Laboratuar Ölçüm Metodları

LABORATUAR ÖLÇÜM
METODLARI VE
ANALİZ YÖNTEMLERİ,
SPEKTROFOTOMETRİ
Ölçüm, bir uzunluğun, bir alanın, bir kapasitenin
veya herhangi bir olgunun belirli bir birim
cinsinden hesaplanmasıdır. Bunun için
standart ölçü birimleri kullanılır.
Ölçü birimleri, iki farklı sistemde farklı olarak
belirtilmiştir:
1- metrik sistem
2- SI sistem (uluslararası sistem)
1- Metrik sistem
uzunluk birimi= metre
kütle birimi= gram
hacim birimi= litre
2- SI sistem
Uzunluk = metre (m)
Kütle= kilogram (kg)
Konsantrasyon= mol (mol)
Zaman= saniye (s)
Elektrik akımı= amper (A)
Isı= kelvin (K)
Işık yoğunluğu= kandela (cd)
Katalitik miktar= katal (kat)
Temel Birimlerin Küçülen Katlarının
Önekleri
Desi (d): 10-1
Santi (c): 10-2
Mili (m): 10-3
Mikro (µ): 10-6
Nano (n): 10-9
Pico (p): 10-12
Femto (f): 10-15
Atto (a): 10-18
Temel Birimlerin Büyüyen Katlarının
Önekleri
Deka (da): 101
Hecto (h): 102
Kilo (k): 103
Mega (M): 106
Giga (G): 109
Tera (T): 1012
Peta (P): 1015
Exa (T): 1018
Laboratuvarda en çok kullanılan
çevrimler:
1 dl
10-1 l
10 dl
1l
1 ml
10-3 l
1 ml
10-2 dl
100 ml
1 dl
1 μl
10-6 l
1000 μl
1 ml
1 mg
10-3 g
1000 mg 1 g
1 μg
10-6 g
Kullanılışlarına göre klinik biyokimyasal
analizler
1) Rutin analizler. Sık kullanılan analizler
2) Acil analizler. Hemoglobin, kan grubu,
hematokrit, KŞ, üre, kreatinin, sodyum,
potasyum, klorür, kalsiyum, bilirubin, AST,
ALT, CK-MB, Amilaz, Lipaz, CRP
Laboratuvar ölçüm metodları
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
2- iyon selektif elektrotlar (ISE)
3- türbidimetri
4- nefelometri
5- florometri
6- düşük konsantrasyonlu
maddelerin ölçümü
7- elektroforez
8- kromotografi
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
Beyaz ışık farklı dalga boyu ve renklere sahiptir.
Birbirini takip eden dalgaların aynı noktaları
(örneğin tepe noktaları) arasındaki uzaklık
dalga boyudur.
Daha kısa aralıklı tepe
noktaları daha kısa dalga
boylarını ve ışığın daha
fazla enerji içerdiğini
gösterir.
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
Dalga boyu nanometre (nm=10-9 m)olarak ifade edilir.
Elektromanyetik ışınlar dalga boylarına göre farklı
adlarla anılırlar:
180-380 nm ……….ultraviyole (UV) (mor ötesi)
380-750 nm ……….visible light (görünür)
750-….. nm ……….infrared (IR) (kızıl ötesi)
Bir maddenin rengi, o maddeden gözümüze ulaşan
görünür bölgedeki elektromanyetik ışınlardır.
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
İşte, madde tarafından tutulan ışınların rengi ile
maddenin görünür rengini oluşturan ışınların
rengi, tamamlayıcı renkler olarak
adlandırılırlar.
Yani maddelerin rengi, maddelerin tuttuğu ışının
tamamlayıcısı olan ışının rengidir.
390-435
Solusyonun rengi,
(görünen renk),
Tamamlayıcı renk
Absorbe edilen Transmitte
ışığın rengi
(yansıyan) edilen
ışığın rengi
Eflatun
Sarı-yeşil
435-490
Mavi
Sarı
490-580
Yeşil
Kırmızı
580-595
Sarı
Mavi
595-650
Turuncu
Yeşil-mavi
650-750
kırmızı
Mavi-yeşil
Dalgaboyu
Tamamlayıcı renkler tablosu
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
1.1 kolorimetri: çözelti içindeki madde
miktarını ölçmek için, çözeltinin renginden
faydalanılır, bu tip ölçüm yapan cihaza
kolorimetre denir.
