HSK’lı hastalarda serum alfafetoprotein düzeyi arasındaki
ilişkide incelendi. Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı.
Ancak TT genotipini taşıyan bireyler GG genotipini taşıyan bireylere göre daha yüksek
serum AFP düzeylerine sahipti. (Ortalama 16.054±12074 ve 2741±1514 sırasıyla)
(Tablo 19.) (Şekil 17.)
10000,00
9000,00
Alfa feto protein ng/dl
8000,00
7000,00
6000,00
5000,00
4000,00
3000,00
2000,00
1000,00
0,00
GG
TG
TT
MDM2 Genotipleri
Şekil 17. MDM2 Genotipleriyle Serum Alfafetoprotein Düzeyi Arasındaki İlişki
75
P53 genotipleriyle HSK’lı hastalardaki serum AFP düzeyleri arasındaki ilişkide
incelendi. Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık mevcut değildi.
(p: 0,679) Ancak Arg/Arg genotipini taşıyan bireylerin diğer genotipleri taşıyan
bireylere göre rolatif olarak daha yüksek serum AFP düzeylerine sahip olduğu saptandı.
(Tablo 19.) (Şekil 18.)
7500,00
7000,00
6500,00
Alfa feto protein ng/dl
6000,00
5500,00
5000,00
4500,00
4000,00
3500,00
3000,00
2500,00
2000,00
1500,00
1000,00
500,00
0,00
pro/pro
arg/pro
arg/arg
P53 Genotipleri
Şekil 18. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalarda Serum Alfafetoprotein Düzeyi Arasındaki İlişki
76
Tablo 20. MDM2 ve P53 Genotipleri ve Sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh Klasifikasyonu
arasındaki İlişki
Değişken
Child-Pugh Evresi
MDM2 SNP309 T>G
P
A (%)
B (%)
C (%)
TT
6(% 46,2)
8 (% 28,6)
8(% 17)
TG
3(% 23,1)
14(% 50)
28(% 59,6)
GG
4(% 30,8)
6(% 21,4)
11(% 23,4)
p53 Kodon72 Arg/Pro
0,155
0,32
Arg/Arg
4(% 36,4)
15(% 50)
19(% 38)
Arg/Pro
7(% 63,6)
10(% 33,3)
21(% 42)
Pro/Pro
0(% 0)
5(% 16,7)
10(% 20)
MDM2 Genotipleriyle Child Pugh Klasifikasyonu arasındaki ilişkiye bakıldığında GG
ve TG genotiplerinin Child Pugh A, B, C sınıfında olan hastalarda sırasıyla 4-3 (% 196,7), 6-14 (% 28,6-31,1), 11-28 (% 52,4-62,2) olarak saptandı. Her 3 genotip arasındaki
farklılık istatiksel olarak anlamlı kabul edilmesede (p: 0,155), Child Pugh B ve C
sınıfında olan hastaların daha fazla GG ve TG genotipine sahip oldukları görüldü.
(Tablo 20.) (Şekil 19.)
77
MDM2
GG
TG
TT
Yüzde
60,0%
40,0%
62
,2
52 %
,4
%
20,0%
27
,3
%
19
,0
%
36
,4
31
28
,1 %
,6
% %
36
,4
%
6,
7%
0,0%
A
B
C
Child Pugh Skoru
Şekil 19. MDM2 Genotipleri ve Sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh Klasifikasyonu
arasındaki İlişki
78
P53 genotipleriyle sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh evresi arasındaki ilişki
incelendi. Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı bir faklılık yoktu (p: 0,32).
Ancak Pro/Pro genotipini taşıyan bireylerin daha çok Child Pugh B-C evresindeki
bireyler olduğu saptandı. (Tablo 20.) (Şekil 20.)
P53
pro/pro
arg/pro
arg/arg
80,0%
Yüzde
60,0%
40,0%
76
,9
%
42
,5
%
20,0%
0,0%
55
,3 47
% ,5
%
18
,4
% 10
,0
%
26
23 ,3
,1 %
%
…
A
B
C
Child Pugh Evresi
Şekil 20. p53 Genotipleri ve Sirozu olan HSK’lı hastalardaki Child Pugh Klasifikasyonu arasındaki
İlişki
79
Tablo 21. MDM2 ve p53 Genotipleriyle HSK Evresi Arasındaki İlişki
Değişken
MDM2 SNP309 T>G
HSK Evresi
Erken
Orta
P
İleri
Son
TT
5(%22,7)
6(%25)
7(%33,3)
9(% 18,8)
TG
11(%50)
12(%50)
7(%33,3)
28(%58,3)
GG
6(%27,3)
6(%25)
7(%33,3)
11(%22,9)
p53 Kodon72 Arg/Pro
0,70
0,83
Arg/Arg
8(%38,1) 12(%50)
7(%35)
19(%38)
Arg/Pro
9(%42,9) 9(%37,5)
11(%55)
21(%42)
Pro/Pro
4(%19)
2(%10)
10(%20)
3(%12,5)
MDM2 genotipi ve HSK evresi arasındaki ilişkiye bakıldığında GG ve TG genotipi
daha çok son evre HSK’lı hastalarda saptanırken, genotipler arasındaki bu fark istatiksel
olarak anlamlı değildi. (p: 0,704) (Tablo 21.) (Şekil 21.)
80
MDM2
GG
TG
TT
50,0%
yüzde
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
2
0
,
0
%
1
9
,
0
%
1
8
,
5
%
2
0
,
0
%
2
0
,
7
%
2
2
,
2
%
2
3
,
3 1
% 2
,
1
%
2
5
,
9
%
4
8
,
3 3
6 % 3
3
,
7
,
3
%
%
0,0%
erken
orta
ileri
HSK Evresi
Şekil 21. MDM2 genotipi ve HSK Evresi Arasındaki İlişki
81
son
P53 genotipleriyle HSK evresi arasındaki ilişki incelendi. Her üç genotip arasında
istatiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı. (p: 0,71) (Tablo 21.) (Şekil 22.)
P53
pro/pro
arg/pro
arg/arg
60,0%
50,0%
Yüzde
40,0%
30,0%
5
2
,
6 4 4
% 2 1
, ,
0 3
% %
20,0%
10,0%
2
6
, 1
3 8 1
% , 5
0 ,
% 2
%
2 2
2
1 , 1
5 0 ,
, % 7
%
8
%
erken
orta
0,0%
5
…
1
8
,
0
%
2
1
,
7
%
ileri
HSK Evresi
Şekil 22. p53 Genotipi ve HSK Evresi Arasındaki İlişki
82
son
Tablo 22. MDM2 ve p53 Genotipleriyle Tümör Nodülaritesi Arasındaki İlişki
Değişken
MDM2 SNP309 T>G
Nodül Formasyonu
Tek Nodül
Multi Nodül
TT
9(% 24,3)
18(% 24)
TG
21(% 56,8)
34(% 45,3)
GG
7(% 18,9)
23(% 30,7)
P53 Kodon72 Arg/Pro
P
0,380
0,941
Arg/Arg
14(% 40)
30(% 39)
Arg/Pro
16(% 45,7)
34(% 44,2)
Pro/Pro
5(% 14,3)
13(% 16,9)
MDM2 genotipleriyle HSK’lı hastalardaki tümör nodülaritesi arasındaki ilişki incelendi.
Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmadı. Ancak HSK’lı
hastaların çoğunluğunun multinodüler kitleye sahip olduğu görüldü. (Tablo 22.) (Şekil
23.)
83
MDM2
GG
TG
TT
80,0%
Yüzde
60,0%
40,0%
76,
7%
61,
8%
20,0%
38,
2%
66,
7%
33,
3%
23,
3%
0,0%
Tek nodül
Multi nodül
Tümörün Nodülaritesi
Şekil 23. MDM2 Genotipleri ve Tümör Nodülaritesi Arasındaki İlişki
84
P53 Genotipleriyle HSK’lı hastalardaki tümör nodülaritesi arasındaki ilişkide incelendi.
Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı bir farklılık mevcut değildi. (p: 0,947)
(Tablo 22.) (Şekil 24.)
P53
pro/pro
arg/pro
arg/arg
80,0%
Yüzde
60,0%
40,0%
66,
7%
68,
0%
70,
5%
20,0%
33,
3%
32,
0%
29,
5%
0,0%
Tek nodül
Multi nodül
Tümör Nodülaritesi
Şekil 24. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalardaki Tümör Nodülaritesi Arasındaki İlişki
85
Tablo 23. MDM2 ve p53 Genotipleri ve Tümörün Vasküler İnvazyonu Arasındaki İlişki
Değişken
MDM2 SNP309 T>G
Vasküler İnvazyon Durumu
Olan (%)
Olmayan (%)
TT
13(% 30,2)
12(% 18,5)
TG
21(% 48,8)
35(% 53,8)
GG
9(% 20,9)
18(% 27,7)
P53 Kodon72 Arg/Pro
P
0,342
0,735
Arg/Arg
14(% 33,3)
26(% 40,6)
Arg/Pro
20(% 47,6)
28(% 43,8)
Pro/Pro
8(% 19)
10(% 15,6)
MDM2 genotipleriyle HSK’lı hastalarda tümörün vasküler invazyonu arasındaki
ilişkide incelendi. Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı.
Ancak GG ve TG genotiplerine sahip bireylerin rölatif olarak TT genotipi taşıyan
bireylere göre daha az vasküler invazyon gösterdiği gözlendi. (Tablo 23.) (Şekil 25.)
86
MDM2
GG
TG
TT
80,0%
Yüzde
60,0%
40,0%
73,
1%
66,
7%
57,
1%
42,
9%
20,0%
26,
9%
33,
3%
0,0%
yok
var
Tümörün Vasküler İnvazyonu
Şekil 25. MDM2 Genotipleri ve Tümörün Vasküler İnvazyonu Arasındaki İlişki
87
P53 Genotipleriyle HSK’lı hastalardaki tümörün vasküler invazyonu arasındaki ilişkide
incelendi. Her üç genotip arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık yoktu. (p: 0,210)
Ancak Arg/Arg genotipini taşıyan bireyler diğer genotipleri taşıya bireylere göre rölatif
olarak daha fazla vasküler invazyon gösteriyordu. (Tablo 23.) (Şekil 26.)
P53
pro/pro
arg/pro
arg/arg
Yüzde
60,0%
40,0%
63,
2%
58,
5%
56,
2%
41,
5%
20,0%
36,
8%
43,
8%
0,0%
yok
var
Tümrün Vasküler İnvazyonu
Şekil 26. p53 Genotipleriyle HSK’lı Hastalarda Tümörün Vasküler İnvazyonu Arasındaki İlişki
88
5. TARTIŞMA
p53 geni hücre döngüsünün düzenlenmesinde ve genomik bütünlüğün
korunmasında kritik öneme sahip bir tümör süpressör gendir. p53 proteini (TP53) bir
transkripsiyon faktör olarak DNA’ya bağlanma, hücre döngüsünün düzenlenmesi, DNA
tamiri, farklılaşma, genomik plastisite ve apopitozis gibi bir çok farklı fonksiyona
sahiptir. Bu yüzden p53 geni kanser biyolojisi alanında en fazla çalışılan tümör süpresör
genlerden biridir. p53 geni ve bu genin sentezlemiş olduğu protein olan TP53’in hücre
döngüsünü, hücre büyümesini ve apopitozisi kontrol eder. Germline mutasyonlara bağlı
p53
yolağındaki
gösterilmiştir.
etkilenmelerin
artmış
karsinogenezisle
ilişkili
olduğu
190,191
Arginin/Prolin polimorfizmi p53 geninin 4. ekzonu içerisinde ve kodon 72
pozisyonunda bulunmaktadır. p53 Arjinin/Prolin varyantları transkripsiyon aktivitesi,
apopitozun indüklenmesi ve hücre transformasyonunun baskılanmasında farklı
fonksiyonel kapasiteye sahiptirler. TP53 Arjinin ve Prolin varyantları DNA’ya
bağlanma ve transkripsiyon aktiviteleri, apopitozis indüksiyonları ve hücre döngüsünün
durdurulmasında farklılık göstermektedirler. p53 Arjinin varyantı prolin varyantına
nazaran apopitozisi daha hızlı ve daha verimli bir şekilde indükler. Apopitozisin p53
Arjinin varyantı tarafından daha hızlı ve etkili bir şekilde indüklenmesinin nedeni
arjinin varyantının mitokondride daha fazla lokalize olması olabilir. Mitokondriye bu
lokalizasyon proapopitotik sitokrom c’nin sitozole salınması ile birliktedir. p53’ün
apopitozu stimüle edici proteinler (ASPP) ailesi p53 kodon 72 arjinin/prolin
polimorfizminin apopitoz fonksiyonunu düzenler. p53 kodon 72 prolin varyantının
apopitoz fonksiyonu seçici bir şekilde p53’ün apopitozu stimüle edici proteini
inhibitörleri (iASPP) tarafından inhibe edilir. p53 kodon 72 arjinin varyantının çok fazla
apopitoz indükleme kapasitesine sahip olması arjinin varyantının iASPP inhisyonunda
kaçabilme kapasitesinden ve daha fazla mitokondride lokalize olma kapasitesinden
kaynaklanmaktadır. Sonuç olarak p53 kodon 72 de Pro/Pro genotipine sahip olan
bireylerde apopitozis Arg/Arg genotipinde olan bireylere göre daha az gerçekleşecek ve
hasarlanmış hücre yıkımdan kaçarak araya giren diğer faktörlerinde etkisiyle anormal
çoğalan klonal hücre halini alarak malignensiye doğru yol alacaktır.
89
MDM2 SNP309 G polimorfizmi p53’ün regülasyonunda ana rol oynayan
MDM2’nin fonksiyonalitesinde değişikliklere yol açarak çeşitli yollarla kansere
predispozisyona yol açan bir gendir. MDM2’nin bir çok tümör süpresör yolakla
etkileştiği gösterilmiştir. Bunlar arasında Rb, p53 ailesi, p73, büyüme baskılayıcı
p14/p19 yer alır.177,192,193 Özellikle p53 yolağı genomik stabilitenin sağlanmasında ve
hücrelerin onkojenik transformasyonunun engellenmesinde ana rol oynar. İlk olarak gen
mutasyonlarına bağlı p53 fonksiyon kaybı insanlarda görülen malignensilerde sık
görülen bir durumdur.194 P53 mutasyonunun olmadığı tümörlerde bile, p53
fonksiyonlarının virus proteinleri veya artmış MDM2 proteini aşırı ekspresyonu gibi
durumlara bağlı etkilendiği görülmüştür.178,195 İkinci olarak MDM2
p53 yolağında
negatif olarak rol alan anahtar bir proteindir, p53’ün degredasyonunu hedefler ve
MDM2’nin aşırı ekspresyonu veya amplifikasyonu çeşitli tipteki insan kanserlerinde
sıklıkla gözlenir.195 MDM2’nin aşırı ekspresyonunun yol açtığı karsinogenezise
yatkınlık genetik olarak modifiye hayvanlarda daha önce test edilmiştir. MDM2
transjenik farelerde nontransjenik farelere göre çeşitli dokularda ortalama 4 kat daha
fazla MDM2 düzeylerine rastlanmış ve bu farelerde diğerlerine göre yaşam boyu
malignensi gelişme riski rölatif olarak daha yüksek olarak saptanmıştır.196 Üçüncü
olarak, araştırılan MDM2 polimorfizmi fonksiyonel olarak aktif olmalıdır. G alleli
Sp1’in
MDM2
promotoruna
bağlanmasını
artırır
ve
bu
durumda
MDM2
ekspresyonunda artışa ve p53 fonksiyonunda azalmaya bağlı DNA hasarı gelişmesine
yol açar.178 MDM2’nin kanser formasyonunda bahsedilen rollerinden dolayı G alleli
taşıyan bireylerde ve yüksek düzeyde MDM2 eksprese eden bireylerde yaşam boyu
kanser gelişme riski yüksektir.
Moleküler epidemiyolojik vaka kontrollü bu çalışmada, Türk populasyonunda
MDM2 SNP309 ve p53 kodon72 Arg/Pro polimorfizminin HSK gelişim riski ve
karakteristikleri üzerinde etkili olup olmadığını araştırdık. p53 kodon72 Pro/Pro ve
MDM2 SNP309 GG polimorfizmini çalışma populasyonumuzda artmış HSK riskiyle
ilişkili olarak saptadık.
Bizim çalışmamızda p53 kodon72 de Pro/Pro genotipine sahip olmak Arg/Arg
ve Arg/Pro genotipini taşıyan bireylere göre artmış HSK riskiyle ilişkili olarak
saptanmıştır. Bu bulgu HSK’lı hastalarda p53 kodon72 Arg/Pro polimorfizmiyle ilgili
90
yapılan ve çelişkili sonuçlara sahip çalışma sonuçlarını pozitif yönde desteklemesi
açısından önemlidir.
Yoon ve arkadaşlarının yaptıkları bir çalışmada kronik hepatit B’si olan
hastalarda MDM2 SNP309 GG ve p53 kodon 72 Pro/Pro polimorfizmlerinin HSK
gelişimini ve erken yaşta kanser gelişme riskini artırdığını saptamışlardır. Bu çalışmada
aynı zamanda her iki gen polimorfizminin HSK riskini artırma yönünde kombine etkisi
incelenmiş ve TG Arg/Pro, TG Pro/Pro, GG Arg/Arg ve GG Pro/Pro genotiplerinin
HSK riskinin istatiksel olarak anlamlı şekilde atırdığı saptanmıştır. Bizim yapmış
olduğumuz çalışmada kansere
yakalanma
yaşıyla
bulgularımız bu çalışma tarafından desteklenmektedir.
ilişki saptanmazken diğer
181
Anzola ve arkadaşları HCV(+) HSK’lı hastalarda yaptıkları çalışmada p53
kodon 72 Arg/Pro polimorfizminin Bask populasyonunda hepatosellüler karsinogenezle
tek başına ilişkili olmadığını saptamışlar ve bu durumu bu polimorizmin değişik
coğrafik bölgelerde değişik sıklıklarda bulunmasıyla açıklamışlardır. Yine aynı
çalışmada p53 kodon 72 Arg/Pro polimorfizminin tümörün histolojik evresi ve
boyutuyla ilişkiside incelenmiş ve herhangi bir ilişki saptanmamıştır. Bu çalışma HSK
riskini artırma yönünden bizim çalışmamızı desteklememekle birlikte bizim
çalışmamızdada p53 kodon 72 Pro/Pro polimorfizmide tümörün boyutu ve evresiyle
ilişkili olarak saptanmamış olsada bu durumun olası nedeni tartışmanın ileriki
kısımlarında açıklanacaktır.199
Ezzikouri ve arkadaşları Fas populasyonundan 96 HSK’lı ve 222 kontrol vakada
gerçekleştirdikleri çalışmada p53 kodon 72 Pro/Pro polimorfizmini özellikle bayanlarda
ve HCV negatif olan vakalarda artmış hepatokarsinogenez riskiyle ilişkili olarak
saptamışlardır.200
Leveri ve arkadaşlarının İtalya populasyonundan 84’ü HSK’lı 340 kronik
HCV’li hastada gerçekleştirdikleri çalışmada p53 kodon 72 Arg/Pro polimorizmini ne
kronik
HCV’nin
progresyonuyla
nede HSK gelişim riskiyle
ilişkili olarak
saptamışlardır.201
Zhu ve arkadaşlarının Çin Populasyonundan 507 HSK’lı ve 540 kontrol vakada
gerçekleştirdikleri çalışmada p53 kodon 72 de Pro alleli taşımanın artmış HSK riskiyle
ilişkili olduğunu saptamışlar ve çalışmalarının daha önceki birkaç çalışmayla çelişkili
sonuçlar yansıtmasını etnik ve coğrafik farklılıklara bağlamışlardır. Yine Zhu ve
91
arkadaşları benzer populasyonun HBsAG(-) olan vakalardan oluşan kısmından
gerçekleştirdikleri ayrı bir çalışmada benzer vaka grubundada p53 kodon 72 Arg/Pro
polimorfizminin artmış HSK riskiyle ilişkili olduğunu göstermişler ve bu konuda daha
önce bildirilen çelişkili sonuçlara pozitif yönde destek vermişlerdir.202
Bunların dışında p53 kodon72 polimorfizmi insanda birçok kansere yatkınlıkla
ilişkili olarak saptanmıştır. Birçok grup p53 Arg72 varyantını mide ca, meme ca, over
ca, özefagus ca, akciğer ca, mesane ve prostat ca’yı içeren epitelyal kanserler için artmış
riskle ilişkili olarak saptarken.181,175,176,182,183,184,185 Bununla birlikte yapılan diğer
çalışmalarda tam tersi bir sonuç elde edilerek p53 Pro72 varyantı tiroid ca, nazofarenks
ca, prostat ca, ürogenital kanserlerle ilişkili olarak saptamışlardır.186,187,188,189 Bazı
çalışmalar
ise
p53
kodon72
varyantlarıyla
kanser
riski
arasında
ilişki
saptamamışlardır.173,174,200
Bizim gerçekleştirdiğimiz çalışmada MDM2’nin intronik promoter’u üzerinde
olan SNP309’da GG polimorfizmi TG ve TT genotipini taşıyan bireylere göre artmış
HSK riskiyle ilişkili olarak saptanmıştır. Ayrıca aynı bölgede G allelini taşımak T
allelini taşıyan bireylere görede artmış riskle ilişkili olarak saptanmıştır.