Ölçülecek çözeltinin rengi, değişik
konsantrasyonlardaki standartların rengiyle
karşılaştırarak değerlendirilir.
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
1.2. fotometri: çözelti içindeki madde
miktarını ölçmek için, çözeltiden geçen veya
çözeltinin tuttuğu ışık miktarından faydalanılır,
bu tip ölçüm yapan cihazlara fotometre denir.
Yani fotometreler, fotoelektrik kolorimetrelerdir.
Fotometrelerde;
◊ hem ışığın tüm bölgelerinde (UV, görünür, IR)
ölçüm yapılabilir,
◊ hem de renk yerine ışık ölçüldüğü için renksiz
çözeltiler de ölçülebilir.
spektrofotometre
Spektrofotometreler, maddenin renk
yoğunluğunun ölçülmesiyle, madde miktarının
veya konsantrasyonunun bulunmasını sağlayan
cihazlardır.
Güneş ışığı veya bir tungsten lambadan saçılan
ışık, insan gözünün beyaz olarak tanımladığı,
farklı dalga boylarındaki ışık enerjilerinin bir
karışımıdır.
Bir madde, elektromagnetik dalga
spektrumunda 380-750 nm uzunluğundaki
görünür ışınların hepsini geçiriyor veya
yansıtıyorsa beyaz görünür; hepsini soğuruyorsa
(arbsorbluyorsa) siyah görünür.
Görünür spektrumda mavi rengi soğuran bir
made sarı renkli, sarı rengi soğuran bir madde
mavi renkli görünür.
yeşil rengi soğuran bir
madde kırmızı renkli,
kırmızı rengi soğuran
bir madde yeşil renkli
görünür.
İçerisinde organik moleküller bulunan bir
çözeltiden UV-görünür bölge ışınları geçerse,
çözelti bu ışınların bir kısmını seçimli olarak
soğurur (absorpsiyon), diğerlerini ise çok az
soğurur veya olduğu gibi geçirir (transmisyon).
Transmitte edilen
renk o bileşiğin
görünen rengini
oluşturur.
Transmitte ve
absorbe edilen
renkler birbirini
tamamlar.
Bir küvet içine konmuş renkli bir
çözeltiden çıkan ışık şiddeti (I), çözeltiye
giren ışık şiddetinden (Io) daha küçüktür.
Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye
giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans
(T) olarak tanımlanır.
Transmittans, genellikle %Transmittans (%T)
olarak ifade edilir.
T=
I
Io
%T=
I
Io
x 100
Absorbans transmittansın negatif
logaritmasıdır.
Absorbans= optik dansite= A
A= log
1
T
= - logT = - log
I
Io
Bir çözeltinin konsantrasyonu
Absorbans (A)
% transmittans
Lambert-Beer Kanunu
• Beer kanunu; Absorbans ve solüt
konsantrasyonu arasındaki ilişkinin ifadesidir.
Konsantrasyon arttıkça absorbans artar.
• Lambert kanunu; ışık yolu uzadıkça
(solüsyonun derinliği arttıkça) absorbans artar.
• İkisi kombine edilerek bir
eşitlik oluşturulmuştur.
A = ε.l.c
A; absorbans (birimi yok)
l; solüsyonun derinliği (cm)
c; konsantrasyon (mol/L)
ε; molar absorbtivite (L.mol-1.cm-1)
ε; molar absorbtivite: 1 cm’lik ışık
yolunda 1 mol/L’lik solusyonun absorbans
değeridir.
Spektrofotometrenin
komponentleri;
Işık kaynağından gelen
beyaz ışıktan uygun dalga
boyunu seçip, diğerlerini
elimine eder. Mercek
veya prizma sistemidir
Küvetten geçen ışığın
şiddetini ölçer.
detektör
küvet
Çıkış yarıklı levhası
monokromatör
Giriş yarıklı levhası
Işık
kaynağı
Tungsten lamba, civa ark,
hidrojen ve döteryum lambaları
Cam veya
plastik numune
okutma
kaplarıdır.