Yoon ve arkadaşlarının Çin populasyonunda HBsAg (+) 287 HSK’lı ve 294
HSK’sı
olmayan
vakada
gerçekleştirdikleri
çalışmada
MDM2
SNP309
GG
polimorfizmini ve ayrıca G alleli taşımayı diğer genotiplere ve T alleli taşıyan bireylere
göre artmış HSK riski ve erken yaşta HSK’ya yakalanmayla ilişkili olarak
saptamışlardır. Bu bulgular kansere yaklanma yaşı dışında bizim saptadığımız bulguları
desteklemektedir.181
Dharel ve arkadaşlarının Japon populasyonundan 187 HSK’lı toplam 435
HCV(+) vakada gerçekleştirdikleri çalışmada SNP 309 GG polimorfizmini ve G allelini
taşıyan bireylerin diğer genotipleri ve T alleli taşıyan bireylere göre artmış HSK riskiyle
ilişkili
olarak
desteklemektedir.
saptamışlardır.
Bu
bulgularda
bizim
saptadığımız
bulguları
180
Bunların dışında insanlarda görülen diğer kaserlerle ilgili yapılan çalışmalarda
MDM2 SNP309 GG polimorfizmi bazı gruplar tarafından meme ca, kolorektal ca, over
ca, peritoneal ca, özefagus epidermoid ca, gastrik ca, endometriyal ca ’da artmış riskle
ilişkili bulunurken bazı gruplar tarafındanda akciğer ca, over ca, oligodendoglial
92
tümörler,
meme
ca’da
benzer
ilişkinin
olmadığı
yönünde
yayınlar
yapılmıştır.203,204,187,205,206,207,186,179,183,208
Her iki polimorfizmi içinde bu şekilde çelişkili sonuçların saptanmasının altında
farklı kanserlerin değişik moleküler patogenez basamaklarının ve hasta gruplarının
farklı
genetik
özelliklerinin
olması,
farklı
coğrafik
ve
etnisiteden
hasta
populasyonlarının çalışmalara alınması yer alıyor olabilir.
Ancak bizim çalışma populasyonumuzda her iki polimorfizim içinde artmış
HSK riskiyle ilişkili olduğunun saptanması ve bu bulguların daha önce yapılmış olan
birçok çalışmayla desteklenmiş olması p53 kodon 72 Arg>Pro ve MDM2 SNP309 T>G
polimorfizminin riskli vakalarda kansere genetik yatkınlığı göstermede moleküler bir
belirteç olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Bizim çalışmamızda ayrıca her iki polimorfizmin hastalara ve tümöre ait
karakteristiklerle ilişkileride incelenmiştir.
Gen polimorfizimleri ve Child Pugh Klasifikasyonu arasındaki İlişki;
Çalışmamızda sirozu olan bireylerde, MDM2 SNP309 GG ve TG genotiplerini taşıyan
bireylerin TT genotipi taşıyan bireylere göre daha belirgin olmak üzere, p53 kodon72
Pro/Pro ve Arg/Pro genotiplerini taşıyan bireylerin ise Arg/Arg genotipi taşıyan
bireylere göre daha fazla Child Pugh B ve C sınıfında oldukları saptandı. Çalışmamıza
alınan sirozlu hastaların çoğunluğunun özellikle Child Pugh C evresi olmak üzere B ve
C evrelerinde bulunması ve bizim saptadığımız ve daha önceki çalışmalardada
desteklenen bir bulgu olan GG ve Pro/Pro genotiplerini taşıyan bireylerde daha yüksek
oranda HSK görülmesi, bu genotipleri taşıyan bireylerin diğer genotipleri taşıyan
bireylere göre neden daha yüksek oranda Child B ve C evrelerinde bulunduğunu
açıklamaktadır.
Gen
polimorfizimleri
ve
HSK’ya
yakalanma
yaşı
arasındaki
İlişki;
Çalışmamızda hem MDM2 genotipleriyle hemde p53 kodon72 genotipleriyle HSK’ya
yaklanma yaşı arasında istatiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. Ancak p53
kodon 72 Arg/Arg genotipini taşıyan bireylerin diğer genotipleri taşıyan bireylere göre
rölatif olarak daha ileri yaşlarda HSK’ya yakalandıkları saptanmıştır. Yoon ve
arkadaşları 296’sı HSK’lı olmak üzere 583 HBsAg(+) vakada gerçekleştirdikleri bir
çalışmada; MDM2 SNP309 ve p53 kodon72 polimorfizimlerini HSK’ya yakalanma yaşı
olarak T/T ve Arg/Arg genotiplerinde diğer genotipleri taşıyan bireylere göre daha ileri
93
yaşlarda olduklarını saptamışlardır.181 Galic ve arkadaşlarının over ve peritoneal
karsinoması olan vakalarda yaptıkları çalışmada p53 kodon72 polimorfizmiyle kansere
yakalanma yaşı arasında ilişki saptamazken MDM2 SNP309 GG genotipi taşıyan
bireylerin daha genç yaşta kansere yakalandığını bildirmişlerdir.205 İdbaih ve
arkadaşlarının oligodenrioglial tümörü olan vakalarda yaptıkları bir çalışmada her iki
gen
polimorfizmiyle
saptanmamıştır.207
hastalığa
Khan
ve
yakalanma
yaşı arasında
arkadaşlarının
kolorektal
herhangi
ca’sı
bir
olan
ilişki
vakalarda
gerçekleştirdikleri çalışmada her iki gen polimorfizmiyle hastalığa yakalanma yaşı
arasında herhangi bir ilişki saptanmamıştır.209 Bunların dışında Walsh ve arkadaşları
endometriyal ca’sı olan vakalarda MDM2 SNP309 gen polimorfizmiyle hastalığa
yakalanma yaşı arasındaki ilişkiye bakmışlar ve herhangi bir istatiksel olarak anlamlı bir
ilişki saptamamışlardır.208 Sonuç olarak literatürdeki bulgularla bizim bulgularımız
beraber ele aldığımızda özellikle HSK’da daha belirgin olmak üzere tüm tümörlerin
gelişiminde alttaki maruz kalınan etyolojik faktörlerin birden fazla oluşu, maruz kalma
süresinin farklılığı ve kanser gelişiminde rol alan moleküler mekanizmaların çokluğu
tümöre yakalanma yaşıyla bir veya birkaç moleküler mekanizmanın tek başına
ilişkilendirilmesinin doğru olmayacağını düşündürmektedir.
Gen polimorfizimleri ve HSK’lı Hastalardaki Tümör Boyutu Arasındaki İlişki;
Çalışmamızda MDM2 SNP309 TT genotipini taşıyan bireyler diğer genotipleri taşıyan
bireylere göre istatiksel olarak anlamlı derecede büyük tümöre sahip olarak saptanırken
(p:0.048), p53 kodon72 Arg/Arg genotipini taşıyan bireylerde ise diğer genotipleri
taşıyan bireylere göre istatiksel olarak anlamlı olmasada (p:0.078), istatiksel olarak
güçlü daha büyük tümör boyutuna sahip oldukları saptanmıştır. Anzola ve arkadaşları
HSK’lı hastalarda yaptıkları bir çalışmada p53 kodon 72 polimorfizmiyle tümör boyutu
arasında herhangi bir istatiksel olarak anlamlı bir ilişki saptamamışlardır. Ancak bu
çalışmada tümör boyutu mm cinsinden değil 3 cm’nin altında ve üstünde olacak şekilde
sınıflandırılmıştır.199 Bunun dışında her iki gen polimorfizmi çeşitli kanserlerde
tümörün TNM sınıflaması ile incelenmiş ve Pro/Pro ve G/G genotipiyle
istatiksel
olarak anlamlı şekilde ilişkili olduğunu saptanmıştır. Literatürdeki bulguların çelişkili
ve
yetersiz
olması
bu
konuda
daha
geniş
çaplı
çalışmaların
yapılmasını
gerektirmektedir. Bizim bulgularımız ise şu şekilde açıklanabilir; Daha önce
tartıştığımız bir bulgu olan GG ve TG, ProPro ve Arg/Pro genotipleri daha çok Child
94
Pugh B ve C evrelerindeki hastalarda saptanırken, TT ve Arg/Arg genotipleri ise daha
çok Child Pugh A ve B evrelerindeki hastalarda saptanmaktadır. Sirozlu hasta
populasyonunda karaciğerin kalan sentez fonksiyonlarının azlığı ve araya giren
komplikasyonlar nedeniyle Child Pugh C evresindeki hastalar diğer evrelerdeki
hastalara göre daha fazla poliklinik kontrolü altındadırlar ve daha fazla hospitalize
edilmektedirler. Bu kontroller ve hospitalizasyonlar esnasındada bu hastalarda yeni
gelişmeye başlayan bir tümör odağının mevcut görüntüleme ve biyokimyasal
belirteçlerle diğer hasta populasyonlarıdaki tümörlere göre daha erken ve boyutları
küçükken yakalanması kaçınılmazdır. Sonuç olarak TT ve Arg/Arg genotiplerini taşıyan
bireylerdeki tümörler diğer genotipleri taşıyan bireylerdeki tümörlere göre bu nedenden
dolayı daha büyük olabilecektir.
Gen polimorfizmleri ve HSK’lı hastalarda tümörün vasküler invazyonu
arasındaki ilişki; Çalışmamızda TT ve Arg/Arg genotipini taşıyan bireylerin diğer
genotipleri taşıyan bireylere göre rölatif olarak daha fazla vasküler invazyon
gösterdikleri saptandı. Daha önceki bulgularda tartıştığımız gibi TT ve Arg/Arg
genotipini taşıyan bireylerdeki tümörlerin diğer genotipleri taşıyan hastalara göre daha
büyük olması ve bu genotipleri taşıyan bireylerin diğer genotipleri taşıyan bireylere
göre daha çok Child Pugh A ve B evrelerinde bulunmaları ve bu nedenden dolayı diğer
genotipleri taşıyan hastalara göre daha az hastaneye başvurmaları nedeniyle TT ve
Arg/Arg genotipi taşıyan bireylerdeki tümörlerin diğer genotipleri taşıyan bireylerdeki
tümörlere göre rölatif olarak daha fazla vasküler invazyon göstermesiyle ilişkili olabilir.
Ancak bu konuyla ilgili daha geniş çaplı çalışmaların yapılması gerekmektedir.
Literatürde bizim bildiğimiz kadarıyla bu konuda HSK veya başka tümörlerde yapılmış
bir çalışma olmaması bu konudaki bulgularımızın değerini artırmaktadır.
Gen polimorfizimleri ve serum alfa fetoprotein düzeyi arasındaki ilişki;
Çalışmamızda TT ve Arg/Arg genotiplerini taşıyan bireylerin diğer genotipleri taşıyan
bireylere göre rölatif olarak daha yüksek serum alfafetoprotein düzeylerine sahip
oldukları saptandı. Bu durum bu genotipleri taşıyan bireylerdeki tümörlerin diğer
genotipleri taşıyan bireylerdeki tümörlere göre rölatif olarak daha büyük olması ve daha
fazla vasküler invazyon göstermesiyle ilişkili olabilir.
Gen polimorfizimleri ve HSK evresi arasındaki ilişki; Çalışmamızda her iki gen
polimorfizminde genotiplerle HSK evresi arasında istatiksel olarak anlamlı bir farklılık
95
saptanmadı. Ancak HSK evresi olarak son dönemdeki hastaların diğer evrelere göre
daha fazla olduğu saptandı. Anzola ve arkadaşları HCV(+) HSK’lı hastalarda yaptıkları
bir çalışmada p53 kodon72 polimorfizimiyle tümörün agresifliği arasında herhangi bir
ilişki olmadığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada tümörün evresiyle ilgili ayrıntılı bir
değerlendirme yapılmamıştır.199 Hong ve arkadaşlarının özefagus skuamöz hücreli
karsinoması olan hastalarda yaptıkları çalışmada MDM2 SNP309 GG genotipiyle ileri
evre karsinom arasında istatiksel olarak anlamlı bir ilişki olduğu bildirilmiştir.206 Gen
polimorfizimleriyle tümör evresi arasındaki ilişkiyle ilgili çelişkili ve yetersiz bilgilerin
olması bu konuda daha ayrıntılı araştırmaların yapılması gerektiğini göstermektedir.
Ancak HSK’nın sıklıkla siroz zemininde gelişmesi ve tümörün evresi belirlenirken
child pugh skoru gibi içerisinde biyokimyasal parametreleri ve alttaki hastalığın
ağırlığını belirleyen faktörlerin yer aldığı skorlama sistemlerinin kullanıldığı tümörlerde
moleküler belirteçlerle tümörün evresi arasında ilişkiyi belirlemek mevcut bilgilerimizle
zor gibi görünmektedir. HSK evresi olarak son dönemdeki hastaların diğer evrelerdeki
hastalara göre daha fazla sayıda bulunmasının nedeni ise; HSK evresi belirlenirken ana
rol oynayan faktörler arasında child pugh skoru, tümörün boyutu, nodülaritesi, vasküler
invazyon gösterip göstermediğinin yer alması ve bizim çalışma grubumuzda TT ve
Arg/Arg genotipi taşıyan bireylerin daha büyük ve daha fazla vasküler invazyona neden
olan tümöre sahip olmaları, GG ve Pro/Pro genotipini taşıyan bireylerin ise daha çok
child pugh skoru C olan hastalar olması nedeniyle olabilir.
Gen polimorfizimleri ve HSK’lı hastalardaki yaşam süresi arasındaki ilişki;
Çalışmamızda MDM2 SNP309 TT ve p53 kodon72 Arg/Arg genotipini taşıyan
bireylerin diğer genotipleri taşıyan bireylere göre daha kısa yaşadıkları saptandı
(p:0,003 ve 0,006 sırasıyla). Galic ve arkadaşlarının over ve peritoneal karsinoması olan
hastalarda yaptıkları bir çalışmada MDM2 gen polimorfizmiyle yaşam süresi arasında
ilişki saptamazken, p53 kodon72 Pro/Pro genotipi azalmış yaşam süresiyle ilişkili
olarak saptamışlardır.205 İdbaih ve arkadaşları oligodendrioglial tümörlü hastalarda
yaptıkları bir çalışmada p53 kodon72 polimorfizmiyle yaşam süresi arasında herhangi
bir ilişki saptamazken, MDM2 SNP309 GG genotipini azalmış yaşam süresiyle ilişkili
olarak saptamışlardır.207 Ohmiya ve arkadaşlarının gastrik adeno ca’sı olan hastalarda
yaptıkları bir çalışmada MDM2 SNP309 GG polimorfizmini azalmış yaşam süresiyle
ilişkili olarak saptamışlardır.179 Bildiğimiz kadarıyla literatürdeki MDM2 ve p53 gen
96
polimorfizmiyle HSK’lı hastalarda yaşam süresi arasındaki ilişkiyi inceleyen ilk çalışma
bizim çalışmamızdır ve bizim bulgularımızın literatürle çelişkili olmasının nedeni ise şu
şekilde açıklanabilir; Öncelikle daha önce tartıştığımız gibi her iki gen polimorfizminde
TT ve Arg/Arg genotiplerini taşıyan bireylerdeki tümörler diğer genotipleri taşıyan
bireylerdeki tümörlere göre daha büyük, daha fazla vasküler invazyon göstermektedir.
TT ve Arg/Arg genotipini taşıyan bireyler daha erken evre sirozlu hastalarda olmasına
rağmen bu bulgular nedeniyle diğer genotipleri taşıyan bireylere göre HSK evresi
dağılımı yönünden eşit dağılım sergilemektedir. HSK’nın sıklıkla siroz zemininde
gelişmesi ve bizim hasta populasyonumuzunda çoğunlukla sirozlu hastalar olması,
sirozlu hastalarda yaşam süresini etkileyen ana faktörlerden birisinin karaciğerin kalan
rezerv fonksiyonu olması nedeniyle, karaciğerde yerleşen daha büyük ve daha fazla
vasküler invazyon gösteren bir tümörün yaşam süresini kısaltması kaçınılmazdır.
Bizim çalışmamızın ana kısıtlaması hastane tabanlı vaka kontrollü bir çalışma
olması ve hastaların tek bir merkezden alınmasıdır (Çukurova Üniversitesi Balcalı
Hastanesi). Bundan dolayı genel populasyondaki hepatosellüler karsinomaları
yansıtmayabilir. Bunun için bulgularımızın daha geniş vaka tabanlı çalışmalarla
desteklenmesi gerekmektedir.
İnsan genomunun sekanslamasının 2001 de tamamlanmasından sonra, tıpta yeni
bir genomik çağa girilmiştir.197 Genetik kodlamanın nuanslarını anlamaya başladıkça,
kanser gibi kompleks hastalıklara karşı olan farklı yatkınlıklara neden olan genetik
varyasyonlarımızıda anlamaya başladık. Her ne kadar farklı bireyler arasındaki genetik
kodlar %99 benzer olsada, genetik polimorfizmler bireyler arasındaki fenotipik farklılığı
neden olur.197,198 Karsinogenezisde etkili olan tek nükleotid polimorfizimleri ve
yolakların bizim çalışmamızda incelenmesi bu çalışmanın iyi taraflarındandır.
Özet olarak bu çalışma Türk populasyonunda p53 kodon72 ve MDM2 gen
polimorfizimiyle HSK riski arasındaki ilişkiyi gösteren ilk çalışmadır. p53 kodon72
Pro/Pro genotipi ve MDM2 SNP309’un G alleli altta HSK riski olan kronik hepatitli
vakalarda artmış HSK riskini göstermede ve bu genotipleri taşıyan bireylerin daha sık
takibe alınmasını belirlemede yararlı bir marker gibi görünmektedir. Bu sonuçlar tümör
süpresör yolağı olan p53 de doğal olarak oluşan mutasyonların kanser gelişimine yol
açtığını desteklemektedir.
97
6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER
1) HSK sıklıkla siroz zemininde gelişen ve erken tanı ve küratif tedaviler uygulanmazsa
sıklıkla mortal seyreden primer karaciğer kanseridir
2) p53 kodon72 Pro/Pro genotipi ve MDM2 SNP 309 da G alleline sahip olmak altta
kronik hepatiti veya sirozu olan vakalarda artmış HSK riskiyle ilişkilidir.
3) p53 kodon72 Pro/Pro ve MDM2 SNP 309 GG genotipleri HSK riskini sinerjistik
olarak artırmaktadır.
3) Altta kronik karaciğer hastalığı veya sirozu olan bu genotiplere sahip bireylerin daha
yakın monitörizasyonu HSK’nın erken dönemde yakalanması açısından faydalı olabilir.
4) p53 kodon72 Arg/Arg ve MDM2 SNP309 TT genotipine sahip HSK’lı hastalar diğer
genotipleri taşıyan bireylere göre rölatif olarak daha büyük tümör boyutuna sahiptir ve
bu bireylerdeki tümörler daha fazla vasküler invazyon göstermektedir.
5) p53 kodon72 Arg/Arg ve MDM2 SNP309 TT genotipine sahip HSK’lı hastalardaki
serum alfafetoprotein düzeyleri diğer genotipleri taşıyan bireylere göre rölatif olarak
daha yüksek olarak saptanmıştır.
.6) p53 kodon72 Arg/Arg ve MDM2 SNP309 TT genotiplerini taşıyan HSK’lı
bireylerde yaşam süresi diğer genotipleri taşıyan bireylere göre daha kısa olarak
saptanmıştır.
7) Siroz zemininde gelişen HSK’da hastalar çoğunlukla ileri evre Child Pugh Skoruna
sahiptir.
8) Her iki gen polimorfizimiyle HSK’ya yakalanma yaşı, Child Pugh evresi ve HSK
evresi arasında ilişki saptanmamıştır.
98
KAYNAKLAR
1.
Parkin DM, Bray F, Ferlay J ve Pisani P. Estimating the world cancer burden Globocan 2000.
Int. J. Cancer 2001; 94:153-156.
2.
Marrero JA Hepatocellular carcinoma. Curr. Opin. Gastroenterol 2006; 22:248-253.
3.
Sherman M. Hepatocellular carcinoma, epidemiology, risk factor, and screening. Semin. Liver
Dis. 2005; 25:143-154.
4.
Collier J ve Sherman M. Screening for hepatocellular carcinoma. Hepatology; 1998; 27:273-278.
5.
Chan HL ve Sung JJ. Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus. Semin. Liver Dis. 2006;
26:153-161.
6.
Han KH ve Ahn SH. How to predict HCC development in patients with chronic B viral liver
disease?. Intervirology 2005; 48:23-28.
7.
Tong MJ, Blatt LM, Kao JH, Cheng JT ve Corey WG. Basal core promoter T1762/A1764 and
precore A1896 gene mutations in hepatitis B surface antigen-positive hepatocellular carcinoma: a
comparison with chronic carriers. Liver Int. 2007; 27:1356-1363.
8.
Yu MW, Yeh SH, Chen PJ, Liaw YF, Liu CJ, Shih WL, Kao JH, Chen DS ve Chen CJ.
Hepatitis B virus genotype and DNA level and hepatocellular carcinoma: a prospective study in
men. J. Natl. Cancer Int. 2005; 97:265-272.
9.
Mahmood S, Niiyama G, Kamei A, Izumi A, Nakata K, Ikeda H, Suehiro M, Kawanaka M,
Togawa K ve Yamada G. Influence of viral load and genotype in the progression of Hepatitis Bassociated liver cirrhosis to hepatocellular carcinoma. Liver Int. 2005; 25:220-225.
10.
Nissen NN ve Martin P. Hepatocellular carcinoma: the high-risk patient. J.Clin. Gastroenterol.
2002; 35:79-85.
11.