Monokromatörden çıkan
ışınlardan istenilen dalga
boyundaki kısım geçirilir,
diğerleri tutulur.
Işık kaynağından çıkan dağınık
ışıkları monokromatöre yönlendirir.
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
1.3. otoanalizör: otoanalizör kabaca, numune
ve reaktifleri uygun ölçülerde alıp karıştıran,
belirli süre ve ısıda inkübe eden, gerekli sürelerde
optik okumaları yapıp sonunda ilgili analiz
sonucunu hesaplanmış olarak kullanıcıya sunan
cihazlardır. Kısaca otomatik bir
spektrofotometredir.
 Bir otoanalizörün birim zamanda ( 1 saat)
yapmış olduğu test sayısı önemlidir. Saatte onlarca
hatta binlerce test yapan cihazlar vardır.
 bir hastanın acil çalışılması gerekirse, cihaza
hasta serumu yüklendikten sonra, ACİL komutu
verilerek öncelik acil hastasına verilebilir.
 numune ve reaktifin karıştırılıp, reaksiyonun
gerçekleştiği küvetler ya tek kullanımlıktır ya da
cihaz tarafından otomatik olarak
yıkanıp tekrar tekrar kullanılır.
 kullanıcı sadece analizör üreticisi
firmanın kitini kullanmak zorundadır.
 otoanalizörlerde kullanılabilir dalga boyu sabittir
ve üretici firma tarafından belirlenir. Kullanılabilir
dalga boyu ne kadar genişse, o kadar iyi olur.
 otoanalizörde serum ve reaktif pipetleyen
problar bir veya daha fazla olabilirler. Serum veya
reaktif bulaşmasını önlemek için her pipetlemeden
sonra, cihaz otomatik yıkama yapar.
 herhangi bir test, tekrar edilmek isteniyorsa
TEKRAR komutu vermek yeterlidir.
 cihazdaki reaktif bölmesinin sıcaklığı önemlidir,
bu yüzden bu bölmeler soğutuculudur. Genelde +4
derecedir. Fakat oda ısısı sıcaklığına sahip bölmeler
de olabilir.
 numune ve reaktif problarında seviye
dedektörleri bulunmalı ve gerektiğinde herhangi
bir serumu otomatik olarak seyreltebilmelidir.
 çok sayıda hasta sonucunu hafızasında
saklayabilmeli ve her çeşit bilgisayara kolaylıkla
bağlanabilmelidir.
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
1.4. flame fotometre (alev fotometresi):
bir atomun elektronları, ısı etkisiyle
uyarılabilirler. Bu şekilde daha üst bir enerji
seviyesine ulaşmış elektronlar daha sonra eski
enerji düzeylerine dönerlerken aradaki enerji
farkını ışık olarak dışarı salarlar. Bu ışınlar her
bir element için spesifiktir. Uygun bir dalga
boyunda bu ışınların fotometrik ölçümü
yapılırsa ortamdaki madde miktarıyla
orantılı ışıma nedeniyle madde
konsantrasyonu belirlenmiş olur. (ör, Na, K
ölçümü)
1- ışık şiddetinden faydalanılarak
yapılan ölçümler
1.5. atomik absorbsiyon (AAS): temel
prensibi alev fotometresinin tam tersidir. Burada
element uyarılmaz, sadece kimyasal bağından
ayrılır ve iyonlaşmamış nötral atom durumunda
bulunur. Atomlar bu durumda 0,001-0,01 nm
arası çok dar bantlı ışımayı absorbe edebilirler. Bu
ışığın kaynağı katot lambasıdır.
Flame fotometrede uyarılmış atomun
saldığı ışın ölçülürken, AAS de atomun
tuttuğu ışın ölçülür. (ör, bakır, çinko,
demir ölçümü)
2- iyon selektif elektrotlar (ISE)
Başta Na, K, Ca, Cl va Li olmak üzere pek çok
elektrolitin (iyonun) tayininde geliştirilmiş bir
yöntemdir. Bu cihazlara iyon selektif
analizörler denir. Burada, özel elektrotlar
yardımı ile numunelerde potansiyel farkı
ölçülür. Böylece numunelerdeki
madde konsantrasyonu
tayin edilir. Her bir element
için ayrı bir elektrot vardır.