Park SH, Choi JE, Kim EJ, Jang JS, Han HS, Lee WK, Kang YM ve Park JY. MDM2
309T>G polymorphism and risk of lung cancer in a Korean population. Lung Cancer 2006; 54:1924.
12.
Bougeard G, Baert Desurmont S, Tournier I, VasserurS, MartinC, Brugieres L, Chompret
A, Paillerets BB, Stoppa Lyonnet D, Bonaiti PellieC ve Frebourg T. Impact of the MDM2
SNP309 and p53 Arg72Pro polymorphism on age of tumour onset in Li-Fraumeni syndrome. J.
Med. Genet. 2006; 43:531-533.
13.
Zhang X, Miao X, Guo Y, Tan W, Zhou Y, Sun T ve Wang Y. Genetic polymorphisms in cell
cycle regulatory genes MDM2 and TP53 are associated with susceptibility to lung cancer. Hum.
Mutat. 2006;27:110-117.
14.
Bond GL, Hu W, Bond EE, Robins H, Lutzker SG, Arva NC, Bargonetti J, Bartel F, Taubert
H, Wuerl P, Onel K, Yip L, Hwang SJ, Strong LC, LozanoG ve Levine AJ. A single
nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway
and accelerates tumor formation in humans. Cell 2004; 119:591-602.
15.
Dharel N, Kato N, Muroyama R, Moriyama M, Shao RX, Kawabe T ve Omata M. MDM2
promoter SNP309 is associated with the risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic
hepatitis C. Clin. Cancer Res. 2006; 12:4867-4871.
99
16.
Staib F, Hussain SP, Hofseth LJ, Wang XW ve Haris CC. TP53 and liver carcinogenesis.
Human Mut. 2003; 21:201-216.
17.
Thomas M, Kalita A, Labrecque S, Pim D, Banks L ve Matlashewski G. Two polymorphic
variants of wild-type TP53 differ biochemically and biologically. Mol.Cell Biol.1999; 19:10921100.
18.
Dumont P, Leu JI, Della Pietra AC, George DL ve Murphy M. The codon 72 polymorphic
variants of p53 have markedly different apoptotic potential. Nat. Genet. 2003; 33:357-365.
19.
Yu MW, Yang SY, Chiu YH, Chiang YC, Liaw YF ve Chen CJ. A p53 genetic polymorphism
as a modulator of hepatocellular carcinoma risk in relation to chronic liver disease, familial
tendency, and cigarette smoking in hepatitis B carriers. Hepatology 1999; 29:697-702.
20.
Zhu ZZ, Cong WM, Liu SF, Xian ZH, Wu WQ, Wu MC, Gao B, Hou LF, Zhu GS. A p53
polymorphism modifies the risk of hepatocellular carcinoma among non-carriers but not carriers of
chronic hepatitis B virus infection. Cancer Lett. 2005; 229:77-83.
21.
Kim YJ ve Lee HS. Single nucleotide polymorphisms associated with hepatocellular carcinoma
with chronic hepatitis B virus infection. Intervirology 2005; 48:10-15.
22.
Parkin DM. Global cancer statistics in the year 2000. Lancet Oncol 2001; 2:533–543.
23.
Parkin DM. Cancer Incidence in five continents. IARC scientific publications volume VIII[No.
155]. 2002. Lyon:IARCPress.
24.
Okuda K, Nakanuma Y, Miyazaki M. Cholangiocarcinoma: recent progress. Part 1:
epidemiology and etiology. J Gastroenterol Hepatol 2002; 17:1049–1055.
25.
McGlynn KA, Tsao L, Hsing AW, Devesa SS, Fraumeni JF Jr.International trends and patterns
of primary liver cancer. Int J Cancer 2001; 94:290–296.
26.
Chang MH, Chen CJ, Lai MS. Universal hepatitis B vaccination in Taiwan and the incidence of
hepatocellular carcinoma in children. Taiwan Childhood Hepatoma Study Group. N Engl J Med
1997; 336:1855–1859.
27.
Yu SZ. Primary prevention of hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 1995; 10:674–
682.
28.
Rudolph KL, Chang S, Millard M, Schreiber-Agus N, DePinho RA. Inhibition of experimental
liver cirrhosis in mice by telomerase gene delivery. Science 2000; 287:1253–1258.
29.
Yu MW, Chen CJ. Elevated serum testosterone levels and risk of hepatocellular carcinoma.
Cancer Res 1993; 53:790–794.
30.
Yu MW, Yang YC, Yang SY, et al. Hormonal markers and hepatitis B virus-related
hepatocellular carcinoma risk: a nested case-control study among men. J Natl Cancer Inst 2001;
93:1644–1651.
31.
Yoshizawa H. Hepatocellular carcinoma associated with hepatitis C virus infection in Japan:
projection to other countries in the foreseeable future. Oncology 2002; 62(Suppl 1):8–17.
32.
Armstrong GL, Alter MJ, McQuillan GM, Margolis HS. The past incidence of hepatitis C virus
infection: implications for the future burden of chronic liver disease in the United States.
Hepatology 2000; 31:777–782.
33.
Wong JB, McQuillan GM, McHutchison JG, Poynard T. Estimating future hepatitis C
morbidity, mortality, and costs in the United States. Am J Public Health 2000; 90:1562–1569.
100
34.
McMahon BJ, Alberts SR, Wainwright RB, Bulkow L, Lanier AP. Hepatitis B-related
sequelae. Prospective study in 1400 hepatitis B surface antigen-positive Alaska native carriers.
Arch Intern Med 1990; 150:1051–1054.
35.
Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Genotypes and clinical phenotypes of hepatitis B virus in
patients with chronic hepatitis B virus infection. J Clin Microbiol 2002; 40:1207–1209.
36.
Camma C, Giunta M, Andreone P, Craxi A. Interferon and prevention of hepatocellular
carcinoma in viral cirrhosis: an evidence based approach. J Hepatol 2001; 34:593–602.
37.
Torbenson M, Thomas DL. Occult hepatitis B. Lancet Infect Dis 2002; 2:479–486.
38.
Yuki N, Nagaoka T, Yamashiro M. Long-term histologic and virologic outcomes of acute selflimited hepatitis B. Hepatology 2003; 37:1172–1179.
39.
Beasley RP. Hepatitis B virus. The major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer 1988;
61:1942–1956.
40.
Kane MA. Global control of primary hepatocellular carcinoma with hepatitis B vaccine: the
contributions of research in Taiwan. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003; 12:2–3.
41.
Goldstein ST, Zhou F, Hadler SC, Bell BP, Mast EE, Margolis HS. A mathematical model to
estimate global hepatitis B disease burden and vaccination impact. Int J Epidemiol 2005; 34:1329–
1339.
42.
Yamamoto T, Kajino K, Kudo M. Determination of the clonal origin of multiple human
hepatocellular carcinomas by clonign and polymerase chain reaction of the integrated hepatitis B
virus DNA. Hepatology 1999; 29:1446–1452.
43.
Stagle BL, Zhou YZ, Butel JS. Hepatitis B virus integration event in human chromosome 17p
near the p53 gene identifies the region of the chromosome commonly deleted in virus-positive
hepatocellular carcinomas. Cancer Res 1991; 51:49–54.
44.
Tokino T, Matsubara K. Chromosomal sites for hepatitis B virus integration in human
hepatocellular carcinoma. J Virol 1991; 65:6761–6764.
45.
Hadziyannis SJ, Lieberman HM, Karvountzis GG. Analysis of liver diseases, nuclear HBsAg,
viral replication, and hepatitis B virus DNA in liver and serum of HBeAg Vs. Anti – Hbe positive
carriers of hepatitis B virus. Hepatology 1983; 3:656–662.
46.
Pantisso P, Poon MC, Tiollais P. Detection of HBV in mononuclear blood cells. Br Med J 1984;
288:1563–1566.
47.
Wang W, London T, Feitelson MA Hepatitis Bx antigen in hepatitis virus carrier patients with
liver cancer. Cancer Res 1991; 51:4971–4977.
48.
Unsal H, Yakıcıer C, Marçais C. Genetic heterogeneity of hepatocellular carcinoma. Proct Natl
Acad Sci USA 1994; 822–826.
49.
Ikeda K, Saitoh S, Arase Y. Effect of interferon therapy on hepatocellular carcinogenesis in
patients with chronic hepatitis type C: a long-term observation study of 1,643 patients using
statistical bias correction with proportional hazard analysis. Hepatology 1999; 29:1124-1130.
50.
Bruno S, Battezzati PM, Bellati G. Long-term beneficial effects in sustained responders to
interferon-alfa therapy for chronic hepatitis C. J Hepatol. 2001; 34:748–755.
101
51.
Donato F, Tagger A, Gelatti U. Alcohol and hepatocellular carcinoma: the effect of lifetime
intake and hepatitis virus infections in men and women. Am J Epidemiol 2002; 155:323–331.
52.
Freeman AJ, Dore GJ, Law MG. Estimating progression to cirrhosis in chronic hepatitis C
virus infection. Hepatology 2001; 34:809–816.
53.
Cramp ME. HBV _ HCV _ HCC?. Gut 1999; 45:168–169.
54.
Serfaty L, Aumaitre H, Chazouilleres O. Determinants of outcome of compensated hepatitis C
virus-related cirrhosis. Hepatology 1998; 27:1435–1440.
55.
Anonim. Effect of interferon-alpha on progression of cirrhosis to hepatocellular carcinoma: a
retrospective cohort study. International Interferon-alpha Hepatocellular Carcinoma Study
Group. Lancet 1998; 351:1535–1539.
56.
Imai Y, Kawata S, Tamura S. Relation of interferon therapy and hepatocellular carcinoma in
patients with chronic hepatitis C. Osaka Hepatocellular Carcinoma Prevention Study Group. Ann
Intern Med 1998; 129:94–99.
57.
Niederau C, Lange S, Heintges T. Prognosis of chronic hepatitis C: results of a large,
prospective cohort study. Hepatology 1998; 28:1687–1695.
58.
Valla DC, Chevallier M, Marcellin P. Treatment of hepatitis C virus-related cirrhosis: a
randomized, controlled trial of interferon alfa-2b versus no treatment. Hepatology 1999;
29:1870–1875.
59.
Okanoue T, Itoh Y, Minami M. Interferon therapy lowers the rate of progression to
hepatocellular carcinoma in chroni c hepatitis C but not significantly in an advanced stage: a
retrospective study in 1148 patients. Viral Hepatitis Therapy Study Group. J Hepatol 1999;
30:653–659.
60.
Overall evaluations of carcinogenicity an updating of IARC monographs. IARC Monographs
1987; 83-87.
61.
Garner RC, Miller EC, Miller JA. Liver microsomal metabolism of aflatoxin B 1 to a reactive
derivative toxic to Salmonella typhimurium TA 1530. Cancer Res 1972; 32:2058–2066.
62.
Bressac B, Kew M, Wands J, Ozturk M. Selective G to T mutations of p53 gene in
hepatocellular carcinoma from southern Africa. Nature 1991; 350:429–431.