Prensibi, iyon farkının bir
membranda (zar) meydana
getirdiği potansiyel farkın
ölçülmesidir.
3- türbidimetri
Deney ortamının bulanık olması durumunda, ışık
kaynağından çıkan ışınların tamamı fotosele
(dedektör) ulaşamaz. Fotosele ulaşan miktar,
ortamın bulanıklığı ile ters orantılıdır. Bundan
faydalanılarak bulanıklığa sebep olan madde
konsantrasyonu hesaplanır.
Bu metod genelde, numunedeki proteinlerin
ölçümünde kullanılır. Proteinler denatüre
edilerek bulanıklık oluşturulur. Bulanıklık,
ortamdaki protein konsantrasyonu ile doğru
orantılıdır.
4- nefelometri
Türbidimetri gibi bulanıklığın ölçümü esasına
dayanır. Fakat burada, ortamdaki partiküllerce,
geliş eksenine göre 90° açıyla yerleştirilmiş
olan fotosele doğru saptırılan ışınların
ölçülmesi söz konusudur.
Türbidimetriden diğer farkı, partikül sayısı
arttıkça türbidimetride % T azalırken, burada
artar.
%T: çözeltiye giren ışığın yüzde kaçının
çözeltiden çıktığını gösterir (% transmittans).
Turbidimetride,
Bulanıklık
,
%T
(çözeltiye giren
ışığın, çözeltiden çıkış
yüzdesi)
Nefelometride,
Bulanıklık
,
%T
5- florometri
Bir maddenin bir çözeltide çok küçük
konsantrasyonlarda bile UV etkisi altında
kuvvetli flüoresans verme özelliklerine
dayanan miktar tayin yöntemidir.
6- düşük konsantrasyonlu
maddelerin ölçümü
Ortamdaki madde konsantrasyonu çok
düşük olduğunda, yukarıda sayılan
yöntemler kantitatif ölçüm için yetersiz kalır.
Bu durumda,
6.1. enzim immunoassay
6.2. radyoimmunoassay (RIA)
6.3. kemilüminessans
yöntemleri kullanılır.
6.1. enzim immunoassay:
ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)
EIA (enzyme immunoassay)
EMIT (enzyme-multiplied immunassay technique)
gibi isimleri vardır.
Prensip: antijen-antikor arasındaki
reaksiyona dayanır.
İşaretli antijen ile işaretsiz antijen, antikorla
reaksiyona girmek için yarışırlar. Tayin etmek
istediğimiz işaretsiz antijendir. İşaretleyici madde
olarak enzim kullanılır. Alkalen fosfataz en çok
kullanılan enzimdir. Reaksiyon tamamlandıktan
sonra ortama bir substrat eklenerek
spektrofotometrik olarak enzim aktivitesi ölçülür.
6.2. radyoimmunassay (RIA)
RIA, bağışıklık reaksiyonlarının spesifikliğini
radyokimyasal yöntemlerle birleştiren bir analiz
yöntemidir. Bu metodda işaretleyici olarak
radyoaktif bir element kullanılır. En çok kullanılan
I125’ dir.
prensip: antijen-antikor ilişkisidir.
Örnek ile kaplı yüzey
(antijenler)
Nonspesifik proteinle
doldurulmamış
bölgelerin bloklanması
Spesifik antijene karşı
1.cil antikorla
inkübasyon
Enzim bağlı antijen ile
antikor kompleksi
substrat
Spesifik antijenin varlığını
Gösteren renkli ürünün
oluşumu
Antijen-antikor ilişkisi
6.3. kemilüminessans
Prensibi RIA’ya benzer. Ancak burada
işaretleyici madde olarak radyoizotop yerine
reaksiyona girdiğinde ışık yayan madde yani
kemilüminesan madde kullanılır.
7- elektroforez
Elektroforez, proteinlerin ve diğer elektriksel
olarak yüklü moleküllerin, bir elektrik alanında
göç etmelerine dayanan bir işlemdir.