63.
Turner PC, Sylla A, Diallo MS, Castegnaro JJ, Hall AJ, Wild CP. The role of aflatoxins and
hepatitis viruses in the etiopathogenesis of hepatocellular carcinoma: A basis for primary
prevention in Guinea-Conakry, West Africa. J Gastroenterol Hepatol 2002; 17:441–448.
64.
Qian GS, Ross RK, Yu MC. A follow-up study of urinary markers of aflatoxin exposure and
liver cancer risk in Shanghai, People’s Republic of China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev
1994; 3:3–10.
65.
Wolk A, Gridley G, Svensson M. A prospective study of obesity and cancer risk (Sweden).
Cancer Causes Control 2001; 12:13–21.
66.
Boffetta P, Matisane L, Mundt KA, Dell LD. Meta-analysis of studies of occupational
exposure to vinyl chloride in relation to cancer mortality. Scand J Work Environ Health 2003;
29:220–222
67.
Marrero JA, Fontana RJ, Su GL, Conjeevaram HS, Emick DM, Lok AS. NAFLD may be a
common underlying liver disease in patients with hepatocellular carcinoma in the United States.
Hepatology 2002; 36:1349–1354.2572 El–Serag and Rudolph Gastroenterology Vol. 132, No. 7
102
68.
Bugianesi E, Leone N, Vanni E. Expanding the naturalhistory of nonalcoholic steatohepatitis:
from cryptogenic cirrhosis to hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2002; 123:134–140.
69.
Regimbeau JM, Colombat M, Mognol P. Obesity and diabetes as a risk factor for
hepatocellular carcinoma. Liver Transpl 2004; 10:69–73.
70.
Fiore G, Fera G, Napoli N, Vella F, Schiraldi O. Liver steatosis and chronic hepatitis C: a
spurious association? Eur J Gastroenterol Hepatol 1996; 8:125–129.
71.
Cotrim HP, Parana R, Braga E, Lyra L. Nonalcoholic steatohepatitis and hepatocellular
carcinoma: natural history? Am J Gastroenterol 2000; 5:3018–3019.
72.
Zen Y, Katayanagi K, Tsuneyama K, Harada K, Araki I, Nakanuma Y. Hepatocellular
carcinoma arising in non-alcoholic steatohepatitis. Pathol Int 2001; 51:127–131.
73.
Shimada M, Hashimoto E, Taniai M, et al. Hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis. J Hepatol 2002; 37:154–160.
74.
Adams LA, Lymp JF, St SJ, et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a
population-based cohort study. Gastroenterology 2005; 129:113–121.
75.
Calle EE, Rodriguez C, Walker-Thurmond K, Thun MJ. Overweight, obesity, and mortality
from cancer in a prospectively studied cohort of U.S. adults. N Engl J Med 2003; 348:1625–
1638.
76.
Moller H, Mellemgaard A, Lindvig K, Olsen JH. Obesity and cancer risk: a Danish recordlinkage study. Eur J Cancer 1994; 30A:344–350.
77.
Ratziu V, Giral P, Charlotte F, et al. Liver fibrosis in overweight patients. Gastroenterology
2000; 118:1117–1123.
78.
Ratziu V, Trabut JB, Poynard T. Fat, diabetes, and liver injury in chronic hepatitis C. Curr
Gastroenterol Rep 2004; 6:22–29.
79.
Adinolfi LE, Gambardella M, Andreana A, Tripodi MF, Utili R, Ruggiero G. Steatosis
accelerates the progression of liver damage of chronic hepatitis C patients and correlates with
specific HCV genotype and visceral obesity. Hepatology 2001; 33:1358–1364.
80.
Hwang SJ, Luo JC, Chu CW, et al. Hepatic steatosis in chronic hepatitis C virus infection:
prevalence and clinical correlation. J Gastroenterol Hepatol 2001; 16:190–195.
81.
Poynard T, Ratziu V, McHutchison J. Effect of treatment with peginterferon or interferon
alfa-2b and ribavirin on steatosis in patients infected with hepatitis C. Hepatology 2003; 38:75–
85.
82.
Westin J, Nordlinder H, Lagging M, Norkrans G, Wejstal R. Steatosis accelerates fibrosis
development over time in hepatitis C virus genotype 3 infected patients. J Hepatol 2002; 37:
837–842.
83.
Wong VS, Wight DG, Palmer CR, Alexander GJ. Fibrosis and other histological features in
chronic hepatitis C virus infection: a statistical model. J Clin Pathol 1996; 49:465–469.
84.
Ong JP, Younossi ZM, Speer C, Olano A, Gramlich T, Boparai N. Chronic hepatitis C and
superimposed nonalcoholic fatty liver disease. Liver 2001; 21:266–271.
103
85.
Ohata K, Hamasaki K, Toriyama K. Hepatic steatosis is a risk factor for hepatocellular
carcinoma in patients with chronic hepatitis C virus infection. Cancer 2003; 97:3036–3043.
86.
Rubbia-Brandt L, Quadri R, Abid K. Hepatocyte steatosis is a cytopa thic effect of hepatitis
C virus genotype 3. J Hepatol 2000; 33:106–115.
87.
Bugianesi E, Manzini P, D’Antico S. Relative contribution of iron burden, HFE mutations, and
insulin resistance to fibrosis in nonalcoholic fatty liver. Hepatology 2004; 39:179–187.
88.
El Serag HB, Tran T, Everhart JE. Diabetes increases the risk of chronic liver disease and
hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2004; 126:460–468.
89.
Adami HO, Chow WH, Nyren O. Excess risk of primary liver cancer in patients with diabetes
mellitus. J Natl Cancer Inst 1996; 88:1472–1477.
90.
Wideroff L, Gridley G, Mellemkjaer L. Cancer incidence in a population-based cohort of
patients hospitalized with diabetes mellitus in Denmark. J Natl Cancer Inst 1997; 89:1360–1365.
91.
El-Serag HB, Hampel H, Javadi F. The association between diabetes and hepatocellular
carcinoma: a systematic review of epidemiologic evidence. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4:
369–380.
92.
Evans AA, Chen G, Ross EA, Shen FM, Lin WY, London WT. Eight-year follow-up of the
90,000-person Haimen City cohort: I. Hepatocellular carcinoma mortality, risk factors, and
gender differences. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002; 11:369–376.
93.
Tanaka K, Hirohata T, Fukuda K, Shibata A, Tsukuma H, Hiyama T. Risk factors for
hepatocellular carcinoma among Japanese women. Cancer Causes Control 1995; 6:91–98.
94.
Yu MC, Yuan JM. Environmental factors and risk for hepatocellular carcinoma.
Gastroenterology 2004; 127(5 Suppl 1):72–78.
95.
De BV, Welsh JA, Yu MC, Bennett WP. p53 mutations in hepatocellular carcinoma related to
oral contraceptive use. Carcinogenesis 1996; 17:145–149.
97.
Korula J, Yellin A, Kanel G, Campofiori G, Nichols P. Hepatocellular carcinoma coexisting
with hepatic adenoma. Incidental discovery after long-term oral contraceptive use. West J Med
1991; 155:416–418.
97.
Rosenberg L. The risk of liver neoplasia in relation to combined oral contraceptive use.
Contraception 1991; 43:643–652.
98.
Maheshwari S, Kramer J, El-Serag HB. The association between oral contracepatives and
hepatocellular carcinoma: a meta-analysis. J Hepatol.
99.
Cauza E, Peck-Radosavljevic M, Ulrich-Pur H. Mutations of the HFE gene in patients with
hepatocellular carcinoma. Am J Gastroenterol 2003; 98:442–447.
100.
Willis G, Bardsley V, Fellows IW, Lonsdale R, Wimperis JZ, Jennings BA. Hepatocellular
carcinoma and the penetrance of HFE C282Y mutations: a cross sectional study. BMC
Gastroenterol 2005; 5:17.
101.
Blanc JF, De Ledinghen V, Bernard PH. Increased incidence of HFE C282Y mutations in
patients with iron overload and hepatocellular carcinoma developed in non-cirrhotic liver. J
Hepatol 2000; 32:805–811.
104
102.
Fracanzani AL, Fargion S, Stazi MA. Association between heterozygosity for HFE gene
mutations and hepatitis viruses in hepatocellular carcinoma. Blood Cells Mol Dis 2005; 35:27–
32.
103.
Boige V, Castera L, de RN. Lack of association between HFE gene mutations and
hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis. Gut 2003; 52:1178–1181.
104.
Hellerbrand C, Poppl A, Hartmann A, Scholmerich J, Lock G. HFE C282Y heterozygosity
in hepatocellular carcinoma: evidence for an increased prevalence. Clin Gastroenterol Hepatol
2003; 1:279–284.
105.
Yu MW, Hsieh HH, Pan WH, Yang CS, Chen CJ. Vegetable consumption, serum retinol
level, and risk of hepatocellular carcinoma. Cancer Res 1995; 55:1301–1305.
106.
Yu MW, Horng IS, Hsu KH, Chiang YC, Liaw YF, Chen CJ. Plasma selenium levels and
risk of hepatocellular carcinoma among men with chronic hepatitis virus infection. Am J
Epidemiol 1999; 150:367–374.
107.
Talamini R, Polesel J, Montella M. Food groups and risk of hepatocellular carcinoma: A
multicenter case-control study in Italy. Int J Cancer 2006; 119:2916–2921.
108.
Sauvaget C, Nagano J, Hayashi M, Spencer E, Shimizu Y, Allen N. Vegetables and fruit
intake and cancer mortality in the Hiroshima/Nagasaki Life Span Study. Br J Cancer 2003; 88:
689 694.
109.
Gallus S, Bertuzzi M, Tavani A. Does coffee protect against hepatocellular carcinoma? Br J
Cancer 2002; 87:956–959.
110.
Gelatti U, Covolo L, Franceschini M. Coffee consumption reduces the risk of hepatocellular
carcinoma independently of its aetiology: a case-control study. J Hepatol 2005; 42:528–534.
111.
Tanaka K, Hara M, Sakamoto T. Inverse association between coffee drinking and the risk of
hepatocellular carcinoma: a case-control study in Japan. Cancer Sci 2007; 98:214–218.
112.
Ohfuji S, Fukushima W, Tanaka T. Coffee consumption and reduced risk of hepatocellular
carcinoma among patients with chronic type C liver disease: A case-control study. Hepatol Res
2006; 36:201–208.
113.
Montella M, Polesel J, La VC. Coffee and tea consumption and risk of hepatocellular
carcinoma in Italy. Int J Cancer 2007; 120:1555–1559.
114.
Shimazu T, Tsubono Y, Kuriyama S. Coffee consumption and the risk of primary liver cancer:
pooled analysis of two prospective studies in Japan. Int J Cancer 2005; 116:150–154.
115.
Inoue M, Yoshimi I, Sobue T, Tsugane S. Influence of coffee drinking on subsequent risk of
hepatocellular carcinoma: a prospective study in Japan. J Natl Cancer Inst 2005; 97:293–300.
116.
Kurozawa Y, Ogimoto I, Shibata A. Coffee and risk of death from hepatocellular carcinoma in
a large cohort study in Japan. Br J Cancer 2005; 93:607–610.
117.
Bruix J, Sherman M, Llovet JM. Clinical management of hepatocellular carcinoma.
Conclusions of the Barcelona 2000 EASL Conference. J Hepatol. 2001; 35:421-430.
118.
Torzilli G, Minagawa M, Takayama T. Accurate preoperative evaluation of liver mass lesions
without fine-needle biopsy. Hepatology.1999; 30(4):889-893.
105
119.
Yu JS, Kim KW, Kim EK. Contrast enhancement of small hepatocellular carcinoma:
usefulness of three successive early image acquisitions during multiphase dynamic MR imaging.
Am J Roentgenol.1999; 173:597-604.
120.
Lim JH, Kim CK, Lee WJ. Detection of hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules in
cirrhotic livers: accuracy of helical CT in transplant patients. Am J Roentgenol. 2000; 175:693698.
121.
Kim T, Murakami T, Takahashi S. Optimal phases of dynamic CT for detecting hepatocellular
carcinoma: evaluation of unenhanced and triple-phase images. Abdom Imaging. 1999; 24:473480.
122.
Huang G, Sheu JC, Yang PM. Ultrasound guided cutting biopsy for the diagnosis of
hepatocellular carcinoma—a study based on 420 patients. J Hepatol. 1996; 25:334-338.
123.
Bru C, Maroto A, Bruix J. Diagnostic accuracy of fine-needle aspiration biopsy in patients
with hepatocellular carcinoma. Dig Dis Sci. 1989; 34:1765-1769.
124.
Nakashima T, Kojiro M. Hepatocellular Carcinoma. Tokyo: Springer Verlag; 1987.
125.
Policy 3.6.4.4 on Organ Distribution: Allocation of Livers. Available at: www.unos.org.
Accessed June 27, 2006
126.
Durand F, Regimbeau JM, Belghiti J. Assessment of the benefits and risks of percutaneous
biopsy before surgical resection of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2001; 35:254-258.
127.
Takamori R, Wong LL, Dang C, Wong L. Needle-tract implantation from hepatocellular
cancer: is needle biopsy of the liver always necessary? Liver Transpl. 2000; 6:67-72.
128.
Smith EH. Complications of percutaneous abdominal fine-needle biopsy. Rev Radiol. 1991;
178:253-258.
129.
Schotman SN, De Man RA, Stoker J. Subcutaneous seeding of hepatocellular carcinoma after
percutaneous needle biopsy. Gut. 1999; 45:626-627.
130.
Yuen MF, Lai CL. Serological markers of liver cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol.
2005; 19(1):91-99.
131.
Gupta S, Bent S, Kohlwes J. Test characteristics of alpha-fetoprotein for detecting
hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C. A systematic review and critical analysis.
Ann Intern Med. 2003; 139:46-50.
132.
Soresi M, Magliarisi C, Campagna P. Usefulness of alpha fetoprotein in the diagnosis of
hepatocellular carcinoma. AnticancerRes. 2003; 23:1747-1753.
133.
Maringhini A, Cottone M, Sciarrino E. Ultrasonography and alpha-fetoprotein in diagnosis of
hepatocellular carcinoma in cirrhosis. Dig Dis Sci. 1988; 33:47-51.
134.
Zhang BH, Yang BH, Tang ZY. Randomized controlled trial of screening for hepatocellular
carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol. 2004; 130(7):417-422.
135.
Chen JG, Parkin DM, Chen QG. Screening for liver cancer: results of a randomised
controlled trial in Qidong, China. J Med Screen. 2003; 10(4):204-209.
136.
Peterson MS, Baron RL. Radiologic diagnosis of hepatocellular carcinoma. Clin Liver Dis.
2001; 5:123-144.
106
137.
Zhang B, Yang B. Combined alpha fetoprotein testing and ultrasonography as a screening test
for primary liver cancer. J Med Screen. 1999; 6:108-110.
138.
Kang JY, Lee TP, Yap I, Lun KC. Analysis of cost-effectiveness of different strategies for
hepatocellular carcinoma screening in hepatitis B virus carriers. J Gastroenterol Hepatol. 1992;
7: 463-468.
139.
Bruix J, Sherman M. Practice Guidelines Committee, American Association for the Study of
Liver Diseases. Management of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2005; 42:1208-1236.
140.
Kojiro M, Roskams T. Early hepatocellular carcinoma and dysplastic nodules. Semin Liver
Dis. 2005; 25:133-142.
141.
Bialecki ES, Di Bisceglie AM. Clinical presentation and natural course of hepatocellular
carcinoma. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2005; 17:485-489.
142.
Ikeda K, Arase Y, Saitoh S. Anticarcinogenic impact of interferon on patients with chronic
hepatitis C: a large-scale long-term study in a single center. Intervirology. 2006; 49(1-2):82-90.
143.
Omata M, Yoshida H, Shiratori Y. Prevention of hepatocellular carcinoma and its recurrence
in chronic hepatitis C patients by interferon therapy. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 3(10
Suppl 2): S141-3.
144.
Okuda K. Natural history of hepatocellular carcinoma including fibrolamellar and hepatocholangiocarcinoma variants. J Gastroenterol Hepatol. 2002; 17:401-405.
145.
Llovet J, Bru C, Bruix J. Prognosis of hepatocellular carcinoma: the BCLC staging
classification. Semin Liver Dis. 1999; 19(3):329-338.
146.
Belghiti J, Hiramatsu K, Benoist S. Seven hundred forty seven hepatectomies in the 1990s: an
update to evaluate the actual risk of liver resection. J Am Coll Surg. 2000; 191:38-46.
147.
Bralet MP, Regimbeau JM, Pineau P. Hepatocellular carcinoma occurring in nonfibrotic liver:
epidemiologic and histopathologic analysis of 80 French cases. Hepatology.2000; 32:200-204.
148.
Imamura H, Matsuyama Y, Tanaka E. Risk factors contributing to early and late intrahepatic
recurrence of hepatocellular carcinoma after hepatectomy. J Hepatol. 2003; 38:200-207.
149.
Ono T, Nagasue N, Kohno H. Adjuvant chemotherapy with epirubicin and carmofur after
radical resection of hepatocellular carcinoma: a prospective randomized study. Semin Oncol.
1997; 24(suppl 6):S6-18.
150.
Yamamoto M, Arii S, Sughara K. Adjuvant oral chemotherapy after curative resection of
hepatocellular carcinoma. Br J Surg. 1996; 83:336-340.
151.
Lau WY, Leung TW, Ho SK. Adjuvant intra-arterial iodine-131-labelled lipiodol for
resectable hepatocellular carcinoma: a prospective randomized trial. Lancet. 1999; 353:797-801.
152.
Takayama T, Sekine T, Makuuchi M. Adoptive immunotherapy to lower postsurgical
recurrence rates of hepatocellular carcinoma: a randomized trial. Lancet. 2000; 356:802-807.
153.
Kubo S, Nishiguchi S, Hirohashi K. Effects of long term postoperative interferon-alpha
therapy on intrahepatic recurrence after resection of hepatitis C virus-related hepatocellular
carcinoma. Ann Intern Med. 2001; 134:963-967.
154.
Lin SM, Lin CJ, Hsu CW. Prospective randomized controlled study of interferon-alpha in
preventing hepatocellular carcinoma recurrence after medical ablation therapy for primary
tumors. Cancer. 2004; 100:376-382.
107
155.
Bismuth H, Chiche L, Adam R. Liver resection versus transplantation for hepatocellular
carcinoma in cirrhosis. Ann Surg. 1993; 218:145-151.
156.
Mazzaferro V, Regalia E, Doci R. Liver transplantation for the treatment of small
hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis. N Engl J Med. 1996; 334:693-699.
157.
Regalia E, Coppa J, Pulvirenti A. Liver transplantation for small hepatocellular carcinoma in
cirrhosis: analysis of our experience. Transplant Proc. 2001; 33:1442-1444.
158.
Llovet JM, Fuster J, Bruix J. Intention-to-treat analysis of surgical treatment for early
hepatocellular carcinoma: resection versus transplantation. Hepatology. 1999; 30:1434-1440.
159.
Lu DS, Yu NC, Raman SS. Percutaneous radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma
as a bridge to liver transplantation. Hepatology. 2005; 41:1130-1137.
160.
Graziadei IW, Sandmueller H, Waldenberger P. Chemoembolization followed by liver
transplantation for hepatocellular carcinoma impedes tumor progression while on the waiting list
and leads to excellent outcome. Liver Transpl. 2003; 9:557-563.
161.
Gondolesi GE, Roayaie S, Munoz L. Adult living donor liver transplantation for patients with
hepatocellular carcinoma: extending UNOS priority criteria. Ann Surg. 2004; 239:142-149.
162.
Hasegawa S, Yamasaki N, Hiwaki T. Factors that predict intrahepatic recurrence of
hepatocellular carcinoma in 81 patients initially treated by percutaneous ethanol injection.
Cancer. 1999; 86:1682-1690.
163.
Shiina S, Tagawa K, Niwa Y. Percutaneous ethanol injection therapy for hepatocellular
carcinoma: results in 146 patients. Am J Roentgenol. 1993; 160:1023-1028.
164.
Lencioni RA, Allgaier HP, Cioni D. Small hepatocellular carcinoma in cirrhosis: randomized
comparison of radiofrequency thermal ablation versus percutaneous ethanol injection.
Radiology. 2003; 228: 235-240.
165.
Lin SM, Lin CJ, Lin CC. Radiofrequency ablation improves prognosis compared with ethanol
injection for hepatocellular carcinoma or equal to 4 cm. Gastroenterology. 2004; 127:1714-1723.
166.
Llovet JM, Bruix J. Systematic review of randomized trials for unresectable hepatocellular
carcinoma: chemoembolization improves survival. Hepatology. 2003; 37:429-442.
167.
Veltri A, Moretto P, Doriguzzi A. Radiofrequency thermal ablation after transarterial
chemoembolization as a combined therapy for unresectable non-early hepatocellular carcinoma.
Eur Radiol. 2006; 16(3):661-669.
168.
Burroughs A, Hochhauser D, Meyer T. Systemic treatment and liver transplantation for
hepatocellular carcinoma: two ends of the therapeutic spectrum. Lancet Oncol. 2004; 5:409-418.
169.
Mathurin P, Rixe O, Carbonell N. Review article: overview of medical treatments in
unresectable hepatocellular carcinoma—an impossible meta-analysis? Aliment Pharmacol Ther.
1998; 12:111-126.
170.
Yao FY, Ferrell L, Bass NM. Liver transplantation for hepatocellular carcinoma: expansion of
the tumor size limits does not adversely impact survival. Hepatology. 2001; 33:1394-1403.