7- elektroforez
Bir molekülün göç hızı;
molekülün net yüküne,
molekülün büyüklüğüne,
uygulanan voltajın yüksekliğine bağlıdır.
Net yük, pozitif ve negatif yüklü birimlerin
sayısına ve elektroforez tankının pH’sına bağlıdır.
Fizyolojik pH’da çoğu proteinler anyondur; yani
negatif yüklerin sayısı pozitif yüklerden fazladır.
Bazı anyonlar; HCO3-, Cl-, HPO42-, SO42-, organik
asitler, proteinler.
Bazı katyonlar; Na+, K+, Ca2+, Mg2+
Elektroforez çeşitleri
 kağıt elektroforezi
destek ortamı olarak filtre kağıdı kullanılır
 agaroz jel elektroforezi
Destek ortamı, karbohidrat polimeri olan agaroz veya
agaropektin
 selüloz asetat elektroforezi
destek ortamı, selüloz asetat kağıtları
 poliakrilamid jel elektroforezi
destek ortamı, poliakrilamid jel
 nişasta jel elektroforezi
destek ortamı, nişasta
 immunoelektroforez
jel üzerinde ayrılmış proteinler, antikorlarla etkileştirilir
ve antijenik durumları hakkında bilgi edinilir
 kapiller elektroforez
kapiller ve dedektör kullanılır
Kan plazması, neredeyse 100 farklı protein içerir.
Elektroforez sırasındaki davranışlarına göre,
bunlar yaygın olarak beş farklı gruba
bölünmüşlerdir. Bunlar:
albumin
α1-globulin
α2-globulin
β-globulin
γ-globulin
Albumin, kanın ozmotik basıncının
korunmasında önemlidir. Ayrıca yağ asitleri,
bilirubin, bazı steroid hormonlar, vitaminler ve Ca
iyonları gibi lipofilik (yağsever) maddeler için
taşıyıcı proteinlerdir.
Globulinler, lipidlerin, hormonların, vitaminlerin
ve metal iyonlarının taşınmasında görev alır ve
kan pıhtılaşma sisteminin önemli bir kısmını
oluştururlar. Ayrıca bağışıklık sisteminin esas
kısmını oluşturan antikorları (γ-globulinler) da
içerirler.
Grup
Protein
Albumin
α1-globulin
Antitripsin,antikimotripsin,lipoprotein(HDL),
protrombin, transkortin, asit glikoprotein,
tiroksin bağlayıcı globulin
α2-globulin
Seruloplazmin, antitrombin III,
haptoglobulin,kolinesteraz, plazminojen,
vitamin D-bağlayıcı protein
β-globulin
Lipoprotein (LDL), transferrin,
fibrinojen,transkobalamin, C-reaktif protein
γ-globulin
IgG, IgA, IgM, IgD, IgE
Plazma proteinleri
Plazma proteinlerinin elektroforezi:
Albumin, % 52-58
α1-globulin, %2.4-4.4
α2-globulin, % 6.1-10.1
β-globulin, % 8.5-14.5
γ-globulin, % 10-21
8- kromotografi
Başka yöntemlerle ayrılamayan aminoasitler, yağ
asitleri, steroid hormonlar gibi maddeleri ayırmak
için kullanılır. Ayrıca çeşitli ilaçların ve uyuşturucu
maddelerin analizi amacıyla emniyet teşkilatında da
kullanılır.
Kromotografi ile ayrılan maddelerin çoğu renksizdir.
Bu yüzden maddeleri birbirinden ayırdıktan sonra
çeşitli boyalarla boyamak gerekir.
Destek ortamı porlu yapıdadır. Ayrıca destek ortamı
iki fazdan oluşur:
Hareketli faz: maddelerin hareket etmesini
(yürümesini) sağlayan akıcı faz
Sabit faz: destek ortamı ile birlikte bulunan
hareketsiz faz
Kromotografi çeşitleri:
 kolon kr.
 ince tabaka kr.
 gaz kr.
 HPLC (high performance liquid
chromatography= yüksek perrformanslı sıvı kr.