171.
Sambrook J. Frits, EF Mnniatis. T. Moleculer cloning : A laboratory manuel. 2 nd ed, vol. 3.
Cold Spring Harbor Laboratory 1989 Cold Spring Harbor, NY.
108
172.
Palumbi SR. Nucleic Acids II: The polymerase Chain Reaction. In.DM Hillis, C Moritz abd
BK Mable (eds): Molecular Systematics. 2 nd edition, Sinauer Associates, Inc.,Sunderland,
Massachusetts 1996;pp. 205-274.
173.
Mayo LD, Donner DB. The PTEN, Mdm2, p53 tumor suppressoroncoprotein network. Trends
Biochem Sci 2002; 27:462–7.
174.
Harris SL, Levine AJ. The p53 pathway: positive and negative feedback loops. Oncogene
2005; 24:2899–908.
175.
Moll UM, Petrenko O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 2003; 1:1001–8.
176.
Haupt Y, Maya R, Kazaz A, Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature
1997; 387:296–9.
177.
Xiao ZX, Chen J, Levine AJ, Modjtahedi N, Xing J, Sellers WR, Livingston DM. Interaction
between the retinoblastoma protein and the oncoprotein MDM2. Nature, 1995; 375:694–698.
178.
Bond GL, Hu W, Bond EE, et al. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter
attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in
179.
Ohmiya N, Taguchi A, Mabuchi N, Itoh A, Hirooka Y, Niwa Y, Goto H, MDM2 promoter
polymorphism is associated with both an increased susceptibility to gastric carcinoma and poor
prognosis. J. Clin. Oncol. 2006; 24:4434–4440.
180.
Dharel N, Kato N, Muroyama R, Moriyama M, Shao RX, Kawabe T, Omata M, MDM2
promoter SNP309 is associated with the risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic
hepatitis C. Clin. Cancer Res. 2006; 12:4867–487
181.
Yoon YJ, Chang HY, Ahn SH, Kim JK, Park YK, Kang DR, Park JY, Myoung SM, Kim
DY, Chon CY, Han KH. MDM2 and p53 Polymorphisms are Associated with the Development
of Hepatocellular Carcinoma in Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection.
Carcinogenesis. 2008.
182.
Lind H, Zienolddiny S, Ekstrom PO, Skaug V, Haugen A. Association of a functional
polymorphism in the promoter of the MDM2 gene with risk of nonsmall cell lung cancer. Int. J.
Cancer 2006; 119:718–721.
183.
Walsh CS, Miller CW, Karlan BY, Koeffler HP. Association between a functional single
nucleotide polymorphism in the MDM2 gene and sporadic endometrial cancer risk. Gynecol.
Oncol 2007; 104:660–664.
184.
Hong Y, Miao X, Zhang X, Ding F, Luo A, Guo Y, Tan W, Liu Z, Lin D. The role of P53
and MDM2 polymorphisms in the risk of esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res.
2005; 65:9582–9587.
185.
Onat OE, Tez M, Ozcelik T, Toruner GA. MDM2 T309G polymorphism is associated with
bladder cancer. Anticancer Res. 2006; 26:3473–3475.
186.
Ma H, Hu Z, Zhai X, Wang S, Wang X, Qin J, Jin G, Liu J, Wei Q, Shen H. Polymorphisms
in the MDM2 promoter and risk of breast cancer: a case-control analysis in a Chinese
population. Cancer Lett. 2006; 240:261–267.
187.
Campbell IG, Eccles DM, Choong DY. No association of the MDM2 SNP309 polymorphism
with risk of breast or ovarian cancer. Cancer Lett. 2006; 240:195–197.
188.
Alhopuro P, Ylisaukko-Oja SK, Koskinen WJ, Bono P, Arola J, Jarvinen HJ, Mecklin JP,
Atula T, Kontio R, Makitie AA, Suominen S, Leivo I, Vahteristo P, Aaltonen LM, Aaltonen
109
LA. The MDM2 promoter polymorphism SNP309T→G and the risk of uterine leiomyosarcoma,
colorectal cancer, and squamous cell carcinoma of the head and neck. J. Med. Genet 2005;
42:694–698.
189.
Tsai JF, Chang WY, Jeng JE, Ho MS, Lin ZY, Tsai JH. Hepatitis B and C virus infection as
risk factors for liver cirrhosis and cirrhotic hepatocellular carcinoma: a case-control study. Liver
1994; 14:98–102.
190.
Bond GL. A single nucleotide polymorphism in the MDM2 gene: from a molecular and cellular
explanation to clinical effect. Cancer Res. 2005; 65:5481–5484.
191.
Bond GL. A single nucleotide polymorphism in the p53 pathway interacts with gender,
environmental stresses and tumor genetics to influence cancer in humans. Oncogene. 2007; 26:
1317–1323.
192.
Dobbelstein M, Wienzek S, Konig C, Roth J. Inactivation of the p53-homologue p73 by the
mdm2-oncoprotein. Oncogene. 1999; 18:2101–2106.
193.
Zhang Y, Xiong Y, Yarbrough WG. ARF promotes MDM2 degradation and stabilizes p53:
ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 tumor suppression pathways. Cell.
1998; 92:725–734.
194.
Soussi T, Beroud C. Assessing TTP53 status in human tumours to evaluate clinical outcome.
Nat Rev Cancer 2001; 1: 233–240.
195.
Oliner JD, Kinzler KW, Meltzer PS, George DL, Vogelstein B. Amplification of a gene
encoding a TP53-associated protein in human sarcomas. Nature 1992; 358:80–83.
196.
Jones SN, Hancock AR, Vogel H, Donehower LA, Bradley A. Overexpression of Mdm2 in
mice reveals a TP53- independent role for Mdm2 in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA
1998; 95:15608–15612.
197.
Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG. The sequence of the
human genome. Science 2001; 291(5507):1304–51.
198.
Sachidanandam R, Weissman D, Schmidt SC, Kakol JM, Stein LD, Marth G. A map of
human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms.
Nature 2001; 409 (6822):928–33.
199.
Mo´nica Anzola, Nerea Cuevas, Mo´nica Lo´pez-Martı´nez, Alberto Saiz, Juan Jose´
Burgos, Marian Martı´nez de Pancorbo. Frequent loss of p53 codon 72 Pro variant in hepatitis
C virus positive carriers with hepatocellular carcinoma. Cancer Letters ;2003; 93:199–205.
200.
Sayeh Ezzikouri, Abdellah Essaid El feydi, Abdelaziz Chafik, Mustapha Benazzouz,
Latifa El kihal, Rajae Afifi, Mohammed Hassar, Pascal Pineau and Soumaya Benjelloun
The Pro variant of the p53 codon 72 polymorphism is associated with hepatocellular carcinoma
in Moroccan population Hepatology Research 2007; 37:748–754.
201.
Michela Leveria, Chiara Grittia, Laura Rossia, Claudio Zavagliab, Emilio Civardia,
Mario U. Mondellic, Annalisa De Silvestrid, Enrico M. Silinia. Codon 72 polymorphism of
P53 gene does not affect the risk of cirrhosis and hepatocarcinoma in HCV-infected patients
Cancer Letters 2004; 208:75–79.
202.
Zhong-Zheng Zhua, Wen-Ming Conga, Shu-Fang Liub, Zhi-Hong Xiana,Wei-Qing Wua,
Meng-Chao Wua, Bin Gaoc, Li-Fang Houd, Guan-Shan Zhuc. A p53 polymorphism
modifies the risk of hepatocellular carcinoma among non-carriers but not carriers of chronic
hepatitis B virus infection. Cancer Letters 2005; 229:77–83.
110
203.
Brenda J. Boersma , Tiffany M. Howe , Julie E. Goodman , Harry G. Yfantis ,Dong H. Lee ,
Stephen J. Chanock , Stefan Ambs. Association of Breast Cancer Outcome With Status of p53
and MDM2 SNP309. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 98, No. 13; July 5, 2006.
204.
Gareth L Bond, Chiara Menin, Roberta Bertorelle, Pia Alhopuro, Lauri A Aaltonen
MDM2 SNP309 accelerates colorectal tumour formation in women. J. Med. Genet. 2006;
43:950-952
Vijaya Galic, Julia Willner, MelissaWollan, Ruchi Garg, Rochelle Garcia, Barbara A.
Goff, Heidi J. Gray and Elizabeth M. Swisher. Common Polymorphisms in TP53 and MDM2
and the Relationship to TP53 Mutations and Clinical Outcomes inWomen with Ovarian
and Peritoneal Carcinomas. GENES, CHROMOSOMES & CANCER ,2007; 46:239–247
205.
206.
Yuan Hong, Xiaoping Miao, Xuemei Zhang, Fang Ding, Aiping Luo, Yongli Guo,
Wen Tan, Zhihua Liu, and Dongxin Lin.The Role of P53 and MDM2 Polymorphisms in the Risk
of Esophageal Squamous Cell Carcinoma.Cancer Res 2005; 65: 20
207.
Ahmed Idbaiha, Blandine Boisseliera, Yannick Mariea, Marc Sansona,Soufiane El
Hallania, Emmanuelle Crinièrea, Maryam Fourtassic, Sophie Parisa,Catherine
Carpentiera,Audrey Rousseaua,KarimaMokhtaria, Christophe Combadièref,Florence
Laigle-Donadeya, Khê Hoang Xuana, Jean-Yves Delattrea. Influence of MDM2 SNP309
alone or in combination with the TP53 R72P polymorphism in oligodendroglial tumors. Brain
Research 2008; 1198:16-20.
208.
Christine S. Walsh, Carl W. Miller, Beth Y. Karlan, H. Phillip Koeffler.Association
between a functional single nucleotide polymorphism in the MDM2 gene and sporadic
endometrial cancer risk.Gynecologic Oncology 2007; 104:660–664.
209.
Sajid A. Khan MD, Kamran Idrees MD, Ann Forslund PhD, Zhaoshi Zeng MD, Shoshana
Rosenberg BS, Hanna Pincas PhD, Francis Barany PhD, Kenneth Offit MD, Michael P.
Laquaglia MD and Philip B. Paty MD. Genetic Variants in Germline TP53 and MDM2
SNP309 Are Not Associated With Early Onset Colorectal Cancer. Journal of Surgical Oncology
2008; 97:621–625.
111
ÖZGEÇMİŞ
Adı-Soyadı
: Ahmet Taner SÜMBÜL
Doğum Tarihi ve Yeri
: 18 / 07 / 1979 - Kadirli
Medeni Durumu
: Evli
Adres
: Damar Arıkoğlu Bulv. Esen Apt. K:6 No:12
Mahfesığmaz Mah. ADANA
Telefon
: 0-505-6166338
E.mail
: [email protected]
Mezuniyet
: Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
Mezuniyet Yılı
: 2003
Yabancı Diller
: İngilizce, Almanca
112